Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии микробиологического синтеза пигмента

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии микробиологического синтеза пигмента"

г Г5 од

2 2 ЯГН ЯП.1

На правах рукописи

СМИРНОВА СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ПИГМЕНТА

03.00.23 - Биотехнология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва, 2000

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте биос> теза белковых веществ (Гос НИИСинтезбелок) и Московском государственном у1 верситете инженерной экологии (МГУИЭ).

Научные руководители:

доктор технических наук, профессор Бирюков Валентин Васильевич, кандидат химических наук Мартемьянова Надежда Александровна.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр Иванович доктор технических наук Авчиева Пенкер Бабаевна

Ведущая организация:

Московский государственный университет прикладной биотехнологии Защита состоится » 2000г. в

часов на заседании

диссертационного совета Д 053.34.13. в Российском химико-технологическом ун верситете им. Д.И.Менделеева (.125047, Москва, Миусская пл.,9).

С диссертацией можно ознакомиться в информационном центре Российского хи мико-технологического университета им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан «

ЯъСбСи^Л- 2000г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук И.И.Гусева

А вгь.зз-м0 о

1.Обшая характеристика работы. Актуальность темы: Вопрос снабжения населения безопасным и экологически чистым продовольствием приобретает в последнее время в связи с загрязнением окружающей среды все большую актуальность. При современной технологии производства пищевых продуктов очень часто они в процессе переработки изменяют или теряют свою первоначальную окраску и приобретают непривлекательный или неэстетичный вид. Такие изменения снижают органолептические свойства пищевых продуктов, а через психофизиологические механизмы ухудшается аппетит и пищеварение. Для придания пище естественной окраски используются пищевые красители. Наиболее широко в настоящее время используются синтетические красители. Их применение должно быть обусловлено крайней необходимостью, поскольку многие из них обладают вредными, иногда даже канцерогенными свойствами. К тому же синтетические красители не имеют пищевой ценности и являются посторонними примесями в продуктах питания.

Использование в качестве источника пищевых красителей растительного сырья не всегда оправдано, т.к. его можно использовать непосредственно для питания населения. Кроме того, растительные красители часто имеют водорастворимый характер и обычно недостаточную стабильность. Эти причины вынуждают вести поиск источников красителей в микробном мире. Таким образом, поставленная в настоящей работе задача изучения пигмента, синтезируемого бактериями рода Flavobacterium, представляет собой важную народнохозяйственную проблему.

Цель и задачи исследования: Целью данной работы является разработка технологии получения пищевого красителя и определение его основных физико-химических характеристик. Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

Выбор продуцента красителя и всестороннее изучение его свойств. Подбор условий хранения культуры.

Исследование условий роста культуры и биосинтеза пигмента при воздействии различных внешних факторов среды. Оптимизация питательных сред, сравнение рекомендуемых сред по их влиянию на основной технологический показатель - выход пигмента.

Разработка основ технологии и изучение основных технологических параметров выделения пигмента из культуральной жидкости. Изучение физических и химических характеристик пигмента. Научная новизна:

Для выбранного штамма ПагоЬа^егшт ациаШе подобраны условия для поддержания и длительного хранения культуры - продуцента пигмента.

Предложен специфичный критерий комплексной оценки эффективности процесса культивирования при биосинтезе водонераствори-мых пигментов.

С использованием математических методов планирования эксперимента изучено влияние компонентов среды на рост биомассы и биосинтез пигмента.

Показана стабильность культуры по качественному и количественному составу синтезируемого пигмента при периодическом культивировании.

Установлено, что вид источника азотного питания и соотношение его с источником углеродного питания влияет в большей мере на выход биомассы, чем на синтез пигмента. , - Изучены витаминные потребности культуры, установлено, что добавление пантотеновой кислоты увеличивает синтез пигмента.

При помощи колоночной и тонкослойной хроматографии выявлена неоднородность состава пигмента. Показано, что "соотношение компонентов пигмента сохраняется неизменным при изменении условий культивирования и при многократном пассировании культуры. Методом прогонного анализа получены предварительные данные о структуре пигмента.

Практическая ценность: Реализация полученных результатов оптимизации условий культивирования н питательной среды позволила увеличить выход пигмента в 2.5-3 раза.

Разработан лабораторный регламент производства микробного пигмента. Предложен способ извлечения пигмента без выделения биомассы из кулыу-ральнойжидкости.

Подготовлен проект ТУ на бнотехнологнческиН пигмент. Производство красителя бактериями рода Р1аУоЬас(епиш обладает главным преимуществом по сравнению с растительными источниками сырья, - оно не связано с сезонностью роста, необходимостью длительного хранения сырья, другими проблемами сельского хозяйства.

Оценка пигмента Р1ауоЬас(епит аяиаШе показала возможность использования его в качестве красителя в пищевой промышленности, например, для окрашивания кондитерского крема. При концентрации пигмента в креме 300400 мг/кг изделие приобретает насыщенную естественную розовую окраску. Изучена возможность применения красителя в ликероводочной промышленности, а также для окрашивания парфюмерных изделий.

Сухая биомасса бактерий предложена в качестве компонента комбикормов для повышения декоративности аквариумных рыб. Возможность ее нспользо-

{

вання подтверждена заключением по биотестированию, представленным ООО «НПО Биотест».

Совместно с Проблемной научно-исследовательской лабораторией электрофизических методов обработки пищевых продуктов Московского государственного университета прикладной биотехнологии изучена возможность замены бактериальным красителем нитрита натрия, традиционно использующегося для окрашивания колбасных изделий.

Апробация: Отдельные положения работы были представлены на II международном симпозиуме молодых ученых, аспирантов и студентов «Техника и технология экологически чистых производств», Москва 1998г.; третьей международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек», Москва 1999г.; Всероссийской конференции молодых ученых «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов», Москва 2000г.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано шесть работ.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (I глава), результатов исследования и их обсуждения (11 - VII главы), основных результатов и выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована графиками, рисунками и таблицами. Список цитируемой литературы включает 103 наименования.

5

Введение

Во введении обосновывается актуальность поставленной проблемы, формулируется цель работы и задачи, решаемые для ее достижения. Описывается научная новизна и практическая ценность проведенных исследований.

1. Микробные и распттельные пигменты. Технологические приемы, используемые при их биосинтезе и выделении Рассмотрено применение натуральных, синтетических и неорганических пищевых красителей, их влияние на организм человека. Особенное внимание уделено обзору микроорганизмов-продуцентов пигментов, методам выделения и разделения пигментов из микробных и растительных клеток. Мировыми лидерами производства натуральных и идентичных натуральным пищевых красителей являются BASF, CHR. HANSEN, Ф.Хоффман-Ля Рош. В России несколько групп исследователей занимаются проблемой природных пигментов. Это группа А.И. Нетрусова (МГУ), Е.П. Феофиловой (Институт микробиологии), В.Я. Быховского (Институт биохимии им. Баха), А.Д. Буракаевой, Л.В. Красилышковой, сотрудники АО «Уралбно-фарм»(Екатерннбург) и др.

Освещена проблема стабильности красителей при воздействии различных внешних факторов. В заключение обобщаются данные, представленные в обзоре, и производится постановка задачи исследований.

Экспериментальная часть 2. Объект и методы исследований

Объектом исследований являлась культура Flavobacterium aquatile шт.409, выделенная из природных субстратов. Выделение осуществляли методом накопительной культуры. Культуру выращивали в колбах Эрленмейера при

б

25° С в течение 18 часов на двух питательных средах, отличающихся источниками минерального азота:

среда №10- (МН4)2504 -3.0 г/л, КН2Р04-6.5 г/л, МВБ04-0.7 г/л; по 12.5 мг/л Ре504, Мп504, 2!л504 и ЫаС1,0.2% дрожжевого автолизата;

среда №11 - МНчН2Р04-5.23 г/л; КН2Р04- 4.45 г/л; Мё504-0.7 г/л; по 12.5 мг/л РеБ04, Мп504, гп504 и ЫаС1,0.5% дрожжевого автолизата, рН среды 6.8-7.0;

В качестве источника углерода вносили глицерин в количестве 2 г/л. Условия культивирования отрабатывали при выращивании в колбах на качалке при 200 об/мин и в ферментерах «МатЫвЫ» и «Биостат» объемом 1,0;1,5;15;100 л. В ходе культивирования в ферментере контролировали температуру, рН, расход аэрирующего воздуха, скорость вращения мешалки, расход титрующего агента. Выращивание засевного материала проводили посредством смыва стерильной водой культуры, выросшей на скошенном агаризованном гидролизате казеина.

О завершении процесса при культивировании в колбах судили по изменению рН, в ферментере по снижению интенсивности потребления титрующего агента. Продуцент выращивался в диапазоне температур 24-26°С при рН 6.87.0.

Рост микроорганизмов оценивали нефелометрическим методом при 4 (синем) светофильтре и весовым методом при использовании мембранных фильтров Бупрог (Нешаро1, Прага) № 6 с размером пор 0.4мкм. Пробы суспензии фильтровали через смоченный мембранный фильтр, отмывали дистиллированной водой от оставшихся в среде минеральных солей и глицерина. Фильтры высушивали в сушильном шкафу при температуре 105°С в течение часа. Удельную скорость роста определяли по формуле:

—, (2.1) Дг х0

где Д Г — рассматриваемый промежуток времени, час

X — конечная концентрация биомассы на рассматриваемом временном промежутке, г/л

дг0 — начальная концентрация биомассы на рассматриваемом промежутке времени, г/л.

Удельную скорость образования продукта определяли по формуле:

АР х_

(2-2)

где Дг — рассматриваемый промежуток времени, час

АР — прирост концентрации пигмента за рассматриваемый промежуток времени, г/л

X — конечная концентрация биомассы на рассматриваемом временном промежутке, г/л

х0 — начальная концентрация биомассы на рассматриваемом промежутке времени, г/л.

Удельную скорость потребления титрующего агента определяли по формуле:

_ АЯ '

7771* (?.3)

<г

где Д г —рассматриваемый промежуток времени, час, х^ — среднее содержание биомассы на рассматриваемом временном промежутке, г/л

АН — потребление титрующего агента за рассматриваемый промежуток времени, г Интенсивность аэрации оценивали сульфитным методом Для определения характеристик биомассы клетки отделяли от суспензии на центрифуге типа

К 70 Д при 2700 об/мни в теченне 40 мин. В сухой биомассе бактерий определяли:

- сырой протеин по ГОСТ 28178-89 белок по Барнштейну

нуклеиновые кислоты по методу, предложенному A.C. Спириным (Спирин, 1955)

- липиды по ГОСТ 28178-89

- влажность по ГОСТ 28178-89

Выделение пигмента осуществляли непосредственной экстракцией куль-туралыюй жидкости этиловым эфиром уксусной кислоты (этипацетатом). Экстракт количественно переносили в отгонные колбы, доведённые до постоянного веса, растворитель отделяли методом вакуумной выпарки на испар-шггеле ИР-IM при температуре 60°С. Выход красящих веществ определялся по сухому остатку или по стандартному раствору C0SO4X7II2O (Леонов 1963).

Для оценки достоверности данных о выходах пигмента, получаемых в экспериментах, проводили статистическую обработку результатов.

3. Процесс ферментации

3.1. Хранение культуры Изучение фнзиолого-биохимических и культурально-морфологических свойств проводили в соответствии с определителем Берджн.

Культуру трудно поддерживать после первоначального выделения, что связано с потребностями в азоте, витаминах группы В, зависимостью от концентрации агара в среде.

Испытывали следующие методы хранения культуры:

метод пересева на свежую агарнзованную питательную среду хранение культуры под слоем минерального масла храпение в жидкой питательной среде хранение сублимацнонно высушенной культуры. В качестве основного рабочего метода использовали метод субкультивнро-вання на агаризованной среде. Первоначально культивирование проводили на средах, рекомендуемых в каталоге культур микроорганизмов (ВКМ), где в качестве источников углерода использовали глюкозу и машшт, в качестве источников аминокислот, витаминов и других факторов роста - пептон, дрожжевой экстракт и казеинат натрия. На рекомендованных средах отмечали слабый рост и нехарактерную пигментацию колоний. Было выяснено, что культура способна к самостоятельному гидролизу казеина, однако лучше утилизирует готовый гидролизат. Кислотный гидролнзат казеина полностью лишен триптофана. Предложено проводить гидролиз при более мягких условиях - при помощи ферментов. Испытывали протосубтн-лин, панкреатин, папаин и мегатерии. Клетки бактерий, выращенные на па-паиновых, мегатернновых, панкреатнновых гндролизатах казенна, полностью или частично теряют пигментацию при пересеве на жидкие среды. В результате исследований установили, что наилучшие условия хранения обеспечивает среда, содержащая: протосубтилнновын гидролизат казеина, сернокислый аммоний, калий фосфорнокислый одпозамещенный, магнии сернокислый, источники микроэлементов - Ре2+, Хп2*, Мп2+, СГ, дрожжевой автолизат и агар-агар. Оптимальный рН среды - 6.8-7.0. Культуру хранили при комнатной температуре в защищенном от света месте. Храпение культуры на пита-

тельной агарнзованной среде указанного состава при этих условиях гарантирует отсутствие расщепления культуры, стабильность ее по качественному и количественному составу синтезируемого пигмента.

3.2. Влияние условий культивирования на рост биомассы и биосинтез пигмента

свет

Биосинтез пигмента клетками в значительной степени зависит от состава питательной среды и режима культивирования. Имеются многочисленные сведения как о стимулирующем воздействии света на синтез пигментов, так и обратные данные (Chu, Lilly,1960; Nandy, 1963). Нами проведено исследование влияния света на биосинтез пигмента (табл.3.1). Стимулирующего воздействия света при этом не выявлено.

Таблица 3.1

Влияние света на синтез пигмента

Условия культивирования Номер образца Оптическая плотность культуральной жидкости Сумма экстрагируемых веществ , г/л Среднее значение суммы экстрагируемых веществ, г/л

1 7.3 0.275

На свету 2 8.6 0.300 0.288

3 8.1 0.150

4 8.5 0.390

В темноте 5 8.7 0.240 0.315

6 7.2 0.143

температура

Это второй важнейший фактор внешней среды. Культура синтезирует пигмент в ограниченном диапазоне температур. Как видно из результатов, представленных в таблице 3.2, оптимальная температура для синтеза пигмента находится в области 25-28°С. Оптимумы температур для роста культуры и для синтеза пигмента не совпадают. При температурах культивирования выше этих значений наблюдается резкое снижение пигментации культуры вплоть до ее полного обесцвечивания при 38°С.

Таблица 3.2

Нахождение температурного оптимума для синтеза пигмента

Температура культивирования, °С Сумма экстрагируемых веществ, г/л АСВ, г/л Цвет к.ж.

1 2 3 4

20 0.0205 Не опре-дел. Светло-розовый

25 0.0690 1.93 Ярко- брусничный

28 0.0570 2.1 Брусничный

30 0.0430 2.28 Малиново-брусничный

34 0.0505 2.67 Розовый

36 - - Светло-розовый

38 - - Слегка розоватый

При температурах выше 38°С роста культуры не наблюдается. Влияние величины рН Самый высокий уровень продуктивности наблюдается при культивировании бактерий на среде, исходный рН которой близок к нейтральному.

При подборе сред для культивирования бактерии-продуцента исследовали различные источники углерода, азота, витаминов и ростовых факторов, влияние на пигментобразующую способность присутствия в среде источников ионов некоторых металлов. - источники углерода

В качестве источника углерода для биосинтеза пигмента исследовали: глицерин, маннит, отход масложировой промышленности - топцитин, представляющий собой смесь фосфолипндов, олеиновую кислоту, глюкозу. Определено, что с точки зрения продуктивности по пигменту и биомассе оптимальным источником углерода является топцитин. Сумма экстрагируемых веществ на среде, содержащей в качестве источника углерода топцитин, на

3.3. Оптимизация питательных сред

Рис 3.1. Вы гад пигмента в взависимости от концентрации олеиновой кислоты

2,5

Сумма экстр. 2 веществ,г/л, Оптическая ^ плотность 1 -экстракта д 5

2 -

О

О

0,2

0,4

0,6

0,8

Содержание олеиновой кислоты в среде,% об Сумма экстрагируемых веществ, г/л 2 ■—•—Оптическая плотность экстракта

порядок выше, чем в контроле, где источником углерода является глицерин (табл. 3.3). Оптические плотности этилацетатных экстрактов при этом близки. Однако, это сырье нетехнологично и непостоянно по составу, что может препятствовать стандартизации продукции.

Таблица 3.3

Сравнение источников углерода

Источник углерода в среде Оптическая плотность культу-ральной жидкости Оптическая плотность этилацетат-ного экстракта Сумма экстрагируемых веществ,г/л

Топцитин 21.6 4.21 1.8

Глицерин 8.45 3.75 1.75

Вторым по интенсивности источником углеродного питания оказалась олеиновая кислота. Результат введения ее среду представлен на рис. 3.1.

Вероятно, присутствие олеиновой кислоты в питательной среде в большей мере стимулирует рост биомассы, а также накопление запасных веществ. Выход пигмента может быть увеличен на 25 %. Положительный эффект' от добавления олеиновой кислоты может объясняться еще и тем, что она в данном случае выступает в роли пеногаснтеля. При использовании глюкозы как единственного источника углерода в среде выход пигмента на 76 % ниже контроля (среда №10). - источники органического азота

В качестве источников органического азота рассматривались дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт, соевая мука, гидролизат казеина, сыворотка.

Одним из важнейших компонентов питательной среды является дрожжевой автолизат. Это не только источник аминокислот, но и витаминов, других факторов роста. Определено оптимальное содержание дрожжевого автолиза-та в питательной среде. Тот факт, что качественный и количественный состав автолизата непостоянен, объясняет стремление заменить этот компонент на другой, стандартный по составу.

При рассмотрении с этой точки зрения соевой муки не отмечено стимулирующего действия ее компонентов на синтез пигмента, хотя продуктивность по биомассе возросла в два раза.

Наряду с традиционным изучением влияния отдельных факторов, использовали многофакторные эксперименты, в частности метод аддитивно-решетчатого описания и метод Бокса-Уилсона

Дополнительно в качестве источников минерального азота исследовались нитрит натрия, нитрат натрия, хлорид аммония, нитрат аммония, аммоний молибдеиовокислый, аммоний фосфорнокислый одно- и двузамёщенный. В результате исследований аммоний сернокислый в базовой среде был заменен аммонием фосфорнокислым однозамещенным (таблица 3.4).

витамины группы В Для выяснения воздействия на рост культуры и синтез пигмента витамииов было проведено культивирование на средах, содержащих различные концентрации тиамина, рибофлавина, пантотеновой кислоты, никотиновой кислоты, пиридоксина, дестиобиотина и цианкобаламина а также их сочетания в подобранных оптимальных концентрациях. Введение в среду пантотеновой кислоты в концентрации 0.28 мкг/мл позволило увеличить выход пигмента на 52%. Отмечено ухудшение условий экстрагирования пигмента из культуры бактерии, выращенных на среде с добавлением витаминов.

Таблица 3.4

Выбор источника минерального азота

Источник азота Сумма экстрагируемых веществ, % от контроля Источник азота Сумма экстрагируемых веществ, % от контроля

С^И4)2504 (контроль) 100 N^N03 90.5

ЫаИОг Нет роста СГ^Н4)6М07024 66.5

ИаИОз 55 (МН4)НР04 126.5

N11)01 95.0 (Ш4)Н2Р04 149.5

микроэлементы

Изучение влияния ионов марганца на синтез пигмента проводили на среде №1 I.

Проведенные эксперименты с тремя источниками марганца - пермангана-том калия, хлористым марганцем и марганцем сернокислым позволяют сделать вывод о целесообразности введения в среду хлорида марганца, оказавшего наибольшее стимулирующее влияние на синтез пигмента.

Рис.3.2 Результаты введения в среду марганца

300

250 350

Концентрация источника марганца, мг/л Сумма экстрагируемых веществ (среда с МпС12) Оптическая плотность этил ацетатного смыва (срвдасМ пС)2) Сумма эксгруемых веществ ( среда с MnS04) Оптическая плотность зтилацетапюго смыва ( среда с М nS04)

3.4. Анализ кинетики роста культуры и синтеза пигмента

Исследование кинетики роста культуры и накопления пигмента позволяет сделать вывод о том, что максимальная удельная скорость накопления пигмента в кулыуралыюй жидкости и максимальная удельная скорость роста не совпадают во времени.

К концу экспоненциальной фазы роста синтез пигмента практически завершен

Удельная скорость потребления титрующего агента максимальна во время ускоренной фазы роста. При замедлении скорости роста бактерий падает интенсивность закисления культуральной жидкости продуктами метаболизма и снижается потребление раствора щелочи на нейтрализацию.

В нашем случае скорость роста микроорганизмов и скорость образования пигмента тесно связаны между собой. Зависимость чр =- Ц(ц) можно выразить уравнением:

/4х¡л-В хц1 С + р + Ехр1

(3.1)

где - удельная скорость образования продукта, 1/ч

(I - удельная скорость роста, 1/ч А,В,С,Е - коэффициенты

И

Рис 3.3 Удельная скорость роста и удельная скорость образования проукга

10 15 20 д-^т) -п-чр(0

0,003

4. Изучение основных параметров процесса выделения пигмента

Изучались два способа выделения пигмента - традиционный для синтетиков каротнноидов - экстрагирование изолированной биомассы бактерий, н нетрадиционный - непосредственная экстракция культуралыюй жидкости.

По традиционной методике основным экстрагентом для извлечения пигментов из биомассы бактерий, грибов, дрожжей, растительных клеток явля-

ется ацетон, из которого красящие вещества для дальнейшего разделения не-реводятся в гексан.

Предложен новый способ выделения пигмента путем непосредственной экстракции культуралыюй жидкости этиловым эфиром уксусной кислоты. Выбор растворителя объясняется промежуточным положением по полярности между ацетоном (дипольный момент молекулы - 1,78) и гексаном (дн-польный момент молекулы 0,08). Пигмент хорошо растворяется в ряде полярных растворителей, в жирных органических кислотах, животных жирах. Предпочтение этнлацетата объясняется его несмешиваемостью с водой, лег-колетучестью, относительной дешевизной. Этот растворитель и ранее применялся для разделения каротнноидов (И.М.Мишина и др., 1993г).

Для выявления способов интенсификации процесса экстрагирования проводили процесс при различных рН и температуре. Выяснено, что оптимальная величина рН для извлечения пигмента находится в диапазоне 3-4, с повышением температуры экстрагируемой среды повышается глубина и скорость извлечения пигмента. Следует учитывать термолабилыюсть пигмента, в связи с этим, вероятно, наиболее целесообразно процесс экстракции проводить при комнатной температуре или при кратковременном воздействии высоких температур.

Рис 4.1 Распределение пигмента между биомассой и

£ 0,04 ю

" 0,03 0,02 0,01 0

0 0,05 0,1 0,15 ОД 0,25 0,3

экстрагентом

Сэ,г/л

При реализации предложенного метода экстракции отпадает необходимость выделения биомассы из культуральной жидкости, механического разрушения клеточных оболочек.

Важнейшей характеристикой экстрагента является коэффициент распределения, равный отношению концентрации экстрагируемого компонента в органической фазе и в равновесном остатке исходной водной смеси. В результате многократной экстракции культуральной жидкости был получен ряд равновесных состояний, характеризующихся определенной концентрацией пигмента в экстракте. Это позволило получить зависимость между концентрацией пигмента в экстракте и культуральной жидкости. Полученная зависимость представлена на рис. 4.1.

5. Физико-химические свойства пигмента

Установлено, что пигмент не растворяется в воде независимо от величины рН, образует взвесь, окрашивающую раствор при рН=13, выпадающую в осадок с течением времени, но растворяется в эфире (этиловый эфир уксусной кислоты, серный эфир). Растворения в соляной кислоте и в растворе едкого натра также нет. Не растворяется в водных растворах поваренной соли и двууглекислого натрия. Растворим в слабых растворах лимонной кислоты (3%), хорошо растворяется в жирных органических кислотах (олеиновая). Очень хорошо растворим в спиртах, кетонах, углеводородах. Практически не растворим в неполярном углеводороде гексане.

Пигмент в нейтральной среде имеет ярко-оранжевую окраску, в кислой -красную, а в щелочной - желтую. При окислении кислородом воздуха, которое быстрее протекает при температуре выше +10°С, пигмент также приобретает красную окраску. При дальнейшем окислении на воздухе или под воз-

действием высоких температур красная окраска изменяется на свекловнчно-фиолетовую.

Пигмент, экстрагируемый из биомассы бактерий-продуцентов не является однородным веществом. Изучение его строения заключалось в хроматогра-фическом разделении на фракции с последующей изоляцией отдельных компонентов. Были рассмотрены многочисленные рекомендуемые в литературе хроматографические системы. Эксперименты по их применению к нашему пигменту не дали желаемого результата. При первоначальном разделении в качестве адсорбента использовали окись алюминия нейтральную для хроматографии. Разделение проводили методом адсорбционной хроматографии на колонках с различными геометрическими характеристиками. Метод колоночной хроматографии в данном случае не оказался достаточно эффективным, зато позволил отделить фосфолипиды и глюколипнды от суммы веществ, экстрагируемых этипацетатом, что облегчает дальнейшее разделение пигмента. Этот вывод иллюстрируется данными, приведенными в таблице 5.1.

Таблица 5.1

Фракционный состав липидов суммы веществ, экстрагируемых этипацетатом, и элюата, полученного при разделении на хроматографической колонке

сА1£з

Анализируемые липиды Вещества, экстрагируемые этилацетатом, % от £ липидов Сумма веществ, прошедших через колонку с А120,, % от Е липидов

1 2 3

Фосфолипиды + глюколипнды 55.8 16.0

1 2 3

Моноглицериды 11.9 5.9

Диглицериды 7.1 следы

Стерины 0.1 следы

Свободные жирные кислоты 2.7 18.3

Триглицериды 9.5 30.2

Эфиры стерннов, воски 19.3 29.7

В результате экспериментального испытания множества рекомендуемых систем растворителей и методов разделения, начальное разделение пигмента на фракции проводили по предложенной ранее схеме (Т.С.Бобкова, 1965), а проверку результатов разделения осуществляли в условиях планарной хроматографии на пластинах 8НиГо1 в системе растворителей хлороформ : метанол 80 : 20, дающей наилучший результат. Разделение пигмента на фракции осложнено необходимостью сапоннфикацнн липидпон фракции 25% раствором едкого кали в метаноле, близостью ИГ разделяемых компонентов. Был получен ряд окрашенных зон со следующими характеристиками : Первая зона - ярко-малиновая, НТ-0.95 ; вторая - оранжевая, -0.8; третья -фиолетовая, ЯГ -0.72 ; четвертая - лимонно-желтая, слабо выраженная, IIГ-0.7, пятая - розовая ЛГ-0.67.

Результаты спектрофотометрнческого исследования пигмента в видимой области иллюстрируют возможность применения этнлацетата в качестве экс-трагента. Максимумы поглощения двух образцов пигмента, выделенного традиционным или предложенным в диссертации способом, практически

совпадают. Небольшие различия в наблюдаемых картинах могут быть объяснены отличными спектральными характеристиками экстрагентов. В первом случае это гексан, во втором - этилацетат.

6. Стабильность пигмента

Для определения стойкости красителя выяснили его отношение к различным внешним факторам, таким как свет, высокая температура, воздействие щелочи, кислот.

Об изменении характеристик пигмента судили по оптической плотности нейтрального, кислого и щелочного растворов пигмента, подвергшихся долговременному воздействию света при комнатной температуре. Следует отметить, что нейтральная форма пигмента имеет два максимума поглощения, первый и основной в области 460 - 470 им, второй - 530 - 535 нм. С течением времени под воздействием рассеянного солнечного света происходит перераспределение между двумя пиками, постепенное уменьшение оптической плотности раствора, что, вероятно, связано с окислением, а затем и разрушением пигмента. Раствор пигмента меняет окраску от оранжевой до малиновой, а затем практически обесцвечивается. Динамика изменения отической плотности экстракта представлена на рис 6.1. Аналогичным образом протекают изменения у кислой и щелочной формах пигмента. Спектральные характеристики компонента пигмента, имеющего основной максимум в области 535 нм, длительное время не претерпевают существенных изменений. Изменение концентрацией пигмента находили в виде уравнения:

, с

1п-= -кхт (6.1)

С

При рассмотрении стабильности пигмента под воздействием температуры изучали следующие температурные режимы: 30,40 и 60 °С. Динамика деструкции пигмента представлена на рис 6.2.

Пигмент достаточно стабилен к воздействию умеренных температур. Учитывая кратковременное температурное воздействие на экстракт в промышленных выпарных установках, значительных потерь на стадии концентрирования продукта не будет.

В результате изучения стабильности пигмента были предложены условия, при выполнении которых изменения цепных свойств пигмента в процессе длительного хранения минимальны. Предпочтительно хранить выделенный пигмент в защищенном от света месте при температуре не выше+10°С, в атмосфере инертного газа.

Рис 6.1 Динамика изменения оптической плотности экстракта под воздействием рассеяного света

7. Мероприятия по реализации технологии

Результаты проведенных исследований позволили предложить технологическую схему производства микробиологического пигмента. Технологическая схема состоит из восьми блоков.

Выращивание посевного материала на косяках и в колбах. Получение инокулята.

Подготовка стерильного воздуха, титрующих агентов и пеногасите-ля.

Приготовление и стерилизация питательной среды. Ферментация.

Экстрагирование пигмента из культуральной жидкости или сгущенной биомассы.

Концентрирование экстракта. Сушка пигмента.

При изменении целевого продукта производства вносятся изменения в окончание технологического процесса. В том случае, когда целевым продуктом является сухая биомасса бактерий, непосредственно после ферментации следует стадия концентрирования биомассы (сепарацией) и сушка. Легко реализовать безотходное производство, в котором биомассу после экстракции и следующего за ней удаления остаточного количества растворителя использовать в качестве высокобелкового компонента корма для сельского хозяйства или в качестве удобрения.

Отдельные стадии технологического процесса (приготовление и стерилизация питательных сред, ферментация, сепарирование, сушка) отработаны на опытной установке.

Подготовлен проект ТУ на микробный пигмент. Разработан лабораторный регламент производства красителя. Проведены испытания по применению пигмента:

в качестве замены красящего вещества колбасных изделий - нитрита натрия - совместно с Проблемной научно-исследовательской лабораторией электрофизических методов обработки пищевых продуктов Московского государственного университета прикладной биотехнологии

для окрашивания парфюмерной продукции - в лаборатории ГУП ГосНИИсинтезбелок

для окрашивания кондитерского крема - в лаборатории ГУП ГосНИИсинтезбелок

Сухая биомасса бактерий испытывалась в качестве компонента кормов для промысловых и аквариумных рыб - в лаборатории Института рыбного хозяйства п океанографии.

Основные результаты и выводы

1. Изучены свойства бактерии Р!ауоЬас(егшн1 ас]иаП1е - продуцента пигмента. Подобраны условия хранения и поддержания культуры и питательные среды, гарантирующие постоянство качественного н количественного состава пигмента.

2. Определены основные физико-химические параметры культивирования клеток - температура 24-26 °С, рН- 6,8-7,0. В исследованных пределах с увеличением К^ увеличивается продуктивность культуры по пигменту.

3. Изучено влияние различных источников минерального и органического азота и углерода па рост бактерий и синтез пигмента. В качестве источника углерода выбран глицерин, органического азота -дрожжевой автолнзат.

4. Выявлено стимулирующее воздействие на биосинтетическую способность культуры пантотеновой кислоты и ионов марганца.

5. На основании изучения факторов питания разработана оптимальная среда, позволившая увеличить выход пигмента в 2,5-3 раза по сравнению с контролем. Получены основные кинетические характеристики культуры - продуцента. Определена взаимосвязь между процессами роста культуры и синтеза пигмента, роста культуры и потребления титрующего агента.

6. Изучены условия экстрагирования пигмента из культуральной жидкости и биомассы. Экспериментально определен коэффициент распределения пигмента для системы бактериальная суспензия : этил-ацетат.

7. Изучены основные физико-химические характеристики пигмента. Методом ЯМР 'Н получены данные о его структуре.

8. Получены данные о кинетике деструкции пигмента под воздействием света и температуры, рекомендованы условия для его долговременного хранения.

9. На основании проведенных исследований предложена технологическая схема производства пигмента и бактериальной биомассы, отдельные стадии технологического процесса отработаны на опытной установке. Составлен проект ТУ на биотехнологический пигмент и разработан лабораторный регламент производства пигмента. Проведены испытания по использованию пигмента в качестве красителя для кондитерского крема, парфюмерной продукции, колбасных изделий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. С.Н.Смирнова, В.В.Бирюков, М.Б.Биттеева, Л.В.Темина, Н.В.Коваленко, В.Г.Осипова, И.Н.Щеблыкин. Экологически чистый процесс получения пигмента для парфюмерной промышленности : Тезисы докладов II международного симпозиума молодых ученых , аспирантов и студентов: Техника и технология экологически чистых производств.-М.:МГУИЭ, 1998.- с 84-85.

2. С.Н. Смирнова. Методы стимуляции синтеза флавопигмента. /УТруды МГУИЭ.- М.:МГУИЭ, 1998- Том II.- с 104-110.

3. С.Н.Смнрнова, В.Г.Осипова, Н.В.Коваленко, И.Н.Щеблыкин В.В.Бпрюков, М.Б.Биттеева. Разработка технологии получения розового пищевого пигмента.: Материалы третьей международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек». - М.: МГУПБ,1999.-с 99-100.

4. С.Н.Смнрнова, М.Б.Биттеева, В.В.Бпрюков, С.Ю.Требоганова. Влияние состава среды и физических факторов на биосинтез пигментов бактериями. //Труды МГУИЭ.-М.:МГУИЭ,1999-Том IV.- с 10-15.

5. Смирнова С.Н. Оптимизация питательной среды для культивирования бактерий - продуцентов пищевого красителя: Сб. трудов Меж-дународ.научн.конф. т.Т.б Санкт-Петербург: Санкт-петербургский гос.технол.нн-т(тех.ун-т), 2000.-е 55-56.

6. С.Н.Смирнова, М.Б.Биттеева, В.В.Бирюков, В.Г.Осипова, Н.В.Коваленко. Биотехнологический синтез микробного пигмента: Тезисы конференции «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов».-М.,2000.-с 156. / /

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Смирнова, Светлана Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. МИКРОБНЫЕ И РАСТИТЕЛЬНЫЕ ПИГМЕНТЫ.

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ИХ БИОСИНТЕЗЕ И ВЫДЕЛЕНИИ.

1Л. Применение пищевых красителей.

1Л Л. Натуральные пищевые красители.

1Л .2. Синтетические органические красители.

1Л .3. Неорганические красители.

1.2. Пищевые красители и здоровье человека.

1.3. Микроорганизмы - продуценты пигментов.

1.4. Особенности ферментации микроорганизмов - продуцентов пигментов.

1.5. Методы выделения и разделения пигментов из микробных и растительных клеток.

1.6. Стабильность пищевых красителей.

1. 7. Выводы и постановка задачи.

Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объект исследований.

2.1.1. Морфологические признаки культуры- продуцента.

2.1.2. Физиологические свойства культуры- продуцента.47 2.1.3.Биохимические свойства культуры- продуцента.

2.2. Хранение культуры.

2.3. Методы культивирования микроорганизмов.

2.4. Определение кинетических характеристик культуры-продуцента.

2.5. Оптимизация питательных сред.

2.6.0пределение оптимальных физико-химических параметров процесса культивирования.

2.7. Изучение выделения продукта.

2.8. Изучение строения пигмента.

2.9. Определение статистических характеристик процесса выделения.

Глава 3. ПРОЦЕСС ФЕРМЕНТАЦИИ.

3.1. Хранение культуры.

3.1.1. Субкультивирование.

3.1.2. Хранение культуры под слоем вазелинового масла.

3.1.3. Хранение лиофилизированной культуры.

3.2. Изучение параметров процесса культивирования бактерий.

3.2.1. Свет.

3.2.2. Температура.

3.2.3.Влияние величины рН на культивирование бактерий.

3.2.4. Потребность культуры в кислороде.

3.3 . Оптимизация питательных сред.

3.3.1. Влияние источников азота на рост бактерий и синтез пигмента.

3.3.1.1. Органические и минеральные источники азота.

3.3.1.2. Влияние дрожжевого автолизата на процесс культивирования.

3.3.1.3. Нахождение оптимального соотношения источников минерального азота и фосфора в среде.

3.3.1.4. Источники минерального азота.

3.3.1.5. Замена дрожжевого автолизата другим источником органического азота.

3.3.1.6. Соевая мука.

3.3.2. Источники углерода.

3.3.3. Витаминные потребности культуры.

3.3.4. Микроэлементы.

3.4. Анализ кинетики роста культуры и синтеза пигмента.

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ ПАРАМЕТРОВ ПРОЦЕССА ВЫДЕЛЕНИЯ ПИГМЕНТА.

4.1. Обоснование выбора экстрагента.

4.2. Определение кинетических характеристик процесса экстрагирования.

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ПИГМЕНТА.

5.1. Определение растворимости пигмента в различных растворителях

5.2. Изучение строения пигмента.

5.3. Идентификация компонентов пигмента.

Глава 6. СТАБИЛЬНОСТЬ ПИГМЕНТА.

Глава 7.МЕРОПРИЯТИЯ ПО РЕАЛИЗАЦИИ ТЕХНОЛОГИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии микробиологического синтеза пигмента"

Вопрос снабжения населения безопасным и экологически чистым продовольствием приобретает в последнее время в связи с загрязнением окружающей среды все большую актуальность. При современной технологии производства пищевых продуктов очень часто они в процессе переработки изменяют или теряют свою первоначальную окраску и приобретают непривлекательный или неэстетичный вид. Такие изменения снижают органолептические свойства пищевых продуктов, а через психофизиологические механизмы ухудшается аппетит и пищеварение. Для придания пище естественной окраски используются пищевые красители. Наиболее широко в настоящее время используются синтетические красители. Их применение должно быть обусловлено крайней необходимостью, поскольку многие из них обладают вредными, иногда даже канцерогенными свойствами. Тем более, что синтетические красители не имеют пищевой ценности и являются посторонними примесями в продуктах питания.

Использование в качестве источника пищевых красителей растительного сырья не всегда оправдано, т.к. его можно использовать непосредственно для питания населения. Эти причины вынуждают вести поиск источников красителей в микробном мире.

Таким образом, поставленная в настоящей работе задача изучения пигмента, синтезируемого бактериями рода Р1ауоЬас1епат, представляет собой важную народнохозяйственную проблему.

Настоящая работа посвящена разработке технологии получения пищевого красителя и определению его основных физико-химических характеристик. Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

Выбор продуцента красителя и всестороннее изучение его свойств. 7

Подбор условий хранения культуры.

Исследование условий роста культуры и биосинтеза пигмента при воздействии различных внешних факторов среды.

Оптимизация питательных сред, сравнение рекомендуемых сред по их влиянию на основной технологический показатель - выход пигмента.

Разработка основ технологии и изучение основных технологических параметров выделения пигмента из культуральной жидкости.

Изучение физических и химических характеристик пигмента.

Практическая ценность: Реализация полученных результатов оптимизации условий культивирования и питательной среды позволила значительно увеличить выход пигмента в 2.5-3 раза.

Разработан лабораторный регламент производства микробного пигмента. Предложен более экономичный способ извлечения пигмента из культуры-продуцента в связи со снижением энергозатрат, что объясняется исключением стадии выделения биомассы из культуральной жидкости.

Подготовлен проект ТУ на биотехнологический пигмент. Производство красителя бактериями рода Р1ауоЬас1:спшп обладает главным преимуществом по сравнению с растительными источниками сырья, - оно не связано с сезонностью роста, необходимостью длительного хранения сырья, другими проблемами сельского хозяйства.

Оценка пигмента Р1ауоЬас1епит aquatile показала возможность использования его в качестве красителя в пищевой промышленности, например, для окрашивания кондитерского крема. При концентрации пигмента в креме 300400 мг/кг изделие приобретает насыщенную естественную розовую окраску.

Изучена возможность применения красителя и в ликероводочной промышленности, а также для окрашивания парфюмерных изделий. 8

Сухая биомасса бактерий предложена в качестве компонента комбикормов для повышения декоративности аквариумных рыб. Возможность ее использования подтверждена заключением по биотестированию, представленным ООО «НПО Биотест».

Совместно с Проблемной научно-исследовательской лабораторией электрофизических методов обработки пищевых продуктов Московского государственного университета прикладной биотехнологии изучена возможность замены бактериальным красителем нитрита натрия, традиционно использующегося для окрашивания колбасных изделий. 9

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Смирнова, Светлана Николаевна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1.Изучены свойства бактерии Fl.aquatile - продуцента пигмента. Подобраны условия хранения и поддержания культуры и питательные среды, гарантирующие постоянство качественного и количественного состава пигмента.

2. Определены основные физико-химические параметры культивирования клеток - температура 24-26 °С, рН 6,8-7,0, уровень аэрация.

3. Изучено влияние различных источников минерального и органического азота и углерода на рост бактерий и синтез пигмента. В качестве источника углерода выбран глицерин, органического азота - дрожжевой автолизат.

4. Выявлено стимулирующее воздействие на биосинтетическую способность культуры пантотеновой кислоты и ионов марганца.

5. На основании изучения факторов питания разработана оптимальная среда, позволившая увеличить выход пигмента в 2.53 раза по сравнению с контролем. Получены основные кинетические характеристики культуры - продуцента. Определена взаимосвязь между процессами роста культуры и синтеза пигмента, роста культуры и потребления титрующего агента.

6. Изучены условия экстрагирования пигмента из культуральной жидкости и биомассы. Экспериментально определен коэффициент распределения пигмента для системы бактериальная биомасса : этилацетат.

7. Изучены основные физико-химические характеристики пигмента, методом ЯМР !Н получены данные о его структуре.

8. Получены данные о кинетике деструкции пигмента под воздействием света и температуры, рекомендованы условия для его долговременного хранения .

9. На основании проведенных исследований предложена технологическая схема производства пигмента и бактериальной

166 биомассы, отдельные стадии технологического процесса отработаны на опытной установке. Составлен проект ТУ на биотехнологический пигмент и разработан лабораторный регламент производства пигмента. Проведены испытания по использованию пигмента в качестве красителя для кондитерского крема, парфюмерной продукции, колбасных изделий.

Москва,2000г ш

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Смирнова, Светлана Николаевна, Москва

1. Булдаков A.C. Пищевые добавки.- Санкт-Петербург: Ut,1996.-240 с.

2. Пищевые добавки. Европейская классификация и описание.

3. В пяти томах./Под ред. Емец В.Н. Минск: ЗАО ВАЭМ, 1998.

4. Краткий определитель бактерий Берги. /Под ред.Дж. Хоулта.-М.:Мир, 1980.-496с.

5. Большой практикум по микробиологии. /Под ред. Г.Л.Селибера.- М.: Высшая школа,1969.-139с.

6. Феофилова Е.П. Пигменты микроорганизмов. М.: Наука, 1974 г

7. Красильникова H.A., Кириллова Н.Ф. и др. Токсономическое значение макимумов поголощения пигментов красно-оранжевых лучистых грибков.//Микробиология.- 1967,- т. 36.- вып.1.- 129135.

8. Т.С.Бобкова Каротиноиды нефотосинтезирующих микро организмов.//Успехи микробиологии.- 1970.-№6, 37-57.

9. Journal of bacteriology.- 1964,- 88.- 6,- 1688-1694

10. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. М.: Пищевая пром-сть,1979.-120с.

11. Ю.Феофилова Е.П., Клеточная стенка грибов. М.: Наука, 1983.-248 с.

12. П.Д.Мецлер. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т. 3. М.:Мир,1980.-488с.

13. Э.Беккер, Физиология грибов и их практическоеиспользование. Издательство Московского Университета, 1963,- 272с.181

14. Гаврилов A.C., Киселева А.И., Матушкина С.А., Кордюкова Н.П., Феофилова Е.П. Получение ликопина микробиологическим способом в условиях завода. //Прикладная биохимия и микробиология.- 1996.-т. 32, № 5.-545-548

15. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C. Способ получения ликопина./ Патент РФ №2115678 С09 В61/00.- БИ №20.-1998.

16. Иванин А.Ф.,Феофилова Е.П. и др.Способ получения ликопина. Патент РФ №2102416 С09 В61/00.- БИ №2.-1998.

17. М.И.Бехтерева, Н.В.Тарасова, Е.П.Феофилова и др.Изучение условий образования у?-каротина Bl.trispora// Микробиология.-1967.-т.36.-вып.1.-46-50.

18. Н.В.Тарасова, М.Н.Бехтерева. Биосинтез/?-каротина некоторыми грибами.//Успехи микробиологии. М.:Наука.-1966.-174-191.

19. Ева Ласло. /?-оинон в биосинтезе каротина.//Прикладная биохимия и микробиология.-1966.-т.- 2.- № 6,- 644-648.

20. Колот Ф.Б., Голышева М.Г. Биосинтез каротиноидов грибом В1. trispora на средах с различыми источнниками углеводов.// Прикладная биохимия и микробиология.- 1967.-т.- 3,- № 6.-738-740.

21. Королева И.Ф., Залашко М.В. и др. Биосинтез каротина дрожжами Sp. Pararoseus Т. при культивировании их на оксидате торфа.//Прикладная биохимия и микробиология.-1979.-т.- 15.-№2.-222-226.

22. Людникова Т.А., Беззубов A.A., Крицкий М.С. Исследование регуляторного взаимодействия путей биосинтеза и десатурации жирных кислот и каротиноидщов у мутантов N. crassa. //Прикладная биохимия и микробиология.-1992.-том 28.-№ 4.571-578.182

23. Полулях О.В., Подопригора О.И. и др. Биосинтез торулина и торулародина дрожжами Ph. rodozyma.// Прикладная биохимия и микробиология.-1991.-т.27.- № 4.-541-545.

24. Быховский В.Я., Райдина В.П. и др. Биосинтез порфиринов бактериями рода Arthrobacter.//Прикладная биохимия и микробиология,- 1992.-том 28.-№ 4.-579-590.

25. Буракаева А.Д., Торопова Е.Г. и др. Способ получения красителя.// Патент РФ№ 2016026, С09В 61/00.-1994, БИ №13

26. Гаврилов А.С., Иванин А.Ф и др. Способ получения кристаллического /?-каротина. //Патент РФ№ 211280, С12Р 23/00,- 1998, БИ №16.

27. Мишина И.М., Карнаухова Е.И. и др. Биосинтетическое получение дейтерированных каротиноидов.//Биотехнология.-1993.-№1, 13-17.

28. Феофилова Е.П., Вакулова J1.А.,Тарасова Н.В. Идентификация каротиноидов гриба Bl. trispora. // Прикладная биохимия и микробиология.-1967.-т.-3.-№ 4.-446-449.

29. Алиев Н.Д., Керимов Ю.Б. и др. Получение пищевого красителя.//Патент СССР № 988846, С09 В61/00, БИ № 22.-1983.

30. Yeast to color fish and egg yolks// Genet. Eng. And Biotechnol. Monit.-1990.-№28.-36.

31. Supercritical fluids to extract algae products.// Bioprogress. Technol.-1989.-ll, №9, 1

32. Леонов Б.И., Леонов Г.Б., Руднев Н.Н. Способ получения пищевого красителя.// Патент СССР №126570, С09В 61/00.1961, БИ№22.

33. Черепкин B.C., Болотов В.М.,и др. Способ получения пищевого флавоноидного красителя из растительного сырья.// Патент РФ №2134280, С09 В61/00, БИ№8.-1998.183

34. Бурвич Н.П., Халилов Д.А и др. Способ получения вытяжки из шафрана. //Патент СССР №207313, С09 В61/00, БИ №2.-1968.

35. Асланов С., Таджиев В.Д. и др. Способ получения экстракта каротиноидов.// Патент РФ №2039775, С09 В 61/00, БИ №20.-1995.

36. Каджая М.П. Способ получения красного пищевого красителя из ягод бузины и черной туты.//Патент СССР №277155, С09В61/00, БИ№ 24.-1970.

37. Козуб Г.И., Ковалевский К.А. и др. Способ получения пищевого красителя из выжимок плодов и ягод.//Патент СССР №707947, С09 В61/00, БИ № 1.-1980.

38. Грейвс Ф.А., Геллехер Д.Д. Способ экстракции каротиноидов из каротинсодержащих природных источников. //Патент РФ №2111991, С09 В 61/00, БИ №2.-1998.

39. Квасенков О.И. Способ получения красного пищевого красителя.// Патент РФ № 2061003 С09В 61/00. -1996, БИ №15.

40. Красильникова JI.B., Филиппов В.И. и др. Способ получения концентрата пищевого красителя из свеклы.//Патент РФ № 2061004 С09В 61/00.- 1996, БИ №15.

41. Тоётама корё К.К. Способ очистки желтого красителя, выделенного из плодов Gardenia jasminoides.// Патент Японии С09 В61/00РЖ ИСМ,- 41-9-93.

42. Накадзоно Сюдо, Сато Симэ. Способ получения красного пигмента для пищевых продуктов.// Патент Японии № 4-79387, С09 В 61/00, РЖ ИСМ,- 43-01-95.184

43. Хино кагаку когё К.К. Способ получения дезодорированного красителя из плодов паприки.// Патент Японии №5-49711, РЖ ИСМ.- 43-12-95

44. Каталог ETOL. Пищевые красители для пищевых продуктов, май 1999

45. Г.Бриттон Биохимия природных пигментов. М.гМир, 1986.

46. Асланов С., Вафоев Б.Д., Баранов B.C. Способ получения пищевых красителей из растительного сырья. //Патент РФ № 2001067, С09В 61/00.-1993, БИ № 37 38.

47. Асланов С., Вафоев Б.Д.,Мухамадалиев Б.Д. Способ получения пастообразного свекловичного красителя. //Патент РФ №2001068, С09В 61/00.-1993, БИ№ 37 38.

48. Бирюков В.В., Биттеева М.Б. и др. Штамм Flavobacterium aquatile ВКПН B-7429-продуцент малинового пищевого пигмента. Патент РФ№ 2125071, С09 В61/00.

49. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т./ Под ред. Дж. Хоулта, Н Крига и др.- М.: Мир,1997.-432 е., ил.

50. ГОСТ28178-89. Дрожжи кормовые. Методы испытаний. М.:Гос.ком.СССР по станд.

51. Спирин A.C. Спектрофотометрическое определение количества нуклеиновых кислот // Биохимия.-1955.- т. 23.- вып 5.

52. Леонов Б.И., Руднев Н.М., Лурье И.С. Концентрирование энокрасителя. М.:ЦИНТИпищепром, 1963, №3,8

53. Бокучава М.А. Биохимия производства растительных красителей. Тбилиси, 1975, 97с.

54. Гнеденко Б.В. Курс теории вероятностей.-М.:Наука.-1988.-448с.185

55. А.С.Пригода, А.И.Коренева /Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих //Биотехнология.-1991.-№4.-38 40.

56. Пригода A.C. и др.//Биотехнология.- 1990.- №2.- с 35-39.

57. Патент США 4427658, МКИ3 А61 К 37/00 (НКИ 424/177), 1984.

58. Смирнова А.Г. и др. //Журн. Микробиол. эпидемиолог, иммунобиолог.- 1985.-№12.-с 22-27.

59. Коновалова Е.Ю., Андреева И.В., Пригода A.C.: Тез. докл. конф. «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии». 41.- Махачкала,1990.- с 16-17.

60. Шарп Д., Госни Н., Роули А. Практикум по органической химии. М.:Мир, 1993,240 с.

61. Методы общей бактериологии. В трех томах, т.1 /Под ред. Ф. Герхардта и др., М.:Мир, 1983.- 536 е., ил.

62. Shopfer W.,Jung А. 1935. Compt.rend.Soc.biot., 120,1093.

63. Ю.Е.Ерохин, А.И.нестеров и др.//Микробиология.-1964.-т.33,-вып.6.-951-955

64. Е.П.Феофилова. каротиноиды грибов: биологические функции и практическое использование//Прикладная биохимия и микробиология.-1994.-т.30.-вып. 2.-181-195.

65. О.В.Weeks R.J. Garner. Biosynthesis of carotenoids in Fl. dehydrogenans Arnaudi.//Arhives of Biochemisrtry and Biophysics.-1967,- 121, 35-49.

66. Chu F.S., Lilly V.G.II Mycologia,1960.-52.-80.

67. Nandy S.,Sen C.N. //Can.J.Microbiol.,1963.-9.-603

68. Иерусалимский H.Д. Азотное и витаминное питание микробов. М.-Л., 1949.-167 с.

69. А.С.Пригода, А.И.Коренева, Е.Ю.Коновалова, И.В.Андреева Конструирование бессывороточных питательных сред для186культивирования клеток млекопитающих.//Биотехнология.- 1990.-№2.-35.

70. Мосичев М.С., Складнев A.A., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. М.: Легкая промышленность1982,- 264с.

71. Т. Сенкевич, К-Л Ридель. Молочная сыворотка: переработка и использование в агропромышленном комплексе. Под ред И.И.Митасева. М.: Агропромиздат, 1989. 270 е.: ил., стр 38

72. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов.-М.:Колос.-1997.-288с.,ил.

73. ГОСТ 3898-56 Мука соевая дезодорированная. М.:Изд. станд.

74. Ciegler A.,Arnold М., Anderson R.,1959b. Appl.Microbiol.,7,98

75. Г.Готтшалк Метаболизм бактерий/ пер. с англ. М.: Мир , 1982.■ 310с.

76. С. Дж.Перт Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.-33 1с., ил.

77. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М.:Наука,1985.-290с.

78. Л.А.Вакулова, В.П.Кузнецова, Ф.Б. Колот, И.Б. Бабьева Г.И.Самохвалов. Быстрый метод количественого определения ß-каротина у микрорганизмов.// Микробиология, 1964.-т.33.- вып.6.

79. А.С.Днепровский, ТИ.Темникова. Теоретические основы органической химии. Л.: Химия, 1991, 560 е.,ил.

80. Кавецкий Г.Д., Королев A.B. Процессы и аппараты пищевых производств. М.: Агропроииздат, 1991.- 432 с.

81. Геккелер К.Е., Экштайн X. Аналитические и препаративные лабораторные методы: Справ, изд.: Перев. с нем.- М.: Химия,1994.-416 е.,ил.187

82. К.И.Сакодынский, В.В.Бражников, С.А.Волков, В.Ю. Зельвенский, Э.С.Ганкина, В.Д.Шатц. Аналитическая хроматография. -М.: Химия, 1993.-464с. :ил

83. Чмутов К.В., Хроматография. М.¡Издательство академии наук, 1962.-100с.

84. Ахрем А.А., Кузнецова А.И. Тонкослойная хроматография. М.: Наука, 1965.-175 с.

85. Айвазов Б.В. Введение в хроматографию: Учебн. Пособие для хим.спец.вузов: М.:Высш.шк., 1983.- 240 е.,ил

86. Лурье А.А. Сорбенты и хроматографические ностители. М.:Химия,1972 г., 320 с.

87. Ф.М.Шемякин, Э.С.Мицеловский, Д.В.Романов/ Хроматографический анализ, М.:ГОСХИМИЗДАТ, 1955.-208с.

88. Т.С.Бобкова. Каротиноидные пигменты микобактерий и дрожжей// Микробиология.-1965.-т.34.- вып. 2.- стр.273-277.

89. Z. Simpson, Nakayama Т.О.М., С.О. Chichester Biosynthesis of yeast carotinoid.// J of bacteriology, 1964, 88, 6, 1688-1694

90. Справочник биохимика. Р.Досон, Д.Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. М.: Мир,1991.-545 е., ил.

91. Справочник по биохимии Ф.Л. Калинин, В.П. Лобов, В.А. Жидков., Киев: Наукова думка, 1971, 850с.93. С.A. Bailey, В.Н.

92. Chen/ Simultaneous separation and identification of carotenoids and chlorophylls in turf bermudagrass by high-performance liquid chromatography.// J. of Chromatography.-1988.- vol.455.-396-400.

93. Jensen S. L., Jensen A. Progress in the chemistry of fats and lipids, 1965.-8.-p.2.-129. Pergamon Press.

94. T.W.Goodwin. Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments.Acad. Press, New-York -London.188

95. S. Liaaen Jensen. Bacterial carotenoid.// Acta Chemica Scandinavica.-1972.-V 21.- №7.

96. G.Britton, W.J.S. Lockley, N.J. Patel, T.W. Goodwin. The use of deuterium oxide as a label in studies of biosynthetic pathways.// FEBS Letters,.-1977,- V79.- №2,- 281-283.

97. J.C.B. McDermott, G.Britton, T.W. Goodwin.Shot communications.// Biochem. J.-1973.-134.-11 15-1117.

98. A.J.Castro, A.H.Corwin, F.J. Waxham, A.L.Beilby. Products from Serratia marcescens. //J. oforganic. chemistry,V 24.-1959.-455-459.

99. R.L.Harned The production of prodigiosin by sybmerged growth of Serratia marcescens.//Applied Microbiol.-1954.-V2.-№4.-365-368.

100. A.H. Jackson, G.W. Kenner. Pyrroles and related compounds X. // Tetrahedron.-1967.-V 23,.- 603-632.

101. Williams R.P./ Ph.D.Thesis, Iowa State Univ., Ames.,1965. ЮЗ.Шлегель Т. Общая микробиология: Пер. с нем.-М.:Мир, 1987.-567е., ил.