Разработка технологии производства вакцины против сальмонеллеза голубей

Гусев, Валерий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии производства вакцины против сальмонеллеза голубей
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии производства вакцины против сальмонеллеза голубей"

ГУСЕВ ВАЛЕРИЙ ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ГОЛУБЕЙ

03.00.23-биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2005 г.

ГУСЕВ ВАЛЕРИЙ ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ГОЛУБЕЙ

03.00.23-биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2005 г.

! .и.

| »»» *••

Работа выполнена в Государственном научном центре прикладной микробиологии Министерства здравоохранения РФ

Научные руководители: доктор медицинских наук доктор ветеринарных наук

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущее учреждение - Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябика

Защита диссертации состоится 23 сентября 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069 01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу: 14И42, Московская обл., Щелковский район, пос.Биокомбинат, п/о Кашинцево, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан 22 августа 2005 года.

Ерусланов Борис Васильевич Апалькин Виктор Александрович

Белоусов Василий Иванович

Степанов Алексей Вячеславович

(

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Ю.Д.Фролов

«•ОС. МАКМОМАЛЬМАЯ

еммютск*

С!

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы

Разведение домашних голубей имеет многовековую историю. Известно, что в Египте уже 5000 лет назад были домашние голуби. Сначала этих птиц просто употребляли в пищу, а затем, узнав об их способности возвращаться к своему гнезду и о большой скорости полета, начали использовать для связи- передачи и получения информации.

Сейчас сохранилось как мясное направление, так и спортивное (почтовые голуби).

И сегодня проблема желудочно-кишечных заболеваний молодняка и взрослых особей голубей является для голубевода первоочередной. Экономический ущерб складывается из падежа части заболевшего молодняка, отставания в росте и развитии переболевшей птицы.

Но помимо потерь от сальмонеллеза среди домашних голубей, нельзя забывать об угрозе здоровью человека. По данным ВОЗ, заболеваемость людей сальмонеллезом за последнее десятилетие возросла шестикратно, а в странах СНГ - в семь раз. Причину заболеваний связывают с поражением продуктов питания животного происхождения патогенными микроорганизмами.

Птица как домашняя, так и дикая, в том числе голуби могут являться резервуаром возбудителя сальмонеллезной инфекции. Голуби свободноживущие и имеющие контакт с животными, открытыми водоемами, при заболевании сальмонеллезом, инфицируют окружающую среду, заражая другие виды птицы. Такие животные, естественно, представляют источник опасности для людей, в том числе и при использовании голубиного мяса в пищу.

Гибель от сальмонеллезной инфекции у голубей может достигать 2025%, нанося значительный экономический ущерб, одновременно являясь

источником заражения животных и человека (Вал.В. Гусев, В.В. Гусев 2003г.).

В связи с этим во всем мире уделяется большое внимание разработке различных лечебных препаратов и сальмонеллезных вакцин.

Сложность борьбы с сальмонеллезом определяется быстрой адаптацией возбудителя, как к антибиотикам, так и другим химиотерапевтическим препаратам.

Бесконтрольное применение антибиотиков усугубило ситуацию и способствовало селекции антибиотико-устойчивых штаммов микроорганизмов. В ряде голубеводческих хозяйств обнаруживается 100% -ная устойчивость бактерий ко всем применяемым антибиотикам.

Поэтому исследования, посвященные изучению проблемы сальмонеллезной инфекции у голубей, и в первую очередь, ее профилактике, несомненно, актуальны для бактериологов, ветеринарных врачей и голубеводов.

1. 2 Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось проведение мониторинга сальмонеллезной инфекции в голубеводческих хозяйствах РФ и разработка средств профилактики этого заболевания.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: -провести мониторинг сальмонеллезной инфекции у голубей в РФ; разработать технологию получения, методы контроля и применения «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей»;

-испытать вакцину в лабораторных и естественных условиях содержания голубей.

1. 3 Научная новизна работы Получены новые данные по результатам мониторинга возбудителя ЗДурЫтипит и его роль в эпизоотической ситуации в неблагополучных голубеводческих хозяйствах.

Обоснована необходимость создания эффективной вакцины на основе штамма БЛурЫтшгшт № 3.

Показана возможность использования питательной среды на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ) вместо мясных переваров без потери урожайности при культивировании сальмонелл.

Созданы 3 экспериментальные серии «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей».

1. 4 Практическая значимость работы Разработаны технологии изготовления, контроля и применения «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей».

Предложена питательная среда для культивирования вакцинного штамма ЗЛурЫтипшп № 3 на основе панкреатического гидролизата рыбной муки. Данная питательная среда позволяет снизить себестоимость вакцинных препаратов, по сравнению с теми, которые получены на средах из мясных переваров.

Получены положительные результаты испытания вакцинных препаратов, как на птице в лабораторных условиях, так и на голубях в естественных условиях содержания.

1.5 Публикация результатов исследований По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

1. 6 Апробация работы Материалы диссертации доложены:

-на международной конференции: «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», 5-6 декабря 2002 г Щелково;

-на межлабораторном научном семинаре ГНЦПМ - май 2005 г.-Оболенск.

1. 7 Основные положения диссертации выносимые на защиту Новые эпизоотологические данные возбудителя ЯЛурЫтипит у голубей на территории Российской Федерации, на примере 57 голубеводческих хозяйств в 8 регионах России.

Питательная среда для культивирования сальмонелл на основе ПГРМ.

«Вакцина живая сухая против сальмонеллеза голубей», характеризующаяся низкой остаточной реактогенностью и формированием стойкого специфического иммунитета.

1.9 Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложений. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 7 рисунками. Список литературы включает в себя 113 источников, в том числе 83 отечественных и 30 зарубежных.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Исследования по данной диссертации проведены в рамках тематики НИОКР по линии Министерства науки, промышленности и технологии РФ в период с 2002 по 2005 гт. в ФГУГТ ГНЦ прикладной микробиологии (ФГУП ГНЦ ГШ), в ООО « Научно-производственной фирме «Диавак» в голубеводческих хозяйствах Московской, Курской, Орловской, Воронежской, Калужской, Липецкой, Тульской областей и республики Татарстан.

Вскрытие павших и вынужденно убитых голубей, патологоанатомическое обследование и отбор патологического материала проводили по общепринятым методикам.

При бактериологическом исследовании патологического материала с целью выделения возбудителей бактериальных инфекций, определения их культурально-морфологических, биохимических свойств и серотипирования руководствовались: «Методическими указаниями по бактериологической диагностике сальмонеллезов животных от 30 декабря 1971 года,

рекомендованными Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР».

Биохимические свойства полевых штаммов сальмонелл исследовали с помощью набора ЭНТЕРОтест 24 (Lachema, Чехия).

Для определения подвижности сальмонелл использовали полужидкий агар (0,2% агар-агара).

При проведении диагностики сальмонеллеза в РА на стекле использовали сальмонеллезные сыворотки производства РАО «Биопрепарат» г. Санкт-Петербург и Краснодарской биофабрики.

Для определения чувствительности полевых штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам взят метод разведений данных препаратов в плотной питательной среде (В.Ф. Ковалев и др. 1988).

Концентрацию в ПГРМ водородных ионов определяли потенциометрически на pH - метре «МР 220» (Швейцария); аминного азота -формольным титрованием по методу Зеренсен - Гаврилова; триптофана по A.M. Пешкову.

Технология изготовления «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей» разработана совместно со специалистами ООО «НПФ «Диавак».

Для производства экспериментальных серий вакцины использовали аттенуированный вакцинный штамм Salmonella typhimurium № 3 (ФГУ ВГНКИ).

Культивирование вакцинного штамма в жидких питательных средах осуществляли в пробирках, колбах Эрленмейера вместимостью 750 см3.

Аэрирование проводилось через ватно-марлиевую пробку при перемешивании на шуттель-аппарате VC67-88, TYPLT-2 (Чехия) с частотой 150 - 250 кол/мин.

Для глубинного периодического культивирования использовали биореакторы АК-210 (объемом 10 дм3) и В-2 (объемом 50 дм3). Вносимая посевная доза составляла 5-10% от объема питательной среды.

Общее количество бактерий определяли при помощи оптического стандарта мутности ГИСК им. Тарасевича на 1 10® микробных клеток, а также путем определения оптической плотности. Измерение оптической плотности осуществляли на фотоколориметре «КФК-3» (Россия) в кювете с длинной оптического пути 0,5 см, длине волны 540 нм, с вычетом оптической плотности соответствующей питательной среды.

Количество жизнеспособных бактерий определяли по методу конечных разведений и подсчета колониеобразующих единиц в соответствии с рекомендациями Мейнел Д., Мейнел Э. (1967).

Для изучения морфологии и тинкториальных свойств бактериальных клеток применяли метод окраски по Граму, микроскопию окрашенных препаратов проводили на микроскопе «Биолам-15» (Россия), при увеличении х 1200.

Безвредность вакцин определяли на:

-белых мышах массой тела 16-18 г;

-цыплятах 5-10-сут. возраста;

- голубях различных половозрастных групп.

При определении иммуногенной активности препаратов использовали цыплят 5-10-сут. возраста.

Вакцинацию осуществляли методом перорального введения.

Иммунизированных лабораторных животных инфицировали контрольным штаммом (после предварительной подтитровки ЛД50 на соответствующем виде животных Salmonella typhimurium № 371 (ФГУ ВГНКИ).

Заражение цыплят и голубей проводили подкожно.

2.2. Результаты исследований 2.2.1. Мониторинг сальмонеллезной инфекции голубей В период с 2002 по 2005г. выполнена работа по мониторингу сапьмонеллеза голубей на территории РФ. Проведено обследование 57

голубеводческих хозяйств в 8 регионах России: Московской области-10, Курской-2, Орловской-б, Воронежской-3, Калужской-11, Липецкой-6, Тульской-4, республики Татарстан-15.

Бактериологическому исследованию подвергнуто 7800 образцов проб патологического материала от павших и вынуждено убитых 1950 голов голубей.

Статистические данные о выделении возбудителей бактериальных инфекций голубей представлены в таблице № 1.

Таблица № 1

Результаты исследований патологического материла от павшей и вынуждено убитой птицы

Возбудители Статистика по годам (%)

2002 2003 2004 2005

Эшерихии 50,1 48,0 48,4 49,5

Сальмонеллы 24,9 25,4 25,3 24,8

в т.ч. typhimurium 22,0 23,5 24,1 23,7

gartneri 2,8 1,6 0,8 0,9

редких групп 0,1 0,3 0,4 0,2

Стафилококки 4,7 4,6 4,8 5,2

Стрептококки 12,7 13,9 13,6 13,2

Пастереллы 2,8 2,7 3,0 2,8

Гемофилы 0,1 0,2 0,4 0,6

Псевдомонады 2,8 3,0 2,4 2,2

Энтеробактерии (Citrobacter, Klebsiella, Morganella, Serratia) 1,9 2,2 2,1 1,7

Данные, представленные в таблице № 3.2.1.1, свидетельствуют, что сальмонеллы выделены из 25,1% исследованного от голубей патологического материала.

Среди выделяемых микроорганизмов возбудителем сальмонеллеза голубей в 93%-тах являлась Salmonella typhimurium, 6% - Salmonella gartneri ив 1 % - сальмонеллы редких групп.

Результаты проведенных исследований показали, что 44,8% голубеводческих хозяйств являются эпизоотическими очагами сальмонеллезной инфекции.

2.2.2. Клиническое проявление сальмонеллеза голубей

В период изучения сальмонеллезной инфекции у голубей наблюдали несколько форм течения заболевания. В 70% случаев (1775 голов) заболевание протекает скрыто, птица является носителем инфекции (при бактериологическом исследовании фекалий наблюдали наличие возбудителя). Выраженная форма имеет кишечную, нервную, суставную формы, а также острое и хроническое течение. В 20% случаев (117 голубей) наблюдалась' кишечная форма: непрекращающийся понос зеленого цвета с содержанием слизи и крови, у 7% (41 голубь) - нервная форма: запрокидывание головы на спину, 3% (17 голубей) - суставная: воспаление сустава.

2.2.3. Бактериологические исследования на сальмонеллез

Для бактериологических исследований материал отбирали от павших и вынуждено убитых голубей не позднее 12 час. после их гибели, обязательно не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами и с характерными для сальмонеллеза клиническими признаками (симптомы септицемии и токсемии, поражение желудочно-кишечного тракта).

Для исследования с учетом правил асептики отбирали, предварительно профламбировав, кусочки паренхиматозных органов

(печень с желчным пузырем, селезенку, почку, легкие, сердце). Патологический материал укладывали в стерильные, пластиковые чашки Петри, маркировали и помещали в отдельные полиэтиленовые пакеты. Полученный патологический материал транспортировали в контейнере со льдом.

Высевы на питательные среды проводили не позднее 24 час. после взятия патологического материала.

Посевы из крови сердца, паренхиматозных органов (печени, селезенки, почки, легких, сердца), желчного пузыря проводили на БГРМ, и плотные питательные среды (АГРМ, агар Эндо).

Учет роста проводили через 18-24 час. инкубирования в аэробных условиях, при t-37°C. Из БГРМ делали высевы на агар Эндо. Изолированные типичные колонии с плотных питательных сред, по характерным тинкториальным свойствам для сальмонелл (на АГРМ небольшие, диаметром 2-4 мм, гладкие, блестящие, с голубоватым отливом, куполообразные колонии и ровными краями; на Эндо бледно-розовые, прозрачные), изучались по морфологии в мазке, окрашенном по Граму.

Подвижность сальмонелл определяли при посеве культуры уколом в полужидкий агар (0,2% агар-агар).

Идентификацию выделенных культур по биохимическим свойствам проводили с помощью набора ЭНТЕРОтест 24 (Lachema, Чехия). Учет результатов осуществляли через 24 час.

Одновременно проводили реакцию агглютинации на стекле с сальмо-неллезными сыворотками.

При положительных результатах исследования по морфологическим, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам, выделенные культуры были окончательно отнесены к роду Salmonella, с указанием конкретного серотипа.

2.2.4. Определение чувствительности полевых штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам

При определении чувствительности к антибактериальным препаратам использовали 30 культур Б. 1уЬр1шипит и 14 культур Б. gar1тleri выделенных из патологического материала.

В результате проведенных исследований установили, что преобладающее количество (более 50 %) культур сальмонелл к ряду препаратов имеют очень высокую резистентность (тетрациклин, окситетрациклин, доксициклин, стрептомицин, бензилпенициллин, бициллин, фуразолидон, фуругин). И лишь к некоторым антибактериальным препаратам, таким как гентамицин, неомицин, канамицин, левомицетин, полимиксин М, ампициллин, энрофлоксацин, норфлоксацин, байтрил, сульфадимезин отмечается чувствительность выделенных изолятов сальмонелл.

Таким образом, лечение и профилактика сальмонеллеза могут быть успешными при условии определения лекарственной устойчивости выделенных эпизоотических штаммов сальмонелл.

Поскольку главной целью изучения эпизоотической ситуации в голубеводческих хозяйствах было совершенствование специфической профилактики сальмонеллеза, следующей стадией нашей работы являлась разработка технологий производства и испытания вакцины.

2.2.5. Технология изготовления и контроль вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей

2.2.5.1. Питательные среды для культивирования вакцинного штамма

Для получения стабильных высоких результатов в накоплении бактериальной массы и одновременном снижении материальных затрат при культивировании вакцинного штамма S. tyhpimurium № 3 в лабораторных и промышленных условиях нами испытана питательная среда (БГРМ) на основе панкреатическогб гидролизата рыбной муки.

БГРМ готовили из рыбо-костной муки путем гидролиза фаршем поджелудочной железы. Процесс гидролиза контролировали по аминному азоту и триптофану.

Апробацию питательной среды проводили путем сравнительного культивирования вакцинного штамма на двух жидких питательных средах с содержанием аминного азота - 250 мг/%, КН2Р04 - 1,0 г/л, Na2HP04 - 5 г/л. Основами питательных сред являлись:

-панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ) с содержанием ам. N > 600 мг%, рН 7,7 + 0,2;

-панкреатический гидролизат мяса по Хоттингеру (ПГМХ) с содержанием ам. N > 600 мг%, рН 7,7 + 0,2;

Культивирование вакцинного штамма осуществляли в колбах Эрленмейера, вместимостью 750 см3, содержащих 100 см3 питательной среды, на шуттель-аппарате VC67-88, TYPLT-2 (Чехия) с частотой 150 - 250 колебаний/мин, в течение 14 часов при t - 37°С.

На рисунке №1 приведены средние данные максимального накопления бактериальной массы и оптическая плотность бактериальной массы.

Оптическая плотность бактериальной массы и концентрация живых клеток при использовании разных питательных сред

□ Бульон Хоттингера ■ БГРМ

В результате установлено:

-выход бактериальной массы (количество живых клеток) одного и того же. штамма практически равен как при культивировании на бульоне Хотингера, так и на БГРМ;

-бактериальные клетки обладают характерными для сальмонелл тинкториальными и серологическими свойствами.

2.2.5.2. Подготовка посевного материала

Для получения посевного материала использовали ампулы с сухой культурой 8а1шопеНа tyhpimuлum № 3.

Динамику роста клеток оценивали при контроле концентрации живых микробных клеток (ж.м.к.) и измерении оптической плотности среды. По полученным данным выстраивали кривую роста бактериальных клеток (рисунок № 2).

»t

t ¿1

Зависимость концентрация живых клеток от времени культивирования

2,25 2

1,75 1.5 1.25 1

0,73 0,5 0.25 0

' л »e»j ; ИЯ (6 ■гт; M'ft fri ¥7

V» p N

ЛвЧ * HfL "¡Vi Щ ü P'i

s> jrf 4 w " ' i Ъ-А

№ f4f ffr i i л 1

ИЫ ш -V' fHr

Ч& 1*1

kk •. л fira wirf Ш

L-l 1« a'tf* UiJ

—о— концеитрвция живых клеток S. typhlmurium №3

Из данных, представленных на рисунке №2. следует, что время приготовления посевного материала Salmonella tyhpimurium № 3 находится в пределах 8-10 часов культивирования. Культура, находящаяся в экспоненциальной фазе роста, наиболее пригодна для использования в качестве посевного материала (М.Я. Ярцев 2000; Н.И. Галиакберова и др. 2001, 2002).

2.2.5.3. Глубинное периодическое культивирование вакцинного штамма S

typhimurium № 3.

В подготовленные биореакгоры АК-210 (объемом 10 дм3) и В-2 (объемом 50 дм3), в асептических условиях вносили посевной материал, в объеме 5-10 % от общего объема, 40% раствор глюкозы до 0,1%-ной концентрации к объему среды и MgS04 х 7 Н20 (0,5 г/л).

При глубинном периодическом культивировании (аэрация 0,5 - 1 дм3 воздуха на 1 дм3 культуры в минуту и перемешивание 350 оборотов в

минуту.) концентрация микробных клеток к 10 часам выращивания находилась в пределах 28,51-28,59 млрд.м.к./см3.

Культивирование прекращали в начале стационарной фазы роста, когда концентрация микробных клеток перестает заметно увеличиваться.

На рисунке № 3 представлена динамика накопления бактериальных клеток вакцинного штамма Salmonella typhimurium № 3 в зависимости от времени культивирования (по результатам 3-х ферментаций).

В районе 8-10 ч. культивирования увеличение концентрации живых микробных клеток замедляется и затем их количество начинает медленно уменьшаться.

Динамика роста вакцинного штамма Salmonella typhimurium № 3 характеризуется замедлением роста клеток, так как к этому периоду времени клетками использованы легкоусваемые питательные вещества и происходит перестройка ферментативной системы бактерий для потребления оставшейся части питательных веществ.

Использование питательной среды БГРМ вместо мясных питательных сред при культивировании сальмонелл показало возможность ее применения без потери урожайности.

Изготовление и контроль экспериментальных серий вакцины проводили согласно разработанным регламентам по изготовлению и контролю. |

Всего было изготовлено 3 экспериментальных серии «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей».

Каждая серия прошла лабораторные испытания с учетом современных требований, в том числе на безвредность и иммуногенность.

Накопление S. typhhnurium №3 при глубинном периодическом культивировании

« MM 1 ЛЛ t

i Hill nu M »r t v « X

ll»S7 hrm t 4

I шш | - z

[ л f Jh £

гМ f ! ■

Lv, .« |iö| А Г * J JU & 1

• 12>43ar**U11U1}14

Время

—О—S. typhlmurium МаЗ

2.2.S.4 Оценка безвредности и иммуногенности вакцины Для проведения экспериментов использовали вакцину живую сухую против сальмонеллеза голубей (из аттенуированного штамма Salmonella typhimurium №3), ТУ экспериментальные, серия № I, контроль № I, изготовленную ООО «НПФ «Диавак».

Испытание безвредности «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей» проводили на цыплятах 5-10-сугочного возраста, а иммуногенности - на голубях 45-60 дневного возраста. Полученные результаты представлены в таблице № 2.

Таблица № 2.

Результаты лабораторных испытаний «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей» на безвредность и иммуногенность

Кол-во голубей Безвредность Иммуногенная активность

Контрольное инфицирование Б. 1урЫтигшт № 371

Пали, гол. Сохранность, % Пали, гол. Сохранность, %

10 гол. 0/10 100

Вакцинированные 10 гол. - 0/10 100%

Контрольные 10 гол. 8/10 20%

Безвредность 100%

Иммуногенность 100%

Из данных таблицы № 2 видно, что результаты испытаний вакцины были положительными и ' свидетельствуют о безвредности этого биопрепарата и высокой иммуногекной активности. Полученные результаты позволили испытать вакцину в условиях голубеводческого хозяйства, неблагополучного по сальмонеллезу.

2.2.6. Производственные испытания вакцины в голубеводческих хозяйствах.

Для проведения экспериментов использовали изготовленную в ООО «НПФ «Диавак» «Вакцину живую сухую против сальмонеллеза голубей» (из аттенуированного штамма Salmonella typhimurium № 3), ТУ экспериментальные, серия № 1, контроль № 1.

Испытание проводили в частном голубеводческом хозяйстве в Ливенском районе, Орловской области под контролем госветслужбы района.

В работе задействовали 40 голубей в возрасте 45-60 дн., из них 20 голов являлись опытной группой и 20 - контрольной.

При иммунизации опытной группы вакцинирующую дозу (2 млрд. ж.м.к.) и схему вакцинации использовали согласно разработанному временному наставлению по применению «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей».

Результаты испытания «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей», представлены в таблице № 3.

Таблица № 3

Результаты испытаний «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза

голубей»

Группа Количество подопытных голубей (гол) Пало от сальмонеллеза Сохранность

гол. % %

опытная 20 0 0 100

контрольная 20 6 30 70

На основании результатов исследования можно сделать вывод, что вакцина живая сухая против сальмонеллеза голубей из аттенуированного штамма Salmonella typhimurium № 3 обладает способностью формирования стойкого специфического иммунитета.

3. ВЫВОДЫ

1. Мониторинг возбудителей сальмонеллеза у голубей выявил, что в настоящее время 30-40% птицы инфицировано, от5 до 80 % может составлять гибель заболевшей птицы. Лечение и профилактика могут быть результативными при условии определения лекарственной чувствительности к сальмонеллезу.

2. Использование БГРМ вместо мясных питательных сред при культивировании вакцинных штаммов сальмонелл не приводит к потере урожайности, бактериальные клетки сохраняют характерные для сальмонелл тинкториальные и серологические свойства, себестоимость вакцинных препаратов снижается по сравнению с теми, которые получены из мясных гидролизатов.

3. Разработана научно-техническая документация по изготовлению и контролю «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей».

4. Полученные экспериментальные серии вакцины прошли лабораторные, а также испытания в условиях голубеводческих хозяйствах. Получены положительные результаты:

-при вакцинации опытной группы голубей (20 голов) вакциной против сальмонеллеза сохранность составила 100%

-в контрольной группе из 20 голов от сальмонеллеза пало 6 голов, сохранность-70%.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В настоящее время ведется утверждение технических условий и наставления по применению «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей» в Департаменте ветеринарии РФ.

Для профилактики сальмонеллезной инфекции у голубей предлагается использование разработанной нами «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей».

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Вал.В. Гусев, В.В. Гусев. Сальмонеллезная инфекция у голубей // Практик, № 5-6, 2003, с. 102-107.

2. Вал. Гусев. Любовь и голуби. Качество жизни // Профилактика, 2002, №5, с. 118-121.

3. Вал.В.Гусев. Сальмонеллезная инфекция у голубей //Сб. докл. межд. конф. «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», Щелково, 2002, с. 106-107.

4.Вал. В. Гусев, М.Г. Теймуразов, С.М. Приходько, С.И. Павлов. Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций в промышленном птицеводстве // Ветеринарный консультант № 19 2002, с. 17-19

5. Вал. Гусев, Э.А. Светоч, Н.К. Глазков, М.Г. Теймуразов, С.М. Приходько, С.И. Павлов. Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций // Птицеводство, № 2, 2003, с. 8-10

Отпечатано в ООО «Мещера» Московская обл., г Щелково, ул. Свирская, 8а. тир. 100 экз. зак. № 429

I )

I 1

114850

РНБ Русский фонд

S 2006-4

10428

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гусев, Валерий Викторович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Род Salmonella - общие сведения

2.1.1. Мониторинг бактерий рода S almonella

2.1.2. Биологические свойства

2.1.3. Антигенная структура

2.2. Сальмонеллезная инфекция голубей

2.3. Средства специфической профилактики 24 сальмонеллеза голубей

2.4. Биотехнология и производство вакцин

2.4.1. Питательные среды

2.4.2. Приготовление посевного материала

2.4.3. Глубинное культивирование микроорганизмов

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методьг

3.2. Результаты исследований

3.2.1. Мониторинг сальмонеллезной инфекции голубей

3.2.2. Клиническое проявление сальмонеллеза голубей

3.2.3. Бактериологические исследования на сальмонеллез

3.2.4. Определение чувствительности полевых штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам

3.2.5. Технология изготовления и контроль вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей

3.2.5.1 Питательные среды для культивирования вакцинного 49 штамма

3.2.5.2 Подготовка посевного материала

3.2.5.3 Глубинное периодическое культивирование вакцинного штамма

S typhimurium №

3.2.5.4 Оценка безвредности и иммуногенности вакцины

3.2.6. Производственные испытания вакцины в голубеводческих 57 хозяйствах

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии производства вакцины против сальмонеллеза голубей"

Актуальность темы

Разведение домашних голубей имеет многовековую историю. Известно, что в Египте уже 5000 лет назад были домашние голуби. Сначала этих птиц просто употребляли в пгацу, а затем, узнав об их способности возвращаться к своему гнезду и о большой скорости полета, начали использовать для связи-передачи и получения информации.

Сейчас сохранилось как мясное направление, так и спортивное (почтовые голуби).

Гибель от сальмонеллезной инфекции у голубей может достигать 2025%, нанося значительный экономический ущерб, одновременно являясь возможным источником заражения животных и человека (Вал.В.Гусев, В.В.Гусев 2003г.).

Бесконтрольное применение антибиотиков усугубило ситуацию и способствовало селекции антибиотико устойчивых штаммов микроорганизмов. В ряде голубеводческих хозяйств обнаруживается 100% -ная устойчивость бактерий ко всем применяемым антибиотикам.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось проведение мониторинга сальмонеллезной инфекции в голубеводческих хозяйствах РФ и совершенствование профилактики этого заболевания с помощью специфических средств.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: -провести мониторинг сальмонеллезной инфекции у голубей в РФ; -разработать технологию производства, методы контроля и применения «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей»;

-испытать вакцину в лабораторных и естественных условиях содержания голубей.

Научная новизна работы

Получены новые данные по результатам мониторинга возбудителя S.typhimurium и его роль в эпизоотической ситуации в неблагополучных голубеводческих хозяйствах.

Обоснована необходимость создания эффективной вакцины на основе штамма S.typhimurium № 3.

Созданы 3 экспериментальные партии «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей».

Практическая значимость работы

Разработаны технологии изготовления, контроля и применения «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей».

Предложена питательная среда для культивирования вакцинного штамма S.typhimurium № 3 на основе панкреатического гидролизата рыбной муки. Данная питательная среда позволяет снизить себестоимость вакцинных препаратов, по сравнению с теми, которые получены на средах из мясных переваров.

Публикация результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены:

-на международной конференции: «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», 5-6 декабря 2002 г Щелково.

-на межлабораторном научном семинаре ГНЦПМ- май 2005г.-Оболенск.

Основные положения диссертации выносимые на защиту

Новые эпизоотологические данные возбудителя S.typhimurium у голубей на территории Российской Федерации, на примере 57 голубеводческих хозяйств в 8 регионах России.

Питательная среда для культивирования сальмонелл на основе ПГРМ. «Вакцина живая сухая против сальмонеллеза голубей»,характеризующаяся низкой остаточной реактогенностью и формированием стойкого специфического иммунитета.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложений. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 7 рисунками. Список литературы включает в себя ИЗ источников, в том числе 83 отечественных и 30 зарубежных.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гусев, Валерий Викторович

5. ВЫВОДЫ

-при вакцинации опытной группы голубей (20 голов) вакциной против сальмонеллеза сохранность составила 100%

-в контрольной группе из 20 голов от сальмонеллеза пало 6 голов, сохранность-70%.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гусев, Валерий Викторович, Оболенск

1. Алимов A.M., Котылев О.А. Сравнительная оценка питательных сред при культивировании вакцинного штамма листерий АУФ. Ученые записки КВИ. Казань: 1975. - Т. 119. -158 с.

2. Андросов Ф.З., Беляев И.Я., Клочко Р.Т., Ковалерчук Л.И. и др.; Под ред. В.Я. Антонова Справочник ветеринарного лаборанта. М.: Колос, 1981. -40-41,89-91 с.

3. Антонов Б.И., Борисова В.В., Волкова П.М., Каменева Л.П. и др.; Под ред. Б.й. Антонова Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные исследования. -М.: Агропромиздат, 1986. 177 - 209 с.

4. Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Гос. изд-во мед. лит., 1962. - 127173 с.

5. Баев Н.А. Биотехнология. М.: Наука, 1984.

6. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М.: Медицина, 1992.

7. Баснакьян И.Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях. М.: Наука, 1982.

8. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. В 2 т. М.: Мир, 1989.

9. Бессарабов Б.Ф. Болезни голубей.- Москва, 2004.

10. Ю.Бияшев К.Б. Автореф. дис. докт. вет. наук. Алма-Ата, 1992.

11. П.Бондаренко В.М. Болезни сельскохозяйственных животных. М.:1986.

12. Борисович Ю.Ф., Кирилов JI.B.; Под ред. Д.Ф. Осидзе Инфекционные болезни животных. М.: ВО Агропромиздат, 1987. - 195 - 203 с.

13. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. М.: Медицина, 1980.

14. Бургасов П.Н. Итоги выполнения рекомендаций XVI всесоюзного съезда микробиологов и эпидемиологов и очередные задачи в области борьбы с инфекционными заболеваниями в СССР. Журн. Микробиол. 1984. - № 7. -4- 16 с.

15. Бухвальдер Р., Фухс Х.-В., Хайдер Г., Хипе Т. и др. Иммунопрофилактика болезней животных. Пер. с нем. М.: Колос, 1981.-415 с.

16. Вайсман И.Ш. Предпосылки комплексной оценки физиологического состояния бактерий и их популяций. Журн Микробиол. 1984. - № 4. - 3 - 8 с.

17. Валеева Ф.К. Автореф. дис. канд. вет. наук. Алма-Ата, 1966.

18. Виестур У.Э., Шмите И. А., Жилевич А.В. Биотехнология. Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. Рига: Зинатне, 1987. -263 с.

19. Галиакберова Н.И., Алимов A.M., Макаев Х.Н. Изыскание питательной среды и оптимизация условий культивирования сальмонелл.

20. Сборник докладов Международной конференции молодых ученых 5-6 июня 2001г. Щелково: 2001. - 103 - 106 с.

21. Галиакберова Н.И., Алимов A.M., Макаев Х.Н. Влияние дозы и фазы роста посевного материала на выход бактериальной массы сальмонелл. Сборник докладов Международной конференции молодых ученых 5-6 декабря 2002г. Щелково: 2002. - 91 - 93 с.

22. Герхард Ф. Методы общей бактериологии. Пер. с англ. М.: Мир, 1983. Т.З

23. Гинзбург Н.Н. Живые вакцины. М.: Медицина, 1969.

24. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 227 - 246 с.

25. Голубева И.В., Килессо В.А., Киселева Б.С., Прямухина Н.С. и др.; Под ред. В.И. Покровского Энтеробактерии. Руководство для врачей. М.: Медицина, 1985. - 121 - 164 с.

26. Гусев Вал.В., Гусев Вик.В./ Сальмонеллезная инфекция у голубей// Практик, 2003, №5-6, с. 102-107.

27. Вал.Гусев/ Любовь и голуби// Качество жизни. Профилактика, 2002, №5, с.118-121.

28. Вал.В.Гусев/ Сальмонеллезная инфекция у голубей// Сб.докл.Межд. Конф. «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», Щелково, 2002, с. 106-107.

29. Гусев Вал.В., Теймуразов М.Г., Приходько С.М., Павлов С.И. Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций в промышленном птицеводстве. Журн. Вет. консультант. 2002. - № 19. с. 17 -19 .

30. Гусев Вал., Светоч Э., Глазков Н., Теймуразов М. и др. Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций. Журн. Птицеводство. 2003. - № 2.с. 8-10.

31. Дзагуров С.Г., Быченко Б.Д. Термины и определения, относящиеся к стандартным образцам биологических препаратов, используемых в медицине. Сборник трудов ГИСК им. Тарасевича и Московской НИИВиС. М.: 1972. - 1 -6 с.

32. Емельяненко П. А. Учение об инфекции и иммунитете // Ветеринарная микробиология. М.: Колос, 1982. - 82 - 137 с.

33. Жданова Л.Г Значение исследований по физиологии патогенных микроорганизмов в вакцинном производстве. Труды Московского НИИВиС. -М.: 1979.- 18-28 с.

34. Ковалев В.Ф., Волков И.Б., Виолин Б.В., Ортман Р.А. и др. Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии: Справочник. -М.: ВО Агропромиздат, 1988. 222 с.

35. Ковалев Н.А., Музычин С.И., Бутьянов Д.Д., Антюков М.А. и др.; Под ред. Н.А. Ковалева Профилактика инфекционных болезней животных. -Минск: Ураджай, 1988. 65 - 68 с.

36. Коляков Я.Е. Ветеринарная иммунология. М.: Агропромиздат, 1986.

37. Котова А.Л., Белозеров Е.С. Сальмонеллезы. Алма-ата: Гылым,1992.

38. Ли В. Физал и сальмонелла исчезнет. Журн. Птицеводство. - 2003. -№2. - 21 - 22 с.

39. Лярски 3. Диагностика вирусных болезней животных. Пер. с пол. -М.: Колос, 1980. 217 - 233 с.

40. Матвиенко Б. А. Иммуногенность аттенуированных штаммов сальмонелл. Журн. Ветеринария. 1970. - № 8. - 44 - 45 с.

41. Матвиенко Б.А. Ветеринарная микробиология. М.: Колос, 1982.

42. Машины, установки, системы.: Каталог / Фирма Pharmatec. -Германия, 1996.

43. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: «Триада-Х», 1999. - 272 с.

44. Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982.

45. Паутов В.Н., Чичерин Ю.В., Евстигнеев В.И. Протективные свойства фракции чумного микроба в эксперименте. Журн. микробиол. -1979.-№10.-37-42 с.

46. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Пер. с англ. М.: Мир, 1978.

47. Позмогова И.Н. Воздействие температур выше оптимальных на • бактерии и дрожжи. Изд-во АН СССР, сер. биол. - 1978. - №2.

48. Позмогова И.Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях. М.: Наука, 1983.

49. Покровский В.И. Энтеробактерии. М.: Медицина, 1985.

50. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. - 363 - 378 с.

51. Работнова И.А. Роль физико-химических условий (рН и гНг) в жюнидеятельности микрорганизмов. М.: Наука, 1957.

52. Работнова И.А., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизма. М.: Наука, 1979.

53. Работнова И.А., Баснакьян И.Н., Боровкова В.М., Запорожцев JI.H. Процессы культивирования микроорганизмов. Изв. АН СССР. Сер. биол. -1982.-№4.-559-573 с.

54. Равилов А.З. с соавт. Микробиологические среды. Казань: ФЭН,1999.-398 с.

55. Раевский А.А. Разработка управляемого процесса культивирования Pasteurella multocida при производстве вакцин. Авореф. дис. канд. биол. наук. Щелково, 2002.

56. Раевский А.А. Перспективное техническое направление культивирования бактерий при производстве вакцин. Материалы Международной науч.-практ. конференции 24-25 апреля 2003г. Щелково: 2003.-61 -64 с.

57. Рахманин П.П., Самуйленко А.Я., Ломакина Т.А. Основные направления развития агробиологической промышленности России. // В кн. Курская биофабрика. К 100-летию биологической промышленности России. Курск: 1996.

58. Рахманов А.И., Бессарабов Б.Ф. Голуби и профилактика их заболеваний.-Москва, 1987.

59. Рахманов А.И. Голуби. Москва, 2002.

60. Рожнова С.Ш. Характеристика некоторых биологических свойств «госпитальных» штаммов S. typhimurium. В книге современные проблемы сальмонеллезов и вакцинопрофилактики кори./МЗ СССР, МЗ Арм. ССР, ЦНИИЭ и др. М.: Ереван, 1976. - 90 - 92с.

61. Романов В.А. Голуби. Москва, 1993.

62. Ряпис JI.A., Беляков В.Д. Проблемы номенклатуры и классификации сальмонелл и сальмонеллезов. Журн. микробиол. 1995. -№4.-115 - 118 с.

63. Сохин А.А. Парадокс инфекционного иммунитета. Журн. микробиол. 1988. -№ 1.-73-80 с.

64. Стерилизаторы фирмы «Гетинте».: Каталог / Фирма Getinge. -Германия, 1996.

65. Табаева А.А., Котова A.JI. Вопросы таксономии и номенклатуры бактерий рода SALMONELLA. Журн. Микробиология. 2001. - № 6. - 110 -113 с.

66. Тимаков В.Д., Левашев B.C., Борисов Л.Б. Микробиология. М.: Медициа, 1983. - 216 - 217 с.

67. Ураков Н.Н., Волков В.Я., Боровик Р.В. Функциональное состояние и механизмы повреждения микрорганизмов в процессе приготовления бактериальных препаратов. Журн. Биотехнолоигия. 1988. - Т. 4 - №4. - 420 -432 с.

68. Фробшпер М. Основы микробиологии. М.: Мир, 1963.

69. Хейфец А.Б. Теоретические и методические основы оценки эффективности специфической профилактики. М.: Медицина, 1968.

70. Хоулт Дж., Крит Н., Снит П., Стейли Дж. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2 т. М.: Мир, 1997. - Т. 1. - 192 - 193 с.

71. Цыбанова В.А. , Котляров В.М. Современные методы типирования патогенных сальмонелл. Сборник докладов Международной конференции молодых ученых 5-6 декабря 2002 г. Щелково: 2002. - 80 - 84 с.

72. Шефлер С., Минцер Л., Бенеш С. Опыты по получению аттенуированных штаммов и иммуногенных штаммов энтеробактерий. Журн. ЖМЭИ. 1957. - №8. - 8 - 14 с.

73. Шустер Б.Ю. Вакцины из аттенуированных штаммов сальмонелл: Дис. докт. вет. наук. М., 1988.

74. Шустер Б.Ю., Малахов Ю.А., Кириллова В.В., Лебедев О.А. и др. Специфическая профилактика сальмонеллеза сельскохозяйственных животных. Журн. Ветеринария. 1994. - №2. — 11 - 14 с.

75. Ярцев М.Я. Разработка технологии производства живых сухих вакцин против пастереллеза птиц, рожи и бруцеллеза животных (экспериментальные исследования и внедрение) Автореф. дис. докт. биол. наук. М., 1991.

76. Ярцев М.Я., Бушуева Н.Б., Раевский А.А., Анисимова Л.В. и др. Технология промышленного производства бактериальных вакцин. Журн. Ветеринария. 1998. - №3. - 22 - 24с.

77. Botes H.I. W. //Bull. Off. Int. Epiz. -1968

78. Ernst R.R. Sterilisation by heat. In «Desinfection, Sterilisation and Preservation». // Led and fabiger, Philadelphia, Pennsylvania, 1977. - pp. 481 -521.

79. Ham R.G. McKeehan W.L. Media and growth requirements. // In «Methods in Ensymology» Vol. 58, Academic Press, New York, 1979.

80. Hansen N.H., Riemann H. Factors affecting the heat resistane of nonsporing organisms. // L. Appl. Bacteriol, 26, - 1963. - pp. 314 - 333

81. Haurowits F. Immunochemistry and the biosynthesis of antibodies. New Jork, London,Interscience. - 1968. - pp. 301.

82. Hemert P. // Progress in indust. Microbiol., 1974, 13

83. Hinshelwood C.N. The chemical kinetics of the bacterial cell. I I Clarendon Press, Oxford, 1946.

84. Kluyver A.J., Perquin L.H.C., Biochemische Zeit., 266, 68 (1933)

85. Le Minor L., Veron M., Popoff M.Y. Proposition pour une nomenclature des Salmonella. Ibid. 1982, 133 B: pp. 245 - 254.

86. Le Minor L., Popoff M.Y., Laurent B. et al. Individualisation dune septieme sous-espece de Salmonella: S. choleraesuis subsp. indica subsp. nov. Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur). 1986, 137 B: pp. 211 - 217.

87. Litwin J. A survey of various media and growth factors used in evil cultivation//Dev. Biol. Stand. 42, - 1979. - pp. 37 - 45.

88. Minkevich I.B. M'ass-Energy Balance for Microbial Product Synthesis. Biochemical cell Culture Aspects. // Biotech. Bioeng, 25, - 1267, - 1983.

89. Monod J. Recherhes sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. 2nd edn., Hermann, Paris, 1942.

90. Monod J. La technigue de culture continue: theorie ef applications, Ann. Inst. Pasteur, Haris, 79, 1960. pp. 390 - 410.

91. Morgan J.F., Morton H.J., Parker R.C. Nutrition of animal cell in tissue culture. I.Intial Studies on a syntetic medium. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, -1950.-pp. 1-8.

92. Pasteur L. Annales de Chime et de Physique, 3 // Serie, 58, - 324,1869.

93. Raulim M. J. Annales des Scinces Naturellus, 5 Serie, 11, - 93,1869.

94. Reeves M.W., Evins G.M., Heiba A.A. Clonal nature of Salmonella typhi and its antigenic relatedness to other salmonellae as shown by multilocus enzyme electrophoresis and proposal of Salmonella bongori comb. nov. I. Clin. Microbiol. 1989, 27; 313 320.

95. Rohn O. Physicas methods of sterilisation of microorganisms. // Bacteriol. Rev., 9, - 1945. - pp. 1 - 47.

96. Schodel F. // Infection. 1992. 20. 1.

97. Ml.Solomons G.L. Materials and methods in fermentation, Academic Press, London and New York, - 1969. - pp. 335

98. Sykes Q. «Methods in Microbiology», Vol. 1., Academic Preess, New York, 1969.-pp. 77-121.

99. Waymouth С., Ham R.G., Chappie P.J., eds. The Growth Requirements of Vertebrate Cells in Vitro. Cambrige: Univ. Press. London and New York, -1981.

Информация о работе

Гусев, Валерий Викторович
кандидата биологических наук
Оболенск, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка технологии производства вакцины против сальмонеллеза голубей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы