Получение анатоксинов Actinobacillus pleuropneumoniae и изучение их свойств

Лебедев, Никита Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Получение анатоксинов Actinobacillus pleuropneumoniae и изучение их свойств
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Получение анатоксинов Actinobacillus pleuropneumoniae и изучение их свойств"

На правах рукописи

Лебедев Никита Викторович

ПОЛУЧЕНИЕ АНАТОКСИНОВ АСТШОВАСІНиБ PLEUROPNEUMONIAE И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ

06.02.02. - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

г 8 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

Владимир -2013

005539729

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Научный руководитель -

доктор ветеринарных наук, профессор Русалеев Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты: Диев Вячеслав Иванович -

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир;

Кушнир Анатолий Тимофеевич -

доктор ветеринарных наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук» (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии), ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной микробиологии, г.Покров.

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИТИБП), г.Щелково.

Защита диссертации состоится «17» декабря 2013 г. в «12°°» часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец. Тел: (4922)529962

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Автореферат разослан «15» ноября 2013 г., размещен на официальном сайте ФГБУ «ВНИИЗЖ» www.arriali.ru и на официальном сайте ВАК Российской Федерации www.vak2.ed.gov.ru.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ»,

кандидат биологических наук

Т.В. Жбанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.Актуалыюсть темы исследования

Актинобациллезная плевропневмония - инфекционное контагиозное заболевание свиней, характеризующееся септикотоксемией, геморрагической и гнойно-некротизирующей пневмонией, а также серозно-фибринозным плевритом, перикардитом и артритами.

Возбудителем болезни являются бактерии семейства Ра$1еиге1[асеае, рода АсИпоЬасШш, вида АсИпоЬасШиз р1еигорпеитотае. Это мелкие грамотрицательные, неподвижные коккобактерии и палочки. Спор не образуют: вирулентные штаммы имеют капсулу; обладают выраженным тропизмом к легочной ткани. Штаммы А. р1еигорпеитотае разделяют на 15 серовариантов по капсулыюму антигену. Эти бактерии продуцируют четыре типа экзотоксинов -Арх1, Арх11, АрхШ, Арх1У. Некоторые исследователи склонны полагать, что экзотоксины играют доминирующую роль в патогенности бактерий А. ркигорпеитотае. Токсины возбудителя губительно действуют на альвеолярные макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты свиней, а также вызывают коагуляционный некроз тканей.

Актинобациллезная плевропневмония свиней была впервые зарегистрирована в свиноводческих хозяйствах Великобритании, США, Швейцарии и Аргентины в 1957-1964 гг., а возбудитель болезни был выделен в 1963. В последующие десятилетия это заболевание было установлено в большинстве стран мира с развитым свиноводством.

Экономический ущерб от этой инфекции складывается из затрат от падежа и вынужденного убоя, снижения продуктивности животных, качества получаемой продукции, затрат, связанных с проведением профилактических и оздоровительных мероприятий. Ежегодно страны Евросоюза тратят один миллиард евро на проведение лечебно-профилактических мероприятий в борьбе с данным заболеванием.

В настоящее время актинобациллезная плевропневмония свиней широко распространена в Канаде, США, Франции, Великобритании, Италии, Дании, Финляндии, Голландии, Японии, Греции, Австралии, а также в странах Южной Африки.

Согласно последним данным, на территории Российской Федерации циркулирует около 8 серовариантов А. pleuropneumoniae, но в связи с все большей глобализацией торгово-экономических отношений, вступлением нашего государства во Всемирную торговую организацию (ВТО), ростом миграции, увеличением импортно-экспортных торговых операций повышается вероятность появления других серовариантов возбудителя этого заболевания (Тимина, 2010). Из этого возникает проблема, решение которой напрямую зависит от наличия у животноводов эффективных средств специфической профилактики. Все известные в мире противоактинобациллезные вакцины подразделяют на корпускулярные и субъединичные (токсоидные). Наиболее распространенными являются корпускулярные вакцины. В состав таких вакцин включают штаммы серотипов, преимущественно доминирующих в конкретном географическом регионе, а создание вакцины, содержащей в своем составе антигены всех 15 серовариантов, достаточно проблематично, и скорее всего такая вакцина будет обладать низкой иммуногенностью.

Исходя из вышеизложенного, наиболее перспективными являются бактерин-токсоидные и субъединичные вакцины. Разработка фирмой Intervet вакцины «PORCILIS АРР» свидетельствует о возможности создания высокоэффективного препарата, имеющего в своем составе инактивированные формальдегидом экзотоксины (Apxl, ApxII, АрхШ) и очищенные белки внешней мембраны, который защищает животных против 14 серовариантов А pleuropneumoniae.

Таким образом, проведение работ по получению анатоксинов A.pleuropneumoniae и изучению их биологических свойств является актуальной задачей, имеющей важное научное и практическое значение для ветеринарии.

1.2. Степень разработанности

Несмотря на то, что актинобациллезная плевропневмония свиней не относится к особо опасным или трансграничным инфекционным заболеваниям животных, а считается лишь факторной инфекцией, ей посвящено большое число научных исследований. Существенный вклад в изучение проблемы актинобациллезной плевропневмонии свиней внесли зарубежные ученые (R.R.Shope, 1964; Т. Nakai, 1983; J. Frey, 1990; R. Nielsen, 2000). Их работы содержат фундаментальные основы эпизоотологии данного заболевания. В

последние годы данной тематике уделял внимание .Ш. ПиЬгсиП, 2000. В Российской Федерации изучением актинобациллезной плевропневмонии, занимались М.А. Сидоров, Д.А. Скородумов, 1986, а также научные сотрудники лаборатории профилактики болезней свиней и рогатого скота ФГБУ «ВНИИЗЖ».

1.3. Цели и задачи исследования

Целью данных исследований было получение анатоксинов А.р1еигорпеитотае и изучение их основных биологических свойств.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить биологические свойства имеющихся штаммов А.р1еигорпеитотае и отобрать гиперпродуценты экзотоксинов;

- разработать метод получения экзотоксинов А.р1еигорпеитотае;

- изучить биологические свойства экзотоксинов А.р1еигорпеитоп1ае;

- разработать схему получения анатоксина;

- изучить иммунобиологические свойства анатоксина А.р1еигорпеитотае на лабораторных и естественно-восприимчивых животных.

1.4. Научная новизна

Научная новизна работы состоит в том, что в результате проведенных исследований:

- отработан метод получения и концентрирования экзотоксинов А.р1еигорпеитотае~,

- изучены биологические свойства экзотоксинов А.р1еигорпеитотае;

- разработана схема получения анатоксина;

- изучены иммунобиологические свойства анатоксина А.р1еигорпеитот'ае:

разработан метод оценки иммуногенности полученного экспериментального образца анатоксина.

1.5. Теоретическая и практическая значимость

На основании экспериментальных данных разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» «Методические указания по определению антигенной активности анатоксин-вакцины против актинобациллезной плевропневмонии свиней».

1.6. Методология и методы исследования

Методологической и теоретической основой диссертационной работы послужили труды зарубежных и отечественных исследователей в областях эпизоотологии и профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней, токсикологии и вакцинологии.

1.7. Положения, выносимые на защиту

- динамика накопления экзотоксинов А.р1еигорпеитотае\

- биологические свойства экзотоксинов А.р1еигорпеитотае\

- условия хранения и способ консервации экзотоксинов А.р!еигорпеитоп1аеш,

технология получения и концентрирования экзотоксинов А.р1епгорпеитотае',

- схема получения актинобациллезного анатоксина;

- иммунобиологические свойства анатоксина А.р1еигорпеитотае в опытах на лабораторных животных и свиньях.

1.8. Степень достоверности к апробация результатов

Материалы диссертации были доложены на заседаниях ученого совета ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2010-2013 гг., а также доложены и опубликованы в материалах конференции «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику», посвященной 30-летию создания СМУ ФГУ «ВНИИЗЖ».

1.9. Публикации

По результатам исследований, выполненных по теме диссертации, опубликовано 4 научных работы, в том числе 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.10. Структура диссертации

Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста по общепринятой схеме и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, включающий 203 источника, в том числе 54 отечественных. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 19 рисунками и дополнена приложением.

1.11. Личный вклад автора в выполнение работы

Основной объём исследований проведен автором самостоятельно. Отдельные этапы работы выполнены совместно с к.в.н. Потехиным A.B., к.в.н. Фроловцевой A.A. и к.б.н. Бьядовской О.П., за что автор выражает им искреннюю благодарность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

Штаммы и изоляты микроорганизмов: в экспериментальной работе использовали референтные штаммы бактерий A.pleuropneumoniae и St.aureus полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС): A.pleuropneumoniae серовар 1 № 27088, A. pleuropneumoniae серовар 2 № 27089, A.pleuropneumoniae серовар 3 № 27090, A. pleuropneumoniae серовар 5 № 33377, А. pleuropneumoniae серовар 6 № 33590, St.aureus № 25923; штамм P. multocida № 1231 из коллекции ФГБУ «ВГНКИ»; изоляты бактерий A.pleuropneumoniae «Ильиногорский» (8 серотип), «Троицкое» (9 серотип), M.haemolytica и A.minor, выделенные из патологического материала от свиней и крупного рогатого скота в лаборатории профилактики болезней свиней и рогатого скота ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Для инактивации бактерий и экзотоксина использовали формалин технический с содержанием формальдегида не менее 36% производства «Метафракс».

Питательные среды: для культивирования бактерий использовали следующие питательные среды: бульон на основе мясного гидролизата по Хоттингеру (с содержанием 250-300 мг % аминного азота) (ХБ), агар на основе мясного гидролизата по Хоттингеру с добавлением 10% дефибринированной крови барана (КА), агар на основе мясного гидролизата по Хоттингеру с добавлением 10% эритроцитов крови лошади (ХКЭ).

При выращивании бактерий A. pleuropneumoniae в питательные среды вносили ростовые факторы: в качестве V-фактора роста использовали НАД х/ч (добавляли 1% приготовленного 0,1%-го раствора) фирмы "AppliChem", или 10% дрожжевого экстракта (ДЭ); в качестве Х-фактора роста использовали гемин х/ч

(Г) (добавляли 1% приготовленного 0,1%-го раствора) фирмы "Serva" или 10% эритроцитов крови лошади (КЭ).

Подопытные животные: в экспериментальной работе использовали белых мышей массой 16-18 г для определения безвредности анатоксина. Кроликов, массой 2,5-3,0 кг для получения антитоксинов Actinobacillus pleuropneumoniae. Поросят массой 10-12 кг для изучения безвредности, реактогенности, антигенных и иммуногенных свойств образцов анатоксинов.

Адъюванты: для изготовления экспериментального образца анатоксина использовали адъювант фирмы SEPPIC, Франция: Montanid ISA-70 VG.

2.1.. Методы

2.2.1. Культивирование бактерий

При выращивании бактерий в жидких и полужидких питательных средах отмечали интенсивность роста и характер помутнения среды.

2.2.2. Световая микроскопия

Световую микроскопию бактерий проводили под микроскопом МБИ-15 «Биолам» при увеличении 700 раз в мазках культур, фиксированных на предметном стекле над пламенем горелки и окрашенных по Граму. Наличие капсулы у бактерий определяли по методу Бурри-Гинса.

2.2.3. Определение числа живых микроорганизмов

Количество клеток в 1 см3 исходной бактериальной суспензии вычисляли по формуле: М = а х 107V, где:

М - количество клеток в 1 см3; а - среднее число колоний при высеве разведения; V - объём суспензии, взятой для посева, в см3; 10" - коэффициент разведения.

2.2.4. Биохимические свойства

Биохимические свойства А. pleuropneumoniae определяли с использованием культур не старше 18-20 ч, выросших на плотной питательной среде, средах Гиса, и с применением системы индикаторной бумажной (СИБ) для идентификации микроорганизмов.

2.2.5. Электрофорез в полиакрнламидном геле

Молекулярную массу белка (экзотоксинов) определяли по его электрофоретической подвижности в 12% полиакрнламидном геле. Для

визуализации результата электрофореза гель окрашивали красителем Кумаси. Молекулярную массу белка определяли, сравнивая его расположение в геле с расположением полос стандартного белкового маркера.

2.2.6. КАМП-тест

Для постановки КАМП-теста золотистый стафилококк высевали на поверхность плотной питательной среды ровным диаметральным штрихом, а штаммы A. pleuropneumoniae перпендикулярно на расстоянии 5 мм. Инкубировали посевы культур в условии термостата в течение 18-20 часов при температуре 37°С. Результаты реакции учитывали визуально, реакцию считали положительной, если около штриха St. aureus наблюдалось значительное просветление плотной питательной среды, то есть КАМП — эффект.

2.2.7. Получение токсинов A. pleuropneumoniae

С целью получения токсинов бактерии выращивали в жидкой питательной среде на основе триптического гидролизата мяса по Хоттингеру с добавлением 10% дрожжевого экстракта и различных концентраций СаС12 в конических колбах в аппарате УВМТ-12-250 и лабораторных биореакторах АК-210, BioFlo-110 и BioTron LiFlus GX. Для освобождения от бактериальных клеток пробы бульонных культур центрифугировали при 8000 g в течение 20 мин при температуре 4-6°С. Дополнительно проводили стерилизующую фильтрацию супернатанта через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Осаждение экзотоксинов из культурального фильтрата (КФ) проводили с помощью сульфата аммония.

2.2.8. Приготовление эритроцитов

Кровь у барана брали из яремной вены в стерильный флакон со стеклянными бусами и встряхивали в течение 10-15 мин для предотвращения свертывания. Дефибринированную кровь фильтровали через двойной слой марли и центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин. Полученные в осадке эритроциты 3 раза отмывали барбиталовым буферным раствором с рН 7,2, содержащим желатин (0,032% желатина в растворе 3,9 шМ барбитала натрия, 1,0 mM MgS04. 0,38 mM СаС12, 145,6 mM NaCl). Осадок эритроцитов ресуспендировали в стократном объеме буферного раствора. Полученная 1%-я суспензия эритроцитов соответствовала концентрации 7х 107 клеток/см3.

2.2.9. Определение гемолитической активности штаммов А. р1еигорпеитоп'ше

Гемолитическую активность штаммов А. р1еигорпеитотае оценивали по гемолитической активности культуральных фильтратов и концентратов, используя два способа:

на агаровых средах с добавлением 5% дефибринированной крови барана и/или кролика делали лунки, в которые вносили аликвоты КФ и инкубировали при 37°С в течение 18 часов, после чего учитывали диаметр зоны Р-гемолиза;

в суспензии 1%-й взвеси отмытых эритроцитов. Для определения 100%-ного гемолиза - к 1,0 мл 1%-й взвеси эритроцитов добавляли 3 мл дистиллированной воды. Пробирки инкубировали при температуре 37°С в течение 45 мин, охлаждали в холодильнике при 4°С в течение 10 мин, центрифугировали при 1500 об/мин и колориметрировали на ФЭК в кюветах (10мм) с зеленым светофильтром против воды. Оптическая плотность лизата при длине волны 541 мкм составляла 1,08.

Расчет количества гемолитических единиц (ГЕ) токсинсодержащего супернатанта бактериальной культуры в 1 мл проводили следующим образом. После титрования исследуемые пробы инкубировали в течение 45 мин при температуре 37°С и далее выдерживали в течение 10 мин в холодильнике при 4°С. Затем пробы центрифугировали и сравнивали с контрольной пробиркой, соответствующей 100% гемолизу или 1 ГЕ.

2.2.10. Реакция гемолиза и реакция нейтрализации гемолизина

Для постановки реакции гемолиза в полистироловых планшетах готовили последовательные двукратные разведения супернатанта, начиная с 1:2 до 1:256 на барбиталовом буферном растворе в объеме 500 мкл. После этого в каждую лунку вносили по 50 мкл суспензии эритроцитов. Инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С и далее в течение ночи при комнатной температуре. Под действием токсина мутная взвесь эритроцитов превращалась в прозрачную ярко-красную жидкость. Степень реакции гемолиза оценивали визуально по четырехбальной системе.

Реакцию нейтрализации гемолизина ставили также в полистироловых планшетах. Для этого готовили последовательные двукратные разведения супернатанта, начиная с 1:2 до 1:256 на барбиталовом буферном растворе в объеме

400 мкл. После этого в каждую лунку вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки кроликов, предварительно инактивированной при температуре 56°С в течение 30 мин. Остальные этапы постановки реакции и учет результатов были как для реакции гемолиза. Индекс нейтрализации гемолизина определяли как разницу титров гемолитической активности токсина (log2), полученных в реакции с использованием нормальной и иммунной сывороток крови кроликов.

2.2.11. Получение первичной культуры альвеолярных макрофагов свиньи

Для получения первичной культуры AMC использовали клинически здоровых поросят 4-10-неделыюго возраста из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням свиней. Животных обескровливали, не допуская попадания крови в трахею, затем отпрепарировали легкие и помещали их в стерильный сосуд с фосфатно-буферным раствором с pH 7,2 (121 шМ NaCl, 10 шМ Na2HP04, 3,2 шМ К2НР04), содержащим гентамицин в количестве 0,8 мг/см3. Альвеолярные макрофаги получали путем вымывания их из легких средой Игла с добавлением рабочей концентрации антибиотиков (25 мкг/см3 канамицина, 0,0025 мг/см3 амфотерицина-В, нистатина 0,04 мг/см3 ).

2.2.12. Определение титра цитотоксина

Разведение фильтратов бульонных культур A. pleuropneitmoniae готовили на среде Игла с глютамином (Sigma) без сыворотки и антибиотиков. Каждую дозу токсина испытывали на четырех матрасах с ровным монослоем AMC. Для характеристики зависимости между эффектом и дозой токсина использовали величину ЦТД50 - дозу токсина (мл), вызывающую гибель 50% клеток в монослое через 1, 3 и 6 часов культивирования. Цитотоксический эффект (ЦТЭ) оценивали по проценту погибших клеток в монослое.

2.2.13. Получение нормальной и специфической сывороток крови лабораторных животных

Для получения сывороток крови использовали кроликов массой 2,5 - 3,0 кг, не имеющих специфических антител к микроорганизмам ActinobaciUus pleur (¡pneumoniae.

2.2.14. Определение антигенной и иммуногенной активности экспериментального образца анатоксина против акгинобациллезной плевропневмонии свиней

Антигенные и иммуногенные свойства анатоксина определяли на свиньях путем оценки уровня антитоксических антител и контрольного заражения животных с оценкой результатов по Ханнану.

Для оценки иммунобиологических свойств анатоксина вводили различные дозы препарата поросятам внутримышечно в области верхней трети шеи однократно, а кроликам - в области бедра, также однократно. До инъекции препарата, а также спустя 7, 14 и 21 сутки после иммунизации у всех животных брали кровь для определения в сыворотке уровня антител к токсинам Apxl и ApxII в непрямом варианте ИФА (тест-система ФГБУ «ВНИИЗЖ») и в ИФА (CIVTEST suis Арр, Hipra).

На 22 сутки всех свиней заражали интраназально минимальными смертельными дозами возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней. Наблюдение за животными вели в течение 10 суток.

2.2.15. Статистика

Использовались стандартные приемы обработки выборок варьирующих переменных. При этом определяли средние квадратичные отклонения (о) и стандартные ошибки средних (т). Сущность различий средних оценок определяли, используя вероятные коэффициенты Стьюдента с заданным уровнем значимости (Р)-

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.1. Определение гемолитической активности различных серотипов A.pleuropneumoniae

Одним из условий удачного проведения экспериментальной работы является получение максимально большого количества гемолизина Apxl. Для выполнения данной задачи было принято решение выявить у имеющихся в распоряжении штаммов и изолятов A.pleuropneumoniae гиперпродуцентов токсина Apxl с помощью реакции гемолиза в лунках полистироловых планшетов. Для этого были использованы 20 часовые агаровые культуры A.pleuropneumoniae штаммов АТСС:

27088 (1 серотип), 27089 (2 серотип), 27090 (3 серотип), 33377 (5 серотип), 335590 (6 серотип) и изолятов «Ильиногорский» (8 серотип) и «Троицкое» (9 серотип).

В результате проведенного эксперимента было установлено, что наибольшую гемолитическую активность проявляли штаммы А. р1еигорпеитотае 1, 5 и 9-го серотипов, являющиеся продуцентами гемолизина Арх1.

3.1.2. Изучение динамики накопления гемолизина в процессе культивирования штамма АТСС 27088 А. р1еигорпеитотае первого серотипа

Основным принципом наработки бактериального экзотоксина является получение возможно большего количества возбудителя за короткий промежуток времени. С этой точки зрения наиболее оптимальным и удобным в технологическом плане является периодический способ глубинного культивирования.

Максимальную концентрацию живых микробных клеток наблюдали через 4 часа культивирования, она соответствовала 7,0><109 КОЕ/мл (9,84±0,07 ^ КОЕ/мл). Через 8 часов выращивания количество бактерий снизилось до 5,62x109 КОЕ/мл (9,75±0,07 Ы КОЕ/мл).

Максимальный титр гемолизина 5,0 1о§2 в суспензии наблюдали через четыре часа культивирования. При выходе культуры в стационарную фазу наблюдали снижение гемолитической активности. Через 8 часов выращивания бактерий титр гемолизина в суспензии составлял 1,5

Для изучения профиля молекулярной массы белка в полученных образцах экзотоксина проводили электрофорез в полиакриламидном геле, результаты представлены на рисунке 1.

' V "Ь'. 1

1ТО «д. . .

1зо¡¿..¿--."'^'^ :, ■■■".;■-.1 : 86 «Я» ' * ■ *'- : ' V '

Рис. 1. 'Электрофореграмма белка из супернатанта бульонной культуры штамма ЛТСС 27088 А. р1еигорпеитотае\ а - стандарты молекулярных масс белка, Ь - белок из супернатанта бульонной культуры

Таким образом, результаты лабораторных исследований свидетельствуют о том, что максимальная продукция гемолизина (Арх1) с молекулярной массой 105 кДа происходит во время экспоненциальной фазы роста бактерий. С переходом

культуры А. р!еигорпеитотае в стационарную фазу гемолитическая активность суспензии резко снижается.

3.1.3. Гемолитическая активность штаммов АТСС 27088 (1 серотип) и 27089 (2 серотип) А.р1еигорпеитотае с эритроцитами барана и кролика

Определение гемолитической активности культуральных фильтратов (КФ) штаммов А.р1еигорпеитотае 1-го и 2-го серотипов проводили на агаровых средах с добавлением 5% дефибринированной крови барана и/или кролика. Гемолитическую активность штаммов оценивали путем определения зоны Р-гемолиза, с помощью измерения ее диаметра. Для этого в лунки вносили аликвоты КФ и инкубировали при 37°С в течение 18 часов.

Зоны гемолиза вокруг лунок с КФ штамма АТСС 27088 начинали формироваться уже через 1,5-2,0 часа инкубирования, тогда как с фильтратом штамма АТСС 27089 - только через 7,0-8,0 часов. При этом максимальный размер зоны гемолиза у КФ штамма 1-го серотипа достигал 20 мм, независимо от вида животных, эритроциты которых использовали в составе среды. Зоны гемолиза у КФ штамма 2-го серотипа были различны, так, размер зоны гемолиза на среде с эритроцитами барана не превышал 10 мм, а на среде с эритроцитами кролика достигал 15 мм.

Данное различие, по-видимому, связано с особенностями механизмов взаимодействия разных гемолизинов с мембранами эритроцитов барана и кролика. Так, задержка лизиса эритроцитов барана КФ штамма АТСС 27089 обусловлена действием "слабого" гемолизина Арх11, который почти не образует поры в мембранах эритроцитов барана, тем самым не вызывает их лизиса, и, напротив, более выраженно лизирует эритроциты кролика.

3.1.4. Влияние концентрации хлористого кальция на активность гемолизина А.р1еигорпеитотае

На данном этапе работы мы изучили влияние хлористого кальция в среде культивирования А. р1еигорпеитотае на активность продуцируемых токсинов. В стандартную среду культивирования добавляли различные концентрации хлористого кальция: 12,5; 25,0 и 50,0 ммоль. Культивирование штаммов 1, 2, 3, 5, 6 и 9 серотипов проводили в конических колбах в установке выращивания микроорганизмов УВМТ-12-250 в течение 4 часов при температуре 37°С и

перемешивании 200 об/мин. Количество гемолитических единиц в стандартном объеме культуральной среды определяли описанным выше Способом.

Результаты опытов показали, что концентрации 25 и 50 ммоль хлористого кальция повышали активность Арх1-токсина у штаммов 5 и 9 серотипов до 8,5, а у штамма 1 серотипа - до 10,5 ГЕ/мл. На основании полученных данных нами было сделано заключение, что гемолизин Арх1 является Са-зависимым.

3.1.5. Влияние физических и химических факторов на сохранение гемолитической активности гемолизинов А.р1еигорпеитотае 1 серотипа

Для определения оптимальных условий хранения экзотоксинов необходимо было выяснить его подверженность влиянию различных температур и сохранению гемолитических свойств при их воздействии.

Гемолитическую активность определяли в очищенном от бактериальной массы супернатанте бульонной культуры А. р1еигорпеитотае 1 серотипа до и после хранения при различных температурах: -70, -20, 4, 22, 37, 56 и 80 С°. Реакцию на определение гемолитической активности ставили в полистироловых планшетах с добавлением дефибринированной крови барана, с последующими двухкратными разведениями. Таблица 1.

Сохранение гемолитической активности сунсриатапта бактериальной культуры Аа'тоЬасМю р/еигорпеитоп1ае 1 серотипа при различных температурах хранения

п=3

Температура ("С) Период полураспада активности (*)

80 < 30 мии

56 90 мин

37 < 24 часов

22 3 дня

4 > 12 дней

-20 > 6 недель

-70 > 6 недель

^определяют как время, в течение которого активность снижается до 50% от исходной активности.

Полученные результаты (табл.1) показали, что гемолизины А. р1еигорпеитотае сохраняют свои гемолитические свойства при низких температурах хранения и в то же время довольно чувствительны к повышенным температурам. Из этого можно сделать вывод, что хранение образцов экзотоксинов возможно осуществлять в обычном бытовом холодильнике в течение короткого периода времени при +4°С и более длительно - в морозильной камере при -20°С и ниже.

Согласно данным зарубежных исследователей, после выхода культуры в стационарную фазу роста токсины Арх начинают разрушаться под действием ферментов, выделяемых бактериальной клеткой (Т. Nakai, 1983). Поэтому для сохранения максимального количества экзотоксинов необходимо инактивировать как сам токсин, так и бактериальные клетки. В своих работах иностранные исследователи рекомендуют использовать формалин в качестве инактиванта в конечной концентрации 0,12%, но поскольку в своих работах они использовали рекомбинантные токсины Арх, у них не было необходимости проводить инактивацию бактериальных клеток (P.Satran, 2003).

Поэтому нами была изучена выживаемость актинобацилл при воздействии различных концентраций формалина. Для инактивации использовались бульонные культуры штамма АТСС 27088, взятые в конце экспоненциальной - начале стационарной фазы роста. Формалин вносили из расчета конечной концентрации 0,025%, 0.05%, 0,1% и 0,2%. Инактивацию проводили при 37°С. Концентрацию живых микробных клеток определяли перед внесением инактиванта (Х0), а затем через каждые 60 мин (Xj).

На основании полученных результатов концентрация 0,2% формалина была определена как оптимальная для инактивации бактерий и экзотоксинов Actinobacillus pleuropneumoniae.

3.1.6. Определение наличия у бактерий A.pleuropneumoniae ко-гемолизина

Наличие ко-гемолизина или КАМП-фактора, является одним из биологических свойств бактерий А. pleuropneumoniae. КАМП-феномен впервые был описан как синергичный гемолиз эритроцитов барана, вызываемый ко-гемолизином стрептококков группы Б (Streptococcus agalactiae) в зоне распространения бета-токсина (сфингомиелазы) St. aureus (J. Frey, 1989).

В начале был проведен КАМП-тест с изолятами А. pleuropneumoniae. Для всех изолятов тест оказался положительным. Затем нами был поставлен сравнительный КАМП-тест двух схожих по своим морфологическим и биохимическим свойствам представителей рода Actinobacillus. Для представителя вида А. pleuropneumoniae тест оказался положительным, а для представителя вида A. minor - отрицательным.

Полученные результаты дали нам основание полагать, что продуцируемый A. pleuropneumoniae ко-гемолизин усиливает гемолитические свойства других токсинов. В то же время данный тест может использоваться для дифференциации A. pleuropneumoniae от другого постоянного обитателя воздухоносных путей свиньи - A. minor.

3,1.7. Выделение экзотоксинов сульфатом аммония

Выделение токсинов из фильтратов бульонных культур проводили путем добавления различных концентраций сульфата аммония.

Результаты опытов по определению оптимальной концентрации сульфата аммония, необходимой для выделения экзотоксинов из КФ A. pleuropneumoniae, на примере штамма АТСС 27088, представлены в табл. 2. Таблица 2

Влияние различных концентрации сульфата аммония на осаждение экзотоксинов щ КФ A. pleuropneumoniae штамма АТСС 27088

п=3

Концентрация сульфата аммония, % Гемолитическая активность концентрата, ГЕ/мл Гемолитическая активность КФ, ГЕ/мл

0 - 10

33 5 5

55 75 0

85 48 0

При анализе полученных результатов можно заключить, что оптимальной концентрацией сульфата аммония, необходимой для более полного осаждения экзотоксинов А. р1еигорпеитотае, на примере гемолизина (Арх1), является 55%.

3.1.8. Цитотоксическая активность штаммов АТСС 27088 (1 серотип) и 27089 (2 серотип) A.pleuropneumoniae

Цитотоксическую активность исследуемых штаммов А. pleuropneumoniae изучали на культуре клеток альвеолярных макрофагов свиньи методом световой микроскопии.

Результаты проведенных опытов, представленные в табл. 3 показывают, что наибольшей цитотоксической/литической активностью в отношении альвеолярных макрофагов свиньи обладал штамм 27088. Известно, что штаммы А. pleuropneumoniae, относящиеся к первому серотипу, не продуцируют цитотоксин АрхШ, активный в отношении альвеолярных макрофагов свиньи. Несмотря на это, мы наблюдали полный лизис AMC через 6 часов после внесения исходного КФ

штамма 27088, по всей вероятности, обусловленный действием "сильного" гемолизина/цитолизина Арх1. Таблица 3

Цитотоксическая активность штаммов А. р1еигорпеитотае

п=3

Шуамм Титр цитотоксина в исходном КФ, 1о§21ЩЬ<>/мл Титр цитотоксина в концентрате КФ, 1о&ЦТД50/мл

27088 6,0±0,5 9,5±1,0

27089 3,5±0,5 6,0±0,5

3.1.9. Выделение экзотоксина методом двухступенчатой ультрафильтрации

Для проведения данного эксперимента бактерии культивировали в биореакторах АК-210, ВюР1о-110 и ВюТгоп 1лР1иБ ОХ в жидкой питательной среде. Процесс накопления гемолизина регистрировали путем ежечасного титрования культурального фильтрата с эритроцитами барана. Максимальное значение было получено на 5-м часу культивирования и соответствовало 1:64 или 6

Затем культуральную жидкость концентрировали методом двухступенчатой ультрафильтрации. В связи с этим были проведены эксперименты на установке микро- и ультрафильтрации «Сартокон-мини» с рабочей поверхностью мембранного модуля 0,1 м2.

Супернатант подвергали ультрафильтрации через полисульфоновый мембранный фильтр (ЗаЛопив) с НОММ 300 кДа. Затем полученный пермеат подвергали ультрафильтрации через полисульфоновый мембранный фильтр (ваЛопиз) с НОММ 50 кДа. В результате был получен двадцатикратный концентрат по объему с содержанием общего белка около 1,0 мг/мл. Стерилизацию концентрата экзотоксина проводили методом микрофильтрации с использованием мембран (ЗаЛопиз) с размером пор 0,22 мкм.

3.2.1. Схема получения актинобациллезного анатоксина

На следующем этапе исследований мы провели измерения общей концентрации белка и гемолитической активности трех образцов токсина, полученных различными способами.

Результаты, приведенные в табл. 4, свидетельствуют о том, что метод ультрафильтрации оказался самым продуктивным для выделения и концентрирования токсинов А. р1еигирпеитоп1ае. Несмотря на простоту традиционного метода получения экзотоксина с помощью сульфата аммония, он оказался очень трудоемким и малопродуктивным. Таблица 4

Характеристика методов получения гемолизнна А. р1еигорпеитомае

п=3

Токсин АрхІ Объем, мл Концентрация белка, мг/мл Активность токсина ГЕ/мл

Нативный 300 0,02 10

Осажденный сульфатом аммония 15 0,3 75

Ультрафильтрация 5 1,2 425

Проведенные исследования по отработке методических подходов мембранного концентрирования экзотоксина АрхІ из культуралыюй жидкости А. ріеигорпеитопіае и его ультрафильтрационного фракционирования позволили предложить примерную технологическую схему изготовления актинобациллезного анатоксина, включающую следующие этапы:

- глубинное культивирование А. ріеигорпеитопіае 1 и 2 серотипов;

- инактивацию бактериальных клеток и токсина путем добавления к суспензии формалина в конечной концентрации 0,2% при температуре 37°С в течение 24 часов (Т. Иакаі, 1983);

- проточное центрифугирование бактериальной суспензии при 15000

- очистка супернатанта проточной микрофильтрацией «кросс-флоу» с использованием микрофильтрационных модулей с мембранами 0,22 мкм;

- очистка супернатанта проточной ультрафильтрацией «кросс-флоу» с использованием ультрафильтрационных модулей с мембранами НОММ 300 кДа;

- концентрирование анатоксина проточной ультрафильтрацией «кросс-флоу» с использованием ультрафильтрационных модулей с мембранами НОММ 50 кДа;

стерилизующая фильтрация концентрата анатоксина проточной микрофильтрацией «кросс-флоу» с использованием микрофильтрационных модулей с мембранами 0,22 мкм.

3.3.1. Реакция диффузионной преципитации сывороток нммунизнрованных кроликов с экстрактами токсинов A pleuropneumoniae, St. aureus и Е. coli

Отработав схему получения анатоксинов, мы приступили к изучению их иммунобиологических свойств. В начале необходимо было определить их специфичность. Поскольку RTX-токсины, к которым относятся Арх-токсины, продуцируются многими микроорганизмами, оставались сомнения в специфичности, а также иммуногенности данных анатоксинов. Для определения специфичности была проведена реакция диффузионной преципитации сыворотки иммунизированного кролика с экстрактами токсинов А.pleuropneumoniae, St.aureus и E.coli. Кролики были иммунизированы полученным образцом анатоксина, а на 7-е сутки из ушной вены была отобрана кровь и приготовлена сыворотка. Реакция проводилась в агаровом слое полистироловой чашки. Через 48 часов между лунками с сывороткой крови и экстрактом токсина А.pleuropneumoniae появилась серо-белая полоса преципитации.

Реакция оказалась положительной только для экстракта токсина App. С экстрактами других представителей группы RTX - токсинов, сыворотка кролика иммунизированного образцом анатоксина А. pleuropneumoniae не была активна. Полученные данные свидетельствуют о специфичности реакции.

3.3.2. Получение экспериментального образца анатоксина Actinobacillus pleuropneumoniae в смеси с адъювантом

Анатоксин получали описанным ранее методом. Затем для усиления иммуногенных свойств анатоксин был смешан с масляным адъювантом Montanide ISA 70. Смешивание проводили интенсивным встряхиванием до получения однородной жидкости белого цвета.

Состав одной дозы препарата: 0,35 см3 — масляный адъювант Montanide ISA-70 и 0,15 см3 — смесь анатоксинов штаммов Actinobacillus pleuropneumoniae АТСС 27088 и 27089 - по 50 мкг каждого, итоговое количество антигена в дозе 100 мкг (A. Rossi-Campos, 1992). Затем было приготовлено три последовательных трехкратных разведения препарата в плацебо с конечными концентрациями антигена 33, 11 и 3,5 мкг. Стерильность экспериментального образца анатоксина в смеси с адъювантом контролировали в соответствии с ГФ XII, ч. 1, с. 150.

3.3.3. Определение безвредности и реактогенности полученного экспериментального образца анатоксина на лабораторных животных и свиньях

Вначале была проведена проверка опытных образцов ira безвредность для лабораторных животных. Безвредность препарата определяли на белых мышах, которым препарат вводили подкожно в области спины в объеме 0,5 см3 с концентрацией анатоксина 100 мкг. Наблюдение за животными вели в течение 10 суток. Все животные, участвовавшие в опыте, оставались живыми и клинически здоровыми в течение всего срока наблюдения.

Затем безвредность образцов анатоксина оценивали на поросятах 25-30-дневного возраста. Исследуемые препараты вводили внутримышечно в области шеи за ухом с правой стороны в объеме, превышающим прививной в 3 раза (1,5 см3). На протяжении всего срока наблюдения животные оставались живыми и клинически здоровыми. Через 2 мес. после иммунизации свиньи были подвергнуты убою с целью проведения патологоанатомического вскрытия. Никаких изменений на месте введения испытуемых препаратов обнаружено не было.

Реактогенность исследуемых образцов анатоксина изучали на поросятах путем двукратной инъекции прививной дозы препарата с интервалом между введениями 20 сут. Образцы анатоксина вводили внутримышечно в области шеи за ухом с правой стороны по 0,5 см3. Наблюдение за животными в течение 10 суток после введения второй дозы анатоксина не выявило каких-либо отклонений со стороны общего состояния организма животных.

Таким образом, проведенные исследования дали нам основания полагать, что полученный образец анатоксина против актинобациллезной плевропневмонии свиней, эмульгированный в масляном адъюванте Montanide ISA 70, безвреден для лабораторных животных и свиней, а также не реактогенен при введении поросятам прививного объема 0,5 см3.

3.3.4. Изучение антигенных и иммуногенных свойств экспериментального образца анатоксина на лабораторных животных и свиньях

Изучение иммунобиологических свойств и антигенной активности анатоксина против актинобациллезной плевропневмонии свиней предполагает

определение уровня специфических антител в сыворотках крови свиней и лабораторных животных (в частности, кроликов). Согласно работам зарубежных исследователей, наиболее оптимальным методом, который может быть использован для оценки уровня специфических антител в сыворотках крови, является непрямой вариант иммуноферментного анализа (Н-ИФА) (J. Klausen, 2007).

Поэтому необходимо было разработать простой и чувствительный вариант иммуноферментного анализа для определения антител к токсинам Apxl и ApxII в сыворотках крови свиней и кроликов.

В начале работы был получен диагностический препарат антигена. Для этого в работе были использованы концентрированные и очищенные анатоксины Apxl и ApxII Actinobacillus pleuropneumoniae, штамма АТСС 27088. Затем мы приступили к получению специфических сывороток лабораторных и естественно-восприимчивых животных. Свиньи и кролики были иммунизированы образцами анатоксина A.pleuropneamoniae содержащими анатоксины Apxl и ApxII. В качестве положительного контроля нами были использованы сыворотки крови свиньи и кролика, специфичные к анатоксинам Apxl и ApxII. В качестве отрицательного контроля - сыворотка крови свиньи и кролика, не содержащая антител к вышеуказанным анатоксинам.

После оптимизации всех параметров и отработки схемы непрямого варианта ИФА были начаты опыты по изучению антигенных и иммуногенных свойств анатоксина. Для иммунизации использовали поросят 45 суточного возраста. До инъекции анатоксина, а также на каждый 7-й день после иммунизации, в течение 4 недель у всех животных брали кровь для исследования сывороток крови на наличие антитоксических антител в ИФА (CIVTEST suis Арр, Hipra) и тест-системе Н-ИФА ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Представленные в табл. 5 данные свидетельствуют о том, что разработанная в лаборатории тест-система н-ИФА для обнаружения поствакцинальных антитоксических антител высокочувствительна и высоко специфична. Как и в первом опыте, все животные, взятые в опыт, оказались отрицательными к токсинам Apxl и ApxII (титр <1:200). Через 7 суток после инъекции анатоксина у части животных выявили специфические антитела. Титр антител у иммунизированных

животных увеличивался на 14, 21 и 28 дни соответственно. Принимая во внимание то, что испытуемый анатоксин был в составе эмульсии, то тенденция роста специфических антител от 7 до 28 дня после иммунизации вполне закономерна.

Таблица 5

Уровень специфических антител у свиней к токсинам Архі и АрхІІ в ІІ-ІІФА (тест_система ФГБУ «ВНІП13Ж»)__

Доза До После инъекции анатоксина, 7 суток после

анатоксина. инъекции суток заражения

мкг анатоксина 7 14 21 28

<1 200 <1:200 1:800 1:1600 1:1600 1:3200

100 <1 200 <1:200 1:1600 1:1600 1:1600 1:3200

<1 200 <1:200 1:400 1:1600 1:3200 1:3200

<1 200 <1:200 1:1600 1:1600 1:1600 1:3200

<1 200 1:400 1:1600 1:3200 1:3200 1:3200

33 <1 200 <1:200 1:1600 1:3200 1:3200 1:3200

<1 200 <1:200 1:400 1:1600 1:3200 1:3200

<1 200 <1:200 1:1600 1:1600 1:1600 1:1600

11 <1 200 <1:200 1:1600 1:1600 1:1600 1:1600

<1 200 <1:200 1:1600 1:1600 1:1600 1:1600

<1 200 <1:200 1:200 1:400 1:400 1:800

3,5 <1 200 <1:200 1:400 1:800 1:800 1:1600

<1 200 <1:200 1:800 1:800 1:800 1:1600

<1 200 <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 1:1600

контроль <1 200 <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 Пал

<1 200 <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 Пал

Примечание: <1:200 - результат отрицательный, >1:200 - результат положительный.

На 29 сутки после иммунизации свиней заражали интраназально под лидокаиновой блокадой минимальной летальной дозой АсНпоЬасШш р1еигорпеитотае 5 серотипа - 2,0*10 КОЕ/мл. За клиническим состоянием животных наблюдали в течение 10 суток после заражения. Павших и вынужденно убитых поросят вскрывали. Параллельно проводили бактериологическое исследование патологического материала с целью подтверждения специфичности заболевания. Для выделения возбудителя актинобациллезной плевропневмонии делали высевы из легких, средостенных и бронхиальных лимфатических узлов, крови из сердца и экссудата из грудной полости на сывороточно-дрожжевой агар. Посевы инкубировали при 37°С в течение 24-48 ч.

Иммуногенность анатоксина оценивали по балльной системе, с той лишь особенностью, что баллы присуждались за показатели, говорящие в пользу инфекции, а отсутствие баллов или их минимум свидетельствовало об иммуногенности препарата (Р.С.Т. Наппап, 1982). Так например, гибель животного

принимали за максимальное количество баллов (100 баллов). Наличие патологоанатомических изменений в легких - до 70 баллов, наличие клинических признаков - повышение температуры тела, угнетение, анорексия, появление рвоты, кашля и одышки - до 15 баллов, положительные результаты бактериологического анализа до - 15 баллов. Противоактинобациллезные вакцины с достаточным уровнем иммуногенности не должны превышать количественный порог 30 баллов. Таблица 6

Оценка иммуиогспной активности анатоксина против астннобациллезной

Доза Клинические Пат. Результаты Итого (сумма

анатоксина, признаки изменения бак. анализа баллов)

мкг Количество баллов

100 0 20 3 23

100 0 20 6 26

100 0 20 3 23

33 0 20 6 26

33 0 20 3 23

33 6 20 3 29

и 0 20 3 23

11 15 50 12 77

11 15 40 12 67

3,5 Пал (9сутки) - - 100

3,5 0 10 3 13

Контроль Пал (8 сутки) - - 100

Контроль Пал (5 сутки) - - 100

Результаты определения иммуногенности опытного образца анатоксина, представленные в табл. 6, показывают, что анатоксин индуцировал у привитых свиней напряженный иммунитет к возбудителю актинобациллезной плевропневмонии свиней. Дозы анатоксина 100 и 33 мкг являются защитными для свиней при заражении одной минимальной смертельной дозой. В группах животных, иммунизированных дозами 100 и 33 мкг анатоксина, все животные после заражения минимальной смертельной дозой оставались живыми и клинически здоровыми. Величина патологоанатомических изменений в легких по Ханнану у всех животных, иммунизированных дозами анатоксина 100 и 33 мкг, не превышала 20 баллов. Бактериологический анализ проб внутренних органов выявил случаи выделения культуры /\ctinobaciUus р1еигорпеитотае 5 серотипа со слизистой оболочки носа и миндалин.

На основании проведенных экспериментов можно сделать выводы, что все полученные образцы анатоксина безвредны и нереактогенны, обладают выраженной антигенной и иммуногенной активностью, а образцы с концентрацией анатоксинов 100 и 33 мкг показали лучшие протективные свойства. В результате проведенных исследований был разработан непрямой вариант иммунофермеитного анализа для определения уровня антител к Арх1 ЛсИпоЬасШих ркигорпеитотае в сыворотках крови свиней и кроликов.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана схема получения анатоксина А. р1еигорпеитотае, основанная на использовании бактериальной массы А. р1еигорпеитошае, полученной путем глубинного культивирования с последующей инактивацией формалином, выделением и концентрированием анатоксинов путем двухступенчатой ультрафильтрации.

2. Установлено, что максимальная продукция токсинов Арх происходит во время экспоненциальной фазы роста бактерий А.ркигорпеитотае, на 4-м часу глубинного культивирования.

3. Установлено, что добавление к питательной среде хлористого кальция в концентрации 25 ммоль в процессе глубинного культивирования бактерий А.ркигорпеитотае повышает гемолитическую активность экзотоксина Арх1 в 1,5 раза.

4. Установлено, что храпение образцов экзотоксинов А р1еигорпеитотае без потери гемолитических свойств возможно осуществлять в обычном бытовом холодильнике в течение 12 дней при +4°С и более длительно - в морозильной камере при -20°С и ниже.

5. Установлено, что концентрация сульфата аммония 55% является оптимальной для максимального осаждения экзотоксинов А. ркигорпеитотае из фильтратов бульонных культур. Также установлено, что метод двухступенчатой ультрафильтрации является наиболее продуктивным и наименее трудоемким для выделения и концентрирования экзотоксинов А. ркигорпеитотае.

6. Опытные образцы анатоксина A.pleuropneumoniae обладают выраженной антигенной активностью и индуцируют в организме поросят образование специфических антител.

7. Установлено, что полученный образец анатоксина A. pleuropneumoniae безвреден и не реактогенен для лабораторных животных и свиней в прививном объеме 0,5 см3.

8. Экспериментально установлено, что однократная иммунизация поросят анатоксином с концентрацией 33 мкг защищала животных при контрольном заражении минимальной смертельной дозой вирулентного штамма A.pleuropneumoniae.

9. Разработана тест-система Н-ИФА, которая может быть использована для оценки антигенной активности анатоксина A. pleuropneumoniae на свиньях и кроликах.

10. С помощью КАМП-теста установлено наличие ко-гемолизина у бактерий A. pleuropneumoniae. Показана возможность его использования в качестве метода дифференциации возбудителя актинобациллезной плевропневмонии от других представителей рода Actinobacillus.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Сидоров М.А., Скородумов Д.И. Гемофилезы животных. - М.: Агропромиздат, 1986. - 176 с.

2. Тимина A.M., Бирюченкова М.В., Щербаков A.B. Генодиагностика актинобациллезной плевропневмонии свиней // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2010. - Т. 8. - С. 114-122.

3. Actinobacillus pleuropneumoniae surface polysaccharides: their role in diagnosis and immunogenicity / J.D. Dubreuil, M. Jacques, K.R. Mittal, M. Gottschalk // Anim. Health Res. - 2000. - Vol.2. - P.73-93.

4. Hannan P.C.T., Bhogal B.S., Fish J.P. Tylosin tartrate and tiamutilin effects on experimental piglet pneumonia induced with pneumonic pig lung homogenate containing mycoplasmas, bacteria and viruses // Res. Vet. Sci. - 1982. - Vol.33. - P.76-88.

5. Immunization of pigs against Actinobacillus pleuropneumoniae with two recombinant protein preparations / A. Rossi-Campos, C. Anderson, O.F. Gerlach [et al.] // Vaccine. - 1992. - Vol.10. - P.512-518.

6. Nakai Т., Sawata A., Kume K. Characterization of the hemolysin produced by Haemophilus pleuropneumoniae II Am. J. Vet. Res. - 1983. - Vol.44, № 2. - P.344-347.

7. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лебедев Н.В., Бирюченков Д.А., Русалеев B.C. Использование КАМП-теста для дифференциальной диагностики актинобациллезной плевропневмонии свиней// Ветеринария и кормление. - 2011. - № 6. - С. 32-34.

2. Лебедев Н. В., Потехин А.В., Фроловцева А.А. Актинобациллезная плевропневмония свиней: профилактика и меры борьбы // Ветеринария сегодня. -

2012. -№3. - С. 24-30.

3. Потехин А.В., Лебедев Н.В., Фроловцева А.А. Гемолитическая и цитотоксическая активность штаммов Actinobacillus pleuropneumoniae первого и второго серотипов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. -Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 122-131.

4. Потехин А.В., Лебедев Н.В., Русалеев B.C. Антигенные и иммуногенные свойства анатоксина Actinobacillus pleuropneumoniae II Ветеринария и кормление. -

2013. -№ 5. - С. 42-43.

Подписано в печать 12 ноября 2013г. Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз. Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Лебедев, Никита Викторович, Владимир

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ»

На правах рукописи

04201450535 ЛЕБЕДЕВ Никита Викторович

ПОЛУЧЕНИЕ АНАТОКСИНОВ

Асттовлсиьт рьЕикоршимотлЕ

И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ

06.02.02. - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель

доктор ветеринарных наук, профессор

РУСАЛЕЕВ Владимир Сергеевич

Владимир — 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................10

1.1. Общие сведения об актинобациллезной плевропневмонии свиней...10

1.2. Возбудитель болезни...............................................................16

1.2.1. Общие свойства возбудителя....................................................16

1.2.2. Патогенность и вирулентность..................................................18

1.2.3. Диагностика актинобациллезной плевропневмонии свиней...............21

1.3. Бактериальные токсины и их свойства.......................................24

1.4. Анатоксины и их применение в ветеринарии...............................30

1.5. Заключение по обзору литературы.............................................34

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................36

2.1. МАТЕРИАЛЫ........................................................................36

2.1.1. Штаммы и изоляты микроорганизмов.........................................36

2.1.2. Растворы и реактивы..............................................................36

2.1.3. Оборудование.......................................................................37

2.1.4. Питательные среды................................................................39

2.1.5. Краски для микроскопических исследований...............................40

2.1.6. Подопытные животные............................................................40

2.1.7. Адьюванты..........................................................................41

2.2. МЕТОДЫ..............................................................................41

2.2.1. Культивирование бактерий......................................................41

2.2.2. Световая микроскопия............................................................41

2.2.3. Определение числа живых микроорганизмов................................42

2.2.4. Биохимические свойства.........................................................42

2.2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле......................................43

2.2.6. КАМП-тест...........................................................................43

2.2.7. Получение токсинов А. р1еигорпеитотае....................................44

2.2.8. Приготовление эритроцитов....................................................45

2.2.9. Определение гемолитической активности штаммов

А.р1еигорпеитотае........................................................................45

2.2.10. Реакция гемолиза и реакция нейтрализации гемолизина.................46

2.2.11. Получение первичной культуры альвеолярных

макрофагов свиньи........................................................................47

2.2.12. Определение титра цитотоксина...............................................48

2.2.13. Получение нормальной и специфической сывороток крови лабораторных животных..................................................................49

2.2.14. Определение антигенной и иммуногенной активности экспериментального образца анатоксина против актинобациллезной плевропневмонии свиней.................................................................49

2.2.15. Статистика..........................................................................50

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..................51

2.3.1. Разработка лабораторного метода получения экзотоксинов АсйпоЪасШиь р1еигорпеитотае и изучение их биологических свойств.......................................................................................51

2.3.1.1. Определение гемолитической активности различных серотипов А.р1еигорпеитотае........................................................................51

2.3.1.2. Изучение динамики накопления гемолизина в процессе культивирования штамма АТСС 27088 А.р1еигорпеитотае первого серотипа......................................................................................55

2.3.1.3. Гемолитическая активность штаммов АТСС 27088 (1 серотип) и 27089 (2 серотип) А.р1еигорпеитотае с эритроцитами барана и кролика.......................................................................................58

2.3.1.4. Влияние концентрации хлористого кальция на активность гемолизина А.р1еигорпеитотае........................................................................59

2.3.1.5. Влияние различных физических и химических факторов на сохранение гемолитической активности гемолизинов А.р1еигорпеитотае 1 серотипа.........................................•.............................................61

2.3.1.6. Определение наличия у бактерий А.р1еигорпеитотае ко-гемо лизина..................................................................................63

2.3.1.7. Выделение экзотоксина сульфатом аммония...............................66

2.3.1.8. Цитотоксическая активность штаммов АТСС 27088 (1 серотип) и 27089 (2 серотип) A.pleuropneumoniae................................................68

2.3.1.9. Выделение экзотоксинов методом двухступенчатой ультрафильтрации.........................................................................70

2.3.2. Разработка схемы получения анатоксина Actinobacillus

pleuropneumoniae..........................................................................72

2.3.2.1. Схема получения актинобациллезного анатоксина.......................72

2.3.3. Изучение иммунобиологических свойств анатоксина Actinobacillus pleuropneumoniae..........................................................................74

2.3.3.1. Реакция диффузионной преципитации сывороток иммунизированных кроликов с экстрактами токсинов A. pleuropneumoniae, St. aureus и Е. coli.............................................................................................74

2.3.3.2. Получение экспериментального образца анатоксина Actinobacillus pleuropneumoniae в смеси с адьювантом..............................................76

2.3.3.3. Определение безвредности и реактогенности полученного экспериментального образца анатоксина на лабораторных животных и свиньях........................................................................................78

2.3.3.4. Изучение антигенных и иммуногенных свойств экспериментального образца анатоксина на лабораторных животных и свиньях.......................79

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.....................92

4. ВЫВОДЫ..............................................................................100

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..........................................102

6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..........................................................................103

7.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................105

ПРИЛОЖЕНИЯ.........................................................................134

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Актинобациллезная плевропневмония - инфекционное контагиозное заболевание свиней, характеризующееся септикотоксемией, геморрагической и гнойно-некротизирующей пневмонией, а также серозно-фибринозным плевритом, перикардитом и артритами.

Возбудителем болезни являются бактерии семейства Pasteurellaceae, рода Actinobacillus, вида Actinobacillus pleuropneumoniae. Это мелкие грамотрицательные, неподвижные коккобактерии и палочки. Спор не образуют; вирулентные штаммы имеют капсулу; обладают выраженным тропизмом к легочной ткани. Штаммы A. pleuropneumoniae разделяют на 15 серовариантов по капсульному антигену. Эти бактерии продуцируют четыре типа экзотоксинов - Apxl, ApxII, ApxIII, ApxIV. Некоторые исследователи склонны полагать, что экзотоксины играют доминирующую роль в патогенности бактерий A. pleuropneumoniae. Токсины возбудителя губительно действуют на альвеолярные макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты свиней, а также вызывают коагуляционный некроз тканей.

Актинобациллезная плевропневмония свиней была впервые зарегистрирована в свиноводческих хозяйствах Великобритании, США, Швейцарии и Аргентины в 1957-1964 гг., а возбудитель болезни был выделен в 1963 году. В последующие десятилетия это заболевание было установлено в большинстве стран мира с развитым свиноводством.

Согласно последним данным на территории Российской Федерации циркулирует около 8 серовариантов A. pleuropneumoniae, но в связи с все большей глобализацией торгово-экономических отношений, вступлением нашего государства во Всемирную Торговую Организацию (ВТО), ростом миграции, увеличением импортно-экспортных торговых операций повышается вероятность появления других серовариантов возбудителя этого заболевания [52]. Из этого возникает проблема, решение которой напрямую зависит от наличия у животноводов эффективных средств специфической профилактики [12, 13, 16, 37, 44]. Все известные в мире противоактинобациллезные вакцины подразделяют на корпускулярные и субъединичные (токсоидные). Наиболее распространенными являются корпускулярные вакцины. В состав таких вакцин включают штаммы серотипов, преимущественно доминирующих в конкретном географическом регионе, а создание вакцины содержащей в своем составе антигены всех 15 серовариантов достаточно проблематично и скорее всего такая вакцина будет обладать низкой иммуногенностью.

Исходя из вышеизложенного, наиболее перспективными являются бактерин-токсоидные и субъединичные вакцины. Разработка фирмой Intervet вакцины «PORCILIS АРР», свидетельствует о возможности создания высокоэффективного препарата, имеющего в своем составе инактивированные формальдегидом экзотоксины (Apxl, ApxII, АрхШ) и очищенные белки внешней мембраны, который защищает животных против 14 серовариантов A. pleur opneumoniae.

Таким . образом, проведение работ по получению анатоксинов A.pleuropneumoniae и изучению их биологических свойства, является

актуальной задачей, имеющей важное научное и практическое значение для ветеринарии.

Степень разработанности. Несмотря на то, что актинобациллезная плевропневмония свиней не относится к особо опасным или трансграничным инфекционным заболеваниям животных, а считается лишь факторной инфекцией, ей посвящено большое число научных исследований. Существенный вклад в изучение проблемы актинобациллезной плевропневмонии свиней внесли зарубежные ученые: Shope, Nakai, Nielsen, и Frey [104, 114, 159, 186]. Их работы содержат фундаментальные основы эпизоотологии данного заболевания. В последние годы данной тематике уделяли внимание Dubreuil и Gottschalk [63, 120]. В Российской Федерации изучением актинобациллезной плевропневмонии, занимались М.А. Сидоров и Д.А. Скородумов [41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49], а также научные сотрудники лаборатории профилактики болезней свиней и рогатого скота ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Цели и задачи исследования. Целью данных исследований было получение анатоксинов A.pleuropneumoniae и изучение их основных биологических свойств.

Для достижения поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

изучить биологические свойства имеющихся штаммов A.pleuropneumoniae и отобрать гиперпродуценты экзотоксинов;

- разработать метод получения экзотоксинов A.pleuropneumoniae;

- изучить биологические свойства экзотоксинов A.pleuropneumoniae;

- разработать схему получения анатоксина;

изучить иммунобиологические свойства анатоксина A.pleuropneumoniae на лабораторных и естественно-восприимчивых животных.

Научная новизна. Научная новизна работы состоит в том, что в результате проведенных исследований:

- отработан метод получения и концентрирования экзотоксинов А ,р1еигорпеитотае;

- изучены биологические свойства экзотоксинов А.р1еигорпеитотае;

- разработана схема получения анатоксина;

изучены иммунобиологические свойства анатоксина А.р1еигорпеитотае\

разработан метод оценки иммуногенности полученного экспериментального образца анатоксина.

Теоретическая и практическая значимость. На основании экспериментальных данных разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», «Методические указания по определению антигенной активности анатоксин-вакцины против актинобациллезной плевропневмонии свиней».

Методология и методы исследования. Методологической и теоретической основой диссертационной работы послужили труды зарубежных и отечественных исследователей в областях эпизоотологии и профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней, токсикологии и вакцинологии.

Положения, выносимые на защиту.

- динамика накопления экзотоксинов А.р1еигорпеитотае\

- биологические свойства экзотоксинов А.р1еигорпеитотае\

условия хранения и способ консервации экзотоксинов А.р1еигорпеитотае\

технология получения и концентрирования экзотоксинов А.р1еигорпеитотае;

- схема получения актинобациллезного анатоксина;

- иммунобиологические свойства анатоксина А.р1еигорпеитотае в опытах на лабораторных животных и свиньях.

Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2010-2013 гг., а также доложены и опубликованы в материалах конференции «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 30-летию создания СМУ ФГБУ «ВНИИЗЖ». По теме диссертации опубликовано 4 научных работы, в том числе две работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ АКТИНОБАЦИЛЛЕЗНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИИ СВИНЕЙ

Актинобациллезная плевропневмония (АПП) - инфекционное контагиозное заболевание свиней. К болезни восприимчивы свиньи всех возрастов, но наиболее чувствительны поросята 2-4 месячного возраста. Такие факторы как скученность и плохой микроклимат в помещениях для животных, играют важную роль в распространении заболевания [1, 5, 6, 12, 14, 15,159].

Возбудитель болезни обладает выраженным тропизмом к тканям воздухоносных путей свиньи. Передача возбудителя может идти как вертикальным путем, от матки к поросенку, так и горизонтальным от больных животных здоровым [63, 145, 151, 159]. Вертикальная передача данного возбудителя происходит в более поздние сроки, чем у других патогенов, это объясняет успех в ликвидации заболевания при раннем отъеме поросят [151].

Передача возбудителя в стадах возможна воздушно-капельным путем. Экспериментально установлено, что воздушно-капельным путем заражение удается на расстоянии до 1 метра [64], при использовании актинобацилл 1 серотипа и до 2,5 метров при использовании 9 серотипа [106]. Наличие А. pleuropneumoniae в пробах воздуха, подтверждалось с помощью ПЦР диагностики [103]. Некоторые исследователи сообщают о возможности передачи A. pleuropneumoniae 1 и 2 серотипа воздушно - капельным путем на расстояния от 150 до 500 м [85, 98]. Данный феномен авторы связывают с сильным ветром [85].

Эпидемиологические исследования при актинобациллезной плевропневмонии базируются в основном на серотипировании возбудителя. Географическая распространенность различных серотипов возбудителя и их превалентность сильно варьирует в разных странах [170]. Наиболее распространенными и клинически значимыми в США являются 1, 5 и 7

серотипы, в Европе 2 и 9, а недавно описанный 15 серотип является одним из наиболее распространенных и вирулентных штаммов в Австралии [63, 73, 151]. Сообщения о выделении 15 серотипа также приходили из Канады, США, Мексики, Бразилии и Аргентины [119, 170]. В настоящее время в России циркулирует широкий спектр серотипов, включающий 2, 3, 5, 6, 8, 9 и 10. Обращает на себя внимание тенденция к увеличению числа хозяйств, неблагополучных по актинобациллезной плевропневмонии свиней. Если в 2007г. актинобациллезная плевропневмония была выявлена только в 3 хозяйствах из 82 обследованных, то в 2008г. - в 5 из 74, а в 2009г. заболевание было диагностировано уже в 21 из 102 обследованных хозяйств. Резкое увеличение числа хозяйств, неблагополучных по актинобациллезной плевропневмонии, объясняется, главным образом, двумя обстоятельствами. Во-первых, за последние годы в РФ ввезено много племенных свиней из Западной Европы и Канады, при этом актинобациллезная плевропневмония не входит в список инфекций, от которых, согласно ветеринарным требованиям, должны быть свободны ввозимые в РФ живые свиньи [10]. За счет импортного поголовья было сформировано много новых свиноводческих хозяйств, а некоторые, ранее функционировавшие в России свинокомплексы, провели полную или частичную замену поголовья. Большинство хозяйств, в которых обнаруживалась актинобациллезная плевропневмония, относились к одной из этих двух категорий. Вторая причина распространения актинобациллезной плевропневмонии - торговые операции между российскими хозяйствами: многие «старые» свинокомплексы закупают ремонтных свиней в «новых» хозяйствах, сформированных из импортных племенных животных [52]. Распространенность и превалирование серотипов А. pleuropneumoniae в разных странах мира показана в таблице 1.

Таблица 1.

Страна Циркулирующие серотипы Превалирующие серотипы Источник данных

Австралия 1,2,3,7, 12, 15 1 Eaves and Blackall et al., 1988; Gottschalk, 2007

Аргентина 1,2,3,5, 12 1 Vena et al., 1997, 1988

Бельгия 2,3,6, 7, 8, 9,11 3 Hommez et al., 1988,1990

Бразилия 1,3,4,5,7,9 3, 5 Piffer et al., 1997

В еликобритания 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10 2,3,8 Hunter etal., 1983; Brandreth and Smith, 19

Информация о работе