Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природа возбудителя розового окрашивания зерна ячменя

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Природа возбудителя розового окрашивания зерна ячменя"

~~ п

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

БЕКДАИРОВА Гульгайша Ильясовна

ПРИРОДА ВОЗБУДИТЕЛЯ РОЗОВОГО ОКРАШИВАНИЯ ЗЕРНА ЯЧМЕНЯ

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

РОССИЙСКАЯ

"1 гео:

Работа выполнена во Всероссийском ордена Трудовой Красного Знамени научно-исследовательском институте зернг и (Продуктов его .переработки (ВНИИЗ) ВНПО «Зернопро дунет» в лаборатории защиты от вредителей и санитарно! охраны зерно,продуктов.

Научный руководитель: кандидат биологических наук вед. н. с. Л. С. Львова.

Официальные оппоненты: доктор 'биологических наук профессор Г. Г. Жарикова; кандидат биологических науь Т. Г. Мирчинк.

Ведущее предприятие — Московский технологический институт пищевой промышленности.

Защита, состоится « ."/. 7» ^ 4' . . 1993 г

в « часов на заседании специализированного совета

К-120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская 49, сектор защиты диссертаций ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « № » .«-4-И - /у-V . 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

ст. н. с. ^ Л. В. Мосина

ВВЕДЕНИЕ

■Актуальность, Ячмень - одна из основных эорнових культур,

янроко гопользуемая на продовольственные и кормовнэ цели. Свыше 2,5 млн.г ячменя расходуется ежегодно для выработка круп, 1,4 мли.т-В пнзошрэпнп.

: В последние года на хлебоприэшшэ предприятия Цантрально-Чер-поземпоИ зоны. Северного Кавказа а ряда другж рэггонов поступает ячмень, содержащий зорка о необычной розовой окраской. Так, а Краснодарском крэо в 1389 г. бнло заготовлено 52,9 тыо.г подобного . ячмеая, и Белгородской области- 138 тнс.т.

ЛЬ сведениям, поступающим с хдебоприэмшк предприятий, в партиях ячменя с налЕянэм розовоокраиеннш: зерен наблюдалось снижен® яохожесги, на обусловленное шажоотыо и температурой хранения зерна. Поэтому гакоЗ ячыак'ь, заготовленный как пивоваренный,. часто яэ-гозкагно бнло рзачазогагь по долевому казяатаниэ.

Аномальныэ зэряа яаленя по.своеы внешний признакам близки к розоЕоокрашсинны зернам лефузаршзпоЗ прпрода, встречающимся в пшенице я раз. Особенно широко это заболзванЕЭ распространено ао рзз. В огдэльннэ годы объеш заготовок такого зэряа достигали 1,5 млн. т.

В дэЗсгйУадЕХ стандартах на роль я ячмень отсутствуют ограничения на содержанка розовоокрашэнннх зерношк. Во вновь разработанном с учетом товарной "классификации стандарте на рожь, зведэзш которого отлозено до шля 1993 г,, содержание розовоокрашенннх зерен в продовольственном зерне ограничивается до 3 %. Дм ячменя подобные разработки на проводились.

Возбудитель и зшическая природа розового окрашивания ячменя до настоящего времени не были исследованы. Отсутствуют сведения: о

семейных и гигиенических: показателях такого зерна.

f

Исходя из изложенного чрезвычайно актуальным являетсз уста- . новданЕЭ степени воздействия подобного поражения зерна на здоровье человека и нивотных н на жизнеспособность зерна ячменя.

Научная новизна. Впервые установлено,'что возбудителем розового окрашивания ячменя является грибы из рода Drecbalera (сем. Dauatiacoae ). Показано существование корреляционной зависимости мевду степенью порааення ячменя грийоди рода Dra chalo га и количеством розовоокрашенных зерен.

Доказало, что по химическому строынгв образуемые D. tarea пигменты относятся к антрахиноновым соединениям. Впервые обнаружена способность D. toreo к синтезу хризофанола и катенарша. Показано, что основные компоненты пигментов D.torea и розово-окрашенного ячменя идентичны. Впервые обнаружено прщгадное загрязнен® зерна ячменя ыономернши антрахиноновыми пигментами: катена-рин, хризофадол, аыодин. Установлены оптимальные значения температуры, величины рН, условий освещения и состава питательной среды для. интенсивного пишентообразованпя О- teros . Изучено фшо-

токсшеское действие d. toros на всхокесть 'ячменя. Установ-

j

лены закономерности распределения антрахшоновых пигментов в зерновке и в продуктах переработки розовоокрашенного ячменя. Определена величина ДД50 суммарного пигмента гриба и показано, что антра-хиноновые пигменты относятся к слаботоксичным веществам-

Практическая значимость. Практическая значимость диссертации. -состоит превде всего в том, что представленные в ней данные по ДД50 анграхинонов о. teres , ик концентрациям в товарных партиях зерна и распределению в продуктах переработки мовно рассиат-

- з -

ргдать как обоснование для разработки предельно допустимых концентраций (ЦДК) аятрахинонов в зерне п для нормирования розовоокра-шенннх зареп в ячмене.

Анализ распределения антрахшопов при переработке посаженного зерна позволяет использовать выработку крупы как. способ механического обезвреживания зерна, удаляющий более 95 % антрахинонов.

Отсутствие заметного отрицательного действия грибов pj)rech3lora па яизнеспособнооть ячменя при хранении исключает необходимость -контроля и нормирования поражения ячменя этими грибами в ячмене пивоваренного назначения.

Цель : работе состояла в установлении причини возникновения розового окрашивания и его влияния на семенные . я гигиенические показатели зерна.

Для достижения поставленной цели решались следующее задачи:

о'предоленю вицового состава возбудителей розового окрашивания ячиеня;. • " установление химической природы пигмэнтов;розовоокрашенного ячменя;-

исследование токсикологических свойсга пигментов розовоокра-¡пенного ячмэий;

установяеню влияния инфещш грибов-патогенов на жизнеспособность я^леня яри хранении; ;

опредоленю концентрации пигментов' в производственных партиях ячменя, и нх распределение э основных, и побочных продуктах переработки на продовольственные цели. .

; Апообапия раббт^/Результаты исследований докладывались на 4 Международной микологическом, конгрессе, Регенсбург, 1990 г.;

Всесоюзном.совещании "Бвэхшея хранения е переработка зерна", Алма-Ата, 1990г.; научной конференция, посвященной 60-дегш МТЕШ, Москва, 1991г.г Ученом Совете ЕНИИВ, Нооква, 1982т,

Публикадри. Do материалам диссертации опублшсогаяо 3 дачаткш: работы.

Объем рабогн. Диссаргадшаная работа соохоьт на введения, обзора лкгоратури, методической частк, эксдершенташюй части, влядов, списка использованной лыература, пршюЕОНЕй. Работа ез~ лоаена на S0 страницах мангаонксного гоксхб, содервЕТ II рвоун-ков и 22 таблицы. Бкблшграфш вклжаат 79 нашонованна, es ees 35 - шосхралкыэ работк.

Обгвкти и метода ссследованш

Объектов наследованы 'евдйлось зерно ячменя,: шешцее розовую окраску нефувергогшаго Ероксхааденвя.

Для шучввш шщюбЕмюгтесккЕ, токсшолопявскик к сеаен-ньк показателей бало отобрало 105 проб явденя с содергшЕзы розова зерен 0,9 % - 10,4 %. Пробы Берна, отбгфалн по ГОСТ 13586.3-83

от партий ячменя, содершвдх рововоокрашюшэ зерна, хюотуиешшх

i -

на хлебонршынЕЗ нрэдпрвятия в'хранши&хся на токах совхозов ж . колхозов в Белгородской, КалуЕОЕОЙе Курской н. Липецкой областях в яервэд IS88-I992 гг.. ,

Лабораторные опытн по Езз?чепш сэкашшх свойств розовоокра- ■ шшшх зерой проводит на пробах свзиоубранного ячмоня урокая ISSO-IS9I гг. р отобранных на хоказ: колхозов в Белгородской область

Для усгаяоатвнш закономоркостп распространены! ртзснха в аорновко ячменя в лабораторных- условиях проводили послойное удаленно цветковой, плодовой в сашиной оболочек sa счзг шелушения н

шлзйовангл поракешюго зерна. Опыты осуществляли на лабораторных нлщювальной и шелушильной машинах. Перерабатывали 2 пробы ячменя с различным содержанием розовоокрашенньк зерен из Белгородской области.

Внугреню» шфэкщдо грибов в зерно определяли лугом раскладкп на среду Чапэка. ига другие агаркзовапшо среды 100 зерен после их стерилизации в течение Г-2 минут раствором сулемы (1:1000) и последующей 3-х кратной промывки стерильной водой. Посевы в чакках Петри инкубировали при 25 °С 7-10 дней в темноте. Дня стимулирования спорообразования использовали культивирование грибов в пластиковых чашках Потри при облучении УФ-светом.

Чистые культуры грибов выделяли из колоний, .обраставших вокруг зерен, методом "сухой иглн" ляп путем пересева, мицелия. Выделенные чистые культуры грибов хранили на агаризовашюй среда Чапека в пробирках.при-8 - 10°С, в.темноте.

Возбудителей розового опрашивания! выделяли такго яз оболочзп зерна под микроскопом с помощыз жгли п накромалгпулятора.

. Щзнп^ЕкацЕЮ гргбов из класса DautearosQ'oatsa , ссиэй-ства Dsnatiacoao а группы порядка Dycalia otorilla проводили на питательных средах:, агаре Чапека, су'сло-агаре, глюкозо-дровжевом агаре.

Для выявления морфогенеза, в Частности, конидшгэлеза ггфо-мщетов'использовали культивирование грибов на предметных стеклах, так называемые "нивые препараты". Яри изучении темноокрашенных гифомицетов прибегали к методу просветления молочной, кислотой.

Чистые культуры мпкромицетов идентифицировали до рода и ввда,. используя известные руководства: Дзщошгашсо (1953)., Литвинов-(1967),

Etais (1971), Хасанов (1992).

Для количественного и качественного определения анграхиноно-вых пигментов в зерне бил разработан метод, основанный на тонкослойной хроматографии (ТСХ). Количественное определение основыва.-лось на сравненЕи интенсивности флуоресценции определяемых нигызн-тов на хромагограмш в сравнении со стандартом 2-меткл-1,4,5,7--тетрагццрокси-антрахшона (катенарина).

Для ввделения сирого препарата пигментов Q,tarâa гриб культивировали 20 суток при 24°С на. авгоклавнрованном-рисе. Пигмент экстрагировали ацетоном. Экстракт упаривали, обезжиривали гексаном и освобождали от водорастворимых прилейей. Сырой препарат пигментов концентрировали за счет переосаждени'й'в'воде и перекристаллизации из горячего мэг анода.

При изучении условий культивирования интенсивность накопления пигментов в культуре грибов определяли на спектрофотометре

Hitachi по интенсивности поглощения при 490 нм и 523 нм, исходя из спектра поглощения суммы пигментов грибов.

Влажность зерна определяли по ГОСТ 13586.5-83. Всхожесть и энергию прорастания - по•Г0СТ/12038-84. Устойчивость розовоокра-щенного ячменя при хранении изучали с использованием методики ускоренного старения (Лихачев, 1978).

Фкготоксическую активность грибных метаболитов определяли методом биопробы на. семенах растений поБкдай (1973), бактерицидную-активность - ПО; Cléments (1968) и BtaCÎ et al(1975).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по Д.А.Доспехову (1973) и Х.Шенн (1972), а также по программе од-нофакгорного дисперсионного'анализа с нахождением НСР05, реализованной на Эй.!. ■

Работа выполнена на базе ВНШЗ, часть экспериментальных результатов получена в ИБФМ РАН (г. Пущино), в САНИШг (г. Ташкент) и в Ереванском государственном университете.

' РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Установление видовой принадлежности стерильного мицелия. вьщеленного из зерен розовоокрашенного ячменя

Для выяснения истинной природы розово-красной окраски зерен ячменя было проведено микроскопическое исследование их оболочек; Было установлено, что окраска оболочек обусловлена пигментом, вьщеленньм мицелием неизвестного гриба, не образующего на зерне органов спороношения. Отложение пигмента происходит в некоторых участках мицелия на наружной поверхности гифов. Пигмент кристаллизуется а виде игл, которые потом образуют на мицелии гранулы и "муфты" оранжевого, красного или кирпично-красного цвета, придающие оболочкам зерна розово-красную окраску.

С простерилизованных (0,1 % раствор HgCl2 ; I мин) розово-красных зерен''были сняты цветочные и плодовые оболочки и разложены на агар Чапека. Окраиенные целые зерновки после поверхностной- стерилизации также были высеяны на агар Чапека. Выросшие пигментированные изоляты грибов были вццелены в чистуюокульту-РУ-

Всего было изолировано около 150 изолятов, способных образовывать красные пигменты разных оттенков и разной степени . 'интенсивности» Изоляты по характеру.роста,-окрашиванию, и спо-роношению были разделены на несколько групп. ■ . .

Изоляты первой группы давали спороношение, характерное для видов рода Др1соссша . Пигменты'этих,грибов имели желто-оранжевый цвет, были растворимы-в питательной, среде.

Вторую группу составляли розово-малиновые колонии грибов» относящиеся к вида»? рода Гипаг1ш: . Малиновый пигмент этих изолятов также растворялся в питательной среда.

Третья большая группа изолятов на образовывала органов спороношения при культивировании в стандартных условиях (темнота, агар Чапека, 22 °С)'. Вишнево-красный или кирпично-крас-ный пигмент, образуемый ими, не растворялся в питательной среде и внешне напоминал скопление кристаллов, наблюдавшиеся в оболочках окрашенных зерновок (Ордлн, 1973), Эти.грибы были предварительно отнесены к группе Цд-сеНа. аЬвгШа.»

Для стимуляции спорообразования изоляты третьей группы культивировали на 13 различных питательных средах. Кроме того, варьировали температурные режимы культивирования (19 °С, 24 °С, 27 °С) и условия освещения: темнота, У2 свет. ( Л =360-330 нм), лампа дневного света.

Морфолого-культуральные признаки стерильных изолятов "третьей группы на различных средах значительно видоизменялись. Изоляты отличались топографией колоний, скоростью роста, интенсивностью образования протоперятеднеа и пикнид, способностью выделять в среду пигменты прко-красного, кирпичного, оранжевого цветов. По структуре колонии были гладкими, шерстистыми или со снопообразными выростами мицелия в середине или по всей поверхности колонии.

Цвет колоний - кирпично-красный. Окраска обусловлена оранжево-красным пигментом, скопления кристаллов которого покрывали отдельные участки гиф субстратного мицелия или были разбросаны в субстрате, причем пигмент не растворялся в питательной среде. При старении культуры в окраске колоний • начинали преобладать, фиолетовые и оливковые тона.

На 6-ой день культивирования у большинства изолятов наблюдалось образование спор.

По морфологии органов спороноаения,- размерам конидий спорообразующив иэоляты были определены кап ВгесЬаХвга tвгaв (Засс) ЗЬоод. Это било подтверждено инокуляцией вегетирую-щих растений ячмонч исследуемыми исолятами, при этом наблюдали признаки поражения .характерные для вида в, Ъогзв.

Единичные иэоляты по морфологическим признакам органов опоронсиения были определены как вид. РгэаЬв1вга щгап1паа С ВаЬ. ах ВоЫвоМ ) ВЬоеи.

Следующее доказательство связи гриба ЭгэсЬз1вга с образованием розовых зерновок ячменя било получено при микологическом анализе фракций аномально окрашенных зерен, отобранных из пробы ячменя Нутанс 518, выращенной в 1990 г. в Белгородской области (табл. I).

Если во внешне нормальном ячмене Х)гвоЬя1вга поражала только 6 % семян, то в темном его численность резко возрастала (33 кол/100 семян) и был р. максимальной в розовых зернах (59 кол/100 семян). Численность других видов, способных образовывать роэсво-красныа пигменты, напротив снижалась в темных и розовых зерновках. В данном случае речь вдет о видах родов а таг 1л, Ер1соосша, :?изах1иа.

Следует подчеркнуть, Что и розовая и темная окраска зерновок ячменя обусловлена поражением одними и теми уе или близкими патогенами из рода ВгвоЬв1вга Ко . Можно предположить, что при старении грибов происходит окисление и компенсация антрахинонов, превращение их в темноокрашенные слаборастворимые соединения типа меланинов.

Никофдора нормальных, теуяоокрапепккт z розовоокразеннкх • зерновок ячг.;опя (колонп5/100 зорэн)

Характер окра скг. зерна Ойщее .колсте-сгво грпбов Alternarla ерр» Стергль-кки МЩЭЛЕЗ Drechsle- Eipola- Spiro. врр. riв во- соссца rokinift- spp. na ?usaziua врр. Прочив

Нормальное 88 32 14 6 18 10 8 0 ■

тезисе 91 17 18 33 6 14 г I ►-i . о

Розовое' I0G 13 IS 59 4 8 2 I i

Подобные процессы наблюдались наш при культивировании на агариэованных средах,

Таким образом, темнее и розовые зерна этиологически близки и являются проявлениями одного или близких заболеваний ячменя, вызываемых грибами рода Dreohßlera . Этот вывод был подтвержден при микробиологическом анализе 9 проб ячменя, отобранных от товарных партий на хлебоприемных предприятиях ЦЧО (табл.2);

Пробы характеризовались разным содержанием розовоокрашен-ных зерен (0,9-7,0 %). Одновременно во всех пробах присутствовали зерна с чёрно-коричневыми лаковыми пятнами. Часто оба вида окраски сопутствовали друг другу.

По мере увеличения содержания розовых зерен нарастала общая численность грибов. Увеличение происходило более всего за счет рода Dreohalera, Зависимость между поражением пробы грибами рода Drechslern и количеством розовых зерен приближалось к прямой линейной (г=0,980).

Возможно и совместное поражение зерновок Drechsiera ер. и В. aorokiaiana (г=0,57б). Повидимсму, виды В» aorokiniana такяе могут принимать в некоторых случаях участив в формировании розового и, в особенности, чёрнс-коричневого окрашивания зерновок (г=0,726). Виды Spicoccum и Fusarlun не играют никакой роли в появлении данного рода окрашивания зерновок ячменя.

Представители родог Drechslera и Bipolarls изБвстны как продуценты антрахиноновых пигментов ( üöno , 1984; Anke et а! , i960). Поэтому в дальнейшем для подтверждения роли грибов рода Drechalora в возникновении окрашивания зерна был проведен сравнительный анализ пигментов грибов и зерна.

Идентификация компонентов состава пигментов розовоокрашенного зерна ячыоня и гриба Р. teyea

¿йсофяора проб ячг»:эзяр содзртсац^х и

Га Г-.::лз 2

; герлозкп

Содержание зерен, % о ,1 ; \ КС-лог зср эк)

пп розово- окрашен- ннх гемнс- скрашен- ных суммарное орр» ЕфзоНа окегЗ.- ЕАр-эХсхДа оогоЫ-ЕДсжа алога орр«, Бр1ссв- врр. ^шг Quri.ua

I ■ . 0,9 . 398 4,7 , 41 ' 20 33 3 2 I

2 • 1,7 ХД - 2,8 28 18 34 7 3 7

3 1,8 1,0 2,8 37 'Т7 15 12 2 3

/• 1,8 1,4 3,2 28 8 25 II 3 II

5 2,0 2,4 48 16 9 25 0 0

с 2,8 3,5 * О 13 ■ 53 22 0 5

7 2,9 1,6 4,5 33 31 6 20 I 0

8 3,9 3,3 7,2 II 12 32 2Э 0 I

9 7,0 2,4 9,4 63 8 61 46 5 х

I

л.

При качественном анализе вьщоленного препарата методом ТСХ пшю установлено, что он состоит из 9 индивидуальных соединений.

Для грубого деления пигмента грибов на компоненты г сухого вещества растворяли я I мл смеси гексан-ацетон (4:1) и ¡лгиосили ого на колонку ¿,0x^5 см, заполненную силикагелем Нагск

н уравновешенна указанной смесью. Элюирование вели той :;:<з системой. Отбирали 3 фракции: I (соединения 1-3), П (соединения 4.-5), Ш (соединения 6-9).

фракцию Л после упаривания переиристаллизовысали из горячего этилового спирта (или но смеси ацогонгекиан). Внпавшш красные кристаллы (0,05*1 г, ¿6 %) ссодииення 4 имели 'Г -¿47 °С. Дальнейшее разделение соединений франции 1, маточного раствора фракции 11 н франции Ш осуществляли высокоэффективной ТСХ на пластинках П.1о91о;а1 60 (1!«ок, ФРГ). Проявление вели а системе гвксан:эфир:уксусная кислота (44:^7:1). В ряда случаен компонентный состав определяли на денситометре СЬхотсшоап-ЮО по поглощении при 4/10 юл (жёлтые фракции) и 5<:0 нм (красные франции).

Для соединений 2,3,4,5 н 7 были сняты масс-спектры, позволяющие определить их молекулярную массу, а для соединений 3,4.. н 5 полнены также спектры поглощения в УЭ-видимой области и спектры ^Н-ЛМР.

На основании типичной окраски, характера её изменения в парах ^Нд, по характерным масс-спектрам все выделенные компоненты пигмента отнесены нами к гндроксипромзводным метилантрахи-нона.

я3 о в2.

Из 9-ти соединений, составляющих выделенный пигмент, нами установлена структура 3-х: хризофанол 3, эмодин 5 и катена-рин 4, который является основным компонентом пигмента. Малые количества остальных минорных соединений не позволили окончательно установить их структуру, однако полученные физико-химические данные позволяют отнести их к гидроксипроизводным мети-лантрахинона.

Ввиду относительно низкого содержания пигментов б ячмене не представлялось возможным выделить и очистить их из зерна в количествах, достаточных для выполнения всего комплекса физико-химических анализов, необходимых для установления структуры соединений.

Идентификацию пигментов розовоокраиенного зерна проводили на основании сравнения их хроматографических, спектральных и • спектрально-люминесцентных характеристик с аналогичными характеристиками антрахиноновых пигментов гриба !>• teres.

Было установлено, что комплекс окрашенных соединений в розо-воокрашенном и тёмноокрашенном зёрнах ячменя состоял, также как и у D* teres из 7-9 окрашенных соединений. Хроматографическая подвижность, цвет на хроматограммах в видимом и УФ-свете, а также после обработки в парах аммиака были идентичными для пигментов зерна и гриба.

Компонентный состав пигментоЕ был такяе достаточно близким. Основным компонентом пигментов зерна являлось вещество, близкое по Е^катенарину. С помощью препаративной ТСХ основные соединения былч выделены из зерна и охарактеризованы по электронным спектрам; последние полостью совпадали со спектральными характеристиками хризофанола, кагенарина и эмодина. Таким образом в . розовом и тёмноокрашенном ячмене был обнаружен близкий состав пигментов.

Для дополнительного подтверждения идентичности пигментов розового зерна и В* tarea были проведены спектрально-люминесцентные исследования окрашенных оболочек и соединения 5 (кате-нарина), являющегося основным компонентом пигмента гриба. Спектр люминесценции катенарина, снятый непосредственно на,хроматограм-ме при 77К (Да 435 нм ), имел только один максимум излучения з области 590 ны. Аналогичный максимум наблюдался и в спектре люминесценции оболочек роэовоокрашенного зерна. Спектры возбужде ния катенарина и оболочек окрашенного зерна также имели общий максимум при 435 ни. Таким образом, наблюдалось совпадение спектрально-люминесцентных характеристик катенарина и оболочек окрашенного зерна ячменя.

Для установления уровней загрязнения ячменя в природных условиях нами было исследовано содержание антрахиноновых пигментов в 9 пробах, отобранных от производственных партий и содержащих 0,9-7,0$ розовоокрашенных и 1,0-3,8% темноокрашенных зерен. В пробах определяли концентрацию основного пигмента - катенарина. Результаты анализа показали, что между содержанием розовоокрашенных зерновок и концентрацией катенарина тлеется корреляционная зависимость ( г >«0,835 ), существенная при Р ■ 0,95. Между содержанием темноокрашенных зерновок и концентрацией катенарина связь несущественна ( г =0,121 ). Антрахиноновые пигменты накапливаются грибаии и во внешне нормальноокрашенных зерновках. Ранее нами было показано, что в пораженной партии в таких зерновках также может присутствовать инфекция D* terea , которая и образует незначительные количества пигмента, маскируемые оболочками ячменя. Таким образом, в природных пробах ячменя максимальное количество антрахиноновых пигментов было обнаружено в розовоокра-

шейных и темноокрашенных зернах.

Факторы, регулирующие образование in t-¡ антрахнноновых пигментов п. tama

Образование пигментов, являющихся пторичными метаболитами многих грибов, регулируется комплексом факторов, из числа которых решающее значение имеют температура, кислотность среды, освещение, химический состав субстрата.

Для выяснения влияния состава питательной среды на пигмен-тообрпзованиа D. teres нами били использованы следующий источники углерода, вводимые эквимолярно в среду Чапека: глюкоза, фруктоза, мальтоза, сахароза. Сравнивая визуально колонии грибов на агаре Чапека с указанными источниками углерода, мы установили, что наиболее интенсивное пигментообразование (оранжево-красноо) наблюдалось нп агаре Чапека с глюкозой.

Условия освещения заметно отражались на интенсивности образования пигментов D» teree . Дневной свет подавлял синтез ан-трахинонов, и ускорял их ыетаболизацию. Наблюдалось быстрое потемнение колонии и превращение красных пигментов в фиолетово-' бурые и коричневые соединения, вероятно, меланкны.

Таким образом, в последующих опытах D» teros культивиро-рали в темноте на агаре Чапека с глюкозой.. ■

Оптимизация условий культивирования не являлось самоцелью,, она позволяла в дальнейшем добиться максимального выхода пигмента из культуры D* teres , необходимого для исследования химического состава и токсичности пигмента.

Температурный оптшум для накопления антрахиноновых пигментоЕ находился при 24°С. Максимальное количество пигмента было обнаружено на 21-е сутки культивирования. Снижение температуры культивирования до 15°С существенно подавляло и пигменгообра-

копание. При повышении температуры до 27-30°С интенсивность накопления антрахинонов был а достаточно высокой, максимум пиг-'■'■ятообразоЕания достигался раньше (на 15-18-а сутки), чем при 1О0. После достижения максимума наблюдалось снижение концентрации пигментов. Это может бить связано с дальнейшим включением -антрахинонов в обмен веществ грибов, в частности, их превращение в теыноокра;аенные пигменты за счет процессов конденсации и окисления. Действительно, в стареющих культурах оранжево-красное окрашивание колоний переходит в красио-флолетовоо и затем п фиолетово-бурое.

Оптимальная кислотность питательной среди для накопления антрахиионовых пигментов находилась в пределах рН 5,0-5,5. Как дальнейшее подкисление, так и подщелачивание среды резко уменьшала выход пигментов. Так, на среде с рН 3 пигментообразование было крайне слабым.

Влияние влажности субстрата на синтез пигментов I). ъвгеэ изучали в опытес зерном свекоубранного ячменя разной влажности. В результате эксперимента было установлено, что оптимальными условиями для образования антрахиионовых пигментов в ячмене является влажность зерна 30%. Нарастание содержания микотоксинов происходит с увеличением влажности зерна от ¡¿0 % до 30 %. При влажности зерна 17,5 % и менее токсинообраэование не наблюдалось.

Следовательно, подобно всем полевым грибам, виды ВгесЬв1вга требуют для своего развития очень высокой влажности субстрата, равновесной с относительной влажностью воздуха 95 % и более.Это объясняется тем, что эти грибы относятся к факультативным паразитам и приспособлены к существованию на живом вегетирующем растении в поле.Условия влажности, создающиеся при хранении зерна, исключают возможность развития грибов рода 1)гесЬз1ага и накопление пигментов в зерне при хранении.

Фитотокоичэокпе свойства т>. ^пт-яя

Фитотоксшш, продуцируемые многими фитопатогенными-грибами, являются важным фактором развития болезной растений.

Антрахиноновыэ пигменты, продуцируемые D, teres , возможно, также играют определенную роль в патогенезе растений. Обладая токсическим действием, они могут сникать жизнеспособность семян и рост проростков.

Целью нашего эксперимента было изучение влияния антрахиноно-вых пигментов на способность семян к прорастанию. При решении это] задачи мы проверяли фитогоксическое действие комплекса веществ, выделяемых D» teres в жидкую среду, и препаратов пигментов гриба, присутствие которых в производственных пробах часто связывают с потерей- всхожести семян.

Б культуралъной жидкости штамма D. tores Сом-6 не бшсо обна,-руяено веществ, обладающих фитотоксщеским действием. Наблвдавшэ-еся снижение всхояеоти зерен, угнетение ростков и корней растения было незначительным и недостоверным.

Одним из действующих начал гриба с» texos являются антрахиноновыэ пигменты. Поэтому ыы считали нужным определить всхокеси ячменя при концентрациях пигментов, близких к реально встречающимся в зерне (2 мг/кг), а'также намного превосходящих их (10 мг/кг и 50 мг/кг). Поскольку пигмент в таких концентрациях в воде не растворяется, мы подщелачивали воду до рН 10,4. Подобно многим полифенолам, анграхшоны способны в щелочной среде образовывать , феноляты, растворимые в воде. Токсичность пигмента определяли до ростовым эффектам. При концентрации пигмента 2 мг/кг всхокесть зорен не отличалась от, контроля, с увеличением концентрации до

10 мг/кг намечалась тенденция к ее снижению, а при более высокой концентрации (50 мг/кг) всхожесть резко падала.

Из результатов математической обработки следует, что достоверное снижение дгаш ростков наблюдалось лишь при концентращш пит- • ыонта 7,0 мг/кг, а корней - при 9,0 мг/кг. Следует отметить, подобные концентрации пигментов в зерно встречаются крайне редко, лишь в исключительно сильно пораженных зерновках.

Гакш образом* как комплекс вырабатываемых веществ О^огва так к аитрахшоповыз всщестЕа, образуемые эии ввдои грибов, обладают слабщ фиготоксическпм действием. Следует подчеркнуть, что в средних концентрациях, близких к встречающимся в природных условиях в зерне, пигмент не оказывал достоверного влияния ни на всхожесть, ни на длину ростков и корней' семян ячменя и красного редиса.

•

Изменение семенннх свойств позовоокрашенного ячменя при хранении

Устойчивость при хранении оемян ячменя с содержанием розово-окрашенных зерен изучали методом ускоренного старения (Лихачев, 1978), а гак&е в лабораторных опытах по хранению при различных влажноорннх и температурных режимах.

Отобранные фракции розовоокрашенных и гемноокрашенних семян ячменя влажностью 13,2 % были заложены на хранение при гемперэ.туре

и относительной влажности 80 т.е. при параметрах ускоряющих естественные процессы старения зерна.. При закладке на хранение и через каадце 10 дней определяли энергию прорастания и всхожесть.

В результате опыта было установлено, что семенные свойства розовоокрашенных и темноокрашенных зерен и контрольного варианта начинали снижаться .после ¿0 дней хранения. Процессы старения,при-

водящие к ухудшению семенных свойств„ протекали одинаково как в опытах, так и в контрольных пробах.

Данный вывод был подтвержден в лабораторном опыте по хранзниэ семян. Опыт был поставлен с пробой ячменя с содержанием рооовоокра-шенных и темноокрашвниах зерен 6,4 и 1,6 % соответственно* ПроЗы влажностью 14,3 и 15,9 % хранили при температурах 20,30 °Г> и агок-лянной таре.

При хранении зорна илакностью 14,3 и 15,9 % при тешзра'гуро 30 °С падение всхожести наблюдалось с основном через 1-2 надели. Различия между контрольным и опытным вариантами не были установлены. При более низкой температуре (20 °С) у зерен влажностью 15,9 % семенные свойства не снижались в течение 2,5 3 месяцев, а у аэрон влажностью 14,3 % сохранялись без изменений в течение 7 месяцаи. Достоверных различий между контрольным и опытным вариантами не наблюдалось. Таким образом, поражение зерна ячменя грибами рода

Brechslera не приводило к ухудшению его семенных свойств при хранении в условиях, близких к создающиеся в послеуборочный период.

Исследование биологической активности розового пигмента D.teres в опытах с белыми мышами и тест-организма:,ш.

Для оценки биологической активности был ввделвн суммарны?] препарат пигмента изолята гриба D. teres Сом-6. В качестве тест* объектов были использованы следующие организмы: личинки жаброного рачка Arfcemia salina , являющихся чувствительным тестом на присутствие ряда ыикотоксинов; Bacillus megateriuia M-I, 394; белые мыши (внутрибрюшинное введение хлороформного раствора.пигмента). Пигмент проявил слабо выраженную биологическую активность по отношению к использованным тест-организмам (слабую токсичность при вну-трибрюшинном введении мышам и низкую бактерицидную активность).

Величина ЛД^ пигмента при внутрибрюшинном введении хлороформ-

кого раствора бельм мышам составила 530 мг на кг веса животного, т.о. пигаонт относится к очень малотокснчнш соединениям. Достаточно сравнить с афлагоксинои Bj, для которого величина ДЦ50 колеблется для раэнык животных в пределах 0,3-17,9 мг/кг веса животного. Подобные результаты по оценке степени токсичности суммарного пигмента

\

гриба D« toras были получены в лаборатории знзимологин Института питания РЛШ.

Распределенив пигментов В» teras в зерновке ячменя.Опыты

по вояушенир к шлифовании розовоокрашанного ячменя.

Б настоящем опыте исследовали проникновение мицелия гриба |)« tarea ¡1 ео ¡мтаболитоз в различии® анатомические части зерновки с цельо спрвджнмя стспонн бозврзднссти продуктов переработки ро-говоокргпз:с!сго стиэнл продовольственного значения. Распределение швдзяия гриба н ого метаболитов издали при последовательном удалении цватковкх, плодеске и свисших оболочек в" зорне ячменя за счет использования тчшюлогичэскгсс приемов шелушения и шлифования. Изцветковые оболочки (лузгу) приходилось 43,1 % всей ыассы пигмента. В плодопш: и семенных o5ojro*mx, сеставлтщюг' основу мучки, было обнарукено 39,3 % пигмента. В звдоеперлэ ззриа (ядре) после шелушения п туфвтт оставалось позначительнее количество антрахино-нов - 2,6 %. Полусонные результата хоропо согласуется е данными микроскопического анализе, показывающего» что резозый мицелий, пргмад,-лвяаазйЗ грибу-патогену, сосредоточен в ловгрягостикх слоях зерновки ппненя, з основном - в цветковых и'плодовых оболочках.,

ВЫВОДЫ'

I. Установлено, что возбудителем широко распространенного заболевания ячменя, приводящего к образовании розовоокрашенных зерен, тпляются виды несовершенных грибов из класса Bautexomycetes 5емейства Dematiacoaa1 Draohßlora tares ( Sacc ) Shoea. и Drechsloga gramínea < Hab. ьх Schlecht .) Shoea.

1.1. Показано существование тесной положительной корреляционной зависимости мевду степенью поражения ячменя грибами рода Dxachalera и количеством розовоокрашенных зерен.

1.2. Причиной порозовения зерновок ячменя является образован» пигментов мицелием грибов рода Drech3lera , которые развиваются преимущественно в цветковых, плодовых и семенных оболочках; в эндосперм мицелий гриба практически не проникает.

1.3. Интенсивность пигментообразования D. tares зависит от состава питательной среды, величины рН, температуры и условий освещения. При культивировании D» teres на агаре Чапека с глюкозой ( рН 5,5 , температура 24°С, темнота) создаются условия для наиболее интенсивного пигментообразования.

2. Выявлено, что розовый пигмент D» teros состоит из 9 компонентов, являющихся гидроксипроизводными антрахинонов. Три основных компонента идентифицированы как антрахиноновые пигменты - хризофанол, эмодин, кагенарин. s

2.1. На основании сравнения хроматографических, спектральных и спектрально-люминесцентных: характеристик пигментов роэовоокрашенных зерен ячменя и мицелия D. teres была установлена их идентичность. -

2.2. Природное загрязнение, зерна ячменя мономерными антрахи-ноновыми пигментами ( катенарином, хризофанолом, эыодином ) обнаружено впервые.

3. Гриб D. taras синтезирует антрахиноновые пигменты на зерне лишь при его высокой влажности (30$), что исключает накопление антрахинонов и порозование зерна при хранении.

4. Антрахиноновые пигменты локализованы в поверхностных слоях

зерновки, основная их масса сосредоточена в цветковой пленке ( 43,1 % ), в-плодовой и семенной ( 38,3.58 ). В эндосперме обнаружено только 2,8 %■ суммы пигментов в зерна.

5. Антрахиноновые пигменты D» Ъэхвз в концентрациях, близких встречающимся в природных условиях в зерне, не оказывали достоверного влияния на всхожесть семян, а также на длину ростков и корней ячменя и красного редиса.

6. Поражение зерна ячменя грибами рода Drochalara не приводило к ухудшению его семенных свойств при хранении.

7. Показано; что пигмент гриба D. Ьэтов относится к малотоксичным соединениям, проявляет низкую бактерицидную активность ПО отношению к тест объектам Bacillus magatarium и Artemia oalim и слабуэ токсичность при внутрибрюшинном введении мышам. Величина ЛД^ составила 530 ыг/кг веса животного.

По.теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Iivova I/.S., Sbovcbenko V.l., Orlova Ii.У., Bakdairova G.I.

The natura of nonacabby pink karaals of rya and barley. //

Fourth International Mycological Congress. Abstracts.- Bsgonsbarg, 1990.

2. ЛьвоваЛ.С., Орлова Н.Ю./Бекдаирова Г.И., Хасанов Б.А., Глухова Л.А. Розовоокрапнный ячмень: возбудитель и химическая природа пигментов// Труды ВНИЗ. - 1991. - вып. 117. -с. 52-55.

3. Львова Л.С., Бекдаирова Г.И., Шевченко В.И., Орлова Н.Ю. Антрахиноновые соединения - новый класс токсических веществ, образуемых микроскопическими грибами в созревающем зерне // Тезисы докладов научной конференции "Научное обеспечение хранения и переработки растительного сырья в пищевой промышленности". -Москва, 1991. -с. 23-24.