Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРИРОДА ВОЗБУДИТЕЛЯ РОЗОВОГО ОКРАШИВАНИЯ ЗЕРНА ЯЧМЕНЯ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПРИРОДА ВОЗБУДИТЕЛЯ РОЗОВОГО ОКРАШИВАНИЯ ЗЕРНА ЯЧМЕНЯ"

А-зоШ/

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи БЕКДАИРОВА Гульгайша Ильясовна

ПРИРОДА ВОЗБУДИТЕЛЯ РОЗОВОГО ОКРАШИВАНИЯ ЗЕРНА ЯЧМЕНЯ

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена во Всероссийском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте зерна и продуктов его переработки (ВНИИЗ) ВНПО «Зернопро-дукт» в лаборатории защиты от вредителей и санитарной охраны зернопродуктов

Научный руководитель кандидат биологичесчих наук, вещ. н с Л. С. Львова.

Официальные оппоненты доктор биологических наул, профессор Г. Г. Жарикова; кандидат биологических наук Т. Г. Мирчинк.

Ведущее предприятие — Московский технологический институт пищевой промышленности. /р

Защита состоится « » ,993 г

в « » часов на заседании специализированного совета К-120 35 06 ,5 Московкой сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева

Адрес 127550, Мо^чва, ул Тимирязевская 49, сектор защиты диссертаций ТСХА

С диосертациеи можно озадкомиться в ЦНБ ТСХА

Автореферат разослан « * » ЗН^О-Р/?. 1993 г

Ученый секретарь специализированного совета

ст. н. с. - Л. В. Мосина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность гемы: Ячмень - одна из основных зерновых культур, широко используемая на продовольственные и кормовые дели. Свыше 2,5 млн.т ячменя расходуется ежегодно для, выработки круп, 1,4 млн.г-в пивоварении. : >,.• •

' В; последние годы на хлебоприемные предприятия Центрально-Черноземной зоны, Северного Кавказа и ряда других регионов поступает ячмень, содержащий зерна о необычной розовой окраской.- Так, в Краснодарском крае.в 1989 г.было заготовлено 52,9 тыс.т подобного ячменя, в Белгородской области - 138 тыс. г.

По сведениям,' поступшсщда. с хлебоприемных предприятий, в партиях ячменя с наличием розовоокрашвнных зерен наблюдалось снижение всхожести, не обусловленное влажностью г температурой хранения зерна. .Поэтому такой ячмень* заготовленный как пивоваренный, часто невозможно бшго реализовать по целевому назначению. , ,

, Аномальные зерна ячменя по:; своим внешним признакам близки к розовоокрашеннш зернам нефузарюзной прщэоды, вотречающимся в пшенице и ржи. Особенно охфоко это заболевание распространено во ржи. В отдельные годы, объемы заготовок такого вернадостигали 1,5 млн.т.

В действующих стандартахна рожь и ячмень отсутствуют ограничения на ооДержаниа розовоокрашвнных зерновок. Во вновь разработанном а уче гад товадаойкд^ введение :которого отложено до июля 1993 г., содержание розовоокрашвнных зерен в продовольственном зерне ограничивается до 3 %. Для ячменя подобше разрабоисж не щюводияись. :

Возбудитель я химическая природа розового окрашивания ячменя до настоящего времени не были исследованы. Отсутствуют сведения о

ЦЕНТРАЛЬНАЯ МАЯЧНАЯ С' "ЛИОТЕКА. £4оск. сел ад«*и

им. К. .

ШшЖ-т

семенных и гигиенических показателях такого зерна.

Игходя из изложенного чрезвычайно актуальным является установление степени воздействия подобного поражения зерна на здоровье человека и животных и на жизнеспособность зерна ячменя.

Научная новизна. Впервые установлено, что возбудителем розового окрашивания ячменя являются грибы из рода Draohsiara (сем. Damati&ceaa ). Показано существование корраляцшнной зависимости аевду степенью поражения ячменя гриЗаыи рода Dreobelara и количеством розовоокрашенных зерен.

Доказано, что по химическому строения образуемые D. tares пигменты относятся к антрахиноновым соединениям. Впервые обнаружена способность D. tacas к оинтезу хризофанола и катенарина. Показано, что основные компоненты пигментов D.terae и розово-окрашенного ячменя идентичны. Впервые обнаружено природное загрязнение зерна ячменя мономерными антрахиноновыми пигментами: катена-рин, хризофанол, эмодин. Установлены оптимальные значения температуры, величины рН, условий освещения и состава питательной среды для интенсивного пигментообразованда D. teres . изучено фкго-токсическое действие D. teres на всхожесть ячменя. Установлены закономерности распределения антрахшоновых пигментов в зерновке и в продуктах переработки розовоокрашенного ячменя. Определена величина ДД50 суммарного пигмента гриба и показано, что антра-хлноновые пигменты относятся к слаботоксичным веществам.

Практическая значимость. Практическая значимость диссертации ■ состоит прежде всего в том, что предотавленные в ней данные по JCHgQ антрахинонов D. teres , их концентрациям в товарных партиях зерна и распределению в продуктах переработки можно рассыат-

-ривать как обосновав» для разработки предельно допустима концентраций (ЦДК) антрахинонов взврне ж дяя нормирования роэовоокра-яеяшх'вврев /

Анализ распределения антрахшовов при переработке посаженного зерна позволяет иопольэовать выработку крупы как опоооб механического обезвреживания зерна, удаляющий более 95 % анграхшовов.

Отсутствие заметного отрвдатвльного дейотвия гриЗов рл)х«сьв1«г* на кизнеспособнооть ячменя при храненинюкдючает веобходшость ' контроля и нормирования поражения ячменя етши гриЗаыи в ячмене пивоваренного назначения..,■:. .

Палы работы состояла в установлении причины возникновения розового окрашиваниа и его влияния на семенные. и гигиенически» показатели верка. • ~ -

Ддядостшсения поставленное цели решалиоьследущив задачи:" оцредвлев» ввдового ооотава возбудитвлей розового окрашивания жчнвня;.

- установлвнивхныичвской природы патентов роэовоокраиенного ятаеня; . , * '

исоледованивтоксикологичеоких свойств пигментов роэовоокра-шенного ячменя; . , .

установление влияния инфекцжигрибов-пагогеновна хизнеспособ-ноеть ячменя ори хранения;

определение концентрации пигментов в производственных партиях ячменя и их" распределение в основных: и побочных продуктах перера- -богкинапродовольственннецели. ^

V. Аппобапм р^оуд.- Результаты исследований докладывались на 4 Международном микологическомконгреоое, Регенсбург, 1990 г.;

Всесоюзном совещании "Бгохшия хранения и сере работки зерна", Алма-Ата, 1990г.; научной конференции, посвященной 60-лагш МТИШ, Москва, 1991г.; Ученом Совете ШШЗ, Москва, 1992г.

Пуйдикапии. По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, выводов, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена ua SO страницах машинописного гоксха, содэраих II рисунков и 22 таблицы. Библиография включает 79 наименования, из н ах 35 - иностранные работы.

Объекты и метода «следования

Объектом исследования являлось зерно ячменя, шеющее розовую окраску нефуаариэзного происхождения.

Для изучения ыккробюлогических, токсикологических и семенных показателей было отобрано 105 проб ячменя с содержанием розовых зерен 0,9 % - 10,4 %. Пробы верна отбирали по ГОСТ 13586.3-83 от партий ячменя, содержащих розовоокрашенные зерна, поступивших на хлебоприемные предприятия г хранившихся на токах совхозов и колхозов в Белгородской, Калужской, Курской и Липецкой областях в период 1988-1992 гг.

Лабораторные опыты по изученею семенных свойств розовоокра-шеняых зерен проводили на пробах свевеубранного ячменя урожая I990-I99I гг., отобранных на токах колхогов в Белгородской области.

Для установления закономерности распространения пигмента в зерновке ячменя в лабораторных условиях проводили послойное удаление цветковой, плодовой а семенной оболочек за счог оелушаяш и

шлифования пораженного; зерна. - Опыты осуществляли на лабораторных шлифовальной и .шелушильной машинах. ■ Перерабатывали 2 пробы ячменя о различным содержанием розовоокрашенных.зерен из Белгородской ' области. '" ■'* '-.-•. ■ ■ • " ..-•/,

Внутренкю инфекцию грибов в зерне определяли'путем раскладки на среду. Чапека .или другие агаризова'нные среды ' 100 зерен после их'.. стерилизации в течение. 1-2 минут раствором сулемы ( 1:1000) и после-дущей-3-x' кратной: промывки стерильной "водой. Посевы, в чашках, Петри инкубировали при 25 °С 7-10 дней в темноте. Для стимулирования спорообразования использовали культивщювание" грибов' в пластиковых -.чашках- Петри при.облучении УФ-светом.V . ■ "

Чистые. культуры;грибов выделяли, из колоний,. обраставших вок-1 ■ :РУГ,''эврвн;>мвгедо1г ^¿ухоГиглы?'•■'ши^аутем-пересева"- мицелия.' Ввде- » Ленные чистые, культуры грибов хранили на агаризованной среде Чапека в пробщсах при -8 - I0°Ci в темноте. ' '.-.V*'

;-.^збудигелей-.-.р080В0Г0.' окрашивания ;ваделяяи-л1акв» --иэ ^оболочек - • зерна под микроскопом с помощью иглы и ывкроыаяапулягора. .

", * Щенлфкацию :грибов из • класса- Deutoromycatas семе®-. . СГВа' Itematiaceae 1 и группы порядка MjrceUa eterllla проводили на питательных- средах:, агаре,Чапека, сусло-агаре,,глшозо-. дрожжевом агаре. " -'Л \ '• .. ' • -• '.'/.

д *. - Дяя выявления морфогенеза¿ в частности, конвдиоганеза ги$о- / мшетов использовали культивирование грибов на предметных стеклах,-гак называемые. "живые препараты". .При изучении темноокрашенных ;: ■ ги$омицетов прибегали к методу просветления молочной кислотой;. '

Чистые культуры микромицегов идеятйфкцировали до рода иввда,.' используя известные руководства:: Пвдодличко (1953)., Литвинов 1967)

- б -

Hllia (IS7I), Хасаяов Для конпественного л качественного оарэдэхенш ичтрах!:ночо-ььх пигментов в зерно бил разработан '«год, окованный на го.чко-огойной хролатогра^ил (ТСл). "и и-чзсгЕе ыоо оьредо.-енпэ ссизыва-. ось на срашган, .i илпшсшьссгл iUjOp.-^ituU ; оп-ачв-чег—^с uai ин-гоь на xponaiorpas"« в ирлвна хдн <.0 cia-naj.c 2ч -)Гьд-1,4, j,7-- г е гр л.' пдро.чс п-ан г р. аетока (^¿енлрида).

Л--1 вьделрнпд ощч-^с препарата и i о i-ов 0. toréa ip } j 1Ыквгровали СО oj го,, при 24°С на авгокла.т роваино i рлее. Лет-.•пт эксграгировалг ¡лагопеч. Экстракт ./ПаркЕсь-и, обезкирквали .ексаном и освобождали от водорастворимих примесей. Сырой препарат шгчентов концентрировали за счэг переосаждения в воде и перекристаллизации из горячего метанола.

При изучении услоалй культивировангл .гнтенсивяосгь накопления пигментов в культуре грибов определ.иа на спо.чтро^ото jaipa

nitaohi. по шгччоивностг поглощения лрг 490 нп и 523 .ci, походя из спектра поглощения суммы пт-енгев грибов.

Itiaкноохь аерна определяли по ГССТ I35BG.3-83. Зоходесгь и >.иоргию прораоганил - t»o ГОСТ I2C38-84. /ai о.гьлюегь роэовоокра-пвнного ячменя при храненм изучал;' с . ^ и-ьзованкем \штодики ускоренного старения (Дихачев, 1978).

*итотоксическую активность грибных ■■оглболптов определяли методом бюпробы на семенах растений по Бгаай (1973), бактерицидную активность - по Olementa (1968) и Btoff et al(1975).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по Д.А.Доспехову (1973) и Х.Шенк (1972), а также по программе од-нофакторного дисперсионного анализа с нахоедон^еы КСР0д, реализованной на ЭВМ.

Работа выполнена на базе ВНИИЗ, часть экспериментальных результатов получена в ИБФМ РАН (г. Путдино), в САНИШг (г. Ташкент) и в Ереванском государственном университете.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ '

Установление видовой принадлежности стерильного мицелия. ввделенного из зерен розовоокрашенного ячменя

Для выяснения истинной природы розово-красной окраски зерен ячменя было проведено микроскопическое исследование их оболочек:-Было установлено, что окраска оболочек обусловлена пигментом, выделенным мицелием неизвестного гриба, на образующего;, на зерне органов спороношения. Отложение пигмента происходит,, в некоторых участках мицелия на наружной поверхности гифов. Пигмент кристаллизуется в виде игл,.которые , потом образует на мицелиигранулы и "муфты" оранжевого, красного или кирпично-красного цвета,-придающие оболочкам зерна розово-красную, окраску. ' ', . V , .-.■•>.'

• С .ррс^суедилизов^нных (0,1 % раствор НеСЛ^ ; I мин) розово-красныц з.ерен?были сняты цветочные и плодовые оболочки и разло- . , жены на агар:Чапека. Окрашенные целые зерновки посла поверхностнойстерилизации также были высеяны на агар,Чапека..'Выросшие ' V," пигментированные изоляты грибов были ввделены вчистухъкульту-

; РУ-: л о';■>.■:. •.;. ; V V: - ^'.'^'-/.Ч ' гл '-„''■',

Всего бьша. изолировано около;150'^изолятов,- способных; об- ' разовывать красные пигменты разных оттенков и разной степени . ' интенсивности.: Изоляты по характеру..ростам окрашиванию .и спо-; " роношению были .разделены на несколько групп; * . ' . ,_ ; • Изоляты первой :группы давали спороношение;" характерное " для-видов рода ' вр1ооссшд Пигменты этих грибов имели; желто- ,. •:. оранжевый цвет,,,были растворимы!впитательной среде; - ; ■ . -

Втору» группу СОСТаЗЛ"Л l рСЭ0В0-»ЗЛ."ТСР^9 ч0юн>*и грибов, относяшиеся к зия™ рс-я "uaariva . Малпневый пигмент этих /чолттсн тачго растгсрятс-г в питательной среда.

Третья Сояьаая группа .«золятов н^ образе «3"-ta органов спороно^ения гри ру^ьт^в *роз w • э ст I'trupr i ix „. словляг (ты/лота, агат '!-лек 1, °С). V-iear-1 - »"H-l л.* '<-;пго-^р с-ныЯ пигмент, сбрпует! v", из ~',ст"орпс<1 з пита-ечьнсЯ СТ>»50 >* EHfc Д!<3 ИЗ"С'«»*Чал cv"T*P4 ' 'р

с. о гбсчоч IX cv; I w'iix " p1 * (Op- 1, .У'Ъ). Ст - гр, 5 был i npp&mpi'ToibHi счесен-J ч г-\, : ijcaiia itorilia.

Дчн ст -¿j 1ЯЦП спорсоб; iso i - т- т еЯ

<j пьтирироча--, и-- I? - с" " tjx г т ~ "mi г< ср°-ах. К, сз того, гар,ирои«."и те-^лер iryp-fve г;*" s чьтиьлро^ан м (19 °С, ^ 1 °С, °С) и условия осредения: темнота, свет ( Л =360-390 ic), тампа дневного сзета.

Морфодого~культуралькь.е пр<сччки стершьных иэс~чтоз третьей группы на раол'чнлх cpe-t x'ohi i но г.1дс пментл.ю! Лэочлтч гплчх-.'сь топографией оюч«?, с -срост о роста, ч-~еНСИРНССТЫЭ Сno-JH П протслог 'Till 'en i .UMl.Vw сяосо ir-CTtti аыделять i с«по, а'п-ентч -*рчо-"таснсп, i-'/p-иного, оранжевого цвеюв. Но структуре «лонин * и i г-адмам, ",ар-стистши .ми со снопообразными „i рос гаг/ > ицелия ч осред/на .1ли по всей поверхности колонии.

Цвет колоний - кирпично-краснЫ. Окраска обуслордена оранжево-красным пигментом, скопленит кшсталлов которого покрывали отдетьные участки гиф субстратного мицелия или были разбросаны в субстрате, причем пигмент не растворялся в питательной среде. При старении культуры в окраске колоний начинали преобладать фиолетовые и оливковые тона.

На 6-ой день культивирования у большинства иэолятов наблюдалось образование спор.'

По морфологии органов спороношения, размерам конидий спорообразушиа изоляты были определены как Drechslera teres (Sace) ßhoem. Это бьшо подтверждено инокуляцией вегетирую-щих растений ячменя исследуемыми изоля7ами, при этом наблюдали признаки поражения .характерные для вида D, teres.

' Единичные, изоляты по морфологическим признакам органов спороноления были'определена как вид. Preohalera gramínea ( Bab. ex Schlecht ) вЬоев.

Следующее доказательство связи гриба Äre chele га с образованием розовых зерновок ячменя было получено при ми- -кологическом анализе фракций аномально окрашенных зерен, отобранных из пробы ячменя Нутанс 518, выращенной в 1990 г, в Белгородской области (табл. I). • , . .

Если во внешне нормальном ячмене . Drechsle» поражала, только 6 % семян, тов темном его численность резко возрастала (33 кол/100 семян) и бьша «аксимальной в розовых sep--.'" .нах (59 кол/100.семян).,Численность других видов, способных образовывать роэсво-красные пигменты, напротив снижалась в темных и розовых зерновках. В данном случае речь идет о видах родов ■ llternaria, Spiooccuo, 7u0&xiun>.

Следует подчеркнуть, что и'розовая и темная окраска зерновок . ячменя. обусловлена поражением одними и теки ке или близкими патогенами из рода Sreohelera Ito , . Можно предполо- , жить, что при старении¡грибов происходит окисление и коаден-сация антрахинонов, превращение' их 'в темноокрашенные слабо-растяорише соединения типа меланинов. .

Tai:s*a I

Цикофяора нормально, теуноокраввпннх в рзловсо .разеяных эерповоя ятаеня (коло¡itíí/103 з^рзч)

а. "?р JK-p-íiíi овр'ш Cuyeü : олкче-сгво грибов Alternarla spp« Стереть— кий ЦВД9ЛЙ Dre chale- Bipola- Kpi-ra epp. rie eo- соссша xoklnia- epp. na ïusarlun spp. Dooms

Hop.Jiaibhoe 88 32 14 6 18 10 Б С i

Tw we 91 17 18 33 6 14 2 I И1 о

Г- 9 I0G 13 19 59 4 8 2 I «

■ ' " . . - II - • '

Подобные процессы наблюдались нами при культивировании на агариэованных средах.

Таким образом, темные и розовые зерна этиологически близки и являются проявлениями одного или близких заболеваний ячменя, вызываемых грибами рода Drechsler* . Этот вывод был подтвержден при микробиологическом анализе 9 проб ячменя, отобранных от товарных партий на хлебоприемных предприятиях Ц40 (табл.2)

.-".-•Пробы характеризовались равным содержанием розовоокрашен-ных зерен.(О,9-7,0 %). Одновременно во всех пробах присутствовали зерна с чёрно-коричневыми лаковыми пятнами. Часто оба вида . окраски сопутствовали друг, другу.

• По мере увеличения содержания розовых зерен нарастача общая численность грибов. Увеличение происходило более всего за ; счет рода. Dreohalera.: Зависимость между поражением пробы грибами рода Dreoheler*. и количеством розовых зерен приближалось к прямой линейной (г =0,960). . "

Возможной совместное пормсениезерновок Dxeehalera ер.и В. eorokiniaaa . (г=0,576). Повидимсму, .виды . В* aorokiaiana также могут принимать в некоторых случаях участие в формировании розового ^,' в особенности, чзрно-коричневого окрашивания зерновок (х=0,726). Вэды *р1ооооит и »uearium не играют никакой роли. ,впоявлении данного рода окрашивания зерновок ячменя.

. Представители родог. Drechsler«, и Scolaris известны как продуценты антрахиноновых пигментов ( üsao -t 1934; Anke et al , i960). Поэтому в дальнейшем для подтверждения роли грибов рода Drechsle» в возникновении окраа/вания зерна был проведен сравнительный анализ пигментов;грибов и;зерна.-••.-.."

.Идентификация гомпонентоь состава пигментов -< -розовоокрашенного'зернаJk4NiOHH и гриба D« teges •

Цикофдора лроо aí .«и, содержав _ i г>. „¿j . г*.. л. лун

t/- Содергаииэ зерен, % Чкз.* 1 г, • . , 'IwZ „ )

ЯП püjOBO- гемго- cyiiyafr- Altar- ¡áycallb Eij<olax¿a Ь-гесЬ- Eplcoo- yuaarium

окрален- скрашен- нос naria awarl- tsoroki- alara oua app.

них HHX epp» Ha alona sjp. opp.

I 0,9 3,8 4,7 41 20 30 T 2 I

2 1,7 1,1 2,8 28 IB 35 n 3 7

3 1,8 1,0 2,6 37 17 T- + V 12 t 3

* •г 1.8 1,4 3,2 28 8 20 i: 2 - T

5 2,0 2,4 4,4 48 IG ir 1С 0

с 2,8 3,5 5,3 22 13 S3 22 С »»

7 2,9 1,6 4,5 33 31 с 2; I 0

8 3,9 3,3 7,2 II 12 23 29 0 I

9 7,0 2,4 9,4 63 8 -T •a - 5 *

_ 13 -

Пг.1 • явственном аналлзв ьнцвлвнноро препарата методом ТСХ б*ло установлено, что он сост<%.т Я индивидуальных соединений.

Для грубого делания пигмента грибов на компоненты 0,,. г сухого ведаства растворлли в I мл смеси гексан-ацетон (1:1) и наносили его на колонку см, заполненную счпикигелем Цвгок

(Ъ-40|и) и ур-*вновь аенную указанной смасью. ¿газирование ьеш той ге системой. Отблрали 3 ^рлцли: I (соединения .1-3), П (соединения ¿-5), и (соединения ¿-9).

1рахщ"Ю II посла упаривания перекроет ыниоеивали и горт-I «го -тегового спирта (или п смеси щатожексач). Цыпнвлш красные кристаллы (0,05-, г, -о () соединения 4 .шали 1П1--МУ °С. Дальнейшее разделение соединения фракции I, ь аточно! о раствора фракции И и фракции Ш осуществляли высокоэ {"{-активной 1СХ на пластинках К1ва1бв1 60 (Поток, 5РГ). Прояв 1вние вели в системе гексан:эфир:уксусная кислота (44:^7:1). В ряде случаев компонентный состав определяли на денситометре СЬхопоаоап-100 по поглощению при 440 нм (желтые фракции) и 5-.0 год (красные фракции).

Для соединений _2,3,_1,5 и '¿_ были сняты масс-спектры, позволяющие определить их молвку1ярну» массу, а для соединений 3,4^ и 5 получена также спектры поглощения в У2-видимой области и спектры ■'Н-хШР.

На основании типичной окраски, характера ее изменения в парах ыНз, по характерным масс-спектрам все выделенные компоненты пигмента отнесены нами к гидроксипроизводным метилантрахи-нона.

0 * в^н^ш с з )

С * )

ТОХТО) нп„н , н2ваз„н^н с 5 }

Ръ о Яг

Из 9-ти соединений, составляющих ввделенный пигмент, нами установлена структура 3-х: хриэофанол 3, эмодин 5 и катена-рил 4, который является основным компонентом пигмента. Малые количества остальных минорных соединений не позволили окончательно установить их структуру, однако полученные физико-химические данные позволяют отнести их к гидроксипроизводным мети-лантрахинона. .... '

Ввиду относительно низкого содержания пигментов в ячмене не представлялось возможным выделить и очистить их из зерна в количествах, достаточных для выполнения всего комплекса физико-химических анализов, необходимых для установления структуры соединений. ' , , - '*•

Идентификацию пигментов;розовоокрашенного зерна проводили на основании сравнения их хроматографических', спектральных и -, спектрально-люминесцентных характеристик с аналогичными характеристиками антрахиноновых пишентов гриба В» teres»

Было установлено, что комплекс окрашенных соединений в розо воокрашенном и тёмноокрашанном зёрнах ячменя состоял, также как и у D» teres из 7-9 окрашенных соединений. Хроматографическал ■ подвижность , цвет на хроматограммах •' в видимом и УФ-свете, а' также после обработки в парах аммиака былиидентичными-для пигментов зерна и гриба. ,, *. • ' V . . \ ;

Компонентный состав пигментов был также достаточно"близким Основным компонентом пигментов зерна являлось вещество;,близкое по В^ катенарину.; С помощью■препаративной < ТСХ основные соедине- • ния былч вццелены из зерна и охарактеризована по алектронным. спектрам; последние по.и?стыо:совпадали со спектральными характе ристиками хризофанола, катенарина и эмодина. Таким образом в розовом и тёмноокрашенном ячмене был обнаружен близкий состав пигментов.

Для дополнительного подтверждения идентичности пигментов розового зерна и О- tares были проведены спектрально-люминесцентные исследования окрашенных оболочек и соединения 5 (кате-иарина), являвшегося основным компонентом пигмента гриба. Спектр люминесценции катенарина, снятый непосредственно на хроматограм-ме при ?7К ( Л » 435 нм ), имел только один максимум излучения в области 590 нм. Аналогичный максимум наблюдался и в спектре люминесценции оболочек розовоокрашенного зерна. Спектры возбужде нил катенарина и оболочек окрашенного зерна также имели общий максимум при 435 нм. Таким образом, наблюдалось совпадение слек-трально-люыинесцентных характеристик катенарина и оболочек окрашенного зерна ячменя.

Для установления уровней загрязнения ячменя в природных условиях нами было исследовано содержание антрахиноновых пигментов в 9 пробах, отобранных от производственных партий и содержащих 0,9-7,0% розовоокрашенных и 1,0-3,8% темноокрашенных зерен. В пробах определяли концентрацию основного пигмента - катенарина. Результаты анализа показали, что между содержанием розовоокрашенных зерновок и концентрацией катенарина имеется корреляционная зависимость ( г «0,835 ), существенная при Р - 0,95. Между содержанием темноокрашенных зерновок и концентрацией катенарина связь несущественна ( г «0,121 ). Антрахиноновые пигменты накапливаются грибами и во внешне нормальноокрашенных зерновках. Ранее нами было показано, что в пораженной партии в таких зерновках также может присутствовать инфекция D. teres , которая и образует незначительные количества пигмента, маскируемые оболочками ячменя. Таким образом, в природных пробах ячменя максимальное количество антрахиноновых пигментов было обнаружено в розовоокра-

шенных и тёмноокрашенных зернах.

Факторы, регулирующие образование in тн+.г-г» антрахиноновых питентов р. taras

Образование пигментов, являющихся нторичными метаболитами многих грибов, регулируется комплексом факторов, из числа ко- . торых решающее, значение имеют температура, кислотность среды, освещение, химический состав субстрата.

Для выяснения влияния состава питательной среды на пигмен-тообразование D» teres нами были использованы следующие источники углерода, вводимые эквимолярно в среду Чапека: глюкоза, фруктоза, мальтоза., сахароза. Сравнивая визуально колонии грибов на агаре Далека с указанными источниками углерода, мы установили^ что наиболее интенсивное пигментообразование (оранжево-красное) наблюдалось на агаре Чапека с глюкозой.

Условия освещения заметно отражались на интенсивности образования пигментов D. teres".* Дневной свет подавлял синтез ан-. трахгаонов, и ускорял их метаболизацию. Наблюдалось быстрое потемнение колонии и превращение красных,пигментов в фиолетово- '. бурые'и коричневые соединения ¿вероятно; меланкны.; : .; '

Таким образом, в последующих опытах D» teres "культивиро-•, ' ?али в темноте на агаре %лека с глюкозой.*".-./•. ; ,

Оптимизация условий культивирования не* являлось самоцелью, она позволяла в дальнейшем1 добиться максимального выхода пигмента из культуры D* teres , -. необходимого для исследования химического■ состава и токсичности пигмента. ; ; > ; ; : ; ~ .

Температурный оптимум для накопления антрахиноновых* пигментов находился при 24°С..- Максимальное 'ко^вство-пигмвнтаг.быяо---^';. обнаружено на 21-е сутки культивирования.* Снижение темпзратуры. * ; культивирования до :15°С сушественно -подавляло и1пктаенгообра^ ,, •

¡ u. П-ы псв^_ечиt "evnep^Tjpj -o интенсивность

' itHHi антр^осинсноз била дсстаточчо нь.сскоИ, ч'ачс.я.у" ii.tr-I СГ5ра_)СВ<~НИЧ „ocritruci t ~чъ_е (н^ IC-ÍJ-в CJ TK.l) , Чь • Лр..

Пссче дост/^йН'я ч^^с-.та .чдб.-ъдзлосл сн/ внлй "онцачтрл-ллг* енттз. С.о "с^ь? блгь св^ано о „ыьнеД. «* цьлйчсч^еч ьг, л с 'чсисл л •jc-.^te t р , а частность лх ¡.р_Бра~.енле

i чоскра-шнн , n.'i^.HTi за счет .¡рсцесгои "сндьнсшлл л окис!' . ,,<-Г'СТчГТЬ. НО, < "ГТ .IX IX V/, iH уьо-и^а^иой с р iHi 9 О ОН. 4 i.JpüXO , <Т Л ^«'-leTübOtí И ) «.Те I .) ít'CieTOEC-Sj.p^e.

Сггг.а'а.-' ноя <~штность ¡лтагепьи т средл мля iui опльн.-и ачтрах! нснел'зс ь'Г-'внтоз иачод'-iCb в '.ре^елах pri L>,0-i>,b. лач д.ечлга Uetí подгдсаенле, тчч .чодделачлетние сред... резко ^люнь-■гала пыход и.тментов. Так, на среде с рН 3 пигментссбразОЕнние было крайне слабым.

3-,'янле члч.чнос?и с} 5страта п.* с птиа п.т iuhx ib D. tarea лэ/чал i ■> сл тис а^рлг11 сьо tб^а. inoro 1чманя разн^.' ало-лносгл.

Г> ¡ГСЗуЛ ПГь ЖСЛС " 1МЕ,ЧТЧ лГС- j СТОПОР ТиЯТ, ЧТО ОПГ.С'аЛиНь м

^ ею"■< сбр.я, ш.ч í4.^-.x.u!choi х л 'гченгой л ль-

1я'тся полнеешь 1врна 30"í. Hip ютчн te с( \зр»анич млкотоксинов .¡ролеходлт с \ветченлем илаедссти лерна. от -íO ' до 30 При ича^ностл !врна 17,5 % и сенее токсинообразование не наблюдалось.

Следовательно, подобно всем полевым грибам, виды Drechslera требуют дня своего развития очень высокой влажности субстрата, равновесной с относительной влажностью воздуха 95 % и более.Это объясняется тем, что этл грибы относятся к факультативным паразитам и приспособлены к существованию на г»ивом вегетирующем растении в поле.Условия влажности, создающиеся при храненил зерна, исключают возможность развития грибов рода Drachslara и накопление пигментов в зерне при храненич.

Фиготоксичеокив свойства п.

5еготоксины, продуцируемые многши фитопатогешшми грибами, являются важным фактором развития болезней растоний.

Антрахиноновые пигменты, продуцируемые D* tarea , возможно, также играют определенную роль в патогенезе растений. Обладая токсическим действием, они могут снижать жизнеспособность семян п рост проростков. - > ' • .

• Целью нашего' экспершента было изучение влияния аяграхшоно-вых пигментов на способность семян к прорастанию. При решении этой задачи мы проверяли фитотоксическое действие комплекса..веществ, выделяемых D* tarea в.жидкую среду, и препаратов пигментов гриба, . присутствие которых в производственных пробах часто связывают с■потерей-всхожести семян. .

В культуральной жидкости штамма D» teres Сом-5 не было обна,-ружено веществ, обладающих фитотоксщеским действием. Наблвдавше- -еся снижение всхожести зерен, угнетение ростков и корней растения било незначительным и недостоверным.' ; .• ...

Одним из" дэйствушцих начал гриба s* teres являются ангра-_ хиноновые« пигменты. Поэтому мы считали нужным определить всхожесть ■ ячменя при концентрациях пигментов, близких к;реально' рстречающш-' ся в зерне (2 мг/кг), а'также намного превосходящих их (10 мг/кг и 50 мг/кг). Поскольку'пигмент в таких концентрациях в.воде не /'-,.. растворяется, мы подщелачивали воду до рн;10,'4.\.Шд00в0:№0гвм: ■ • полифенолам*, антрахшоны способны в щелочной :среде:образовывать : феноляты, растворимые в воде. Токсичность пигмента, определяли по ростовым эффектам.При концентрации пигаента 2 мг/кг всхожесть ч зерен не отличалась от. контроля, с увеличением концентрации', до " '

П г/^ 1С.'е^лась тснда щ:.* ч сэ чгьеи зэ, а при Соле»* ьксэкс.! м , «грата' (оО .¡г/кг) восо с г.. ^оако иад-ла.

1Ь реа/льгатов "ате 'аг^иис^оь обра2о1КИ следуй?, ч^о д^о^ь^!' •> < лшьчша д..пш роогков I 1тода~ось л "~.ь при /.о^онграпи* гг.и -иа 7,0 т/1и, а -охаей - мь 3,0 т/к^. Слету о? ог-чти^ь, г^-^Саьа ьонцонграци, ¡хп! и нов в .к рио вс.рзчаюхч I • р ь' ¡е Г""Д-и> л .екляьтельчо с.'.ль'ю ¡гора теьних пор чихах. таып I , ! ис ихраСаг.лае час Вк. гегп о.сегва

гак к ач*рахшо1юаьо воцесгна, образуепыа эгш вице • гргЗов, длог слабил ч¡стото ю.пес1с~1 дэРсте^ч. Сгодуог подчерк 1уть, что в средних концентрациях, близких к встречающимся в природных условиях в ларне, пигмент не окалывал достоверного влияния ни на всхожесть, ни на длину ростков и корней семян ячменя и красного редиса.

'*з»-енечтга семенных свойств тозорооко; -»'того я"че"я тог •упа-течги

Устойчивость при хранении оемян ячменя о содержанием розово-окрашенных зерен изучали методом ускоренного старения (Лихачев, 1978), а гакае в лабораторных опытах по храпению при различных алажностных и температурных режимах.

Отобранные фракции розовоокрашенных и темноокрашенных семян ячменя влажностью 13,2 % были заложены на хранение при температуре 30°С и относительной влажности 80 %, т.е. при параметрах ускоряющих естественные процессы старения зерна. При закладке на хранение и через каздые 10 дней определяли энергию прорастания и всхокесть.

2 результате опыта было установлено, что семенные свойства розовоокрашенных »1 темноокрашенных зерен и контрольного варианта начинали сниматься после <¿0 дней хранения. Процессы старения,при-

водящие к ухудшению семенных свойств, протекали одинаково как в * опытах, так и в контрольных пробах.

Данный вывод был подтвервден в лабораторном опыте по хранению семян. Опыт был поставлен с пробой ячменя с содержанием розовоокра- . шенных и темноокрашенных зерен 6,4 и 1,6 % соответственно. Пробы * влажностью 14,3 и 15,9 О хранили при температурах 20,30 fC в стеклянной таре.

При хранении зерна влажностью 14,3 и 15,9 % при температура 30 °С падение всхожести наблюдалось в основном через 1-2 недели. Различия между контрольным и опытным вариантами не были установлены. При более низкой температуре (20 ?С) у зерен влажностью 15 ,9 ^ семенные свойства не снижались в течение 2,5 3 месяцев, а у зерен, влажностью 14,3 % сохранялись без изменений в течение 7.месяцев.

. Достоверных различий между контрольным и,опытным вариантами не наблюдалось. Таким образом, поражение'зерна ячменя грибами рода

Drechslera не приводило к ухудшению его семенных свойств при хранении в условиях, близких к создающимся в послеуборочный период Исследование биологической активности розового пигмента '

р.tares - в опытах с белыми мышами и тес?-организмами. -. 1>: ' Для оценки биологической активности бьш вьщелен суммарный препарат пигмента изолята гриба D. teres Сом-6. В качестве тест-« объектов были -.использованы следующие организмы: личинки жаброного : .

рачка irfcemia saline. , являющихся чувствительным тестом на присут-' ствие рада микотоксинов; Bacillus magateriuk V M-I, 394; белые мыши (внутрибрюшинное введение хлороформного раствора.пигмента). Пигмент проявил слабо выраженную биологическую активность по отношению к использованным тест-организмам (слабую токсичность при вну-трибрюшинном введении мышам и низкую бактерицидную активность).

Величина JWgQ пишента при внутрибрюшинном введении хлороформ-

ного раствора белым мышам составила 530 мг на кг веса животного, т.е. пигмент относится к очень малотоксичным соединениям. Достаточно сравнить с афлатоксином Bj, для которого величина Д%о колеблется для разных животных в пределах 0,3-17,9 мг/кг веса животного. Подобные результаты по оценке степени токсичности суммарного пигмента гриба В. teres были получены в лаборатории энзимологии Института питания РАШ.

Распределение пигментов D» tarea в зерновке ячменя.Опыты

по шелушению и шлифований розовоокрашенного ячменя.

В настоящем опыте исследовали проникновение мицелия гриба X). tares и ее метаболитов в различные анатомические части зерновки с целью опредаязния степени безвредности продуктов переработки розовоокрашенного ячменя продовольственного значения. Распределение мицелия гриба и его метаболитов изучали при последовательном удалении цветковых, плодовых и семенных оболочек в зерне ячменя за счет использования технологических приемов шелушения и шлифования. На цветковые оболочки (лузгу) приходилось 43,1 % всей массы пигмента. В плодовых н семенных оболочках, составляющих основу мучки, было обнаружено 39,3 % пигмента. В эндосперме зерна (ядре) после шелушения и шлифования оставалось незначительное количество антрахино-нов - 2,6 %. Полученные результаты хорошо согласуются с данными микроскопического анализа, показывающего» что розовый мицелий, принадлежащий грибу-патогену, сосредоточен в поверхностных слоях зерновки ячменя, в основном - в цветковых к плодовых оболочках.

вывода

I. Установлено, что возбудителем широко распространенного заболевания ячменя, приводящего к образованию розовоокрашенных зерен, являются виды несовершенных грибов из класса Eeuteromycates с< действа U'jaati&caao i Brechfllera taras ( Sacc ) óbogia. и Drecbsle^a graciasa ( Eab. ex Scbleoht ) Sboem-

1.1. Показано существование тесной положительной корреляционной зависимости меладу степенью поражения ячменя грибами рода Drechslera и количеством розовоокрашенных зерен.

1.2. Причиной порозовения зерновок ячменя является образование пигментов мицелием грибов рода Drechslera , которые развиваются преимущественно в цветковых, плодовых и семенных оболочках; в эн- ; досперм мицелий гриба практически не проникает. »

1.3. Интенсивность пигаентообразования в. teres зависит от состава питательной среды, величины рН, температуры и условий освещения. При культивировании D» teres на агаре Чапека с глюкозой; ( рН 5,5 , температура 24°С, темнота) создаются условия для наиболее интенсивного пишентообразования. ' . ^

2. Выявлено, что розовый пигмент D. teres ..состоит из 9 компонентов, являющихся гцдроксипроизводными антрахинонов. Три основных компонента идентифицированы как антрахиноновые пигменты - хризофанол, эмодин,' катенарин. ; ' : . •;'*

2.1. На основании сравнения хроматографических, спектральных . и спектрально-лшинесцентных'характеристик пигаентов роэовоокра-шенньос зерен ячменя и мицелия !>• teres была установлена их идентичность. ' . У ■ .'■'"/■'.'■.'.* •' .'--''V-

2.2. Природное загрязнение зерна ячменя мономерными антрахи-ноновыми пигментами ( катенарином, хризофанолом, эмодином) обнаружено впервые. ■'''.-.'■'*•. ; ^'-Д'' ,"-Vvv/V^*'"

3. Гриб D. teres синтезирует антрахиноновые пигменты на aep-» не лишь при его высокой влажности (30^) , что исключает накопление-\ антрахинонов и порозовение зерна при хранении. . . : .^N

4. Антрахиноновые пигменты локализованы в поверхностных слоях.

зерновки, основная их масса сосредоточена в цветковой пленке ( 43,1 % ), в плодовой и семенной ( 38,3 % ). В эндосперме обнаружено только 2,8 % суммы пигментов в зерне.

5. Антрахиноновые пигменты D» tarea в концентрациях, близких встречающимся в природных условиях в зерне, не оказывали достоверного влияния на всхожесть семян, а также на длину ростков и корней ячменя и красного редиса.

6. Поражение зерна ячменя грибами рода Drechalara не приводило к ухудшению его семенных свойств при хранении.

7. Показано, что пигмент гриба D. tarea относится к малотоксичным соединениям, проявляет низкую бактерицидную активность ПО отношению к тест объектам Bacillus megatarium и Artemia salina и слабую токсичность при внутрибрюшинном введении мышам. Величина ЛД^ составила 530 мг/кг веса животного.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Iwova L.S., Bhevchenko 7.1., Qrlova Н.Г., Bekdairova. G.I.

The natura of nonscabby pink kernels of rye and barley. //

fourth International Uycological Congress. Abstracta.- Raganaburg, 1990.

2. ЛьвоваЛ.С., Орлова Н.Ю., Бекдаирова Г.И., Хасанов Б.А., Глухова Л.А. Розовоокрашнный ячмень: возбудитель и химическая природа пигментов// Труды ВНИИЗ. - 1991. - вып.117. -с. 52-55.

3. Львова Л.С., Бекдаирова Г.И., Шевченко В.И., Орлова Н.Ю. Антрахиноновые соединения - новый класс токсических веществ, образуемых микроскопическими грибами в созревающем зерне // Тезисы докладов научной конференции "Научное обеспечение хранения и переработки растительного сырья в пищевой промышленности". -Москва, 199I. -о. 23-24.

е

Объем 1"г п л

Закал 25

Тираж 100

Типография Московской с ч академии им К. А Тимирязева 127550 Москва И 550 Тимирязевская ул, 44