Разрывы ДНК, их репарация и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека

Тронов, Виктор Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разрывы ДНК, их репарация и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разрывы ДНК, их репарация и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека"

На правах рукописи

РГб од

тронов ..

Виктор Александрович О МАг 230д

РАЗРЫВЫ ДНК, 11Х РЕПАРАЦИЯ И ГИБЕЛЬ ПОКОЯЩИХСЯ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в Институте химической физики им. Н.Н.Семенова РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л.Б. Горбачева

доктор биологических наук, профессор Д.М. Спитковский

доктор биологических наук, профессор А.П. Акифьев

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский Институт физико-химической медицины Минздрава России, Москва

Зашита состоится " ^ч/^-М 2000 года в *// часов на заседании

Диссертационного совета Д 20СГ53.01в Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН по адресу: 117977, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН

Автореферат разослан " Ш 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационого совета Д 200.53.01

кандидат химических наук М.А.Смотряева

t »

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. С открытием программированной клеточной смерти (апоптоза) как альтернативы некроза проблема связи первичных повреждении ДНК с гибелью клетки приобрела более конкретные очертания и формулируется как проблема связи типов повреждений ДНК с формами клеточной гибели (проблема включает в себя и механизм траисдукции первичного сигнала). Исследования в ной области предполагают 3 варианта ответа на поставленный в проблеме вопрос.

(1) Апоптоз является универсальным механизмом программированной гибели; вне зависимости от вида повреждений ДНК и природы повреждающею агента, гибель клетки завершается апотозом (высокие уровни воздействия индупируюг некротическую гибель).

(2) Двунитевые разрывы ДНК (ДР), будучи главной причиной снижения колоннеобразования пролиферирующих клегок, являются основным типом повреждений, запускающих апоптоз.

(3) Повреждения ДНК сами по себе не являются причиной апоптоза, но запускают механизм репарации, в ходе функционирования которого создаются условия для гибели клетки, генерируется сигнал, запускающий про!рамму гибели.

Предлагаемая работа находится в русле последнего представления. К ному направлению исследований тесно примыкает так же весьма интересная и пока далекая от своего решения проблема взаимоотношения механизмов репарации и апоптоза. Повреждения ДНК, с одной стороны, являются субстратом для реиаративных ферментов в клетке, а с другой стороны, запускают программу клеточной гибели -апоптоз. Апоптоз проходит через этап деградации ДНК, которой также противостоят механизмы репарации. Эти два процесса конкурируют не только за субстрат, но и за энергетические ресурсы клетки, поскольку оба энергозависимы. Результаты исследований последних лет обнаруживают связь между механизмами апоптоза и репарации ДНК [см. обзоры Götz, Montenarh M. 1996, Oliver et al. 1999, Тронов 1999]. Однако, в некоторых исследованиях отмечается отсутствие взаимосвязи апоптоза и репарации. Здесь примечательными являются работы [Story et al. 1994, Vrai et al. 1998] на клетках мышиной лимфомы и лимфоцитах кропи человека, в которых авторы независимо приходят к выводу, что апоптоз в лих клетках определяется только начальными ДР и не зависит от репарации ДНК. Как видно, столь противоречивые данные создают предпосылку для исследований взаимосвязей <неньен цепи "повреждение ДНК - репарация - клеточная гибель (апоптоз)". Исследования мы

проводили сланным обраюм на покоящихся лимфоцитах крови человека (ЛКЧ), и потому результаты работы касаются также проблемы гибели покоящихся клеток, индуцированной повреждением ДНК. Покоящиеся клетки формируют основной клетчный пул высших организмов и опухолей. 13 то же время отсутствует ясное представление о том, в чем состой г опасность отдельных повреждений в их нсрсплшшруюшемся геноме. Неситмулированпые к делению лимфоциты представляют собой благодатный объект для изучения этой проблемы в силу своей высокой чувствительности к повреждениям ДНК. Возможно это связано с кри1пчнос1ыо выполняемых ими функций: наиболее важная функция лимфоцитов in \i\o в ответ на антигенный стимул состоит в синтезе антител или в стимуляции пролиферации, приводящей к продукции иммунологически активных дочерних клеток. С друтй стороны, как и во многих долгоживущих клетках, в покоящихся лимфоцитах in \1чо отмечается заметный уровень конститутивной экспрессии BCL-2, белка, подавляющего апопгов и увеличивающею жизнеспособность клеток [Yang, Korsmeyer IW6, Boviaetal. 1998].

llc.ii> и залами исследования. Цель настоящей работы - на покоящихся лимфоцитах кропи человека установить связь формы шбели клетки с типом разрывных дефектов ДНК и исследовать влияние процесса репарации дефектов на клеточную гибель.

Достижение этой цели потребовало постановки и решения следующих задач.

1) Ратработать метод поклеточной регистрации повреждений генома клетки. Оценнть ei о но »нежности для регистрации и дискриминации форм клеточной гибели.

2) Исследовать гибель ЛКЧ после их облучения in vitro.

}) С > I ic 1111 ■ ь роль ДР в индукции гибели покоящихся клеток.

4) Исследовать гибель покоящихся ЛКЧ, индуцированную ОР и роль механизма их репарации

Научили новизна полученных результатов. ППроведена качественная и количественная оценка возможности метода ДНК-комет для регистрации и дискриминации форм клеточной гибели. Анализ бивариантных распределений комет позволяет дискриминировать преимущественную форму гибели клеток в популяции. Однако, для такой дискриминации на уровне отдельной клетки требуется привлечение морфолот ических исследований. 2) Метод позволяет идентифицировать крупноблочную деградацию ДНК на ранних этапах апоптоза. Впервые продемонстрирована корреляция данных, полученных с помощью метода ДНК-комет и резчлыагов морфологической опенки частоты апоптоза ЛКЧ. 3) Прикладные

возможности метода ДНК-комет впервые продемонстрированы на лимфоцитах больных системной красной волчанкой (СКВ) и больных хроническим миелолейкозом (XMJ1), подвергнутых тотальному фракционированному облучению (суммарная доза облучения 1 Гр). Показано, что спонтанная поврежденность ДНК в J1K4 больных СКВ выше таковой в J1K4 здоровых доноров. Частота спонтанного апопоза ЛКЧ больных СКВ выше, чем у здоровых доноров. 4) Показано, что ЛКЧ больных ХМЛ сохраняют "память" об облучении in vivo в виде более высокой спонтанной гюврежденностн ДНК в них и более высокой частоты спонтанного апоптоза части клеток, наблюдаемой спустя 2-3 месяца после завершения терапевтического курса. 5) Показано, что гамма-облучение ЛКЧ in vitro и последующая инкубация в среде с пониженным содержанием сыворотки (<5%) индуцировали смешанную гибель клеток, в которой некроз и апоптоз были представлены как два относительно независимых события, к которым приводят два доминирующих вида дефектов ДНК, ОР и ДР.

5) Исследована роль ДР в индукции гибели покоящихся ЛКЧ мод действием ингибитора топоизомеразы II этопозида. Показано, что формирующиеся ДР в ЛКЧ сохраняются нерепарированными в течение по крайней мере 8 час, времени начала проявления признаков апоптоза. Апоптоз сопровождался характерными морфологическими изменениями клеток, межнуклеосомной деградацией ДНК, появлением гиподиплоидных клеток, но отсутствием экспрессии р53. Последнее обусловлено экранированием ДР ковалентно связанной с ним топоизомеразой II (предположительно ее р-изоформы).

6) Исследована роль ОР и их репарации в индукции гибели ЛКЧ. ОР индуцировали перекисью водорода (диапазон концентраций 10-400 мкМ). Показано, что (i) Н202 индуцирует в клетках разрывы ДНК, не являющиеся следствием циготоксического действия агента, (¡i) Возникшие ОР запускают программу гибели. Спустя 24 час в популяции ЛКЧ обнаруживаются какапоптотические, так и некротические клетки. При концентрациях Н202 > 200 мкМ некроз становится доминирующей формой гибели, хотя до 15% клеток сохраняют апоптотическую морфологию. (i¡i) Апоптоз сопровождается межнуклеосомной деградацией ДНК и экспрессией р53. (iv) Репарация ОР осуществляется с участием PARP, так как NAm подавляет репарацию ОР. При этом резко снижается доля некротических клеток, и в 2 раза возрастает частота апоптоза. Полученные данные интерпретируются в рамках концепции о де-энергнзирующем действии на клетки репаративного механизма и определяющей роли снижения уровней

I NAD, ATP|i в форме iiiGcjih покоящихся JIK4.H целом работа представляет новое направление исследований - биофизику клеючной гибели. Научно-практическая значимость.

1) Полученные результаты о связи формы гибели клеток и типов повреждений ДНК внося i cynieci венный вклад в решение проблемы, относящейся к области исследования бпофи шки клеточной гибели: механизмы передачи сигнала от первичных повреждений i енома до конечною эффекта.

2) Наши результаты свидетельствуют о существенной роли в этом де-энергизации покоящейся клегки, связанной с функционированием системы репарации ДНК. Метод ДНК-комет расширяет ассортимент исследовательских процедур в области биофизики 1С. 1С I Kit.

Маши результаты о влиянии этоиозида на ЛКЧ связывают наблюдаемый эффект ai ста с наличием в лимфоцитах |5-изоформы гопоизомеразы И, локализованной в ядрышке. Ото ставит проблему идентификации расположения на ДНК формируемых сю ДР и пути передачи первичного сигнала, минуя важнейший медиатор р53.

4) Результат о влиянии Н202 подтверждают представление о генотоксическом механизме действия окисли тельного стресса в широком диапазоне концентраций перекиси. Медиатором трансляции сигнала от первичного повреждения ДНК (ОР) ямляеюя р53. С ростом объема повреждения ДНК возрастает объем репарации и >иер| о затраты на нее. Это уменьшает вероятность прохождения апоптоза и увеличивает исрониюсть его трансформации в некроз. Все это дополняет наши представления о мехами змах действия окислительного стресса па клетку.

5) Исследования на лимфоцитах больных хроническим миелолейкозом и системной красной волчанкой показывают плодотворность использования метода ДНК-комет для решения многих прикладных задач, связанных с мониторингом радио- и химиотерапии 0НК0Л01 ических заболеваний и заболеваний иммунной системы, а также для оценки leiepoieiiHOCTH клеточных популяций in vivo и in vitro rio чувствительности к различным воздействиям (включая терапевтические).

6) 11олученые результаты могут также быть использованы в разработке такт ики терапии рака, основанной на индукции снижения внутриклеточного [ATPji [Martin DS, Schwartz tik IW7]

Основные положения,выносимые на защиту

- ДНК-кометы служат надежным биофизическим маркером клеточной гибели: (i) предложена классификация типов ДНК-комет, формируемых клетками, определены

соответствующие им размеры фрагментов одно- и двуспиралыюй ЛИК; (ii) показано, что они формируются в процессе крупноблочной фрагментации генома Fia начальной стадии апоптоза (commited phase); (iii) продемонстрирована хорошая корреляция частоты формируемых ДНК-комет с частотой апоптотических лимфоцитов нормальных доноров и больных системной красной волчанкой.

- Облучение покоящихся лимфоцитов в условиях дефицита сыворотки индуцирует в популяции две формы гибели - некроз и апоптоз; (i) некроз обусловлен де-энергизацией клетки за счет эффективной репарации ДНК; (ii) апоптоз индуцируется долго живущими повреждениями ДНК (двунитевыми разрывами); (iii) репарация ДНК играет роль "антиапоптотичсского " фактора, влияющего на форму клеточной гибели.

- Ингибитор топоизомеразы II этопозид индуцирует в покоящихся лимфоцитах нерепарируемые двунитевые разрывы ДНК: (i) на фоне отсутствия репарации в клетках развивается апоптоз, который не связан с экспрессией р53.; (ii) сигналом для апоптоза служат конформационные перестройки хроматина - релаксация суперспиральных доменов ДНК, содержащих разрывы, маскированные топоизомеразой II

- Смена формы гибели апоптоз—»некроз в ЛКЧ происходит на терминальной стадии в результате де-энергизации клетки в процессе репарации ДНК: (i) OP эффективно репарируются и одновременно индуцируют р53-зависимый апопто], (ii) репарация ОР связана с функцией PARP: никотинамид, ингибитор PARP, подавляв! репарацию ДНК; (iii) подавление репарации защищает клетки от некротической гибели , но не от апоптоза.

6. Апробация работы. Материалы диссертации представлялись и обсуждались на следующих конференциях и съездах. II Радиобиологический съезд (Киев, 1993); VIII Международный конгресс по радиационной защите (Монреаль, Канада. 1992); X Международный конгресс по радиационным исследованиям (Вюрцбург, Германия.

1995); VIII ежегодный съезд Европейского Радиобиологического Общества (Монпелье, Франция. 1996); IV конференция 1UBMB "Жизнь и смерть клетки" (Лондон, Англия.

1996); I съезд онкологов стран СНГ (Москва. 1997); III съезд но радиационным исследованиям (Москва. 1997); II съезд биофизиков России (Москва. 1999).

Материалы диссертации докладывались также на семинарах и научных конференциях в Институте химической физики РАН и в Институте биохимической физики РАН.

7. Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения-характеристики работы, 4 глав, выводов, списка литературы (186 наименований) и содержит 172 стр: 38 рисунков, 5 таблиц. Материалы диссертации изложены в 22 публикациях, в том числе двухобзорных статьях. Личный вклад автора заключался в постановке работы, в планировании и выполнении большей части экспериментов, в написании всех публикаций по результатам исследования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ДНК-КОМЕТЫ КАК МАРКЕР КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ 1.1. Клеточная гибель и методы ее регистрации.

В начале 70-х была сформулирована гипотеза о программированной гибели клетки как альтернативе случайной некротической смерти. Поначалу этот механизм был идентифицирован морфологически и назван апоптозом [Kerr et al. 1972] (рис. 1). Истинный взрыв интереса к апоптозу произошел почти десятилетие спустя, когда

была обнаружена характерная для анонтоза дег радация генома гибнущих клеток: в pe tyjii.raie формируются олигонуклеосомные фрагменты двунитевой ДНК [Wyllie АН. 1980| В процессе гель-электрофореза такие фрагменты выстраиваются в группы полос в виде "лесенки". При некрчие дефадация ДНК наблюдаегся на поздних стадиях процесса и имеет стохастический характер.

Кисшим. П начале 90-х была дока tana 1снешческая запрограммированность ai ion iota и идентифицированы гены, ответственные за индукцию и развитие апоптоза. Мерным из них в клетках млекопитающих оказался ген человека, кодирующий про iea IV, ответственную за мост-трансляционный процессинг пропептида ишерлейкина 11,-1(5 (ICE: - Interleukin-l[5-converting enzyme) [Yuan 1993]. Позднее были мдешифицированы другие гены ICl.-гomo.toiи (СРР32, Nedd2, ТХ, Mch2, Ichl-I I Продукты этих генов являются цисгеии содержащими протеазами, имеющими cvócipaiHvio специфичность к аспарагину. Эю послужило причиной объединения их н семейство под общим названием каспазы (caspases: cistein-containing, asparagine-specillc proteases) [Salvesen, Dixit, 1997. Thornberry, Lazebnik,1998], Каспазы являются важнейшим компонентом биохимического механизма самоуничтожения клетки. Капицы вызывают ограниченный сайт-специфичный протеолиз многих белков клоки. Ключевые исполнители программы клеточной гибели постоянно Репрессированы, но неактивны, то есть находятся в форме проэнзима. Прокаспазы ofipaivior группу ферментов, насчитывающую 14 цистеиновых протеаз [Thornberry, I ;\/ebnik,1998], В зависимости от длины N-концевого домена, прокаспазы разделены на дне группы.Среди представителей, содержащих длинный N-концевой продомен, иденшфицироваиы две последовательности, ответственные за белок-белковые шаимодействия - DHD (death effector domain) и CARD (caspase recruitment domain). Ь.таюдаря им прокаспазы образуют олигомеры или взаимодействуют с другими белковыми факторами, способствующими акгивации фермента [Yang et al. 1998, Li et al IW8|. Неактивный профермент представляет собой единую полипептидную цепь, которая подвергается частичному протеолизу и укладке в сложную субъединичную структуру активного фермента. Протеолитический процессинг осуществляется по caiiiy, содержащему остаток Asp, в области, соединяющей большую и малую слСч.едипицы фермента. Степень протеолиза регулируется аминокислотной иоследовагельностью в ближайшем окружении Asp-сайга [Srinivasula et al. 1996, Muzio el al 1997, Slee et al. 1999] Первичным активирующим ферментом может выступать акшвная "инициаторная" каспаза. Например, при лиганд-рецепторной индукции

апотпоза "инициатором" является каспаза 8, которая осуществляет процессинг-активацию "исполнительных" ("executioner") каспаз 3, 6 и 7 [Salvesen,Dixit, I999|

Нерепарированные повреждения в геноме, индуцированные мутагенами и/или радиацией, активируют другую "инициаторную" касиазу 9 [Li et al. 1997] Активация инициатора, более сложный процесс, требующий участия митохондриальных компонентов (цитохрома С, Apaf-1 и АТФ). ,

Мембрана. Апоптоз завершается распадом клетки на мембранозамкнутые апоптозные тельца (apoptotic bodies). Этому процессу сопутствует индукция тканевой трансглутаминазы, сшивающей белки в сеть нерастворимых комплексов, что укрепляет мембрану апоптотических клеток [l'iacentini et al. 1991 J.

Вообще для мембраны нормальной клетки характерно асимметричное распределение фосфолипидов: молекулы фосфатидилхолина и сфингомиэлина экспонированы преимущественно во внешнюю сторону мембраны, а фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин экспонируются внутрь клетки [Ор den Кашр, 1979]. При апоптозе асимметрия распределения нарушается: на внешней поверхности возрастает доля фосфатидилсерина [Fadok et al. 1992]. Это служит сигналом для распознавания апоптотических клеток макрофагами и их поглощения.

Р53. Одной из ключевых молекул в апоптозе признан белок р53. Продукт гена р53 - полипептид (состоит из 393 аминокислот), содержащий 3 домена (Dickman, 1997). N-терминапьный домен, включающий в себя 45 аминокислотных остатков, ответственен за трансактивацию промоторов респонсивных генов - генов, транскрипция которых активируется белком р53. Центральный домен, пептид, заключенный между 113 и 290 аминокислотными остатками, отвечает за связывание белка со специфическими респонсивными последовательностями ДИК. С-терминальный домен, участок с 319 по 363 аминокислотый остаток, ответственный за неспецифическое связывание с однонитевой ДНК и РНК. Белок функционально активен в виде тетрамера. Тот факт, что мыши-гомозиготные мутанты по гену р53 развиваются в нормальные взрослые особи до 9-месячного возраста (Donehower et al., 1992), позволяет предполагать, что р53 не обязателен для выполнения нормальных клеточных функций. В то же время функции р53 чрезвычайно важны и

разнообразны при различных стрессовых ситуациях, связанных с возникновением в геноме повреждений (Fritsch el al., 1993, Hall et ai, 1993). За это p53 часто называют "хранителем генома" (guardian of genome). Повреждения в ДНК приводят к подавлению распада р53, возрастанию уровня его содержания в клетке и открывают

мнможиоаь для р53 выполнясь свои разнообразные функции, большое разнообразие <|»> 11 Kt in it и регуляторных нзаимодейсшии, и которые р53 может вступать побуждает предполагав существование ею в клетке в виде 3 форм: латентной, активированной и апошотической (Hansen, Oren, 1997). Дне последние являются активными и обеспечивают контроль за реакциями клетки на повреждение. Каждая из трех форм с i [4)1 о не идентифицирована, но сущест вуют экспериментальные данные, косвенно свидетельствующие в пользу их существования [Fu el til., 1996, Knippschild el al., 1996, . Shaw et al, 1996, Hansen R., Oren, 1997]. 1>олее детально участие p53 в апотггозе и репарации отражено па рис.2

Как видно из схемы, р53 осуществляет остановку клеточного цикла в точке Gl путем трансактивации тена p2l WuJ-I Cip-I. Его продуктом является ингибитор циклим-ганисимой киназы. Ингибитор снижает уровень фосфорилировании белка ретинобласюмы pRb. В нефосфорилированном состоянии pRb образует прочный комплекс с фактором транскрипции Н2Г. В составе этого комплекса фактор E2F не способен осуществлять свою транскрипционную функцию, в результате блокируется продвижение клетки но циклу [cl-Deiry et al. 1993]. Кроме тою, р21 способен Hciynaib во взаимодействие с компонентом транскрипционного/репаративного комплексов I'CNA (proliferating cell nuclear antigen). Это снижает скорость транскрипции, и укорачивает размер синтезируемых фрагментов ДНК, что создает предпосылки для репарации [Marx 1994] Далее рассматриваются методы

peí iicipaumi и количественной оценки аиоптоза

Методы регистрации апопгош.

11а сеюдняшний день морфологические изменения погибающей клетки являются основным критерием идентификации аттоигоза и его дискриминации от алыернативиой формы гибели, некроза. Используются электронная, фазово-контрасшая и флуоресцентная микроскопии (рис. I).

Широко распространенным маркером агюпгоза является "лесенка" фрагментов ДНК, формируемая при гель-электрофорезе ядерных ДНК-экстрактов. Однако следует имен, в виду, что апоптоз некоторых линий клеток не сопровождается межнуклеоеомной деградацией [Akagi et al.,1993] Ьолее универсальным показателем является крупноблочная деградация.генома ("доменная фрагментация" 11 -arnshaw, 1995,Jarovaia et al. 1995]), в результате ко юрой формируются фрагменты ДНК длиной 50-700 тыс.п.о. [Oberhammer et al.,1993]. Этот процесс всегда предшествует межнуклеоеомной дег радации |Bortner et al.,1995] Допускается участие

в этом топоизомераз [Razin et al, 1995]. Апоптотическая фра! метания ДНК сопровождается формированием большого количества свободных концов ДНК в спейсерных и коровых участках хроматина [Peitsch, 1993]. Эти концы Moiyr быть идентифицированы с помощью терминальной иуклеотидил-трансферазы, присоединяющей к З'-ОН концу биотинилированный dUTP (метод TUNEL: temiinal deoxynucleotidyltranslerase mediated dUTP-biotin nick end labelling). Регистрацию флуоресценции таких клеток можно проводить микроскопически, либо с помощью проточного цитофлуориметра [Hotz,1992, Koopman,1994|.

Методы проточной цитометрии позволяют идентифицировать апоптоз на основе измерения содержания ДНК в клетке (оценка доли гиподинлоидных клеток) [Darzynkiewicz et al. 1992], изменения светорассеяния клеточной суспензии за счет уменьшения линейных размеров гибнущих клеток [Dive 1992., Swat,1991], возрастания чувствительности ДНК клеток к денатурации [Hotz,1992, Нага,1996].

Широко используется идентификация участников процесса гибели клетки, таких как р53, р21, ДНК-РК, PARP, ATM, цитохром С и др. Идентифицируются как продукты трансляции, так и мРНК - соответственно Вестерн- и Нозерн-блоттинги с использованием моноклональных антител [Darzynkiewicz, 1998]. Однако, поскольку все идентифицируемые белки экспрессируются и в нормальных жизнеспособных клетках, т.е., сами не являются маркерами гибели, то этот метод нуждается в дополнительных тестах из тех, которые перечислены ранее.

Недавно было обнаружено, что антикоагулянт а, аннексии V (VACa) преимущественно связывается с отрицательно заряженными молекулами фосфатидилсерина [Andree,1990] Использование аннексина V, сконъюгированного с флуоресцирующим зондом (FITC, fluorescein isothiocyonate) позволяет определять уровень экспонирования фосфатидилсерина на поверхности мембраны апоптотических клеток [Andree,1996],

На сегодняшний день процесс программированной гибели клетки довольно полно описан на морфологическом, биохимическом и молекулярном уровнях. Схематическое представление этого процесса приведено на рис.3. Морфологически и биохимически апоптоз разделен на две фазы: фазу подготовки (предапоптотическую, commited phase) и фазу деградации (execution phase). В течение первой фазы происходит экспрессия и активация важнейших медиаторов р53, pRb, 1RF-I; трансактивация генов, блокирующих прогрессию клетки по циклу; индукция генов репарации, репарация и/или фиксация повреждений ДНК. Длительность ной фазы по

* \

суш определяет длительность апоптоза. Она варьирует от нескольких до 24 ч |l.cist,Nicotera,1997J. Завершается фата активацией молекулярного механизма апошоза и формированием в клетке состояния готовности к гибели ("cell commeted to diu"I При эюм морфоло! ически клетка сохраняется интактпой. Вторая фаза апоптоза topai;to менее длительна (не более 2 ч [Messam, l'ittman,l998]), по более драматична. Чдееь аноптоз приобретает характер видимых необратимых морфологических н (менений в клетке, которые являются следствием процессов происходивших в предшествующей фазе. Наше внимание в данном исследовании было направлено главным образом на влиянии процессов репарации, протекающих в первой фазе, на феноменологию и механизм клеточной гибели, наблюдаемой в терминальной фазе (на рис 2 но о1мечено вонросшельным знаком)

В то же время, учитывая такое распределение длительностей фаз апоптоза, а щкже аеинхронность вступления клеток в аноптоз, следует ожидать в каждый момент времени довольно небольшую долю клеток с видимыми (терминальными) признаками апошоза [l:arnsha\v,1995, Sanejima et al. 1998]. Поэтому использование методов поклеючной регистрации гибели позволяет избежать или уменьшить недооценку часю1ы апошоза в гетерогенной клеточной популяции.

Повреждение ДНК в индивидуальных клегках; метод ДНК-комет .

В последнее время широкое распространение получил метод ДНК-комет, с высокой точностью регистрирующий повреждения ДНК в клетке [Fairbairn et al. 1995, Тронов, Пелевина,1996, Olive,1999, Piperakis,1999], Метод позволяет поклеточно определять одновременно повреждение ДНК и ее содержание в клетке.

Суспензия клеюк (ингактных или после воздействия) смешивается с раствором aiapoibi, и смесь наносится гонким слоем на поверхность микроскопического стекла. После застывания геля стекло погружайся в лидирующий раствор, обеспечивающий ли tue мембран и частичное высвобождение ДНК. В результате из каждой клетки формируются нуклеоиды, иммобилизованные в агарозе. В постоянном электрическом ноле свободные петли (сегменты) ДНК мигрируют (вытягиваются) к аноду, придавая нуклеоиду асимметрию. Любая обработка, способствующая высвобождению ДНК из ядра KJieiKH (разрывы, проiciinaia) увеличивает миграцию ДНК. Стекла по|ружаются в нейтрализующий раствор (0.4 М Tris-HCI, pH 7.4), способствующий ренатурации, ДНК окрашивается флуоресцирующим красшелем (АО, RB, DAP1, Hoechst 33342 и тр ) ДНК наблюдают, используя флуоресцентный микроскоп, снабженный сооп1етс!вуюишми фильтрами. Использование щелочного лавирующего раствора

переводит ДНК в одионитчатую форму. Образующиеся одношпевые фр;п менгы ДНК мигрируют как независимые молекулы.

На рис. 4 представлены компьютерные изображения ДНК-комет, наблюдаемых под микроскопом. Голова кометы представляет собой полость в агарошом |еле, заполненную ДНК и сохраняющимся матриксом. Но существу комета представляет собой клеточный геном, поскольку в щелочных условиях РНК распадается, и флуоресцирует только комплекс ДНК-краситель Результатом регистрации является графическое представление индивидуальной кометы в виде профиля интенсивности флуоресценции (рис. 4). Этот профиль в дальнейшем анализируется. На профиле в общем виде без труда дискриминируются голова кометы и ее хвост; каждый iti них характеризуется своим профилем интенсивности флуоресценции.

Общепринятым параметром, характеризующим ДНК-комету является момент хвоста кометы mt [Olive et al., 1490] Он представляет собой произведение медиант,! хвоста кометы (Хт) и доли ДНК в нем (Ft): mt = Xm*Ft,

Хт = [2(Ii*Xi) ]/Zli, t t

Ft = (En) / (En).

t с

Здесь Ii - интенсивность флуоресценции в точке i; Xi - расстояние ог медианы головы кометы до точки i, Мс - интегральная флуоресценция комеIы Индексы нот знаком суммы обозначают область суммирования: t - суммирование прополи гея только в пределах хвоста кометы; с - суммирование в пределах всей кометы Н дальнейшем помимо параметров mt и Ft исполыуются показатели интегральной интенсивности флуоресценции кометы Мс - iji и 1-е полная длина кометы о г начала головы до конца хвоста. С учетом некоторых оговорок Мс соответствует содержанию ДНК в комете (клетке), a mi - мера поврежденное!и ДНК в клетке. Вообще, моим ДНК-комет не является абсолютным Поэтому для количественной интерпретации результатов в терминах повреждений ДНК любой используемый параметр нуждается в эмпирической калибровке. Общепринято испольювагь с этой целью понтирующее излучение, исходя из того, что 1 Гр индуцирует около 1000 ОР [Ward К.1,1988] и 50-80 ДР [Holley, Chatterjee.1996, Ager, DewcylWO] в диплоидном геноме k.-icimi Принципиальным моментом является то, что калибровка корректна только и том диапазоне воздействий, в котором параметр комег линейно изменяется с ростом доты

Для щелочных условий (ОР) область линейной зависисмости mt от дочы (0-10) Гр. Дли ней i рольных коме i (ДР) ног лиана юм расширяйся до (10-200) Гр (Olive 1995].

В следующем разделе приводя 1ся резулыаты собственных исследований, иллюсфируютне также возможности метода главным образом для харктеристики и дискриминации форм клеточной гибели

1.2. Материалы и методы.

Лимфоциты выделяли из венозной крови доноров, центрифугируя i спарини тированную кровь, наслоенную на смесь фиколла с верографином (р I 078 i см') |Ьелум Л. 1980]. Процедура обеспечивает получение клеточной суспензии, в котрои более 90 % составляют лимфоцшы Суспензию инкубировали в пластиковой посуле при 37 С в атмосфере 5% С(К

Морфоло! ические исследования проводили после окрашивания клеток смесью Л О и lilBr (50 mki/mji каждого) и после тщательного перемешивания микроскопировали в течение 1-2 ч. Использовали флуоресцентный микроскоп с длимой волны возбуждающего света 390 нм, барьерный фильтр 420-450 нм. На каждую ючку иросчшывали не менее 200 клеток. Следующие признаки были основными критериями классификации клеток (рис.1). 1) Ярко-зеленые клетки.содержащие ядро неправильной формы с неравномерно окрашенным хроматином, - интактные клетки. 2) Клегки с интактным ядром, окрашенные в оранжевый и желтый цвета, - некротические клетки. К некротическим относили также KjiciKH увеличенного размера с неидентифицируемой структурой. 3) Зеленые или оранжевые клетки с характерной морфоло! ней ядра: округлое ядро, содержащее хроматин, конденсированный по периферии, хроматин плотно конденсирован в виде шара или полумесяца; фрагменгированиое ядро. Во всех случаях окраска ядра яркая и i омо1 енная, без малейшей внутренней структуры хроматина, - апоптотические клетки. Оранжевая окраска свидетельсвует о наступившей пермеабилизации на поздних стадиях апошоза.

Облучение проводили на гамма-установке Cs с мощностью дозы 0.5 Гр/мин в доте 5 Гр. Клетки инкубировали при 37 С во влажной атмосфере, содержащей 5%

аъ

Выделение и электрофорез нуклеосомных фрагментов ДНК проводили по методу, описанному в рабоге |llermann et а1.1994|, модифицированному нами [Громов и

соавт,1999]. Клетки лизировали в низкосолевом буфере:NP-100,20 тМ НОТА, 50 тМ Tris-HCl, рН 7.5. Суиернатант обрабатывали протеиназой К, ДНК высаживали этанолом в 2.5 M ацетате натрия. Осадок растворяли в утяжеляющем буфере 0,05% бромфеноловый синий, 40% (w/v) сахароза, 0,1 M EDTA, рН 8, 0,5% (w/v) Ds-Na. Электрофорез проводили в 1% агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл I'tBr, в ТАЕ-буфере рН 8.3

Щелочные ДНК-кометы получали в условиях лизиса и электрофореза, соответствующих стандарту [Singh, Stephens, 1997]. Клетки иммобилизовали в гонком слое легкоплавкой агарозы (0,5% в PBS) на поверхности стекла. Стекла пог ружали в лизирующий раствор (2,5 M NaCl, 100 мМ EDTA, 10 мМ Tris-HCl, рН 10, 0,5 % Triton Х100, 1 % Ds-Na, 10 % DMSO) ночь при 8 С. Затем слайды инкубировали 30 мин в буфере для электрофореза (300 мМ NaOH, 1 mM EDTA, рН>13) Электрофорез проводили при постоянном напряжении 0,8 В/см, 20 мин. После электрофореза стекла промывали в 0,4 M Tris-HCl, рН 7,5. На поверхность геля капали 50 мкл водного раствора иодистого пропидия (10 мкг/мл), накрывали покровным стеклом и микроскопировали с помощью флуоресцентного микроскопа (длина волны возбуждения 390-420 им, барьерный фильтр 500 им). Количество комет, детектируемых на одну экспериментальну точку, варьировало в разных экспериментах, но всегда превышало 50.

Нейтральный вариант метода ДНК-комет отличался от щелочного тем, что после лизиса слайды помещали на 1 час в буфер ТАЕ, содержащий 100 мМ ЕДТА, рН 9.09.5. Электрофорез проводили в этом же буфере при напряжении 0.7 В/см, 20 мин. По окончании электрофореза слайды выдерживали 5 мин в 300 мМ NaOH H тМ Na2EDTA и нейтрализовали Трис-буфером (0.4 М, рН 7.4). В опыте с бесклеточной системой клетки иммобилизовали в агарозном слайде и лизировали в стандартном лизирующем растворе 1 ч. Затем лизирующий раствор заменяли на PBS, содержащий агент и инкубировали 30 мин при 4-8° С. После отмывки слайд подвергали инкубации в 300 мМ NaOH + 1 мМ EDTA и электрофорезу в этом же буфере. Во всех случаях визуализацию комет проводили после окрашивания PI, 10 мкг/мл. Определение белка р53 с помощью вестерн-блотинга проводили в соответствии с работой [Agapova et al. 1999].Клетки (107) лизировали в течение 2-4 мин в лизирующем растворе (300 - 500 мкл), содержащем 20 mM Hepes (рН7.6), 10 шМ NaCl, 1.5 шМ МцС12, 0.2 шМ EDTA, 20% глицерин, 0.1% triton XI00, 1 тМ DTT, 1 тМ PMSF, 100 мкг/мл апротинина. К осадку после центрифугирования (10000 об/мин,

30 с| добавляли буфер NC (20мМ Ilepes (pll 7.6), 500мМ NaCi, 1.5мМ MgCI2, 0.2мМ ')Д1Л, 20% глицерин, 0.1°/» 'Григом Х-100, 1мМ DTT, 1мМ PMSF, апротинин 100 мкт/мл), суспендировали и ставили на качалку. После центрифугирования ЮОООоб/мин 10 мин использовали супернагант. К требуемому объему лизага добавляли 0.5 объема лодинг-буфера:150мМ Трнс-11С1 (рН-6.8), ЗООмМ DTT, 6% SDS, 0 3% бромфеиол синий, 30",« глицерин и прогревали при 95С 5 мин. После охлаждения на льду и центрифугирования 10000 об/мин, 10 мим образцы вносили в icjii. для электрофореза. Электрофорез:5% 11ЛГ концентрирующий 1 М Трис НО (рН 6 8), 7 5% Г1ЛГ' разделяющий 1 м Трис HCI (pll 8.8) содержал 10% SDS, TEMED, 10% l'SA. Буфер для 'злектрофо|нгза: 25 мМ Трис, 250 мМ глицин (рМ 8.3), 0.1% SDS 35-40 мА Использовали белковые маркеры Rainbow (14300-220000 Da). Влажный блот-перенос проводили с помощью прибора Semiphor, 150 mA, 3 ч. Перенос осуществляли на мембраны hybond ECL-membrane, Arnersham, в блот-буфере: ЮмМ Трис-НС1 ipil 7.4), 0.4% NaCI, 0 5еó Tucen 20, NI'DM (обезжиренное сухое молоко) 5мг/мл. Мембраны проявляли моноклинальными ант т елами 421 в разведении 1:3000 в блот-буфере, не содержащем NDFM, 45-60 мин. Вторичные антитела (antimouse Fab NA9310, Arnersham) в блог-буфере, разведение 1:5000. Белковые зоны ви палтировали с помощью ECL-набора (Arnersham).

1.3. Классификация щелочных ДНК-комет.

Все множество комет, наблюдаемых в микроскопе, разбивали на 5 классов (рис 4) Для представления 1етерогеиной популяции комет в измеряемом образце нсиользовали гистограммы частотных распределений каждою из параметров ( из них находили средние значения параметров T/-SD) или бивариантные распределения по паре параметров: момент-интегральная флуоресценция (mt - Мс) или длина хвоста -доля Д1IK в хвосте (1.1 - Ft), в которых каждая комета представляется точкой в плоскости координат пары параметров. Такое сочетание параметров является наиболее информативным и чаше всего встречайся в работах, использующих метод Д1 lK-комет.

Соответствующие 5 классам комет средние параметры приведены в таблице 1. Первый класс комет СО характеризуется симметрией и максимальной ншенеивнос1ью флуоресценции. Кометы, омюсящиеся к классу С1 отличаются от коме( СО небольшой асимметрией гало за счет миграции ДНК. Иногда бывает трудно осипни, кометы CI от СО не только визуально, но и по параметрам, поэтому мы

объединили их в одну группу (С0/С1). Для комет этой группы характерны компактные биварианты: гги<5, а доля мигрирующей в хвост ДНК не превышает 15%. Кометы ' класса С2 всегда характеризуются наличием отчетливо выраженных I оловы и хвоста.

Таблица 1 Средние значения параметров пяти классов

Класс комет MC+/-SD (о.е.) mt+/-SD Ft+/-SD (о.е.) Lt+/-SD (мкм)

СО 1.00 +/-0.20 1.0+/-0,8 0.06+/-0.03 7.1+/-6.7

С1 0.98 »/-0.29 3.41/-1.3 0.15+/-0.03 20.0 »/-12.3

С2 0.62+/-0.29 8.8+/-4.0 0.30+/-0.08 38.2+/-15.3

СЗ 0.38+/-0.14 26.9+/-11.8 0.60+/-0.05 69.0»7-22.9

С4 0.27+/-0.14 39.7+/-14.2 0.84+/-0.08 82.4+/-28.9

Результат получен путем усреднения параметров >100 комег каждого класса. Приведены средние значения параметров +/-8.0.

Доля мигрирующей ДНК возрастает,варьируя в пределах 20-40%, и но приводит к увеличению момента хвоста - mt. Тот факт, что значительная часть Д11К не мигрирует из головы кометы объясняется тем, что ДНК остается связанной с ядерным матриксом. В кометах СЗ наблюдается снижение Мс. Это снижение флуоресценции связано с значительным повреждением ДНК и структурными изменениями хроматина. Возможна также утрата части ДНК из-за деградации: шикополимерные фрагменты могут экстрагироваться из геля в процессе лизиса клеток. Кометы класса С4 также характеризуются снижением Мс по сравнению с СО/С 1 и С2-комегами. Отличительной особенностью комет С4 является видимый отрыв хвоста от головы кометы. Это свидетельствует не только о значительной деградации ДНК, но и об утрате связи ДНК с ядерным матриксом. В связи с представленной классификацией встает вопрос о связи типов комет с уровнем повреждения ДНК и фазой аноптоза. На сегодняшний день отсутствует достаточно универсальный показатель, характеризующий предапоптотическое состояние клетки.

1.4. Связь классов щелочных комет с количеством разрывов ДИК и фазой апошоза JIK4.

Два важных процесса, сопровождающих апоптоз - дег радация ДНК и иротеолиз ядерного матрикса, не могут не отразиться на формировании ДНК-комет Начальная крупноблочная деградация хроматина завершается • формированием фрагментов двунитевой ДНК >50 тыс п о. Эти фрагменты могут сохранять связь с ядерным

V 16

мафиксом. Потому логично связать лот уровень деградации с кометами классов С1-СЗ Межнуклеосомная деградация наблюдается на поздних лапах аггоптоза, когда становятся видимыми морфологические изменения в клетке. Па этом -папе активированные касназы вьпывают протеолит цшоскелета и ядерггою магрикса. Помочу считается, чн> апогпогические клетки с видимыми морфологическими и 1ЧСНСШ1ИМИ формируют коме1ы 4 класса [Olive,1943, Fairbairn et al.,1995, 1996]. Для более строгой корреляции класса комет с уровнем повреждения ДНК (фазой клеточной шбели) мы исследовали формирование комет из лимфоциюв, нолпертнутых гамма-облучению в условиях блока репарации (О С, PBS» 20 тМ 1-:1)1Л).

Область линейной зависимости tnl "щелочных" комет от дозы гамма облучения клеток ограничена диапазоном (0-10) Г'р [Olive et al.,1998], в ггределах которой скорость накопления ОН с дозой облучения остается постоянной 1000 ОР/диплоидный icnoM клетки. Область значении mt, приходящихся на линейный участок laiiiiciiMOCTii, рагбита на 3 ингервала (рис. 5), соответствующих значениям mt комет СО, С1 и С2 (согласно данным таблицы 1). 1 Iojiai ая средний размер ДНК в хромосоме ЛКЧ 100 М и.о. [Morton, 1991 ], можно оцепить размер однонитевого фрагмента ДНК,

Таблица 2. Параметры щелочных комег, формируемых облученными ЛКЧ

и соответствующий им ра i мер фрагментов одноценочечной ДНК.

Класс комет Интервал mt Доза (Гр) Размер фрагмента (тыс.пукл) Клетки*)

СО 0.3-1.7 0.0-0.5 10М.2*104 via.

CI 2.4-3.6 1.0-2.5 6*10,-2.4*101 via./pre-ap

С2 4 5-1 1.5 3.0-10.0 2*lü'-6*l02 рте-ар.

СЗ 15.0-38.7 >10.0 <■6*102 рге-ар./ар.

С-1 >40 - - ар/пест. (?)

*) via. - жизнеспособные, интакшые клетки, рге-ар - предагюптотические клетки ; ар. - апоптотические клетки; пест - некротические клетки

соответствующего каждому из трех классов комет. Результат такой оценки иредоанлен в таблице 2. В ней вычисленный размер фрагмента уменьшен в 1.5 раза и счет вклада щелочелабильных сайтов в результате облучения и за счет стчасгической деградации ДНК в щелочной среде.

Согласно данным пульс-электрофореза, в начале аноптоза (фаза преданоитоза) инициирующая деградация продуцирует фрагменты двусггиралыгой ДНК, размер которых варьирует от 700 до 50 тыс. и о | ОЬегЬаттнттег е1 а1 ,1993] Как видно из

таблицы 2, этому диапазону соответствуют фрагменты, дающие кометы С2 и СЗ Проведенная оценка позволяет установить соответствие между классами комет и фазами апоптотической гибели (глубиной деградации генома). Это соответствие приведено в последней графе таблицы 2. Общим для комет С0-С2 является то, чю ДНК в них сохраняет связь с ядерным матриксом, а механизм формирования mix комет - ориентация свободных концов ДНК в сторону анода. Для комет С4 характерен иной тип миграции в электрическом поле - миграция независимых фрагмент он ДНК. не связанных с ядерным матриксом (рис.4). Кометы СЗ занимают промежуточное положение между С2 и С4 классами.

1.5. Корреляция метола ДНК-комег с морфологическими щменениими клеюк и процессе гибели.

Корреляцию осуществляли прямым сопоставлением данных независимых экспериментов, в которых исследовали ДНК-кометы и одновременно опешша.ш морфологические изменения в лимфоцитах Поскольку морфологические изменения соответствуют фазе деградации (рис. 3), то логично скоррелировать эти данные с кометами СЗ и С4. Коэффициент линейной корреляции в этом случае, как видно, составляет гЧ).70, р<0.01. Однако, включение комет С2-класса увеличивает коэффициент корреляции до г 0 7') при уровне значимости р-0.001. Таким обра ¡ом, наилучшая корреляция прослеживается между долей комет (С2+СЗ + С4) и долей апоптотических клеток. Это позволяет выражать частоту аноптоза черет долю апоптотических комет, включая в них классы С2-С4

Два следующих раздела диссертации иллюстрируют возможности метода ;ии решения прикладных задач, связанных с характеристикой патологических состоянии и мониторингом их в процессе терапевтических процедур.

1.6. Поврежденность ДНК и спонтанный апоптоз лимфоцитов больных системной красной волчанкой.

Апоптозу принадлежит важная роль в удалении потенциально аутореактивных лимфоцитов, примером которой является негативная селекция клеюк в тимусе (Cohen, 1991). Ошибки в этом фи отологическом процессе могу т приводи п. к аутоиммунным заболеваниям. Предполагается, что подавление анонима способствует накоплению клона аутоиммунных лимфоцитов (Cheng et al.,|944) Прямые доказательства существования связи заболевания СКВ у человека с т епами, контролирующими апоптоз, отсутствуют. С другой стороны, с помощью морфологических показателей, проточной цитофлуориметрии и дифениламиновой

пробы на деградацию ДНК показано, то лимфоциты крови больных СКВ обладают повышенной склонностью к апонтозу in vitro но сравнению с лимфоцитами здоровых доноров (Hmlen el al.,1995) Цель данной раСнны заключалась в сравнительной оценке меюдом ДНК-комет спонтанной гибели лимфоцитов, получаемых из крови здоровых доноров и больных СКВ. Использовали щелочной вариант метода ДНК-комет. На каждую экспериментальную точку измеряли не менее 100 комет. Показано возрастание уровня спонтанной поврежденноеiи ДНК в лимфоцитах больных системной красной волчанкой по сравнению со здоровыми донорами. Доля комет классов > CI составляет 15% у здоровых доноров и >40% у больных СКВ. Популяции лимфоцитов, выделенных у здоровых доноров и у больных СКВ практически не отличались друг от друга как по содержанию ДНК в клетках, так и но распределению клеток по этому показателю. Однако, согласно морфологическим данным, в исходной популяции СКВ лимфоцитов наблюдается более высокое содержание апоптогнческих клеток. 11о >тому закономерна постановка вопроса о связи более высокой поврежденности ДНК в СКВ-лимфоцитах с их склонностью к сноп тайному апоптозу.

Спонтанную шбель клеток оценивали после 24 ч инкубации при 37С в среде RI'MI-1640, содержащей гдутамин (20 мМ) и собственную плазму (10%). Сразу после выделения лимфоциты больных в среднем содержат большее количество анонютических клеток по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров (20% против 6%, р- 0 01, Манн-Уитни). Наблюдается также более высокое варьирование этого показателя среди больных СКВ по сравнению с контрольной группой.

Инкубация покоящихся клеток in vitro в течение 24 ч еще больше проявляет различие между двумя исследованными труппами доноров. В популяции лимфоцитов здоровых доноров после 24 ч инкубации обнаруживается в среднем 20% анонютических клеток (комет классов С2-С4). Лимфоциты больных СКВ в результате инкубации обнаруживают достоверное увеличение доли анонютических клеток в среднем до 54% (р- 0.001, Манн-Уитни). Это возрастание приходится главным образом на кометы С2/СЗ. Доля комет класса С4 как для здоровых доноров, так и для больных не превышает нескольких процентов

В заключении следует ошетить, что повышенное содержание разрывов в 1СИОМС може1 быть как предпосылкой аиошоза, так и результатом его начала. Дриими словами, вопрос о первоначальном сигнале, запускающем механизм гибели лимфоцитов больных СКВ, остается открытым. Является ли таким сигналом

I1)

повышенное содержание дефектов в геноме с последующей экспрессией гена р53 или реализуется какой-либо другой механизм покажут последующие исследования Но всяком случае, повышенный апоптоз in vitro лимфоцитов больных СКВ скорее bcci о отражает изменения в этих клетках in vivo, связанные с патогенезом заболевания. 1.7. Оценка повреждений ДНК при терапевтическом облучении in vivo. Возможности метода ДНК-комет при мониторинге терапевтическою воздействия были оценены на 3 больных хроническим миелолейкозом (XMJI). подвергшихся тотальному фракционированному гамма-облучению до получения общей дозы 1 Гр [Johnson et al.,1971, Rosenberg et al.,1971]. Каждый больной ежедневно подвергался облучению в лозе 10 сГр в течение 5 дней. После нескольких дней перерыва 5-дневный курс облучения повторялся. Облучение проводилось на фоне стандартного курса химиотерапии. По мере накопления дозы у больных брали кровь и в течение 2-3 ч из нее выделяли лимфоциты, которые исследовали с помощью метода ДНК-комет. В таблице 3 приведены средние значения длины кометы I., найденные для каждого больного в процессе его облучения и спустя более двух месяцев после окончания курса.

Таблица 3. Изменение средней длины хвоста комет из лимфоцитов трех больных ХМЛ,подвергнутых фракционированному терапевтическому облучению

Накопленная лоза, Гр

Больные 0.0 0.1 0.5 1.0 70 дн*

Ап L + /- SD, мкм Ап

1 8 66+/-19 75+/-30 85+/-19 104+/-19 93+/-30 28

2 12 64+/-17 82+/-24 119+/-29 78+/-29 19

3 7 59+/-16 82*/-24 91+/-24 86+/-21 17

*) Результаты получены спустя 70 дн после завершения курса Прицелены средние значения из >50 комет +/-5.(1. Лп - % апопготнческих клеток сразу после выделения лимфоцитов из крови.

Как видно, уровень повреждения ДНК нарастает по мерс накопления дозы облучения Обращает на себя внимание тот факт, что спустя 2 месяца после курса 1ерапнн по крайней мере в части,клеток обнаруживаются повреждения ДНК. Эти повреждения могут отражать более высокую частоту апоитоза в ЛКЧ больных после их зерапип. что частично подтверждено морфологическими данными.

--.у

Ж" ... в

Рисунок 1. Характерные морфологические изменения в клетках по мере их прогрессии в апоптозе. А, Б, В, Г и Д -лимфоциты крови человека. Е - асцитные клетки мыши; краситель - акридиновый оранжевый. Фото А - интактная клетка; на фото П видна также некротическая клетка. На фотографиях разное увеличение.

Рисунок 2 Предполагаемое участие р53 в репарации и апоптозе клетки Вопросительным знаком отмечена область интереса диссертации

DNA-duTUse form«}»

соммгпш

PHASE

EKVraaiotVKtivsUm оГгЗЗ l'KF l RM

I--

Activ»Uce ç£ сырме*

-В»*

ЛсЪтЬоп с£laute prate«» (ywuyntM А, В, 3)

............./>..................

rro, l.amH КиН>

■uv^KoluKW change« ■ —active)

DS/SS ibivige ui DNA

Û...S.

\yJ vv

■lim l'A h l»-<(i

l'Akl'-<leaviipe

HMW-h|nied« ufi o<

La <1 do- 'fri0ncnlB(im

кхг.сипоы

141АКК

.J 1

Рисунок 3. Схематическое представление последовательности событий, святывакицих первичные повреждения ДНК с конечным феноменом программированной клегочной гибели клетки Схема адаптирована щ (МапсИе « а1. 1996)_

Dose. Ci у

Рисунок 5 Зависимость среднего момента хвоста комет о г доил облучения клеток. Представлены средние значения из 3 независимых экспериментов -+/-80

Рисунок 4. Микрофотографии комет С0-С4, получаемых из лимфоцитов крови человека после инкубации с перекисью водорода (50 мкМ) Из [Тронов и соавт. 1999] и профиль интенсивности флуоресценции кометы СЗ._

1.8. Заключение.

Me i од ноклеточной регистрации разрывов ДНК , метод ДНК-комет, позволяет обнаруживай. повреждения ДНК в отдельной клоке, индуцированные облучением в до te <1 Гр. Me юл позволяет идешифицировать крупноблочную деградацию ДНК на j

ранних папах anonroia. Анализ бивариантных распределений комет позволяет j

дискриминировать преимущественную форму гибели клеток в популяции. Однако, !

для iакои дискриминации на уровне отдельной клетки требуется привлечение •

морфоло! ическнх исследований. Ппервые продемонсфированй корреляция данных, полученных с помощью метода ДНК-коме i и результатов морфологической оценки части,! апопгоза лимфоцшах. Прикладные возможности метода ДНК-комет впервые нродемонсфироваиы на лимфоцишх больных СКВ и больных XMJ1, подвергнутых нналыюму фракционированному облучению. Полученные результаты позволили в следующих разделах работы оптимально использовав метод ДНК-комет в сочетании с др\1ими методами для анализа механизма гибели ЛКЧ в связи с типом разрывов Д1 f 1С и динамикой их репарации.

Глава 2. IIК К* PO i И А1ЮПТОЗ В РАДИАЦИОННОЙ ГИБЕЛИ ПОКОЯЩИХСЯ ЛИМФОЦИТОВ

2.1. Радиочувствительность лимфоциюв in vitro.

Ранее (см. гл. 1(7)) мы показали, что лимфоциты крови человека (ЛКЧ) обнаруживают чрезвычайно высокую радиочувствительность in vivo, которая выражается в способности клеток подтереться апоптотической гибели при сравнительно малых дозах ионизирующей радиации [ Тронов и соавт.,1993]. Повидимому потенциальная способность лимфоциюв к пролиферации обусловливает их изначально высокую чувствительность к возникающим в ДНК повреждениям. Это проявляется в Юм, чю при сравншельно низких уровнях воздействия в популяции лимфоцитов прослеживался апонюз [Vrai et al. 1998, Story et al. 1994]. Однако, с ростом дозы во!действия частота апоптоза достигает насыщения на уровне 15-20%. Возможно это обуловлепо тем, что в покоящихся лимфошпах происходит конститутивная экспрессия HCl.-2, белка, подавляющею апонюз и повышающею жизнеспособность клеток [Yang, Kor snieyer, 1996, Bovia et al. 1998].

2.2.Mt'\aiiii 1МЫ радиационного анопюза лимфоцитов.

Апоптоз может быть индуцирован различными путями в зависимости от природы стимула, его интенсивности, типа клеток. В случае лимфоидных клеток важная роль в механизме клеточной гибели принадлежит CD95/Fas/APO-l системе, включающей в себя помимо CD95-peneriTopa CD95 лиганд (CD95L) [Seki et al. 1994]." Показано, что в результате облучения на поверхности клетки увеличивается экспрессия CD95L При участии лиганда на поверхности клетки формируется комплекс (CD95/CD95L), который активирует связанный с ним общий медиатор CD95- и TNF-индуцированного апоптоза -FADD/MORT1. С помощью ICE-подобной протеазы, ассоциированной с CD95/Fas (FLICE) активируются другие протеазы (в том числе каспаза-3), которые атакуют белки-мишени, осуществляя демонтаж структур в апоптотической клетке [Belka et al. 1998]. Как видно, такой путь передачи сигнала не предполагает участия повреждений ДНК и р53. С другой стороны, известно,что покоящиеся ЛКЧ устойчивы к сигналам CD95: замыкание на поверхности клеток рецепторов с помощью моноклональных антител и облучение (5 Гр) индуцировали в ЛКЧ около 10 % аиоптоэов [Belka et al. 1998].

Другим независимым от р53 путем развития апоптоза в ЛКЧ может быть "мембранный механизм", в основе которого лежит представление о церамиде как главном медиаторе этого пути развития апоптоза [Hannun, Obeid, 1995]. Церамид образуется под действием активируемых облучением сфингомиэлиназ, расщепляющих мембранный липид сфингомиэлин. Церамид непосредственно активирует протеинкиназу РКС-С, фосфатазу и мембранную киназу, которые атакуют белки-мишени, приводя к апоптозу [Santana et al. 1996]. В случае покоящихся ЛКЧ радиационный апоптоз отмечается спустя 24 ч и более после облучения клеток.

В этой части работы мы исследовали динамику развития клеточной гибели в покоящихся ЛКЧ, подвергнутых действию радиации in vitro. Использовали нейтральный вариант метода ДНК-комет. В такой постановке метод позволял регистрировать главным образом двунитевые разрывы ДНК и был менее чувствителен к ОР. Для проведения гель-электрофореза ДНК клетки иммобилизовали в агарозном гель-блоке размером 1x4x4 мм (2*106 клеток) Блоки помещали в лизирующий раствор, содержащий 0.2 % N-лаурилсаркозината,'20 мМ трис, ЮОмМ ЭД'ГА, 20 мМ NaCI, протеиназу К, 1 мг/мл на 2-3 ч при 37 С. По окончании лизиса блоки погружали в колодцы 1.5 % геля агарозы. Электрофорез проводили в ТВЕ буфере при напряжении 4 В/см в течение 1 ч и далее 2В/см 4 ч. Регистрацию осуществляли после прокрашивания 0.5 мкг/мл бромистым этидием.

2.3. 'laiiMCHMocu. nit or количества двупнтзых разрывов в ДНК.

Для коме г, формируемых двушнеиой ДНК в нейтральных условиях (нейтральные ДПК-комеш) область линейной зависисмоаи mt от дозы облучения ограничена j диапазоном доз 10-200 Гр [Olive et al. 1948] Причем, от 0 до 5 Гр чувствительность меюда может резко возрастать, то есть, увеличивается наклон кривой "доза-эффект". Ьлаюдаря этому, даже в нейтральных условиях открывается возможность оценить повреждающий эффект радиации при очень низких уровнях воздействия. Сам по себе hoi фак! не связан с двунитевыми разрывами в ДНК, а объясняется изменениями j происходящими на высшем уровне ее структурной организации в клетке - утратой ; с\нерспирадыюсти из-за появления однонигевых разрывов. |

'Зависимость «Д01а-эффск1» для лнмфоциюв, подвергнутых гамма-облучению, мрсдаавляет собой прямую линию в диапазоне доз 10-200 Гр для нейтральных комет. : Комсм.1 получали сразу после облучения в условиях максимального блока репарации. Как и в случае щелочных комет, линейный участок зависимоеги охватывает первые 3 ¡

класса неГнральных комет и частично кометы СЗ. В таблице 4 суммированы результаты '

анализа них данных,. Значения длины фрагменшв двусниралыюй ДНК (L) вычисляли, ; исходя из средней длины ДНК в хромосоме человека 100 М по. [Morton, 1991], ' |ффективнос1ь облучения - 70 ДР/1 Гр/диплоидный lenoM клетки [Ager, Dewey, 1990].Все значения mt получены усреднением результатов собственных независимых жеперименюв. Как видно, размеры двуцепочечных фрагментов, определяющих тип

нейфадьных комет, близок к размеру одноцепочечных фрагментов, формирующих тот i

же класс щелочных комег (таблица 1). Таким образом, нейтральные С2- и СЗ-кометы ;

Таблица 4 Параметры нейтральных комет, формируемых

облученными ДКЧ и соответствующий им размер _____фрагментов двусниралыюй ДНК._

Класс mt+/-s.d. Доза, Гр L., тыс.тз.о.

KOMCI

СО 6.1+/-1.3 0-13 10s-5*101

(Т 8.5+/-1.8 12-30 (5.4-2.2)*105

С 2 14.0(7-6.1 18-88 3 6*101-7.4*102

СЗ 31.0 + /-13.0 76-200 (8.6-3.3)*102

связаны с крупноблочной деградацией генома на ранних этапах апоптоза. Можно по иид им ии предположить, что кометы С4 формируются лимфоцитами на конечной стадии а1 юн юза - фа зс де1 радации. В связи с ним возникае! вопрос о способности метода ДНК-коме I дискриминировать апоптотическую и некротическую формы гибели.

2.4. Центральные кометы, формируемые некротическими клетками.

В отдельном эксперименте иммобилизованные в агарозе клетки ипк\fuipoiu in при 50 С в течение 20 мин. После такой обработки в клетках pamimaeiot коагуляционный некроз [Buja ct al. 1993]. Некротическая гибель лимфоцитов,

индуцированная гипертермией, сопровождается характерными изменениями Морфологически некроз идентифицируется как ранняя пермеабилитация клеточной мембраны: при отсутствии видимых изменений ядра, клетки становятся проницаемыми для бромистого тгидия. Со временем клетки увеличиваются в размерах, их т ранним становятся все более расплывчатыми, свидетельствуя о нарастающем атиолтне Наблюдается также деградация ДНК, что следует из результатов исследования ДНК-комет, формируемых некротическими клетками (рис.6): сразу после инкубации клеюк при 50 С возрастает момент хвоста комет. Эти изменения имеют необратимый характер, поскольку последующая инкубация клеток в полнопенной среде не обнаружите i признаков восстановления структуры ДИК. Этот результат резко контрастирует е поведением клеток после умеренной гипертермии (43.5 С), вызывающей главным образом апоптотическую гибель клеток [Fairbaim et al. 1995]. Как видно из рисунка, и и этом случае сразу после воздействия в ДНК лимфоцитов формируются разрывы, о чем свидетельствует начальное увеличение момента хвоста комет. Однако, в процессе инкубации клеток в полноценной среде (37 С, 5% С02) разрывы в ДНК ьтимпнирукнот (рис.6). Именно эта способность к репарации повреждений ДНК принципиально отличает апоптотические клетки от некротических. Эта репарация происходит в ни период, когда в клетках еще на наблюдаются какие-либо признаки апоптота - <|м <-т предапоптоза (commited phase).

Формируемые некротическими клетками кометы относятся к С1 и С4 классам, что подтверждают бивариантпые распределения комет, формируемых ЛКЧ нос те гипертермической обработки (рис.7). Эю кажется естественным, поскольку в омичис от апоптоза, при некрозе деградация ДНК происходит на терминальной стадии i поели При этом электрофорез экстрагируемой из клеток низкополимерной ДИК, обнаруживает стохастическую деградацию генома. Учитывая эти ретулыаты, в дальнейшем при анализе радиационной гибели ЛКЧ нейтральные кометы С4 класса идентифицировали i некротическими клетками. Кроме тою, как видно, дискриминирующая способное i т. метода ДНК-комет ограничена предамотошческой фазой, клетки в терминальной фа те апоптоза и клетки некротические формируют кометы класса С4.

2.5. ДНК-кометы в процессе радиационной гибели лимфоцитов.

На рис. 8 представлена динамика численности трех групп комет, формируемых жизнеспособными, апоптотическими и погибшими лимфоцитами. Видно, что в процессе инкубации иитактных лимфоцитов наблюдается монотонное снижение доли жизнеспособных клеток и одновременно происходит нарастание доли апоптотических и некротических клеток.

Облучение ЛКЧ в дозе 5 Гр приводит к снижению доли комет классов СО и С1 и одновременному возрастанию доли комет класса С2 сразу после облучения - результат образования разрывов ДНК. При инкубации наблюдается возрастание доли комет С4 (до 50%) и адекватное снижение доли СО/С 1-комет (до 35%). Эта динамика отражает процесс некротической гибели. В пользу этого заключения говорят результаты электрофореза ДНК, выделенной на это время из клеток: ДНК мигрирует в виде "шмера", что отражает процесс стохастической деградации генома в некротических клетках (рис.9, дорожка 2). Как результат некротической гибели, плотность суспензии ЛКЧ в интервале 10-12 ч после облучения падает в 1.5 раза (благодаря лизису погибших клеток). За счет этого наблюдается резкое снижение доли комет С4 и возрастание доли СО/С I-комет.

Постепенное нарастание доли С2/СЗ-комет в диапазоне 12-20 ч отражает процесс апотпо!ической гибели оставшихся клеток. Этот процесс сопровождается характерной для апоптоза межнуклеосомной деградацией хроматина, о чем свидетельствуют результаты гель-электровореза ядерных ДНК-экстрактов из ЛКЧ на поздних сроках после облучения (рис.9, дорожка 3). Прединкубация клеток с ингибитором синтеза белка циклогексимидом (0.1 мкг/мл) не влияла на клеточную гибель в диапазоне 2-12 ч после облучения. Эго говорит в пользу предположения о некротической природе первой волны гибели у-облученных лимфоцитов. Появление комет С1-СЗ классов отражает начавшийся в ЛКЧ апоптоз, сигналом к которому послужили индуцированные облучением разрывы.

Полученные нами данные говорят о том, что облучение в дозе 5 Гр индуцирует в лимфоцитах периферической крови человека in vitro смешанную гибель. Здесь наши данные подтверждают результаты работы [Payne et al. 1992], показавшей наличие смешанной гибели лимфоцитов крови человека спустя 16 ч после облучения in vitro в диапазоне доз 2-20 Гр.

На основании полученных результатов мы предполагаем следующий сценарий развития событий в популяции облученных ЛКЧ in vitro. Возникшие после облучения

повреждения ДНК могут быть репарированы и/или послужить сигналом для запуска механизма гибели клетки. В ответ на повреждение ДНК в клетке актнви¡нруется PARPjUcker et al. 1992]. В результате из АДФ-рибозной компоненты НАД синтезируйся разветвленный гомополимер PAR, промотор репарации ДНК [I.autier et al. 1993]. Вызванное этим снижение уровня НАД подавляет внутриклеточный гликолиз и образование АТФ [Hyslop et а), 1988]. Поскольку синтез НАД и АТФ в покоящихся лимфоцитах ограничен [Carson et al. 1986], их истощение при недостаточном ресинтезе может индуцировать клеточную гибель. Одними из первых оргаиелл, испытывающих недостаток этих соединений, являются клеточные мембраны. Их повреждение приводит к нарушению клеточного гомеостаза и некрозу [Buja et al. 1993].

Одновременно возникшие повреждения могут непосредственно быть сигналом к развитию апоптоза. Скорее всего такими повреждениями являются двунитевые разрывы, репарация которых в покоящихся лимфоцитах замедлена [Johnstone,1984]. Длительно существующие разрывы могут имитировать предапоптотическое состояние 1енома клетки, характеризующееся высокомолекулярной деградацией ДНК, формирующей CI-СЗ кометы [Bicknell,Cohen, 1995, Walker et al.1991, Nakano, Shinohara, 1994]. 2.6. Заключение.

Таким образом, совокупность полученных результатов позволяет заключить: 1. Облучение лимфоцитов периферической крови человека in vitro индуцирует в них параллельно две формы гибели - некроз и апоптоз. Некроз завершается гибелью клеток (около 50%), приходящейся на 8-12 ч после облучения. Она сопровождается стохастической деградацией генома. Часть клеток (около 20%) гибнет но механишу апоптоза. Эта гибель происходит примерно с постоянной скоростью в течение пострадиационной инкубации клеток, и сопровождается межнуклеосомной деградацией генома.

2. Мы предполагаем, что причиной некроза является де-энергнзация клетки, связанная с репарацией повреждений ДНК (ОР и поврежденные основания) , Нерепарируемые или медленно репарируемые повреждения (ДР, например) могут быть устойчивым сигналом к апоптозу. Последующие разделы работы посвящены экспериментальной проверке этого предположения путем сопоставления типа гибели клеток с типом повреждений ДНК (ДР, ОР) и их репарацией.

i j

,.JSO_ 200 250

Рисунок 6 Динамика репарации и деградации ДНК в ЛКЧ в процессе инкубации клеток при 37С после гнпертермической обработки при 43С и 5 ОС'

g 30

0 2С

+---- I )

20 40 60 80

200 j

0,5

Рисунок 7. Биваринтныераспределения комет, формируемых некротическими лимфоцитами после гипертермической обработки (500*20 мин+3702ч)

100

во

60 20

6 1 0 С 100 О ci 75 vV U ## о V

25 0 о •

0 4 В 12 16 20 Время, ч

Рисунок 8 Динамика численности комет, формируемых интактными (Л) и облученными 5 Гр (Б) клетками. (О) - кометы С0/С1; (•) - С2/СЗ, (V) - С4.

Рисунок 9. Электрофорез ДНК, экстрагированной из ЛКЧ. 1 интактные клетки; 2 клетки облучены (5 Гр) и инкубированы 5 ч при 37 С; 3 клетки облучены (5 Гр) и инкубированы 20 час при 37 С.

Глава 3. ДВУ11ИТЕВЫЕ РАЗРЫВЫ ДНК И ЛИОН ГОЗ ПОКОЯЩИХСЯ ЛИМФОЦИТОВ

3.1. Двунитевые разрывы ДНК: индуктор клеточной гибели.

На делящихся клетках убедительно показано, что ДР является летальным повреждением [Zhou et al.,1998]. Велика роль ДР и в anorno¡e[Arends et al ,1990]. Некоторые исследователи полагают, что ДР являкнся признаком апошотической деградации ДНК [Elia et al.,1991 В последнее время показано, что в ранней предапоптотической деградации наблюдается периодичность, соответс1вующая среднему размеру одною суперспиралыюго домена ДНК [Jarovaia et а!., 1995]. Можно считать доказанным, что крупномасштабная фрагментация ДНК при аноптозе ecib результат нестохастической деградации надмолекулярной структуры генома, осуществляемой ферментами матрнкса [Разин, Юдинкова,1998], топокюмеразой II, например [Lagarkova el al., 1995].

Среди агентов, индуцирующих преимущественно ДР в ДНК можно выделить блеомицин (BLM), ингибиторы топоизомеразы II (topoll) этонозид VP-I6 и 1енииозид VM-26 и экзогенные рестриктазы. Использование рестрнктаз позволяет также выяснить роль структуры концов разрывов. Оказалось, чю агенты, вызывающие рафывы в ДНК, всегда увеличивали экспрессию р53 в опухолевых клетках человека.. В случае ингибиторов topo (VP-16, VM-26, камптотецин и др.) формируются скрьмые разрывы, маскированные ферментом, поэтому для достижения эффекта на р53 необходимо еще участие репликации, при которой скрытый разрыв трансформируется в открытый ДР. Все агенты, индуцирующие дефекты в ДНК неразрывного характера, не приводили к увеличению экспрессии р53, либо эта экспрессия наблюдалась после формирования инцизионных разрывов в процессе репарации [Nelson, Kastan, 1999].

Всякое повреждение имеет прямое и непрямое последствие для клетки. Примером прямого эффекта является анеуплоидия, когда повреждение является препятствием для репликации и причиной утраты генетического материала. Пример непрямого механизма реализации повреждения - задержка продвижения клетки по циклу. При непрямом эффекте большая роль принадлежит генам, осуществляющим контроль за прохождением по циклу, (компоненты "checkpoints"). Повреждение чаще всею не затрагивает эти гены, но они включаются благодаря сигнальной функции повреждения.

H некоторых случаях прослеживалась сигнальная функция ДР [Bennclt et al.,1993, Bennell elal.,1992, Bryant et al.,1998] Окшалоеь, чю ДР являются достаточной причиной формирования морфологических ишснении, наблюдаемых при апоптозе [Tounekti et al ,19951.

Следует подчеркнуть, что все нитруемые здесь исследования проводились на делящихся клетках Гибель таких клеюк оцениваек-я по снижению пролиферативной способности (колоииеобразования) и включает в себя как гибель, вызванную первичным повреждением, так и дегенеративную гибель поюмков поврежденной клетки, т.н. "ми юшчсская гибель" [Tounekti cl al ,1993] В последнем случае гибель обусловлена комплексом повреждений, накопленных и усиленных в результате митозов. Этот тип I иоели отсутствует в покоящихся клетках, что ионюляет исследовать связь их гибели с I тервоиа1 lajiы Iым повреждением.

В качестве агента, индуцирующею ДР в ДНК мы использовали ингибитор topoll нопотид Гто leiio токсическая активность опосредована topoll, ферментом, и (меняющим топологию ДНК в клетке. Механизм действия этопозида заключается в подавлении лигазной активности topoll, при этом фермент ковалентно связывается с концами ДР В отличие от пролиферирующих клеток, неделятциеся клетки менее чистительны к VP-I6, что обусловлено шпким содержанием в них topoll [Heck MMS, I:arnshaw,1986, Jaxel et al.,1988]. Однако, недавно в работе [l.ebailly et al.,1997] методом щелочных ДНК-комет было покамно, что мопозид в концентрациях 20-1360 мкМ индуцировал ратрывы ДНК в покоящихся лимфоцитах крови человека.

В этой части работы мы исследовали индукцию лопозидом разрывов ДНК, их репарацию и апоптоз нестимулированных JIK4. Выбор агента обусловлен тем, что, как видно m предыдущею, формируемый в данном случае ДР либо не репарируется, либо репарпруегся медленно, поскольку экранирован topoll и VP-16. Использовали коммерческий препарат этопозида (Brislol-Maiers, GMBH, Germany), который растворяли и 30% спирте (15 мг/мл) и хранили в холодильнике. К суспензии лимфоцитов в полноценной среде добавляли требуемое количество агента и инкубировали 3 или 20 час В первом случае после удаления этопошда (однократное центрифугирование 400 g, 5 мин) клеIктт суспендировали в свежей среде и инкубировали 20 ч при 37С.

3.2. Морфо.тш ическис итмененни .11СЧ и типы комет, индуцированные чюпозндом.

В таблице 5 суммированы результаты измерения доли клеток (%), ошосящихся к трем морфологическим типам - интактные, аиоиготические и некрошческие клетки - и соответствующих им трех типов комет, формируемых при электрофорезе в щелочных условиях: (СО/С 1)-, (С2/СЗ)- и (С4)-комет.

Таблица обнаруживает заметные различия между % некротических клеюк и % С4-комет: во всех случаях последний превышает % погибших клеток.Это твори г о юм, чю кометы С4 продуцируются не только погибшими клетками, но и клетками, находящимися в терминальной фазе апошта.

Таблица 5. Доля (%) клеток 3-х морфологических типов и соответствующие им доли

3-х типов Д1 lK-комст (среднее+Z-s d ).

VP-16, ti, t2. Интактные Кометы Лпоптот. Кометы Некрот. Кометы

мкг/мл час час клетки С0+С1 клетки С 21СЗ клет ки С4

0 0 0-24 82+/-9 68+/-7 11+/-6 26+/-7 7+/-4 6-1/-2

Ю0*(1) 3 3 80** 34 <7-11 14** 48 »7-12 II** 18 + /-5

100 (1) 3 20 43 т/-7 291/-5 47 Ч-Ь 42 * /-5 10I/-3 291 /-6

100 (2) 24 0 37+/-7 22 Ч-в 50+/-6 49+/-4 I3+/-3 29 <7-6

Как видно, в двух протоколах опыта распределения клеток по типам практически одинаковы. Обработка клеток этопошдом в концентрации 100 мкг/мл приводи! к А-кратному возрастанию доли клеток с апошотической морфолог ией и адекватному снижению доли ингактных клеток. Наблюдаемое небольшое увеличение доли некротических клеток недостоверно. Изменение концентрации этопозида в диапазоне 50-200 мкг/мл не обнаружило достоверного изменения в распределении клеток по морфологическим типам, и ясно прослеживается тенденция к насыщению в области концентрации этопозида >100 мкг/мл с выходом на плато в области 50-60% апоптозов через 24 ч. Индуцированные этопозидом морфологические изменения в покоящихся лимфоцитах сопровождаются межнуклеосомной деградацией ДНК (рис. 10), которая наблюдается как после 3 час, так и после 24 час инкубации с атентом. В последнем случае отмечается более интенсивная межнуклеосомная деградация ДНК. На рис. II изображены гистограммы распределений клеток по содержанию ДНК в комете. Сдвиг гистограмм влево и появление второго максимума отражает появление в популяции гиподиплоидных клеток. Цифры в площади рисунка - вычисленный процент гиподишюидиых клеток.

3.3. Репарация ДНК после действия этопозида.

Для оценки репарации ДИК после действия иопозида учитывали только нейтральные кометы СI, С2 и СЗ, поскольку ранее мы показали, что кометы С4 могут формировался ггекрогнческимгг клетками, которые быстро исчезают в процессе инкубации или клетками на терминальной стадии апошоза, где репарация отсутствует. I'eiyjibiaibi представлены на рис.12. Измерения проводили в нейтральных условиях, и рс!>лышы фактически отражают динамику ДР и ДНК. Как видно, удаление VP-16 не приводи! к заметной репарации ДР.

3.4. Мсрснарированныс ДР индуктор анонима J1КЧ.

Совокупность полученных в лой части данных говорит о том, что эгопозид индуцируе! аноптоз в нестимулированных ЛКЧ.

Следующие результаты говорят о том, что аноптоз, индуцированный VP-16 в .шмфоци та.х, опосредован topoll. (i) VP-16 индуцирует ДР в покоящихся лимфоцитах, (ii) Удаление VP-16 не сопровождается репарацией ДР, что указывает на то, что комплекс VP-16-iopoll коваленгио связан с ДНК [Akagi, et al., 1993J. (iii) Частота апошоза и выход ДР не и {меняются при 2-кратном увеличении/уменьшении концентрации этогтозида. I аким обраюм, представляется логичным свяпггь nepeiтарированные ДР с наблюдаемым анопююм ЛКЧ как причину и следствие. Мы полагаем, что поскольку возникшие ДР маскированы связанным с ним комплексом topoll-VPI6, то вряд ли они сами являются он налом Как показали наши результаты нестерн-блоттннга, в ЛКЧ, обработанных шннмилом, несмотря на наличие ДР, не жсиреесируется р53 (рис. 13). Этот факт I опориI о том, что ДР действительно экранированы, а сигналом к запуску анонтоза здесь скорее всею являются конформационные гнмененнн ДНК на уровне суперспиральных томенон чромаитна Понидимому система р53 слишком чувствительна и не срабатывает на сюль масштабные изменения структуры генома.

3.5. Топонзомераза II в покоящихся ЛКЧ.

Па различных линиях клеток показано, что делящиеся клетки обнаруживают более высокий уровень вутриклеточного содержания topoll, чем покоящиеся клетки [Heck, Harnshaw, I986J. Эго сочетается с более высокой ч\нс1вн1слыюстьн> их к этопозиду и более высокой повреждаемостью ДНК при действии иитибиторов topolf [Minato, 1990, Oshita, Saijo,1994). Было показано, что в

»рнгропоэзе по мере созревания клеток чи''и<> мппнк-уп фермента снижается от 78x10

копий в эри!робластах до 3x10" копий в эритроцитах. Уровень содержания topoll в

покоящихся лимфоцитах был на пределе чувсвительности метода ФГЛ-стимуляиия лимфоцитов сопровождалась синтезом фермента de novo.

Аналогичный результат был получен на лимфоцитах человека [llsang, Liu,1988]. Было показано, что в покоящихся лимфоцитах фермент не обнаруживался, но после ФГА-стимуляции ею содержание возрастало в 100 раз

Для объяснения наблюдаемого эффекта этопозила на покоящихся JIK4 мы можем предположить, что в нестимулированных лимфоцитах человека присутствует одна из двух изоформ топонзомеразы II - topoll-fV Сравнительно недавно 2 нзоформы топокзомеразы II - а и Р были обнаружены в клетках NIH-3T3 [Woessner et al., I991J, HeLa [Heck, Earnshaw,1986] и K562 [Zini N, et al.,1994] Topoll-a - 170 кДа белок, локализован в нуклеоплаэме и более экспрессирован во время клеточного роста. TopoII-(i - 180 кДа нестабильный белок, дающий в результате протеолиза стабильный фрагмент 150 кДа, экспрессирован максимально в плато-фазе и локализован в ядрышке. 11а синхронизованных клетках NIH-3T3 показана связь экспрессии изозимов topoll с фазами клеточного цикла [Woessner et а1.,1991]: количество topoll-a возрастало в 02/М-фазе и снижалось до нуля по завершении митоза; количество topoII-P оставалось на постоянном уровне во всех фазах цикла, включая фазу Go. Последнее обстоятельство позволяет предположить, что Р-форма топонзомеразы II присутствует в нестимулированных лимфоцитах человека и обуславливает повреждающую активность этопозида и последующее вхождение клеток в апоптоз. Заключение.

Таким образом, представленные в этой части работы данные свидетельствуют о том, что даже в скрытой форме ДР в ДНК вызывают апоптоз. Апошоз характеризуется всеми стандартными показателями (морфология ядра, межнуклеосомная деградация, формирование гиподиплоидных клеток и комет). В то же время апоптоз не связан с экспрессией р53. Этот факт объясняется механизмом образования ДР при действии этопозида, в котором концы разрыва экранированы комплексом topolI-VPI6. Этим объясняется наблюдаемое отсутствие репарации ДР. Результат позволяет предположить, что сигналом, запускающим апоптоз являются не сами ДР, а вторичные конформационные изменения структуры хроматина на уровне суперспиральных доменов. Данное предположение является интересной предпосылкой для дальнейшего биофизического экспериментирования.

1 ВС) М.ф КУКПРОГИДОЛ ♦ - ШПП

*— вии ■*— они

Рисунок 10 Межнумеосомная фра1 ментапия ДНК в ЛКЧ, индуцированная ттопсмндом 100 мкг/мл 1 - контроль,2 - З-ч инкубация с УР16. 3 - 24 ч инкубация с УР16, 4 -маркер 100 п о

10 20 30 40

18%

10 20 ЭО 40

Мс 28% Рисунок II. Бивариантные распределения комет и соответствующие им гистограммы для контрольных клеток (А), клеток, инкубированных с этопозидом (100 мкг/мл) и бет него после смены среды в течение 3 ч (В) и 20 ч (В)

2 3

1-1-г

О 5 10 15 20 25 30 Время гнкубвцыи, час

Рисунок 12 Чависнмосм. среднего момета хвоста нейтральных комет ог времени после инкубации МИК с могкнидом (100 мкг/мл, 3 ч) Светлые кружки - (<)/('I-кометы,. треугольники - С2-комегы, темные кружки -СЗ/С4-комс1Ы

«~р53

Рисунок 13 Вестерн блотгинг экстрактов из контрольных клеюк (I), инкубированных с этопозидом, 100 мм/мл, 20 ч (3) и с перекисью водорода 50 мкМ. 30 мин

л>_

ГЛАВА 4. ОДНОНИТЕВЫЕ РАЗРЫВЫ, РЕПАРАЦИЯ ДНК И 11П.КЛ1. ПОКОЯЩИХСЯ ЛКЧ.

4.1. Олнонитевые разрывы и репарация при апоптозе.

На сегодняшний день образование ОР в процессе апошошческой гибели выделяют в отдельный тип деградации ДНК в гибнущих кле1ках, отличный от крупнофрагментарной деградации и межнуклеосомной деградации хроматина [Bortner et al., 1995] Роль этого типа деградации в механизме гибели клетки остается пока неясной.

ОР являются самым многочисленным типом повреждения ДНК: они сопровождают действие очень многих агентов и являются вторичными, промежуточными дефектами при функционировании эксцизионной репарации Такая "вездесущность" ОР сочетается с устойчивым представлением об их нелеталыюсти [Cohen-Jonatan et al., 1999]. В то же время ОР способны индуцировать апоптоз в ряде клеток [Yoshida et al.,1993, Nelson,Kastan,1999] Учитывая это обстоятельство, ОР представляют большой интерес для изучения взаимосвязи механишов репарации и апоптоза.

Репарация и апоптоз противоположно направлены: первый восстанавливает поврежденную структуру ДНК, второй удаляет из популяции клетки, содержащие повреждения. По крайней мере часть разрывов, возникающих на начальных этапах апоптоза, может быть репарирована [Khodarev et al. 1999]. Репарация ДНК и апоптоз энергозависимы и могут конкурировать за энергоресурсы клетки. Эта конкуренция может влиять на картину гибели клетки, изменяя ее от типичного апоптоза до некроза [ Richter et al., 1996, Eguchi et al.,1997].

Во многих исследованиях показана обратная корреляция час юты апоптоза с эффективностью репарации ДНК [Тронов, 1999, Götz, Montenarh, 1996 ] В предыдущей главе мы показали, что этопознд индуцирует нерепарируемые двунигевые разрывы ДНК в покоящихся лимфоцитах, которые инициируют апоптоз в покоящихся ЛКЧ.

С другой стороны, в ряде работ показано отсутствие какой-либо связи между репарацией ДНК и апоптозом [Vrai et al. 1998,Hampton et al. 1998]. Отмечается, что только начальные повреждения ДНК являются сигналом, запускающим апоптоз, и дальнейшая их судьба (включая репарацию) не влияет на развитие апоптоза.

Целью этой части работы явилось исследование связи между процессами репарации ДНК и апоптоза в покоящихся лимфоцитах крови человека (ЛКЧ), подвергнутых действию перекиси водорода. Перекись водорода вызывает образование однонитевых разрывов ДНК и индуцирует апоптоз в ра ¡личных линиях клеток.

4.2. Действие 11202 на ДНК" лимфоцитов.

1'ис. 14 а и б представляет резулыат действия 11202 на ДНК u J1K4 после получасовой инкубации ml линейно Tioipactaei с росiом конценфации Н;02 до 50 мкМ, далее следует насыщение и выход на плато. Нелинейность изменения mt с концентрацией перекиси скорее всею святапа с понижением разрешающей способности меюда комет при высокой плотности повреждений в ДНК.

Основным механизмом, но коюрому перекись водорода повреждает ДНК в кле1ке, является реакция Фен юна. В ней при участ ии ионов переходных металлов продуцируются реактивные ОН'и ОН , атакующие ДНК. Кроме того, взаимодействие 1Mb с пероксидазой, локализованной в мембранах, приводит к образованию активного продукта IIOCI, которая повреждает белки мембраны, вызывая лизис клеток. В этом сосюш механизм цитотоксического действия нейгрофилов [Hampton et al., 1998]. Как pci\:n.iai цитотоксическою действия наблюдается деградация ДНК. Паши опыты с добавлением ДМСО, перехватчиком гпдроксилыюго радикала, подтвердили I еиотокеичеекий механизм образования OV в J1K4. В пользу этого механизма вошикновения повреждений ДНК в ЛКЧ при действии I ЬО; свидетельствует также результат исследования действия перекиси на нуклеоиды, предварительно сформированные из ЛКЧ. Как оказалось, несмотря на большую доступность ДНК для актки со стороны Н:0;, степень повреждения в этом случае значительно ниже, чем при инкубации клеток (рис. 14), Такое снижение повреждения объясняется процессами диссоциации и диффузии ионов металлов от ДНК, неизбежно происходящими в высокосолевом лизирующем растворе.

1'атрывы ДНК в ЛКЧ, индуцированные перекисью водорода, в значительной степени репарируют в течение 2-х часов инкубации клеток в полноценной среде (рис. 14) Сам этот факт свидетельствует о том, что разрывы ДНК являются не следствием цпююксичсского действия перекиси, а скорее результатом генотоксичности H2Oi, опосредованной реакцией Фсмтона (сравни с результатами гипертермии, рис.6).

4.3. Гибель ЛКЧ, индуцированная II202.

Несмотря на эффективную репарацию, клетки подвергаются гибели спустя 24 часа (рис 15) Доля погибающих клеток нарастает с ростом концентрации 1 ЬОк Эю ii.ipaciamic более выражено в некротической форме iпоели. При концентрации перекиси ■200 чкМ некро) становится доминирующей формой гибели ЛКЧ. Однако, при всех

уровнях окислительного стресса наряду с некротическими присутствуют клетки, обнаруживающие апоптотическую морфологию. Возможно этот ((такт говорит о том, что наблюдаемый некроз является вторичным но отношению к апоптозу. Волее того, даже при высоких концентрациях I ЬОт, когда большая часть клеток нермеабилиэована и обнаруживает некротическую морфологию, из них экстрагируется низкополимерная ДНК, дающая "лесенку" при электрофорезе в агарозном геле (рис. 16).

4.4. Роль PARP и NAm в репарации ДНК.

На сегодняшний день общепризнана роль иоли(АДФ-рибозо) полимерам (PARI') на ранних этапах репарации. С одной стороны, фермент связывается с ДНК в области разрыва своим ДНК-связывающим доменом (DBD), тем самым фиксируя разрыв. С другой стороны, PARP присоединяется к гистону 111 и гистонам нуклеосомного кора, модифицирует эти белки, присоединяя к ним разветвленный полимер поли(ЛДФ-рнбозу) (PAR), синтезируемый каталитической субъединицей. В результате у модифицированного белка появляется полианионный "хвост", который, благодаря одноименному с ДНК заряду, облегчает миграцию гистонов но ДНК: ')то увеличивает доступность поврежденных участков для репаративных ферментов. В качестве модифицируемого белка может выступать и сама PARP, содержащая в своей структуре ауто-модифицируемый домен, к которому каталитический домен присоединяет PAR. Под влиянием отрицательно заряженного PAR происходит диссоциация PARP от ДНК, освобождение дефекта для присоединения репаративного комплекса В качестве предшественника PAR используется АДФ-рибозная компонента NAD+, при этом высвобождается никотинамид, который реутилизируется при синтезе NAD*. Избыток NAm по механизму отрицательной обратной связи подавляет каталитическую активность PARP, не затрагивая активность DBD.

4.5. Гибель ЛКЧ в условиях подавления репарации ДНК никотиамидом.

Результаты, представленные в таблице 5, показывают, что вплоть до 20 mM NAm сам по себе практически не оказывает влияние на ДНК в клетках. Столь же незначительный эффект оказывает и его присутствие в инкубационной среде в течение 2-х часов во время обработки перекисью водорода. Этот вывод подтвержден так же морфологическими исследованиями. Присутствие NAm в концентрации 20 mM во время инкубации клеток, обработанных 50 мкМ и 200 мкМ lbCK, в значительной степени замедляет или даже блокирует процесс репарации разрывов ДНК в ЛКЧ. Мри этом наблюдается снижение уровня некротической гибели и 1.5-2-х кратное возрастание частоты апоптотических клеток под влиянием 5 шМ Nam. (рис. 15 Ь) Возрастание

концентрации NAm до 20 niM еще более снижает долю некрозов и увеличивает частоту анонимок JIK4 (рис.15 Ii).

1аблииа 5. Моменты хвостов комег (int), формируемых клетками сразу

после инкубации с перекисью водорода и с никотинамидом и ___спустя 2 ч репарации._

\п1, мМ 11202, мкМ

0 20 50 200

0 1,2 </-0,2 10,51 /-0,9 17,7 <-/-2,8 24,1 </-5,7

5 3,5 </1,4 9,0</-5,2

20 2,5 11,1

Репарация 2 ч

0 1,2 </-0,2 5,3 </-2,7 6,8</-1,7 9,5+/-2,8

5 3,5</-1,4 5,2 </-0,3 10,0

20 2,4)/-0,1* 16,0 </-4,0* 22,7<7-3,9

11ринеяснм средние значения mt из >3 опытов </- S.E.

*) - средние mt из двух независимых опьпов • /- максимальное отклонение от среднего. Условия обработки агентамии репарации см. в разделе "Материалы и методы"

4.6. Сепарации ДНК" и некротическая гибель Л КЧ.

Перекись водорода - нормальный моаболиг любой аэробной клетки. Ее Iсноюкснческий эффекл определяется главным образом высоко реакционным 01Г радикалом, формируемым в реакции Фешона |Smulson et al.,1988]. Основным повреждением в ДНК, индуцируемым перекисью водорода, являются OP. 1ЬО:, как окашлось, индуцирует и генетические изменения, приводящие к опухолевой трансформации клеток в культуре [Okamoto et al., 1996].

Вообще, злокачественная трансформация клетки сочетается с подавлением ее способности к програмированной гибели, индуцируемой различными эндогенными сшналами [Barr, Tomei,1994], Наши результаты убедительно показывают, что окислительный стресс JIK4 в большей степени индуцирует отдаленный некроз, чем амопнн. При этом наблюдается "апопготическая" (межнуклеосомная) деградация ДНК (рис. 16). Во многих работах , включая и собственные исследования, показано, что для JIKM характерна высокая чувствительность к различным воздействиям, индуцирующим аноним [Story et al.l994,Vral et al.l998,Boreham et al. 1997]. Однако, с ростом дозы шндейавия частота апопгоэа достигает насыщения на уровне 15-20% и отмечается высокий процент некротических клеток [Тронов и соавг.1998, Payne et al.,1992, Marini et al,l997| В работе [Marini et al., 1997] было показано, что перекись водорода н

концентрациях 50 - 500 мкМ инициировала апомтоз в 10 - 15% лимфоцитов человека и одновременно некроз в 25 - 40% клеток. Аналогичный результат получен нами. Эти результаты могут быть интерпретированы в рамках двух активно разрабатываемых гипотез. Согласно первому предположению, нарастающий некроз клеток с увеличением концентрации Н202 является следствием повреждающею действия перекиси на каспазы [Hampton, Arrenius,1997], Каспазы являются основным эффектором терминальной фа>ы аноптоза; их повреждение делает невозможным завершение апоптоза и переводит ею в некроз. Эта гипотеза получила недавно экспериментальное подтверждение [Rössing et а!., 1999]. Второе предположение утверждает, что внутриклеточный уровень [АТР; NAD+]i определяет тип клеточной смерти, апоптоз или некроз [Тронов и соавт.,1998, Richter et al., 1996, Eguchi et al., 1997]. Снижение [ATPJi является сигналом для запуска программы клеточной гибели. Однако, если это снижение ниже критического уровня, достаточного для завершения апоптоза, апоптоз переходит в некроз. Рассматривая эту гипотезу для объяснения наших результатов, нужно иметь в виду, ню, если сигналом к апоптозу, вызваному Н202, является снижение уровня [ATP;NAD+]i, то следует ожидать отсутствие зависимости апоптоза от функции р53 . Однако, как показывают наши данные по вестерн-блоттингу, гибель ЛКЧ, индуцированная Н202, сопровождается заметным усилением экспрессии р53 (стр.34, рис.13). Этот факт подтверждает предположение о том, что сигналом для апоптоза в ЛКЧ являются разрывы ДНК, индуцированные перекисью водорода.

Высокий уровень экспрессии р53 стимулирует экспрессию ВАХ - белка, принадлежащего к семейству BCL-2, но обладающего про-апоптотической активностью; экспрессия ВАХ, приводя к возрастанию соотношения BAX/BCI.-2, способствует клеточной гибели [Selvakumaran et а!.,1994]. Одновременно с апоптозом разрывы активируют систему репарации, важным компонентом которой является PARP. Функция PARP связана с активным потреблением [NAD+]i и [ATP]i. При достаточно большом объеме репарации их уровень внутри клетки может упасть ниже критического и с этого момента апоптоз замещается некрозом. В нашей работе мы показали, что подавление активности PARP с помощью NAm снижает частоту некроза и увеличивает частоту апоптоза. Схематически предполагаемая цепь событий показана па рис. 17. В заключение следует сказать, что, коль скоро энергетический статус клетки является критичным для выбора пути, по которому протекает процесс ее гибели, то должна существовать точка дивергенции, в которой происходит расщепление путей, ведущих к гибели. На схеме она отмечена заштрихованым кружком. Мы предполагаем, что такой

точкой скорое всего являются каашы, активация коюрых из проэнзимов протекает при участи Л'ГФ и факторов АраП (apoptotic procaspase activatig factor 1) и Apaß (циюхром С) Структурные перестройки проэнптма ipeöyioг участия АТФ. Снижение уровня АТФ .ic.uci нетнмможным со1реванне каспа) ло активной формы и блокирует терминальную ф;и\ анонима. В последнее время зюг механизм трансформации клеточной гибели становится предметом пристальною и (учении [Nicotera, Leist,1997, liguchi et at.,1997, Leist et al ,1999].

4.7. {включение.

Проведенные ттсследовання показали, что OP, индуцированные перекисью водорода в J1K4, репарируют после удаления агента. С другой стороны, ОР запускают программу Iибели клеток. Аноним харакчертуется морфологическими изменениями, межнуклеосомной деградацт|ей и экспрессией р53. Доля апоптотических клеток, наблюдаемых 24 ч после вощейсгвия, составляла 15%. Параллельно до 30% клеток обнаруживали некротический тип iибели. Пикошнамид подавлял репарацию ОР, и это сопровождалось 2.5-кратным увеличением частоты апоптоза и >4-кратным снижением частоты некроза. Наблюдалась так же более интенсивная межнуклеосомная деградация ДНК. Никошнамид сам не индуцировал разрывы в ДНК и не изменял морфологию клеток. Результат подтверждает предположение о том, что процесс репарации и спя тайная с ним активация поли(Л01'-рибою)полимеразы (PARP) понижают внутриклеточное содержание NADt и AI P ниже поротового уровня, при котором некроз становится вероятным механизмом гибели клеток. Наблюдаемая картина смешанной I ибели покоящихся лимфоцитов, индуцированной действием перекиси водорода, является следствием де-эиергизации клетки за счет быстрой репарации в первые часы после удаления генотоксического агента

пи 40

[11202], иМ Рисунок 14 Зависимость пи комет от концентрации перекиси водорода при инкубации клеток (I) и их нуклеоидов (2) с Н202 (3) - клетки, репарированные в течение 3 ч после инкубации с Н202. представлены средние результаты ъ £ из >3 независимых экспериментов

А Б

12 3 I 2 3 4

т 2

1 „--О

¡г

1 ...О

* *

7Ф •

Рисунок 16 Ге'И.-» 1СК"1"|*><|мреч ни шшолимсрнмй Д11К, жсгришротишоИ и»ЛКЧ. пориСмнанпыч перекисью иолородя Л-5имкМ1ЬО;,);-400мкМШЪ I-мнпрыь, 2 - мимо I).<>г, } - Н:< >;^Лт 20 тМ, 4 -

мнркс^ |М II о )_

|Г>Лш|, иМ

Рисунок 15. Морфологическая оценка уровней апоптоза (I) и некроза (2) ЛКЧ после обработки Н202 в отсутствии (а) и с добавлением ^ мМ ЫАт (б) (в) - влияние МАт на чаетгу апоптоза (I) и некроза (2) ЛКЧ, обработанных 200 иМ 11202. По оси ординат для всех рисунков % клеток

ЛКЧ

(фонов« чвгпрсссмя ЙС1.-2)

повреждения дик

Мяш1зш ^ репарация ДНК

-Анаши И АКР

Рисунок 17. Предполагаемая последовательность событии в клетке, подвергнутой окислительному стрессу, приводящая к смешанной гибели ЛКЧ и к сдвигу от апоптоза к некрозу

Экспрессе ПАХ

^ВЛХиП 2 (мпохпилг**')

^рЧАО'/АТР]»

кмводы

1. ДНК-комеiы являются адекватным биофизическим показателем клеточной пн'юлп ¡5 основе его лежит двух-уровневая деградация генома в апоптотических клоках Анали) бивариантных распределении комет позволяет выделить преимущественную форму гибели клеток в популяции. Однако для идентификации типа i ибелк па уровне отдельной kjicikit требуется привлечение морфологических показателей

Впервые продемонстрирована корреляция данных, полученных с помощью метода ДНК-комс'1, и результатов морфологической оценки часоты впоптоза. Прикладные во)можнос111 меюда ДНК-комет продемонстрированы на ЛКЧ больных системной красной волчанкой и больных хроническим миелолейкозом, подвергнутых тотальному фракционированному облучению. Обнаружена повышенная частота апоптоза in vitro в ЛКЧ, выделенных из крови больных СКВ. Вероянто это отражает изменения в ЛКЧ, спя ванные с патогенезом заболевания.

2. Облучение ЛКЧ in vitro (дота 5 Гр, при дефиците сыворотки) индуцирует в них параллельно две формы гибели - некроз и апоитоз. Некроз завершается гибелью клеток (около 50"о), приходящейся на 8-12 ч после облучения. Она сопровождается стохастической деградацией генома. Часть клеток (около 20%) гибнет, по механизму апопюза. Эта гибель происходит примерно с постоянной скоростью в течение пострадиационной инкубации клеток. Динамика развития процессов говорит о по крайней мере их частичной независимости. Предполагается, что причиной некроза является де-энергизация клетки, связанная с функционированием системы репарации повреждений ДНК (ОР и поврежденные основания). Hepeiтарируемые или медленно рсиарируемые повреждения (ДР, например) могут быть устойчивым сигналом к апошо зу.

3. ДР, индуцированные ингибитором топоизомеразы II этопозидом, сохраняются перепарированными и запускают в покоящихся ЛКЧ апоптоз. Поскольку при этом не жснсрссируется р53, предполагается, что источником сигнала для запуска механизма апоптоза являются конформационные изменения ДНК на уровне суперспиральных доменов хроматина.

4 Однонитевые разрывы ДНК, вызванные обработкой клеток перекисью водорода, подвергаются быстрой репарации и одновременно запускают программу шбели в покоящихся лимфоцитов кроззи человека. Апоигозу сопутствуют характерные

морфологические изменения , межнуклеосомная деградация ДНК и экспрессия р53. Параллельно значительная часть клеток (до 25 %), согласно морфологическим критериям, обнаруживала признаки некротической смерти. Никошнамид подавлял репарацию ОР в клетках и это подавление сопровождалось увеличением в 2,5 раза доли апонтотических клеток и снижением в 4,5 раза доли клеток с некротической морфологией ядра. Этот результат подтверждает предположение о том, что конкурирующие за энергетические ресурсы клетки процессы репарации и апоптоза приводят к смешанной форме гибели. Сдвиг к некротической форме гибели обусловлен энергетической необеспеченностью апоптоза. Одной из причин де-энергизации клетки в процессе репарации может быть активация поли(АОР-рибозо)полимеразы. Это понижает внутриклеточное содержание NAD+ и АТР ниже порогового уровня, при котором блокируется терминальная фаза апоптоза.

Таким образом , основной итог работы - обнаружение смешанного типа гибели покоящихся ЛКЧ при действии ДНК-повреждающих агентов: на конечных стадиях апоптоза наблюдается смена формы гибели от апоптоза к некрозу. Смена форм гибели происходит из-за энергетической необеспеченности апоптоза. Важная роль в де-энергизации клетки принадлежит процессу репарации ДНК. Подавление репарации защищает клетки от некротической гибели , но не от апоптоза. Работа представляет новое направление исследований - биофизику клеточной гибели.

Список основных публикаций по теме диссертации.

1. Алферова 'ГМ, Тронов ВА. Солдатенков ВА, Денисенко МФ, Филиппович ИВ//. Спонтанные повреждения ДНК и активность ДНК-полинуклеотидлигазы в популяциях тимоцитов, различающихся по радиочувствительности.// Радиобиология 1988.28(4): 441-447.

2. Котеров АН, Новорадовская НА, Тронов ВА. Золотарева ЛА, Филиппович ИВ.// Выделение и характеристика белка, связывающегося с однонитевой ДНК (ВБВ-белка), из клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ).// Биохимия 1988. 53 (7): 1193-

Тронов ИЛ, Провогоров ЛИ и др.// Обракшапие и репарация разрывов ДНК в субпопуляциях облученных клеток кос i нот мола крыс.// Радиобиология 1989. 29 (4). 451-456.

I Тронов НА. Зайцев НА, Черный ДИ, Koicpou All, Филиппович ИВ// Связывание SSB-бедка из клеток аснитной карциномы Зрлиха с ДНК и полирибонуклеотидами. Молекулярная биолог ия 1991. 25 (1). 212-222

s 1 ронов ВА, Гринько HB, Бериташвнли ДР, Филиппович ИВ // Микрозлектрофорез ДНК индивидуальных интактных и тамма-облученных тимощпов. //Цитология 1991. 33 (2). 94-102.

1 ilippovich I.V., Tronov VA.. Denisenko M.I-'., Alfyerova Т.М., Grin'ko E.V.// Possibilities of the microelectrophoresis technique for the assessment of risk at low-dose Ii radiation.// In: 8- th International Congress of the International Radiation Protection Association (1RPA8), Montreal, Canada, Vol.1, pp 528-532, 1992.

I Тронов ВА. Гринько ЕВ и др.// Остаточные тщреждения ДНК в периферических лимфоцитах после ююльного гамма-облучения человека.//Медицинская радиология 1993.2:38-41.

х 1 ронов ВА, Гринько ЕВ, Афанасьев ГГ, Филиппович ИВ.//Исследование иовреждепности ДНК и гетерогенносш клеток методом гель-микротлектрофорезаУ/Биофизика 1994 39(5): 810-819.

9 Тронов ВА, Гринько ЕВ, Афанасьев ГГ, Пелевина ИИ.Филиппович ИВ.// Структура ДНК высшею порядка в двух линиях клеток мышиной лимфомы (L5178Y), различающихся по радиочувствительности // Цитология. 1994. 36 (6): 631-641.

10 I pono» ВА, Пелевина ИИ.// Метод ДНК-комет индивидуальных клеток. Принцип и применение метода. //Цитология. 1996. 38 (4/5): 427-439.

II I ронов ВА. Терещенко ДГ, Коноплянников МА.// Механизм радиационной гибели лимфоцшов периферической крови человека, оцениваемой методом ДНК-комет.// Биофизика. 1998.43(1): 115-124.

12 Лисицына ТА. Тронов ВА, Коноплянников МА, Дурнев АД, Иванова ММ.// Исследование поврежденное™ ДНК мононуклеариых клеток крови больных СИС1СМНОЙ красной волчанкой методом ДНК-комет.//Бюллетень Эксперим. Биологии и Медицины. 1998. 125 (1): 75-78.

Г- I ромов ВА Репарация ДНК и аноним //1 Iniojioi ия 1999 41 (5): 405-411.

14 Тронов ВА. Никольская ТН, Коноплянников МА.// ДНК-кометы как маркер клеточной гибели.// Биофизика. 1999. 44 (2): 288-295.

15 Тронов ВА. Никольская ТА, Коноплянников МА, Лисицына ТА, Дурнев АД.// Спонтанная гибель мононуклеарных клеток, полученных от здоровых доноров и больных системной красной волчанкой.// Цитология. 1999. 41 (5): 400-404.

16 Тронов ВА. Коноплянников МА, Никольская ТА, Константинов ЕМ.// Апоптоз нестимулированных лимфоцитов человека и разрывы ДНК, индуцированные ингибитором тпоизомеразы И этопозидом./У Биохимия. 1999. 64 (3): 412-420.

17 Тронов ВА. Константинов ЕМ.//Репарация разрывов ДНК и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека, индуцированные перекисью водорода.//Биохимия. 2000. 65 (в печати).

Тезисы докладов (последние 5 лет)

18 Tereschenko DG, Tronov VA... Radiation-induced death of human peripheral blood lymphocytes measured by comet-assay.// In: "'Radiation Research Congress Proceedings", Vol.1, P.142. 1995.

19 Tronov VA. Tereschenko DG, Konoplvannikov MA, Gotlib VY.// Instability of chromatin structure in progeny of irradiated cells.// 27-th Annual Meeting of European Society for Radiation Biology. Montpellier. September 1-4 1996, page 78.

20 Tronov VA. Konoplyannikov MA./,Mechanisms of radiation-induced death of human peripheral blood lymphocytes measured by comet-assav.// Transactions of Biochemical Society. Abstracts of 4th 1UBMB Conference "The Life and Death of the Ceil". 1996. Page 597.

21 Тронов ВА. Коноплянников МА.Брацыло СБ,Терещенко ДГ.,/Некроз и апоптоз в радиационной гибели лимфоцитов человека in vitro н in vivo, исследованные методом ДНК-комет.// I Сьезд онкологов стран СНГ.-Москва. 3-6 декабря 1997 г. Материалы Съезда. С. 176.

22 Тронов ВА. Константинов ЕМ. Коноплянников МА, Терещенко ДГ.// Взаимодействие механизмов клеточной гибели н репарации повреждений ДНК.// II Сьезд биофизиков России 23-27 августа 1999 г. т III, С 848.

Работа частично выполнялась при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований. Гранты 96-04-50496 и 99-04-48057.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тронов, Виктор Александрович

Введение ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность проблемы

2. Цель и задачи исследования

3. Научная новизна полученных результатов

4. Научно-практическая значимость б

5. Положения, выносимые на защиту

6. Апробация работы б. Список публикаций по теме диссертации

Глава 1 ДНК-КОМЕТЫ КАК МАРКЕР КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ

1.1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ

1.1.1 Клеточная гибель

1.1.2 Методы регистрации апоптоза

1.1.3 Повреждение ДНК в индивидуальных клетках. Метод ДНК-комет

1.2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.2.1. Материалы и методы

1.2.2. Результаты и обсуждение

1.2.2.1 Классификация ДНК-комет

1.2.2.2 Связь mt с количеством разрывов и фазой апоптоза (калибровка метода)

1.2.2.3 Корреляция метода ДНК-комет с морфологическими изменениями клеток в процессе гибели

1.2.2.4 Поврежденность ДНК и спонтанный апоптоз лимфоцитов больных системной красной волчанкой

1.2.2.5 Оценка повреждений ДНК в ЛКЧ при фракционированном облучении in vivo

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разрывы ДНК, их репарация и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека"

1. Актуальность проблемы.

С открытием программированной клеточной смерти (апоптоза) как альтернативы некроза проблема связи первичных повреждений ДНК с гибелью клетки приобрела более конкретные очертания и формулируется как проблема связи типов повреждений ДНК с формами клеточной гибели (проблема включает в себя и механизм трансдукции первичного сигнала).

Исследования в этой области предполагают 3 варианта ответа на поставленный в проблеме вопрос

1) Апоптоз является универсальным механизмом программированной гибели; вне зависимости от вида повреждений ДНК и природы повреждающего агента, гибель клетки завершается апоптозом (высокие уровни воздействия индуцируют некротическую гибель).

2) Двунитевые разрывы ДНК (ДР), будучи главной причиной снижения колониеобразования пролиферирующих клеток, являются основным типом повреждений, запускающих апоптоз.

3) Повреждения ДНК сами по себе не являются причиной апоптоза, но запускают механизм репарации, в ходе функционирования которого создаются условия для гибели клетки, генерируется сигнал, запускающий программу гибели.

Настоящая работа находится в русле последнего представления. К этому направлению исследований тесно примыкает так же весьма интересная и пока далекая от своего решения проблема взаимоотношения механизмов репарации и апоптоза. Повреждения ДНК, с одной стороны, являются субстратом для репаративных ферментов в клетке, а с другой стороны, запускают программу клеточной гибели -апоптоз. Апоптоз проходит через этап деградации ДНК, которой также противостоят механизмы репарации. Эти два процесса конкурируют не только за субстрат, но и за энергетические ресурсы клетки, поскольку являются энергозависимыми. Результаты исследований последних лет обнаруживают связь между механизмами апоптоза и репарации ДНК [см.'обзоры Götz, Montenarh M. 1996, Oliver et al. 1999, Тронов 1999]. Однако, в некоторых исследованиях отмечается отсутствие взаимосвязи апоптоза и репарации. . Здесь примечательными являются работы [Story et al. 1994, Vrai et al. 1998] на клетках мышиной лимфомы и лимфоцитах крови человека, в которых авторы независимо приходят к выводу, что апоптоз в этих клетках определяется только начальными ДР и не зависит от репарации ДНК. Как видно, столь противоречивые данные создают предпосылку для исследований взаимосвязей звеньев цепи "повреждение ДНК репарация - клеточная гибель (апоптоз)". Эту последовательность можно представить в виде схемы:

Исследования мы проводили главным образом на покоящихся лимфоцитах крови . человека (JIK4) , и потому результаты работы касаются также проблемы гибели покоящихся клеток, индуцированной повреждением ДНК. Покоящиеся клетки формируют основной клеточный пул высших организмов и опухолей. В то же время "^отсутствует ясное представление о том, в чем состоит опасность отдельных повреждений в их нереплицирующемся геноме- Нестимулированные к делению лимфоциты представляют собой благодатный объект для изучения этой проблемы в силу своей высокой чувствительности к повреждениям ДНК. Возможно это связано с критичностью выполняемых ими функций: наиболее важная функция лимфоцитов in vivo в ответ на антигенный стимул состоит в синтезе антител илц в стимуляции пролиферации, приводящей к продукции иммунологически активных дочерних клеток. С другой стороны, как и во многих долгоживущих клетках, в покоящихся лимфоцитах in vivo отмечается заметный уровень конститутивной экспрессии BCL-2, белка, подавляющего апоптоз и увеличивающего жизнеспособность клеток [Yang, Korsmeyer 1996, Bovia et al.1998]

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Тронов, Виктор Александрович

ВЫВОДЫ

1. ДНК-кометы являются адекватным биофизическим показателем клеточной гибели. В основе его лежит двух-уровневая деградация генома в апоптотических клетках. Анализ бивариантных распределений комет позволяет выделить преимущественную форму гибели клеток в популяции. Однако для идентификации типа гибели на уровне отдельной клетки требуется привлечение морфологических показателей.

Впервые продемонстрирована корреляция данных, полученных с помощью метода ДНК-комет, и результатов морфологической оценки часоты впоптоза. Прикладные возможности метода ДНК-комет продемонстрированы на J1K4 больных системной красной волчанкой и больных хроническим миелолейкозом, подвергнутых тотальному фракционированному облучению. Обнаружена повышенная частота апоптоза in vitro в ЛКЧ, выделенных из крови больных СКВ. Вероятно это отражает изменения в ЛКЧ, связанные с патогенезом заболевания.

2. Облучение ЛКЧ in vitro (доза 5 Гр, при дефиците сыворотки) индуцирует в них параллельно две формы гибели - некроз и апоптоз. Некроз завершается гибелью клеток (около 50%), приходящейся на 8-12 ч после облучения. Она сопровождается стохастической деградацией генома. Часть клеток (около 20%) гибнет по механизму апоптоза. Эта гибель происходит примерно с постоянной скоростью в течение пострадиационной инкубации клеток. Динамика развития процессов говорит о по крайней мере их частичной независимости. Предполагается, что причиной некроза является де-энергизация клетки, связанная с функционированием системы репарации повреждений ДНК (ОР и поврежденные основания). Нерепарируемые или медленно репарируемые повреждения (ДР, например) могут быть устойчивым сигналом к апоптозу.

3. ДР, индуцированные ингибитором топоизомеразы II этопозидом, сохраняются нерепарированными и запускают в покоящихся ЛКЧ апоптоз. Поскольку при этом не эксцерссируется р53, предполагается, что источником сигнала для запуска механизма апоптоза являются конформационные изменения ДНК на уровне суперспиральных доменов хроматина.

4. Однонитевые разрывы ДНК, вызванные обработкой клеток перекисью водорода, подвергаются быстрой репарации и одновременно запускают программу гибели в покоящихся лимфоцитов крови человека. Апоптозу сопутствуют характерные морфологические изменения , межнуклеосомная деградация ДНК и экспрессия р53. Параллельно значительная часть клеток (до 25 %), согласно морфологическим критериям, обнаруживала признаки некротической смерти. Никотинамид подавлял репарацию ОР в клетках и это подавление сопровождалось увеличением в 2,5 раза доли апоптотических клеток и снижением в 4,5 раза доли клеток с некротической морфологией ядра. Этот результат подтверждает предположение о том, что конкурирующие за энергетические ресурсы клетки процессы репарации и апоптоза приводят к смешанной форме гибели. Сдвиг к некротической форме гибели обусловлен энергетической необеспеченностью апоптоза. Одной из причин де-энергизации клетки в процессе репарации может быть активация поли(ADP-рибозо)полимеразы. Это понижает внутриклеточное содержание NAD+ и АТР ниже порогового уровня, при котором блокируется терминальная фаза апоптоза.

Таким образом , основной итог работы обнаружение смешанного типа гибели покоящихся ЛКЧ при действии ДНК-повреждающих агентов: на конечных стадиях апоптоза наблюдается смена формы гибели от апоптоза к некрозу. Смена форм гибели происходит из-за энергетической необеспеченности апоптоза. Важная роль в де-энергизации клетки принадлежит процессу репарации ДНК. Подавление репарации защищает клетки от некротической гибели , но не от апоптоза. Работа представляет новое направление исследований биофизику клеточной гибели.

4.2.3. Заключение.

Проведенные исследования показали, что ОР, индуцированные перекисью водорода в ЛКЧ, репарируют после удаления агента. С другой стороны, ОР запускают программу гибели клеток. Апоптоз характеризуется морфологическими изменениями, межнуклеосомной деградацией и экспрессией р53. Доля апоптотических клеток, наблюдаемых 24 ч после воздействия составляла, 15%. Параллельно до 30% клеток обнаруживали некротический тип гибели. Никотинамид подавлял репарацию ОР, и это сопровождалось 2.5-кратным увеличением частоты апоптоза и >4-кратным снижением частоты некроза. Наблюдалась так же более интенсивная межнуклеосомная деградация ДНК. Никотинамид сам не индуцировал разрывы в ДНК и не изменял морфологию клеток. Результат подтверждает предположение о том, что процесс репарации и связанная с ним активация поли(АБРрибозо)полимеразы (PARP) понижают внутриклеточное содержание NAD+ и АТР ниже порогового уровня, при котором некроз становится вероятным механизмом гибели клеток. Наблюдаемая картина смешанной гибели покоящихся лимфоцитов, индуцированной действием перекиси водорода, является следствием де-энергизации клетки за счет быстрой репарации в первые часы после удаления генотоксического агента.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тронов, Виктор Александрович, Москва

1. Ager DD, Dewey WC. 1990.// Calibration of PFGK (pulse-field gel electrophoresis) for measurement of DNA double-strand breaks.// Int. J. Radiat. Biol. 58: 245-59.

2. Akagi Y, Ito K, Sawada s. 1993// Radiation-inciuced apoptosis and necrosis in MOLT-4 cells: a study of dose-response relationships and their modification.// Int. J. Radiat. Biol. 64: 47-56.

3. Amersham Life Science Products. Catalogue 98' . Amersham pharmacia biotech 1998.

4. Andree HAM, Reutelingsperger CPM, Hauptman R, Hemker HC, Hermens WT, Willems GM, 1990. // Binding of vascular anticoagulant a (VACa) to planar phospholipid bilayers.// J. Biol. Chenu 265: 4823-26.

5. Arends MJ, Morris RG, WyLlie AH, 1990// Apoptosis: the role of endonucleases. //J. Am. Pathol. 1^6: 593-608.

6. Arends MJ, Wyllie AH, 1991.//Apoptosis: mechanisms and role in pathology.//Int. Rev. Exp. Pathol. 32: 223-38.

7. Barr PJ, Tomei LD1994. // Apoptosis and its role in human disease. // BioTechnology. 12: 487-93.

8. Bayle JH, Elenbaas B, Levine AJ, 1995//The carboxyl-terminated domain of the p53 protein regulates sequence specific DNA binding through its nonspecific nucleic acid-binding activity.//Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 92:5729-33.

9. Belka C, Marini P, Budach W, Schulze-Osthoff K, Lang F, Gulbins E, Banberg M, 1998.// Radiation-induced apoptosis in human lymphocytes and lymphoma cells critically relies on the up-regulation of CD95/Fas/APO-l ligand.// Radiat. Res. 149:588-95.

10. Bennett GB, Lewis AL, Baldwin KK, Resnick MA, 1993.//Lethality induced by a single site-specificdouble-strand break in dispensable yeast plasmid.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 5613-17.

11. Bennett M, Macdonald K, Chan SW, Lussio JP, Simari R, Weissberg P, 1998.//Cell surface trafficing of Fas: a rapid mechanism ofp53-mediated apoptosis.// Science. 282:290-3.

12. Bertrand R, Sarang M, Jenkin J, Kerrigan D, Pommier Y, 1991.//Differential induction of secondary DNA fragmentation by topoisomerase II inhibitors in human tumor cell lines with amplified c-myc expression.//Cancer. Res. 51: 6280-5.

13. Bicknell GR, Cohen GM, 1995//Cleavage of DNA to large kilobase pair fragments occurs in some forms of necrosis as well as apoptosis.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 207: 40-47.

14. Boreham DR, Dolling JA, Maves SR, Morris DP, Mitchel REJ, 1997.// Heat-induced thermal tolerance and radiation resistance to apoptosis in human lymphocytes.//Biochem. Cell. Biol. 75:393-7.

15. Boreham DR, Dolling JA, Maves SR, Morris DP, Mitchel REJ, 1997// Heat-induced thermal tolerance and radiation resistance to apoptosis in human lymphocites//Biochem.Cell.Biol.75:393-7.

16. Borek C, Oug A, Morgan WF, Cleaver JE, 1991.// Morphological transformation of 10T1/2 mouse embryo cells can be initiated by DNA double strand breaks alone.// Mol. Carcinogen. 4: 243-7.

17. Bortner CD, Oldenburg NBE, Cidlovski JA, 1995.// The role of DNA fragmentation in apoptosis.// Trends in Cell Biol. 5: 21-6.

18. Bortner CD, Oldenburg NBE, Cidlovski JA, 1995. // The role of DNA fragmentation in apoptosis// Trends in Cell. Biol. 5: 21-6.

19. Bovia F, Nabili-Tehrani AC, Werner-Favre C, Barnet M, Kindler V, Zubler RH, 1998.// Quiescent memory B cells in human peripheral blood co-express bcl-2 and bcl-x(L) anti-apoptotic proteins at high levels.// Eur. J. Immunol. 28:4418-23 .

20. Bovia F, Nabili-Tehrani AC, Werner-Favre C, Barnet M, Kindler V, Zubler RH. 1998// Quiescent memory B cells in human peripheral blood co-express bcl-2 and bcl-x(L) anti-apoptotic proteins at high levels.// Eur. J. Immunol. 28: 4418-23 .

21. Bryant PE, Finnegan CF, Swaffield L, Mozdarani H, 1998.// G2 chromatid breaks in murine SCID cells.// Mutagenesis 13: 481-5.

22. Buja LM, Eigenbrodt ML, Eigebrodt EH, 1993//

23. Apoptosis and necrosis: basic types and mechanisms of cell death// Arch. Pathol. Lab. Med. 117: 120814 .

24. Cantoni 0, Murray D, Meyn RE, 1986.// Effect of 3-aminobenzamide on DNA strand break rejoining and cytotoxicity in CHO cells treated with hydroperoxide.// Biochem. Biophys. Acta. 867: 13543.

25. Cantoni 0, Sestili P, Guidarelli A, Palomba L, Brambilla L, Cattabeni F, 1996.//Cytotoxic impact of DNA single vs double strand breaks in oxidatively enjured cells.// Arch. Toxicol. Suppl. 18: 223-35.

26. Carson DA, Seto S, Wasson DB, Carrera CJ, 1986// DNA strand breaks, NAD-metabolism, and programmed cell death//Exp.Cell Res. 161:273-81.

27. Catchpoole DR, Stewart BW, 1995.//Formation of apoptotic bodies is assiciated with intrnucleosomal fragmentation during drug-inducedapoptosis.// Exp. Cell Res. 216: P160-77.

28. Cheng J, Zhow T, Liu C, Shapiro JP, Brauer MJ, Kiefer MC, Barr PJ, Mountz JD, 1994.//A soluble form of the Fasmolecule protects cells from Fas mediated apoptosis//Science 263:1759-62.

29. Cohen-Jonatan E, Bernhard EJ, Mckenna WG//How does radiation kill cells?//Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. 3: 77-83.

30. Cohen JJ, 1991.//Programmed cell death in the immune system//Adv. Immunol. 50: 55-85.

31. Cohen PL, 1992.//Eisenberg R.A. The lpr and gld genes in systemic autoimmunity life and death in the Fas lane.//Immunol. Today. 13: 427-28.

32. Darzynkiewicz Z, Bedner E, Traganos F, Murakami T, 1998// Critical Aspects in the analysis of apoptosis and necrosis.// Human cell. 11: 3-12.

33. Darzynkiewicz Z, Bruno S, Del Bino G, Gorczyca W,

34. Hotz M, Lassota P, Traganos F, 1992// Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.// Cytometry. 13: 795-808.

35. Dickman, 1997//First p53 relative may be a new tumor suppressor.//Science. 277:1605-06

36. Dive C, Gregory CD, Phipps DJ, Evans DL, Milner AE, Wyllie AH, 1992.// Analisys and discrimination of necrosis and apoptosis (programmed cell death) by multiparameter flow cytometry//Biochim. Biophys. Acta. 1133:275-85.

37. Donehower LA, Harvey M, Slagle BA, McArthur MJ, Montgomery CA,Butel JS, BRAdly A, 1992//Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumor.//Nature. 356: 215-21.

38. Earnshaw WC, 1995.// Nuclear changes in apoptosis. //Curr. Opinion in Cell. Biol. 7: 337-43.

39. Earnshaw WC, 1995.// Nuclear changes in apoptosis.// Curr. Opinion Cell Biol. 7: 337-343.

40. Eguchi Y, Shimizu S, Tsujimoto Y, 1997.// Intracellular ATP levels determine cell death fate by apoptosis or necrosis.//Cancer Res. 57:1835-40.el-Deiry WS, Tokino T, Vasculescu VE, Levy DB,; :* ' . .j: iJi^iTrKa^Mf ^* «p^»

41. Parsons R, Trent JM, Lin D, Merser WE, Kinzler KW, Vogelstein B. 1993// WAF-1, a potential mediator of p53 tumor suppression.// Cell. 75:84952 .

42. Elia MC, DeLuca JG, Bradly MO, 1991// Significance and measurement of DNA double strand breaks in mammalian cells.// Pharmacol. Ther. 51: 291-327.

43. Ellis H, Horvitz HR, 1986// Genetic control of programmed cell death in the nematode C.elegans.// Cell. 44: 817-29.

44. Emlen W, Niebur J, Kadera R, 1995.// Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus.//J. Immunol. 152: 3685-92.

45. Fadok VA, Voelker DR, Cambell PA, Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM. 1992.// Exposure of phosphstidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes trigers the specific recognition and removial by macrophages.// J. Immunol. 148: 220716.

46. Fairbairn DW, Olive PL, O'Neill KL. 1995. // The comprehensive review.// Mutat. Res. 339: 37-59.

47. Fairbairn DW, Walburger DK, Fairbairn JJ, O'Neillr . - - >~> * - - ^ v:

48. KL. 1996. // Key morphologic changes and DNA strand breaks in human lymphoid cells: discriminating apoptosis from necrosis.// Scanning. 18: 407-16.

49. Fairbairn JJ, Khan MW, Ward KJ, Loveridge BW, Fairbairn DW, O'Neill KL. 1995.// Induction of apoptotic cell DNA fragmentation in human cells after treatment with hyperthermia.// Cancer Lett. 89: 183-8.

50. Filippovich IV, Sorokina N1, Robillard N, Lisbona A. Chatal J.-F, 1998// Radiation-induced apoptosis in human tumor cell lines: adaptive response and split dose-effect.// Int. J. Cancer.77: 76-81.

51. Filipski J, Leblan J, Youdale T, Sikorska M, Walker PR, 1990.// Periodicity of DNA folding in higher order chromatin structures.// EMBO J. 9: 1319-27.

52. Fritsch M, Haessler C, Braudner G, 1993// Induction of nuclear accumulation of the tumor suppressor protein p53 by DNA damaging agents.//Oncogene. 8:307-18.

53. Fu L, Minden MD, Benchimol S, 1996//Translation regulation of p53 expression.//EMBO J. 15:4395401.

54. Gorczyca W, Gong J,Darzykiewicz Z, 1993.// Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.// Cancer Res. 53: 1945-51.

55. Götz C, Montenarh M. 1996// p53: DNA damage, DNA repair, and apoptosis.// Rev Physiol Biochem Pharmacol.// 127: 65-95

56. Gromkowski SH, Brown TC, Cerutti P, Cerottini JC// DNA of human Raji target cells is damaged upon lymphocyte-mediated lysis.// J. Immunol. 1986. 136: 752-6.

57. Hall PA, McKee PH, Menage HP, Dover N, Lane DP, 1993//High levels of p53 protein in UV-irradiated normal human skin.//Oncogene. 8:203-7.

58. Hallan E, Blomhoff HK, Smeland EB, Lomo J, 1997.// Involvement of ICE (Caspase) family in gamma-radiation-induced apoptosis of normal Blymphocytes// Scand. J. Immunol. 46: 601-8

59. Hampton MB, Arrenius S, 1997. //Dual regulation of caspase activity by hydrogene peroxide: implications for apoptosis.//FEBS Lett. 414: 55256.

60. Hampton MB, Kettle AJ, Winterbourn CC, 1998// Inside the neutrophil phagosome: oxidants, mieloperoxidase and bacterial killing. Blood. 92: 3007-17.

61. Hannun YA, Obeid LM, 1995// Ceramide: an intracellular, signal for apoptosis.//Trends Biochem. Sei. 20:72-7.

62. Hansen R, Oren M, 1997//P53; from inductive signal to cellular effect.//Curr. Opin. Genet. Develop. 7: 46-51.

63. Hara S, Halicka HD, Bruno S, Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z, 1996// Effects of protease inhibitors on early events of apoptosis.// Exp. Cell Res. 223: 372-84.

64. Heck MMS, Earnshaw WC, 1986.// Topoisomerase II: a specific marker for cell proliferation.// J. Cell Biol. 103: 2569-81.

65. Hermann M, Lorenz H-M, Voll R, Grunke M, Woith W,

66. Kalden JR. 1994.// A rapid and simple method for isolation of apoptotic DNA fragments.// Nucl. Acids Res. 22: 5506-7.

67. Hickman MJ, Samson LD, 1999. // Role of DNA mismatch repair and p53 in signaling induction of apoptosis by alkylating agents.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96: 10764-9.

68. Hochstrasser M, 1998//There is the rub: a novel ubiquitin-like modification linked to cell cycle regulation.//Genes Develop. 12:901-7.

69. Holley WR, Chatterjee A. 1996.// Clusters of DNA induced by ionizing radiation: formation of short DNA fragments. I. Theoretical modeling.// Radiat. Res. 145: 188-99.

70. Holmberg K, Meijer AE, Harms-Ringdahl M, Lambert B, 1998.// Chromosomal instability in human lymphocytes after low dose rate gamma-irradiation and delayed mitogen stimulation//Int. J. Radiat. Biol. 73: 21-34 .

71. Hsang YH, Liu LF.// Identification of mammalian DNA topoisomerase I as an intracellular target of the anticancer drug camptothecin.// Cancer Res. 1988. 48: 1792-1796.

72. Huang L-C, Clarkin KC, Wahl GM, 1996.// Sensitivity and selictivity of the DNA damage sensor responsible for activating p53-dependent Gl arrest.//Proc Natl.Acad.Sei. USA. 93:4827-32.

73. Husain A, He G, Venkatraman ES, Spriggs DR, 1998.// BRCA-1 up-regulation is associated with repair-mediated resistance to cis-diamminedichloroplatinum (II).//Cancer Res. 58: 1120-23.

74. Jarovaia OV, Lagarkova MA, Razin SV, 1995// Specificity of human lymphocyte nucleolar longrange fragmentation by topoll and exogenouse Bal 31 nuclease depends on cell proliferation status.// Biochemistry 34: 4131-38.

75. Jaxel C, Tandon G, Portemer C, Mirambean G, Panijel J, Duguet M, 1988.//Topoisomerase inhibitors induce irreversible fragmentation of replicated DNA in Con A stimulated splenocites.// Biochemistry 27: 95-9.

76. Johnson RE, Glover MK, Marshall SK,1971.// Results of radiation therapy and implications for the clinical staging of Hodgkin's disease.// Cancer Res. 31:1834-7

77. Johnstone AP,1984//Rejoining of DNA strand breaks is an early nuclear event during the stimulation of quiescent lymphocytes// Eur. J. Biochem. 140: 401-6.

78. Kerr JFR, 1971//Shrinkage necrosis: a distinct model of cellular death//J. Pathol. 105: 13-20.

79. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. 1972// Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging application in tissue kinetics.// Br. J. Cancer 26: 239-57.

80. Khodarev NN, Sokolova IA, Vaughan AT, 1999.// Fdortive apoptosis as an initiator of chromosomal translocations// Med. Hypotheses. 52: 373-6.

81. Knippschild U, Oren M, Deppert W, 1996// Abrogation of wild-type p53 protein impair the Gl checkpoint after DNA damage.//Mol.Cell.Biol. 16:1126-37.

82. Major GN, Brady M, Notarianni GB, Collier JD, Douglas MS,1997//Evidence for ubiquitin-mediated degradation of the DNA repair enzyme for 06-methykguanine in non-tumor derived human cell and tissue extracts.//Biochem.Soc.Trans. 25:359S.

83. Marini M, Frabetti F, Musiani D, Franceschi C, 1997.// Oxygen radicals induce stress proteins and tolerance to oxidative stress in human lymphocytes.//Int. J. Radiat. Biol. 70: 337-50.

84. Marini M, Munsiami D, Sestili P, Cantoni 0,i- • ' ' -«if1. JL1996.// Apoptosis of human lymphocytes in the absence or presence of internucleosomal DNA cleavage.//Biochem. Biophys. Res. Commun. 229: 910-15.

85. Martin DS, Schwartz GK,1997//Chemotherapeutically induced DNA damage, ATP depletion, and the apoptotic biochemical cascade//Oncol. Res.9: 1-5.

86. Marx J, 1994.// New link found between p53 and DNA repair.//Science. 266:1321-22.

87. McConkey MD, Zhyvotovsky B,Orrenius S. 1996// Apoptosis molecular mechanisms and biochemical implications.// Mol.Aspects of Med. 17:1-10.

88. Meijer AE, Kronqvist US, Lewensohn R, HarmsRingdahl M, 1998.// RBE for the induction of apoptosis in human peripheral lymphocytes exposed in vitro to high-LET radiation generated by accelerated nitrogen ions// Int. J. Radiat. Biol. 73:169-77.

89. Meikrantz W, Bergom MA, Memisoglu A, Samson L, 1998. // 06-alkylguanine DNA lesions trigger apoptosis.// Carcinogenesis. 19: 369-72.

90. Meng H, Terado T, Kimura H,1998// Apoptosis induced by x-ray and chemical agents in murine fibroblastic cell lines with defect in repair of DNA double-strand breaks.// Int. J. Radiat. Biol. 73: 503-10.

91. Mengubas K, Fahey AA, Lewin J, Mehta AB, Hoffbrand AV, Wickremasinghe RG, 1999.//Killing of T lymphocytes by synthetic ceramide is by a nonapoptotic mechanism and is abrogated following mitogenic activation//Exp.Cell.Res. 249:116-22.

92. Messam CA, Pittman RN, 1998.// Asynchrony and commitment to die during apoptosis.// Exp. Cell Res. 238: 389-98.

93. Minato K, Kanzawa F, Nashio K, Fujiwara Y, Saijo N, 1990.// Characterization of etoposide-resistant human small-cell lung cancer cell line.// Cancer Chemother. Pharmacol. 26:313-17.

94. Morton NE. 1991.//Parameters of the human genome.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 88:7474-6.

95. Mundle SD, Gregory SA, Preisle HD, Raza A, 1996.// Enzymatic programming of apoptotic cell deathreview).// Pathobiology. 64: 161-70.

96. Muzio M, Salvesen GS, Dixit VM, 1997//FLICE induced apoptosis in a cell-free system. Cleavage of caspase zymogens.// J Biol Chem 272:2952-6.

97. Nagata S, Goldstein P, 1995.//The Fas death factor.// Science. 267:1449-55.

98. Nakano H, Shinohara K, 1994// X-ray-induced cell death: apoptosis and necrosis// Radiat. Res. 140: 1-9.

99. Nelson WG, Kastan MB, 1999.// DNA strand breaks: the DNA template alterations trigger p53-dependent DNA-damage response pathways.// Mol. Cell. Biol. 14: 1815-23.

100. Nicotera P, Leist M,1997//Energy supply and the shape of death in neurons and lymphoid cells//Cell Death Differ. 4:435-42.

101. Okamoto M, Kawai K, Reznikoff CA, Oyasu R, 1996.

102. Transformation in vitro of a tumorigenic rat urothelial cell line by hydrogen peroxide.//Cancer Res. 56: 4649-53.

103. Olive PL, Banath JP, Durand RE. 1990.// Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumour and normal cells measured using the 'comet' assay.// Radiat.Res. 122: 69-72.

104. Olive PL, Frazer G, Banath JP. 1993.// Radiation-induced apoptosis measured in TK6 human B lymphoblast cells using the comet assay.// Radiat. Res. 136: 130-6.

105. Olive PL, Johnston PJ, Banath JP, Durand RE, 1998//The comet assay: a new method to examine heterogeneity associated with solid tumors.// Nature Med. 4: 103-5.

106. Olive PL. 1999. //DNA damage and repair in individual cells: applications of the comet assay in radiobiology.// Int. J. Rad. Biol. 75: 395-405.

107. Olive PL.1995// Detection of hypoxia by measurement of DNA damage in individual cells from spheroids and murine tumours exposed to bioreductive drugs. I. Tirapazamine.// British J. Cancer.// 71: 529-36.

108. Oliver FJ, Menissier-de Murcia J, de Murcia G.1999//Poly(ADP-ribose) polymerase in the cellular response to DNA damage, apoptosis, and disease.// Am J Hum Genet. 64: 1282-8 .

109. Op den Kamp JAF. 1979.// Lipid asymmetry in membranes.// Ann. Rev. Biochem. 49: 47-59.

110. Oshita F, Saijo N, 1994.// Rapid polymerase chain reaction assay to detect variation in the extent of gene-specific damage between cisplatin- or VP-16-resistant and sensitive lung cancer cell lines.// Jpn. J. Cancer Res. 85: 669-73.

111. Ostling 0, Johanson KJ. 1984//

112. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damage in individual mammalian cells// Biochem. Biophys. Research Commun. 123: 2 91-8.

113. Ostling 0, Johanson KJ. 1987.// Bleomycin, in contrast to gamma irradiation, induces extreme variation of DNA strand breakage fron cell to cell.// Int. J. Radiat. Biol. 52: 683-91.

114. Pardee AB. 1974.// A restriction point for control of normal animal cell proliferation.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71: 1286-90.

115. Payne CM, Bjore CG, Schuttz DA,1992.//Change in the frequency of apoptosis after low and high dose of X-irradiation of human lymphocytes//J. Leuk.k. , V « «U, 4. «.'iwd »! «*>*<»-If. «rfUM'O- -» • -"uxor,* .iff»-»1. Biol. 52:433-40.

116. Peitsch MC, Muller C, Tschopp J, 1993.// DNA fragmentation during apoptosis is caused by frequent single-strand cutts.// Nucl. Acids Res. 21: 4206-9.

117. Piacentini M, Fesus L, Farrace MG, Ghibelli L, Pirredda L, Melino G. 1991.// The expression of "tissue" transglutaminase in two human cancer cell lines is related with the programmed cell death (apoptosis).// Eur. J. Cell. Biol. 54: 5870-78.

118. Piperakis S, Visvardis EE, Tassiou AM. 1999. // Comet assay for nuclear DNA damage.// Methods- in Enzymol. 300: 184-94.

119. Razin SV, Gromova II, Iarovaia OV, 1995.// Specificity and functional significance of DNA interaction with yhe nuclear Matrix: New approaches to clarify theold questions.// Int. Review Cytol. 162B: 405-448.

120. Richter C, Schweizer M, Cossarizza A, Franceschi C, 1996.// Control of apoptosis by cellular ATP level.// FEBS Lett. 378: -107-110.

121. Rosenberg SA, Boiron M, DeVita VT Jr, Johnson RE, Lee BJ, Ultmann JE, Viamonte M Jr, 1971.//Report of the Committee on Hodgkin's Disease Staging

122. Procedures.//Cancer Res. 31:1862-3

123. Rossing L, Fichtlscherer B, Breitschopf K, Haendeler J, Zeiher AM, Mulsch A, Dimmeler S, 1999.// Nitric oxide inhibits caspase-3 by S-nitrosation in vivo. J. Biol. Chem. 274: 6823-826.

124. Salvesen GS, Dixit VM. 1997//Caspases: intracellular signaling by proteolysis//Cell. 91: 443-6.

125. Salvesen GS,Dixit VM 1999// Caspase activation: theinduced proximity model// Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96:10964-7.

126. Sandstrom BE, Marklund SL, 1990.//Effects of variation in glutatione peroxidase activity on DNA damage and cell survival in human cells exposed to hydrogen peroxide and tert-butyl hydroperoxide// Biochem. J. 271: 17-23.

127. Saraste A, 1999.// Morphologic criteria and detection of apoptosis.// Hertz 24: 189-95

128. Seki H, Kanegane H, Iwwai K, Konno A, Ohta K, Yachie A, Taniguchi N, Miyawaki T, 1994.// Ionizing radiation induces apoptotic cell death in human TcR-g/d+ T and natural killer cells without detectable p53 protein// Eur. J. Immunol. 24: 2914-17.

129. Selvakumaran M, Lin HK, Miyashita T, Wang HG, Krajewski S, Reed JC, Hoffman B, Liebermann D, 1994.// Immediate early up-regulation of bax expression by p53 but not TGF beta 1: a paradigm for distinct apoptotic pathways.//Oncogene. 9: 1791-8.

130. Shaw P, Freeman J, Bovey R, Iggo R, 1996//Regulation of specific DNA-binding by p53: evidence for a role for O-glycosylation and charged residues at the carboxyl-terminus.//Oncogene. 12:921-30.

131. Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. 1988.//

132. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.// Exp. Cell Res. 175: 184-91.

133. Singh NP, Stephens RE. 1997.//Microgel electrophoresis: sensitivity, mechanisms, and DNA electrostretching.// Mutat.Res.383:167-7 5.

134. Singh NP, Stephens RE. 1998.//X-ray induced DNA double-strand breaks in human sperm.// Mutagenesis 13:75-9

135. Story MD, Voehringer DW, Malone CG, Hobbs ML, Meyn RE. 1994// Radiation-induced apoptosis in sensitive and resistant cells isolated from a mouse lymphoma.// Int. J. Radiat.Biol. 66: 659-68.

136. Sun A-M, Cohen GM, 1994. // Mg+2-dependent cleavage of DNA into kilobase pair fragmentsis reasonable for the initial degradation of DNA in apoptosis.// J. Biol. Chem. 269: 14857-60.

137. Swat W, Ignatowicz L, Kisielow P, 1991// Detection of apoptosis of immature CD4+8+ thymocytes by flow cytometry.// J. Immunol. Methods. 137: 79-87.

138. Thornberry NA, Lazebnik Y, 1998// Caspases: enemies within//Science 281: 1312-6.

139. Tomei LD, Shapiro JP, Cope FO. 1993. //Apoptosis in CH3/10T1/2 mouse embryonic cells:evidence of internucleosomal DNA modification in the absence of double strand cleavage.// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 90: 853-7.

140. Tounekti O, Belehradek J, Mir LM, 1995.// Relationships between DNA fragmentation, chromatincondesation and changes in flow cytometry profiles detected during apoptosis.// Exp. Cell Res. 217: 506-12 .

141. Tounekti 0, Pron G, Belehradek J Jr, Mir LM, 1993.//Bleomycin, an apoptosis-mimetic drug that induces two types of cell death depending on the number of molecules internalized.// Cancer Res 53: 5462-9.

142. Ucker DS, Obermiller PS, Eckhart W, Apgar JR, Berger NA, Meyers J, 1992// Genome digestion is a dispensable consequence of physiological cell death mediated by cytotoxic T lymphocytes// Mol. Cell. Biol. 12: 3060-69.

143. Vral A, Cornelissen M, Thierens H, Lonagie H, Philippe J, Strijckmans K, De Ridder L. 1998// Apoptosis induced by fast neutrons versus 60Co grays in human peripheral blood lymphocytes.// Int.J.Radiat.Biol. 73: 289-95.

144. Walker PR, Smith C, Youdale T, Leblanc J, Whitfield JF, Sikorska M,1991// Topoisomerase II-reactive chemotherapeutic drugs induce apoptosis in thymocytes.// Cancer. Res. 51: 1078-85.

145. Wang JC, 1985.//DNA topoisomerases.// Ann. Rev. Biochem. 54: 665-97.

146. Ward JF, Blakely WF, Joner EI, 1985// Mammalian cells are not killed by DNA single strand breaks caused by hydroxyl radicals from hydrogen peroxide.// Radiat. Res. 103: 383-92.

147. Ward JF, Evans CL, Limoli CL, Calabro-Jones PM, 1987. // Radiation and hydrogen peroxide induced free radical damage to DNA.// Brit. J. Cancer. 55: 105-12.

148. Ward KJ. 1988.// DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: indication of mechanisms of formation and reparability.// Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 35: 95-125.

149. Woessner RD, Mattern MR, Mirabelli CK, Johnson RK, Drake FH, 1991.// Proliferation- and cell cycle-dependent differences in expression of the 170 kDa forms of topoisomerase II in NIH-3T3 cells.// Cell Growth Differ. 2: 209-14.

150. Wyllie AH. 1980// Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with of endogenious endonucclease activation.// Nature 284: 555-6.

151. Yang E, Korsmeyer SJ, 1996.// Molecular tanatopsis: a discourse on the BCL2 family and cell death.// Blood. 88: 386-401.

152. Yoshida A, Ueda T, Wano Y, Nakamura T, 1993.// DNA damage and cell killing by camptothecin and its derivative in human leukemia HL-60 cells.//Jpn. J. Cancer Res. 84: 566-73.

153. Yuan J, Shahman S, Ledoux S, Ellis H, Horvitz HR. 1993. // The C. elegans cell death gene ced3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-lb-converting enzyme.// Cell. 75: 64152.

154. Zhou PK, Sproston AR, Marples B, West CM, Margison GP, Hendry JH, 1998// The radiosensitivity of human fibroblast cell lines correlates with residual level of DNA double strand breaks.// Radiother. Oncol. 47: 271-6.

155. Zini N, Santi S et al.// Discrete localization of different DNA topoisomerases in HeLa and K562 cell nuclei and subnuclear fractions.// Exp. Cell Res. 1994. 210: 336-8.

156. Белум A. 1980. Выделение лимфоцитов, гранулоцитов и макрофагов. В кн. "ЛимфоцитыЖ выделение. фракционирование, характеристика." Ред. Натвиг ДБ,

157. Перлман П, Визгелль X. Медицина. М.

158. Лисицына ТА, Тронов ВА, Коноплянников МА, Дурнев АД, Иванова ММ, 1998.//Исследование поврежденности ДНК мононуклеарных клеток крови больных системной красной волчанкой методом ДНК-комет// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 125: 73-8.

159. Разин СВ, Юдинкова ЕЮ, 1998.// Крупномасштабная фрагментация ДНК при апоптозе: разрезается ли геном по границам топологических доменов?// Известия РАН. Сер. Биол. 2: 167-71.

160. Тронов ВА, Гринько ЕВ, Бериташвили ДР, Филиппович ИВ. 1991//Микроэлектрофорез ДНК индивидуальных интактных и гамма-облученных тимоцитов.// Цитология 33: 94-102.

161. Тронов ВА, Гринько ЕВ, Кончаловский МВ, Данилова НБ, Терещенко ДГ, Филиппович ИВ,1993.// Остаточные повреждения ДНК в периферических лимфоцитах после тотального облучения человека// Медицинская радиология. 2:38-41.

162. Тронов ВА, Коноплянников МА, Никольская ТА, Константинов ЕМ,1999// Разрывы ДНК и апоптоз, индуцированные ингибитором топоизомеразы II этопозидом (УР—16).// Биохимия. 64: 412-420.

163. Тронов ВА, Коноплянников МА, Никольская ТА,175

164. Константинов ЕМ. 1999. // Апоптознестимулированных лимфоцитов человека и разрывы ДНК, индуцированные ингибитором топоизомеразы II этопозидом.// Биохимия 64: 412-20.

165. Тронов ВА, Пелевина ИИ. 1996.// Метод ДНК-комет индивидуальных клеток. Прицип и применение метода.//Цитология 38:427-39.

166. Тронов ВА, Терещенко ДГ, Коноплянников МА, 1998. // Механизм радиационной гибели лимфоцитов периферической крови человека, оцениваемой методом ДНК-комет.// Биофизика. 43: 115-24.

167. Тронов ВА. 1999.// Репарация ДНК и апоптоз.// Цитология. 41: 405-11.

Информация о работе

Тронов, Виктор Александрович
доктора биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.02

Диссертация

Разрывы ДНК, их репарация и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы