Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение антибиотических веществ из разных сортов ячменя и исследование их биологического действия

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Выделение антибиотических веществ из разных сортов ячменя и исследование их биологического действия"

На правах рукописи

Кулешова Екатерина Сергеевна

ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ИЗ РАЗНЫХ СОРТОВ ЯЧМЕНЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ¡"ОН 2014

Воронеж-2014 г.

005549607

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Павловская Нинэль Ефимовна

Официальные оппоненты:

Корнеева Ольга Сергеевна

доктор биологических наук, профессор, Воронежский государственный университет инженерных технологий, кафедра микробиологии и биохимии, зав. кафедрой.

Корниенко Надежда Николаевна

кандидат биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Госуниверситет — УНПК», кафедра технологии и товароведения продуктов питания, доцент

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Брянский государственный

университет им. академика И.Г. Петровского»

Защита состоится «01» июля 2014 года в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета и на сайте http://www.science. vsu.ru

Автореферат разослан »014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Брехова Любовь Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сложившаяся к настоящему времени в России критическая ситуация с производством антибиотиков диктует необходимость изыскания новых источников для их выделения и производства. По прогнозам маркетологов, в ближайшие годы ожидается падение российского производства антибиотиков. Основными причинами являются изношенность основных фондов, морально устаревшая номенклатура субстанций в условиях необходимости создания новых более эффективных лекарств, мощная конкуренция со стороны зарубежных производителей. Требуется усилить исследования по поиску веществ, обладающих антимикробной и антивирусной активностью. Источниками получения подобных веществ, кроме микроорганизмов, являются растения и в том числе злаковые, к которым относится ячмень.

Ячмень отличается повышенным содержанием антивирусных и антибактериальных веществ, в том числе лизина и гордецина. В связи с этим ячменные отвары и настои являются популярным средством народной медицины для лечения грибковых и воспалительных заболеваний кожи, желудочно-кишечного тракта и органов дыхания. Зерна ячменя служат сырьем для производства бактерицидных и противовирусных фармацевтических препаратов. В середине прошлого века Новогельновым Н.В. и Ежовым И.С. (1957) из солодовой воды на пивоваренном заводе был выделен гордецин и установлена его химическая структура, проведены исследования его влияния на патогенную микрофлору. Однако исследования были свернуты и это интересное и перспективное вещество предано забвению.

Цели и задачи исследований. Целью данной работы было выявление источника гордецина и получение антимикробных веществ из плесени, образующейся на корнях ячменя.

Для достижения цели решались следующие задачи:

- Провести скрининг генотипов ячменя коллекции Всероссийского института растениеводства на наличие гордецина.

- Установить видовую принадлежность плесени и бактериальной обсемененности на корнях ячменя.

- Выявить наличие антибиотиков в корневой плесени ячменя.

- Провести исследования биологической активности антибиотиков на растительных тканях.

- Изучить влияние гордецина на активность антиоксидантных ферментов гороха.

- Выявить связь между содержанием антибиотиков и устойчивостью ячменя к болезням.

Научная новизна работы. Впервые проведен скрининг генотипов ячменя из коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова на содержание

антибиотических веществ. Разброс данных по генотипам составляет о 1 - 12 мг/%. Разработана оригинальная методика выделения гордецина из малых проб зерна ячменя и высокоэффективная жидкостная хроматография для очистки гордецина. Гордецин в условиях снятия масс-спектра переходит в окисленную форму. Впервые установлено, что развитие плесени на корнях различных генотипов ячменя обратно пропорционально содержанию гордецина в зерновках и строго повторяется по образцам. Установлена избирательность действия гордецина на возбудителя корневых гнилей Fusarium oxsyspontm.

Практическая значимость паботы. Выявленная четкая зависимость между содержанием гордецина, полеганием и устойчивостью к грибным заболеваниям у отдельных генотипов дает возможность отбора соответствующих по данным признакам образцов для включения их в селекционную программу создания устойчивых сортов ячменя. У инфицированных проростков гороха гордецин оказывает избирательное действие на гриб Fusarium oxysporum, угнетая его развитие и оказывая выздоравливающее влияние на больные проростки гороха, что дает основание отнести гордецин к компоненту защиты клеток растений от возбудителя корневых гнилей и увядания. Гордецин может стать компонентом для создания новых биологических средств защиты растений.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии Орловского государственного аграрного университета при чтении лекций по физиологии, биохимии, микробиологии, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на региональных конференциях. Они были представлены на международной научно-практической конференции « Инновации аграрной науки и производства» (Орел, 2011); региональной научно-практической конференции молодых ученых « АПК в современном мире: взгляд научной молодежи» (Орел,2011); международной конференции «Биология-наука 21 века» (Москва, 2012); региональной научно-практической конференции молодых ученых «Современный агропромышленный комплекс глазами молодых исследователей» (Орел, 2012); международной конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2012); 5 международной заочной научно-практической конференции «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (Орел, 2012); на 6 международной заочной научно-практической конференции «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (Орел, 2013); международной научно-практической конференции молодых ученых « Животноводство России в условиях ВТО: от фундаментальных и прикладных исследований до

высокопродуктивного производства» (Орел, 2013); международной научно-технической конференции « Фундаментальные и прикладные аспекты создания биосферосовместимых систем» (Орел, 2013)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, заключения, приложения, списка литературы, включающего 140 источников. Работа нллюстрирована 6 таблицами и 24 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Экспериментальная работа проводилась в лаборатории биотехнологии и молекулярной экспертизы Орловского регионального биотехнологического центра сельскохозяйственных растений ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет», исследования по изучению корневых плесеней ячменя проводились в микробиологической лаборатории орловской городской больницы им. С.П.Боткина. В работе исследованы 14 образцов ячменя коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова различного географического происхождения, различающиеся продуктивностью, устойчивостью к полеганию, к пыльной головне, восприимчивостью к мучнистой росе и пятнистостям. Сортообразцы: к-22089 Белогорский, к-30845 Золотник, к-27080 Белорусский 76, к-19417 Московский 121, к-30943 Amulet, к-29864 Kleine gerste, к-28292 WestendorÜTirol, к-27471 Korona Laschego, к-17844 Coeleste, к- 30919 Омский голозерный, к-30846 Сигнал, к-30440 23007, к-6557 Местный Армения, к-14981 Местный Дагестан.

Методы исследования. Проращивание обработанных семян гороха проведено в рулонах фильтровальной бумаги по ГОСТ - 12038-84. Для создания необходимых условий выращивания использовалась программируемая климатокамера "Фитотрон" производства компании Biokom. Выращивание производилось при температуре 25°С, 12-ти часовом световом дне. Для изучения действия гордецина на активность антиоксидантных ферментов использовали сорт гороха Батрак. Проростки гороха исследовали на 3-ий, 4-ый, 7-ой, 8-ой и 10-ый день после проращивания семян. Для изоляции патогенов - возбудителей фузариоза Fusarium oxysporiim L. и инфицирования грибами Fusarium oxysporum L. использовали культуральную жидкость, предварительно профильтрованную через двойной слой марли для удаления кусочков мицелия. Заражение гороха возбудителем корневых гнилей и увядания Fusarium oxysponim L. проводили путем замачивания в водном смыве мицелия (1 г на 100 мл воды).

Корни проростков погружали в культуральную жидкость гриба на 15-20 минут. Зараженные проростки переносили во влажную камеру (Павловская и др., 2002).

С целью получения корневых плесеней и выявления антибиотиков семена ячменя сорта Скарлет выращивали на фильтровальной бумаге в фитокамере в контролируемых условиях в течение 10 дней. Зерно ячменя промывали проточной водой, замачивали на 2 часа в слабо розовом растворе калия перманганата. По 5 грамм ячменя раскладывали в 3 чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную водой, накрывали крышкой. Ставили чашки с ячменем в термостат суховоздушный ТС 1/80 СПУ. При температуре 26 и влажности 60%. На 3-ий день появились корешки, на 7-ой день -плесень. С 7 по 10 день наращивали плесень.

На 10 день плесень идентифицировали. Для наращивания плесени использовали среду Сабуро, предназначенную для культивирования грибков медицинского назначения. Наращивание плесени проводилось в течение 24 часов в термостате. На 2-ой день проводили идентификацию гриба и определяли его чувствительность к антибиотикам на бактериологическом анализаторе bio Merieux серии mini API по стрипам.

Вместе с тем, бактериальную обсемененность ячменя определяли методом посевов смывов с образцов ячменя на чашки Петри с МПА и учетом выросших колониеобразующих единиц (КОЕ) после инкубирования в термостате при температуре 30 С° в течение 3 суток.

зДля получения смывов навеску ячменя массой Юг помещали в колбу с 90 см стерильной водопроводной воды. Колбу взбалтывали на качалке 10 минут. Из полученного смыва делали разведения: 10"', 10~2, 10"3, 10~4 и высевали по 1 см3 на чашки Петри с МПА.

Для определения общей бактериальной обсемененности посевы производили сразу после смыва. Для определения термоустойчивых бацилл смывы перед посевом прогревали на водяной бане при 85-90 С° в течение 15 минут.

Обнаружение антибиотиков проводили по Добрыниной и Свешниковой (1967).

Для определения каталазы (КФ 1.11.1.6) в растениях была использована методика А.И.Ермакова (1987) с модификациями JI.E. Иваченко (1997).

Пероксидазную активность (КФ 1.11.1.2) растений определяли колориметрическим методом Бояркина с модификациями (Плешков, 1985). Для определения активности супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) была использована модифицированная методика (Giannopolities, C.N., 1977) с использованием прибора (фотореактора) (Гринблат А.И., 2005-2006).

Статистическая обработка данных. Лабораторные опыты проводили в 3 кратной биологической повторности, аналитическое

определение для каждой пробы также в трех повторностях. Достоверность экспериментальных данных оценивали методами математической статистики с привлечением современных программных средств. Расчеты, построение графиков и их описание осуществляли с помощью приложений Microsoft Office Word 7 и Excel 7 для Windows ХР и пакета прикладных программ «Statistica. 7,0», «Biotest -D».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морфологические особенности сортообразцов ячменя

Для промышленного производства растительных антибиотиков, прежде всего, требуется выявить его источник (сырьё). С этой целью проводят скрининг на его содержание в районированных и перспективных сортах ячменя, оценивают его экономическую эффективность и выращивают в производственных экологически чистых условиях.

Скрининг генетической коллекции ячменя показал, что генотипы ячменя существенно различаются по содержанию гордецина (рис. 1). Разброс данных составляет 1-12 мг/%.

Рисунок 1 - Результаты скрининга генотипов ячменя коллекции ВИР на содержание гордецина

Наименьшее содержание гордецина было установлено у сорта Белогорского, местного сорта из Армении и Westendorf Tirol (1-2 мг/%). Сорт Белогорский устойчив к полеганию и пыльной головне, но восприимчив к мучнистой росе и пятнистостям.

Рекордсменом по наличию гордецина является сорт Амулет, у которого количество гордецина достигает 11-12 мг/%. Амулет устойчив к полеганию, к мучнистой росе, слабо поражается пятнистостями.

У большинства генотипов содержание гордецина колеблется от 4 до 9 мг/%. Из них среднеустойчивыми к полеганию являются сорта Белогорский, Золотник, Белорусский 76, Московский 121. Белорусский 76 устойчив к мучнистой росе. Таким образом, четкая зависимость между содержанием гордецина, полеганием и устойчивостью к грибным заболеваниям выявлена не у всех образцов.

Факты показывают, что синтез гордецина при прорастании наиболее интенсивный в проростках генотипа сорт Амулет на первых этапах развития. Через 16 часов прорастания он достигает более 9 мг/%. Дальнейшее развитие сопровождается плавным снижением синтеза гордецина до 5, 26 мг/% на 5-ый день прорастания. У образца сорта Местный Армения динамика синтеза несоизмерима с таковой у первого образца. Количество гордецина не превышает величины 1,0 мг/%, с небольшим подъемом через 16 часов прорастания.

2. Химическая природа гордецина

Костромичевой Е.В. (2013) была разработана технология выделения гордецина из малых проб зерна ячменя. Выделение гордецина проводили методом, предложенным Новотельновым Н.В. и Ежовым И.С. (1968). Ниже представлены собственные данные проведенных исследования по очистке препаратов гордецина методами ВЭЖХ. Препаративная хроматограмма данного вещества (вещества) приведена на рис.2, из которого видно, что спиртовый экстракт карбонатной фракции содержит несколько пиков. Указанные на хроматограмме фракции собирали в круглодонные колбы, упаривали на роторном испарителе досуха при температуре 25°С и растворяли в метаноле. Для идентификации пика, соответствующего гордецину, нами был использован тот факт, что очищенный препарат гордецина в УФ области спектра содержит плато в области 260-275 нм. При снятии УФ-спектров полученных фракций установлено, что плато в указанной области характерно только для фракции-4 (рис.3). На этом основании можно предположить, что фракция-4 соответствует гордецину.

/ \

л г"

Ч'

Время

Рисунок 2 - Препаративная хроматограмма спиртового экстракта карбонатной фракции, содержащая гордецин. Условия: колонка -1Л1ха$П-81(250 х 7.8; 10 мкм); подвижная фаза - 97,5% гексан + 2,5% изопропанол; скорость протока -2мл/мин; проба, наносимая на колонку - 2 мл; детектирование - УФ при 260 нм

Время

Рисунок 3 - Аналитическая хроматограмма очищенного препарата гордецина. Условия: колонка -1Лтш1-8!(250 х 4,6; 5 мкм); подвижная фаза -

97,5% гексан + 2,5% изопропанол; скорость протока - 0,5 мл/мин; проба, наносимая на колонку - 10 мкл (с= 1 мг/мл); детектирование - УФ при 260 нм

На основании проведенных исследований можно предполагать, что разработана методика выделения и очистка гордецина из малых проб зерна ячменя методом ВЭЖХ. Установлено, что гордецин в условиях снятия масс-спектра, видимо, переходит в окисленную форму. Показано, что количественно гордецин можно определить хроматографическим методом или спектрофотометрически после его хроматографической очистки.

3. Видовая принадлежность плесени и бактериальной обсемененности на корнях ячменя

Причиной низкого качества зерна ячменя является высокая восприимчивость культуры к комплексу фитопатогенных микроорганизмов, которые приводят к значительному снижению его жизнеспособности, изменению химического состава и ухудшению органолептических показателей. Основной причиной низкого качества зерна ячменя пивоваренного является развитие фитопатогенной микрофлоры. Исследования, связанные с выявлением микрофлоры ячменя, являются важными не только с позиции пивоварения, но и устойчивостью к микрофлоре соответствующего ареала выращивания, а также возможностью поражения возделываемых сортов.

•р й® # л? # л4 1 снотгшы

Рисунок 4 - Количественная характеристика объем плесени на корнях 10-дневного ячменя

Установлено, что развитие плесени на корнях различных генотипов ячменя обратно пропорционально содержанию гордецина в зерновках и строго повторяется по образцам (рис. 4). При сравнении рис. 1 и рис. 4 ясно прослеживается обратная зависимость роста плесени на корнях ячменя и содержания гордецина в ячмене. Это дает основание полагать, что гордецин сдерживает заражение ячменя микроорганизмами. Вместе с тем, кроме плесени, представляющей собой мицелий грибов, на корнях ячменя поселяются бактерии. Микроорганизмы являются источниками антибиотических веществ. Нами была поставлена задача - выявить наличие источников антибиотиков, идентифицировать и установить связь с их содержанием и устойчивостью ячменя к возбудителям болезней.

Плесень, выросшая на корнях ячменя (рис.5), видимо, относится к грибам рода З^ерЮтусез.

Рисунок 5 - Плесень ЗггерЮтусея. а) внешний вид на корнях; б) увеличение под микроскопом 10x100; в) общий вид плесени

Общее количество микроорганизмов (КОЕ/г) в разных сортах ячменя представлено в порядке убывания: 6557 Армения (3,6x10 5) > К-270080 Белорусский 76 (1,7x10 5)> К-30943 Amulet (6,0x10 4)> 14891 Дагестан (5,0x10 4). Из этих данных нельзя сделать вывод, что общее количество микроорганизмов связано с устойчивостью либо к полеганию, либо с устойчивостью к болезням.

Вместе с тем, на корнях ячменя выявлена Klebsiela pneumonia - вид грамотрицательных факультативно - анаэробных условно-патогенных бактерий (рис.6). Входит в состав нормальной микрофлоры кишечника, кожи, ротовой полости человека. Имеет вид небольшой округлой палочки размером 0,5-0,8 на 1-2 мкм. Klebsiela pneumonia не образует спор, неподвижна, способна к образованию капсул. Располагаются одиночно, попарно и скоплениями.

Рисунок 6 — Морфология Klebsiela pneumonia

Таким образом, проведенные исследования показали наличие на зерне ячменя актиномицета Streptomyces и бактерий Вас. subtilis, Вас. brevis, Klebsiela pneumonia.

4. Наличие антибиотиков в корневой плесени ячменя

Таблица 1 - Вес плесени и содержание антибиотиков (мг/мл)

№ Название образца U и ^ ю g 9 g <L) я я § я я s X я s я s S о H с i s й ы s я св о. я s i я я s

>> g s <L> С Cu Eu ü H а. L

1 22089.Ленинградская обл. Белогорский 15 0,02 0.0064 0,0046 0,0

2 30845. Новосибирская обл. Золотник 2 0,015 0,0071 0.0036 0,0

3 6557. Армения. 5 0,12 0,0095 0,0079 0,013

4 14891. Дагестан. Местный 1 0,03 0,0062 0.0022 0,011

5 27080.Беларусь. Белорусский 76 3 0,06 0,0060 0,004 0,0475

6 19417.Московская обл. Московский 121 1 0,06 0.0056 0.0027 0,0105

7 30943.Чехия. Amulet 1 0,008 0,0064 0,0 0.048

8 29860.Германия. Kleine gerste 4 0,04 0.0074 0,0018 0,0

9 28292.Австрия Nudum 5 0,03 0,0079 0.0018 0,0163

10 30919.0мская обл. Омский голозерный 3 0,06 0,0068 0,0027 0,0163

11 27471.11олына.А'оуоио Laschrgo 4 0,02 0,0062 0.0017 0,0

12 17844.Ленингр. обл. Cocleste 2 0.05 0,008 0.0025 0,0

13 30846.Новосибирская обл. Сигнал 1 0,01 0,005 0,0 0,0

14 30440.Дания.23007 Nudum 2 0,04 0,0064 0.0024 0,013

Анализ наличия антибиотиков в плесени показал (табл. 1) присутствие в незначительных количествах антибиотиков: пенициллина, стрептомицина, тетрациклина и грамицидина. Содержание пенициллина в образцах от 0,02 до 0,06 мг, стрептомицина от 0,0062 до 0, 0071, тетрациклина от 0,0 до 0,0079 и грамицидина от 0,0 до 0,048 мг. Рекордсменом по накоплению антибиотиков пенициллина, стрептомицина и тетрациклина является образец сорта 6557 Армения и по грамицидину сортов 27080 Белорусский 76 и 30943 Амулет Чехия. Анализ связи между содержанием антибиотиков и устойчивостью к заболеваниям выявил следующее: образец сорта 6557 Армения, несмотря на самое высокое содержание антибиотиков плесени, не устойчив ни к грибным болезням, ни к полеганию. Можно предполагать, что подобная устойчивость может определяться наличием антибиотика грамицидина. Однако, по данным Гаузе Т.Ф. и Бражниковой М.Г. (1983г.), грамицидин продуцирует не плесень, а бактерии рода Bacillus brevis. Из таблицы (№1 ) следует, что масса плесени у данных образцов невелика (1-3 мг/мл). Из всех изученных образцов только эти два генотипа не поражаются мучнистой росой и устойчивы к полеганию. Все остальные образцы поражаются мучнистой росой и полегают при неблагоприятных условиях. Однако, на эти признаки не влияет принадлежность ячменя к голозерным или пленчатым.

5. Исследования биологической активности антибиотиков на растительных тканях

Одной из существенных причин низких урожаев гороха в различных регионах страны является поражение растений корневыми гнилями -наиболее вредоносным заболеванием в условиях Орловской области. Потери урожая от данного заболевания могут составлять 30-50 % и более. Показатель вредоносности корневых гнилей - до 25% (Зотиков, Борзенкова, 2009). В наших исследованиях изучено влияние вытяжки из плесени и гордецина на зараженные F. oxysporum проростков гороха сорта Батрак. На рис.7 представлены результаты измерений опытных и контрольных проростков на 10-ый день прорастания зерна гороха.

Как видно из рисунков, у здоровых проростков гороха за 10 дней корни выросли до 7 см. Под влиянием гордецина в концентрации 10"'"М корни угнетены и 10-дневные имеют размер менее 2 см. Вытяжка из плесени (мицелия) также действует угнетающе и у 10-дневных проростков гороха составляет 3 см. Инфицирование семян гороха F. Oxysporum приводит у 10-дневных проростков к угнетению развития корневой системы, хотя боковых корешков становится больше. Вместе с тем, обработанные гордецином инфицированные проростки гороха имеют размер корней больше

контрольных (до 8 см). Обработка вытяжкой из плесени (мицелия) больных проростков гороха не привела к таким положительным результатам. Длина корешков была около 4 см.

га sc 3 ш о.

о *

га х S =; et

4 7 8 Время, сутки

10

0 контр.вода Я гордецин В мицелий И контр.инф. ЯП инф.+гордецин Eä инф.+мицелий

Рисунок 7 - Развитие проростков гороха сорта Батрак по вариантам: 1 - контроль (вода); 2 - обработка гордецином 10"12 М; 3 - обработка вытяжкой из плесени; 4 - инфицированные F. oxysporum;

5 - Инфицированные +гордецин; 6 - инфицированные +вытяжка из плесени

Между тем, практически у всех вариантов обработка гордецином, вытяжкой из плесени и инфицирование действуют угнетающе на рост и развитие побегов.

Гриб Fusarium oxysporum проникает в растение гороха через корневую систему и по этой причине угнетает рост корней. Уже с первых суток после инфицирования длина корня меньше, чем у здоровых проростков. Но еще сильнее угнетает рост корней гордецин на протяжении всего времени наблюдения. Вытяжка из плесени ячменя оказала не меньшее угнетение, чем инфицирование возбудителем корневых гнилей, что указывает на её патологическое влияние на проростки гороха. Обработка гордецином инфицированных Fusarium oxysporum проростков приводит не только к восстановлению ростовой активности корней, но и к их стимулированию.

Таким образом, гордецин оказывает избирательное действие на возбудителя корневых гнилей у гороха, восстанавливая нормальные функции

гороха, инфицированного F. oxysponim. Вытяжка из плесени таким свойством не обладает.

К настоящему времени нет утвержденных и внесенных в реестр разрешенных препаратов средств, эффективных против фузариозного заболевания гороха. Однако, Павловской U.E. и др. (2009-2013 гг.) запатентованы 5 средств защиты гороха и других культур от болезней и вредителей. Поиски эффективных средств продолжаются и одним из перспективных препаратов является гордецин, который исследуется в качестве средства защиты растений от болезней.

6. Влияние гордецина и плесени на активность антиоксидантных ферментов проростков гороха сорта Батрак, зараженного Fusarium oxysporum

Антиоксидантная система растений является тест-системой на состояние клеток, а активность отдельных ферментов служит способом оценки новых препаратов, оказывающих выздоравливающее действие на зараженные растения. Горох является индикатором для подобных экспериментов.

Е/мг

СОД

7 8 10

Время, сутки

контроль вода St гордецин 9 мицелий а контр.инф И инф+гордецин ЕЭ инф.+мицелий

Рисунок 8 - Изменение активности супероксиддисмутазы здоровых и больных проростков гороха под влиянием гордецина и вытяжки из плесени

ячменя

На рис. 8 показано, что активность супероксиддисмутазы в процессе развития здоровых проростков гороха с 3-х до 10-ти суток возрастает от 113 Е/мг до 1400 Е/мг. При обработке семян гороха гордецином в концентрации 10 |0% активность СОД остается низкой на протяжении всего времени наблюдения (230-260 Е/мг), что указывает на возрастание свободнорадикальных процессов, с которыми борется СОД. Обработка семян гороха смывами плесени ячменя в меньшей степени угнетает проростки гороха, чем гордецин, активность СОД в процессе развития равна 155-938 Е/мг. Заражение семян гороха путем замачивания в культуральной жидкости гриба Fusarium oxysporum приводит к снижению активности СОД от 99 до 734 Е/мг в процессе развития больных растений. Инфицированные проростки гороха, обработанные гордецином, восстанавливают свою антиоксидантную систему, что выражается в резком увеличении активности СОД от 241 Е/мг у 3-дневных проростков до 1521 Е/мг - у 10-дневных. Вытяжка из плесени оказала меньший эффект, хотя и в этом случае активность СОД выше, чем у инфицированных проростков (162-1200Е/мг.)

В систему тканевых биоантиокислителей, обеспечивающих разложение перекисей, образующихся как в результате патологических процессов, так и при деятельности СОД, входит каталаза, строго специфичная по отношению к перекисям. Показано ее довольно стабильно значение во всех вариантах опыта. Активность выражается в близких значениях около 20-25 Е/мг. Однако закономерность остается такой же, как в случае с СОД. Гордецин на инфицированные проростки гороха оказывает восстанавливающее действие. Активность каталазы по сравнению с контролем выросла на 2 единицы и превосходит даже здоровые проростки. Вытяжки из плесени ячменя были слабее, но присутствие антибиотиков в среде также оказало положительное влияние на больные проростки до 7 дней прорастания. В более поздние сроки их действие ослабевает.

Пероксидаза использует перекись как окислитель множества соединений фенольной природы. Кривые активности пероксидазы гороха в процессе его развития повторяют таковые по супероксиддисмутазе (рис.9). Наблюдается та же закономерность. От 3-х до 10-ти дней прорастания семян гороха активность пероксидазы здоровых проростков возрастает от 206 до 1280 Е/мг.

□ контроль вода

Я гордецин

К мицелий

Н контр, инф.

Щ инф.+гордецин Е инф.+мицелий

Рисунок 9 - Изменение активности пероксидазы здоровых и больных проростков гороха под влиянием гордецина и вытяжки из плесени

ячменя

Гордецин оказывает сильное угнетающее действие на здоровые проростки. Действие вытяжки из плесени такого угнетения не оказывает. Однако гордецин у инфицированных проростков гороха вызывает резкое повышение активности пероксидазы, превышающее даже контрольный вариант. Это указывает на выраженную избирательность действия гордецина на возбудителя заболевания гороха. Вытяжка из плесени такого эффекта не вызывает.

7. Связь между содержанием антибиотиков и устойчивостью

ячменя к болезням

Резюмируя полученные данные, можно констатировать, что скрининг генетической коллекции ячменя показал, что генотипы ячменя существенно различаются по содержанию гордецина. Разброс данных составляет 1-12 мг/%. Наименьшее содержание антибиотика было у сорта Белогорского, местного сорта из Армении и Westendorf Tirol (1-2 мг/%). Сорт Белогорский устойчив к полеганию и пыльной головне, но восприимчив к мучнистой росе и пятнистостям. Два других генотипа полегают при

Ё/мг Пероксидаза

Время, сутки

неблагоприятных условиях среды, поражаются всеми грибными заболеваниями.

Рекордсменами по наличию гордецина являются сорта Сигнал nutans и Амулет, у которых количество гордецина достигает 11-12 мг/%. Сорт Сигнал среднеполегаемый и поражается всеми грибными заболеваниями, а сорт Амулет устойчив к полеганию, к мучнистой росе, слабо поражается пятнистостями.

У большинства генотипов содержание гордецина колеблется от 4 до 9 мг/%. Из них среднеустойчивыми к полеганию являются сорта Белогорский, Золотник, Белорусский 76, Московский 121. Белорусский 76 устойчив к мучнистой росе. Таким образом, четкая зависимость между содержанием гордецина, полеганием и устойчивостью к грибным заболеваниям выявлена не у всех образцов.

Было установлено, что в плесени, развивающейся на корнях различных генотипов ячменя из коллекции ВИР им. Н.И.Вавилова, обнаружены антибиотики: стрептомицин, тетрациклин и пенициллин, а также грамицидин. Генотипы ячменя различаются по их количественному содержанию. Вместе с тем, установлено, что вытяжка из плесени ячменя стимулирует рост растений гороха.

Содержание в образцах: пенициллина (0,02-0,06 мг) стрептомицина (0,0062-0,0071), тетрациклина (0,0-0,0079) и грамицидина (0,0-0,048 мг). Рекордсменом по накоплению антибиотиков пенициллина, стрептомицина и тетрациклина является образец сорта 6557 Армения и по грамицидину сортов 27080 Белорусский 76 и 30943 Амулет Чехия.

ВЫВОДЫ

1. Проведен скрининг генотипов ячменя на содержание антибиотических веществ. Разброс данных составляет 1 мг/% - 12 мг/%. Наибольшее количество гордецина определено у сортов Сигнал и Амулет (11-12 мг/%). Сорт Сигнал среднеполегаемый и поражается всеми грибными заболеваниями, а сорт Амулет устойчив к полеганию, к мучнистой росе и слабо поражается пятнистостями.

2.У большинства генотипов ячменя содержание гордецина колеблется от 4 до 9 мг/%. Из них среднеустойчивыми к полеганию являются сорта Белогорский, Золотник, Белорусский 76, Московский 121. Сорт Белорусский 76 устойчив к мучнистой росе.

3.Четкая зависимость между содержанием гордецина, полеганием и устойчивостью к грибным заболеваниям выявлена не у всех исследуемых образцов. Это дает возможность отбора соответствующих по данным признакам образцов для включения их в селекционную программу создания устойчивых сортов ячменя.

4. Разработана оригинальная методика выделения гордецина из малых проб зерна ячменя и ВЭЖХ для очистки гордецина. Гордецин в условиях снятия масс-спектра, видимо, переходит в окисленную форму.

5. Установлено, что развитие плесени на корнях различных генотипов ячменя обратно пропорционально содержанию гордецина в зерновках и строго повторяется по образцам, ясно прослеживается обратная зависимость роста плесени на корнях ячменя и содержания гордецина в ячмене. Это дает основание полагать, что гордецин сдерживает заражение ячменя микроорганизмами.

6. Установлено наличие на зерне ячменя группы микроорганизмов: актиномицета Streptomyces и бактерий Вас. subtilis, Вас. brevis, Klebsiela pneumonia.

7. В плесени на корнях ячменя выявлены антибиотики: пенициллин (0,02-0,06 мг), стрептомицин (0,0062-0,0071), тетрациклин (0,0-0,0079) и грамицидин (0,0-0,048 мг) в зависимости от сортообразца. Рекордсменом по накоплению антибиотиков пенициллина, стрептомицина и тетрациклина является образец сорта 6557 Армения и по грамицидину сорта 27080 Белорусский 76 и сорта 30943 Амулет Чехия.

8. Изучено влияние гордецина на рост, развитие и активность антиоксидантных ферментов гороха. Гордецин в нанодозах (10"'2 М) угнетает развитие здоровых побегов гороха, увеличивает образование свободных радикалов в клетках, что выражается в снижении активности антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы.

9. У инфицированных проростков гороха гордецин оказывает избирательное действие на гриб Fusarium oxysporum, угнетая его развитие и оказывая выздоравливающее влияние на инфицированные проростки гороха, усиливая ростовую активность корней и повышая активность антиоксидантных ферментов.

Ю.Гордецин следует отнести к антимикробным препаратам направленного действия и к средствам защиты растений биологической природы от возбудителя корневых гнилей и увядания.

У инфицированных проростков гороха гордецин оказывает избирательное действие на гриб Fusarium oxysporum, угнетая его развитие и вызывая выздоравливающее действие на инфицированные проростки гороха, усиливая ростовую активность корней и повышая активность антиоксидантных ферментов.

11. Выделены генотипы сортов ячменя к-27080 Белорусский 76 nudum и к-30943 Amulet nutans Чехия, устойчивые к полеганию и мучнистой росе, слабо поражающиеся пятнистостями, для которых характерно высокое содержание гордецина и грамицидина.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Павловская, Н.Е. Выявление антибиотических веществ ячменя и их влияние на проростки гороха / Н.Е. Павловская, Е.И. Юшкова, Е.С. Кулешова // Ученые записки ОГУ. - 2012. - №3. - С. 132-136.

2. Кулешова, Е.С. Скрининг генотипов ярового ячменя по содержанию гордецина в семенах / Е.С. Кулешова, Н.Е. Павловская,

B.Г. Лоскутов // Ученые записки ОГУ. - 2012. - №6. - С. 138-142.

3. Павловская, Н.Е. Ячмень-источник антибиотиков / Н.Е. Павловская, Е.В. Костромичева, Е.С. Кулешова, И.В. Горькова, И.Н. Гагарина // Вестник Орел ГАУ. - 2012. - №4. - С. 70-72.

4. Солохина, И.Ю. Скрининг генотипов овса по содержанию авенацина / И.Ю. Солохина, Е.С. Кулешова, Н.Е. Павловская, И.Г. Лоскутов, Ученые записки ОГУ. - 2013. - №3. - С. 181 -186.

Статьи и материалы конференций:

5. Кулешова, Е.С. Применение гордецина в животноводстве / Е.С. Кулешова // Материалы международной научно-практической конференции «Инновации аграрной науки и производства», Орел. - 2011. -

C. 77-79.

6. Кулешова, Е.С. К вопросу о получении гордецина из ячменя / Е.С. Кулешова, Н.Е. Павловская // Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых «АПК в современном мире: взгляд научной молодежи», Орел. - 2011. - С. 48-50.

7. Кулешова, Е.С. Плесень ячменя - источник получения антибиотиков/Е.С. Кулешова, Н.Е. Павловская // Материалы 5 Международной заочной научно-практической Интернет-конференции «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству», Орел. - 2012. - С. 252-255.

8. Кулешова, Е.С. Выявление антибиотических веществ, продуцируемых корневыми плесенями ячменя / Е.С. Кулешова, Н.Е. Павловская, Е.И. Юшкова // Сборник трудов международной Интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее», Казань. - 2012. - С 191193.

9. Кулешова, Е.С. Динамика накопления гордецина в образцах ячменя различного происхождения / Е.С. Кулешова, Н.Е. Павловская // Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых «Современный агропромышленный комплекс глазами молодых исследователей», Орел. - 2012 . - С. 95-97.

10. Кулешова, Е.С. Гордецин-антибиотик природного происхождения /Е.С. Кулешова, C.B. Квасова, Е.И. Юшкова // Сборник трудов «Обучение и

развитие студентов-оенова стратегического управления в фармацевтическом бизнесе», Орел.-2012.-С. 31-33.

11. Кулешова, Е.С. Изучение состава микрофлоры корневых плесеней ячменя / Е.С. Кулешова, Н.Е. Павловская, Е.И. Юшкова // Межрегиональный научный сборник выпуск 14. «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов», Воронеж. —2012. - С. 148-152.

12. Кулешова, Е.С. Природные сырьевые ресурсы для создания биологически активных препаратов защиты растений / Е.С. Кулешова, Н.Е. Павловская, Е.И. Юшкова, Н.И. Ботуз // Материалы международной конференции «Биология - наука 21 века», Москва. - 2012. - С. 671-673.

13. Кулешова, Е.С. Особенности применения антибиотика гордецина в сельском хозяйстве / Е.С. Кулешова // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Животноводство России в условиях ВТО: от фундаментальных и прикладных исследований до высокопродуктивного производства», Орел. —2013. - С. 218-220.

14. Кулешова, Е.С. Плесневые грибы как источник антибиотических веществ /Е.С. Кулешова // Материалы 6 международной заочной научно-практической интернет-конференции «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственного производства», Орел. — 2013. — С. 22-26

15. Кулешова, Е.С. Зараженность ячменя микрофлорой / Е.С. Кулешова, Н.Е. Павловская // Материалы международной научно-технической интернет-конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты создания биосферосовместимых систем», Орел. - 2013. - С.300-302.

16. Кулешова, Е.С. Выявление связи между устойчивостью ячменя к болезням и наличием антибиотиков в плесени корней / Е.С. Кулешова, Н.Е. Павловская // Межрегиональный научный сборник «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов», Воронеж. - 2013. - С. 105108.

17. Кулешова, Е.С. Выделение, очистка и некоторые физико-химические свойства антибиотика гордецина из ячменного зерна / Е.С. Кулешова, А.Н. Даниленко, Н.Е. Павловская // Материалы международной заочной научно-практической конференции «Наука и образование в XXI веке», Тамбов. -2013. - С. 55-57.

Подписано в печать 24.04.2014 г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0. Заказ 28. Тираж 100 экз.

Отпечатано в издательстве Орел ГАУ, 2014, Орел, бульвар Победы, 19

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кулешова, Екатерина Сергеевна, Орел

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

0420145931

На правах рукописи

КУЛЕШОВА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ИЗ РАЗНЫХ СОРТОВ ЯЧМЕНЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

03.01.05 — физиология и биохимия растений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Павловская Н. Е.

Орел-2014

Оглавление

Список сокращений.....................................................................................................4

1 .Введение....................................................................................................................5

2. Обзор литературы....................................................................................................8

2.1.Значение ячменя в народном хозяйстве...........................................................8

2.2.Химический состав зерна ячменя..................................................................11

2.3. Болезни и микробиота ячменя.......................................................................16

2.4. Роль антибиотиков и рынок...........................................................................21

2.5. Влияние антибиотиков на животные организмы.........................................30

2.6. Влияние антибиотиков на сельскохозяйственные растения....................33

2.7. Устойчивость ячменя к возбудителям болезней.......................................38

2.8. Цель и задачи работы......................................................................................61

3. Объект и методы исследования...........................................................................62

3.1 .Ботаническое описание генотипов ячменя....................................................63

3.2. Методы выделения гордецина и его спектрофотометрическое определение, очистка и идентификация методами ВЭЖХ, масспектрофотометрии и ЯМР.............................................................................67

3.3. Методы выращивания растений гороха........................................................71

3.4. Инфицирование гороха возбудителем корневых гнилей Fusarium oxysporum L.............................................................................................................71

3.5. Видовая принадлежность плесени, образующейся на корнях ячменя.... 72

3.6.Методы выделения антибиотиков из плесени ячменя.................................74

4. Результаты и обсуждение.....................................................................................76

4.1. Скрининг генотипов ячменя коллекции ВИР на содержание гордецина76

4.2. Динамика синтеза гордецина в проростках ячменя...................................78

4.3. Химическая природа гордецина из ячменного зерна.................................80

4.4. Видовая принадлежность плесени, образцующейся на корнях ячменя... 87

4.5. Наличие антибиотиков в корневой плесени ячменя...................................96

4.6. Исследования биологической активности антибиотиков на растительных тканях.......................................................................................................................99

4.7. Влияние гордецина и плесени на активность антиоксидантных ферментов проростков гороха сорта Батрак, зараженного

Fusarium oxysporum..............................................................................................102

5. Заключение...........................................................................................................108

6. Выводы...............................................................................................................111

7. Список литературных источников....................................................................113

8. Приложение.........................................................................................................127

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода

БАД - биологически активные добавки

ВИР - Всероссийский институт растениеводства

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГО - гиперчувствительный отклик

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТНБ - дитионитробензоат

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

КОЕ - колониеобразующая единица

ЛПУ - локальная приобретенная устойчивость

МПА - мясо-пептонный агар

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РАК - разновидности активного кислорода

СПУ - системная приобретенная устойчивость

СОД - супероксиддисмутаза

ЯМР - ядерно- магнитный резонанс

1.Введение

Сложившаяся к настоящему времени в России критическая ситуация с производством антибиотиков диктует необходимость изыскания новых источников для их выделения и производства. По оценкам маркетологов, в ближайшие годы ожидается падение российского производства антибиотиков. Основными причинами являются изношенность основных фондов, морально устаревшая номенклатура субстанций в условиях необходимости создания новых более эффективных лекарств, мощная конкуренция со стороны зарубежных производителей. «В России выпускать составляющие для производства антибиотиков стало невыгодно, так как отечественные фармпроизводители не могут составить конкуренцию таким странам, как Китай и Индия, субстанции которых гораздо дешевле», - считает гендиректор НПО "Микроген" Минздрава РФ Антон Катлинский[137].

Подавляющее большинство антибиотиков, нашедших применение в медицине и народном хозяйстве, получено из грибов - представителей рода Actinomyces, которые используются в виде настоев, вытяжек, мазей, порошков, таблеток, входят в составы многочисленных БАДов, и могут служить сырьем для промышленного производства антимикробных соединений.

Однако в настоящее время многие антибиотики стали неэффективны, в связи с чем требуется усилить исследования по поиску веществ, обладающих антимикробной и антивирусной активностью. Источниками получения подобных веществ, кроме микроорганизмов, являются растения и в том числе злаковые, к которым относится ячмень.

Солод, являющийся основой приготовления пива, представляет собой пророщенное зерно ячменя, который отличается повышенным содержанием антивирусных и антибактериальных веществ, в том числе лизина и гордецина. В связи с этим ячменные отвары и настои являются популярным средством народной медицины для лечения грибковых и воспалительных заболеваний кожи, желудочно-кишечного тракта и органов дыхания. Зерна ячменя служат

я< I,

сырьем для производства бактерицидных и противовирусных фармацевтических препаратов.

В середине прошлого века Новотельновым Н.В. и Ежовым И.С. (1957) из солодовой воды на пивоваренном заводе был выделен гордецин и установлена его химическая структура, проведены исследования его влияния на патогенную микрофлору. Однако исследования были свернуты и это интересное и перспективное вещество предано забвению.

Целью данной работы было выявление источника гордецина из зерен и антимикробных веществ из корневых плесеней ячменя. Задачи:

- Провести скрининг генотипов ячменя коллекции Всероссийского института растениеводства на наличие гордецина.

- Установить видовую принадлежность плесени и бактериальной обсемененности на корнях ячменя.

- Выявить наличие антибиотиков в корневой плесени ячменя.

- Провести исследования биологической активности антибиотиков на растительных тканях.

- Изучить влияние гордецина на активность антиоксидантных ферментов гороха, зараженного Fusarium oxysporum L,

- Выявить связь между содержанием антибиотиков и устойчивостью ячменя к болезням.

Научная новизна. Впервые проведен скрининг генотипов ячменя коллекции ВИР им.Н.И.Вавилова на содержание антибиотических веществ.

Разработана оригинальная методика выделения гордецина из малых проб зерна ячменя и высокоэффективная жидкостная хроматография для очистки гордецина. Гордецин в условиях снятия масс-спектра переходит в окисленную форму.

Впервые установлено, что развитие плесени на корнях различных генотипов ячменя обратно пропорционально содержанию гордецина в зерновках и строго повторяется по образцам.

Установлена избирательность действия гордецина на возбудителя корневых гнилей Fusarium oxysporum.

Практическое значение. Выявленная четкая зависимость между содержанием гордецина, полеганием и устойчивостью к грибным заболеваниям у отдельных генотипов, что дает возможность отбора соответствующих по данным признакам образцов для включения их в селекционную программу создания устойчивых сортов ячменя.

У инфицированных проростков гороха гордецин оказывает избирательное действие на гриб Fusarium oxysporum, угнетая его развитие и оказывая оздоравливающее действие на больные проростки гороха, что дает основание отнести гордецин к компоненту защиты клеток растений от возбудителя корневых гнилей и увядания. Гордецин может стать компонентом для создания новых биологических средств защиты растений.

Положения, выносимые на защиту.

1 .Разработана оригинальная методика выделения гордецина из малых проб зерна ячменя и ВЭЖХ для его очистки.

2.Межсортовая вариация содержания гордецина в зерне генотипов ячменя коллекции ВИР им.Н.И.Вавилова составляет 1 мг/% - 12 мг/%.

3. Развитие и объем плесени на корнях различных генотипов ячменя обратно пропорционально содержанию гордецина в зерновках и строго повторяется по образцам.

4. Гордецин в нанодозах (10"12 М) угнетает развитие здоровых побегов гороха, увеличивает образование свободных радикалов в клетках, что выражается в снижении активности антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы.

5. У инфицированных проростков гороха гордецин оказывает избирательное действие на гриб Fusarium oxysporum, угнетая его развитие и оказывая выздоравливающее влияние на инфицированные проростки гороха, усиливая ростовую активность корней и повышая активность антиоксидантных ферментов.

2. Обзор литературы

2.1.3начение ячменя в народном хозяйстве

Ячмень (лат. Hördeum) — род растений семейства Злаки, один из древнейших злаков, возделываемых человеком. История культивирования ячменя, одной из наиболее распространенных в мире злаковых культур, начала свой отсчет в глубокой древности. На территории нынешней России ячмень выращивают более 5000 лет. На Руси ячмень издавна находил широкое кулинарное применение. Пророщенные зерна этого злака являлись основным сырьем для приготовления кваса, пива, ячменного уксуса, выпечки, а отвары из ячменных зерен в русской кухне использовали в приготовлении супов, каш, киселей и похлебок.

Основная часть посевных площадей ярового пивоваренного ячменя сосредоточена в европейских странах, где благоприятные погодно-климатические условия способствуют получению высоких урожаев зерна, соответствующего ГОСТу на пивоваренный ячмень. Если в мировом производстве зерна ячмень занимает четвертое место после пшеницы, риса и кукурузы, то в Украине эта культура является второй зерновой культурой после пшеницы. В отдельные годы посевная площадь занимает свыше 5,0 млн. га. Его выращивают во всех почвенно-климатических зонах, особенно, в Степи и Лесостепи[129].

Большое кормовое значение зерна ячменя, неприхотливость возделывания и довольно высокая урожайность определяют значительное распространение этой культуры. По данным ФАО, в мире ячмень занимает 6070 млн. га. Россия значительно уступает по урожайности этой культуры

странам Европы. Урожайность ячменя в таких странах как Дания, Франция, Германия превышает 50 ц/га. Сбор ячменя с площади около 10 млн. га в этих странах составляет более 48 млн. тонн, тогда как в нашей стране с той же площади собирают лишь 19 млн. тонн зерна ячменя[131; 133].

Основное количество зерна ячменя используется на фуражные цели. Зерно ячменя является отличным концентрированным кормом с высоким содержанием белка. Оно содержит весь набор незаменимых аминокислот, в том числе лизин и триптофан. В его зерне содержится 11,8% протеина, 2,3% жира, 2,8% золы и 65—72% безазотистых экстрактивных веществ.

При откорме свиней зерном ячменя получен более высокий производственный и экономический эффект, чем при кормлении зерном других зерновых культур. На 1 кг привеса свиней расходуется 4 - 4,5 кг ячменя, тогда как кукурузы 5,0-5,3 кг, а пшеницы 6,0 - 7,9 кг.

На фураж используются более высокобелковые сорта ячменя. Благодаря своим высоким кормовым качествам зерно ячменя и продукты его переработки намного питательнее других концентрированных кормов. Так, в 1кг зерна содержится 1,2 кормовые единицы и 100 граммов переваримого протеина. Ячневая крупа — это дроблёные ячменные ядра, освобождённые от цветочных плёнок. Преимущество ячневой крупы в том, что в отличие от перловки она не подвергается шлифовке, поэтому в ней больше клетчатки. Перловая крупа — это цельные ячменные зёрна, очищенные и шлифованные. Своё название перловка получила потому, что цветом и формой напоминает речной жемчуг.

Ячневую и перловую крупы получают из ярового и озимого ячменя. В народной медицине отвар ячменной и перловой круп используют при воспалительных заболеваниях желудка и кишечника, как общеукрепляющее средство после операций на органах брюшной полости и для смягчения кашля. Несколько лет назад ученые обнаружили в белке ячменя такие вещества как триглицерид и токотриенол, способные значительно снижать уровень холестерина в крови. Ячменную муку добавляют (10-15%) при выпекании ржаного и пшеничного хлеба. Через низкое качество клейковины хлеб из

чистой ячменной муки малообъемен, слабопористый, быстро черствеет. Из зерна ячменя изготовляют суррогат кофе.

Особенностью ячменной муки является большое количество полисахарида b глюкана, обладающего холестерино-понижающим эффектом, хорошее соотношение между белком и крахмалом, богатое содержание провитамина А, витаминов группы В и минеральных веществ: кальция, фосфора, йода, особенно много кремниевой кислоты[131]. Известно около 30 видов ячменя, из которых наибольшее значение имеют Hordeum distichon — Ячмень двухрядный и Hordeum vulgare L. — Ячмень обыкновенный[35]. Ячмень обыкновенный подразделяется на два подвида -двурядный и многорядный. Некоторые исследователи считают эти подвиды самостоятельными видами. Возделываются двурядные и многорядные, преимущественно пленчатые ячмени. Озимые ячмени почти все многорядные, ярые — преимущественно двурядные.

В России на кормовые цели используют до 70 % ячменя, возделываются по преимуществу яровые сорта.

Озимый ячмень младше, чем ярый примерно на 2000 лет. В настоящее время в многих странах наблюдается переход по выращиванию озимого ячменя. Практически полностью на осенний сев перешли Румыния и Болгария. Яровой ячмень возделывают на всей земледельческой территории России - от Заполярья до субтропиков. Однако в тех районах, где обеспечивается хорошая перезимовка озимых, например на Северном Кавказе, Крыму, Закавказье, целесообразно выращивать более урожайный озимый ячмень.

Для создания новых сортов сельскохозяйственных растений, обладающих комплексом ценных признаков, высокой урожайностью и высоким качеством продукции в разнообразных условиях среды, пригодных для энергосберегающих и природоохранных агротехнологий, требуется хорошо изученный исходный материал. Вопрос о выборе наиболее перспективных родительских форм для скрещиваний из имеющегося разнообразия

генетических ресурсов сельскохозяйственных растений до сих пор остается одним из самых трудных и ответственных моментов в селекционном процессе.

Коллекция зернофуражных культур ВНИИР им. Н.И. Вавилова является основным источником нового исходного материала для обеспечения селекционных программ по созданию новых конкурентоспособных сортов. В институте собрана одна из самых больших коллекций. Она насчитывает около 18000 образцов по ячменю разного географического происхождения[33].

Практически все мировое разнообразие форм озимого ячменя представлено в коллекции ВИР. Коллекция озимого ячменя насчитывает 3400 образцов. Генетическое разнообразие РФ представлено 500 образцами, в основном, это местные формы и стародавние сорта (320 образцов), собранные в 20-30-е годы XX столетия в Ставропольском и Краснодарском краях, Ростовской области, Чечено-Ингушетии, Кабардино-Балкарии и Дагестане, и новые сорта и селекционные линии. Среди образцов зарубежного происхождения 1150 образцов - это местные формы стран Европы, Азии и республик бывших СССР. В основном коллекция озимого ячменя представлена сортами озимого ячменя Европейских стран. За последние 5 лет коллекция пополнилась 100 образцами озимого ячменя. В основном это сорта Франции, Германии, Югославии. При работе с коллекцией зернофуражных культур особое внимание уделяется комплексному изучению образцов по важным хозяйственно ценным признакам и выявлению источников и доноров, которое проводится согласно методике ВИР [34].

2.2.Химический состав зерна ячменя.

Хозяйственное значение и использование ячменя обыкновенного, или озимого (Hordeum vulgare) определяется его химическим составом. Зерно содержит в среднем 12% белка, 65% углеводов, 2,1 % жира и идет на приготовление перловой и ячневой круп, суррогата кофе, муки для выпечки лепешек, реже - хлеба, который получается низким, слабопористым, быстро черствеющим из-за невысоких качеств клейковины. Озимый ячмень в составе

своего белкового комплекса имеет больше 20 аминокислот, 8 из них незаменимые. Белок ячменя более полноценен, чем у других культур, но содержит мало лизина - 2,5-3,2%.

Ячмень состоит на 12—20% из воды и 88—80% сухого вещества. Влагосодержание спелого ячмен