Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии получения кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии получения кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки"

гз од

, г [1 »«-'р 1ГШЯ

На правах рукописи

МИХАЙЛОВА Вера Александровна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ КРОЛИЧЬЕЙ ХОЛЕРНОЙ АГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ О-СЫВОРОТКИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск, 1998

Работа выполнена в Иркутском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока

Научные руководители:

Кандидат биологических наук Н.М. Андреевская

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Е.Ю.Марков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.А.Заикина доктор биологических наук, профессор Г.Е.Аркадьева

Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится «30» июня 1998 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургской Химико-фармацевтической Академии (197376 Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 14)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Санкт-Петербургской Химико-фармацевтической Академии

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н.В.Кириллова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Целенаправленная научно-обоснованная борьба с инфекционным заболеванием начинается с установления природы его возбудителя. Особенно это важно для карантинных инфекций, в частности для холеры, когда в кратчайшие сроки требуется принятие решения и осуществление ответственных противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Проблема холеры остается актуальной в связи с особенностями ее современного широкого распространения по континентам и странам (Онищенко Г.Г. с соавт., 1992; Марамович A.C. с соавт., 1994; Ломов Ю.М. с соавт., 1995).

При этом весьма существенное, даже решающее значение имеет первый точный бактериологический диагноз, в котором определяющим звеном служит серологический этап исследования.

Одним из перспективных направлений усовершенствования препаратов для идентификации возбудителя холеры является создание диагностикумов на основе моноклональных антител (Алексеева Л.П., 1983). Однако прогресс в этом направлении в нашей стране сдерживается отсутствием или дефицитом коммерческих реактивов и в еще большей мере - недостаточностью сведений о природе антигенов холерного вибриона.

В любом случае для точной серологической детекции холерного вибриона требуется высококачественная холерная агглютинирующая О-сыворотка. В настоящее время в связи со значительным снижением потребности выпуск лошадиных холерных О-сывороток стал экономически не выгодным. Кроме того, лошадиная холерная агглютинирующая О-сыворотка в силу физиологических особенностей продуцента недостаточно видоспецифична, в связи с чем технология ее производства предусматривает как дополнительный этап адсорбцию неспецифических (перекрестно-реагирующих) антител убитыми формалином холерными вибрионами не 01 группы. Однако, эта трудоемкая и требующая больших количеств микробной массы процедура не обеспечивает высокой специфичности готового препарата. При адсорбции удаляются антитела не только к штаммам, используемым в качестве адсорбента, но и существенно снижается титр специфических антител (Дертева И.И. с соавт., 1972; Тюменцев С.Н. с соавт., 1983).

Более рационально использовать кроликов в качестве продуцентов иммунных сывороток, которые более специфичны, чем аналогичные препараты от крупных животных, в частности лошадей (Андреевская Н.М., 1987). Своеобразие сывороточных антител кролика обусловлено тем, что их антиген-связывающие центры соответствуют группировкам из 2-6 простых Сахаров в молекуле О-антигена, а поскольку вероятность встречаемости именно таких

сочетаний в О-антигенах других бактерий невелика, иммунные сыворотки кроликов содержат меньшее количество гетерогенных антител и дают соответственно меньше перекрестных реакций (Staub A.M., 1964; Staub A.M. et al., 1966). По этой причине при изготовлении кроличьих агглютинирующих сывороток создается возможность исключения из технологического процесса этапа адсорбции неспецифических антител.

Активность и специфичность агглютинирующих сывороток обусловливается целым рядом факторов: свойствами иммунизирующего антигена, схемой иммунизации животных, включая способы, дозы, кратность и периодичность введения антигена, видовыми и индивидуальными особенностями иммунологической реактивности животных-продуцентов (Карпов С.П. с соавт., 1976; Смирнов В.В. ссоавт., 1980; Андреевская Н.М., 1987).

В настоящее время в производстве холерных агглютинирующих сывороток в качестве антигена для иммунизации животных-продуцентов используют препараты, получаемые обработкой микробных клеток кипячением (корпускулярный О-антиген), или препараты на основе экстрагированного липополи-сахарида (ЛПС) /растворимый О-антиген/. Наличие балластных веществ в корпускулярном антигене стимулирует у животных-продуцентов выработку перекрестно-реагирующих антител, для удаления которых сыворотки подвергают трудоемкой операции - адсорбции неспецифических антител. С другой стороны, изолированный из вибриона ЛПС, как правило, высокотоксичен. Указанные обстоятельства делают актуальным поиск таких способов инактивации микробной массы и выделения иммуногенных препаратов, которые позволяют получать агглютинирующую кроличью О-сыворотку с высоким титром специфических антител.

Перспективным в этом плане может оказаться препарат клеточных оболочек холерного вибриона, получаемый путем лизиса (с одновременным обеззараживанием) живых клеток мочевиной (Голубинский Е.П. с соавт., 1988), поскольку традиционные способы инактивации холерных вибрионов (кипячение, обработка формалином или фенолом) существенно снижают антигенность получаемого материала (Kabir S., 1989).

Срок годности коммерческих диагностических холерных сывороток составляет 5 лет. Однако, судя по результатам переконтроля сыворотки некоторых серий по этому показателю не соответствуют требованиям нормативной документации. В силу этого повышение стабильности иммунобиологических препаратов, т.е. их способности длительно сохранять физические, иммунохимические и биологические свойства, продолжает оставаться в центре внимания исследователей.

Цель работы. Разработка технологической схемы получения стабильной специфической кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки для идентификации и серологической характеристики штаммов холерного вибриона.

Задачи работы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить препараты О-антигена холерного вибриона разными способами, изучить их физико-химические и биологические свойства и пригодность для получения диагностической холерной агглютинирующей О-сыворотки.

2. Разработать или оптимизировать схемы иммунизации кроликов - продуцентов холерной О-сыворотки.

3. Отработать технологию получения кроличьей высокоактивной специфической холерной агглютинирующей О-сыворотки.

4. Разработать способ стабилизации кроличьей холерной О-сыворотки с целью повышения срока ее годности.

Научная новизна работы.

Впервые проведено широкое сравнительное изучение физико-химических и биологических свойств полученных разными способами антигенов холерного вибриона с целью оценки их антигенной активности. Показано, что наиболее пригодными в качестве антигена для иммунизации кроликов-продуцентов являются клеточные оболочки и делипидизированный липополиса-харид.

На основе теоретических предпосылок и экспериментальных исследований разработаны научно-методические подходы к решению проблемы повышения эффективности получения гипериммунной высокоактивной специфичной холерной агглютинирующей О-сыворотки, не нуждающейся в адсорбции групповых антител.

Установлено, что при определенных условиях иммунизации кроликов О-антигеном холерного вибриона может наступить специфическая иммунологическая ареактивность животных-продуцентов холерной агглютинирующей О-сыворотки. Разработанные и успешно апробированные принципы иммунизации животных позволили предотвратить возникновение подобного явления.

В отношении холерной агглютинирующей О-сыворотки впервые успешно применен множественный изотермический тест на ускоренное разрушение антител, позволяющий оценивать стабильность диагностических препаратов.

Выявлено, что наилучшим стабилизирующим эффектом при хранении диагностической сыворотки обладает смесь сахарозы и тиосульфата натрия, добавляемые к препарату в установленных концентрациях. Оригинальный способ стабилизации кроличьей агглютинирующей О-сыворотки защищен авторским свидетельством.

Практическая значимость работы. Разработана и рекомендована в практику эффективная и экономичная технология получения стабильной холерной агглютинирующей О-сыворотки при использовании в качестве продуцентов кроликов. За счет оптимизации схемы иммунизации продуцентов и исключения этапа адсорбции гетерологических агглютининов срок получения конечного продукта сокращен до 45 сут. Предложен способ стабилизации О-сыворотки, позволяющий продлить срок ее хранения (до 9 лет, срок наблюдения) без потери исходных свойств. По материалам диссертации разработаны и внедрены экспериментально-производственный регламент № 393-92 на сыворотку диагностическую холерную О-агглютинирующую неадсорбированную кроличью сухую для реакции агглютинации (регламент утвержден директором Иркутского противочумного института 25.08.92 г., согласован с директором Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича 26.12.96 г. и переименован в регламент производства № 393-96 15.11.96 г.); внесены изменения в фармакопейную статью № 42-349ВС-90 на сыворотки диагностические холерные "О"- 1 - адсорбированную и неадсорбированную, сухие для РА; разработаны "Методические рекомендации по очистке липополисахарида холерного эльтор вибриона с использованием иммобилизованного полимиксина В", которые одобрены ученым советом Иркутского противочумного института (протокол № 3 от 7.02.86 г.) и утверждены директором института; предложен оригинальный метод стабилизации кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки" (авторское свидетельство №1592780 от 15.09.1990 г.).

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Выбор оптимальных препаратов О-антигена холерного вибриона для получения кроличьей специфической высокоактивной холерной агглютинирующей О-сыворотки.

2. Технология получения стабильной кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки.

3. Способ стабилизации кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки с целью повышения срока ее годности.

Работа выполнена в лаборатории диагностических сывороток и биохимическом отделе Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока в соответствии с планом НИР в рамках двух тем: «Использование деградированного липополисахаридного О-антигена для получения высокоактивных и специфичных холерных сывороток» и «Разработка требований к однородности и стабильности бакпрепаратов для профилактики и диагностики особо опасных инфекций».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на:

• научной конференции молодых ученых Сибирского института физиологии и биохимии растений, Иркутск, 1984;

• научно-практической конференции по проблеме "Холера", Ростов-на-Дону, 1984;

•Всесоюзной научно-практической конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии", Махачкала, 1990;

• научных конференциях Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока, Иркутск, 1984-1997 гг.

Публикации . По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе одно авторское свидетельство.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц и 12 рисунков. Список литературных источников содержит 176 наименований, в том числе 69 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. Описаны научные основы производства диагностических холерных агглютинирующих сывороток, значение вида животного-продуцента для получения иммунных сывороток, обсуждены вопросы оптимизации свойств иммуногенов, схемы иммунизации продуцентов, стабильности диагностических сывороток и иммунобиологических препаратов.

Материалы и методы.

Для получения антигенов холерного вибриона использовали штаммы Vibrio cholerae eltor М-878 (Инаба) и V. cholerae eltor Р-3116 (Огава).

При изучении агглютинабельной активности сывороток в опыты включали до 20 типичных штаммов V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor сероваров Огава и Инаба, специфичности - 38 штаммов холерного вибриона не 01 группы.

Для получения диагностической кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки в качестве антигенов апробировали корпускулярный О-антиген (регламент производства № 144-97); клеточные оболочки (Голубинский Е.П. с соавт., 1988); ЛПС водно-фенольной (Адаме Г.А., 1975), трихлоруксусной (Boivin А. et al., 1937) и водной (Тюменцев С.Н. с соавт., 1983) экстракции; ЛПС, очищенный аффинной хроматографией (Межин А.П. с соавт., 1985); де-липидизированный антиген (Folch S. et al., 1957); липид А и О-полисахарид

(Кэбот Е., Мейер М., 1968); конъюгат О-полисахарида с протаминсульфатом (Seid R.C. et al., 1981), а также комплексы О-полисахарида с у-глобулином (Едвабная JI.C., Зарубина Е.К., 1978) и липида А с бычьим сывороточным альбумином (Galanos S. et al., 1975).

Для характеристики антигенных препаратов применяли диск-электрофорез (Маурер Г., 1971). Гель-хроматографию проводили на сефадексе G-200 и сефа-розе 4В в колонке размером 50x2.5 см. Контроль за выходом компонентов осуществляли спектрофотометрически на Uvicord III при длинах волн 230 и 280 нм и по реакции на углеводы с фенолом и серной кислотой.

Антигенную активность препаратов определяли в реакции встречной имму-нодиффузии по O.Ouchterlony (1949).

Содержание белка определяли по Z.Zaman, R.L.Verwilghen (1979) и M.M.Bradford (1976), углеводов - в реакции с фенолом и серной кислотой (Хансон Р., Филлипс Дж., 1984), суммарное количество нуклеиновых кислот -спектрофотометрически по А.А.Спирину (1958).

Антигенную активность бактериальных препаратов (кроме корпускулярного антигена) определяли путем иммунизации кроликов по оптимальной схеме, разработанной в нашей лаборатории для ЛПС водной экстракции. Антиген вводили в дозах 0.05, 0.1, 0.15, 0.18, 0.20 мг в 1 мл 0.9% раствора хлористого натрия с интервалом в 2 дня. Корпускулярным О-антигеном кроликов иммунизировали согласно регламенту производства.

Токсичность препаратов характеризовали в опытах на белых мышах величиной ЛД50 (Joo J. et al., 1970), которую рассчитывали по методу Кербера в модификации И.П.Ашмарина, АЛ.Воробьева (1962).

Активность и специфичность сывороток определяли в классической объемной реакции агглютинации и оценивали в соответствии с ФС 42-349 ВС-90.

При изучении стабильности холерных агглютинирующих О-сывороток применяли изотермический тест на ускоренное разрушение антител (Jameson Р. et al., 1979).

Статистическую обработку результатов опытов проводили по Е.П.Монце-вичюте-Эрингене (1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В производстве холерной агглютинирующей О-сыворотки, согласно нормативной документации, в качестве животных-продуцентов рекомендованы лошади и кролики. Тем не менее, лаборатории диагностических сывороток Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" и Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и

Дальнего Востока в настоящее время выпускают только лошадиную холерную агглютинирующую О-сыворотку. Параллельная технология производства кроличьей О-сыворотки предусмотрена документацией с учетом возможности возникновения чрезвычайной эпидемиологической обстановки, требующей быстрой замены продуцентов-лошадей кроликами.

Производство агглютинирующих сывороток начинается с подбора и подготовки штамма для получения микробной массы - источника антигена для иммунизации животных-продуцентов. Направленность этого этапа технологического процесса обусловлена необходимостью получения и использования в работе максимально специфических и высокоиммуногенных антигенов.

При выборе способа изоляции антигенов бактериальной клетки важное значение уделено максимальному сохранению их нативности (Станиславский Е.К., 1971), вследствие чего перспективное значение имеет тщательный выбор экст-рагента и условий экстрагирования. Это побудило нас при получении холерных антигенов, в частности липополисахаридных препаратов, апробировать не только традиционные, но и методы, которые в производстве холерной сыворотки использованы нами впервые.

Для сравнительной оценки пригодности при получении холерной агглютинирующей О-сыворотки нами испытаны липополисахариды, полученные из штаммов V. cholerae eltor Р-3116 и М-878 путем экстракции водно-фенольной смесью, трихлоруксусной кислотой и дистиллированной водой, а также параллельно - делипидизированный ЛПС, очищенный ЛПС и клеточные оболочки холерных вибрионов.

По литературным данным, белковый компонент липополисахарида О-анти-гена обусловливает антигенность, липидный - такие биологические эффекты, как токсичность, пирогенность, антигенность и толерогенность (Лисовенко В.Г. с соавт., 1984), полисахарид - серологическую специфичность (Ляшенко В.А., Воробьев A.A., 1982; Езепчук Е.В., 1985).

Изучение химического состава антигенных препаратов холерного вибриона, полученных разными способами, показало, что ЛПС, полученный водно-фенольной экстракцией, по сравнению с одноименными антигенами, экстрагированными дистиллированной водой и трихлоруксусной кислотой, содержит меньше белка, но больше углеводов и нуклеиновых кислот. Два последних препарата по содержанию белка, углеводов и нуклеиновых кислот оказались практически идентичными. Делипидизированный антиген по уровню белка, углеводов и нуклеиновых кислот не отличался существенно от ЛПС водной экстракции. ЛПС, полученные на иммуносорбенте с иммобилизованным полимиксином В, по химическому составу представляли собой наиболее гомогенный препарат: он включал не более 1.25% белка и не содержал нуклеиновых кислот. Обращает

внимание, что препараты клеточных оболочек холерного вибриона, содержат больше белка, но меньше нуклеиновых кислот, чем препараты ЛПС.

Есть основания считать, что нативные молекулы ЛПС содержат белковый компонент, ковалентно связанный с липидом А (Кульберг А.Я., 1985; Wollenweber H.W. et al., 1984). Обработка фенолом в процессе экстракции приводит к отщеплению этого белкового компонента, поэтому такие препараты имеют в своем составе, как правило, не более 1-2% белка (Петров Р.В. с соавт., 1983; Кульберг А.Я., 1985).

При диск-электрофорезе в 5.5 и 7.5% полиакриламидном геле препараты ЛПС, независимо от способа экстракции, разделялись, как минимум, на две фракции, различающиеся по размерам мицелл. Электрофоретические данные подтверждаются результатами ультрафильтрации препаратов ЛПС в ячейках с ультрафильтрами ХМ-100 и РМ-10.

О негомогенности ЛПС можно также судить по расположению и выраженности линий преципитации в реакции иммунодиффузии и результатам гель-фильтрации на колонке с сефарозой 4В. Более того, в последнем случае в препарате ЛПС, полученном водно-фенольной экстракцией, выявлены две высокомолекулярные и одна низкомолекулярная фракции.

Неоднородность полученных разными способами препаратов ЛПС холерного вибриона, особенно водно-фенольного, на наш взгляд, является следствием его деградации в процессе экстракции. Не исключено, однако, что наличие низкомолекулярной фракции может быть связано присутствием R-формы ЛПС с редуцированным О-Пс.

Таким образом, как данные электрофореза, так и результаты исследования с помощью ультрафильтрации и иммунодиффузии, во многом совпадают и свидетельствуют о гетерогенности препаратов липополисахарида, которая не зависит ни от серовара вибриона, ни от способа выделения антигена (Costerton J.W. et al., 1974; Ghosh S. et al., 1985; Guhathakurta B. et al., 1986).

Полученные препараты ЛПС существенно различаются по своим биологическим и антигенным свойствам.

Показано, что ЛПС, экстрагированные водно-фенольным методом, почти в два-три раза менее токсичны (ЛД50 для белых мышей 1998 мкг), чем ЛПС, полученные другими способами (ЛД50 648 - 1095 мкг). Известно, что при делипиди-зации - удалении хлороформ-метанолом свободных и части связанных липидов -токсичность препаратов ЛПС снижается (Folch S. et al., 1957). В нашем случае это обстоятельство убедительно подтверждено на примере делипидизированных препаратов ЛПС водной экстракции, которые были в 10 раз менее токсичными, чем исходный антиген (ЛД50 648 мкг против 6512 мкг). Обработка вибрионов мочевиной с последующим дифференциальным центрифугированием позволяет

получать менее токсичные, чем препараты ЛПС, клеточные оболочки (ЛД50 8140 мкг), что согласуется с данными Л.Я.Урбанович с соавт. (1996).

Наиболее высокой антигенной активностью обладают препараты ЛПС водной экстракции, очищенный ЛПС и корпускулярный антиген, которые при иммунизации кроликов по оптимальной схеме вызывают выработку антител в титрах 3000±658, 4000±568 и 3000±497 соответственно. ЛПС водно-фенольной и трихлоруксусной экстракции по антигенной активности (1440± 157 и 1513±151 соответственно) существенно им уступают. Мы склонны объяснить более высокий иммуногенный эффект первых тем, что в процессе их получения вибрионы не подвергались воздействию сильнодействующих химических реагентов (типа фенола или ТХУ) и характеризуются более высокой нативностью. Особое значение, на наш взгляд, может иметь наличие или отсутствие в антигене ли-пидного компонента. Обеспечивая токсичность ЛПС, липид в то же время играет известную роль и в обеспечении антигенной активности. По нашим данным, делипидизация ЛПС водной экстракции снижает не только его токсические, но в значительной мере - и антигенные свойства. Утраченную антигенную активность препарата нам удалось компенсировать увеличением иммунизирующих доз (рис 1).

Рис. 1. Влияние доз липополисахарида водной экстракции и делипидизи-рованного липополисахарида холерного вибриона на антителообразова-ние при иммунизации кроликов по оси ординат - обратные значения среднеарифметических титров антител по оси абсцисс - группы кроликов:

I-иммунизация по оптимальной схеме (0.05, 0.1, 0.15, 0.18, 0.2 мг); II - дозы увеличены в 3 раза; III - дозы увеличены в 5 раз; IV - дозы увеличены в 6 раз

Увеличение иммунизирующих доз делигшдизированного ЛПС в 3 и 5 раз по сравнению с первоначальными сопровождалось существенным повышением титра антител. В результате титры специфических антител сыворотки крови кролика возросли более чем в 4 раза - с 1795±348 до 7400±324. Введение антигена в таких дозах животные перенесли без видимых отклонений от нормы. Дальнейшее повышение дозы вводимого антигена - в 6 раз - не только не вызывало роста титра антител, но и привело к некоторому его снижению (3225±548). Применение в таких же больших дозах липополисахарида водной экстракции вызывало у подопытных животных токсикоз с летальным исходом.

С этих позиций становится более понятной низкая антигенная эффективность, например, ЛПС водно-фенольной экстракции, в котором нарушена на-тивность липидного компонента (Tsang J.C. et al., 1974). Это обстоятельство подтверждает известные литературные данные, что количественное и качественное содержание антигенных детерминантов отражается не только на физико-химических, но и биологических свойствах ЛПС (Алексеева Л.П., 1993; Pike R., Chandler С., 1975; Kabir S., 1987, 1989).

Особое внимание привлекают результаты изучения антигенности препарата, содержащего компоненты клеточных оболочек холерных вибрионов. Согласно литературным данным (Станиславский Е.К., 1971; Смирнов В.В. с соавт., 1980) клеточные стенки различных бактерий семейства Enterobacteriaceae, вызывают более интенсивный синтез антител, чем препараты ЛПС, выделенные из этих микроорганизмов.

Применение клеточных оболочек холерного вибриона, обладающих сравнительно низкой токсичностью, дало возможность Е.П.Голубинскому с соавт. (1988) увеличить иммунизирующие дозы препарата и получить высокоактивную специфическую холерную агглютинирующую О-сыворотку. Следует, однако, заметить, что при всех возможных достоинствах метода, применяемые авторами иммунизирующие дозы очень высокие. Эта схема послужила нам прототипом для оптимизации методики иммунизации.

С целью поиска оптимальных иммунизирующих доз клеточных оболочек холерного вибриона был поставлен опыт на кроликах, распределенных на 5 групп.

Животным первой группы клеточные оболочки, взвешенные в 0.9% растворе хлористого натрия, вводили пятикратно внутривенно в дозах 0.15, 0.5, 0.75, 0.9 и 1.0 мг (в объеме 1 мл) с интервалом между инъекциями 2 дня. Кролики второй группы получали по 5, третьей - по 10, четвертой - по 20 и пятой - по 30'мг антигена на каждую инъекцию. Первую инъекцию производили подкожно, две последующие - внутривенно с интервалом между инъекциями 3 дня. Тотальное кровопускание выполняли на седьмой день после заключительной инъекции антигена.

Трех- и пятикратное введение клеточных оболочек во всех испытанных дозах кролики перенесли без существенных отклонений от нормального физиологического состояния, что указывает на низкую токсичность и соответственно -хорошую переносимость препарата.

Результаты определения специфической активности групповых сывороток показали, что наиболее эффективна иммунизация путем трехкратного введения клеточных оболочек холерного вибриона по 30 мг на инъекцию (рис. 2).

9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

I II III IV V

Рис. 2. Влияние доз антигена (клеточных оболочек) холерного вибриона на антителообразование при иммунизации кроликов по оси ординат - обратные значения среднеарифметических титров антител по оси абсцисс - группы кроликов:

I - иммунизация по оптимальной схеме с увеличением доз в 5 раз

II - иммунизация в дозах по 5 мг

III - иммунизация в дозах по Ю мг

IV - иммунизация в дозах по 20 мг

V - иммунизация в дозах по 30 мг

Полученная в последнем случае агглютинирующая сыворотка имела высокий титр антител (9000±1200) и, что не менее важно, не агглютинировала холерные вибрионы не 01 группы в титре 1:100 и выше. В других сыворотках титр антител не превышал 2000±320-4500±150, причем отмечена четкая тенденция его повышения по мере увеличения иммунизирующей дозы антигена.

В связи с имеющимися литературными данными о возможности усиления антигенной активности полисахаридных гаптенов ряда бактерий путем их конъюгации и комплексирования с гетерогенными белковыми носителями и син-

тетическими полиэлектролитами (Петров Р.В., Кабанов В.А., 1983; Seid R.C., 1981), нами были получены и испытаны препараты на основе конъюгации и комплексирования полисахаридных гаптенов холерного вибриона с протамин-сульфатом, у-глобулином и липида А - с бычьим сывороточным альбумином. Попытки конъюгировать О-полисахарид и липид А с белковыми носителями с целью повышения их агглютиногенности, к сожалению, не дали положительных результатов. Нельзя, видимо, не согласиться с мнением, что изоляция ЛПС из клетки холерного вибриона с помощью кислотного или щелочного гидролиза снижает в значительной мере иммуногенную активность, которую не удается восстановить за счет конъюгации с гетерогенными белками и полиэлектролитами (Марков Е.Ю. с соавт., 1995).

Выявленные нами антигенные особенности изученных О-антигенов холерных вибрионов позволили рекомендовать две схемы иммунизации кроликов-продуцентов холерной агглютинирующей О-сыворотки:

• пятикратные внутривенные инъекции делипидизированного антигена в дозах 0.15, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0 мг в 1 мл 0.9% раствора хлористого натрия с интервалом два дня;

• трехкратное введение клеточных оболочек: первая инъекция - подкожно, вторая и третья - внутривенно с трехдневными интервалами по 30 мг в 1 мл 0.9% раствора хлористого натрия.

Сыворотки, получаемые от кроликов, иммунизированных по вышеуказанным схемам, имеют титры антител в пределах 1:3200-1:9000, являются высокоспецифичными и не нуждаются в дополнительной адсорбции групповых антител. Разница в титрах может быть объяснена индивидуальными особенностями животных. Увеличение доз, количества инъекций и отдаленная иммунизация не сопровождаются повышением титра антител.

Как известно, ЛПС грамотрицательных бактерий относятся к Т-незави-симым антигенам (ТНА), способным включать в иммуногенез В-лимфоциты, минуя Т-клетки (Фонтапин Л.И., Певницкий Л.А., 1982; Васильев Н.В. с соавт., 1984). При этом не возникают клетки памяти, и иммуногенез идет по принципу первичного ответа.

Активирующий эффект ЛПС оказывает, в основном, на зрелые В-лим-фоциты, численность которых среди популяций B-клеток относительно невелика, но продолжительность их физиологической активности исчисляется днями (Петров Р.В. с соавт., 1983). Этим мы объясняем ббльшую эффективность сближенных инъекций О-антигена холерного вибриона, что показано в наших экспериментах и опытах других авторов (Смирнов В.В. с соавт., 1980; Чард Т., 1981). Отдаленная иммунизация не дает такого эффекта, поскольку, как упоминалось выше, не образуются клетки иммунологической памяти, как при имму-

низации Т-зависимыми антигенами (ТЗА), когда вторичный иммунный ответ бывает в десятки и даже сотни раз выше (Петров Р.В. с соавт., 1981).

Для получения сыворотки каждого вида приходится разрабатывать индивидуальную оптимальную схему иммунизации продуцентов. Наши многолетние наблюдения за динамикой накопления агглютининов показали, что при иммунизации животных впервые применяемым антигеном с использованием даже оптимальных схем приходится, к сожалению, сталкиваться с возникновением своего рода специфической иммунологической ареактивности, так как наступает момент, когда дальнейшее введение антигена не сопровождается повышением титра специфических антител.

Обращает внимание то обстоятельство, что в наших опытах при внутривенном введении антигена в конце первого цикла иммунизации и отдаленной иммунизации кролики не проявляли видимой реакции на введение ЛПС в дозах (0.5 мг), которые при первичной иммунизации доя животных были бы летальными. Это наводит на мысль, что следует различать возникшую ареактивность, или устойчивость, к токсическому действию ЛПС, и ареактивность, проявляющуюся слабым антителообразованием. В связи с этим есть основание заключить, что при иммунизации животных ЛПС индуцируется выработка не только специфических агглютининов и вибриоцидных антител, но и антител, нейтрализующих токсичность лидида А.

При иммунизации кроликов ЛПС холерного вибриона нам ни разу не удалось наблюдать иммунологического паралича, сопровождающегося полным подавлением выработки антител, о чем сообщали некоторые авторы (Фонталин Л.Н. с соавт., 1982). Даже при клиническом проявлении интоксикации, вызванной высокими дозами ЛПС, животные остаются способными к биосинтезу антител.

При внутривенном введении кроликам ЛПС в малых (подпороговых) дозах наблюдается меньший толерогенный эффект, чем при введении в подушечки лап. Это связано, видимо, с тем, что при введении непосредственно в вену кровь быстро разносит антиген по всему организму, при этом какая-то часть его остается неблокированной специфическими антителами, вступает в контакт с В-лимфоцитами и индуцирует антителообразование.

Специфическая иммунологическая ареактивность может быть передана кроликам путем внутривенного введения иммунной сыворотки. Ареактивность, возникшая у животных после двукратного введения ЛПС в небольших дозах, сохраняется до 60 дней, однако ее можно продлить путем однократных инъекций того же антигена.

На основании вышеуказанного можно сделать вывод, что специфическая ареактивность к ЛПС холерного вибриона у животных может развиваться не

только за счет угнетения В-лимфоцитов большими дозами антигена, но и за счет блокады антигенных детерминант ЛПС циркулирующими в крови специфическими антителами, что согласуется с литературными данными (Прокопенко Л.Г. с соавт., 1974; Фонталин Л.Н. с соавт., 1982).

Одним из главных показателей выпускаемых диагностических сывороток является стабильность их специфической активности и физических свойств.

С учетом этого, важное место в нашей работе уделено повышению стабильности холерной агглютинирующей О-сыворотки, разработке ускоренных методов определения этого показателя и его оценки.

При оценке стабильности изучаемых сывороток мы использовали множественный изотермический тест на ускоренное разрушение антител УашезБОП Р. е1 а1.,1979). Следует заметить, что изменение характера агглютинации (образование "прозой") в сыворотке, наблюдаемое при определении стабильности с помощью множественного изотермического теста на ускоренное разрушение антител, подобно изменениям, происходящим в результате длительного хранения сывороток при температуре 7±3°С, предусмотренной нормативной документацией.

По мере увеличения продолжительности выдерживания лиофилизированных препаратов при повышенных температурах, помимо специфической активности, ухудшается их растворимость. Снижается растворимость и при переконтроле сыворотки в связи с истечением срока годности.

Одинаковый характер изменений специфической активности и растворимости, наблюдаемый при хранении в условиях повышенных температур, подтверждает возможность использования множественного изотермического теста на ускоренное разрушение антител для изучения стабильности холерных диагностических сывороток. Используя результаты изотермического теста и применив экспоненциальную регрессию, можно прогнозировать сроки годности диагностических сывороток.

В результате использования изотермического теста для оценки стабильности производственных серий лошадиной холерной агглютинирующей сыворотки выявлена неодинаковая термостабильность сывороток разных серий. По материалам переконтроля установлено, что после 5-летнего хранения сывороток почти 30% серий имеют активность, не соответствующую требованиям нормативной документации.

При хранении иммуноглобулиновых препаратов в них может происходить расщепление белковых молекул и повышение уровня низкомолекулярных соединений (Шмакотина З.В. с соавт., 1974). Обеспечить гарантированную работу диагностического препарата в течение срока годности можно лишь при увеличении стабильности его белковых молекул.

При поиске стабилизатора диагностических сывороток мы остановились на веществах, известных своим стабилизирующим действием на молекулы иммуноглобулинов, прежде всего многоатомных спиртах (сорбите), углево-дах(сахарозе) и аминокислотах (цистеине, глутамине) (Гдалевский Г.Я., 1980). В качестве стабилизатора испытаны также тиосульфат натрия и глутатион - исходя из предположения, что эти вещества как антиоксиданты могут предотвратить свободнорадикальное окисление.

В результате сравнительных исследований удалось установить, что наилучший стабилизирующий эффект оказывает смесь сахарозы (в концентрации от 2.2 до 3.0%) и тиосульфата натрия (от 0.75 до 1.0%). Оба компонента стабилизатора растворяли в 0.9% растворе хлористого натрия и вносили в сыворотку в соотношении, зависящим от специфической активности сыворотки. Сыворотку с титром антител 1:3200 и выше разводили 3:1 стабилизатором, содержащим 9% сахарозы и 3% тиосульфата натрия, с титром антител не ниже 1:1600 - 12:1 раствором, содержащем 30% сахарозы и 10% тиосульфата натрия. Конечное содержание стабилизирующих веществ в сыворотке в обоих случаях было одинаково: 3% - сахарозы и 1% - тиосульфата натрия. В результате стабильность экспериментальной сыворотки была выше, чем у контрольной, в 5 и более раз. Кроме того, сахароза и тиосульфат натрия значительно улучшали растворимость препарата. На специфическую активность и растворимость оказывала влияние остаточная влажность препарата: наиболее стабильными были холерные агглютинирующие О-сыворотки с остаточной влажностью не более 2.0-2.2%.

С целью дальнейшей характеристики полученных препаратов мы провели сравнительное изучение термостабильности кроличьих сывороток, разведенных в соотношении 3:1 0.9 % раствором хлористого натрия и стабилизатором. Представленные в таблице материалы показывают, что кроличьи сыворотки, разведенные 0.9 % раствором хлористого натрия, так же как и коммерческая лошадиная сыворотка, проявили невысокую термостабильность: падение титра антител при температуре 70° С на 50% происходило в течение 4-10 сут.

Проведенные опыты показали, что предлагаемый нами способ дает возможность получить кроличью сыворотку холерную О-агглютинирующую - термостабильную, активную и специфическую.

Разведение сыворотки стабилизатором, помимо стабилизации титра антител, приводит к увеличению на 25-33% выхода конечного продукта, что экономически выгодно для сывороточного производства. Результаты исследования составили предмет изобретения, на которое получено авторское свидетельство "Способ консервирования кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки" № 1592780, опубликованное 15.05.90.

Таблица. Термостабильность кроличьих и лошадиных холерных агглютинирующих О-сывороток в тесте ускоренного разрушения антител при 70 0 С.

Сыворотка Се- Разба- Обратные значения среднеарифметических титров антител Время сни-

через интервалы времени в сутках жения титра

рия витель 0 1 3 5 7 10 15 20 25 30 АТ на 50%"

186 2500 2125 1225 475 562 - - - - - 3

Коммерческая 189 1650 1500 725 400 637 512 - - - - 2

лошадиная 190 нет 2433 2900 2200 2787 1900 1062 - - - - 8

192 2500 1800 1225 1412 1012 250 - - - - 6

193 3300 3100 1425 1425 1112 525 - - - - 2

Эксперимен- 12а 0.9% 3400 - 2350 1875 1075 1037 - - - - 6.

тальная кро- 13а ЫаС1 3900 3500 2400 2300 1550 - - - - 8

личья 14а 2850 2125 1325 825 800 - - - - 4

106 3800 - 3117 - 3250 3600 3550 3580 3200 >30

Эксперимен- 12в Ста- 3636 - 3700 - 3590 2900 2900 3200 3100 >30

тальная кро- 1 Зв били- 3782 - 3300 - 3500 3150 3150 3200 3200 >30

личья 14в затор 3054 - 3284 - 2800 2010 2010 2435 2053 >30

20 5673 - - 5893 - 5400 5050 5050 4732 4712 >30

х - в сутках; (-) - исследование не проводили

На основании всего комплекса полученных экспериментальных результатов мы отработали технологию производственного процесса изготовления кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки для постановки объемной реакции агглютинации и внедрили ее в производство в виде регламента № 393-96.

По нашей технологии изготовлены сыворотки 29 лабораторно-экспери-ментальных, 10 - экспериментально-производственных и одна - производственной серий, качество которых соответствует требованиям ФС 42-349 ВС-90. Сыворотки прошли апробацию и получили положительные оценки в противочумном Центре (г. Москва) и в лаборатории стандартизации и контроля препаратов против особо опасных инфекций ГИСК им. Л.А.Тарасевича (г. Саратов).

ВЫВОДЫ

1. На основе сравнительного изучения физико-химических и биологических свойств О-антигенов холерного вибриона рекомендованы для получения кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки клеточные оболочки и дели-пидизированный липополисахирид, обладающие высокими антигенными свойствами.

2. Оптимизированы схемы иммунизации кроликов-продуцентов, включая способы, дозы, кратность и периодичность введения антигена; исключен этап адсорбции гетерологичных агглютининов, что привело к сокращению срока, упрощению технологии получения и удешевлению конечного продукта.

3. Установлен факт развития иммунологической ареактивности в процессе иммунизации кроликов антигенами холерного вибриона. Предложенная схема иммунизации исключает возможность возникновения данного феномена.

4. Из испытанных криопротекторов и антиоксидантов отобраны сахароза и тиосульфат натрия, добавление которых в установленных концентрациях к кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотке увеличивает на 25-33% выход конечного продукта, стабилизирует физические свойства сыворотки и повышает устойчивость специфических антител при хранении.

5. Теоретически и экспериментально обоснован и предложен для практического применения способ оценки стабильности диагностической холерной О-сыворотки путем постановки множественного изотермического теста на ускоренное разрушение антител.

6. Полученная неадсорбированная кроличья холерная О-сыворотка по своим основным свойствам адекватна коммерческой лошадиной адсорбированной холерной агглютинирующей О-сыворотке. При потребности в сыворотке в пределах до 10 л использование в качестве продуцентов кроликов экономически более целесообразно, чем эксплуатация лошадей.

7. Создана технология получения стабильной кроличьей диагностической холерной агглютинирующей О-сыворотки, на которую разработана и утверждена технологическая документация.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Молева В.А., Михайлов JI.M. Афферентная блокада иммунного ответа у кроликов при иммунизации липополисаха-ридным компонентом холерного О-антигена. Сообщение 1 //Тез. докл. науч.-практ. конф. по проблеме "Холера". - Ростов-на-Дону, 1984. - С. 120-123.

2. Тюменцев С.Н., Молева В.А., Андреевская Н.М., Михайлов JI.M., Марков Е.Ю. Афферентная блокада иммунного ответа у кроликов при иммунизации липополисахаридным компонентом холерного О-антигена. Сообщение II //Актуальн. вопр. иммунодиагностики особо опас. инфекций: Тез. докл. Всесо-юз. науч.-практ. конф. - Ставрополь, 1986. - С. 141-143.

3. Тюменцев С.Н., Марков Е.Ю., Молева В.А., Андреевская Н.М., Михайлов JI.M., Платонов А.И. Использование деградированного О-антигена для получения иммунных высокоактивных холерных сывороток //Ред. ж. «Иммунология». -М., 1988.-40 с. Деп. в ВИНИТИ 01.12.88 г., №8482-В88.

4. Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Молева В.А., Марков Е.Ю., Михайлов JI.M. Физико-химические и биологические свойства липополисахаридов холерных вибрионов, полученных различными способами //Актуальн. вопр. микро-биол., лабораторной диагностики и профил. холеры: Тез докл. Всесоюз. науч. конф. - Ростов-на Дону, 1988. - С. 163-165.

5. Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Молева В.А., Журавлева В.И., Михайлов JI.M. Влияние циклофосфана на антителообразование при иммунизации кроликов липополисахаридом холерного вибриона //Актуальн. вопр. микро-биол., лабораторной диагностики и профил. холеры: Тез докл. Всесоюз. науч. конф. - Ростов-на- Дону, 1988. - С. 206-208.

6. Тюменцев С.Н., Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Андреевская Н.М., Михайлова В.А. Использование клеточных оболочек холерного вибриона для получения высокотитражной кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки //Актуальн. вопр. иммунодиагностики особо опас. инфекций: Тез. докл. Всесоюз. науч.-практ. конф. - Ставрополь, 1989. - Ч. II. - С. 93-95.

7. A.C. № 1592780 G01 №33/53. Способ консервирования кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки / Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Молева В.А., Журавлева В.И. - Опубл. 15.09.90.

8. Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Михайлова В.А., Журавлева В.И. Получение стабильной кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки