Разработка технологии изготовления иммуноферментного набора для определения антител к Actinobacillus pleuropneumoniae

Шадрова, Наталья Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии изготовления иммуноферментного набора для определения антител к Actinobacillus pleuropneumoniae
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии изготовления иммуноферментного набора для определения антител к Actinobacillus pleuropneumoniae"

На правах рукописи

ШАДРОВА Наталья Борисовна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО НАБОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К АСТМОВАСШШ РЬЕШОРЖШОМАЕ.

03.00.23,- биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Владимир 2009

003472047

Работа выполнена в лабораториях диагностики бактериальных инфекций и микробиологии Федерального государственного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Прунтова 0.15.

Официальные оппоненты: доктор биологических паук

Телишевская Л.Я. (ФГУ «ВГНКИ»)

доктор ветеринарных наук, профессор Скородумов Д.И. (Московский государственный университет прикладной биотехнологии)

Ведущая организация: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина.

Защита состоится Ж 2009 г. в » часов на заседании

диссертационного совета Д.220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, тел/факс 253-14-91.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ». Автореферат разослан « £ » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, заслуженный ветеринарный врач РФ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микроорганизмы вида Actinobacillus pleuropneumoniae вызывают плевропневмонию свиней — инфекционную контагиозную болезнь, характеризующуюся при остром течении геморрагическим воспалением легких и фибринозным плевритом, а при подостром и хроническом — развитием очаговой гнойной некротизирующей плевропневмонии и фибринозным плевритом (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, 1986; М. Gottschalk, D.J. Taylor, 2007).

Этому заболеванию подвержены поросята всех возрастов (R. Nielsen, 1982).

Актинобациллезная плевропневмония широко распространена по всему миру и наносит значительный урон свиноводческим хозяйствам за счет большого падежа свиней, затрат на лечение больных животных и проведение ветеринарно-санитарных мероприятий (Д.И. Скородумов, 1997; J.T. Bosse, 2002).

Особенностью данного заболевания является возможное субклиническое течение инфекции (часто после лечения антибиотиками), а также бактерионосительство без внешних проявлений болезни, которое представляет потенциальную опасность при формировании нового, смешанного стада (L.V. Andersen, 2004; F. Haesebrouck, 1997). В таком случае вспышка происходит внезапно, болезнь носит острый характер, часто с привлечением сопутствующей микрофлоры, что приводит к значительному экономическому ущербу. Поэтому выявление серопозитивных животных является важным звеном в противоэпизоотических мероприятиях при данном заболевании (R. Desrosiers 2004, D.J. Taylor, 2007).

Принятые в нашей стране методические указания по лабораторной диагностике гемофилезной (актинобациллезной) плевропневмонии свиней, утвержденные в 1981 г., не предусматривают проведения серологических исследований (Б.И. Антонов, 1986). В то же время, в ряде стран ЕС и Северной Америке широкое распространение в диагностике актинобациллеза нашли методы выявления антител с помощью, как традиционных

серологических реакций, так и иммуноферментного анализа (K.R. Mittal, 1992; V. Sorensen, 1997, J. Klausen, 2002).

Являясь одним из сравнительно "молодых" методов, базирующихся на использовании антител, конъюгированных с различными ферментами, ИФЛ по многим параметрам превосходит традиционные методы диагностики: по чувствительности, специфичности и производительности, быстроте получения результатов, возможности стандартизации условий постановки анализа, доступности широкому кругу практических учреждений (Y.L. Trottier, P.F. Wright, Е. Nilssno, 1993).

Указанные преимущества этого метода способствовали его выбору для изучения возможности использования в качестве метода выявления и количественного определения антител к бактериям A.pleuropneumoniae.

Кроме того, важным аспектом в диагностике актинобациллезной плевропневмонии является определение серовариантной принадлежности циркулирующих в хозяйствах штаммов A.pleuropneumoniae (B.C. Русалеев, 2007).

До настоящего времени в РФ отсутствовали отечественные коммерческие диагностикумы для выявления антител в сыворотках крови свиней к бактериям A.pleuropneumoniae и серотипирования изолягов A.pleuropneumoniae. Исходя из этого, проведение работ по получению диагностикумов для выявления антител к бактериям A.pleuropneumoniae является актуальной задачей, имеющей научное и практическое значение.

Цели и задачи исследования. Целью наших исследований была разработка иммуноферментного набора для выявления антител против бактерий A.pleuropneumoniae в сыворотках крови свиней.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- получить специфические препараты антигенов и сывороток на лабораторных и естественно-восприимчивых животных для использования в качестве компонентов в РА и ИФА;

- обосновать схему постановки реакции агглютинации для выявления антител к бактериям A.pleuropneumoniae микрометодом и изучить

возможность её использования для серотипирования выделенных изолятов бактерий А.р1еигорпеитотае;

- разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения антител к бактериям А.р1еигорпеитотае в сыворотках крови свиней;

- провести серологический мониторинг в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней в свиноводческих хозяйствах Российской Федерации.

Научная новизна работы:

- получены специфические компоненты А.р1еигорпеитотае для ИФА;

- обоснована схема постановки реакции агглютинации микрометодом для серотипирования изолятов бактерий А.р1еигорпеитотае;

разработана иммуноферментная тест-система для выявления специфических антител к бактериям А.р1еигорпеитотае в сыворотках крови свиней при тестировании их в одном разведении;

- проведена сравнительная оценка результатов исследований сывороток крови свиней, с использованием разработанного непрямого варианта ИФА, реакции агглютинации и импортного иммуноферментного коммерческого набора;

- проведен серологический мониторинг свинопоголовья в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии.

Практическая значимость. Штаммы бактерий АмтоЬасШиз р1еигорпеитотае «Г-1», «Ш-1», «К-2», выделенные на территории РФ депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГУ «ВГНКИ».

Экспериментальные данные диссертационной работы явились основой для разработки методических рекомендаций по получению специфических компонентов для постановки РА и ИФА.

Разработана нормативная документация на набор для выявления антител к бактериям АсИпоЬасШш р1еигорпеитат'ае и сыворотках крови свиней иммуноферментным методом.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на заседаниях Ученого Совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2004-2009 гт, на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» - Владимир, 2004; на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 50-летию ФГУ «ВЫИИЗЖ» - Владимир, 2008 г.

Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, одна из них в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 15 рисунками. Список использованной литературы включает 175 источников, из них 141 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения биологических свойств штаммов бактерий А.р1еигорпеитотае, депонированных во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГУ «ВГНКИ»;

- серотипирование изолятов бактерий А.р1еигорпеитоп'ше в РА микрометодом;

- разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае при тестировании сывороток крови свиней в одном разведении;

- результаты применения разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к бактериям A.pleuropneumoniae при определении динамики накопления иоствакцинальпых антител и проведении серологического мониторинга в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы

Работа выполнена в 2004-2009 гг. в лабораториях микробиологии и диагностики бактериальных инфекций животных, ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.

Штаммы микроорганизмов. В работе использовали референтные штаммы бактерий, полученные из Американской коллекции типовых культур: A.pleuropneumoniae №27088 (серотип 1); №27089 (серотип 2); №27090 (серотип 3); №33377 (серотип 5); № 33590 (серотип 6); Pasleurella multocida штамм № 11039; Haemophilus parasuis штамм №19417. Штаммы бактерий A.pleuropneumoniae «Г-1», «Ш-1», «К-2», выделенные на территории РФ, депонированные в ФГУ «ВГНКИ». Штаммы Salmonella typhimurium №371, и Yersinia enterocolitica №3, полученные из ФГУ «ВГНКИ».

Питательные среды. Для культивирования бактерий использовали питательные среды на основе мясного перевара по Хоттингеру с добавлением 10% дрожжевого экстракта.

Лабораторные животные. Для получения специфических сывороток в качестве доноров использовали клинически здоровых кроликов в возрасте 90-180 дней с массой 2,5-3,0 кг и свиней в возрасте 8 недель, массой 25-30 кг.

Сыворотки. Специфические сыворотки кроликов и свиней, используемых в качестве положительных контрольных сывороток, получали путем иммунизации доноров инактивированными антигенами A.pleuropneumoniae, Н. parasuis, P. multocida, S. typhimurium.

Нормальную сыворотку крови кроликов и свиней получали от здоровых доноров, не имеющих антител к вышеперечисленным бактериям.^

Коммерческий диагностический набор. В работе использовали коммерческий набор «СЛУТЕБТ АРР» («Н1Р11А», Испания) для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитоп1ае в сыворотках крови свиней.

Биохимические свойства бактерий А.р1еиюрпеитотае определяли с использованием культур не старше 18-20 часов, выросших на плотных питательных средах и системы индикаторной бумажной (СИБ) для идентификации микроорганизмов (ФГУ «НПО «Микроген» МЗ РФ).

Антигены для серологических реакций. В качестве антигена для проведения реакции агглютинации (РА) использовали суточную агаровую культуру актинобацилл, приготовленную по методу К.II. М1Иа1 (1982). Антигены считали активными, если в реакции с гомологичной сывороткой они образовывали видимые невооруженным глазом агглютинины в разведении сыворотки 7,6 и выше. Для постановки реакции диффузной преципитации (РДП) антигены изготавливали по методу К.II. Мта1 (1983).

Определение серовариаитной принадлежности штаммов А.р1еигорпеитотае. Серовариантную принадлежность штаммов А.р1еигорпеитотае определяли в РДП, в РА на планшете и в РА на стекле. При серотипировании штамм относили к тому серотипу антисыворотка, которого демонстрировала наивысший титр.

Антигенное двустороннее родство (К) штаммов устанавливали, используя результаты, полученные в количественной РА, по формуле Архетти и Хорсфала (I. АгсЬеШ е1 а1., 1950; Ю.А. Черняев и соавт., 1973):

II > 70% при 3-кратном титровании свидетельствует о статистически достоверном родстве испытуемых штаммов.

Антигены для ИФА. Для ИФА использовали липополисахаридные антигены, полученные по методике. 8. Яаёасоу1с1 е1 а1. (1994). Активность и специфичность антигенов проверяли в непрямом варианте ИФА.

Пероксидазные конъюгаты. В качестве антивидовых конъюгатов использовали коммерческие диагностические антитела против иммуноглобулинов кроликов и свиней, выпускаемые НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Рабочее разведение конъюгата определяли при проведении непрямого варианта ИФА.

Иммупофермснтный анализ. В работе применяли непрямой вариант ИФА, оптимальные условия постановки которого определяли экспериментально. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин (ОФД) и 2,2'-азино-ди(3-этилбензотиазолина-6-сульфокислоты)

диаммониевой соли (АБТС). Результаты реакции учитывали на сиектрофотометрс-ридсре при длине волны 492 нм для ОФД и 405 нм для АБТС.

Статистическая обработка результатов.

При анализе и обобщении результатов исследований были использованы методы, описанные И.П. Ашмариным, A.A. Воробьевым (1962), H.A. Плохинским (1970), Н. Бейли (1962). Кроме того, для обработки данных применяли компьютерную программу «Statistica».

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Изучение биологических свойств штаммов бактерий A.pleuropneumoniae

На плотных питательных средах с добавлением дрожжевого экстракта через 16-18 ч культивирования при температуре 37°С актинобациллы формировали мелкие, полупрозрачные, округлой формы с ровными краями и вязкой консистенции колонии S-формы диаметром 0,5-1,2 мм (.A.pleuropneumoniae «Ш-1» и «К-2») и 0,2-0,8 мм (A.pleuropneumoniae «Г-1»),

В мазках, окрашенных по Граму, возбудитель представлял собой грамотрицательные, мелкие полиморфные палочки. При окраске мазков по Бури-Гинсу отмечали наличие у бактерий капсулы.

При изучении биохимических свойств культур A.pleuropneumoniae было отмечено, что псе штаммы обладали оксидазпой, уреазпой и бега-

гемолизной активностью, не продуцировали индол и сероводород, не утилизировали цитраты. Штамм «Ш-1» отличался от других штаммов по ферментации глюкозы, лактозы и арабинозы, а штамм «К-2» ферментировал лактозу, но был не активен в отношении маннита.

2.2.2. Определение серовариантиой принадлежности штаммов А.р1еигорпеитошае

Серовариантную принадлежность выделенных штаммов А.ркигорпеитотае определяли в следующих серологических реакциях: РА, РА на стекле и РДП.

Для изготовления антигенов и получения специфических сывороток крови кроликов были использованы культуры бактерий А.р1еигорпеитотае, референтных штаммов: № 27088 (серотип 1), № 27089 (серотип 2), № 27090 (серотип 3), № 33377(серотип 5), № 33590 (серотип 6) и изучаемых штаммов «Г-1», «Ш-1» и «К-2».

По результатам качественных реакций; РА на стекле и РДП, штамм «Г-1» был отнесен к серотипу 1, штамм «Ш-1» - к серотипу 2, штамм «К-2» -к серотипу 6. Эти данные подтверждали в количественной РА, выполняемой микрометодом, результаты которой позволили рассчитать степень антигенного родства изучаемых штаммов к референтным (табл. 1).

Антигенное родство штамма «Ш-1» к сероварианту 2 составило 67,5+5,4%, штамма «К-2» к сероварианту 6 - 70,5+15,4%, штамма «Г-1» к сероварианту 1 - 70,5+15,4%.

Таблица 1

Антигенное родство штаммов А. ркигорпеитотае (1*%) в РА

(п=3)

Штаммы А.р1. 27088 серотип 1 27089 серотип 2 27090 серотип 3 33377 серотип 5 33590 серотип 6 «Ш-1» «К-2» «Г-1»

«Ш-1» 0,4+0,1 67,5+5,4 0,7+0,1 0,4+0,1 2,2+1,8 100 2,1+0,9 0,8±0,1

«К-2» 2,1 ±0,9 4,63+0,4 1,7+0,3 0,4+0,2 70,5+15,4 2,1 ±0,9 100 0.8+0,1

«Г-1» 70,5+15,4 0,8+0,1 '2,1 + 1,1 0,8+0,1 0,4+0,1 1,0±0,1 0,4+0,2 100

11римечанис: при К > 70% штаммы принадлежа! к одному ссронариамту.

На основании полученных результатов нами были разработаны методические рекомендации по получению антигена и гипериммунной сыворотки крови кролика, специфической к бактериям A.pleuropneumoniae для постановки реакции агглютинации, утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ».

Для дальнейшей работы были использованы штаммы A.pleuropneumoniae: «Г-1» (серотип 1), «Ш-1» (серотип 2) и «К-2» (серотип 6), выделенные на территории Российской Федерации. В 2009 году данные штаммы бактерий были депонированы в коллекции микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» в качестве производственных штаммов для изготовления диагностических наборов и вакцины против актинобациллезной плевропневмонии свиней.

2.2.3. Выбор антигена A.pleuropneumoniae для ИФА

По данным литературы, в качестве антигена для ИФА используют как цельные бактериальные клетки, так и отдельные клеточные компоненты и токсины (J. Nicolet, 1981; J.T. Bosse, 1990; М. Gottschaik, Е. Altman, 1994; R. Nielsen, J.F. Bosch, 2000). Мы исследовали следующие антигены A.pleuropneumoniae: липополисахаридный (ЛПС), капсульный (К-АГ), соматический (О-АГ), формалинизированный (Ф-АГ), и антиген, полученный путем кипячения (100°С-АГ).

Для оценки их активности и специфичности реакцию проводили с гипериммунными сыворотками крови свиней, полученными к Ф-АГ бактерий A.pleuropneumoniae: «Г-1», «Ш-1», «К-2»; P.multocida №15742; H.parasuis №19417; S.typhimurium №371. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотки крови свиней, не содержащие антитела к вышеперечисленным бактериям.

Специфичность и активность антигенов А.р1еигорпеитотае, в ИФА

антигены Титры антител сывороток *

Контрольные сыворотки Гетерологичные

N8** положительные Р.гп. Н.рБ.

Г-1 Ш-1 К-2

Штамм «Г-1»

ЛПС 133+58 5333+1847 333+115 333+115 167+58 167+58

К-АГ 167+58 2667+924 1333+462 1333+462 1333+462 4266+1847

О-АГ 133+58 1333+462 333+115 333+115 333+115 1333+462

Ф-АГ 133+58 2667±924 333+115 333+115 333+115 666+231

100°С-АГ 167+58 4266+1847 666+231 1066+462 333+115 333+115

Штамм «Ш-1»

ЛПС 133+58 333+115 8593+3695 333+115 167+57,7 133+57,7

К-АГ 133+58 1066+462 5333+1847 1066+462 1066+462 333+115

О-АГ 167+58 666+231 2667+924 666+231 1066+462 1066+462

Ф-АГ 133+58 1066+462 5333+1847 333+115 333+115 1066+462

100°С-АГ 133+58 333+115 4266+1847 1066+462 266+115 266+115

Штамм «К-2» .

ЛПС 100+0 333+115 333+115 10667+3695 167+58 167+58

К-АГ 167+58 1333+462 1066+462 5333+1847 333+115 1066+462

О-АГ 167+58 666+231 666+231 5333+1847 666+231 333+115

Ф-АГ 133+58 333+115 1066+462 2667+924 333+115 1333+462

100°С-АГ 167+58 333+115 333+115 4266+1847 1066+462 333+115

Примечание: * титры антител сывороток выражены величиной, обратной разведению и представлены в виде М^п ** контрольная отрицательная сыворотка

Каждый антиген титровали в шахматном порядке с гипериммунной сывороткой и выбирали оптимальное разведение антигена по значению оптической плотности положительного контроля, которое должно составлять 0,8-1,2 o.e. Затем антиген в выбранном разведении исследовали на специфичность с различными гетерологическими сыворотками. Сыворотки вносили в лунки планшета, начиная с разведения 1:100, с двукратным шагом. За титр сыворотки принимали разведение, в котором значение оптической плотности в 2 раза превышало значение отрицательного контроля.

В результате установлено (табл. 2), что при постановке ИФА методом последовательных разведений титры положительных контрольных сывороток составляли с гомологичными антигенами не менее 1333+462 а титры отрицательных контрольных сывороток - не более 167+58 со всеми препаратами антигенов.

Кроме того, необходимо отметить, что из всех рассмотренных антигенов штаммов «Г-1», «LLI-1» и «К-2» более специфичными были ЛПС антигены, которые взаимодействовали с гетерологичными сыворотками с титром антител не выше 167+58 что соответствует уровню отрицательной сыворотки. Антигены остальных трех штаммов показали перекрестные реакции с некоторыми гетерологичными сыворотками.

На основании этих результатов, в качестве антигена для иммуноферментного анализа, нами был выбран липополисахаридный антиген.

2.2.4. Разработка иммунофермснтной тест-системы для определения антител к бактериям A.pleuropneumoniae Оптимизации условий постановки непрямого варианта ИФА.

Определение оптимальных условий для проведения непрямого варианта ИФА состояло из подбора наиболее подходящих буферных систем с оптимальной ионной силой для сорбции антигена на планшеты, блокирующих растворов, а также определения времени адсорбции компонентов реакции и температурного режима.

Было установлено, что использование 0,1М карбонатно-бикарбонатного буфера (рН 9,5-9,6), температуры 4°С и режима сорбции 16-18 часов являются наиболее оптимальными для сенсибилизации лунок планшета ЛПС антигенами. Для всех последующих стадий использовали 0,05М трис-НС1 с 0,2М 1МаС1 буферный раствор (рН 7,4-7,6). Блокирование остаточных свободных центров связывания в лупках планшетов с адсорбированным антигеном проводили 1% раствором сухого обезжиренного молока.

Определение оптимальных разведений препаратов антигена и конъюгата. В связи с тем, что ЛПС-АГ не содержит белок, определить оптимальную концентрацию вносимого в лунку антигена по количеству белка не представляется возможным. Поэтому оптимальное разведение антигенов определяли путем постановки ИФА методом последовательных разведений. За рабочее разведение принимали последнее разведение антигена, при которой значение оптической плотности контрольной положительной сыворотки было в диапазоне 0,8-1,2 о.е.

Установлено, что оптимальное разведение антигенов при нанесении на планшеты составило для

ЛПС АГ А.р1еигорпеитотае штамм «Г-1» — 1:6400 (12,64 ^г);

ЛПС АГ А.р1еигорпеитотае штамм «Ш-1» - 1:3200 (11,64 ^2);

ЛПС АГ А.р1еигорпеитотае штамм «К-2» - 1:6400 (12,64 1о§2).

При исследовании влияния различных разведений коныогата на специфическую активность положительных контрольных сывороток, установлено, что оптимальное разведение антисвиного конъюгата составило 1:500.

Получение комбинированного антигена. Для получения комбинированного ЛПС антигена использовали штаммы актинобацилл «Г-1» серотип 1, «Ш-1» серотип 2 и «К-2» серотип 6, выделенные на территории Российской Федерации. Антигены смешивали в соответствии с определенными рабочими разведениями для каждого серотипа. Было установлено, что активность мои» антигенов в составе комбинированного

антигена снижалась незначительно, значения оптической плотности контрольных сывороток оставались в заданном диапазоне (0,8-1,2 o.e.), и составили для сыворотки, полученной на штамм «Г-1» - 0,92+0,11 o.e., для сыворотки, полученной па штамм «Ш-1» - 0,87+0,06 o.e., для сыворотки, полученной на штамм «К-2» - 0,89+0,08 o.e. (табл 3).

Таблица 3

Активность моно- и комбинированного антигенов с гипернммунными сыворотками крови свиней в ИФА

Сыворотка положительная Значение ОП / антигены

Г-1 серотип 1 Ш-1 серотип 2 К-2 серотип 6 комбинированный антиген

«Г-1» (серотип 1) 1,10+0,12 0,28+0,05 0,32+0,06 0,92+0,11

«Ш-1» (серотип 2) 0,35+0,05 1,1+0,09 0,50+0,03 0,87+0,06

«К-2» (серотипб) 0,39+0,07 0,42+0,04 0,96+0,11 0,89+0,08

Выбор условий хранения комбинированных антигенов на планшете. Сохранение исходной активности иммобилизованного комбинированного ЛПС антигена проверяли через 24 часа, а далее через 1, 3, 6, 12 месяцев при хранении при температуре 4-8°С, определяя отношение оптической плотности положительного контроля к оптической плотности отрицательного контроля в ИФА при разведении сыворотки 1:400.

Активность комбинированного ЛПС антигена А.р1еигорпеитотае через 1 месяц снижалась на 1%, через 3 месяца на 5%, через 6 месяцев на 8%, а спустя 12 месяцев на 14%, по сравнению с исходной (24 ч). Таким образом, было установлено, что иммобилизованный на планшеты комбинированный ЛПС антиген сохраняет специфическую активность при температуре 4-8°С в течение 12 месяцев.

Сравнительная оценка результатов выявления антител к бактериям А.р1сигорпеитотае в непрямом варианте ИФА и в РА. При сравнительном исследовании сывороток крови свиней в РА и Н-ИФА, установлено, что сыворотки, имеющие в реакции агглютинации наименьший

тигр 3,55 log2, иоказали при тестировании в И-ИФА титр 6,64 log2, а сыворотки с максимальным значением титра в РА-10,29 log2, имели титр в I I-ИФА 13,64 log2. Коэффициент корреляции составил 0,89. Таким образом, результаты полученные с помощью непрямого ИФА, были сопоставимы с базовой реакцией, что позволяет применять разработанную тест-систему для выявления антител к бактериям A.pleuropneumoniae в сыворотках крови свиней.

Разработка пммуноферментной тест-системы дли выявлении антител к бактериям A.pleuropneumoniae при тестировании сывороток крови свиней в одном разведении. Разработка тест-системы включала в себя определение рабочего разведения сывороток, выведение уравнения линейной регрессии для вычисления титра, определение оптимального диапазона оптических плотностей контролей и установление позитивно-негативного порога.

Определение рабочего разведении сыворотки крови свиней и расчет титра антител. При тестировании сывороток крови свиней методом одного разведения, согласно литературным данным, результаты, как правило, представляют в виде S/P отношения величин оптической плотности исследуемой сыворотки (S) и положительного контроля (Р) (D.G. Snyder, 1983; Y.L. Trottier, P.F. Wright, 1992; X. Rebordosa, 1999).

Для определения оптимального разведения сыворотки методом последовательных разведений тестировали сыворотки крови свиней с различным уровнем антител к бактериям A.pleuropneumoniae (80 сывороток). Для разведений 1:100, 1:200, 1:400 вычисляли значения S/P.

Полученные результаты обрабатывали с помощью компьютерной программы "Statistica", которая позволила рассчитать значения параметров уравнения, значение коэффициента корреляции, стандартную ошибку и построить линейную регрессию для каждого из выбранных разведений. Наиболее высокий коэффициент корреляции (R=0,9139 - для субстрата ОФД, 11=0,9195 - для субстрата АБТС) с наименьшей стандартной ошибкой

(0,058322 - для ОФД, 0,04211 - для АБТС) был получен для разведения 1:400. Поэтому данное разведение было выбрано в качестве рабочего.

Коэффициенты уравнения, соответствующие этому разведению использовали для расчета суммарного титра антител к бактериям Л.р1еигирпеипютае при тестировании сывороток в одном разведении.

Исходя из значений оптической плотности (ОП) исследуемых сывороток, для двух субстратов, были построены калибровочные прямые и выведены уравнения линейной регрессии определения титров (рис. 1).

А В

Рис. 1. Уравнения линейной регрессии и калибровочные прямые для определения титра антител к бактериям А.р1еигорпеитотае в Н-ИФА (А-субстрат ОФД, В-субстрат АБТС)

Определение допустимых величин оптической плотности контрольных сывороток. Диапазоны допустимых значений оптической плотности (ОП) отрицательного и положительного контролей являются обязательными для тест-систем ИФА (У.Ь. ТгаШег, 1993).

Для определения допустимых величин контролей, исследовали в 5 повторностях 10 положительных сывороток и 10 отрицательных контрольных сывороток. Все сыворотки были предварительно оценены с помощью набора «ОУТЕБТ АРР» и в РА. На различных планшетах исследовали вариации значений оптической плотности контролей в разведении 1:400. Полученные результаты позволили рассчитать

соответствующие средние величины, стандартные отклонения и 95% доверительный интервал оптических значений контролен.

Было показано, что допустимые значения оптической плотности контрольных сывороток находятся в диапазоне: для положительного контроля - от 0,72 до 1,16 o.e. (ОФД), от 0,69 до 1,21 o.e. (АБТС), для отрицательного контроля - от 0,07 до 0,18 o.e. (ОФД) и от 0,08 до 0,2 o.e. (АБТС).

Определение позитивно - негативного порога. Одним из важных аспектов при разработке непрямого варианта ИФА и интерпретации его результатов является обоснование пороговых значений S/P и титра, разграничивающих неспецифическую (отрицательную) и специфическую (положительную) реакции. Для этого в непрямом варианте ИФА определяли значения оптической плотности 100 образцов сывороток, не имеющих антител к бактериям A.pleuropneumoniae и предварительно протестированных с помощью «CIVTEST АРР» и РА.

Среднее значение оптических плотностей исследованных сывороток, суммированное с утроенным стандартным отклонением, составило значение ОГ1, соответствующее наименьшему положительному значению. По уравнениям линейной регрессии определяли пороговые значения S/P и находили пороговые значения титра, которые составили 330 для ОФД, 410 для АБТС. С учетом возможных погрешностей, допустимых в пределах одного разведения, где Т/2<Т>Тх2, выделяли зону сомнительных значений.

Таким образом, для субстрата ОФД, титр антител в пределах 0-330 считали отрицательным, 331-660 - сомнительным, от 661 и выше -положительным; для АБТС: 0-410 - отрицательным, 411-820 -сомнительным, от 821 и выше - положительным.

Сравнение чувствительности и специфичности разработанной нммуноферментной тест-системы с РА и коммерческим набором ИФА

Параллельное тестирование 212 полевых сывороток крови свиней проводили с использованием коммерческого иммуноферментпого набора

«СИУТЕБТ АРР», разработанной иммуноферментной тест-системы Н-ИФА «ВНИИЗЖ» и РА (табл. 4).

Таблица 4

Результаты тестировании сывороток крови свиней, полученные но _ данным серологических тестов_

Количество сывороток

Результаты Н-ИФА С1УТЕБТ АРР РА

положительные 132 138 139

отрицательные 64 65 66

сомнительные 16 9 7

всего 212 212 212

Чувствительность непрямого варианта ИФА относительно реакции агглютинации составила 94,9%, а относительно С1\ИГЕБТ АРР - 95,6%. Специфичность разработанной нами тест-системы составила 96,9% относительно РА, и 98,4% относительно ОУТЕБТ АРР.

2.2.5. Иммунологический мониторинг свинопоголовья в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии на свинокомплексах

Российской Федерации Определение динамики накопления поствакцинальных антител

Для изучения динамики накопления поствакцинальных антител, используя разработанный вариант непрямого ИФА, тестировали сыворотки крови свиней, полученные после применения инактивированной вакцины против актинобациллезной плевропневмонии, изготовленной в ФГУ «ВНИИЗЖ» (рис. 2).

Вакцину, согласно наставлению вводили животным внутримышечно, в объеме 0,5 мл двукратно с интервалом 21 день. Одна прививная доза содержала бактерии трех серотипов: серотипа 1 (2х109м.к.), серотипа 2 (2х109м.к.), и серотипа 6 (2х109м.к.).

На 21 день после первой иммунизации, отмечали нарастание титра антител, определяемого в Н-ИФА в пределах 8,73+0,48 что

соо тве тствует зоне сомнительных •значений.

13 12 Н

)

11 10

е- ,

□ до иммунизации

ш после 1-ои иммунизации

□ после 2-ой иммунизации

N 0- -ъ (X <о Л <Ъ °> ^ ^ <Ь ^ ^ Ч<Ь чо> г^ № животного

ПНП

Рис. 2. Тигр антител (1(^2) в сыворотках кропи свинсй к А.ркигорпеитошае до и после иммунизации инактивировапной вакциной, по данным Н-ИФА

Спустя 21 день после второй иммунизации среднее значение титра антител возросло и достигло значения 10,94+0,9 что соответствует зоне положительных сывороток. Полученные данные наглядно демонстрируют динамику накопления поствакцинальных антител в крови иммунизированных поросят.

Серологический мониторинг в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии на свинокомнлексах РФ,

проведенный с применением разработанных наборов ИФА С целью проведения серологического мониторинга по актинобациллезной плевропневмонии свиней в ИФА, были исследованы 2254 сыворотки крови животных, не подвергавшихся вакцинации, присланные в 2004-2008 гг. из 258 свииоводческих хозяйств, расположенных в 16 регионах РФ.

Результаты исследований указывают на значительный процент положительных проб сывороток крови свиней из хозяйств Московской и Белгородской областей 44,8% и 31,6%, соответственно. При этом следует

обратить внимание на то, что в хозяйствах, где наблюдали высокий показатель положительных проб, животные были закуплены за рубежом.

В целом, из общего количества исследованных проб сывороток было выявлено 12,7% положительных, что говорит о возможной циркуляции возбудителя А.р1еигорпеитотае по крайней мере в 10 различных регионах нашей страны.

Таким образом, разработанная тест-система на основе непрямого варианта ИФА может быть использована для оценки уровня накопления антител в сыворотках крови вакцинированных свиней, а также при проведении серологического мониторинга в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней.

2.2.6. Технологическая схема производства иммуноферментного набора для определения антител к бактериям А.р1еигорпеитошав

Проведенные исследования по разработке и испытанию иммунофементной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА явились основанием для создания коммерческого иммуноферментного набора для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае.

В результате проведенной работы были получены компоненты диагностического набора:

препарат антигена, обладающий высокой активностью и специфичностью, пригодный для хранения на планшетах (не менее 12 месяцев);

- иммуноспецифическая сыворотка крови свиней;

- нормальная сыворотка крови свиней.

Кроме того, в состав диагностического набора были включены набор солей для приготовления буферного раствора для разведения испытуемых и контрольных проб, антивидового конъюгата, межэтапных промывок и приготовления стоп-раствора, антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против свиней; субстрат - раствор АБТС.

Рис. 3. Стадии технологического процесса изготовления наборов ИФА

Компоненты, входящие в состав набора, по своим физико-химическим и биологическим свойствам проходят проверку на соответствие требованиям и нормам СТО 00495527-0110-2009, при проведении входного и внутреннего контролей.

Производство наборов для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитоп'ше в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических и биологических процессов, включающий разнотипное оборудование, связанное между собой материальными и энергетическими потоками и образующих технологическую линию (рис.3).

3. ВЫВОДЫ

1. Изучены культурально-морфологические и биохимические свойства штаммов бактерий А.р1еигорпеитотае «Г-1», «Ш-1» и «К-2». Было установлено, что штамм «Ш-1» отличался от других штаммов по ферментации глюкозы, лактозы и арабинозы, а штамм «К-2» ферментировал лактозу, но был не активен в отношении маннита.

2. Получены иммуноспецифические компоненты: препараты антигена и гипериммунные сыворотки для серологического типирования изолятов бактерий А.р1еигорпеитотае в РА. Установлено, что штамм «Г-1» относится к серотипу 1, штамм «Ш-1» к серотипу 2, а штамм «К-2» к серотипу 6.

3. Получены иммуноспецифические компоненты для разработки иммуноферментной тест-системы для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае в сыворотках крови свиней. Комбинированный антиген

включает в себя липополисахаридные антигены серотипов 1, 2, и 6.

4. Разработана тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае при тестировании сывороток крови свиней методом одного разведения. Специфичность и чувствительность разработанной гест-системы ИФЛ относительно РА составляет 94,9% и 95,6%, а в сравнении с

коммерческой иммуноферментной тест-системой «СЛУТЕБТ АРР» - 96,9% и 98,4%, соответственно.

5. Разработанная тест-система на основе непрямого варианта ИФА позволяет оценивать уровень накопления поствакцинальных антител.

6. Проведен серологический мониторинг в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней, с использованием разработанной тест-системы, в результате которого из 2254 исследованных проб выявлено 12,7% положительных сывороток.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Штаммы бактерий А.р1еигорпеитотае «Г-1», «Ш-1» и «К-2», депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГУ «ВГНКИ» (30.03.2009).

Материалы научных исследований использованы при подготовке следующих методических рекомендаций:

- «Методические рекомендации по получению соматического антигена А.р1еигорпеитотае для использования в реакции агглютинации» (утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 19.05.2004);

- «Методические рекомендации по получению гипериммунной сыворотки крови кролика специфической к А.р1еигорпеитотае для использования в реакции агглютинации» (утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 19.05.2004);

- «Методические рекомендации по постановке реакции агглютинации для выявления антител к бактериям А.ркигорпеитотае» (утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 19.05.2004);

- «Методические рекомендации для определения антител к бактериям А.ркигорпеитотае в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом» (утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 10.03.2007);

- «Методические рекомендации по получению антигена бактерий А.ркигорпеитотае для использования в непрямом варианте

иммуноферментного анализа» (утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 19.06.2008);

- «Методические рекомендации по выявлению антител к бактериям

A.pleuropneumoniae в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом» (утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 19.06.2008).

Разработана нормативная документация:

- «Инструкция по применению набора для выявления антител к возбудителю актииобациллсзпой плевропневмонии свиней (Actinobacillus pleuropneumoniae) в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» (2009 г), утвержденная заместителем руководителя Россельхознадзора 08.04.2009.

- СТО 00495527-0110-2009 «Набор для выявления антител к возбудителю актинобациллезной плевропневмонии свиней (Actinobacillus pleuropneumoniae) в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении», утвержденный заместителем руководителя Россельхознадзора 08.04.2009.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Биохимические и антигенные свойства изолятов Actinobacillus pleuropneumoniae / О.И. Ручнова, О.В. Прунтова, B.C. Русалеев, Н.Б. Шадрова // Пробл. монитор, и генодиагност. инфекцион. бол. ж-ных: Матер. Междунар. науч. конф. молодых ученых. -Владимир, 2004. - С. 45-47.

2. Шадрова, Н.Б. Разработка иммуноферментного набора для выявления антител в сыворотках крови кур к Pasteurella multocida / Н.Б. Шадрова, О.В. Бородина // Пробл. монитор, и генодиагност. инфекцион. бол. ж-ных: матер. Междунар. науч. конф. молодых ученых. - Владимир, 2004. - С. 136-139.

3. Прунтова, О.В. Получение специфических компонентов Haemophilus parasuis для иммуноферментного анализа / О.В. Прунтова, B.C. Русалеев,

B.М. Гневашев, Н.Б. Шадрова // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2006. - Т. 4. - С. 214-224.

4. Шадрова, Н.Б. Выявление антител к бактериям Ас1тоЪасШи$ р!еигорпеитотае в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием липополисахаридного антигена / Н.Б. Шадрова, О.В. Прунтова, М.А. Коржавина // Вет. патология. - 2007. № 4 (23). - С. 68-72.

5. Шадрова, Н.Б. Выявление антител к бактериям АсНпоЬасШия р1еигорпеитотае серотип 1 в непрямом варианте иммуноферментного анализа / Н.Б. Шадрова, М.А.Балашова // Актуальные проблемы инфекционной, инвазионной и незаразной патологии домашних и сельскохозяйственных животных: Матер. Междунар. науч.-практической конф. - Ставрополь, 2009. - С. 105-110.

6. Шадрова, Н.Б. Серотипирование изолятов бактерий АсвпоЬасШиБ р1еигорпеитотае, выделенных на территории РФ / Н.Б. Шадрова // Био. -2009.№4 (103). -С. 18.

Для заметок

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», тираж 100 экз., апрель 2009 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шадрова, Наталья Борисовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Возбудитель плевропневмонии свиней A. pleuropneumonia.

1.1.1. История открытия возбудителя и его систематическое положение

1.1.2. Биологические свойства возбудителя.

1.1.3. Серологическая дифференциация Apleuropneumoniae.

1.2. Роль A pleuropneumoniae в патологии животных.

1.2.1. Факторы вирулентности A. pleuropneumoniae.

1.2.2. Эпизоотологические особенности и клинические признаки заболевания.

1.3. Роль серологических методов и иммуноферментного анализа в диагностике актинобациллезной плевропневмонии.

1.3.1. Диагностика актинобациллезной плевропневмонии'свиней.

1.3.2. Иммуноферментный анализ.

1.3.2.1 Непрямой метод ИФА.

1.3.2.2 Интерпретация результатов ИФА.

1.3.3. Применение ИФА для выявления антител к бактериям

A .pleuropneumoniae.

1.4. Особенности технологии производства бактериальных диагностикумов (антигенов и диагностических сывороток).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии изготовления иммуноферментного набора для определения антител к Actinobacillus pleuropneumoniae"

Актуальность темы. Болезни свиней представляют одну из значимых проблем ветеринарной науки и практики. Перевод свиноводства на промышленную технологию выявил значение ряда инфекционных болезней, которые до этого оставались за пределами внимания специалистов. К этой категории бактериальных болезней свиней можно отнести актинобациллезную плевропневмонию [12, 24, 28, 29].

Этому заболеванию подвержены поросята всех возрастов [172, 173].

Болезнь свиней наносит значительный урон свиноводческим хозяйствам за счет большого падежа свиней, затрат на лечение больных животных и проведение ветеринарно-санитарных мероприятий [30, 33, 34, 78].

В настоящее время актинобациллезная плевропневмония свиней широко распространена в Канаде, США, Франции, Великобритании, Италии, Дании, Финляндии, Голландии, Японии, Греции, Австралии, а также в странах Южной Африки [47, 65, 159, 160].

Диагноз на актинобациллезную плевропневмонию свиней устанавливают комплексно на основании данных эпизоотологического обследования хозяйства, клинических признаков и патологических изменений у пораженных животных и результатов лабораторных исследований [17, 78, 172].

Особенностью данного заболевания является возможное субклиническое течение инфекции (часто после лечения антибиотиками) а также бактерионосительство, без внешних проявлений болезни, которое представляет потенциальную опасность при формировании нового, смешанного стада [41, 43, 51]. В таком случае вспышка происходит внезапно, болезнь носит острый характер, часто с привлечением сопутствующей микрофлоры, что влечет за собой значительный экономический ущерб. Поэтому выявление серопозитивных животных является важным звеном в противоэпизоотических мероприятиях при данном заболевании [58, 66, 78].

Принятые в нашей стране методические указания по лабораторной диагностике гемофилезной плевропневмонии свиней, утвержденные в 1981 г., не предусматривают проведения серологических исследований [17], в то же время, в ряде стран ЕС и Северной Америке широкое распространение нашли методы выявления антител с помощью, как традиционных серологических реакций, так и иммуноферментного анализа. В Канаде и Дании серологические методы используют для эпидемиологического надзора за поголовьем свиней [67, 78, 86, 162, 163, 168].

Разработка иммунохимических методов, в частности ИФА, расширила возможность выявления специфических антител к возбудителям бактериальных инфекций, открыла перспективы устранения многих технических проблем лабораторной диагностики и повышения ее стандартизации и достоверности [124, 156, 157, 161, 178, 179].

Являясь одним из сравнительно "молодых" методов, базирующихся на использовании антител, конъюгированных с различными ферментами, ИФА по многим параметрам превосходит традиционные методы диагностики: по чувствительности, специфичности и производительности, быстроте получения результатов, возможности стандартизации условий постановки анализа, доступности широкому кругу практических учреждений [169, 173].

Указанные преимущества этого метода, способствовали его выбору для изучения возможности использования в качестве метода выявления и количественного определения антител к бактериям A.pleuropneumoniae [156, 161, 178, 179].

Кроме того, важным аспектом в диагностике актинобациллезной плевропневмонии является определение серовариантного состава циркулирующих в хозяйствах изолятов A.pleuropneumoniae.

До настоящего времени в РФ отсутствовали коммерческие диагностикумы для выявления антител в сыворотках крови свиней к бактериям A.pleuropneumoniae и серотипирования изолятов A.pleuropneumoniae, что и послужило выбору данной темы.

Цели и задачи исследования. Целью наших исследований была разработка иммуноферментной тест системы для выявления антител против бактерий А.р1еигорпеитотае в сыворотках крови свиней.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- получить специфические препараты антигенов и сывороток на лабораторных и восприимчивых животных для использования в качестве компонентов в РА и ИФА;

- обосновать схему постановки реакции агглютинации для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае микрометодом и изучить возможность использования её для серотипирования выделенных изолятов бактерий А.р1еигорпеитотае;

- разработать иммуноферментную тест систему для количественного определения антител к бактериям А.р1еигорпеитотае в сыворотках крови свиней;

- разработать регламент на изготовление и контроль диагностических наборов для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом;

Научная новизна работы:

- получены специфические компоненты А.р1еигорпеитотае для ИФА;

- обоснована схема постановки реакции агглютинации микрометодом для серотипирования изолятов бактерий А.р1еигорпеитотае; разработана иммуно ферментная тест-система для выявления специфических антител к бактериям А.р1еигорпеитотае в сыворотках крови свиней при тестировании их в одном разведении;

- проведена сравнительная оценка результатов исследований сывороток крови свиней, с использованием разработанного непрямого варианта ИФА, реакции агглютинации и иммуноферментного коммерческого набора;

- проведен серологический мониторинг свинопоголовья в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней.

Практическая значимость. Штаммы бактерий АсИпоЬасШт р1еигорпеитотае «Г-1», «Ш-1», «К-2», выделенные на территории РФ депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГУ «ВГНКИ».

Разработана нормативная документация на набор для выявления антител к бактериям АсИпоЬасШгш р1гигорпгитотае в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом.

Иммуноферментный набор для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае применяется в ФГУ «ВНИИЗЖ» при исследовании сывороток крови свиней.

Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, одна из них в издании по перечню ВАК РФ.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на заседаниях Ученого Совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2004-2009 гг, на Международных научно-практических конференциях: «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» - Владимир, 2004; «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», - Владимир, 2008 г.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 15 рисунками. Список использованной литературы включает 186 источников, из них 149 иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту.

- ссротипирование изолятов бактерий А.р1еигорпептотае в РА микрометодом;

- разработка технологии изготовления иммуноферментного набора для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае при тестировании сывороток крови свиней в одном разведении;

- результаты применения разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае при определении динамики накопления поствакцинальных антител и проведении серологического мониторинга в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Шадрова, Наталья Борисовна

4. ВЫВОДЫ

4. Разработана тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае при тестировании сывороток крови свиней методом одного разведения. Специфичность и чувствительность разработанной гест-системы ИФА относительно РА составляет 95,5% и 96,7%, а в сравнении с коммерческой иммуноферментной тест-системой «С1УТЕ8Т АРР» - 97,2% и 98,6%, соответственно.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы научных исследований использованы при подготовке следующих методических рекомендаций:

- «Методические рекомендации по постановке реакции агглютинации для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае» (утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 19.05.2004);

- «Методические рекомендации для определения антител к бактериям А.р1еигорпеитоп'ше в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом» (утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 10.03.2007);

- «Методические рекомендации по получению антигена бактерий А.р1еигорпеитотае для использования в непрямом варианте иммуноферментного анализа» (утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 19.06.2008);

- «Методические рекомендации по выявлению антител к бактериям А.р1еигорпеитотае в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом» (утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 19.06.2008).

Разработана нормативная документация:

- «Инструкция по применению набора для выявления антител к возбудителю актинобациллезной плевропневмонии свиней (АсйпоЪасШнз р1еигорпеитотае) в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» (2009 г), утвержденная заместителем руководителя Россельхознадзора 08.04.2009.

- СТО 00495527-0110-2009 «Набор для выявления антител к возбудителю актинобациллезной плевропневмонии свиней {АсНпоЬасШиз р1еигорпеитотаё) в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении», утвержденный заместителем руководителя Россельхознадзора 08.04.2009.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шадрова, Наталья Борисовна, Владимир

1. Антитела. Методы: в 2-х кн. Кн. 2: пер.с англ. / под ред. Д. Кэтти. — М.: Мир, 1991.-382 с.

2. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А.Воробьев. Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

3. Баев, A.A. Биотехнология / A.A. Баев. М.: Наука, 1984. - 310 с.

4. Бейли, Н. Статистические методы в биологии / Н. Бейли. М.: Изд-во иностр. лит., 1962. - С. 124-135.

5. Бекер, М.Е. Биотехнология / М.Е. Бекер, Г.К. Лиепиньш, Е.П. Райпулис. М.: Агропромиздат, 1990. - С. 7-149.

6. Биотехнология / И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева и др.; под ред. Воронина Е.С. СПб.:ГИОРД, 2005. - 700 с.

7. Биотехнология микробного синтеза / М.Е. Бекер, М.Ж. Кристапсонс, У.Э. Вистур и др.; под ред.М.Е. Беккера. Рига: Зинатне, 1980. - 350 с.

8. Биотехнология. Принципы и применение: пер. с англ. / под ред. И. Хиггинса, д. Беста, Дж. Джонса. М.: Мир, 1988. - 477 с.

9. Бомфорд, Р. Адъюванты / Р. Бомфорд // Биотехнология клеток животных. М., 1989. - Т. 2. - С. 264-268.

10. Ю.Бьядовская, О.П. Разработка и совершенствование методов иммуноферментной диагностики классической чумы свиней: дис. . канд. биол. наук /Бьядовская Ольга Петровна. Владимир, 2002. - 124 с.

11. Н.Волкова, М.А. Разработка и применение иммуноферментных тест-систем для определения антител к вирусу ССЯ-76 и оценки качества вируссодержащего сырья: дис. . канд. биол. наук / Волкова Марина Алексеевна. Владимир, 1999. - 151 с.

12. В.Грязнева, Т.Н. Основы производства гипериммунных сывороток и иммуноглобулинов: учебно-методическое пособие / т.Н. Грязнева, И.В. Тихонов, Д.А. Дервишев. М.: МГАВМиБ, 2003. - 51 с.

13. Диагностика гемофилезной плевропневмонии свиней / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, Н.И. Лаврентьев и др. //Ветеринария. 1981. - № 12. - С. 66-68.

14. Блинов, Н.П. Основы биотехнологии / Н.П.Елинов. СПб.: Наука, 1995.-С. 221-223.

15. Иммуноферментый анализ / под ред. т.т. Нго, г. Ленхоффа. м.: Мир, 1988.-444 с.

16. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции / под ред. Б.И. Антонова. М.: Агропромиздат, 1986. - 352 с.

17. Методические рекомендации по получению соматического антигена Haemophilus parasuis для использования в реакции агглютинации / О.В. Прунтова, B.C. Русалеев, В.М. Гневашев и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ».-Владимир, 2004. 12 с.

18. Методические рекомендации по получению гипериммунной сыворотки крови кролика специфической к Haemophilus parasuis для использования в реакции агглютинации / О.В. Прунтова, B.C. Русалеев, В.М. Гневашев и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». Владимир, 2004. - 14 с.

19. Методы общей микробиологии: в 3-х т. Т.1: пер. с англ. / под ред. Ф. Герхарда и др.; М.: Мир, 1983. 536 с.21 .Мицаев, Ш.Ш. К вопросу диагностики гемофилезной плевропневмонии свиней / Ш.Ш. Мицаев // Бюл. ВИЭВ. М., 1982. - Вып. 45.- С. 20-22.

20. Определитель бактерий Берджи: в 2-х т.: пер. с англ. / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др.. М.: Мир, 1997. - Т. 1 - С. 200-203.

21. Основы биотехнологических процессов. Ч. 3. Выделение, концентрирование и очистка биопрепаратов: учебно-метод. пособие по биотехнологии / И.В. Тихонов, Е.С. Воронин, C.B. Ковалев и др.. М.: МГАВМиБ, 2000. - 48 с.

22. Плохинский, H.A. Биометрия / H.A. Плохинский. М.: Изд-во Гос.4ун-та, 1970.-С. 212-229.

23. Практическая биохимия белка: пер. с англ. / под ред. А Дарбре. М.: Мир, 1989. - 623 с.

24. Русалеев, B.C. Актинобациллезная плевропневмония свиней / B.C. Русалеев, A.A. Фроловцева, Д.А. Бирюченков // Всерос. вет. конгр. 15-й Моск. Междунар. вет. конгр. по болезням мелких дом. ж-ных. Проблемы инфекц. патологии свиней. М., 2007. - С. 38-39.

25. Русалеев, B.C. Респираторные инфекции свиней бактериальной этиологии / B.C. Русалеев // Всерос. вет. конгр. 13-й Моск. Междунар. вет. конгр. по болезням мелких дом. ж-ных. Проблемы инфекц. патологии свиней. М., 2005. - С. 41-42.

26. Сидоров, М.А. Гемофилезы животных / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов. М.: Агропромиздат, 1986. - С. 50-51.

27. Скородумов, Д.И. Актинобациллезная пневмония свиней: патогенез и вирулентность культур A. pleuropneumoniae различной серовариантнойпринадлежности / Д.И. Скородумов, В. А. Шубин // Ветеринария сельскохозяйственных животных. — 2005. № 7. — С. 13-17.

28. Скородумов, Д.И. Актинобациллезная пневмония свиней / Д.И. Скородумов // Ветеринария сельскохозяйственных животных. 2005. - № 10.- С. 20-25.

29. Скородумов, Д.И. Актинобациллезная пневмония свиней / Д.И. Скородумов // Ветеринария сельскохозяйственных животных. — 2008. № 12. -С. 10-13.

30. Способы поддержания асептических условий при культивировании: учебно-метод. пособие по биотехнологии / И.В.Тихонов, Е.С.Воронин, Т.Н.Грязнева и др.. М.: МГАВМиБ, 2002. - 48 с.

31. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев и др.. М.: Высш. школа, 1991. - 288 с.

32. Черняев, Ю.А. Определение соответствия эпизоотических штаммов вируса ящура производственным / Ю.А. Черняев, А.И. Собко // Ветеринария.- 1973. -№ 1. С. 43-46.

33. A multiplex PCR that can distinguish between immunologically cross-reactive serotype 3, 6 and 8 Actinobacillus pleuropneumoniae strains / L. Zhou, S.C. Jones, O. Angen et al. // J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol. 46. - P. 800-803.

34. A 2-mercaptoethanol tube agglutination test for diagnosis of Haemophilus pleuropneumoniae infection in pigs / K.R. Mittal, R. Higgins, S. Larviere et al. // Am. J. Vet. Res. 1984. - Vol. 45. - P. 715-719.

35. Actinobacillus pleuropneumoniae infection in pigs: the pole of virulence factors in pathogenesis and protection / F. Haesebrouck, K. Chiers, I. Van Overbeke et al. //Vet. Microbiol. 1997. - Vol. 58, N 2/4. - P. 239-249.39

36. Actinobacillus pleuropneumoniae surface polysaccharides: their role in diagnosis and immunogenicity / D. Dubreuil, M. Jacques, K. Mittal et al. // Animal Health Res. Rev. 2000. - Vol. 1. - P. 73-93.

37. Airborne transmission of Actinobacillus pleuropneumoniae and porcine reproductive respiratory syndrome virus in nursery pigs / M. Torremorell5 q Pijoan, IC. Janni et al. // Am. J. Vet. Res. 1997. - Vol. 58. - P. 828-832.

38. An Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 3 specific PCR / L. Zhou S.C. Jones, O. Angen et al. // Vet. Res. -2008. Vol. 162. - P. 648-652.

39. An enzyme-linked immunosorbent assay, using an EDTA extracted antigen for the serology of Haemophilus pleuropneumoniae / J. Nicolet, P. Paroz, M. Krawincler et al. // Am. J. Vet. Res. 1981. - Vol. 42. - P. 2139-2142.

40. Analysis of the Actinobacillus pleuropneumoniae ArcA regulon identifies fumarate reductase as a determinant of virulence / F.F. Buettner, I.M. Bendallah J.T. Bosse et al. // Infect. Immun. 2008. -Vol. 76. - P. 2284-2295.

41. Andersen, L.V. A successful elimination of Actinobacillus pleuropneumoniae (serotype 2), Mycoplasma hyopneumoniae and PRRS (European and Vaccine-strain) by partial depopulation, early weaning ancj

42. Tilmicosin (Pulmotil, Elanco) treatment / L.V. Andersen, S. Gram // Proc. 18th. IPVS Congress. Hamburg, Germany, 2004. - Vol. 1. - P. 179.

43. Angen, O. PCR tests for serotype specific identification and detection of Actinobacillus pleuropnenmoniae / O. Angen, S. Jessing // Proc. 18th. IPVS Congress. Hamburg, Germany, 2004. - Vol. 1. - P. 161.

44. Angen, O. Development of a multiplex PCR test for identification of Actinobacillus pleuropneumonias serovars 1, 7, and 12 / O. Angen, P. Ahrens, S.G. Jessing // Vet. Microbiol. 2008. - Vol. 132. - P. 312-318.

45. Archetti, J. Persistent antigenic variation of influenza / J. Archetti, F.L. Horsfall // J.Exp. Med. 1950. - Vol. 92. - P. 441.

46. Beybon, L.M. Characterization of the Actinobacillus pleuropneumoniae serotype K11/01 capsular antigen / L.M. Beybon, J.C. Richards, M.B. Perry // Eur. J. Biochem. 1993. - Vol. 214. - P. 209-214.

47. Bosse, J.T. Capsular poli saccharide antigens for detection of serotype-specific antibodies to Actinobacillus pleuropneumoniae / J.T. Bosse, R.P. Johnson, S. Rosendal // Can. J. Vet. Res. 1990. - Vol. 54. - P. 320-325.

48. Both Apxl and ApxII of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 are necessary for full virulence / B.K. Boekema, E.M. Kamp, M.A. Smits et al. // Vet. Microbiol. 2004. - Vol. 100. - P. 17-23.

49. Brandreth, S.R. Prevalence of pig herds affected by pleuropneumonia associated with Haemophilus pleuropneumoniae in eastern England / S.R. Brandreth, I.M. Smith // Vet. Rec. 1985. - Vol. 117. - P. 143-147.

50. Byrd, W. Preparation, characterization and immunogenicity of conjugate vaccines directed against Actinobacillus pleuropneumoniae virulence determinants / W. Byrd, S. Kadis // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 3042-3051.

51. Characterizatoin of apxIVA, a new RTX determination of Actinobacillus pleuropneumoniae / A. Shaller, R. Kuhn, P. Kurneit et al. // Microbiology. -1990.-Vol. 145.-P. 2105-2116.

52. Characterization of the in vitro adhesion of Actinobacillus pleuropneumoniae to swine alveolar epithelial cells / I. Van Overbeke, K. Chierrs, G. Charlier et al. // Vet. Microbiol. 2002. - Vol. 88. - P. 59-74.

53. Cloning and characterization of an Actinobacillus pleuropneumoniae outer membrane protein belonging to the family of PAL lipoproteins / J. Frey, P. Kuhnert, L. Villiger et al. // Res. Microbiol. 1996. - Vol. 147. - P. 351-361.

54. Desrosiers, R. Epidemiology, diagnosis and control of swine diseases. Howard Dunne Memorial Lecture / R. Desrosiers // Proc. Am. Ass. Swine Vet. -2004. P. 9-37.

55. Desrosiers, R. Porcine pleuropneumonia associated with Haemophilus pleuropneumoniae serotype 3 in Quebec / R. Desrosiers, K.R. Mittal, R. Malo // Vet. Rec. 1984. - Vol. 115. - P. 628-629.

56. Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in the porcine upper respiratory tract as a complement to serological tests / M. Sidibe, S. Messier, S. Lariviere et al. // Can. J. Vet. Res. 1993. - Vol. 57. - P. 204-208.

57. Detection of antibodies to Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 12 in pig serum using a blocking enzyme-linked immunosorbent assay / L.O. Andersen, J. Klausen, K. Barfod, V. Sorensen // Vet. Microbiol. 2002. - Vol. 89. - P. 61-67.

58. Devenish, J. Humoral antibody response and protective immunity in swine following immunization with the 104-kilodalton hemolysin of Actinobacilluspleuropneumoniae / J. Devenish, S. Rosendal, J.T. Bosse // Infect. Immun. 1990. Vol.58. - P. 3829-3832.

59. Development of an immunomagnetic method for selective isolation of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 from tonsils / A. Gagne, S. Lacouture, A. Broes // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 251-254.

60. Development of a DIVA subunit vaccine against Actinobacillus pleuropneumoniae infection / A. Maas, J. Meens, N. Baltes et al. // Vaccine. -2006. Vol. 24. - P. 7226-7223.

61. Development of enzyme-linked immunosorbent assay for the serodetection of pigs exposed to Haemophilus pleuropneumoniae / G. Goyette, S. Lariviere, K.R. Mittal, R. Higgins // Proc. 9th IPVS Congress. Barcelona, Spain, 1986. - P. 256.

62. Diseases of Swine / Ed. by B.E. Straw et al.. 9th ed. - Ames, Jowa: Black. Publ., 2006. - P. 563-576.

63. Dubansky, Y. Factory virulentnce, epizootologie a patogeneze Actinobacillus pleuropneumoniae / Y. Dubansky, J. Drabek // Veterinarstvi. 2000. -Vol. 10.-P. 399-406.

64. Efficacy of vaccines against bacterial diseases in swine: what can we expect? / F. Haesebrouck, F. Pasmans, K. Chiers et al. // Vet. Microbiol. 2004. - Vol. 100.-P. 255-268.

65. Electron microscopic examination of capsular material from various serotypes of Actinobacillus pleuropneumoniae / M. Jacques, B. Foiry, R. Higgings et al. // J. Bacterid. 1988. - Vol. 170. - P. 3314-3318.

66. Endobronchial inoculation with Apx toxins of Actinobacillus pleuropneumoniae leads to pleuropneumonia in pigs / e.M. Kamp, N. Stockhofe-zurwieden, L.A. Van Leengoed et al. // Infect. Immun. 1997. -Vol. 65. - P. 4350-4354.

67. Etiologic and pathologic study of respiratory disease in lambs from intensive breeding facilities in southern Spain / J. Hervas, A. Mendez, J.C. Gomez-Villamandos et al. // Zentralbl. Veterinarmed. 1996. - Bd. 43. - S. 221-231.

68. Evaluation and field validation of PCR tests for detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in subclinically infected pigs / N. Fittipaldi, A Broes, J. Harel // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 5085-5093.

69. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for serological surveillance of infection with Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5 in pig herds / J. Klausen, L.O. Andersen, K. Barfod et al. // Vet. Microbiol. 2002. -Vol. 88. - P. 223-232.

70. Evaluation of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to the Apx toxins of Actinobacillus pleuropneumoniae / R.

71. Nielsen, J.F. Bosch, T. Plambeck et al. // Vet. Microbiol. 2000. - Vol. 71. - P. 81-87.

72. Experimental aerosol transmission of Actinobacillus pleuropneumoniae to pigs / J.L. Jobert, C. Savoye, R. Cariolet et al. // Can. J. Vet. Res. 2000. - Vol. 64. - P. 21-26.

73. Feed and water consumption in pigs following an Actinobacillus pleuropneumoniae challenge / A. Pijpers, J.A. Vernooy, L.A. Leengoed et al. // Proc. 1 Ith IPVS Congress. Lussane, Switzerland, 1990. - P. 39.

74. Fenwick, B. Porcine pleuropneumoniae / B. Fenwick, S. Henry // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1994. - Vol. - 204. - P. 1334-1340.

75. Fenwick, B.W. Virulence attributes of the lipopolysaccharides of the HAP group of organisms / B.W. Fenwick // Can. J. Vet. Res. 1990. - Vol. 54. - P. 2832.

76. Fenwick, B.W. Lipopolysaccharides and capsules of the HAP group of bacteria / B.W. Fenwick, W. Donachie, F.A. Lainson // Haemophilus, Pasteurella and Actinobacillus. New York; London: Plenum Press, 1994. - P. 75-87.

77. Frey, J. Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae and RTX toxins / J. Frey // Trends Microbiol. 1995. - Vol. 3. - P. 257-261.

78. Frey, J. Regulation of haemolysin expression in Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 by Ca2+ / J. Frey, J. Nicolet // Infect. Immun. -1988. Vol. 56. - P. 2570-2575.

79. Frey, J. Association of the CAMP phenomen in Actinobacillus pleuropneumoniae with the RTX toxin Apxl, ApxII and ApxIII / J. Frey, R. Kuhn, J. Nicolet // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - Vol. 124. - P. 245-251.

80. Frey, J. Detection, identification, and subtyping of Actinobacillus pleuropneumoniae / J. Frey // Methods Mol. Biol. 2003. - Vol. 216. - P. 87-95.

81. Qenetic map of the Actinobacillus pleuropneumonias RTX-toxin (Apx) opérons: characterization of the ApxIII opérons / R. Jansen, J. Briaire, A.B.Van Geel et al. // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 4411-4418.

82. Gilbride, K.A. Evaluation of a selective medium for isolation of Haemophilus pleuropneumoniae / K.A. Gilbride, S. Rosendal // Can. J. Comp. Med. 1983. - Vol. 47. - P. 445-450.

83. Gottschalk, M. Recent developments on Actinobacillus pleuropneumoniae / M. Gottschalk, A. Broes, N. Fittipaldi // Proc Am Assoc Swine Vet. 2003. - P. 387-393.

84. Gram, T. Evaluation of a PCR for detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in mixed bacterial cultures from tonsils / T. Gram, P. Ahrens, J.P. Nielsen // Vet. Microbiol. 1996. - Vol.51. - P. 95-104.

85. Gunnarson, A. Serological studies on porcine strains of Haemophilus parahaemolyticus (pleuropneumonia) agglutination reactions / A. Gunnarson, E. L. Biberstein, B. Hurvell // Am. J. Vet. Res. 1977. - Vol. 38. - P. 1111-1114.

86. Gunnarson, A. Serologic studies on porcine strains of Haemophilus parahaemolyticus (pleuropneumoniae): extraction of type specific antigens / A. Gunnarson // Am. J. Vet Res. 1979. - Vol. 40. - P. 469-472.

87. Herd factors associated with the seroprevalence of Actinobacillus pleuropneumoniae serovars 2, 3 and 9 in slaughter pigs from farrow-to-finish pig herds / D. Maes, K. Chiers, F. Haesebrouck et al. // Vet. Res. 2001. - Vol. 32. -P. 409-419.

88. Host cell contact-induced transcription of the type IV fimbria gene cluster of Actinobacillus pleuropneumoniae / B.K. Boekema, N. Stockhofe-Zurwieden, H.E. Smith et al. // Infect. Immun. 2004. -Vol. 72. - P. 691-700.

89. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumonias with porcine lung and tracheal epithelial cells / E. Auger, V. Deslandes, M. Ramjeet et al. //Infect. Immun.- 2009. Vol. 77.-P. 1426-1441.

90. Hunneman, W.A. Incidence, economic effects, and control of Haemophilus pleuropneumoniae infections in pigs / W.A. Hunneman // Vet. Q. -1986.-Vol. 8.-P. 83-87.

91. Identification of hemolytic and cytotoxic proteins of Actinobacillus pleuropneumoniae by use of monoclonal antibodies / E.M. Kamp, J.K. Popma, J. Anakotta et al. // Infect. Immun. 1991. - Vol. 59. - P. 3079-3085.

92. Identification of type 4 fimbriae in Actinobacillus pleuropneumoniae / Y. Zhang, J.M. Tennent, A. Ingham et al. // FEMS Microbiol. Lett. 2000. -Vol. 189.-P. 15-18.

93. Inzana, T.J Capsules and virulence in the HAP group of bacteria / T.J. Inzana // Can. J. Vet. Res. 1990. - Vol. 54. - P. 22-27.

94. ISApll, a novel insertion element of Actinobacillus pleuropneumoniae, prevents ApxIV-based serological detection of serotype 7 strain AP76 / H.e. Tegetmeyer, S.C. Jones, P.R. Langford, N.Baltes // Vet. Microbiol. 2008. - Vol. 128. - P. 342-353.

95. Jacques, M. Surface polysaccharides and iron-uptake systems of Actinobacillus pleuropneumoniae / M. Jacques // Can. J. Vet. Res. 2004. - Vol. 68.-P. 81-85.

96. Jessing, S.G. Evaluation of a multiplex PCR test for simultaneous identification and serotyping of Actinobacillus pleuropneumoniae serotypes 2, 5, and 6 / S.G. Jessing, O. Angen, T.J. Inzana // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. -P. 4095-4100.

97. Kilian, M. A taxonomic study of the genus Haemophilus with the proposal of a new species / M. Kilian // J. Gen. Microbiol. 1976. - Vol. 32. - P. 93 -95.

98. Kilian, M. Pathogenic species of the genus Haemophilus and Streptococcus pneumoniae produce immunoglobulin Al protease / M. Kilian, J. Mestecky, R.E. Schrohenloher // Infect. Immun. 1979. - Vol. 26. - P. 143-149.

99. Komal, J.P. Grouping of Actinobacillus pleuropneumoniae strains of serotypes 1 through 12 on the basis of their virulence in mice / J.P. Komal, K.R. Mittal // Vet. Microbiol. 1990. - Vol. 25. - P. 229-240.

100. Lida, J. Use of monoclonal antibodies for classifying Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae / J. Lida, I.M. Smith, J. Nicolet //Res. Vet. Sei. 1990. Vol. 49, № 1. - P. 8-13.

101. Ligget, A.D. Sequential study of lesion development in experimental Haemophilus pleuropneumoniae / A.D. Ligget, L.R. Harrison // Res. Vet. Sei. -1987.-Vol. 42.-P. 204-221.

102. Little, T.W. The comparative pathogenicity of two porcine Haemophilus species / T.W. Little, J.D. Harding.// Vet. Ree. 1971. - Vol. 88. - P. 540-545.

103. McClaren, M.L. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): practical aspects of standartization and quality control / M.L. McClaren, J.E. Lillywhite, C.S. Andrew // Med. Lab. Sci. 1981. - Vol. 38. - P. 245-251.

104. Matthews, P.R.J. The identification of Haemophilus-\ik.Q organism associated with pneumonia and pleurisy in pig / P.R.J. Matthews, I.H. Pattison // J. Comp. Pathol. 1961. - Vol. 71. - P. 44-52.

105. McDowell, S.W.J. Serotypes of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated in the British Isles 1988-1993 / S.W.J. McDowell, H.J. Ball //Vet. Rec. -1994.-Vol. 134.-P. 522-523.

106. Mittal, K.R. Evaluation of slide agglutination and ring precipitation test for capsular serotyping of Haemophilus pleuropneumonia / K.R. Mittal, R. Higgins, S. Larviere // J. Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 15. - P. 1019-1023.

107. Mittal, K.R. Detection of type-specific antigens in the lungs of Haemophilus pleuropneumoniae- infected pigs by coagglutination test / K.R. Mittal, R. Higgins, S. Larviere // J. Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 18. - P. 13551357.

108. Mittal, K.R. Determination of antigenic specificity and relationship among Haemophilus pleuropneumoniae serotypes by an indirect hemagglutination test / K.R. Mittal, R. Higgins, S. Larviere // J. Clin. Microbiol. 1983. - Vol. 17. -P. 787-790.

109. Mittal, K.R. An evaluation of agglutination and coagglutination techniques for serotyping of Haemophilus pleuropneumoniae isolates / K.R. Mittal, R. Higgins, S. Larviere // Am. J. Vet. Res. 1987. - Vol. 48. - P. 219-226.

110. NAD-independent Âctinobacillus pleuropneumonias implicated in the etiology of fatal swine pleuropneumoniae / J.Maldonado, P. Riera, E. Martinez et al. //Proc. 18th IPVS Congress. Hamburg, Germany, 2004. - Vol. 1. - P. 159.

111. Nicolet, J. Zur Haemophilus- pleuropneumoniae beim Schwein. 2. Eine kontagiose Krankheit von wirtschaftlicher Bedeutung / J. Nicolet, H. Konig E. Scholl // Schweiz. Arch. Tierheilkd. 1969. - Bd. 111. - S. 166-174.

112. Nicolet, J. Zur Haemophilus pleuropneumoniae beim Schwein: bacteriologische, pathologisch-anatomische und histologische Befunde / J. Nicolet, H. Konig // Pathol. Microbiol. 1966. - Bd. 29. - S. 301-306.

113. Nicolet, J. L'epreuve de fixation du complement, un test de depistage des infections a Haemophilus parahaemolyticus / J. Nicolet; P.A. de Meuron, H. Bachman // Schweiz. Arch. Tierheilkd. 1971. - Bd. 113. - S. 191-200.

114. Nicolet, J. Sur L hemophilose du porc. 3. Différenciation serologique de Haemophilus parahaemolyticus / J. Nicolet II Zentralbl. Bacteriol. Hyg. (Orig A). 1971. - Bd. 216. - S. 487-495.

115. Nicolet, J. Taxonomy and serological identification of Actinobacillus pleuropneumoniae / J. Nicolet II Can. Vet. J. 1988. - Vol. 29. - P. 578-580.

116. Nicolet, J. Actinobacillus pleuropneumoniae / J. Nicolet // Diseases of Swine / Ed. by A.D. Léman et al.. 7th ed. - Ames, Iowa, 1992. - P. 215-225.

117. Nielsen, R. Colostral transfer of immunity to Haemophilus parahaemolyticus in pigs / R. Nielsen // Nord. Vet. Med. 1975. - Vol. 27. - P. 319-328.

118. Nielsen, R. Haemophilus pleuropneumoniae infection in pigs: thesis / R. Nielsen. Copenhagen, 1982. - 15 p.

119. Nielsen, R. Haemophilus pleuropneumoniae serotypes cross protection experiments / R. Nielsen // Nord. Vet. Med. - 1984. - Vol. 36. - P. 221234.

120. Nielsen, R. Serological characterization of Haemophilus pleuropneumoniae (Actinobacillus pleuropneumoniae) strains and proposal of anew serotype: serotype 9 / R. Nielsen // Acta Vet. Scand. 1985. - Vol. 26. - P. 501-512.

121. Nielsen, R. Serological characterization of Haemophilus pleuropneumoniae (Actinobacillus pleuropneumonias) strains and proposal of a new serotype: serotype 10 / R. Nielsen // Acta Vet. Scand. 1985. - Vol. 26. - P. 581-585.

122. Nielsen, R. Serology of Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae serotype 5 strains: establishment of subtypes A and B / R. Nielsen//Acta Vet. Scand. 1986. - Vol. 27. - P.49-58.

123. Nielsen, R. Serological characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae strains and proposal of a new serotype: serotype 12 / R. Nielsen // Acta Vet. Scand. 1986. - Vol. 27. - P. 453-455.

124. Nielsen, R. Serological characterization of 8 Haemophilus pleuropneumoniae strains and proposal of a new serotype: serotype 8 / R. Nielsen, P.J. O'Connor// Acta Vet. Scand. 1984. - Vol. 25. - P. 96-106.

125. Olander, H.J. A septicaemic disease of swine and its causative agent Haemophilus parahaemolyticus / Ph.D. dis. // H.J Olander. California, 1963. -156 p.

126. Otits in a weaned pig: A new role for A.pleuropneumoniae / J. Duff, J.W. Scott, M.K. Wilkes et al. // Vet. Rec. 1996. - Vol. 139. - P. 561-563.

127. Penzes, Z. Comparison of different computational methods for measuring antibodies to avian infectious bronchitis virus in singl serum dilution / Z. Penzes, I. Meszaros // Acta Vet. Hungarica. 1992. - Vol. 40. - P. 311-312.

128. Phenotypic and genetic characterization of NAD-depend Pasteurellaceae from the respiratory tract of pigs and their possible pathogenetic importance / P. ICielstein, H. Wuthe, O. Angen et al. // Vet. Microbiol. 2001.1. Vol. 81.-P. 243-255.

129. Pleuropneumoniae caused by Actinobacillus pleuropneumoniae biotype 2 in growing and finishing pigs / R.K. Frank, M.M. Chengappa, R.D. Oberst et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 1992. - Vol. 4. - P. 270-278.

130. Production and characterization of monoclonal antibodies against Actinobacilhis pleuropneumoniae serotype 1 / K. Lairini, E. Stenbaek, S. Lacouture, M. Gottschalk // Vet. Microbiol. 1995. - Vol. 46. - P. 369-381.

131. Proposal of a new serovar of Actinobacilhis pleuropneumoniae: serovar 15 / PJ. Blackall, H.L. Klaasen, H. Van Den Bosch, et al. // Vet. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 84. - P. 47-52.

132. Protective efficacy of an affinity purified hemolysin vaccine against experimental swine pleuropneumoniae / Y. Haga, S. Ogino, S. Ohashi et al. // J. Vet. Med. Sci. 1997. - Vol. 59. - P. 115-120.

133. Rosendal, S. Serotyping of Haemophilus pleuropneumoniae / S. Rosendal, D.A. Boyd // J. Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 16. - P. 840-843.

134. Rycroft, A.N. Actinobacillus species and their role in animal disease / A.N. Rycroft, L.H. Garside // Vet. J. 2000. - Vol. 159. - P. 18-36.

135. Sandord, S.E. Porsine Haemophilus pleuropneumonia epizootic in Southwestern Ontario: clinical, microbiological, pathological and some epidemiological findings / S.E. Sandord, G.K.A.'Josephson // Can. J. Comp. Med. 1981.-Vol.45.-P. 2-7.

136. Serodiagnosis of swine pleuropneumonia due to Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 7 and 4 using long-chain lipopolysaccharides / M. Gottschaik, E. Altman, N. Charland et al. // Can. J. Vet. Res. 1997. - Vol. 61. -P. 62-65.

137. Serological characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae strains isolated from pigs in Quebec / K.R. Mittal, R. Higgins, S. Larviere et al. // Vet. Microbiol. 1992. - Vol. 32. - P. 135-148.

138. Serological characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype 2 strains isolated from pigs in two Danish herds / R. Nielsen, L.O. Andersen, T. Plambeck et al. // Vet. Microbiol. 1997. - Vol. 54. - P. 35-46.

139. Serotyping Actinobacillus pleuropneumoniae by the use of monoclonal antibodies / S. Lacouture, K.R. Mittal, M. Jacques et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 1997. - Vol. 9. - P. 337-341.

140. Serotyping of Haemophilus pleuropneumoniae in the Netherlands: with emphasis on heterogeneity within serotype 2 and (proposed) serotype 9 / E. Kamp, J.K. Popma, L.A. Leengoed et al. // Vet. Microbiol. 1987. - Vol. 13. - P. 249-257.

141. Shope, R.E Porcine contagious pleuropneumonia. 1. Experimental transmission, etiology and pathology / R.E. Shope // J. Exp. Med. 1964. - Vol. 119. - P. 357-358.

142. Shope, R.E. Porcine contagious pleuropneumonia. 2. Studies of the pathogenicity of the etiological agent Haemophilus pleuropneumoniae / R.E. Shope, D.C. White, G. Leidy // J. Exp. Med. 1964. - Vol. 119. - P. 369-375.

143. Sorensen, V. Evaluation of laboratory diagnostic assays for monitoring respiratory infections in pigs: Ph. D. thesis / V. Sorensen. -Frederiksberg, Denmark: The Royal Vet. and Agricult. Univer. 1997. - 25 p.

144. Stevenson, A. Cloning and characterization of type 4 flmbrial genes from Actinobacillus pleuropneumoniae / A. Stevenson, J. Macdonald, M. Roberts // Vet. Microbiol. 2003. - Vol. 92. - P. 121-134.

145. Taylor, DJ. Pleuropneumonia (.Actinobacillus pleuropneumoniae) // Pig Disease / D.J. Taylor. 6th ed. - Suffolk, UK, - 1995. - P. 188-193.

146. Taylor, DJ. Actinobacillus pleuropneumoniae / DJ. Taylor // Bacterial Diseases. 1999. - Vol. 3. - P. 343-354.

147. The CAMP effects of Actinobacillus pleuropneumoniae is caused by Apx toxin / R. Jansen, J.Briaire, E.M.Kamp et al. // FEMS Microbiol. Lett. -1995. Vol. 126. - P. 139-143.

148. The complete genome sequence of Actinobacillus pleuropneumoniae L20 (serotype 5b) / S.J. Foote, J.T. Bosse, A.B. Bouevitch et al. // J. Bacteriol. -2008.-Vol. 190.-P. 1495-1496.

149. The genetic organization isolation of the capsule biosynthesis region of Actinobacillus pleuropneumoniae serotypes 1, 6, 7 and 12 / S.G. Jessing, P. Ahrens, T. J. Inzana, O. Angen // Vet. Microbiol. 2008. - Vol. 129. - P. 350-359.

150. Use of recombinant ApxIV in serodiagnosis of Actinobacillus pleuropneumoniae infections, development and prevalidation of the ApxIV ELISA

151. A. Dreufus, A. Schaller, S. Nivollet et al. // Vet. Microbiol. 2004. - Vol. 99. -P. 227-238.

152. Valks, M.M. A clinical field trial in finishing pigs to evaluate the efficacy of a new APP subunit vaccine / M.M. Valks, T. Nell, J.E. Bosch // Proc. 14th IPVS Congress. Bologna, Italy, 1996. - P. 208.

153. Van Leengoed, L.A. Endobronchial inoculation of various doses of Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae in pigs / L.A. Van Leengoed, E.M. Kamp // Am. J. Vet. Res. 1989. - Vol. 50. - P. 2054-2059.

154. Virulence properties and protective efficacy of the capsular polymer of Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae serotype 5 / T.J. Inzana, J.Ma, T. Workman et al. // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56. - P. 1880-1889.

155. Vigre, H. Decay of acquired colostral antibodies to Actinobacillus pleuropneumoniae in pigs / H. Vigre, A.K. Ersboll, V. Sorensen // J. Vet. Med. B. -2003.-Vol. 50.-P. 430-435.

156. Welch, R.A. Pore-forming cytolysing of gram-negative bacteria / R.A. Welch // Mol. Microbiol. 1991. - Vol. 5. - P. 521-528. 1

157. Wilson, R.W. Haemophilus parahaemolyticus associated with abortion in swine / R.W. Wilson, M. Kierstead // Can. Vet. J. 1976. - Vol. 17. - P. 222.

Информация о работе

Шадрова, Наталья Борисовна
кандидата биологических наук
Владимир, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка технологии изготовления иммуноферментного набора для определения антител к Actinobacillus pleuropneumoniae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка технологии изготовления иммуноферментного набора для определения антител к Actinobacillus pleuropneumoniae - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы