Антимикробная активность и лечебная эффективность тилоколина при бактериальных инфекциях органов дыхания поросят

Сычев, Сергей Владимирович

Автореферат диссертации по теме "Антимикробная активность и лечебная эффективность тилоколина при бактериальных инфекциях органов дыхания поросят"

На правах рукописи

СЫЧЕВ СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ И ЛЕЧЕБНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТИЛОКОЛИНА ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ ПОРОСЯТ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 3 НОЯ 2010

Воронеж-2010

004613121

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН.

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент РАСХН Шахов Алексей Гаврилович

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Земсков Андрей Михайлович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Белгородская государственная сельскохозяйственная академия

Защита диссертации состоится «9» декабря 2010 года в 10-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 006.004.02 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН (394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии».

Автореферат разослан « ноября 2010г.

Ученый секретарь

кандидат ветеринарных наук Манжурина Ольга Алексеевна

диссертационного совета

Близнецова Г.Н.

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Перспективным направлением решения проблемы обеспечения населения страны животноводческой продукцией собственного производства является интенсивное развитие свиноводства (В. Си-доркин с соавт., 2003; Е. Елисеева, 2008; М.Ш. Акбаев с соавт., 2009).

Однако развитие свиноводства сдерживают инфекционные болезни животных (Р.В. Душук с соавт., 2000; Ю.А. Малахов, Р.В. Душук, 2001; В. Кудимов, 2003; М.А. Сидоров с соавт., 2006; B.C. Русалеев, 2008), среди которых наибольший удельный вес занимают желудочно-кишечные и респираторные заболевания молодняка свиней (П. Щербаков с соавт., 2002; М.В. Бабкин с соавт., 2008; А.Г. Шахов, 2008).

В их этиологии принимают участие вирусы, бактерии и другие возбудители (А.Г. Шахов с соавт., 1991, 2009; H.A. Ковалев, В.М. Болтак, 2000; Н.П. Зуев, 2008; М.В. Билокур, В.В. Палунина, 2008).

Одно из ведущих мест в комплексе мероприятий по борьбе с инфекционной патологией свиней, наряду со специфической профилактикой, принадлежит применению антимикробных средств (A.B. Голиков с соавт., 2001; В.Ю. Коптев с соавт., 2002).

Однако в результате бессистемного использования химиопрепаратов для терапии и профилактики заболеваний инфекционной этиологии в последние десятилетия все большую опасность для животных cfann приобретать антибиотикорезистентные штаммы микроорганизмов (М. Roselli et al., 2005). При этом наиболее часто устойчивые микроорганизмы выделяются при респираторных заболеваниях (Z. Pejsak et al., 2005).

Поэтому в химиотерапии бактериальных инфекций важное место отводится комплексным препаратам, содержащим в своем составе компоненты, обладающие разным механизмом действия на микробную клетку. Создание таких препаратов научно обосновано, так как более выраженный клинический эффект у них обусловлен широким спектром антимикробной активности и более выгодными токсикометрическими характеристиками (A.B. Гуник с соавт., 2002; H.A. Лагуткин, 2006; Л. Гоби, 2009).

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований является разработка и внедрение нового антимикробного препарата тилоколин для этиотропной терапии поросят при респираторных болезнях бактериальной этиологии.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить антимикробную активность тилоколина in vitro в отношении потенциальных бактериальных возбудителей респираторных болезней поросят;

2. Изучить антимикробную активность тилоколина in vivo на моделях инфекций белых мышей, вызванных Salmonella cholerae suis, Pasteurella mul-tocida и Staphylococcus aureus;

3. Изучить влияние тилоколина на ультраструктуру Pasteurella multo-cida и Staphylococcus aureus;

4. Изучить формирование устойчивости Escherichia coli, Salmonella cholerae suis, Pasteurella multocida и Staphylococcus aureus к тилоколину и сроки восстановления их чувствительности к препарату;

5. Изучить лечебную эффективность тилоколина при респираторных болезнях поросят бактериальной этиологии;

6. Определить экономическую эффективность применения тилоколина при респираторной патологии поросят бактериальной этиологии.

Научная новизна. Впервые изучены in vitro и in vivo на моделях экспериментальных инфекций белых мышей антимикробная активность тилоколина, влияние его на ультраструктуру потенциально патогенных возбудителей респираторных болезней свиней, формирование устойчивости микроорганизмов к препарату и восстановление их чувствительности к нему, лечебная и экономическая эффективность тилоколина при пневмониях поросят в крупных специализированных хозяйствах.

Практическая значимость и внедрение. Для терапии больных животных разработан новый высокоэффективный комплексный препарат тило-колин с широким спектром антимикробного действия, технология его промышленного производства и контроля качества, которые в соответствии с широкими производственными испытаниями вошли в нормативно-техническую документацию на препарат (Инструкция по применению тилоколина и технические условия по изготовлению и контролю опытной партии тилоколина № ТУ 9337-028-004882909-09), согласованную с Главным государственным ветеринарным инспектором по Воронежской области.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного производства» 20-22 января 2010 года, г. Курск; Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ГНУ ВНИВИПФиТ «Актуальные проблемы болезней обмена веществ у сельскохозяйственных животных в современных условиях» 30 сентября - 2 октября 2010 года, г. Воронеж.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 5 статьях, в том числе одна - в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Антимикробная активность тилоколина in vitro и in vivo на моделях экспериментальных инфекций белых мышей;

2. Формирование резистентности микроорганизмов к тилоколину и восстановление их чувствительности к препарату;

3. Влияние препарата на ультраструктуру золотистого стафилококка и пастерелл;

4. Лечебная и экономическая эффективность тилоколина при респираторных болезнях поросят бактериальной этиологии.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических предложений и списка использованной литературы. Диссертация изложена на 152 страницах маши-

нописного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 12 рисунками. Библиография содержит 357 источников, в том числе 85 - иностранных авторов.

2. Материалы и методы исследований

Диссертация выполнена в 2007-2010 гг. в отделе микробиологии, вирусологии и иммунологии в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии по заданию 08.04.01. «Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных» (№ гос. регистрации 15070. 3666026906. 06.8.001.2).

Для выяснения эпизоотической ситуации в хозяйствах использовали данные отчетов ветеринарных служб и результаты собственных исследований.

При клиническом исследовании у животных измеряли температуру тела, определяли частоту дыхания и пульса, наличие одышки, кашля, носовых истечений в соответствии с принятыми в клинической диагностике методами.

Этиологическую структуру респираторных болезней изучали на основании эпизоотологического обследования хозяйств, результатов бактериологических, серологических и молекулярно-генетических исследований патологического материала от павших и убитых с диагностической целью больных животных.

Бактериологические исследования проводили общепринятыми классическими методами согласно утвержденным наставлениям. При бактериологических исследованиях использовали пораженные участки легких на границе со здоровой тканью, средостенные лимфатические узлы, кровь из сердца, селезенку, почки, печень. Патологический материал исследовали не позднее 2 часов после его взятия. Посевы патологического материала проводили на мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), МПА с 5% крови барана, среду Эндо. Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов, после чего учитывали характер роста микроорганизмов. У выделенных чистых культур изучали тинкториальные, морфологические и культурально-биохимические свойства. Чувствительность выделенных штаммов микроорганизмов к антибиотикам определяли методом индикаторных бумажных дисков. Оценку результатов проводили путем измерения величины зоны задержки роста культур. Патогенность выделенных штаммов микроорганизмов определяли с помощью постановки биопробы на белых мышах.

Молекулярно-генетические исследования выполняли методом ПЦР с применением соответствующих утвержденных тест-систем, амплификацию ДНК проводили в программируемом термостате «Терцик ТПЧ-ПЦР01». Для регистрации продуктов ПЦР использовали метод электрофоретического разделения продуктов амплификации в агарозном геле.

Серологические исследования проводили согласно утвержденным методикам и наставлениям к соответствующим диагностическим наборам. Учет результатов иммуноферментного анализа осуществляли на спектрофотометре с вертикальным ходом луча «Униплан-ТМ».

Изучение антимикробной активности тилоколина и оптимального соотношения тилозина и колистина в препарате проводили in vitro методом серийных разведений (Б.И. Антонов с соавт., 1986; В.Ф. Ковалев с соавт., 1988; М.А. Сидоров с соавт., 1995). В качестве тест-культур использовали музейные и полевые (патогенные) штаммы микроорганизмов - возбудителей респираторных и желудочно-кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных.

Оптимальное соотношение тилозина и колистина определяли путем сравнения антимикробной активности изучаемых композиций с таковой у составляющих компонентов.

Минимальную бактериостатическую концентрацию (МБсК) определяли методом серийных разведений в МПБ, а минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) - путем высева из пробирок с прозрачной средой на плотные питательные среды. При определении чувствительности стрептококков к среде добавляли 1% глюкозы. В качестве контроля роста культуры использовали пробирку, не содержащую препарат. Содержание микробных клеток в 1 мл среды составляло 500 тысяч. Посевы инкубировали при 37°С в течение 18-20 часов. По истечении срока инкубации учитывали результат.

Антимикробную активность тилоколина (in vivo) изучали на моделях пастереллезной, сальмонеллезной и стафилококковой инфекций белых мышей. В предварительных опытах определяли минимальную летальную дозу (DLM) суточных культур, которая составила для Staphylococcus aureus 750 млн. микробных клеток/мышь, для Salmonella cholerae suis - 3 млн. микробных клеток/мышь, для Pasteurella multocida - 250 тыс. микробных клеток/мышь.

Заражение проводили смывом суточных агаровых культур возбудителей. Их разведения делали на стерильном физиологическом растворе. Концентрацию микробных клеток устанавливали по стандарту мутности. Для определения профилактической эффективности препарат вводили однократно внутримышечно одновременно с заражением в дозе 0,075 мл/кг. Для определения терапевтической эффективности лечение мышей начинали через 6 часов после заражения. Препарат вводили 1 раз в сутки внутримышечно в той же дозе в течение 10 дней.

Эксперименты проводили на половозрелых нелинейных разнополых белых мышах с массой тела 16-19 г. Животных содержали в условиях вивария Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии, при температуре воздуха 20-22°С и влажности 40-60%.

Группы животных формировали по принципу парных аналогов по 8 мышей в каждой, учитывали массу тела, развитие и клиническое состояние. Животных контрольных групп лечению не подвергали. За подопытными бе-

лыми мышами вели клиническое наблюдение в течение 15 дней, учитывали заболеваемость, сроки выздоровления, гибель. Специфичность гибели определяли бактериологическим методом при выделении исходных культур микроорганизмов из крови сердца, печени, селезенки павших мышей. Индекс защиты определяли по формуле В.Д. Белякова (1961).

О профилактической и терапевтической эффективности препарата судили по количеству выживших мышей после окончания опыта и числу мы-ше-дней жизни для каждой группы через 15 дней после инфицирования.

Изучение формирования резистентности Salmonella cholerae suis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Pasteurella multocida к тилоколину проводили путем культивирования бактерий на МПБ, содержащем возрастающие суббактериостатические концентрации препарата. После каждых десяти пассажей методом серийных разведений изучали антимикробную активность тилоколина в отношении данных штаммов микроорганизмов. У пассируемых культур степень устойчивости к препарату оценивали по коэффициенту резистентности - отношению максимальной, не препятствующей росту бактерий концентрации, к исходной.

Для изучения стабильности приобретенной культурами устойчивости к тилоколину проводили последовательные пассажи полученных резистентных штаммов микроорганизмов на мясо-пептонном бульоне, не содержащем препарат. Методом серийных разведений после каждых десяти пассажей определяли антимикробную активность тилоколина в отношении изучаемых культур микроорганизмов.

Изучение воздействия препарата на клетки Staphylococcus aureus и Pasteurella multocida проводили на соответствующих культурах в фазе логарифмического роста. Культуры выращивали на МПБ при загруженности в 500 тысяч микробных клеток на 1 мл среды в условиях усиленной аэрации. Тило-колин добавляли к 5-часовой культуре в минимальной бактерицидной концентрации и в концентрации, в 4 раза превышающей МБцК. Время экспозиции составляло 3 часа. Контролем служили культуры без препарата. Опытные и контрольные образцы центрифугировали 5-10 минут при 3000 об/мин. Осадок 2-3 раза отмывали в физиологическом растворе. Затем бактериальные клетки помещали на 1 час в 2,5% глутаральдегид на s-коллидиновом буфере, центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин, осадок отмывали 10% раствором сахарозы 5 раз по 20 минут.

Постфиксацию проводили четырехокисью осмия. Фиксированный материал обезвоживали в восходящих концентрациях этилового спирта, после чего осадок помещали в смесь эпоновых смол.

Срезы получали на ультратоме LKB III-8802A, контрастировали 2%-ным водным раствором уранил ацетата и цитратом свинца в течение 10 минут.

Препараты просматривали на электронном микроскопе марки JEM-100 СХ II фирмы JEOL при ускоряющем напряжении 80 кВольт и разрешающей способности 3 ангстрема. Применяли инструментальное увеличение 19000-48000.

Опыты по изучению лечебной эффективности тилоколина проведены на поросятах 1,5-3 месячного возраста в условиях двух хозяйств, стационарно неблагополучных по респираторной патологии: ОАО Агрофирме "Ливен-ское мясо" Ливенского района Орловской области и колхозе им. Ленина Тамбовского района Тамбовской области. Опыты проведены в соответствии с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту (И.Т. Фролов, 1965) по постановке контроля, подбору аналогов, соблюдению одинаковых условий содержания и кормления животных в период исследования.

Действие препарата на морфологические и иммунологические показатели крови и неспецифическую резистентность организма было изучено на больных пневмонией поросятах. Для оценки уровня неспецифической резистентности определяли гемолитическую активность комплемента у животных - по Г.Ф. Вагнеру (1963), бактерицидную активность сыворотки крови -по О.В. Смирновой и Т.А. Кузминой (1966), лизоцимную - по К.А. Каграма-новой и З.В. Ермольевой (1966), фагоцитарную активность лейкоцитов, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс - по B.C. Гостеву (1950).

Морфологический анализ крови проводили на гематологическом анализаторе «АВХ Micros 60», биохимические исследования крови - на анализаторе «Hitachi-902» в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению биохимических методов исследований крови животных» (2005). Определение микроэлементов проводили на атомно-адсорбционном спектрофотометре - 6500.

Показатели, отражающие состояние системы ПОЛ-АОЗ: содержание малонового диальдегида, глутатионпероксидазы и каталазы (B.C. Бузлама с соавт., 1997)-определяли на спектрофотометре «Speco1-340».

Экономическую эффективность применения препарата определяли согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (Ю.Е. Шатохин с соавт., 1997).

Статистическая обработка полученных результатов исследований проведена общепринятыми методиками (Е.К. Меркурьева, 1964). Результаты исследований обрабатывались на ПК с использованием программ «Winstat 557» и «ExStat».

Разработку препарата проводили совместно с сотрудниками лаборатории экспериментальной фармакологии (зав. доктор биологических наук Г.А. Востроилова); морфологические и биохимические исследования крови с участием сотрудников отделов физико-химических методов исследований (зав. кандидат биологических наук В.И. Шушлебин) и клинической биохимии (зав. профессор, доктор биологических наук М.И. Рецкий); электронно-микроскопические исследования совместно с сотрудниками лаборатории биофизики ГНУ ВНИИЭВ им. Я.Р. Коваленко (зав. кандидат биологических наук Г.А. Надточей); клинические испытания тилоколина с участием ветеринарных специалистов хозяйств, которым автор выражает искреннюю признательность.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Комплексный антимикробный препарат тилоколин на основе тилозина и колистина разработан в ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии с нашим участием.

3.1. Изучение оптимального соотношения компонентов в тилоколине

Изучение антимикробной активности и оптимального соотношения компонентов в препарате тилоколин в опытах in vitro проводили методом серийных разведений в мясопептонном бульоне с определением МБсК и МБцК. Соотношение колистина и тилозина в препарате изучены в различных комбинациях: 5:5,4,5:5,5,5,5:4,5,4,0:6,0,6,0:4,0 (таблица 1).

Таблица 1

Антимикробная активность (МБсК) колистина, тилозина и различных

композиций препарата, мкг/мл

Препарат/ Культура К Т К1 К2 КЗ К4 К5

Е. coli 1,56 3,12 0,19 0,39 0,19 0,19 0,39

S. dublin 0,78 6,25 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78

S. cholerae suis 3,12 6,25 0,39 1,56 0,39 1,56 1,56

Staph, aureus 25,0 0,78 0,78 1,56 1,56 0,78 1,56

P. multocida 6,25 ЗД2 0,39 0,39 0,78 0,78 0,78

Обозначения: К - колистин; Т - тилозин; К1 - композиция 1; К2 - композиция 2; КЗ - композиция 3; К4 - композиция 4; К5 - композиция 5

Минимальная бактериостатическая концентрация тилозина в отношении Е. coli 57/853 составила 3,12 мкг/мл, S. dublin 593/75 - 6,25, S. cholerae suis - 6,25, Staph, aureus 209 P - 0,78 и P. multocida В 651 - 3,12; МБсК колистина составила 1,56, 0,78, 3,12,25,0 и 6,25 мкг/мл соответственно.

Из таблицы 1 видно, что наиболее выраженным антимикробным действием обладала композиция 1 (5:5). Ее минимальная бактериостатическая концентрация в отношении эшерихий и S. cholerae suis по сравнению с таковой колистина уменьшилась в 8 раз, тилозина - в 16 раз и Р. multocida в 16 и 8 раз соответственно. МБсК композиции 1 в отношении S. dublin по сравнению с минимальной бактериостатической концентрацией колистина не изменилась, а по сравнению с таковой тилозина снизилась в 8 раз и Staph, aureus по сравнению с минимальной ингибирующей концентрацией колистина снизилась в 32 раза, а по сравнению с таковой тилозина - не изменилась.

Широким спектром антимикробной активности в отношении изученных микроорганизмов обладали и другие композиции. Из них следует отметить вторую и третью, так как они проявляли выраженный синергидный эффект.

Таким образом, изучение антимикробной активности колистина и тилозина, а также различных их композиций in vitro показало наличие у по-

следних взаимоусиливающего (синергидного) действия в отношении изученных патогенных культур, которое было наиболее выражено у композиции 1.

На основании результатов, полученных в опытах in vitro, в опытах in vivo испытаны 1, 2 и 3 композиции. Их специфическая активность была изучена на моделях инфекций, вызванных Salmonella cholerae suis, Staphylococcus aureus и Pasteurella multocida.

Однократная инъекция композиции 1 при сальмонеллезной инфекции обеспечила сохранность 62,5% животных, пастереллезной - 50,0% и при стафилококковой - 62,5%; композиции 2 - 37,5% при всех указанных выше инфекциях и композиции 3 - 50,0, 12,5 и 62,5% соответственно.

Гибель животных во всех группах контроля составила 100%.

Наибольшую суммарную продолжительность жизни белых мышей обеспечила однократная инъекция композиции 1. При сальмонеллезной инфекции она составила 84 дня, при пастереллезной - 81 и стафилококковой -89 дней. При применении композиции 2 - 68,69 и 64 дня, композиции 3 - 80, 56 и 85 дней соответственно.

Число мыше-дней жизни в группах контроля при заражении их Salmonella cholerae suis, Pasteurella multocida и Staphylococcus aureus составило 26, 39 и 31 день соответственно.

Лечебная эффективность композиции 1 составила при сальмонеллезной инфекции - 75,0%, при пастереллезной - 62,5% и при стафилококковой -87,5%; композиции 2 - 62,5, 62,5 и 75,0%; композиции 3 - 75,0, 50,0 и 87,5% соответственно.

Суммарная продолжительность жизни белых мышей при лечении животных композицией 1 составила при сальмонеллезной инфекции 99 дней, при пастереллезной - 88 дней и при стафилококковой - 111 дней; при применении композиции 2 - 86, 87 и 98 дней; композиции 3 - 98, 81 и 108 дней соответственно.

Суммируя данные опытов in vitro и in vivo, можно сделать вывод, что наиболее эффективной оказалась композиция 1, которая в дальнейшем была названа препаратом тилоколин. В связи с этим более детально изучена его антимикробная активность.

3.2. Изучение антимикробной активности препарата тилоколин

Согласно представленным в таблице 2 данным, тилоколин обладает выраженными антимикробными свойствами. Активность препарата в отношении как музейных, так и полевых штаммов эшерихий была достаточно высокой - 0,19-3,12 мкг/мл. Минимальное ингибирующее действие тилоколина в отношении сальмонелл установлено в концентрации 0,39-3,12 мкг/мл. Активность препарата в отношении пастерелл также была высокой - 0,39-0,78 мкг/мл. Бактериостатическая концентрация для кокковой микрофлоры составила 0,78-3,12 мкг/мл. Бактерицидная концентрация тилоколина в отношении изученных культур превышала бактериостатическую в 2 раза.

Таблица 2

Антимикробная активность тилоколина_

Культура микроорганизмов Тилоколин

МБсК, мкг/мл МБцК, мкг/мл

Escherichia coli 57/853 0,19 0,39

Escherichia coli 04 0,39 0,78

Escherichia coli 0139 (n) 1,56 ЗД2

Escherichia coli 866 0,19 0,39

Escherichia coli 0142 (n) 3,12 6,25

S. cholerae suis 0,39 0,78

S. cholerae suis (n) 1,56 3,12

S. dublin 593/75 0,78 1,56

S. dublin 1,56 3,12

S. thyphimurium 3,12 6,25

S. thyphimurium 383/144 1,56 3,12

Pasteurella multocida 0,39 0,78

Pasteurella multocida (n) 0,78 1,56

Staph, aureus 209P 0,78 1,56

Staph. cowan-I-JTCTCC 8530 0,78 1,56

Strept. faecalis 5957 гр.Д 1,56 3,12

Strept. pneumoniae (n) 3,12 6,25

п - полевые штаммы микроорганизмов.

Таким образом, препарат обладает широким спектром антимикробного действия в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов - возбудителей респираторных и желудочно-кишечных болезней сельскохозяйственных животных.

3.3. Изучение формирования устойчивости потенциальных бактериальных возбудителей респираторных инфекций к тилоколину

В опыт по изучению формирования устойчивости к тилоколину были взяты Salmonella cholerae suis, Escherichia coli 866, Staphylococcus aureus 209P и Pasteurella multocida, исходная МБсК препарата для которых составила 0,39, 0,19,0,78 и 0,39 мкг/мл соответственно.

Таблица 3

Формирование устойчивости микроорганизмов к тилоколину

Культуры микроорганизмов МБсК, мкг/мл МБцК, мкг/мл

исх. 10 п. 20 п. 30 п. 40 п. исх. 10 п. 20 п. 30 п. 40 п.

Е. coli 866 0,19 3,12 6,25 12.5 12,5 0,39 6,25 12,5 25 25

S. cholerae suis 0,39 6,25 12,5 25 25 0,78 12,5 25 50 50

Staph. aureus 0,78 1,56 3,12 6,25 6,25 1,56 3,12 6,25 12.5 12.5

Р. multocida 0.39 0,78 3,12 3,12 3,12 0,78 1,56 6,25 6,25 6,25

Минимальная бактериостатическая концентрация тилоколина в отношении Escherichia coli 866 и Salmonella cholerae suis после 10 пассажей увеличилась в 16 раз, после 20 - в 32 и через 30 пассажей - в 64 раза (коэффициент резистентности 64), Staphylococcus aureus 209Р соответственно в 2, 4 и 8 раз (коэффициент резистентности 8) и Pasteurella multocida после 10 пассажей в 2 и через 20 - в 8 раз (коэффициент резистентности 8). При дальнейших пассажах культур микроорганизмов увеличение МБсК препарата не происходило (таблица 3).

Для решения вопроса о стабильности приобретенных свойств были проведены последовательные пассажи культур микроорганизмов с выработанной устойчивостью на МПБ, не содержащем препарат.

Таблица 4

Восстановление чувствительности микроорганизмов к тилоколину

Культуры МБсК/МБцК, мкг/мл

микроор- исх. 10 п. 20 п. 30 п. 40 п. 50 п. 60 п. 70 п. 80 п. 90 п.

ганизмов

Е. coli 866 12,5/ 6,25/ 6,25/ 6.25/ 3,12/ 3,12/ 1,56/ 0,78/ 0,19/ 0,19/

25,0 12,5 12,5 12,5 6,25 6,25 3,12 1,56 0,39 0,39

S. cholerae 25,0/ 12,5/ 6,25/ 6,25/ 3,12/ 3,12/ 0,78/ 0,39/ 0,39/ -

suis 50,0 25,0 12,5 12,5 6,25 6,25 1,56 0,78 0,78

Staph, aureus 6,25/ 6,25/ 3,12/ 1,56/ 1,56/ 1,56/ 0,78/ 0,78/ - -

209P 12,5 12,5 6,25 3,12 3,12 3,12 1,56 1,56

P.multocida 3,12/ 1,56/ 0,39/ 0,39/ 0,39/ 0,39/ - - ■ -

6,25 3,12 1,56 1,56 0,78 0,78

Согласно данным таблицы 4 МБсК тилоколина в отношении эшерихий после 10 пассажей уменьшилась в 2 раза, 40 - в 4,60 - в 8, 70 - в 16 и через 80 пассажей - в 64 раза, достигнув исходного уровня. В отношении сальмонелл она после 10 пассажей снизилась в 2 раза, 20 - в 4,40 - в 8,60 - в 32 и через 70 пассажей - в 64 раза, достигнув исходного значения. МБсК препарата в отношении золотистого стафилококка через 20 пассажей уменьшилась в 2 раза, 30 - в 4 и через 60 пассажей в 8 раз и достигла исходного уровня. Минимальная бактериостатическая концентрация тилоколина в отношении пастерелл через 10 пассажей снизилась в 2 раза и после 20 - в 8 раз, достигнув исходного уровня. При дальнейших пассажах всех изучаемых кулыур микроорганизмов на средах, не содержащих препарат, снижение его МБсК не происходило.

Согласно полученным данным, наибольшую устойчивость к тилоколину выработали эшерихии и сальмонеллы (индекс резистентности 64). Также наиболее длительно происходило восстановление их чувствительности к препарату (в течение 80 и 70 пассажей соответственно). Значительно меньшую устойчивость к тилоколину выработали стафилококки и пастереллы (индекс резистентности 8), а восстановление их чувствительности к препарату произошло через 60 и 20 пассажей соответственно.

Таким образом, при культивировании штаммов Escherichia coli 866, Salmonella cholerae suis, Staphylococcus aureus 209P и Pasteurella multocida на средах, содержащих суббактериостатические концентрации тилоколина,

происходит повышение их резистентности к препарату. Однако приобретенная устойчивость является нестабильной и при пассировании культур на средах, не содержащих тилоколин, происходит постепенное восстановление их чувствительности к препарату.

3.4. Изучение стабильности антимикробной активности тилоколина

Для изучения стабильности антимикробного действия препарата ежеквартально в течение года проводили изучение его антимикробной активности. Минимальные бактерицидные и бактериостатические концентрации тилоколина в отношении Е. coli 866, S. cholerae suis, S. thyphimurium 383/144, S. dublin 593/75, P. multocida, Staph, aureus 209P, Strept. faecalis 5957 гр.Д и Staph. cowan-I-JICTCC 8530 после 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения оставались на исходном уровне.

Согласно проведенным исследованиям установлено, что препарат стабилен и сохраняет свою антимикробную активность в течение 12 месяцев хранения (срок наблюдения).

3.5. Влияние тилоколина на ультраструктуру клеток Staphylococcus aureus и Pasteurella multocida

Клетки золотистого стафилококка (контроль) имели микроскопическую структуру, свойственную этому микроорганизму (рис.1). Клеточная стенка целостная, имеет трехслойную структуру, ее слои четко дифференцированы. Внутренний электронно-плотный слой хорошо выражен. Одноконтурная цитоплазматическая мембрана плотно прилегает к клеточной стенке. Цитоплазма мелкозернистая, заполнена гранулярным компонентом, в отдельных ее участках выявляли рибосомальные гранулы. Нуклеотид расположен в центральной части клетки и просматривается в виде более просветленной зоны за счет меньшей электронной плотности.

Внутрицитоплазматические структуры имели вид двухконтурных мембран. Деление клеток осуществлялось посредством образования септ, которые включали в свой состав все компоненты клеточной стенки и цитоплазма-тической мембраны. Обнаруживали много активно делящихся клеток, находящихся на различных стадиях размножения.

При воздействии тилоколина в минимальной бактерицидной концентрации (1,56 мкг/мл) клетки золотистого стафилококка сохраняли исходную форму, однако происходило значительное утолщение клеточной стенки (рис.2). Ее трехслойная структура местами теряла контурность. Нарушалась целостность поверхностного электронно-плотного слоя клеточной стенки. Цитоплазматическая мембрана выявлялась не на всем протяжении. Содержимое цитоплазмы было представлено дисперсным веществом неоднородной электронно-оптической плотности. У значительного числа клеток цитоплазма приобретала глыбчатую структуру с участками просветления и лизиса. В отдельных частях клетки происходило полное исчезновение разграничения между цитоплазмой и клеточной стенкой. Рибосомальные гранулы не выявлялись. Ядерный материал слабо дифференцировался.

Рис. 1. Клетка S.aureus (контроль). Рис. 2. Клетка S.aureus под воздействием

МБцК тилоколина.

КС - клеточная стенка, КП - клеточная перегородка (септа), ЦПМ - цитоплазматическая мембрана. Н - н\'клеоид, Р - рибосомы, MC - мезосомальные структуры, Ц - цитоплазма. Ув. 29000.

Происходило нарушение процесса размножения, в результате чего выявлялось незначительное количество делящихся клеток. Образование септ происходило неравномерно.

----------------------При воздействии тилоколина в

4-х кратной МБцК (6,25 мкг/мл) в ультраструктуре стафилококков отмечали более выраженные изменения (рис.3).

Клетки увеличены в размере, неправильной округлой формы. Клеточная стенка значительно утолщена и имела меньшую электронную плотность. Ее трехслойная структура сохранялась лишь в отдельных участках клеток. Внутренний электронно-плотный слой клеточной стенки не четко дифференцировался, либо не просматривался. Целостность цитоплазмати-ческой мембраны нарушалась. Цитоплазма теряла гомогенность и состояла из участков различной электронной плотности. В ней обнаруживались электронно-прозрачные участки различных размеров, в отдельных случаях содержащие неоднородные осмиофильные включения. Рибосомальные гранулы и нуклеоид не выявлялись. Обнаруживали и полностью лизирован-ные клетки. Их клеточная стенка истончалась, целостность нарушалась, трехслойная структура не дифференцировалась практически на всем протя-

Рис. 3. Клетка S.aureus под воздействием 4-х МБцК тилоколина

КС - клеточная стенка. ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, МС - мезосомальные структуры, Ц - цитоплазма, JI - участки лизиса, ОВ - осмиофильные включения, ЭГТУ -электронно-прозрачные участки, JIK - лизи-рованная клетка. Ув. 29000.

жении. Процесс размножения нарушался. Практически отсутствовали делящиеся клетки.

Клетки пастерелл (контроль) имели ультраструктуру, типичную для данных бактерий (рис.4). Клеточная стенка трехслойная, волнистая. Ее целостность не нарушена. Цитоплазматическая мембрана плотно прилегает к клеточной стенке. Цитоплазма гомогенная. Рибосомальный аппарат четко выражен. Генетический аппарат расположен в центральной части клетки и пред-

При воздействии на пастерел-лы МБцК тилоколина (0,78 мкг/мл) наблюдалась значительная вариабельность размеров клеток. Клеточная стенка приобретала бугристый вид. Ее трехслойная структура дифференцировалась не на всем протяжении. Местами не просматривалось разграничение между клеточной стенкой и цитоплазмой. Цитоплазматическая мембрана выявлялась не на всем протяжении. Цитоплазма не гомогенна, у отдельных клеток имела мелкоглыбчатый вид. В различных ее частях, чаще в центре, просматривались просветленные участки лизиса, в которых обнаруживались мембранные структуры. Рибосомальный аппарат сохранен. Ядерный материал слабо дифференцировался. Нарушен процесс деления (рис.5).

ставлен более рыхлой структурой.

Рис. 4. Клетка пастереллы (контроль) КС - клеточная стенка, ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, Ц - цитоплазма, Н -нуклеоид. Р - рибосомы. Ув. 29000.

Рис. 5. Клетки Р.тикос1<1а под воздействием Рис. 6. Клетки Р.тиНоаёа под воздействием МБцК тилоколина 4-х МБцК тилоколина

КС - клеточная стенка, ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, МС - мезосомальные структуры, Ц - цитоплазма, Н - нуклеоид, ПП - периплазматическое пространство, П -перетяжка, Л - лизис. Ув. 29000.

При воздействии 4-х МБцК препарата (3,12 мкг/мл) отмечали сходные, но более глубокие деструктивные изменения структуры клеток (рис.6). Наряду с бактериями, имеющими обычный размер, встречались увеличенные клетки неправильной формы. Клеточная стенка истончена, местами не просматривалась полностью, ее слои не дифференцировались. Остатки цито-плазматической мембраны выявлялись лишь в некоторых участках клетки. Граница между клеточной стенкой и цитоплазмой была практически полностью стерта. Внутренний электронно-плотный слой отсутствовал. Гомогенность цитоплазмы нарушена. Осмиофильные участки по краям клеток переходили в зоны лизиса, расположенные в центральной части. Лизис внутренних структур по-разному выражен у отдельных клеток. Рибосомальный и генетический аппараты редуцированы. Присутствуют полностью лизирован-ные клетки.

Выявленные изменения в ультраструктуре бактерий под действием тилоколина обусловлены синергидным эффектом составляющих его компонентов - колистина и тилозина. Первичное воздействие колистина на цито-плазматическую мембрану ускоряет проникновение тилозина в бактериальную клетку, и оба компонента одновременно действуют на ее различные структуры.

Таким образом, воздействие тилоколина на клетки стафилококков и пастерелл вызывает значительные деструктивные изменения их ультраструктуры и нарушает процесс деления. При этом глубина и степень выраженности повреждений зависят от концентрации препарата.

3.6. Изучение лечебной эффективности тилоколина при респираторных

болезнях поросят

Первый опыт проведен на поросятах 40-45 дневного возраста, принадлежавших ОАО Агрофирме «Ливенское мясо». Заболевание проявлялось потерей аппетита, слабостью, повышением температуры тела на 0,5-1,5°С, кашлем, усиливающимся после физических нагрузок, серозными и серозно-слизистыми истечениями из носовых отверстий.

При патологоанатомическом вскрытии павших и вынужденно убитых с диагностической целью поросят обнаруживали катаральное воспаление слизистой оболочки трахеи и бронхов, отечность и гиперемию паренхимы легких, лобулярное катаральное воспаление легочной ткани.

При бактериологическом исследовании патологического материала от убитых с диагностической целью поросят, больных пневмонией, выделены Pasteurella multocida и Haemophilus parasuis. Методом ПЦР в пораженных легких обнаружен геном Mycoplasma hyopneumoniae. При исследовании сывороток крови больных поросят выявлена сероконверсия к вирусу РРСС в 70%, цирковирусу II типа - в 80% случаев.

В опыте по принципу аналогов были сформированы 2 группы больных поросят. Животным опытной группы (п=24) применяли тилоколин в дозе 0,075 мл/кг массы тела, группы сравнения (п=28) - байтрил в дозе 0,05 мл/кг массы тела. Препараты вводили внутримышечно 1 раз в сутки в течение 7-10

дней. Выбор байтрила в качестве базового варианта был осуществлен на основании определения чувствительности выделенной из патологического материала микрофлоры к антибактериальным препаратам.

За подопытными животными вели клиническое наблюдение, учитывали общее состояние, прирост массы тела, сроки выздоровления, отсутствие или наличие падежа. До лечения и спустя 11 дней после назначения препаратов проводили морфологические и биохимические исследования крови и определяли показатели общей неспецифической резистентности.

При изучении морфологических показателей крови у поросят обеих групп существенной разницы не установлено. В лейкограмме выявлено повышенное содержание сегментоядерных нейтрофилов - в опытной группе на 14,8% и в группе сравнения на 17,6%. При анализе биохимического статуса у животных отмечены относительно низкая активность ферментов переамини-рования и повышение активности щелочной фосфатазы. Пониженное содержание общего белка (60,5 и 62,2 г/л соответственно) вероятнее всего связано с перераспределением сывороточных протеинов, которое обусловлено воспалительным процессом в легочной ткани. При этом у поросят опытной группы отмечен более низкий (на 16,9%) уровень альбуминов при высоком содержании (на 26,6%) а-глобулинов.

У больных поросят обеих групп отмечены повышение активности глу-татионпероксидазы в 1,7 раза и процессов перекисного окисления липидов с накоплением в крови токсических продуктов, о чем свидетельствовал высокий уровень МДА. При этом существенных различий между показателями ПОЛ-АОЗ у животных не выявлено.

При сравнении показателей неспецифической резистентности у животных опытной группы были ниже КАСК на 25,4%, показатели фагоцитоза -ФАЛ на 7,7% (Р<0,02), ФЧ и ФИ - на 36,9 и 31,4% (Р<0,02) и выше уровень лизоцима в крови - на 39,7% (Р<0,02).

Применение тилоколина в течение 7-10 дней способствовало выздоровлению 91,7% животных. Терапевтическая эффективность байтрила составила 85,7%. Поросята опытной и группы сравнения выздоравливали на 7-8 день лечения, среднесуточный прирост массы тела составил 155,0 и 160,0 г соответственно.

После проведенного курса лечения у поросят опытной группы процент сегментоядерных нейтрофилов снизился в 2 раза, произошло увеличение количества моноцитов на 25,0% и лимфоцитов на 19,7%. Перечисленные изменения в лейкограмме указывают на уменьшение воспалительного процесса. У поросят группы сравнения процент сегментоядерных нейтрофилов снизился в 1,5 раза, моноциты на 55,6%, лимфоциты повысились на 23,2%.

У животных опытной группы повысился уровень общего белка на 21,1%, альбуминов на 12,5%, при снижении содержания а-глобулинов на 12,7%, что также указывает на уменьшение воспалительного процесса и улучшение общего гомеостаза. У поросят группы сравнения аналогичные изменения были выражены в меньшей степени.

У животных обеих групп отмечена нормализация активности АсАТ и АлАТ. Повышенная активность каталазы и глутатионпероксидазы обеспечивала переход процессов перекисного окисления липидов на оптимальный уровень. Снижение уровня молекул средней массы свидетельствовало об уменьшении явления эндогенной интоксикации.

У поросят опытной группы отмечали существенное увеличение ФЧ и ФИ - в 1,8 и 1,6 раза, ФАЛ - на 10,8% (Р<0,02), снижение ЛАСК на 10,9%. Под влиянием тилоколина КАСК повысилась на 36,1%, что, видимо, связано с уменьшением расхода компонентов комплемента. У животных группы сравнения снижение КАСК произошло в 1,78 раза, наблюдалось менее выраженное увеличение ФАЛ (на 3,6%), ФЧ и ФИ (на 3,7% и 3,9%), но оставалась более высокой ЛАСК, что свидетельствует о более напряженном фагоцитозе и повышении расхода компонентов системы комплемента.

Во второй серии опытов в ОАО Агрофирме «Ливенское мясо» изучение лечебной эффективности тилоколина при респираторных болезнях поросят проводили на животных 75-85 дневного возраста.

При клиническом обследовании поросят с респираторной патологией были отмечены следующие признаки: слабость, потеря аппетита, отставание в росте и развитии, кашель, повышение температуры тела на 0,5-1,5° С.

При патологоанатомическом вскрытии павших и вынужденно убитых с диагностической целью поросят обнаруживали отечность и гиперемию паренхимы легких, лобулярное катаральное и катарально-гнойное воспаление легочной ткани, средостенные и бронхиальные лимфатические узлы увеличены в объеме, серо-белого цвета. В отдельных случаях наблюдали очаги некроза в легких.

При бактериологическом исследовании патологического материала от убитых с диагностической целью больных пневмонией поросят выделены Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Streptococcus pneumoniae. При мо-лекулярно-генетическом исследовании обнаружены геномы вируса ЦВС-Н, хламидий, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis. При исследовании сывороток крови поросят с респираторным синдромом выявлены положительно реагирующие на РРСС в 80% и цирковирусную инфекцию - в 70% случаев.

Взятые в опыт животные были разделены на две группы. Поросятам опытной (п=15) - применяли парентерально тилоколин в дозе 0,075 мл/кг массы тела 1 раз в сутки, контрольной (n=l 1) -энрофлокс перорально в дозе 2 мл на голову. Лечение больных животных проводили в течение 7-10 дней. Выбор в качестве базового варианта энрофлокса осуществили на основании определения чувствительности выделенной из патологического материала микрофлоры к антибактериальным препаратам.

Применение тилоколина способствовало выздоровлению 86,7% животных, тогда как лечебная эффективность энрофлокса составила 81,8%. Поросята опытной и группы сравнения выздоравливали на 7-8 день лечения при среднесуточном приросте массы тела 296±9,3 г и 289±4,0 г соответственно.

Третий опыт по изучению лечебной эффективности тилоколина при респираторных болезнях поросят был проведен в колхозе им. Ленина Тамбовского района Тамбовской области.

Патологоанатомическая картина у павших и вынужденно убитых с диагностической целью поросят характеризовалась преимущественным поражением легких. Пораженные доли легкого увеличены, уплотнены, неравномерно окрашены; отмечено серозно-катаральное воспаление легочной ткани. Легочная плевра местами слегка набухшая. Средостенные лимфатические узлы увеличены, отечны, гиперемированы.

При бактериологическом исследовании патологического материала от убитых с диагностической целью поросят выделена культура Р. multocida. Методом ПЦР в пораженных легких обнаружены геномы М. hyopneumoniae, М. hyorhinis, цирковируса II типа.

Опыт по изучению лечебной эффективности тилоколина проведен на поросятах 50-55 дневного возраста. Поросятам опытной группы (п=24) применяли тилоколин в дозе 0,075 мл/кг массы тела, группы сравнения (п=20) -тилозин в дозе 1 мл на 10 кг массы тела. Препараты вводили внутримышечно. Лечение проводили в течение 7-10 дней. Выбор в качестве базового варианта тилозина был осуществлен на основании определения чувствительности выделенной из патологического материала микрофлоры к антибактериальным препаратам.

Применение тилоколина способствовало выздоровлению 83,3% животных при 80,0% эффективности в группе сравнения. У поросят опытной группы выздоровление наступало на 6-7 день, при этом среднесуточный прирост массы тела составил 187,0 г., группе сравнения - на 7 день при среднесуточном приросте 181,0 г.

Таким образом, комплексный антимикробный препарат тилоколин обладает выраженной лечебной эффективностью при бактериальных и осложненных бактериями вирусных пневмониях поросят и способствует выздоровлению 83,3-91,7 % животных.

3.7. Экономическая эффективность применения тилоколина при респираторных заболеваниях поросят

Опыт по изучению экономической эффективности применения антибактериального препарата тилоколин для лечения поросят с респираторной патологией проводили в ОАО Агрофирме «Ливенское мясо» Ливенского района Орловской области на 123 больных животных 40-45 дневного возраста. Всего восприимчивое поголовье составило -411 голов.

Экономический ущерб от респираторных болезней поросят составил 12237,9 руб., затраты на проведение ветеринарных мероприятий - 6542 руб. Предотвращенный экономический ущерб был равен 116139,6 руб. Экономический эффект, полученный в результате осуществления лечебных мероприятий, составил 109597,6 руб. Экономический эффект от проведения лечебных мероприятий на рубль затрат был равен 16,7 руб.

4. ВЫВОДЫ

1 . Новый комплексный антибактериальный препарат тилоколин, действующими веществами которого являются колистин и тилозин в соотношении 1:1, обладает широким спектром антимикробной активности. Минимальная бактериостатическая концентрация тилоколина в отношении эшери-хий составила 0,19-3,12 мкг/мл, сальмонелл - 0,39-3,12, пастерелл - 0,390,78, стафилококков - 0,78, стрептококков - 1,56-3,12 мкг/мл. Минимальная бактерицидная концентрация во всех случаях в 2 раза превышала минимальную бактериостатическую концентрацию.

2. Использование комбинации колистина и тилозина в препарате дает выраженный синергидный эффект, проявляющийся снижением минимальной бактериостатической концентрации тилоколина в отношении эшерихий и S. cholerae suis по сравнению с таковой колистина в 8 и тилозина в 16 раз и Pas-teurella multocida- в 16 и 8 раз соответственно. Минимальная ингибирующая концентрация препарата в отношении Salmonella dublin по сравнению с МБсК колистина не изменилась, а по сравнению с таковой тилозина снизилась в 8 раз и Staphylococcus aureus - по сравнению с минимальной бактериостатической концентрацией колистина снизилась в 32 раза, по сравнению с таковой тилозина - не изменилась.

3. Тилоколин обладает выраженной профилактической и терапевтической эффективностью при экспериментальных инфекциях белых мышей, вызванных Staphylococcus aureus, Salmonella cholerae suis и Pasteurella multocida. Индекс защиты при профилактике стафилококковой и сальмонеллезной инфекций белых мышей составил 62,5%, пастереллезной - 50,0%; при лечении - 87,5,75,0 и 62,5% соответственно.

4. При культивировании сальмонелл, эшерихий, стафилококков и пастерелл на средах, содержащих суббактериостатические концентрации тилоколина, у микроорганизмов формируется резистентность к препарату, индекс которой через 30 пассажей составил у Pasteurella multocida и Staphylococcus aureus - 8, Escherichia coli и Salmonella cholerae suis - 64.

5. Приобретенная микроорганизмами устойчивость к тилоколину является не постоянной и при пассировании на средах, не содержащих препарат, их чувствительность к нему восстанавливается: у Pasteurella multocida через 20 пассажей, Staphylococcus aureus - после 60, Salmonella cholerae suis - 70 и Escherichia coli - через 80 пассажей.

6. Выявленные изменения в ультраструктуре бактерий под действием тилоколина обусловлены синергидным эффектом составляющих его компонентов: колистина и тилозина.

6а. Воздействие минимальной бактерицидной концентрации тилоколина на клетки золотистого стафилококка проявляется значительным утолщением клеточной стенки, нарушением ее трехслойной структуры, недостаточной дифференциацией внутреннего электронно-плотного слоя, нарушением целостности цитоплазматической мембраны, потерей цитоплазмой гомогенности и обнаружением в ней электронно-прозрачных участков различных

размеров, в отдельных случаях содержащих неоднородные осмиофильные включения, слабой дифференциацией рибосомальных гранул и ядерного материала, нарушением процесса деления.

При воздействии четырехкратной бактерицидной концентрации препарата отмечали более выраженные изменения, проявляющиеся увеличением клеток в размере, значительным утолщением клеточной стенки, имеющей меньшую электронную плотность, сохранением ее трехслойной структуры лишь в отдельных участках клеток, нарушением целостности цитоплазмати-ческой мембраны практически на всем ее протяжении, наличием в цитоплазме участков различной электронной плотности, отсутствием дифференциации рибосомальных гранул и нуклеоида, появлением полностью лизирован-ных клеток, нарушением процесса размножения.

66. Воздействие минимальной бактерицидной концентрации тилоколи-на на пастереллы проявляется потерей клеточной стенкой трехслойной структуры, фрагментированием цитоплазматической мембраны, наличием в цитоплазме участков лизиса, слабой дифференциацией рибосомального и ядерного материала.

Более выраженные изменения в клетках под воздействием четырехкратной бактерицидной концентрации препарата характеризуются истончением клеточной стенки или ее отсутствием в отдельных местах, наличием цитоплазматической мембраны лишь в некоторых участках клетки, нарушением гомогенности цитоплазмы, переходом осмиофильных участков в зоны лизиса, расположенные в центральной части, отсутствием дифференциации генетического и рибосомального аппаратов, наличием погибших клеток с практически полным лизисом цитоплазмы и ядерного материала.

7. Применение тилоколина внутримышечно в дозе 0,075 мл/кг массы тела 1 раз в сутки в течение 7-10 дней при бактериальных и осложненных бактериями вирусных респираторных заболеваниях поросят обеспечивает клиническое выздоровление в 83,3-91,7% случаев, проявляющееся нормализацией клеточного состава крови, белкового обмена, переходом процессов перекисного окисления липидов на оптимальный уровень, уменьшением явлений эндогенной интоксикации, повышением общей неспецифической резистентности организма.

8. Применение тилоколина при терапии поросят с респираторной патологией является экономически выгодным. Эффективность лечебных мероприятий составляет 16,7 рубля на один рубль затрат.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для лечения больных пневмонией бактериальной этиологии поросят рекомендуется применять тилоколин внутримышечно в дозе 0,075 мл/кг массы тела один раз в сутки в течение 7-10 дней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1*. Шахов А.Г. Этиология респираторных болезней поросят в промышленных свиноводческих хозяйствах и меры их профилактики / А. Шахов, Л. Сашнина, М. Лебедев, С. Першина, Ю. Бригадиров, В. Шушлебин, А. Никулин, С. Сычев, А. Стребков // Свиноводство. - 2008. - №5. - С. 26 - 28.

2. Сашнина Л.Ю. Антимикробная активность тилоколина / Л.Ю. Сашнина, C.B. Сычев // Научное обеспечение агропромышленного производства (материалы Международной научно-практической конференции, 20-22 января 2010 года, г. Курск, ч. 2). - Курск, 2010. - 69-71.

3. Сашнина Л.Ю. Терапевтическая эффективность тилоколина при респираторных болезнях поросят бактериальной этиологии / Л.Ю. Сашнина, C.B. Сычев II Научное обеспечение агропромышленного производства (материалы Международной научно-практической конференции, 20-22 января 2010 года, г. Курск, ч. 2). - Курск, 2010. - 67-69.

4. Сашнина Л.Ю. Эффективность тилоколина при экспериментальных инфекциях белых мышей / Л.Ю. Сашнина, C.B. Сычев // Научное обеспечение агропромышленного производства (материалы Международной научно-практической конференции, 20-22 января 2010 года, г. Курск, ч. 2). - Курск, 2010.-60-62.

5. Сычев C.B. Экономическая эффективность применения тилоколина при респираторной патологии поросят / C.B. Сычев // Актуальные проблемы болезней обмена веществ у сельскохозяйственных животных в современных условиях (материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ГНУ ВНИВИПФиТ, 30 сентября -2 октября 2010 года). - Воронеж, 2010.-291-293.

* - издание, рекомендованное ВАК РФ.

Подписано в печать 29.10.2010 г. Формат 60 х 84/16 . Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,3 Тираж 110 экз. Заказ №2369

Отпечатано в типографии Воронежский ЦНТИ - филиал ФГУ «РЭА» Минэнерго России 394730, г. Воронеж, пр. Революции, 30

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Сычев, Сергей Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Распространение респираторных заболеваний свиней.

1.2. Этиологические факторы респираторных болезней поросят.

1.2.1. Роль отдельных возбудителей в этиологии респираторных инфекций животных.

1.2.2. Этиологическая роль ассоциаций вирусов и бактерий при респираторных болезнях свиней.

1.3. Роль условно-патогенной микрофлоры в этиологии инфекционных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных.

1.4. Проблема антибиотикорезистентности бактериальных возбудителей инфекционных болезней животных.

1.5. Диагностика, профилактика и методы борьбы с респираторными болезнями свиней.

1.5.1. Диагностика инфекционных респираторных заболеваний свиней.

1.5.2. Средства и методы борьбы и профилактики респираторных болезней свиней.

1.5.2.1. Вакцины и вакцинопрофилактика.

1.5.2.2. Иммуностимулирующие препараты.

1.5.2.3. Химиотерапевтические средства.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Антимикробная активность и лечебная эффективность тилоколина при бактериальных инфекциях органов дыхания поросят"

Актуальность темы. Перспективным направлением решения проблемы обеспечения населения страны животноводческой продукцией собственного производства является развитие свиноводства, имеющего целый ряд преимуществ перед другими отраслями животноводства, так как свиньи наиболее плодовитые и скороспелые животные, которые лучше других используют корм и дают наибольший выход мяса и жира (В. Сидоркин с соавт., 2003; Р. Волобуев, В. Волобуев, 2004; Е. Елисеева, 2008; Т.З. Байбиков, 2008; М.Ш. Акбаев с соавт., 2009).

Однако развитие свиноводства, как и в целом отрасли животноводства, сдерживает такой фактор, как инфекционные болезни животных (Р.В. Душук с соавт., 2000; Ю.А. Малахов, Р.В. Душук, 2001; В. Кудимов, 2003; Т.З. Байбиков, A.M. Рахманов, 2003; М.А. Сидоров с соавт., 2006; B.C. Русалеев, 2008).

Среди них наибольший удельный вес занимают желудочно-кишечные и респираторные заболевания молодняка свиней (П. Щербаков, 2002; М.В. Бабкин с соавт., 2008; А.Г. Шахов, 2008).

В их этиологии принимают участие вирусы, бактерии и другие возбудители (А.Г. Шахов с соавт., 1991, 2009; H.A. Ковалев, В.М. Болтак, 2000; Н.П. Зуев с соавт., 2008; М.В. Билокур, В.В. Палунина, 2002; Л.Ю. Сашнина, 2008).

Эпизоотической особенностью указанных болезней являются — бессимптомная персистенция возбудителей инфекций при относительной устойчивости у взрослых животных, широкое распространение, полиэтиологич-ность и, чаще всего, смешанное течение у молодняка (В.В. Макаров, 2005).

Возникновению заболеваний у поросят способствует большая концентрация животных на ограниченных площадях на промышленных комплексах и в крупных специализированных хозяйствах с законченным циклом воспроизводства, где на их организм постоянно воздействует большое количество разнообразных стресс-факторов, обусловливающих снижение естественной резистентности и проявление вторичных иммунодефицитов (А.И. Ерошов, 2004; Г.Л. Асоян с соавт., 2006; П.А. Красочко с соавт., 2007; Л.Ю. Топурия, r.Mi Топурия, 2008). Большая плотность размещения поголовья разного возраста и с разным иммунным статусом влияет не только на физикохимиче-ский, но и на микробный состав среды обитания^ что в свою очередь способствует появлению новых заболеваний сельскохозяйственных животных (П.А. Ануфриев, 2006).

На фоне спорадических случаев, небольших вспышек или эпизоотий отдельных классических инфекций основной причиной высокой заболеваемости и падежа молодняка являются факторные инфекции, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами (А.Г. Шахов, 2005; А.П. Пономарев, В.А. Мищенко, 2005).

Для профилактики и/или лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций животных предлагаются специфические сыворотки (Т.Р. Гайнутдинов, М.В. Харитонов, 2007), вакцины (A.M. Рахманов, H.A. Яременко, 2002, 2003; И. Волков, 2004; Б.Г. Орлянкин с соавт., 2005), имму-номодуляторы и иммуностимуляторы (С.И. Лютинский с соавт., 1991; Ч. Авылов, 2001; A.B. Деева с соавт., 2004; А.Г. Шахов с соавт., 2006), антибиотики (Е.В. Кузьминова, H.A. Трошина 2008), неантибиотические препараты (В. Энговатов с соавт., 2008; Л.Ю. Сашнина с соавт., 2009), физические средства и методы (Ю.Г. Юшков с соавт., 2003) и др.

Одно из ведущих мест в комплексе мероприятий по борьбе с инфекционной патологией свиней занимает антимикробная терапия (A.B. Голиков с соавт., 2001; В.Ю. Коптев с соавт., 2002).

Однако в результате бессистемного применения химиопрепаратов для терапии и профилактики заболеваний инфекционной этиологии в последние десятилетия все большую опасность стали приобретать антибиотикорези-стентные штаммы микроорганизмов (М. Roselli et al., 2005). При этом наиболее часто устойчивые микроорганизмы выделяются при респираторных заболеваниях (Z. Pejsak et al., 2005).

В связи с этим особенно остро стоит вопрос о создании антимикробных препаратов, сдерживающих формирование устойчивости у патогенных и условно-патогенных бактерий, участвующих в возникновении респираторных и желудочно-кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных (Т.А. Панина, C.B. Шабунин, 2007; A.B. Гавриков, В.В. Воронкова, 2010; C.B. Шабунин с соавт., 2010).

Для предупреждения развития и борьбы с уже сформировавшейся ан-тибиотикорезистентностью штаммов микроорганизмов предложены различные пути: одновременное использование двух и более антибиотиков (Т.Е. Толяронок, 2006; О.И. Гулий с соавт., 2007); оптимизация применения уже имеющихся на вооружении препаратов (A. Bottner et al., 2000; E.B. Воробей-чиков с соавт., 2006; C.B. Шабунин, 2008); поиск препаратов, отличающихся от антибиотиков по механизму действия (H.A. Шкиль с соавт., 2006).

Однако поиск, разработка и внедрение новых химиопрепаратов связаны со значительными затратами средств и времени (Е.В. Воробейчиков с соавт., 2006).

Поэтому в химиотерапии бактериальных инфекций важное место отводится комбинированным препаратам, содержащим в своем составе компоненты, обладающие разным механизмом действия на микробную клетку. Их создание научно обосновано, так как более выраженный клинический эффект у этих лекарственных средств, по сравнению с однокомпонентными антибиотиками, обусловлен более выгодными токсикометрическими характеристиками (A.B. Гуник с соавт., 2002; H.A. Лагуткин, 2006).

С применением комбинированных препаратов связывают решение основных проблем этиотропной терапии респираторных инфекций, так как они обладают более широким спектром антимикробной активности, чем одно-компонентные, что весьма важно при смешанном течении инфекции или при неустановленном патогене (Л. Гоби, 2009).

Взаимоусиливающее действие компонентов комбинированных препаратов и достижение терапевтического эффекта меньшими, чем обычно, курсовыми дозами имеет немаловажное значение при использовании антибиотиков, вызывающих побочное действие (например, нефротоксическое у поли-миксинов) (М.И. Рабинович, 1991).

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являет о ся разработка и внедрение нового антимикробного препарата тилоколин для1 I этиотропной терапии поросят при респираторных болезнях бактериальной этиологии.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить антимикробную активность тилоколина in vitro в отношении потенциальных бактериальных возбудителей респираторных болезней поросят;

2. Изучить антимикробную активность тилоколина in vivo на моделях инфекций белых мышей, вызванных Salmonella cholerae suis, Pasteurella mul-tocida и Staphylococcus aureus;

3. Изучить влияние тилоколина на ультраструктуру Pasteurella multo-cida и Staphylococcus aureus;

4. Изучить формирование устойчивости Escherichia coli, Salmonella cholerae suis, Pasteurella multocida и Staphylococcus aureus к тилоколину и сроки восстановления их чувствительности к препарату;

5. Изучить лечебную эффективность тилоколина при респираторных болезнях поросят бактериальной этиологии;

6. Определить экономическую эффективность применения тилоколина при респираторной патологии поросят бактериальной этиологии.

Исследования проведены в 2007 - 2010 годы в соответствии с планом НИР ВНИВИПФиТ по заданию 08.04.01. «Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных» (№ гос. регистрации 15070. 3666026906. 06.8.001.2).

Научная новизна. Впервые изучены in vitro и in vivo на моделях экспериментальных инфекций белых мышей антимикробная активность тилоко-лина, влияние его на ультраструктуру потенциально патогенных возбудителей респираторных болезней свиней, формирование устойчивости микроорганизмов к препарату и восстановление их чувствительности к нему, лечебная и экономическая эффективность тилоколина при пневмониях поросят в крупных специализированных хозяйствах.

Практическая значимость и внедрение. Для терапии больных животных разработан новый высокоэффективный комплексный препарат тило-колин с широким спектром антимикробного действия, технология его промышленного производства и контроля качества, которые в соответствии с широкими производственными испытаниями вошли в нормативно-техническую документацию на препарат (Инструкция по применению тилоколина и технические условия по изготовлению и контролю опытной партии тилоколина за номером ТУ 9337-028-004882909-09), согласованные с Главным государственным ветеринарным инспектором по Воронежской области.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 5 статьях, в том числе одна — в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного производства» 20-22 января 2010 года, г. Курск, ч. 2; Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ГНУ ВНИВИПФиТ «Актуальные проблемы болезней обмена веществ у сельскохозяйственных животных в современных условиях» 30 сентября — 2 октября 2010 года, г. Воронеж.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Антимикробная активность тилоколина in vitro и in vivo на моделях экспериментальных инфекций белых мышей;

2. Влияние препарата на ультраструктуру золотистого стафилококка и пастерелл;

3. Формирование резистентности у микроорганизмов к тилоколину и восстановление их чувствительности к препарату;

4. Лечебная и экономическая эффективность тилоколина при респираторных болезнях поросят бактериальной этиологии.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Сычев, Сергей Владимирович

5. ВЫВОДЫ

1 . Новый комплексный антибактериальный препарат тилоколин, действующими веществами которого являются колистин и тилозин в соотношении 1:1, обладает широким спектром антимикробной активности. Минимальная бактериостатическая концентрация тилоколина в отношении эшери-хий составила 0,19-3,12 мкг/мл, сальмонелл - 0,39-3,12, пастерелл - 0,390,78, стафилококков — 0,78, стрептококков - 1,56-3,12 мкг/мл. Минимальная бактерицидная концентрация во всех случаях в 2 раза превышала минимальную бактериостатическую концентрацию.

2 . Использование комбинации колистина и тилозина в препарате дает s выраженный синергидный эффект, проявляющийся снижением минимальной бактериостатической концентрации тилоколина в отношении эшерихий и S. cholerae suis по сравнению с таковой колистина в 8 и тилозина в 16 раз и Pas-teurella multocida- в 16 и 8 раз соответственно. Минимальная ингибирующая концентрация препарата в отношении Salmonella dublin по сравнению с МБсК колистина не изменилась, а по сравнению с таковой тилозина снизилась в 8 раз и Staphylococcus aureus — по сравнению с минимальной бактериостатической концентрацией колистина снизилась в 32 раза, по сравнению с таковой тилозина - не изменилась.

3. Тилоколин обладает выраженной профилактической и терапевтической эффективностью при экспериментальных инфекциях белых мышей, вызванных Staphylococcus aureus, Salmonella cholerae suis и Pasteurella multocida. Индекс защиты при профилактике стафилококковой и сальмонеллезной инфекций белых мышей составил 62,5%, пастереллезной - 50,0%; при лечении - 87,5, 75,0 и 62,5% соответственно.

4. При культивировании сальмонелл, эшерихий, стафилококков и пастерелл на средах, содержащих суббактериостатические концентрации тилоколина, у микроорганизмов формируется резистентность к препарату, индекс которой через 30 пассажей составил у Pasteurella multocida и Staphylococcus aureus - 8, Escherichia coli и Salmonella cholerae suis - 64.

5. Приобретенная микроорганизмами устойчивость к тилоколину является не постоянной и при пассировании на средах, не содержащих препарат, их чувствительность к нему восстанавливается: у Pasteurella multocida через 20 пассажей, Staphylococcus aureus - после 60, Salmonella cholerae suis — 70 и Escherichia coli — через 80 пассажей.

6. Выявленные изменения в ультраструктуре бактерий под действием тилоколина обусловлены синергидным эффектом составляющих его компонентов: колистина и тилозина. ба. Воздействие минимальной бактерицидной концентрации тилоколина на клетки золотистого стафилококка проявляется значительным утолщением клеточной стенки, нарушением ее трехслойной структуры, недостаточной дифференциацией внутреннего электронно-плотного слоя, нарушением целостности цитоплазматической мембраны, потерей цитоплазмой гомогенности и обнаружением в ней электронно-прозрачных участков различных размеров, в отдельных случаях содержащих неоднородные осмиофильные включения, слабой дифференциацией рибосомальных гранул и ядерного материала, нарушением процесса деления.

При воздействии четырехкратной бактерицидной концентрации препарата отмечали более выраженные изменения, проявляющиеся увеличением клеток в размере, значительным утолщением клеточной стенки, имеющей меньшую электронную плотность, сохранением ее трехслойной структуры лишь в отдельных участках клеток, нарушением целостности цитоплазматической мембраны практически на всем ее протяжении, наличием в цитоплазме участков различной электронной плотности, отсутствием дифференциации рибосомальных гранул и нуклеоида, появлением полностью лизирован-ных клеток, нарушением процесса размножения. бб. Воздействие минимальной бактерицидной концентрации тилоколина на пастереллы проявляется потерей клеточной стенкой трехслойной структуры, фрагментированием цитоплазматической мембраны, наличием в цитоплазме участков лизиса, слабой дифференциацией рибосомального и ядерного материала.

Более выраженные изменения в клетках под воздействием четырехкратной бактерицидной концентрации препарата характеризуются истончением клеточной стенки или ее отсутствием в отдельных местах, наличием цитоплазматической мембраны лишь в некоторых участках клетки, нарушением гомогенности цитоплазмы, переходом осмиофильных участков в зоны лизиса, расположенные в центральной части, отсутствием дифференциации генетического и рибосомального аппаратов, наличием погибших клеток с практически полным лизисом цитоплазмы и ядерного материала.

7. Применение тилоколина внутримышечно в дозе 0,075 мл/кг массы тела 1 раз в сутки в течение 7-10 дней при бактериальных и осложненных бактериями вирусных респираторных заболеваниях поросят обеспечивает клиническое выздоровление в 83,3-91,7% случаев, проявляющееся нормализацией клеточного состава крови, белкового обмена, переходом процессов перекисного окисления липидов на оптимальный уровень, уменьшением явлений эндогенной интоксикации, повышением общей неспецифической резистентности организма.

8. Применение тилоколина при терапии поросят с респираторной патологией является экономически выгодным. Эффективность лечебных мероприятий составляет 16,7 рубля на один рубль затрат.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для лечения больных пневмонией бактериальной этиологии поросят рекомендуется применять тилоколин внутримышечно в дозе 0,075 мл/кг массы тела один раз в сутки в течение 7-10 дней.

Заключение

Приведенный обзор литературы показывает, что респираторные болезни свиней являются одними из наиболее распространенных патологий. В их этиологии принимают участие различные вирусы и бактерии как в отдельности, так и чаще всего в различных ассоциациях. Большую роль в возникновении этих болезней играют предрасполагающие факторы, снижающие естественную резистентность организма животных.

Для профилактики болезней органов дыхания и терапии больных животных разработаны различные средства и методы, среди которых ведущее место занимают химиопрепараты. Однако эффективность последних снижается из-за формирования устойчивости микроорганизмов к антибактериальч ным препаратам.

Перспективным направлением, позволяющим ограничить появление устойчивых бактерий, является разработка и применение комплексных антимикробных препаратов, включающих в свой состав компоненты с различными механизмами действия.

Учитывая изложенное, в нашей работе была поставлена цель разработать и внедрить новый комплексный препарат тилоколин для этиотропной терапии поросят при болезнях органов дыхания бактериальной этиологии.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ