Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Особенности производства безвирусного посадочного материала земляники и малины в ЦЧР

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Особенности производства безвирусного посадочного материала земляники и малины в ЦЧР"

МИЧУРИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

Х -* \

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

ЛУКЬЯНОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ПРОИЗВОДСТВА БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ЗЕМЛЯНИКИ И МАЛИНЫ 3 ЦЧР

Специальность 06.01.07 - плодоводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МИЧУРИНСК-1998

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно -исследовательском институте садоводства им. И. В. Мичурина в 1991 - 1997 гг.

Научный руководитель - кандидат сельскохозяйственных наук

Н.П. Семина

Официальные оппоненты - доктор сельскохозяйственных наук

А.А. Зубов

Кандидат биологических наук Ю.Н. Приходько

Ведущее предприятие - Россошанская зональная плодово-

ягодная опытная станция

Защита диссертации состоится 1998 года

в час. /¿?мин. на заседании диссертационного совета Д. 120.18.01

по адресу: 393740, Тамбовская обл., г. Мичуринск, ул. Интернациональная, 101 Мичуринская государственная сельскохозяйственная академия,

С диссертацией можно ознакомится в библлиотеке академии. Автореферат разослан '' '' 998 г.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные и Офепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д. 120.18.01, кандидат сельскохозяйственных наук, доц&нг^^

Ю. В. Трунов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Центральное Черноземье Российской Федерации - благоприятная зона для возделывания таких культур, как земляника и малина. Богатое содержание полезных веществ и высокие вкусовые качества ягод способствуют их повсеместному распространению и широкому использованию в пищевых и лечебных целях.

В настоящее время спрос населения на продукцию данных культур полностью не удовлетворяется. Наметилась тенденция к снижению производства ягод, что в значительной мере обусловлено ухудшением экономического состояния сельского хозяйства, процессами его дезинтеграции. В результате наблюдаются нарушения технологии выращивания посадочного материала, отсутствует система контроля за его качеством.

Стихийный характер производства и реализации, межрегиональный межгосударственный обмены нетестированными растениями способствовали широкому распространению вирусных заболеваний. Размеры потерь, причиняемые фитовирусами, достигают 5391% и характеризуются снижением биологической продуктивности, ухудшением качества продукции, сокращением сроков эксплуатации насаждений (Кеглер, Вердеревская, 1986; Converse, 1977-1990; Семина и др. 1995-1996; Приходько, 1997). В связи с этим весьма актуален перевод ягодоводства на безвирусную основу.

Теоретической базой для промышленных технологий выращивания безвирусных сортов земляники и малины являются современные достижения вирусологии. Использование новейших научных разработок позволяет в значительной степени повысить эффективность возделывания этих культур.

Анализ зональных особенностей распространения и патогенеза фитовирусов, оптимизация методов их диагностики, изучение способов оздоровления растений остаются актуальными в настоящее время. Это и явилось основанием для проведения нами исследований в условиях ЦЧР.

Цель и задачи исследований Совершенствование элементов технологии производства безвирусного посадочного материала земляники и малины в условиях ЦЧР с целью повышения ее эффективности.

В задачи исследований входило:

► Определить видовой состав, установить доминирующие вирусы и типы их сопряжения на землянике и малине в условиях ЦЧР, выявить фенотипические особенности инфицированных растений.

► Изучить естественные пути циркуляции сокопереносимых вирусов в антропогенных биоценозах.

► Оптимизировать экспресс-метод (ИФА), с целью повышения эффективности индикации вирусов земляники и малины.

► Дать сравнительную оценку хозяйственных признаков здоровых и инфицированных растений в условиях ЦЧР.

► Изучить различные способы оздоровления растений.

► Выделить в банк ССЭ безвирусные клоны сортов земляники и малины с целью дальнейшего размножения и закладки безвирусных маточников.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые в условиях ЦЧЗ осуществлена массовая экспресс-диагностика экономически значимых сокопереносимых вирусов малины и земляники. Обследованы насаждения земляники и малины различных категорий качества общей площадью 117,6 га. Отобраны и протестированы методом иммуноферментного анализа 1345 образца земляники и 979 образца малины. В банк ССЭ выделено и передано на размножение в НПХО ВНИИС им. ИВ.Мичурина и базовые хозяйства более 1500 безвирусных клонов обеих культур. Изучено влияние сокопереносимых вирусов на продуктивность земляники и малины. Оптимизирована методика ИФА, определены органы растений с максимальной концентрацией активных вирионов НЕПО - вирусов и ВТМ. Проведено сравнительное изучение эффективности использования моноклональных антител и поликлональных сывороток к вирусом AM и ОМ. Выявлены наиболее характерные для земляники и малины комплексные и смешанные инфекции. Подтверждена целесообразность термообработки корневых черенков малины. В условиях in vitro на землянике проведено испытание 3 антивирусных препаратов (биназа, барназа, никотиновая кислота).

Апробация работы Основные положения данной работы шожены на отчетных сессиях и заседаниях ученого совета ВНИИС им. В.Мичурина; Научном совещании в Воронежском СХИ " Экология и юмышленное садоводство и овощеводство Воронеж, 1996 г.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 :чатных работ.

Объем и структура диссертационной работы юсертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит введения, 7 глав, выводов, предложений производству, содержит 28 блиц и 25 рисунков. Список литературы состоит из 282 наименований, в м числе 97 - зарубежных авторов.

Материалы, методы и условия проведения исследований

Исследования проведены в 1991-1997 гг. на базе лаборатории русологии ВНИИС им. И.В.Мичурина, а также в насаждениях мбовской, Липецкой, Воронежской и Курской областей.

Основными объектами исследований являлись безвирусные и [фицированные НЕПО-вирусами: латентной кольцевой пятнистости мляники (strawberry latent ring spot virus, SLRV), черной кольцевой тнистости томатов (tomato black ring spot virus, TBRV), кольцевой тнистости малины (raspberry ring spot virus, RRSV), арабис мозаики •abis mosaic virus, AMV); ТОБАМО-вирусом табачной мозаики (tomato ick ring spot virus, TMV) и КУКУМО-вирусом огуречной мозаики icumber mosaic virus, CMV) растения земляники и малины.

Идентификацию вирусов проводили методом

¡муноферментного анализа (ИФА) по сэндвич- варианту (М. Clark, А. lams, 1977). Регистрацию результатов фиксировали на автоматическом сорциомере "Dinatech" при длине волны 492 нм. Степень заражения разцов определяли по отношению экстинкций тестируемого объекта к :тинкциям безвирусного контроля (Эо/Эк). Использовали агностические наборы, предоставленные Институтом микробиологии iH, кафедрой вирусологии МГУ им. М.В. Ломоносова, Институтом оорганической химии РАН.

Для стабилизации инфекционности вирусов в инокулюме при проведении ИФА использовали поливинилпирролидон (ПВП, м.в. 1000, "Serva") и 1% бычий сывороточный альбумин (м.в.67000,"Serva") в фосфатном буфере, РН 7,5.

Биотест на травянистых растениях - индикаторах (Chenopodium quinoa L.,.Nicotina tabacum L., Cucumis sativus.) проводили по стандартной методике Кпяйнхемпеля (Kleinhempel, 1968). С целью стабилизации вирусов в соке растений применяли никотиновое основание (м.в.162.2, "Serva") и поливинилпирролидон (ПВП, м.в. 10000, "Serva"). Для анализа одного образца использовали от 3 до 10 индикаторных растений.

Вредоносность НЕПО - вирусов определяли путем учета вегетативной продуктивности здоровых и зараженных растений на землянике сорта Редгонтлит, малине сортов Яркая, Алый парус, Новость Миколайчука, Метеор, Бабье лето согласно "Программе и методике селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур" (Мичуринск, 1980). Оценку влияния вирозов на урожайность земляники проводили методом подсчета количества завязей и средней массы ягоды.

Вегетационные опыты были заложены по методике, принятой для стран СЭВ, изложенной в "Рекомендациях по выращиванию плодово-ягодных культур и винограда" (М., Колос, 1980) и "Технологии производства посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда" (М.,1989).

Для оздоровления корневых черенков малины и земляники ин витро от вирусов ЧКПТ, КПМ, ЛКПЗ использовали суховоздушную терапию при 37°-38°.С Термообработку проводили в условиях in vivo. После экспонирования корневые отпрыски малины высаживали в глиняные горшки, помещенные в открытый грунт, после чего неоднократно тестировали.

Меристематические верхушки земляники культивировали in vitro на среде Мурасиге и Скуга по Высоцкому (1976), Туровской (1991) и др. В качестве антивирусных препаратов использовали никотиновую кислоту, биназу, барназу. Вироциды стерилизовали с помощью бактерицидных фильтров с микропорами 0,05 мкр. Препараты вводили в питательные среды на этапах вычленения и пролиферации. Полученные регенеранты адаптировали к нестерильным условиям и тестировали.

Обоснованность и достоверность результатов исследований подтверждается достаточным объемом исходного материала. Обработку данных и оформления результатов осуществляли с применением компьютерных программ Microsoft Word и Microsoft Excel, а также по "Методике полевого опыта" Б. А. Доспехова, (1979). 6 ----

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Видовой состав сокопереносимых вирусов земляники и малины и характер их распространения в ЦЧЗ. В результате маршрутных обследований маточных, коллекционных, селекционных и плодоносящих насаждений Тамбовской, Липецкой и Воронежской областей, проведенных в 1991 - 1997 гг., а также массового тестирования методом ИФА 2324 образцов земляники и малины выявили повсеместное

распространение вирусных заболеваний. Использование серологического метода позволило идентифицировать вирусы различных таксономических групп: НЕПО, КУКУМО, ТОАМО, КЛОСТЕРО. Установили доминирующую роль НЕПО патогенов. В начале вегетационного периода их можно было идентифицировать визуально по наличию хло-Рис.1.Вирус кпм на землянике ротичных и желтоватых пятен на листьях, мо-(сорт Редгонтлит) рщинистости листовой пластинки (рис.1). Из представителей данной таксономической группы преобладают вирусы ЧКПТ, КПМ, ЛКПЗ (таб.1). Первоисточником заболеваний являются, как правило, зараженный посадочный материал, особенно на селекционных и сортоиспытательных участках (таб. 2.1,2.2)

1 .Видовой состав сокопереносимых вирусов малины и земляники в ЦЧР

(данные 1991-1997 гг.).

Вирус Группа Метод иедегсац ии Распространенность*

Маг »на Эемтоиа

Кшьцгваяпяшилосп. малины (кпм) НЕПО Ш>А.О«)роА1и эжщ№сйапа ЙеогцйиззАб \iijiis 5-33 10-40

Лаггентшя галшегая ПЯ1НИЯ0С1ЪЭеМЛЯНИКИ(ЛКЩ) НЕПО ИОДОвгроДт злтщОхитв Яме 15-28 21-32

Чергая кольцевая ПШйСГОСПЛОШГОВ (ЧКГП) НЕПО ИФА,Оигро4гп ¡^¿тдЙежАб 3-28 10-25

Арабис мазаика<АМ) НЕПО ИФА, ОтегсроАт зпщ Оштс ЯМ8 2-35 14-28

Табачгая мозаика(Ш) ТОБАМЭ ИФА,Овпсро4т <5*гд Мхйгга йЬват 8-25 10-30

Огуречная мозаика (ОМ) КУКУМЭ ИФД ОтраДт длта, Оюпв 83МБ 1-7 1-5

Хлоротическая пягшсгосгь листьев яблони* (хпля) клос-тего ИФА, ОнгсроАт джт 1-2 -

* Вирус идентифицирован совместно с научным сотрудником ВНИИС им.

И.В.Мичурина Цукановой Е.М. 7

2.1. Зараженность сортообразцов земляники сокопереносимыми вирусами в обследованных насаждениях ЦЧР

(данные ИФА1992-1997 гг.)

I ОБЛАСТЬ I РАЙОН ХОЗЯЙСТВО Типы насаждений Обследова нная площадь, га Общее количество тестируемых сортов, шт. Число анализируемых образцов, шт. Заражено, % Не заражено, %

ТАМ BCK, 50- МИЧУРИНСКИЙ нпхо, ОПХВНИИС им.И.В.Мичурина TOO им. И.В Мичурина ТОО Зеленый Гай г. Мичуринск ССЭМ; ЭМ; СУ; КУ; УС, ПП М; ЭМ М, ЭМ, ЧП 1,02 3,20 6,00 1,00 1.01 5 6 3 1 6 113 230 154 9 98 8 52 25 26 45 92 48 75 74 55

ТАМБОВСКИЙ ТОО Ягодный г. Тамбов ПП;ЧП ЭМ ЧП 73,02 3,00 0,02 7 2 2 355 100 55 52 28 53 48 72 47

КУРСКАЯ ОБОЯНСКИЙ Обоянь чп 0,03 3 15 33 67

ЛИПЕЦКАЯ ЛИПЕЦКИЙ г. Липецк чп 0,03 3 10 10 90

ЛЕБЕДЯНСКИЙ too Агроном ЭМ 5,00 8 80 12 88

ВОР НЕЙ KA 0-СС-Я РОССОШАНСКИЙ Россошанская зональная плодово-ягодная станция КУ, чп 0.03 0,02 2 2 40 20 36 10 64 90

КАЛАЧЕ-ЕВСКИЙ too Нива ПП 6.00 3 55 43 57

ПАВЛОВСКИЙ г. Павловск ЧП 0,03 2 20 42 58

Примечание: ССЭМ - супер-супер элитный маточник; ЭМ - элитный маточник м - маточник 1 репродукции; КУ - коллекционный участок

СУ - селекционный участок; УС - участок сортоизучения; ПП - плодоносящая плантация; чп-частная плантация

2.2. Зараженность сортообразцов малины сокопереносимыми вирусами в обследованных насаждениях ЦЧР

(данные ИФА 1992-1997 гг.)

ОБЛАСТЬ РАЙОН ХОЗЯЙСТВО Типы насаждений Обследова иная площадь, га Общее количество тестируемых сортов, шт. Число анализируемых образцов,шт. Зараж ено, % Не заражено, %

ТАМБОВСКАЯ МИЧУРИНСКИЙ ТАМБОВСКИЙ нпхо вниис им.и.в.Мичурина г. Тамбов тоо Ягодный тооЖердевский М; ШМ; КСУ ПП ПП 5,20 0,05 3,00 2,00 28 2 1 3 709 12 15 30 28 67 53 37 72 33 47 63

ЛИПЕЦКАЯ ГРЯЗЕНСКИЙ г. Грязи г. Липецк г. Усмань ЧП ЧП ЧП 0,05 0,03 0,02 2 1 1 20 21 15 61 60 45 39 40 55

ВОРОНЕЖСКАЯ РОССОШАНСКАЯ Россошанская зональная плодово-ягодная станция ЧП ПП 0,04 0,7 2 2 14 20 10 32 90 68

КАЛАЧЕЕВ- ский тоо Нива г. Павловск п. Кантимировка ПП ЧП ЧП 7,04 0,02 0,01 10 4 1 73 40 10 52 10 10 48 72 60

Примечание: сэм - суперэлитный маточник; м - маточник; КСУ - коллекционно-селекционный участок; пп - плодоносящая плантация; шм - школка малины; чп - частная плантация.

Вирусологический анализ инфицированных растений земляники и малины позволил констатировать: изучаемые в ЦЧР вирусы на обеих культурах чаще встречаются в виде комплексов. Из 2324 протестированных методом ИФА растений земляники и малины 724 оказались инфицированными, в том числе 143 из них - одиночными вирусами и 582 - комплексами, что составляет 20% и 80% соответственно от общего числа зараженных (таб.3).

3. Моновирусная и комплексная инфекции на землянике и малине в ЦЧЗ (данные 1992-1997 гг.)

КУЛЬТУРА КОЛИЧЕСТВО ТЕСТИРУЕМЫХ РАСТЕНИЙ, шт. ЗАРАЖЕНО

ВСЕГО ОДИНОЧНЫМИ ВИРУСАМИ КОМПЛЕКСАМИ

ШТ. % шт. % ШТ. %

ЗЕМЛЯНИКА 1345 344 26 55 16 289 84

МАЛИНА 979 381 39 88 23 293 77

ВСЕГО 2324 725 32 143 20 582 80

F4>=1>FO,05=O,O5

Наиболее характерным для ЦЧР сопряжением на землянике и малине является бикомплекс КПМ + ЧКПТ. На землянике он может вызывать хлоротическую пятнистость листьев, на малине - симптомы курчавости. Результаты статистической обработки многолетних (19921997) данных тестирования с 95% вероятностью свидетельствуют о преобладании данного комплекса вирусов над вирозами, вызванными моновозбудителями КПМ и ЧКПТ. Верхние и нижние границы доверительных интервалов в вариантах с одиночными вирусами не пересекаются с границами доверительного интервала комплекса ЧКПТ + КПМ, что позволяет констатировать его большую распространенность (таб.4).

На малине в ТОО "Жердевка" Тамбовской области совместно с Н.П. Семиной и Е.М. Цукановой идентифицировали вирус ХПЛЯ в составе комплексов: ХПЛЯ+ЧКПТ+КПМ+АМ, ХПЛЯ+ЧКПТ, ХПЛЯ+ ЧКПТ+КПМ. Доля смешанных инфекций на малине от общего числа комплексов составила 10%.

4. Частота встречаемости вирусов КПМ и ЧКПТ и их комплекса на землянике и малине

КУЛЬТУРА ЗЕМЛЯНИКА МАЛИНА

ВАРИАНТЫ КПМ ЧКПТ чкпт-н<пм КПМ ЧКПТ чкпт+кпм

"£ % от числа инфицированных 23,0 33,0 44,0 25,0 26,0 49,0

О 2,1 2,9 2,2 1,9 1.1 1,6

1р=0.95 4,0 5,6 4,1 4,1 2,4 4,0

1ру 27,5 38,5 47,9 29,3 38,5 53,6

1рп 19,5 27,3 39,6 21.1 23,2 45,0

- среднеквадратичное отклонение 0.95 - доверительный интервал I - верхняя граница доверительного интервала 1 - нижняя граница доверительного интервала

Влияние экологических факторов на развитие очагов грусной инфекции земляники и малины Анализ степени

оявления симптоматики у зараженных растений свидетельствуют о ачительном влиянии погодных условий на характер течения болезни. В ды с низкими среднесуточными температурами воздуха (1993, 1994 гг.) блюдали большое разнообразие симптомов: мозаики, хлорозы, тнистости, некротические поражения и проч. При повышенных еднесуточных температур воздуха (1991, 1995гг.) процессы накопления фекции замедляются и заболевания носят, как правило, латентный ха-ктер. Исключение составляют анатомические изменения: морщи-стость, листовой пластинки, карликовость и др., которые сохраняются в чение всего онтогенеза.

Аналогичная закономерность прослеживается и в течение одного гетационного периода. С наступлением высоких температур наблю-ется маскировка большинства симптомов, а осенью, в связи с похо-данием происходит возвратное накопление активных вирионов в тканях стений, в результате чего многие симптомы появляются вновь (рис. 2).

Применение серодиагностики позволило фиксировать личественные изменения концентрации вирусов в растениях. Результаты ализа сезонных флуктуаций свидетельствуют об уменьшении роположительных экстинций до 0,245. При этом отношение нижнего рога экстинций может достигать 1,8. .

В большей степени этим процессам подвержены верхние сти растений, находящиеся под прямыми лучами солнечного света и

11

страдающие от термического воздействя. Так, у малины листья верхнего яруса куста с наступлением жары теряют симптомы хлороза, вызываемые НЕПО вирусами, а листья нижнего яруса, находящиеся в затененном состоянии, менее подвержены подобным изменениям (рис. 3).

Эо/Эк

»густ

сентябрь

-•«■•-Эо/Эк Сроки тестирования

Рис. 2. Динамика экстинций в ЕЫБА-тесте на ВЛКПЗ и ВКПТ в зависимости от колебаний температуры воздуха

Эо/Эк (•а)

■„^.эд^Ьпь^ч,.^...............................

-«.-г-1-*

I 1.1 11111 I I

I май

..¿-мюль

-I—I—I—I—1—I—I—I—I

верхние

нижние Сорторбраэцы, шт.

Рис. 3 . Относительная концентрация активных вирионов в листьях малины с верхнего и нижнего ярусов куста----------——

Наблюдения за характером распространения инфекции внутри насаждений свидетельствуют о том, что этот процесс происходит, как правило, за счет уже имеющихся очагов болезни. Скорость накопления инфекции достаточно высока и составляет от 4,5 до 40,6 % в год.

Большую роль в циркуляции вирусов в агробиоценозах играют сорные растения - резерваторы сокопереносимых вирусов. Тест методом ИФА позволил выявить растения 12 семейств, являющихся природными хозяевами изучаемых нами патогенов. Среди них : сложноцветные, подорожниковые, вьюнковые, злаковые, амарантовые, молочайные, гречишные, лютиковые, маревые, крестоцветные, бобовые, крапивные. В числе выявленных растений преобладают представители семейства сложноцветные: мать-и мачеха, полынь горькая, лопух малый, амброзия полынолистная, ромашка непахучая, чертополох, пижма обыкновенная и другие.

Оценка вредоносности вирусных болезней земляники и малины. Известно, что влияние фитовирусов на растительные

объекты носит, как правило, редукционный характер (ВохиБ, 1984; Сопуеге, 1990 е1 а!.). С целью оценки вариабельности воздействия моновирусов изучали влияние ЛКГ13, ЧКПТ, АМ, КПМ на биологическую продуктивность земляники сорта Редгонтлит.

Получены данные о снижении энергии усообразования у зараженных вирусами растений на 6-40%. Наиболее вредоносны по данному параметру ЧКПТ, КПМ, ТМ. Вирус Ам в меньшей степени воздействует на рост и формирование усоплетей. Однако, столоны больных растений, как правило, в 1,5-2 раза короче и тоньше по сравнению со здоровыми.

Влияния вируса ЛКПЗ на процесс усообразования не наблюдали. Разница с безвирусным контролем в данном варианте была несущественна (рис.4).

Количество розеток на одном маточном растении у инфицированных клонов было на 5-37% меньше, чем в безвирусном контроле. Наибольшее влияние при этом наблюдали при заражении вирусами ЧКПТ, КПМ, ВАМ.

Общее количество получаемых от маточного куста сформированных розеток у инфицированных растений снижается на 1040%. Наиболее вредоносными являются ВТМ (до 75%), ВКПМ (до 74%), ВАМ (69%), ВЧКПТ (до 60%). .

□ Кхтрогь

ВВПКПЗ

ВЕМКПГ

■ ВКГМ

■ ВТМ

□вдм

Пфамяры цхзгфтожссг

В течение ряда лет (1995 - 1998 гг.) изучали влияние вирусных инфекций на урожайность земляники сорта Редгонтлит. Сравнительный анализ показал, что по количеству образовавшихся завязей наибольшую степень угнетения по сравнению с здоровым контролем вызывают вирусы ЧКПТ (79%), ТМ (73%), ЛКПЗ (70%), АМ (67%). ВКПМ оказывает несущественное влияние на число завязей. Его вредоносность в этом опыте составила 5%.

Масса ягод у всех инфицированных растений существенно уменьшилась по сравнению с контролем. Наиболее мелкими были ягоды в варианте с вирусом ЧКПТ. Снижение их массы достигало 25% по отношению к безвирусным. ВТМ способствовал уменьшению массы ягод до 34%, а вирусы ЧКПТ, КПМ и АМ - до 55; 42; 47% соответственно (рис.4).

На малине угнетение биологической продуктивности под влиянием поливирусной инфекции наблюдали в 1993-1995 гг. С целью выявления сортовых особенностей в восприимчивости НЕПО возбудителей в опыт были включены пять районированных сортов малины: Яркая, Бабье лето, Новость Миколайчука, Метеор, Алый парус, зараженных сопряженной инфекцией. В состав вирусного комплекса входили: ВЧКПТ, КПМ, АМ, ЛКПЗ. Полученные данные позволяют констатировать многофакторность влияния вирусных инфекций на' жизнедеятельность растений. Степень и характер вредоносности зависит как от особенностей воздействия патогена, так и от сортовых различий в реакции растений на его вмешательство. Так, у инфицированных растений сортов Яркая, Бабье лето, Новость Миколайчука наблюдали существенное снижение вегетативной продуктивности. Среднее число побегов у этих сортов уменьшилось по сравнению с безвирусным контролем на 29-39%, а их высота на 27-43% была короче, чем у здоровых.

У зараженных растений сорта Метеор количество корневых отпрысков практически не уменьшилось по сравнению со здоровыми растениями. Однако, их длина была значительно меньше, чем длина побегов здоровых растений того же сорта, и достигала 0,3 - 0,7 м.

Незначительное влияние изучаемого комплекса на число отросших корневых отпрысков наблюдали также у малины сорта Алый парус. Разница с контролем у данного сорта составила 8 - 15%. Однако, этот факт нивелировался снижением энергии роста побегов инфицированных растений по сравнению с контрольными (рис.5).

1,8 - 20

^ркая Альй парус Метеор Бабье пето Новость

МиоолаЬцка

5. Влияние НЕПО вирусной инфекции на биологическую продуктивность малины (данные 1993-1995 гг.)

Оптимизация экспресс-диагностики вирусов земляники и малины. С целью повышения эффективности ИФА при идентификации вирусов земляники и малины оценивали содержание активных вирионов в различных органах растений (молодых и старых листьях, цветках, завязи и плодах). Полученные данные свидетельствуют: максимальная локализация изучаемых вирусов в молодых листьях. В старых листьях содержание антигенов, достаточное для ферментативной реакции с субстратом, наблюдается сравнительно редко - 25 - 38%. Вирусы КПМ, АМ и ТМ успешно идентифицируются также в зрелых плодах. В ягодах земляники достоверно диагностировать можно только антигены вируса ЛКПЗ.

Для повышения эффективности специфической реакции антигена и сыворотки в составе экстрагирующего буфера использовали поливинилпирролидон ( 2-4%). Тестируемый антиген вносили в лунки микроплат, предварительно подготовив вируссодержащий раствор стандартным и упрощенным способами:

• в виде сулернатанта после центрифугирования в течение 10 минут со скоростью 40 оборотов в минуту (стандарт);

• при механическом отжатии тестируемого образца, гомо-генезированного с экстрагирующим буфером (упрощенный метод).

Полученные результаты анализов обоих вариантов идентичны. Совпадение результатов составило 99,9% Дисперсионный анализ с использованием И-критерия подтвердил отсутствие разницы между выборочными средними (Рфакт. < р0,05). Подобный способ приготовления инокулюма позволил сэкономить время и затраты труда на проведение теста.

Серией опытов изучили возможности применения моноклональных антител (МКА) для диагностики вирусов АМ и ОМ в полевых образцах. Полученные данные свидетельствуют о превышении сенсибилизирующей активности МКА по сравнению с таковой при использовании лоликлональных сывороток (ГТКС). Однако, диагностические возможности ГТКС в 2-3 раза выше, чем МКА, поскольку позволили выявить большее количество инфицированных растений (рис. 6).

выявлено зараженных, шт.

□ поликлон. ■ моноклон.

6. Эффективность идентификации вирусов АМ и ОМ при использовании двух тест-систем

20

15

10

А"*"*' >

9— *

* * *. т

10 20 Рис.7. 1. Количественная характеристика побегообразования корневых черенков малины в процессе термотерапии

Дни

-в - - Награда

-•А- Новость Кузьмина

- -ж—-88-93 х 7-1

-Сигма

-Барнаульская -79-86

Способы оздоровления инфицированных растений

Нами осуществлена комплексная работа по изучению методов оздоровления земляники с использованием суховоздушной термотерапии, культуры мерисгематических верхушек и хемотерапии in vitro. Исследования проводились на вирусных штаммах ЦентральноЧерноземного региона России.

С целью выявления возможности оздоровления от вирусов черной кольцевой пятнистости томатов и кольцевой пятнистости малины в 19911993 гг. проводили термотерапию корневых черенков малины, инфицированной комплексом ВЧКПТ+ВКПМ. Изучали сорта: Награда, Сигма, Барнаульская, Новость Кузьмина, гибриды селекции ВНИИС им. И.В.Мичурина 88-93 х 7-7 и 79-83.

Установлена различная степень термоустойчивости сортов. Наиболее подвержены к воздействию повышенных температур Новость Кузьмина и Барнаульская. После 20 дней обработки наблюдали остановку роста и угнетение. Сорт Сигма в течение всего периода термотерапии отличался хорошей силой роста и достаточно высоким коэффициентом размножения: из 5 корне-вых черенков длиной 12-15 см. выросло 19 побегов размером 15 - 20 см (рис. 7.1.).

Результаты тестирования прогретых растений позволяют констатировать отсутствие вирусов в верхушках побегов, отросших в условиях повышенных температур. Более длительные наблюдения за побегами в условиях, традиционных для вегетации (t<37°C) свидетельствуют о накоплении, сохранившихся в черенках, вирусных частиц и системному распространению инфекции.

Многочисленные тесты полученных после микроразмножения инфицированных растений свидетельствуют о том, что меристематические верхушки часто содержат вирусы, концентрация которых ниже порога чувствительности ИФА (Эо/Эк<1,8). В процессе субкультивирования происходит размножение и распространение вирусов в некоторые части эксплантантов. В результате часть микропобегов оказываются зараженными. Это обстоятельство обуславливает необходимость дополнительных мероприятий в процессе микроразмножения для оздоровления инфицированных растений.

В1991-1993 гг. применяли метод термотерапии in vitro для эксплантантов земляники сортов Трубадур, Фестивальная, Источник, зараженных вирусами ЛКПЗ и ЧКПТ.

Результаты исследований, позволяют констатировать достаточную эффективность термообработки земляники in vitro с целью оздоровления от вирусов ЧКГГГ, ЛКПЗ и их комплекса.

При температуре 37°С и продолжительности обработки 24 дня, оздоровление растений произошло на 79-85 %, в то время как, в контрольном варианте без термотерапии доля безвирусных растений составила 44 - 52 %.

Следует отметить, что полученные после оздоровления регенеранты целесообразно рстестировать через 12 месяцев после их адаптации, поскольку низкая концентрация вирусов в ткани в более раньие после культивирования сроки не обеспечивает достоверность их диагностики.

Альтернативным методом оздоровления является хемотерапия in vitro. Впервые испытывали препарат Bacillus amylologuefaciens, получивший комерческое название "барназа".

Антивирусную активность РНКаз и никотиновой кислоты (НК) к ВЧКПТ, ВКПМ, ВЛКПЗ изучали в концентрациях: барназа -5,10,25 мкг/мл; биназа -10,25,40 мкг/мл; НК -1 х 10"3 Моль, 2 х 10"3 Моль.

Результаты экспериментов позволяют констатировать, что для повышения эффективности вироцидных свойств РНКаз предпочтительнее использовать жидкие питательные среды. Поскольку длительные сроки культивирования эксплантантов без агара могут вызвать явления витрификации, содержание их на жидкой среде целесообразно осуществлять не более 12-14 дней.

Наибольший эффект получен при использовании РНКаз в концентрации 25 мкг/мл (таб.5). Их применение в данной концентрации гарантирует высокий процент оздоровления и освобождает от возможных негативных влияний вещества на развитие регенеранта.

НК сама по себе не обладает достаточным вироцидным эффектом для изучаемых вирусов. Ее применение более оправдано в сочетании с ингибиторами, воздействующими на иные аспекты репродуктивной активности патогенов.

Ввиду возможного накопления остаточной инфекции окончательный тест после хемотерамии следует проводить не ранее, чем через год после адаптации

5. Ингибирующее влияние биназь1 и барназы на вирусы земляники Накопление инфекции после хемотерапии (Усредненные данные 1991-1994 гг.)

ВАРИАНТ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИРО-цидов. мкг/мл Количество здоровых растений, % X Э 492 образцов

Время теста

Через месяц после адаптации Через год после адаптации

лкпз кпм чкпт лкпз кпм чкпт Сероотрица-тельных Сероположи-тельных

Биназа 10 70 75 89 67 70 82 0,203 + 0,013 0,408^0,025

25 92 86 95 85 80 88 0,198+0,020 0,392+0,027

40 100* 90* 100* 90 80 94 0,228+0,018 0,417 +.0,031

Барназа 5 82 94 92 88 80 87 0,213 + 0,017 0,385+0,018

10 90 100 85 84 92 80 0,231 +0,018 0,4051.0,032

25 94 97 93 85 90 88 0,225+0,022 0,397 + 0,021

КОНТРОЛЬ - 58 55 50 52 48 45 0 0,539+0,027

* - Высокая степень витрификации, низкий процент адаптированных растений

ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА

ЗЕМЛЯНИКИ И МАЛИНЫ.

Уровень развития ягодоводства зависит от производительности маточников, обеспечивающих потребность хозяйств в высококачественном посадочном материале.

Согласно Федеральной программы развития садоводства России, для восстановления площадей под насаждениями плодовых и ягодных культур с 1993 по 2000 год необходимо ежегодно закладывать 93 тыс. га садов и ягодников, для чего следует производить 351,5 млн. шт. посадочного материала.

Повышение эффективности производства возможно за счет увеличения количества и качества материала (отводков, усов, розеток). Использование безвирусных растений является существенным фактором, способным обеспечить продуктивность маточных насаждений.

Применение современных методов экспресс - диагностики вирозов и методов терапии зараженных растений предполагают повышение производственных затрат при выращивании посадочного материала. Однако увеличение уровня рентабельности безвирусных технологий свидетельствует о несомненном их преимуществе над традиционными (таб. 6.)

б. Экономическая эффективность производства безвирусного посадочного материала земляники сорта Трубадур и малины сорта Бабье лето.

ПОКАЗАТЕЛИ РЯДОВОЙ МАТОЧНИК БЕЗВИРУСНЫЙ МАТОЧНИК

ЗЕМЛЯНИКА МАЛИНА ЗЕМЛЯНИКА МАЛИНА

БАЗОВЫЕ РАСТЕНИЯ, ШТ. 1000 1000 1000 1000

ВЫХОД СТАНДАРТНЫХ РОЗЕТОК. ПОБЕГОВ, ШТ. 10000 12000 15000 18000

ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ ЗАТРАТЫ, руб./шт. 2314 2250 3750 3400

СЕБЕСТОИМОСТЬ 1 ТЫС. ШТ., руб. 231 188 233 188

РЕАЛИЗАЦИОННАЯ ЦЕНА 1 ШТ., руб. 0,50 4,0 0,70 5,0

СТОИМОСТЬ ПРОДУКЦИИ, руб. 5000 4800 11200 90000

ЧИСТЫЙ ДОХОД Руб. 2686 2550 7450 86600

% 100 100 278 340

УРОВЕНЬ РЕНТАБЕЛЬНОСТИ, % 116 113 199 254

выводы

1. В результате проведенных исследований впервые методом ИФА уточнен видовой состав вирусов земляники и малины в условиях ЦЧР. Идентифицированы вирусы НЕПО, КУКУМО, ТОБАМО, КЛОСТЕ-РО - групп. Установлена доминирующая роль НЕПО-патогенов.

2. Распространенность сокопереносимых вирусов на землянике и малине в обследуемом регионе составляет 2 - 40%. Преобладают вирусы ЧКПТ, КПМ, ЛКПЗ. Первоисточником заболеваний являются, как правило, нетестированный посадочный материал, особенно в селекционных коллекциях и сортоиспытательных участках.

3. В ЦЧР для ягодных культур наиболее характерны поливирусные инфекции. Среди них часто встречаются комплексы ЧКПТ+КПМ, ЛКПЗ+ЧКПТ, ЛКПЗ+ЧКПТ+КПМ. На малине идентифицирована смешанная инфекция ХПЛЯ+КПМ, КПМ+КПМ+ХПЛЯ+ЧКПТ.

4. Вирозы угнетают ростовые процессы растений. Выход рассады у инфицированной земляники на 10-40% ниже по сравнению со здоровой. Количество корневых отпрысков у здоровой малины на 739% превышает число побегов от инфицированных кустов.

5. Важное значение на рост и развитие вирусных очагов в насаждениях малины и земляники ЦЧР имеет первоначальноый инфекционный фон. Скорость накопления инфекции внутри очага может составлять от 4,5 до 40,6% за вегетационный период.

6. Для концентрации возбудителей в организме хозяина характерны сезонные и возрастные флуктуации. Отношение нижнего порога экстинкций серологической реакции активных вирионов в экстракте сортообразцов может достигать 1,8.

7. Сорные растения являются резерваторами НЕПО-вирусов в агробиоценозах. В ЦЧР среди них преобладают представители семейств: сложноцветные, злаковые, крестоцветные.

8. При массовом тестировании земляники и малины методом ИФА целесообразно использовать поливалентные сыворотки, а не моноклонапьные антитела. Центрифугирование не оказывает существенного влияния на экстракцию вирогенного начала анализируемых сортообразцов и для упрощения может быть исключено из процесса тестирования.

9. Органами максимальной локализации вирусных патогенов в растениях являются молодые листья, плоды, усы земляники, иногда завязь. Использование их позволяет расширить временные границы ИФА - теста в условиях ЦЧР и повысить его эффективность.

10. Вследствие высокой термочувствительности вегетирующих растений малины, инфицированной НЕПО - вирусами, целесообразно проводить термотерапию корневых черенков. Успех отрастания зависит от сортовых особенностей обрабатываемых растений.

11. При необходимости оздоровления растений земляники, инфицированной НЕПО - вирусами, целесообразно осуществлять термо- и хемотерапию in vitro, позволяющую повысить до 40 % выход оздоровленных растений по сравнению с собственно микроразмножением. В качестве вироцидов рекомендуется применять биназу и барназу в концентрации 25 мкг/мл. Количество здоровых растений после терапии зависит от эффективности антивирусного воздействия, морфобиологических закономерностей органогенеза регенерантов, ряда технологических приемов, направленных на повышение коэффициента пролиферации эксплантантов.

Рекомендации производству.

• На основании проведенных исследований рекомендуется перевод всех технологий возделывания земляники и малины на безвирусную основу. Маточные насаждения следует закладывать только безвирусным посадочным материалом, что предотвратит заражение почв и обеспечит повышение выхода стандартной рассады земляники на 10-40%, а корневых отпрысков малины - на 7-39%.

• Учитывая широкий круг возбудителей, поражающих землянику и малину, и легкие пути их передачи, следует осуществлять строгий вирусологический контроль на всех этапах производства высококачественного посадочного материала. Для этого рекомендуется использовать модифицированную для средней зоны плодоводства методику ИФА, включающую в себя применение в качестве инокулюма молодые листья, плоды, а в некоторых случаях цветки и завязь растений.

• Для массовых серологических анализов полевых образцов целесообразно использовать поликлональные сыворотки, позволяющие индексировать различные штаммы вирусов.

• При массовом заражении экономически значимых сортов земляники и малины вирусами ЛКПЗ, ЧКПТ, КПМ следует осуществлять их оздоровление с применением методов термо- и хемотерапии. В качестве вироцидов рекомендуется использовать биназу, барназу в концентрации 25 мкг/мл. Принимая во внимание вероятность возвратной инфекции, полученные после оздоровления регенераты рекомендуется ретестировать не ранее, чем через 12 месяцев после их адаптации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ:

1. Лукьянова Е.А. Применение иммуноферментного анализа для тестирования некоторых вирусов ягодных культур II Перспективы отечественного садоводства / Тезисы докладов II Республиканской конференции молодых ученых и специалистов, Киев. -1991. - С.25-26.

2. Лукьянова Е.А. Использование ингибиторов вирусов в культуре ткани с целью оздоровления земляники // Биология культивируемых клеток и биотехнология / Тезисы докладов II Международной конференции, Алма-Ата. - 1993. - С. 133.

3. Семина Н.П., Лукьянова Е.А., Цуканова Е.М. Вирусные болезни плодовых и ягодных культур в ЦЧО // Современные проблемы садоводства / Тезисы докладов научной конференции, посвященной 70-летию БНИИП, Минск. - 1995. - С.241.

4. Лукьянова Е.А. Изучение возможности использования бактериальных РНКаз для хемотерапии в культуре ин витро // Тезисы докладов совещания молодых ученых, Москва. - 1995 - С. 117-119.

5. Лукьянова Е.А. Видовой состав вирусов ягодных культур в ЦЧЗ и возможность оздоровления земляники с использованием бактериальных РНКаз // Экология и промышленное садоводство и овощеводство / Тезисы докладов к совещанию, Воронеж. - 1996. -С.47.

6. Семина Н.П., Лукьянова Е.А. Идентификация вирусов земляники в ЦЧО // Методы эффективного введения садоводства / Сб. научн. работ ВНИИС им. И.В.Мичурина, Мичуринск. - 1996 - С.96-102.

7. Лукьянова Е.А. Изучение вирозов ягодных культур в ЦЧЗ и определение оптимальных органов для экспресс-диагностики // Сельскохозяйственное производство и высшая школа на переломном этапе реформирования. / Сб.2., ч. 1, Мичуринск. -1996 - С.38-40.

8. Лукьянова Е.А. Методы оздоровления растений от вирозов // Сельскохозяйственное производство и высшая школа на переломном этапе реформирования / Сб. 2.,ч.2., Мичуринск. - 1996. - С.61-62.

9. Семина Н.П., Цуканова Е.М., Лукьянова Е.А Система производства безвирусного посадочного материала плодово-ягодных культур в средней зоне садоводства. // Сб. научн. тр. ВНИИС им. И.В.Мичурина - 1997. (В печати).

10. Лукьянова Е.А Эффективность моноклональных антител и поликлональных сывороток при диагностике вирусов АМ и ОМ на землянике и малине // Сб. трудов ВНИИС им. И.В.Мичурина - 1998 (В печати).

11. Лукьянова Е.А. Особенности циркуляции НЕПО - вирусов в искусственных агробиоценозах ЦЧР // Сб. тезисов к конференции МГСХА - 1998 (В печати).

12. Лукьянова Е.А. Применение поликлональных сывороток и моноклональных антител для диагностики вирусов огуречной и арабис мозаик // Агробиологические науки - М. - 1998 (в печати).

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Лукьянова, Елена Анатольевна, Мичуринск

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ САДОВОДСТВА им. И В. МИЧУРИНА.

ЛУКЬЯНОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ПРОИЗВОДСТВА БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ЗЕМЛЯНИКИ И МАЛИНЫ В ЦЧР.

Специальность 06.01.07-плодоводство

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

Научный руководитель Кандидат сельскохозяйственных наук

Н.П.СЕМИНА

МИЧУРИНСК 1998 год

СОДЕРЖАНИЕ:

стр.

ВВЕДЕНИЕ _____ 4

I. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ЗЕМЛЯНИКИ И М АЛИНЫ (Состояние вопроса)

1.1. Организационные принципы безвирусного ягодоводства ____ 7

1.2. Фитопатогенные вирусы земляники и малины и их вредоносность _ 14

1.3. Проблемы идентификации фитовирусов __ _ 21

II. УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Краткая характеристика агроклиматических ресурсов центральночерноземной зоны_ 23

2.2. Условия проведения исследований и объекты изучения __ 25

2.3. Методы исследований__ 29

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

III. ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ ЗЕМЛЯНИКИ и МАЛИНЫ В ЦЧР

3.1. Определение органов максимальной локализации НЕПО - вирусов

и ВТМ _ 32

3.2. Изменение методики ИФА при диагностике сокопереносимых вирусов земляники и малины ____ 35

3.3. Сравнительное изучение эффективности моноклональвых антител и поликлональных сывороток при диагностике вирусов AM и ОМ ______ 34

IV. ВИДОВОЙ СОСТАВ СОКОПЕРЕНОСИМЫХ ВИРУСОВ ЗЕМЛЯНИКИ И МАЛИНЫ В ЦЧР; ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНФИЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ

4.1. Маршрутные обследования, ELISA - тест___ 40

4.2. Биологическое титрование _____ 55

4.. Характер распространения вирусов на землянике и малине

в ЦЧР ___ 61

4.3. Скорость накопления вирусной инфекции в насаждениях _ 74

V. ВИЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА РАЗВИТИЕ ОЧАГОВ ВИРУСНЫХ

ИНФЕКЦИЙ МАЛИНЫ И ЗЕМЛЯНИКИ

5.1. Роль абиотических факторов в инфекционном процессе _ 78

5.2.Пути циркуляции НЕПО - вирусов и ВТМ в агробиоценозе _ 85

5.3. Значение сорной растительности как резерватора вирусов_ 87

VI. ОЦЕНКА ВРЕДОНОСНОСТИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ МАЛИНЫ

И ЗЕМЛЯНИКИ ____ 91

VII. ИЗУЧЕНИЕ ЭЛЕМЕНТОВ СИСТЕМЫ ПРОИЗВОДСТВА ОЗДОРОВЛЕННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА

7.1. Термотерапия in vivo _ 96

7.2. Термотерапия in vitro _____ 102

7.3. Хемотерапия в сочетании с микроклональным размножением _ 108

7.3.1. Определение антивирусной активности бактериальных нуклеаз_ 108

7.3.2. Использование никотиновой кислоты в в качестве вироцида _ 114

VIII. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРОИЗВОДСТВА БЕЗВИРУСНОГО

ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ЗЕМЛЯНИКИ И МАЛИНЫ _ 116

ВЫВОДЫ _____ 117

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ ____ 119

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ __ 120

ПРИЛОЖЕНИЯ _ 147

ВВЕДЕНИЕ

Центральное Черноземье России - благоприятный район для возделывания земляники и малины. Богатое содержание полезных веществ и высокие вкусовые качества ягод способствуют их повсеместному распространению и широкому использованию в пищевых и лечебных целях. Однако в настоящее время спрос населения на продукцию данных культур полностью не удовлетворяется. Наметилась тенденция к снижению производства ягод, что обусловлено отчасти ухудшением экономического состояния сельского хозяйства, процессами его дезинтеграции.

Появление качественно новых типов сельскохозяйственных предприятий с раздробленной структурой и малыми размерами производства привело к тому, что технология возделывания насаждений выдерживается не всегда, отсутствует контроль за качеством посадочного материала. В результате возникают очаги различного рода заболеваний, происходит заражение почв, а повышенная активность межрегионального обмена нетестированными растениями способствует распространению инфекций.

Положение усугубляется изменением экологической обстановки. Критические низкие и высокие температуры, засухи, повышенная солнечная радиация, загрязнение окружающей среды и прочие факторы снижают иммунитет растений, способствуют их заражению грибными, вирусными, мико-плазменными и бактериальными заболеваниями.

Размеры потерь, причиняемые фитовирусами на ягодных культурах, достигают 53-91% и характеризуются снижением продуктивности, ухудшением качества продукции, сокращением сроков эксплуатации насаждений (Кеглер,1986; Converse, 1977-1990; Семина и др. 1995-1996; Приходько, 1993-1997). В связи с этим весьма актуален перевод ягодоводства на безвирусную основу.

Система создания интенсивных технологий возделывания насаждений неэффективна без использования современных достижений науки: экспресс-

диагностики патогенов, физио- и хемотерапии.

Подобные мероприятия и программа приняты в большинстве европейских стран и полностью оправдали себя. Во Франции, США, Германии, Италии, Бельгии, Голландии действуют государственные системы по производству безвирусного посадочного материала и контролю за его качеством.

В России были достигнуты несомненные успехи в идентификации ви-розов ягодных растений, терапии, создании системы производства оздоровленного посадочного материала (Абраменко,1970-1973; ЛемановаД972; Помазков,1964-1978; Трушечкин, 1970 - 1974; Вердеревская,1972-1985; Борзых, 1973-1980; Келдыш 1978-1985; Семина 1988-1997 и др.). Однако в настоящее время эти работы в значительной степени сокращены, для идентификации сокопереносимых вирусов редко используются современные методы экспресс-диагностики, в частности ИФА. В связи с ухудшением материально-технического состояния научных учреждений, мероприятия по оздоровлению проводятся редко.

Очевидной проблемой остается высокая восприимчивость земляники и малины к фитовирусам. Исследования некоторых вирозов на эти культурах в ЦЧР, проведенные в 60-х-начале 80-х гг. Ю.И. Помазковым и Г.Т. Борзых, а также многочисленные работы Ю.Н. Приходько (1990-1997 гг.) и других в средней полосе России, доказывают необходимость дальнейшего изучения этого вопроса.

В настоящее время еще не получили широкого внедрения в практику высокочувствительные иммунохимические экспресс-тесты на многие вирусы ягодных растений. Сортовые различия культур, а также отличительные особенности вирусных штаммов требуют модификаций методов индексации и оздоровления, оптимально подходящих для конкретной зоны с индивидуальным сортиментом. Хорошо зарекомендовавшие себя способы: термотерапия и культура апикальных меристем in vitro, нуждаются в детальных доработках применительно к местным штаммам. Не найден пока универсальный антивирусный препарат для оздоровления растений от вирусов путем хемотерапии.

В связи с актуальностью указанных проблем, целью наших исследований являлось совершенствование элементов технологии производства безвирусного посадочного материала земляники и малины в условиях ЦЧР с целью повышения ее эффективности.

В задачи исследований входили следующие вопросы:

► оптимизировать экспресс-метод (ИФА), с целью повышения эффективности индикации вирусов земляники и малины;

► определить видовой состав, установить доминирующие вирусы и типы их сопряжения на землянике и малине в условиях ЦЧР, выявить фено-типические особенности инфицированных растений;

► изучить естественные пути циркуляции сокопереносимых вирусов в антропогенных биоценозах;

к*

► дать сравнительную оценку хозяйственных признаков здоровых и инфицированных растений в условиях ЦЧР;

► изучить различные способы оздоровления растений;

► выделить в банк ССЭ безвирусные клоны сортов земляники и малины с целью дальнейшего размножения и закладки безвирусных маточников.

1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ЗЕМЛЯНИКИ И МАЛИНЫ

( Состояние вопроса)

1.1. ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ ПРИНЦИПЫ БЕЗВИРУСНОГО

ЯГОДОВОДСТВА

Использование здоровых растений плодовых и ягодных культур является приоритетным направлением в садоводстве и значительно повышает его эффективность. Урожайность безвирусных плантаций ягодных культур на 17-65% выше по сравнению с обычными. Одновременно улучшается качества плодов (Тупицын, 1986). Продуктивность насаждений малины и земляники, заложенных безвирусным посадочным материалом, возрастает на 19,423,9 ц/га и 14,0-40,1 ц/га соответственно (Помазков,1975).

Система производства высококачественного посадочного материала ягодных культур неэффективна без комплекса научно-организационных мероприятий. Они включают в себя:

• производство чистосортного безвирусного посадочного материала с применением новейших методов биотехнологии;

• комплексное обеззараживание почвы и удаление потенциальных источников вирусной инфекции;

• закладку маточных насаждений с учетом пространственной изоляции от промышленных посадок;

• карантинные мероприятия для предотвращения появления и распространения инфекции;

• вирусологический и фитосанитарный контроль за состоянием растений, выбраковку инфицированных.

Современная тенденция перевода ягодоводства на безвирусную основу предусматривает оптимизацию некоторых элементов действующей ныне технологии (рис. 1). Прежде всего это касается методов идентификации вирусов и оздоровления зараженных растений.

Рис. 1. ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННОГО ПОСАДОЧНОГО

МАТЕРИАЛА ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР.

Принимая во внимание важность перечисленных проблем, производство посадочного материала высших категорий качества, включающих в себя условие его безвирусности, возлагается на научные учреждения, обладающие необходимым оборудованием и имеющие квалифицированных специалистов.

Основным этапом, предшествующим размножению растений, является вирусологический тест и выделение здоровых клонов. Однако при массовом заражении сортов вирозами возникает необходимость оздоровления инфицированных растений.

Одним из методов оздоровления большинства вегетативно размножаемых растений, во всем мире является термотерапия. Первую попытку использования высоких температур, а именно горячую воду против болезни СЭРЭ (Sereeh) сахарного тростника, предпринял Кобус в 1889 году (Kobus, 1890, по Метьюз, 1973) еще до открытия вирусной природы этого заболевания.

В 1923 году Вилбринк (Wilbrink, 1923, по Метьюз, 1973) повторил его опыты и получил свободные от той же болезни растения сахарного тростника путем погружения черенков в горячую воду с температурой 52С° на 1 час. Впоследствии горячая водная обработка стала ведущим методом борьбы и с другими вирусными болезнями (Martin, 1930; Bell, 1933; Steib et al., 1934; Miller, 1953; Antoine, 1962; Ling, Chuang, 1963).

Суховоздушная термотерапия также получила широкое распространение. Успешно применяли этот метод на плодовых и ягодных растениях в Болгарии (Христов, 1947, 1953, 1958), ГДР (Kegler, 1959, 1960), Англии (Posnette, Cropley, 1956,1958,1959), СССР (Качармазов, 1970; Цуркан, 1973), США (Hewitt, 1962, 1964; Gohen et al, 1965), Франции (Vuittenez, 1964; Vuettenez et al., 1962; Dufranoy, 1966; Galzy, Compan, 1968), Румынии (Гена и др., 1970) и других странах.

Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термообработки существуют различные гипотезы. Согласно одной из них, повышенная температура воздействует непосредственно на вирусные

частицы, лишая их инфекционности. Для термического оздоровления растений, находящихся в состоянии покоя, когда температура обработки достигнет 60°С при водной и 80°С при воздушной терапии, эта гипотеза кажется приемлемой, но для понимания механизма инактивации вирусов при воздействии на вегетирующие растения она неудовлетворительна, т.к. при этом допустимые температуры не превышают 38-40°С, в то время, как температура инактивации большинства вирусов 50-70°С (Вердеревская, Маринеску, 1985).

Суть второй гипотезы заключается в том, что в зараженных вирусами растениях непрерывно протекают противоположно направленные процессы синтеза и дегенерации вирусных частиц. При помещении растений в температурные условия, неблагоприятные для синтеза вируса и благоприятные для его деградации на достаточно длительное время, могут произойти разрушения всех накопленных в клетках вирусных частиц и полное освобождение целого растения от вирусов. Однако, чаще освобождаются от инфекции лишь отдельные части растений, отросшие в процессе обработки. В остальных тканях уменьшается концентрация вирусных частиц, которые не успевают перемещаться в новые, быстрорастущие ткани. Данной точки зрения придерживаются Kassanis, 1957; Posnette, 1961; Молдован, 1964,1966.

Третья гипотеза инактивации вирусов при термообработке связана с ингибирующей активностью клеток растения-хозяина, возрастающей под действием высоких температур. В результате, растения как бы сами освобождают себя от вирусов (Nienhaus, 1956). В подтверждение этой гипотезы при работе с табачной мозаикой на томатах наблюдалось повышение устойчивости к заражению и снижению концентрации вируса в уже зараженных растениях, растущих при температуре 35-36°С (Вердеревская, Маринеску, 1984).

Однако, ни одна из перечисленных гипотез не объясняет полностью все факты, накопленные практикой термотерапии растительных вирусов.

По всей видимости, поведение вируса в живых клетках растений при высоких температурах - процесс достаточно сложный и многофакторный. В

нем большую роль играют чувствительность вируса к температуре, направленность процессов синтеза и деградации вирусных частиц, защитные реакции растения-хозяина (Кеглер, 1986).

Ряд ученых придерживаются мнения, что получить свободный от вирусов материал можно путем культуры верхушечных меристем, так как последние довольно часто оказываются свободными от вирусов (White, 1933; Limasset et al., 1949; Holmes, 1955; Morel, Martin, 1952,1955; Hollings, 1965).

Лимасс с сотрудниками объясняют данное явление наличием в апикальном материале больших концентраций ауксинов, ингибирующих размножение вирусных частиц (Limasset et al., 1949).

Солберг и Болд (Solberg, Bold, 1963) предполагают, что следствием этого является само физиологическое состояние клеток меристематических тканей. Боуден (Bawden, 1959) также считает, что физиология меристемы такова, что она препятствует проникновению вирусной инфекции и затрудняет размножение вирусов. Однако, единого мнения на этот счет пока не существует.

На землянике впервые метод верхушечных меристем описали Белкен-грен и Миллер, которые освободили таким образом 50% растений Fragaria vesca от термостабильного вируса A (Belkengren, Miller, 1962). Позже эти авторы сообщили об 53%-м оздоровлении таким же путем альпийского клона Fragaria vesca, зараженного вирусами морщинистости и окаймления жилок. Муллин с соавторами получил 25% растений земляники, освобожденной от вируса слабого пожелтения жилок (Mullin et al., 1979).

В дальнейшем метод верхушечных меристем стал использоваться во многих странах мира на разных культурах: Нидерландах (Quak, 1965), Румынии (Наталия Гена, 1970), Японии (Shoshiro Takeuchi, по Абраменко, 1973), Молдове (Абраменко, 1973, 1975), России (Агаева, 1969; Ростовцева, 1969; Харченко, 1970; Трушечкин, 1970; Поликарпова, 1986; Высоцкий, 1983; Туровская и др., 1986; Тюленев и др., 1987; Атрощенко и др., 1990; Леонова-Орлова, 1991), Испании (Greno, Navarro, 1988) и др.

Однако, практические опыты Лейке и Лабеса, показавшие наличие остаточной инфекции в пораженных вирозами культурах, доказали проблематичность размножения in vitro инфицированных сортов (Лейке, Лабес, 1980). В связи с этим вирусологи начали применять для оздоровления растений термотерапию в сочетании с культурой in vitro. Так, Мак Грю добился положительных результатов, применив для освобождения сорта земляники Сью-ванни от латентного вируса С метод культуры верхушечных меристем с предварительной термообработкой (McGrew, 1965). Н. Абраменко и И. Цур-кан (1973) использовали подобное сочетание методов и добились 51,6%-го освобождения земляники от вирусов морщинистости, пожелтения краев и скручивания листьев. Таким же образом осуществляли оздоровление плодовых культур (Цуркан, 1973, по Кеглеру; Богуш, Чернец, 1983; Чернец, 1993).

Параллельно с вышеописанными способами борьбы с вирусами все больший научный интерес представляют альтернативные методы, к числу которых относятся химиотерапия in vivo и in vitro, а также индукция устойчивости к вирусам, генная инженерия.

В исследованиях последних десятилетий установлена принципиальная возможность защиты растений от вирусных болезней химическими веществами (Hansen, 1979; Schuster, 1979; Cassel, 1981). Главная трудность при подборе таких веществ заключается в том, что антивирусный препарат должен блокировать процесс заражения и репродукцию вируса, не повреждая при этом само растение. Но размножение патогена сильно взаимосвязано с процессами, происходящими в клетке, поэтому любое вещество, блокирующее его, будет в большей или меньшей степени оказывать влияние на хозяина (Chet, 1987; Keil, Cwerolo, 1979).

Химиотерапия может быть основана также на индукции эндогенного синтеза соединений, определяющих устойчивость растений к вирусам (Hemenway, Fang, Kaniewski, Chua, Turner, 1988).

В том и другом случае антивирусный препарат должен сохранять активность в течение достаточно длительного времени, поскольку частое его

применение может быть экономически невыгодно. Вироцид дол