Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка цитотоксических агентов направленного действия на основе эпидермального фактора роста человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ермолюк, Ярослав Станиславович

СОДЕРЖАНИЕ.

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.:.

Глава 1. Эпидермальный фактор роста и его рецептор.

1.1. Эпидермальный фактор роста.

1.2. Рецептор эпидермального фактора роста.

1.3. Структура рецептора эпидермального фактора роста.

1.4. Регуляция и биологические функции рецептора.

Глава 2. Вектора для доставки чужеродного генетического материала в клетки млекопитающих.

2.1. Ретровирусы.

2.1.1. Биология вируса.

2.1.2. Вектора на основе MLV.

2.1.3. Вектора на основе лентивирусов.

2.2. Аденовирусы (Ad).'

2.2.1. Биология аденовируса.

2.2.2. Векторные системы на основе аденовирусов.:

2.3. Аденоассоциированные вирусы (AAV).

2.3.1. Биология AAV.

2.3.2. Вектора на основе AAV.

2.4. Вирус простого герпеса (HSV).

2.4.1. Биология вируса.

2.4.2. Вектора на основе рекомбинантного HSV.

2.4.3. Вектора на основе дефектного HSV.

2.5. Невирусные векторные системы.

2.5.1. Свободная ДНК.

2.5.2. Катионные липиды.

2.5.3. Конденсированная ДНК.

2.5.4. Инъекция "без иглы".

2.5.5. Электропорация.

2.6. Адресная доставка чужеродного генетического материала.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1. Разработка системы экспрессии hEGF.

4.1.1. Клонирование тиоредоксина Е. coli и конструирование вектора pHis-EGF.

4.1.2. Подбор штамма-хозяина.

4.1.3. Оптимизация условий культивирования рекомбинантных штаммов Е. coli и разработка метода очистки гибрида.

4.1.4. Очистка гибридного белка.

4.1.5. Высвобождение hEGF из гибридного белка.

4.2. Получение и тестирование цитотоксического действия конъюгата А-субъединицы рицина и гибрида тиоредоксин-hEGF.

4.3. Разработка векторной системы для доставки чужеродного генетического материала в клетки млекопитающих.

4.3.1. Конструирование экспрессионного вектора pffis-NLS-hEGF.

4.3.2. Экспрессия гена и очистка белка NLS-hEGF.

4.3.3. Биологическое тестирование hEGF, NLS-hEGF и укороченного hEGF.

4.3.4. Тестирование векторной системы NLS-hEGF.

4.3.5. Использование векторной системы НЬв-МЮР для доставки антисмысловых олигонуклеотидов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка цитотоксических агентов направленного действия на основе эпидермального фактора роста человека"

Для терапии онкологических заболеваний несомненный интерес представляют препараты, способные избирательно элиминировать опухолевые клетки. Избирательное действие таких препаратов обусловлено наличием на перерожденных клетках антигенов, ассоциированных с опухолью, которые могут быть использованы в качестве мишеней для доставки лекарственных субстанций. В ряде случаев возможность адресной доставки цитотоксических агентов определяется значительным превышением количества, по сравнению с нормальными клетками, специфических рецепторов на поверхности опухолевых клеток. Одним из таких рецепторов является рецептор эпидермального фактора роста человека (БвРЯ). На определенных этапах развития его экспрессируют почти все типы клеток, за исключением кроветворных. В норме на клетках представлено 2x104 - 2x105 молекул этого рецептора. Плотность же его на злокачественных клетках ряда опухолей эпителиального происхождения значительно выше и достигает 107 молекул на клетку. Гиперэкспрессия рецептора ЬЕОБ наблюдается при карциномах (1), глиомах (2, 3), опухолях груди, яичников (4) и других тканей.

Таким образом, одним из способов создания противоопухолевых препаратов направленного действия является конъюгация цитотоксического агента и эпидермального фактора роста человека (ЪЕОР). Причем последний выполняет роль векторной молекулы, способной доставлять и концентрировать цитотоксический агент в опухолевых тканях. Другой способ заключается в использовании геннотерапевтического подхода. Создание гибрида ИБвР и сигнального пептида ядерной локализации (N1.8), способного связывать нуклеиновые кислоты и проникать из цитоплазмы в ядро клетки, позволит доставлять чужеродную ДНК в ядро перерожденной клетки.

Целью настоящей работы была разработка и получение белковых препаратов на основе ЫЮР человека, способных селективно доставлять в раковые клетки токсины и чужеродную ДНК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ермолюк, Ярослав Станиславович

выводы

1. Разработана эффективная гибридная система экспрессии hEGF в клетках Е. coli.

2. Получен штамм Е. coli BL21(DE3)pLysED, несущий ген лизоцима бактериофага Т7, необладающего амидазной активностью. Доказана уникальность этого штамма для стабильной экспрессии токсичных для Е. coli белков - РНКазы и энтерокиназы.

3. Продемонстрирована возможность создания эффективных цитотоксических агентов на основе конъюгата тиоредоксин-hEGF - молекулы токсинов.

4. Показано, что hEGF в составе гибридного белка полностью сохраняет свои функциональные свойства.

5. Установлено, что укорочение hEGF с С-конца на пять аминокислотных остатков не влияет на его активность.

6. Разработана эффективная гибридная система экспрессии hEGF с сигнальным пептидом ядерной локализации в клетках Е. coli.

7. Показано, что NLS-hEGF способен доставлять чужеродную плазмидную ДНК в ядро эукариотических клеток.

8. Продемонстрирована способность NLS-hEGF защищать фосфодиэфирные антисмысловые олигонуклетиды от нуклеазной деградации в клеточной культуре.

9. Установлено увеличение эффективности действия антисмысловых олигонуклеотидов в присутствии NLS-hEGF.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ермолюк, Ярослав Станиславович, Москва

1. De Boer WI, Houtsmuller AB, Izadifar V, Muscatelli-Groux B, Van der Kwast TH, Chopin

2. DK. Expression and functions of EGF, FGF and TGFbeta-growth-factor family members and their receptors in invasive human transitional-cell-carcinoma cells. Int J Cancer 1997, 71(2), 284-91

3. Wersall P, Ohlsson I, Biberfeld P, Collins VP, von Krusenstjerna S, Larsson S, Mellstedt H,

4. Boethius J. Intratumoral infusion of the monoclonal antibody, mAb 425, against the epidermal-growth-factor receptor in patients with advanced malignant glioma. Cancer Immunol Imimmother 1997, 44(3), 157-64

5. Ennis BW, Lippman ME, Dickson RB. The EGF receptor system as a target for antitumortherapy. 1991, Cancer Invest 1991,9(5), 553-62

6. Kumar V, Bustin SA, McKay IA. Transforming growth factor alpha. Cell Biol Int 1995, 19(5),373.88

7. Shoyab M, Plowman GD, McDonald VL, Bradley JG, Todaro GJ. Structure and function ofhuman amphiregulin: a member of the epidermal growth factor family. Science 1989, 243 (4894 Pt 1), 1074-6

8. Higashiyama S, Abraham JA, Miller J, Fiddes JC, Klagsbrun M. A heparin-binding growthfactor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF. Science 1991, 251(4996), 936-9

9. Sasada R, Ono Y, Taniyama Y, Shing Y, Folkman J, Igarashi K. Cloning and expression ofcDNA encoding human betacellulin, a new member of the EGF family. Biochem Biophys Res Commun 1993,190(3), 1173-9

10. Toyoda, H., Komurasaki, T., Ikeda, Y., Yoshimoto, M., Morimoto, S., 1995. Molecularcloning of mouse epiregulin, a novel epidermal growth factor-related protein, expressed in the early stage of development. FEBS Lett 1995, 377(3), 403-77

11. Marchionni MA, Goodearl AD, Chen MS, Bermingham-McDonogh O, Kirk C, Hendricks M,

12. Carraway KL 3rd, Weber JL, Unger MJ, Ledesma J, Yu N, Gassmann M, Lai C. Neuregulin2, a new ligand of ErbB3/ErbB4-receptor tyrosine kinases. Nature 1997, 387(6632), 512-6

13. Zhang D, Sliwkowski MX, Mark M, Frantz G, Akita R, Sun Y, Hillan K, Crowley C, Brush J,

14. Godowski PJ. Neuregulin-3 (NRG3): a novel neural tissue-enriched protein that binds and activates ErbB4. Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94(18), 9562-7

15. Harari D, Tzahar E, Romano J, Shelly M, Pierce JH, Andrews GC, Yarden Y. Neuregulin-4: anovel growth factor that acts through the ErbB-4 receptor tyrosine kinase. Oncogene 1999, 18(17), 2681-9

16. Cohen S. Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor eruption andeyelid opening in the new born animal. J. Biol. Chem. 1962, 237, 1555-62

17. Gregory H. In vivo aspects of urogastrone-epidermal growth factor. J Cell Sci Suppl 1985, 3,11.7

18. Mroczkowski B, Reich M, Chen K, Bell GI, Cohen S. Recombinant human epidermal growthfactor precursor is a glycosylated membrane protein with biological activity. Mol Cell Biol 1989, 9(7), 2771-8

19. Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. Annu Rev Biochem 1979, 48,193-216

20. Carpenter G. Epidermal growth factor: biology and receptor metabolism. J Cell Sci Suppl1985, 3,1-9

21. Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. J Biol Chem 1990,265(14), 7709-12

22. Junier MP. What role(s) for TGFalpha in the central nervous system? Prog Neurobiol 2000,62(5), 443-73

23. Carpenter G. Receptors for epidermal growth factor and other polypeptide mitogens. Annu

24. Rev Biochem 1987, 56, 881-914

25. Bishayee S. Role of conformational alteration in the epidermal growth factor receptor

26. EGFR) function. Biochem Pharmacol 2000, 60(8), 1217-23

27. Maa MC, Leu TH, McCarley DJ, Schatzman RC, Parsons SJ. Potentiation of epidermalgrowth factor receptor-mediated oncogenesis by c-Src: implications for the etiology of multiple human cancers. Proc Natl Acad Sci U S A 1995, 92(15), 6981-5

28. Boonstra J, Rijken P, Humbel B, Cremers F, Verkleij A, van Bergen en Henegouwen P. Theepidermal growth factor. Cell Biol Int 1995,19(5), 413-30

29. Zwick E, Hackel PO, Prenzel N, Ullrich A. The EGF receptor as central transducer ofheterologous signalling systems. Trends Pharmacol Sci 1999, 20(10), 408-12

30. Carpenter G. The EGF receptor: a nexus for trafficking and signaling. Bioessays 2000, 22(8),697.707

31. Anderson WF, Blaese RM, Culver K. The ADA human gene therapy clinical protocol: Pointsto Consider response with clinical protocol, July 6, 1990. Hum Gene Ther 1990, 1(3), 33162.

32. Mountain A. Gene therapy: the first decade. Trends Biotechnol 2000, 18(3), 119-28

33. Stone D, David A, Bolognani F, Lowenstein PR, Castro MG. Viral vectors for gene deliveryand gene therapy within the endocrine system. J Endocrinol 2000, 164(2), 103-18

34. Bordignon C, Notarangelo LD, Nobili N, Ferrari G, Casorati G, Panina P, Mazzolari E,

35. Maggioni D, Rossi C, Servida P, Ugazio AG, Mavilio F. Gene therapy in peripheral blood lymphocytes and bone marrow for ADA- immunodeficient patients. Science 1995, 270(5235), 470-5

36. Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D. In vivogene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 1996, 272(5259), 263-7

37. Blomer U, Naldini L, Kafri T, Trono D, Verma IM, Gage FH. Highly efficient and sustainedgene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J Virol 1997, 71(9), 6641-9

38. Hermens WT, Verhaagen J. Viral vectors, tools for gene transfer in the nervous system. Prog

39. Neurobiol 1998, 55(4), 399-432

40. Engelhardt JF, Ye X, Doranz B, Wilson JM. Ablation of E2A in recombinant adenovirusesimproves transgene persistence and decreases inflammatory response in mouse liver. Proc Natl Acad Sci U S A 1994, 91(13), 6196-200

41. Yeh P, Dedieu JF, Orsini C, Vigne E, Denefle P, Perricaudet M. Efficient dualtranscomplementation of adenovirus El and E4 regions from a 293-derived cell line expressing a minimal E4 functional unit. J Virol 1996, 70(1), 559-65

42. Fisher KJ, Choi H, Burda J, Chen SJ, Wilson JM. Recombinant adenovirus deleted of all viralgenes for gene therapy of cystic fibrosis. Virology, 217(1), 11-22

43. Mitani K, Graham FL, Caskey CT, Kochanek S. Rescue, propagation, and partial purificationof a helper virus-dependent adenovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A 1995, 92(9), 3854-8

44. Kotin RM, Siniscalco M, Samulski RJ, Zhu XD, Hunter L, Laughlin CA, McLaughlin S,

45. Muzyczka N, Rocchi M, Berns KI. Site-specific integration by adeno-associated virus. Proc Natl Acad Sci U S A 1990, 87(6), 2211-5

46. Hermonat PL, Muzyczka N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloningvector: transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1984, 81 (20), 6466-70

47. Hermonat PL, Labow MA, Wright R, Berns KI, Muzyczka N. Genetics of adeno-associatedvirus: isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2 mutants. J Virol 1984, 51(2), 329-39

48. Samulski RJ, Chang LS, Shenk T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associatedviruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol 1989, 63(9), 3822-8

49. Li J, Samulski RJ, Xiao X. Role for highly regulated rep gene expression in adeno-associatedvirus vector production. J Virol 1997, 71(7), 5236-43

50. Longnecker R, Roizman B. Clustering of genes dispensable for growth in culture in the Scomponent of the HSV-1 genome. Science 1987, 236(4801), 573-6

51. Ho DY, Mocarski ES. Beta-galactosidase as a marker in the peripheral and neural tissues ofthe herpes simplex virus-infected mouse. Virology 1988,167(1), 279-83

52. Wolfe JH, Deshmane SL, Fraser NW. Herpesvirus vector gene transfer and expression ofbeta-glucuronidase in the central nervous system of MPS VII mice. Nat Genet 1992, 1(5), 379-84

53. Spaete RR, Frenkel N. The herpes simplex virus amplicon: a new eucaryotic defective-viruscloning-amplifying vector.Cell 1982, 30(1), 295-304

54. Davison MJ, Preston VG, McGeoch DJ. Determination of the sequence alteration in the DNAof the herpes simplex virus type 1 temperature-sensitive mutant ts K. J Gen Virol 1984, 65 (Pt 5), 859-63

55. Fraefel С, Song S, Lim F, Lang P, Yu L, Wang Y, Wild P, Geller AI. Helper virus-freetransfer of herpes simplex virus type 1 plasmid vectors into neural cells. J Virol 1996, 70(10), 7190-7

56. Dani SU. The challenge of vector development in gene therapy. Braz J Med Biol Res 1999,32(2), 133-45

57. Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani A, Feigner PL. Direct genetransfer into mouse muscle in vivo. Science 1990, 247(4949 Pt 1), 1465-8

58. Wang R, Doolan DL, Le TP, Hedstrom RC, Coonan KM, Charoenvit Y, Jones TR, Hobart P,

59. Margalith M, Ng J, Weiss WR, Sedegah M, de Taisne C, Norman JA, Hoffman SL. Induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in humans by a malaria DNA vaccine. Science 1998,282(53 88), 476-80

60. Krieg AM. Direct immunologic activities of CpG DNA and implications for gene therapy. J1. Gene Med 1999,1(1), 56-63

61. Abdallah B, Sachs L, Demeneix BA. Non-viral gene transfer: applications in developmentalbiology and gene therapy. Biol Cell 1995, 85(1), 1-7

62. Dass CR, Walker TL, Burton MA, Decruz EE. Enhanced anticancer therapy mediated byspecialized liposomes. J Pharm Pharmacol 1997, 49(10), 972-5

63. Ropert C. Liposomes as a gene delivery system. Braz J Med Biol Res 1999, 32(2), 163-9

64. Bloomfield VA. DNA condensation. Curr Opin Struct Biol 1996, 6(3), 334-41

65. De Smedt SC, Demeester J, Hennink WE. Cationic polymer based gene delivery systems.

66. Pharm Res 2000, 17(2), 113-26

67. Зеленин, A.B. Генная терапия на границе третьего тысячилетия. Вестник РАН 2001,71(5), 387-395

68. Mathei С, Van Damme Р, Meheus A. Hepatitis В vaccine administration: comparisonbetween jet-gun and syringe and needle. Vaccine 1997, 15(4), 402-4

69. Kaplitt, M.G. and Loewy A.D. 1995. Viral vectors: gene therapy and neuroscienceapplications. Academic Press, San Diego, CA, 486

70. Smaglik, P. Investigators Ponder What Went Wrong After Gene Therapy Death. The1. Scientist, 1999,13(21), 1

71. Wu GY, Wu CH. Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carriersystem. J Biol Chem 1987, 262(10), 4429-32

72. Curiel DT, Agarwal S, Wagner E, Cotten M. Adenovirus enhancement of transferrinpolylysine-mediated gene delivery. Proc Natl Acad Sci U S A 1991, 88(19), 8850-4

73. Cristiano RJ, Smith LC, Woo SL. Hepatic gene therapy: adenovirus enhancement of receptormediated gene delivery and expression in primary hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 1993, 90(6), 2122-6

74. Plank C, Oberhauser B, Mechtler K, Koch C, Wagner E. The influence of endosomedisruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. J Biol Chem 1994, 269(17), 12918-24

75. Pollard H, Remy JS, Loussouarn G, Demolombe S, Behr JP, Escande D. Polyethyleniminebut not cationic lipids promotes transgene delivery to the nucleus in mammalian cells. J Biol Chem 1998, 273(13), 7507-11

76. Godbey WT, Wu KK, Mikos AG. Tracking the intracellular path of poly(ethylenimine)/DNAcomplexes for gene delivery. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(9), 5177-81

77. Branden LJ, Mohamed AJ, Smith CI. A peptide nucleic acid-nuclear localization signalfusion that mediates nuclear transport of DNA. Nat Biotechnol 1999, 17(8), 784-7

78. Ziemienowicz A, Gorlich D, Lanka E, Hohn B, Rossi L. Import of DNA into mammaliannuclei by proteins originating from a plant pathogenic bacterium. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(7), 3729-33

79. Birnboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinantplasmid DNA. Nucleic Acids Res 1979, 7(6), 1513-23

80. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol 1983,166(4), 557-80

81. Kurien BT, Scofield RH. Polyethylene glycol-mediated bacterial colony transformation.

82. Biotechniques 1995, 18(6), 1023-6

83. Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli withplasmids. Gene 1990, 96(1), 23-8

84. Prep-A-Gene DNA Purification Kit Instruction Manual, Bio-Rad Laboratories, 1991

85. Маниатис T, Фрич Э, Сембрук Д. Молекулярное клонирование. Москва, "Мир", 1984.)

86. Sequenase Version 2.0. DNA Sequencing Kit. United States Biochemical, 1992

87. Мазин A.A., Кузнеделов К.Д., Краев A.C., Холодилов Н.Г., Блинов А.Г., Кузьминов

88. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4. Nature 1970, 227(259), 680-5

89. Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 1987,166(2), 368-79.

90. Carlsson J, Drevin H, Axen R. Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation.

91. N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, a new heterobifunctional reagent. Biochem J 1978,173(3), 723-37

92. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application toproliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983, 65(1-2), 55-63

93. Тесенков В. Реакция бласт-трансформации лимфоцитов селезенки под влияниемантигена in vitro. Иммунологические методы. Ред. Х.Фримеля. Москва, Мир, 197999

94. Hockney RC. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli.

95. Trends Biotechnol 1994,12(11), 456-63

96. Takahashi N, Creighton TE. On the reactivity and ionization of the active site cysteineresidues of Escherichia coli thioredoxin. Biochemistry 1996, 35(25), 8342-53

97. Holmgren A. Thioredoxin. Annu Rev Biochem 1985, 54, 237-71

98. Buchanan BB, Schurmann P, Decottignies P, Lozano RM. Thioredoxin: a multifunctionalregulatory protein with a bright future in technology and medicine. Arch Biochem Biophys 1994, 314(2), 257-60

99. LaVallie ER, DiBlasio EA, Kovacic S, Grant KL, Schendel PF, McCoy JM. A thioredoxingene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (NY) 1993, 11(2), 187-93

100. Lu Z, DiBlasio-Smith EA, Grant KL, Warne NW, LaVallie ER, Collins-Racie LA, Follettie

101. MT, Williamson MJ, McCoy JM. Histidine patch thioredoxins. Mutant forms of thioredoxin with metal chelating affinity that provide for convenient purifications of thioredoxin fusion proteins. J Biol Chem 1996, 271(9), 5059-65

102. Cheng X, Zhang X, Pflugrath JW, Studier FW. The structure of bacteriophage T7 lysozyme, azinc amidase and an inhibitor of T7 RNA polymerase. Proc Natl Acad Sei U S A 1994, 91(9), 4034-8

103. Robertas JD. Toxin structure. Cancer Treat Res 1988;37:11-24

104. Endo Y, Tsurugi K, Lambert JM. The site of action of six different ribosome-inactivatingproteins from plants on eukaryotic ribosomes: the RNA N-glycosidase activity of the proteins. Biochem Biophys Res Commun 1988, 150(3): 1032-6

105. Lord JM, Roberts LM, Robertas JD. Ricin: structure, mode of action, and some currentapplications. FASEB J 1994, 8(2), 201-8

106. Тоневицкий А.Г., Агапов И.И., Фисенко А.П. Структура и механизм действиярибосоминактивирующих белков (РИБ). Применение РИБ и их конъюгатов для элиминации вирусинфицированных клеток. Биотехнология, 1995, 11,5-10

107. Preijers FW. Rationale for the clinical use of immunotoxins: monoclonal antibodiesconjugated to ribosome-inactivating proteins. Leuk Lymphoma 1993, 9(4-5), 293-304

108. Schlenstedt G. Protein import into the nucleus. FEBS Lett 1996, 389(1), 75-9

109. Collas P, Alestrom P. Nuclear localization signals: a driving force for nuclear transport ofplasmid DNA in zebrafish. Biochem Cell Biol 1997, 75(5), 633-40

110. Goldfarb DS, Gariepy J, Schoolnik G, Kornberg RD. Synthetic peptides as nuclearlocalization signals.Nature 1986 Aug 14-20;322(6080):641-4

111. Dworetzky SI, Lanford RE, Feldherr CM. The effects of variations in the number and sequence of targeting signals on nuclear uptake. J Cell Biol 1988, 107(4), 1279-87

112. Adam EJ, Adam SA. Identification of cytosolic factors required for nuclear location sequence-mediated binding to the nuclear envelope. J Cell Biol 1994,125(3), 547-55

113. Feigner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M, Northrop JP, Ringold GM,

114. Danielsen M. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A 1987, 84(21), 7413-7

115. Лебедев И.В., Стайн C.A. Подавление экспрессии генов bcl-2 и bcl-xL с помощью антисмысловых олигонуклеотидов: новый подход к терапии рака. Мол. Биол. 2000, 34(6), 1025-38

116. Стеценко Д.А., Арзуманов А.А., Коршун В.А., Гейт М.Дж. Пептид-олигонуклеотидные конъюгаты как антисмысловые агенты нового поколения. Мол Биол 2000, 34(6), 998-1006

117. Lebedeva IV, Stein СА. Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides as Inhibitors of Gene

118. Expression: Antisense and Non-Antisense Effects. Applications of antisense therapies torestenosis \ Ed. Rabbani LE, Boston, Dordrecht, London: Kluwer Acad. Publ. 1999, 99-119101

119. Ohnuma T, Li FL, Holland JF. Inhibitory effects of telomere-mimic phosphorothioate oligonucleotides on various human tumor cells in vitro. Anticancer Res 1997, 17, 2455-8

120. Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям академику РАН, д.б.н. М.П. Кирпичникову и к.б.н. А.А. Шульге за постоянное внимание, чуткое руководство и помощь при выполнении данной работы.

121. Автор глубоко признателен всем сотрудникам Лаборатории спектрального анализа ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и Центра "Биоинженерия" РАН за доброжелательность и поддержку.