Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культура ткани и клеток сахарного тростника и орхидей на безвирусной основе

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Культура ткани и клеток сахарного тростника и орхидей на безвирусной основе"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ .\ЮЛД02А ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ АН ЕЛ

На правах рукописи

ТХАЙ С/АН ЗУ

УДК 581.1.035

КУЛЬТУРА ТКАНИ И КЛЕТОК САХАРНОГО ТРОСТНИКА И ОРХИДЕЯ НА БЕЗШРУСНОЙ ОСНОВЕ

Специальность 03. СО. 12~£:13'лслогля растеклй

Автореферат

диссертации на соискание ученой степакл кандидата биологических наук

'Кииглноз - 1991

Работа выполнена в Институтэ экспериментальной биология города Хошпглша и на ка$едрз вирусологии Киевского ордена Л-энлна и ордена Октябрьской Революции государственного унп -вэрситета им.Т.Г.Шевченко.

Научные руководители: член - корреспондент УААН,

доктор биологических наук, профессор БОЙКО А.Л.,

кандидат биологических наук НГУЭН ВАН УЕН.

Официальные опоненты: доктор биологических наук»

ДАСКАЛКК А.П.,

доктор биологических наук, профессор ВЕРДЕРЕВСКАЯ Т.Д.

Ведущее учреждение: Центральный республиканский

ботанический сад АН Украины.

Защита состоится " а О^Кги^о^ 1391 г.в/?ча< на заседании специализированвдго совету/012.06.01 при Инст1 туте физиологии растений АН Республики Молдова,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт физиологии растений АН РМ.

Адрес: 277018, Кишинев, ул. Лесная, 22

Автооефеоат разослан '/л___ 1991

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук КЛЕВЦОЗА 2.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теми. Создание системы методов культивированных растительных тканей и клеток является одной из первостепенных задач биотехнологии растений. Владея на высоком уровне этими методами исследователи могут эффективно применять современную технологию в работе селекции-линий, сортов, видов сельскохозяйственных растений, производства биологически активных веществ, в создании банков генов, работающих при пониженной температуре и др.

Биологические процессы, которые до определенного времени были объектом исследования в основном энзимологов, микробиологов, за последнее время получили широкое развитие среди физиологов, вирусологов и ботаников. Наряду с сохранением генофонда (штаммов микроорганизмов, видов растений) биотехнология вносит значительный вклад и в совершенствование производства по разработке процессов выращивания растений на безвирусной основе. Важнейшей.предпосылкой успешного культивирования культуры тканей и клеток растений является усовершенствование этих методов и технология. При этом особую значимость этих процессов необходимо правильно понимать для растений, многие из которых в основном размножаются вегетативным путем. При этом инфекционное начала болезней может быстро "мигрировать" от больного растения к здоровому. К таким растениям относится сахарный тростник и орхидеи.

Дель и задачи исследований. Основной задачей по теме являлась разработка технологии культивирования на беавирусной основе клеток сахарного тростника для селекционных целей и растений орхидей для производства.

Для реализации поставленной еадачи необходимо было провести следующие исследования:

- индукция каллусов из различных органов сахарного трост-

. ника и отбор здорового материала;

• исследование возможности регенерации целого растения из каллуса на безвирусной основе;

- разработка технологии изолирования одиночных клеток сахарного тростника из каллусов;

- разработка технологии культивирования одиночных клеток и оптимизация условий для нормального деления одиночных клеток, а также получения каллуса из них;

- разработка технологии регенерации целого растения сахарного тростника из одиночных клеток и орхидей из меристемы с целью получения безвирусного посадочного материала;

- создание Оиотехнологической модели для внедрений исследованных результатов в селекцию;

- изучение влияния аминокислот и их комбинации на рост и деление одиночных клеток сахарного тростника.

Научная новизна работы. Показана возможность регенерации сезвирусных растений сахарного тростника из каллуса й множественности пассажей, а такде разработаны новые методические подходы по селекции одиночных клеток. Усовершенствована технология получения здоровых растений орхидей из клеток меристемы.

Создана система культивирования клеток сахарного тростника для селекции. СХ5нарулены линии растений, которые устойчивы к • высокой концентрации аминокислот (лизина, треонина, метионина и их комбинаций). При этом доказана возможность получения мутационных клеточных линий, обладающих способностью суперпродукции одной или нескольких аминокислот.

Практическая значимость результатов. Проведена селекция клеточных линий сахарного тростника и получены мутантные клеточные линии с повышенным содержанием незаменимых аминокислот (Lys и Thr), что позволяет применить данную технологию к таким обедненным аминокислотами кормовым культурам, как батат и маниок. С помощью этой технологии возможно с этой же целью проводить селекцию клеточных линий риса.

Полученные данные могут быть использованы для получения здоровых растений сахарного тростника и орхидей.

Разработанная система культивирования сахарного тростника нашла применение в НШ экспериментальной биологии ( г. Хошимин). Модифшсация методов культивирования орхидей успешно используется в промышленном производстве орхидей во Вьетнаме, учебном процессе кафедры вирусологии Киевского госуниверситета им. Т. Г. Шевченко.

Апробация работы. Работа вьтгшена согласно государствен-

ной программе научных исследований Института экспериментальной биологии (ИЭБ) под номером 4901 и совместному договору кафедры вирусологии Киевского госуниверситета им. Т. Г. Шзвченко и Института экспериментальна^ биологии (г, Хошимин).

Работа докладывалась на конференциях Института экспериментальной биологии (ИЭБ) и совместных заседаниях ИЭБ и специалистов Академии Наук Республики Куба (г. Хошимин, 1Q82), а также тематических заседаниях по этим проблемам на кафедре вирусологии биологического факультета Киевского госуниверситета им. Т. Г. Шевченко.

Публикации. Основная часть диссертационной работы опубликована в 5-ти научных статьях.

На публичную вашиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработка и усовершенствование состава питательных сред для культивирования клеток и регенерации целостных растений сахарного тростника.

2. Разработанный технологический процесс культивирования клеточных суспензий и получение клеточных линий сахарного тростника, устойчивых к аминокислотам.

3. Получение беэвирусных регенерантов сахарного тростника иа каллуса и орхидей из меристематических клеток во множественности пассажей.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, об-вора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 главы), обсуждения, выводов, списка использованной литературы (131 источник, из них 108 зарубежных авторов). Работа изложена на 124 страницах машинописного текста и содержит 10 таблиц, 30 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Материалы и методы. В работе были использованы растения сахарного тростника (Saccharum officinarum L.). Тайваньский гибрид сахарного тростник; F-156 импортирован во Вьетнам в 1970 - 1677 г. г. Рост растений интенсивный, цветет редко, устойчивы к м=лезу и алюминию, процентное содержание сахара в растениях высокое (Tran Van Sol - 1980).

В экспериментах по получению безвирусного посадочного материала были использованы растения орхидеи (Dendroblum Lim Hepa). Таиландский вид орхидеи D. Lim Hepa импортирован во Вьетнам в 1060-1082 г. г. (Черевченко Т.М., 1986). Для исследования вирусов орхидей также использовались листья цимбидиума гибридного (Cyntudíum hybrldum) с ярко выраженными симптомами мо-ваичяостм и частичной некротизации.

Отбор растительного материала, пораженного вирусной инфекцией, проводили визуально. Количество больйых растений учитывали по трехбальной шкале (Бойко А. Л , 1976) для сахарного тростника на 1 м , для орхидей - по количеству больных растений в одном ряду. Для обнаружения и идентификации вирусов применили метод растений-индикаторов. Использовались растения Datura strara-nlum и Chenopodium siraranticolor (Кирай 3., 1974), а также с помощью электронной микроскопий методом негативного контрастирования (Проценко А. Е., 1066). В качестве контрастера использовали 27. раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты, pH 7,4 или 1.5Х водный раствор уранил-ацетата, pH 7,3. Исследования проводили при ин-птпументальном увеличении* микроскопа ЭМ-125, J ЕМ-1200 - 20-30 тыс.

Для быстрого обнаружения вирусов в.растительном материале использовали иммуно-ферментный анализ (dot-ELISA) (Гнутова Р.В., 1985). Для этих шлей применяли поликлональную антисыворотку к вирусу мозаики цимбидиума, полученную из НПО "Биолар", г. Олайне, Латвия, а также диагностикумы получены на кафедре вирусологии КГУ.

Выделение и очистку вирусов проводили методом дифференциального центрифугирования (Frowd S.A., 1977) и центрифугированием в градиенте плотности сахарозы.

Индукцию и получение каллуса осуществляли по методике Но V.J. и Vasll I.K. (1983). В работе использовали основную питательную среду Мурашиг-Скуга (Ш;:) (MS) в нашей модификации с

?

использованием комплекса витаминов Мореля (1667) (Mo) (Табл. I). Модифицированная среда обозначена нами как МЗ-Мо, которая использовалась во всех следующих экспериментах. Оценку влияния комплекса витаминов среды Ш и среды Kfc определяли через прирост каллуса и по его способности к регенерации.

Результаты регенерации целого растения оценивались по критерию Saka H. и Maeda Е. (1972).

Изолирование и культивирование одиночных клеток в жидкой и агаризованной среде было проведено по технологии Но V. J. и Va-sll I.K. (1983). Рост клеточной суспензии определился путем отбора пробы и подсчета клстэк в камере Горяева.

Влияние лизина (Lys), треонина (Thr), метионина (Met), го-мосерина (Нот) и их комбинации на рост каллуса, мальтишутов, сеянцев и одиночных клеток сахарного тростника определили по следующим критериям: - оценка влияния присутствующих аминокислот на рост каллуса (взвешивание свежей биомассы);

- оценка ингибирования роста сеянцев определялась измерением высоты растений, количества листьев, длины и количества корней;

- критерием оценки ингибирования роста мальтишутов являлась выживаемость;

- для одиночных клеток критерием оценки являлось соотношение образования каллусов к исходной плотности посева клеток -Platin? efficiency (Street H. Е., 1977).

Технология селекции клеточных линий сахарного тростника, устойчивых к обратному ингибированию была основана ж. работе Green С. Е. и Phillips R. L. (1974) , позволяющая выбрать комбинацию аминокислот в 2 мМ Lys + 2 m)-) Thr как системы селекции му-тантных линий по суперпродукции аминокислот в их числе Lys, Thr и Met. Клеточная суспензия рассеивалась на поверхность твердой питательной среды, содержащейся в чашках,'' Петри. Среда содержала 2 мМ Lys + 2 мМ Thr. Для поддерживания ¡/стойчивой характеристики выбранных линий каллуса (линия каллуса LT-2, которые выжили на среде, содержащей 2 мМ Lys + 2 мМ Thr) пассировали на среде без 2 мМ Lys + 2 мМ Thr ( LTO). Затем линии LT0 пересевал« на среду содержащую 2 ,Ш Lys + 2 мМ Thr. Линии LT2 и LTQ обозначены нами как LT (линия, устойчивая к Lys и Thr).

Таблица I.

Компоненты питательных сред Мурашиг-Скуга и Мэреля для культуры ткани и клеток растений

Компоненты среды

1

Макроэлементы

кЛ05 кС1г МгЗо^. СаС1.

Са( М0: кНгРО„

7Нг0 2Нг0

ъ'з. ■

4Н,0

Микроэлементы

Н$В04 Мп50„.

4И30

2НгО

гпБО. . 7Н„0

т

К1

МагМо04 СиЗо4 СоС1л А1СЦ Н1С12 ГвБО,

5Н30 бНгО

6На0 7Иг0

Иад - ЭДТА 6На0

Г$С1,

(В4)

Витамины Тиамин - НС1 Пиридоксин - НС1 (В6) Глицин

Никотиновая кислота

Концентрация мг/л

мз Мо

2 3

1Б50

1000

1900

1000

370 125

440

500

170 125

6.2 1

гг.з 0,1

8,6 1

0,83 0,01

0,25

0,025 0,03

0,025

0,03

0.03

27,8

37,2

1

0,1 1

0,5 1

2

0,5

р-

1

2

3

Са-пантотенат

Биотин

Мезоинозит

100

100

1

0,01

Сахар Сахароза

£0000

20000

Определение свободных аминокислот иа каллуса контрольных линий и линий LT2 и LT0 проводилось по методике Tompson S. 3. (1954), Sen N. Т. (1971) и Serry К. I. (1974) на аминокислотном анализаторе Beckman- Multiohrom В.

Полученные результаты экспериментов подвергали статистической обработке по Максимовой (1980).

Оценка технологических процессов культивирования ткани и одиночных клеток. Как показали исследования, каллус хорошо образовывался на питательной среде КБ-Мэ с 3 мг/л 2,4-дихлорофе-ноксиуксусной кислоты (2,4-Ю- При этом отмечено, что появляется два главных типов каллуса - рыхлый и компактный. Такая модификация среды для культивирования каллуса способствовала поддержанию его в компактном состоянии. При этом способность к регенерации сохранялась на протяжение 1,5-2 лет, в отличие от среды MS, на которой способность к регенерации терялась в основном через 7-8 месяцев.

Исследование по поддерживанию способности к регенерации каллуса имеет большое значение в длительный период селекции.

Наилучшей регенерационной средой являлась среда, включающая фитогормоны 3-индолилмасляной кислоты (ИМК) - 2 ыг/л и 5-бензиламинопирина (БАП) - 2 мг/л; ИМК - 2 мг/л и БАП - 1 мг/Л; 3-индолилуксусной кислоты (ИУК) - 1 мг/л, кинетин - 0,5 мг/л. однако отмечено, что эмбриогенез и регенерация растения лучше происходили с комбинацией фитогормонов ЩЛ + ВАП, чем с комбинацией НУК + кинетин. Исследованиями с рыхлым каллусом отмечено, что при этом не обнаруживается эмбриогенеза и органогенеза.'

В связи с тем, что компактный каллус имеет значительное преимущество в эмбриогенезе, его использовали в качестве исходного материала при получении одиночных клеток.

В экспериментах изолированиями культивирования одиночных клеток сахарного тростника на мдкой среде получили клеточную . суспензию.о большим количеством эмбрйогенных одиночных клеток. Клеточная суспензия хорошо росла в среде с добавкой 5 X кокосовой воды, G0 мг/л чргинина (Ars), 500 мг/л дрожжевого экстракта (ЛЭ), 2 мг/л г,4-Я и 2 сахарозы. На рисунке 1 показана динамика роста клеточной суспензии на жидкой среде. Для поддерживания суспензии в хорошем состоянии, их необходимо пассировать один раз в 3--Б дней.

Рис.1. Рост клеточной суспензии сахарного тростника на жидкой среде.

Показано, что оптимальной средой для деления, роста клеток и каллусообраэования ив ¡слеток являлась среда с. присутствием 2.4-Д - 0,25 мг/л. 3-4 X. сахарозы и 1 мг/л активированного угля. Этот результат выражался не только в общем соотношении образования каллуса из одиночных клеток, но и в соотношении его ти-

ПОЕ.

Каллусы, образующиеся из одиночных клеток, пересаживали на

А

о

г 4 <? в 'о время (день)

и

регенерационную среду, содержащую КМК - 2 мг/л и БАП - 1-2 мг/л или БАЛ - 0,2 мг/л и получили регенераты сахарного тростника.

Таким образом наш выполнена одна из главных задач нашей работы, т. е. создание системы методов культивирования каллуса, одиночных клеток и регенерация из них растений. Эта система методов отображена на рисунке 2. На .. .знове этой системы методов нам удалось продолжить селекционную работу.

Рис. 2. Культивирование каллуса, клеток и регенерация из них растений. 1 - растение; 2 - культивируемые молодые листья; 3 - каллус; 4 - клеточная суспензия; 5 - поддерживание клеточной суспензии; 6 - рост клеток в чашках Петри; 7 - регенеранты.

Исследование селекции клеточных линий сахарного тростника, устойчивых к аминокислотам. На основе полученных результатов о влиянии лизина, треонина, метионина, гомосерина и их комбинации на рост каллуса, сеянцев, мальтишутов и ка клетки сахарного . тростника отмечалась обегая реакция, которая выражалась в том, что их рост почти полностью ингибировался из-за присутствия в питательной среде комбинации 2 мМ Lys + 2 мМ Thr. Обратное ин-гибирование 2 мМ Lys + 2 мМ Thr нейтрализовалось при тюбавлеини в среду 0,2 мМ Mot или 0,4 мМ Нет. Такач реакция а'млоппша реакции, наблюдаемой Green С. Е. и Phillip R. L. (1971) у каллуса ;ï

ß

эмбриоидов кукурузы.

На основе полученных данных комбинация 2 МЫ Lys + 2 Ш Thr была выбрана как система дд^ селекции клеток сахарного тростника, устойчивых к аминокислотам.

После многократных последовательных экспериментов были получены 30 каллусных линий, способных нормально расти на среде, содержащей 2 мМ Lys + 2 мМ Thr. Частота появления устойчивых линий каллуса составляла 4*10" . Отмечено, что устойчивая способность сохранялась длительное время. Это выражалось в том, что после 3-х пасажай линия каллуса LT0 была проведена на сре- . ду, содержащую 2 мМ Lys + 2 мМ Thr, при этом рост каллуса проходил нормально ( рисунок 3.3), в отличие от контрольного каллуса (рисунок 3.1), пересаженного на вышеуказанную среду и погибшего (рисунок 3.2).

i I ■ ■ Г. ■■•> ' .. У' - ; " ,

tui ■ À--,

Рис.3. Рост ке£ллусов контрольной линии И ЛИНИЙ LT0.

1 - контроль на нормальной среде. 2 - контроль на среда с 2 мМ Lys + 2 мМ Thr. 3 - устойчивый каллус линии LTO на среде с 2 мМ Lys + 2 мМ Thr. При анализе содержания свободных аминокислот линии контрольного каллуса, линии LT2 и LT0 показал, что количество сво- . бодного лизина линии LT2 повышалось в 4,6 раз, количество свободного лизина линии LT0 повышалось в 4,1 раз. ,Зто свидетельствует о том, что количество свободного лизина линии LT увеличилось в общем от 4,1 до 4,0 раз по сравнению с контролем (рисунок 4).

мг

Рис.4. Содержание свободных аминокислот ;саллусов (мг, % свежего веса). ,

Этот результат совпадает с результатом, полученным Hibbert К. А. (1980; 1982) из линии каллуса, семян кукурузы, регенерирующего из клеточной линии, устойчивой к ингибированию Lys + Thr.

Оценка растительного материала сахарного тростника и орхидей на вирусоносительство. С помощью метода электронной микроскопии обнаружены и идентифицированы возбудители вирусных болезней сахарного тростника И орхидей. Из сахарного тростника выделен возбудитель мозаики сахарного тростника (нитевидный вирус, длиной около 600 нм, группа потивирусов - Potyvirus). Из орхидей с использованием ЭМ и ИФА идентифицированы возбудитель мозаики цимбидиума (нитевидный вирус, длиной около 450 нм, группа потекевирусов - Potexvirus) и вирус кольцевой пятнистости одон-тоглоссума, палочковидный, длиной около 300 нм (группа тобамо-

вирусов - Tobamovlriis), Результаты этих исследований подтверждались и другими вирусологическими тестами. Определен'круг восприимчивых растений-индикаторов для вирусов орхидей. Симптомы на листьях растений Datura stramonium L. и Chenopodlum amaranticolor появлялись на 8-12 день после инокуляции. Характер симптомов - светлые некротические пятна. Во всех случаях отмечено локальное поражение.

Для тестирования.вирусов орхидей применяли также иммуно-ферментный анализ (dot-ELISA) с использованием, в основном, коммерческой антисьшоротки. Положительная реакция с вирусами, выделенными из орхидей, свидетельствует о возможности их диагностирования с помощью данного метода.. Использование ступенчатого вирусологического контроля растительного материала сахарного трослшка и орхидей, позволило нам вести отбор здоровых растений. Как показали опыты, для размножения орхидей путем культивирования меристематических клеток необходимо создавать здоровые растениядоноры с последующим отбором иа них клеток инициации.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что оптимальной питательной средой для индуцирования и поддержания роста змбриогенного каллуса из здоровых растений сахарного тростника является среда с минеральными элементами МЗ - 1962, комплексом витаминов Мореля, добавкой 10% кокосовой воды,- 60 мг/л Arg, 2-3 мг/л 2,4-Д. 2% сахарозы, 6 г/л агара Difco и рН 5,6.

2. Впервые разработана и предложена оптимальная среда для регенерации целого растения сахарного тростника из каллуса, состоящая из основной среды МЗ-Мз с добавкой 10% кокосового молока. 50 мг/л Arg, 2 мг/л Ю,И и 1-2 мг/Л БАП, 27. сахарозы, ' б г/л агара Difco, 'применяемая при освещении 2500-3000 лк и температуре культивирования 26-28*0.

3.' Разработаны оптимальные условия для Поддержания клеточных , суспензий сахарного тростника в нормальном состоянии со следующие составами: питательная среда MS-to с добавлением Ь% кокосовой воды, БО мг/л Arg, 500 мг/л ДЭ, 2 wr/л 2,4-Д, 2Х

сахарозы. Установлено, что пассирование необходимо проводить каждые 3-5 дней с начальной плотностью 5 х 10 - 10 клеток/мл.

4. Подобраны условия культивирования клеточной суспензии сахарного тростника на питательной среде MS-Mo, содержащей 5Х кокосовой воды, 50 мг/л Аг?, 500 мг/л ДЭ, 0,25 мг/л 2,4-Д, 3-4 X сахарозы и 1 г/л активированного угля.

5. Установлено, что линии эмбриогенного каллуса, образующиеся из клеточной суспензии, хорошо регенерировались в целое растение на твердой питательной среде с 2 мг/л ИМИ и 1-2 мг/л ВАН

6. Получены клеточные линии LT, устойчивые к комбинации аминокислот при концентрации 2 мМ Lys + 2 мМ Thr, с повышенным содержанием свободного лизина в 4,1-4,6 раз. Разработана технология культивирования каллуса, одиночных клеток сахарного тростника и регенерация из них целого растения. Исследована селекция клеточных линий, устойчивых к аминокислотам, которая может быть модельной системой для дальнейшего изучения технологических процессов на других сельскохозяйственных культурах (рис, батат, маниок и др.)

7. Установлено, что верхушечные меристемы орхидей системно зараженные незначительным количеством вируса, могут в стерильно подготовленных средах давать начало здоровым растениям. В последующих опытах такие растения являлись безвирусными донорами для получения массовых регенерантов.

8. Получены безвирусные регенераты сахарного тростника /90 -100 7J из каллуса и орхидей /88-92 7./ из мерисгематических клеток, которые могут успешно использоваться в производстве.

По теме диссертации опубликованы следующие работы

1. Тх?й Суан Зу и Нгуен Ван Уен. Культивирование одиночных клеток в жидкой среде и регенерация целого растения табака из одной клетки. Доклады научной конференции. - 1977 г. в ШЩИ г. Хошимина. - С. 129-135.

2. Тхай Суан Зу и Нгуен Ван Уен. Культивирование одиночных кле-

тов сахарного тростника вида F_156 (Saccharum offlclnarum L. ) и батата (Ipomea batatas). Регенерация целого растения сахарного тростника из одиночных клеток. Доклады 1-ой конференции всей страны о культуре ткани и клеток растений для слуизЗ'ы селекционной работы сельскохозяйственных культур в Вунг Tay в 1980 г.

3. Тхай Суан Зу. By Ыи Льен и Нгуен Ван Уен. Вегетативное размножение сахарного тростника методом культивирования ткани и клеток растений. Журнал науки и сельскохозяйственной технологии. - 1983, No 6. - С. 258-264.

4. Тхай Суан.Зу и Нгуен Ван Уен. Регенерация сахарного тростника вида F_156 из одиночных клеток. В кн. : Культура ткани для службы селекционной работы культур. Изд. г. Хошимина. - 1983. •- С. 112-118. '

5. Du X. Thal. Van V.Tran, T.S.Tran. Suong К. Ngo et Uyen

Y. Mguyen. Composition en proteínas et en acides amines des cellules de canne a sucre d'dne lignes tolérants a un milieu riche en lysine, et en threonine. Can. J. Plant Sel. - 1989. -69. - P. 265-269.

Заказ 4С0,т»р.1ОО.Уч.Т1ш. KtV, 1801г. Kaes-17,Булымр Шеачаюц), H,