Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК

Ванюшева, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК"

На правах рукописи

ВАНЮШЕВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ДЕТЕКЦИИ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ НА ОСНОВЕ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПЦР С ПРИМЕНЕНИЕМ АВТОМАТИЧЕСКИХ АНАЛИЗАТОРОВ ДНК

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2005

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в группе анализа геномов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (г. Москва).

Научные руководители: академик РАМН,

доктор химических наук, профессор Швец Виталий Иванович

кандидат химических наук Шилов Илья Александрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович

кандидат биологических наук Зимин Андрей Леонидович

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Зашита состоится 31 октября 2005 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, г. Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова. Автореферат разослан 30у> СЯи^^ 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Анализ известных точечных мутаций в ДНК является одним из основных направлений современной ДНК-диагностики и находит широкое Применение при выявлении предрасположенности человека к различным наследственным заболеваниям, при анализе устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам, в миграционных исследованиях, а также в фармакогеномике.

Существующие методы детекции известных точечных мутаций можно разделить на две группы. В одной группе методов анализ мутаций проводится после амплификации исследуемого участка ДНК. Точечные мутации обнаруживают по расщеплению анализируемых фрагментов ДНК соответствующими рестриктазами, с помощью аллель-специфической гибридизации или удлинения праймера на один нуклеотид. Ко второй группе методов относятся те, в которых амплификация является частью системы детекции. Эти методы основаны на лигировании специфических олигонуклеотидных зондов в месте потенциальной мутации и аллсль-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР). Тем не менее, при всем существующем многообразии методов не один из них пока не является полностью подходящим для клинического использования. К общим недостаткам методов первой группы, ограничивающим их применение в клинической практике и крупномасштабных исследованиях, можно отнести: трудоемкость, наличие стадии обработки ПЦР-продукгов, способствующей контаминации, долгое время анализа и низкую производительность. Кроме того, наиболее используемый в клинической диагностике метод первой группы, основанный на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, имеет существенные ограничения по применению, поскольку требует наличия сайта рестрикции в месте предполагаемой мутации. Методы второй группы являются более предпочтительными с точки зрения использования их в клинической практике, т.к. они позволяют проводить генотипирование в одну стадию, что сокращает время анализа и значительно упрощает анализ. Эти., методы также являются малопроизводительными, что ограничивает их широкое применение. Кроме того, метод аллель-специфического олигонуклеотидного лигирования характеризуется низким выходом продукта

реакции.

К преимуществу аллель-специфической ПЦР можно отнести возможность генотипирования всех видов точечных нуклеотидных замен и получение информации не только об их присутствии в ДНК, но также и об их гомо- и гетерозиготности, поэтому представляется актуальным разработка быстрого, высокопроизводительного и надежного метода на основе аллель-специфической ПЦР.

Работа выполнена в рамках темы РК 01.200.201917 «Иммунологические и молекулярно-биологические основы нарушения репродуктивной функции» Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН.

Цель работы. Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР (АС-ПЦР) с применением автоматических анализаторов ДНК. Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Разработать методологию конструирования аллель-специфических праймеров, которая позволит проводить автоматизированную детекцию продуктов реакции АС-ПЦР.

2. Разработать технологию детекции мутаций на основе АС-ПЦР с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК.

3. Применить разработанную технологию для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С->Т), факторов И (20210С—>А) и V (169Ш—>А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, 0(-6)А в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах а1 -коллагена типа 1 (20460—>Т), рецептора витамина БЗ (45082С—>А) и эстрогенового рецептора а (938Т->С и 984А—>0).

Научная новизна. Впервые разработана методология создания тест-систем для детекции мутаций на основе АС-ПЦР и капиллярного электрофореза, адаптированная для использования в клинической практике. На основе предложенной технологии разработаны диагностические наборы реагентов для выявления нуклеотидных замен в генах метилентстрагидрофолатредуктазы (677С-+Т), факторов II (202100—>А) и V " '............4

(16910-»А) свертываемости крови, полиморфизмов М235Т, Т174М, 0(-6)А в гене ангиотензиногена человека, а также для нуклеотидных замен в генах а 1-коллагена типа 1 (2046в—>Т), рецептора витамина БЗ (450820—>А) и эстрогенового рецептора а (938Т->С и 984А—>С), для которых тест-системы на основе АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом разработаны впервые.

Практическая значимость работы. Созданы наборы реагентов для детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (202100—► А) и V (169Ш >А) свертываемости крови. Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ. Используя разработанные наборы, была проанализирована группа женщин с нормальным течением беременности и гестозом, выявлена более высокая частота встречаемости вышеупомянутых мутаций в генах пациенток с гестозом. Также была выявлена высокая частота встречаемости данных мутаций в ДНК беременных женщин с варикозной болезнью. Данные результаты свидетельствуют о связи этих мутаций с предрасположенностью к гестозу и варикозной болезни во время беременности.

Разработанная технология может служить основой для создания новых тест-систем для выявления мутаций в любых интересующих генах.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Методология конструирования аллель-специфических праймеров, позволяющая использовать АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом.

2. Технология детекции мутаций на основе АС-ГПДР с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе капиллярного электрофореза.

3. Разработанные тест-системы для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов П (202100 ->А) и V (169Ю—>А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, в(-6)А в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен

в генах al-коллагена типа 1 (2046G—>Т), рецептора витамина D3 (45082G-->A), эстрогенового рецептора a (938Т—>С и 984A—>G).

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ. Основные результаты исследований были представлены на конференции European Human Genetics Conference (Мюнхен, Германия, 12-15 июня.

2004), конференции European Human Genetics Conference (Прага, Чехия, 7-10 мая,

2005), всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 19-22 мая, 2005), научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 20-21 июня, 2002), III Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 10 апреля, 2003), а также на 34-м Международном Конгрессе «Патология беременности» (Венгрия, 27-30 июня, 2002), TV Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 21-25 октября, 2002) и V Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 6-10 октября, 2003).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного современным методам детекции точечных мутаций, главы, отражающей результаты работы и их обсуждение, раздела, посвященного материалам и методам исследования, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах печатного текста, содержит ^ таблиц и ■¿рисунков. Список литературы включает^^сточников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследования.

В работе использовали олигонуклеотиды, синтезированные ЗАО "Синюл" (г. Москва) на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-102U (г. Новосибирск); дНТФ фирмы «Медиген» (г. Новосибирск); Taq ДНК-полимеразу фирмы Promega (США), ArnpliTaqGold ДНК-полимеразу фирмы Applied BioSystems (США) и Taq Platinum ДНК-полимеразу фирмы Invitrogen (США).

Использовали аллель-специфические праймеры, меченные флуоресцентным красителем JOE и стандарты длины, меченные красителем ROX фирмы Molecular Probes (США).

Образцы крови беременных с гестозом различной степени тяжести, варикозной болезнью и с неосложненным течением беременности были предоставлены Научным центром акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (г. Москва), образцы крови больных с постменопазуальной и сениальной формами остеопороза были предоставлены ОАО «Медицина» (г. Москва) и ГУН ЦИТО им. H.H. Приорова (г. Москва).

Получение клинического материала. Анализируемые образцы крови помещали в пластиковые пробирки, содержащие ЭДТА или цитрат натрия. Образцы замораживали и хранили при -20°С.

Выделение геномной ДНК из крови человека проводили по стандартной методике с использованием протеиназы К, последующей фенольной экстракцией и осаждением этанолом (Blin N. et al., 1976). Концентрацию ДНК определяли спектро-фотометрически при 260 нм.

Полимеразную цепную реакцию проводили с помощью двух флуоресцентно-меченых аллель-специфических и одного общею образною праймеров, указанных в Табл. 1. Реакции проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 100 нг ДНК, 20 пмоль общего праймера, 10 пмоль аллель-специфического праймера AS-(N)-WT и 8 пмоль праймера AS-(N)-MT, 67 мМ Трис-HCl (pH 8,5 при 25°С), 16 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлорида магния, 0,01% Твин-20, 400 мкМ каждою дезоксинуклеозидтрифосфата и 1 ед. ДНК-полимеразы. Для амплификации использовали термоциклер «Mastercycler gradient» фирмы «Eppendorf» (Германия) и GeneAmp PCR System 2400 фирмы "Perkin Elmer" (США). Условия ПЦР указаны в Табл. 1.

Флуоресцентно-меченые продукты ПЦР анализировали с помощью капиллярного электрофореза на автоматическом анализаторе ДНК «Мультиген» производства НПФ «АТГ-Биотех» (г. Москва) с флуоресцентным детектором (диапазон эмиссии от 550 до 615 нм). Использовали капилляры TSP100200 фирмы Polymicro Technologies (США), заполненные 2 %-ным раствором гидроксипропилметилцеллюлозы, содержащей 8 M мочевину. Разделение ПЦР-

продуктов осуществляли в трис-боратном буфере (50 мМ Трис-борат (рН 8,3); 1 мМ ЭДТА). Использовали капилляры длиной 50 см.

ПЦР-продукты вводились в капилляр с помощью электрокинетической инъекции при напряжении 5 кВ в течение 40 сек. Перед нанесением ПЦР-продукты осаждали с помощью этанола и растворяли в 80 %-ном формамиде, после чего к ним добавляли маркеры длины в количестве 1 пмоль каждого. В качестве маркеров длины использовали фрагменты ДНК размером 131, 180 и 239 п.н. Перед каждой инъекцией обновляли полимер, вводя его в капилляр под давлением.

Разделение проводилось при комнатной температуре при напряжении 8 кВ.

Секвенирование ДНК по Сэнгеру проводили с помощью набора реактивов для секвенирования Су5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit фирмы Amersham BioSciencs (США). Секвенируемые ПЦР-продукты предварительно очищали от дезоксинуклеозидтрифосфатов и остатков праймеров с помощью спин-колонок MicroSpin™ S-300 HR Columns фирмы Amersham Biosciences (США). Электрофоретическое разделение продуктов секвенирования проводили с помощью автоматического секвенатора ALFexpress II фирмы Amersham Biosciences (США).

2. Разработка технологии детекции мутаций на основе АС-ГЩР с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК.

В основе АС-ПЦР лежит та особенность полимеразной цепной реакции, что для ее эффективного осуществления 3'-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду ДНК-матрицы. В противном случае эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается и при определенных сочетаниях нуклеотидов может отсутствовать вообще (Goodman M.F., 1995; Патрушев Л.И., 2000). Поэтому, в АС-ПЦР используются два аллель-специфических праймера, З'-концевые нуклеотиды которых соответствуют месту расположения детектируемой нуклеотидной замены в ДНК. При этом, 3'-концевой нуклеотид у одного из праймеров комплементарен «мутантному» нуклеотиду ДНК-матрицы, а у другого - соответствующему нуклеотиду «нормальной» ДНК-матрицы, не несущей мутацию. Следовательно, в зависимости от наличия или отсутствия мутации в ДНК происходит удлинение соответствующего аллель-специфического праймера. Последующий же анализ образующихся при этом продуктов реакции позволяет идентифицировать нуклеотидную замену.

А: Гомозигота "нормальная" jot^ f ГО

Аллель 1,2

пз—

I ROX

Б: Гомозигота "мутантная"

„JOE

. III

* П2

joe:""

Аллель 1,2 j' ■ 3'

га—

ROX 2

В: Гетерозигота

JOE—. ш

Аллель I j) д.

Рис. 1. Принцип выявления точечных нуклеотидных замен с помощью АС-ПЦР при использовании капиллярного электрофореза. П1, П2 - флуоресцентно-меченные с помощью красителя JOE праймеры, специфичные к «нормальному» аллелю и аллелю, несущему нуклеотидную замену, соответственно. ПЗ - общий праймер Пики, обозначенные цифрами 1 и 2 на электрофореграммах соответствуют продуктам ПЦР, полученным удлинением праймеров П1 и П2, соответственно. Пик, обозначенный пунктиром, соответствует маркеру длины, меченному красителем ROX. Стрелками на схемах А, Б и В обозначено направление удлинения праймеров, черным треуюльником обозначена нуклеотидная замена. А. В случае «нормальной» ДНК происходит удлинение праймера П1 с образованием продукта 1 и отсутствует удлинение праймера П2. Б. В случае, если нуклеотидная замена присутствует в обоих аллелях, удлиняется праймер П2 с образованием продукта 2 и не происходит удлинение праймера П1. В. Если нуклеотидная замена присутствует только в одном из аллелей, то происходит удлинение обоих аллель-специфических праймеров П1 и П2 с образованием двух продуктов реакции 1 и 2.

Преимуществом АС-ПЦР является то, что она позволяет получать информацию не только о наличии мутации в геномной ДНК, но также и об ее аллельном распределении. Тем не менее, данный метод редко используется в клинической практике. Это связано, прежде всего, с тем, что продукты АС-ПЦР, как правило, мало различаются по длине, что затрудняет их идентификацию с помощью электрофореза в агарозном геле и делает метод неудобным для использования.

Капиллярный 'электрофорез (КЭ) по сравнению с классическим электрофорезом имеет ряд преимуществ: очень высокое разрешение, простоту детектирования фрагментов ДНК в режиме реального времени, короткое время

анализа, возможность автоматизации. Эти достоинства делают КЭ более подходящим методом для идентификации продуктов ПЦР в клинической практике, нежели классический электрофорез в агарозном геле.

Разработанная нами технология детекции известных точечных мутаций заключается в том, что проводится ПЦР с тремя праймерами: двумя аллель-специфическими и одним общим обратным праймером. Для того чтобы выявить гетерозиготное состояние мутации (мутация содержится только в одном из аллелей), используемые аллель-специфические праймеры различаются по длине их 5'-концевых последовательностей, что приводит к образованию ПЦР-продуктов разной длины. Таким образом, при анализе продуктов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза на электрофореграмме наблюдается один пик (рис. 1, А и Б), если ДНК является гомозиготной по «нормальному» аллелю (мутация отсутствует в обоих аллелях) или гомозиготной по «мутантному» аллелю (мутация содержится в обоих аллелях) и два пика (рис. 1, В) - в случае, если ДНК гетерозиготна. Для исключения ложной интерпретации результатов используются стандарты длины. Это специально синтезированные фрагменты ДНК, длины которых являются промежуточными между длинами продуктов АС-ПЦР. При использовании КЭ с флуоресцентной детекцией анализируемые ПЦР-продукты и маркеры длины метятся разными флуорофорами и разделяются в одном капилляре. В рамках нашей работы в качестве флуорофоров были использованы коммерчески доступные красители JOE и ROX (рис. 2).

6-JOE 6-ROX

Рис. 2. Химические формулы красителей JOF (Лпих возбуждения/флуоресценции = 520 нм/548 нм) и ROX (580 нм/605 нм), используемых для флуоресцентной детекции в предлагаемой в данной работе технологии выявления мутаций.

3. Разработка методологии конструирования аллель-специфических праймеров для АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом.

Для того чтобы идентифицировать в ДНК человека исследуемые мутации, мы разработали для каждой из них два аллель-специфических праймера: AS-(N)-WT (где N - уникальное для каждой мутации обозначение), специфичный к «нормальному» аллелю ДНК, и AS-(N)-MT, специфичный к ДНК, содержащей мутацию, а также один общий праймер, которые использовали в одной реакционной смеси. Праймеры AS-(N)-WT и AS-(N)-MT различаются их 3'-концевыми нуклеотидами. При этом, их специфичность зависит от того, насколько сильно «ингибирует» удлинение праймера некомплементарная пара, которую образуют З'-концевой нуклеотид праймера и соответствующий нуклеотид ДНК-матрицы. Так, наиболее неблагоприятными для продолжения синтеза ДНК являются пары нуклеотидов пурин-пурин и пиримидин-пиримидин (Goodman M.F., 1995; Патрушев Л.И., 2000). Тем не менее, вероятность удлинения праймера сохраняется даже в случае образования самой неблагоприятной для удлинения пары нуклеотидов. Поэтому, для того, чтобы увеличить аллельную селективность праймеров, были введены дополнительные некомплементарные матрице нуклеотиды на их 3'-концах. Они вводились в одно и тоже положение (-1 или -2), что важно для получения сравнимой эффективности амплификации для двух аллель-специфических праймеров (Ulvik A. et al., 1998). Кроме того, дополнительные неспаренные нуклеотиды на З'-конце, в случае, если они различаются для парных аллель-специфических праймеров, приводят к большему различию образуемых Г1ЦР-продуктов, что также снижает вероятность неспецифического отжига праймеров на них (Rust S., 1993).

Для того, чтобы ПЦР-продукты, образующиеся в результате удлинения аллель-специфических праймеров различались по длине, праймеры AS-(N)-MT, определяющие специфичность к мутантному аллелю, были удлинены на 12 нуклеотидов (некомплементарных матрице) с 5'-конца. При этом, в структуре праймеров AS-(N)-WT два 5'-концевых нуклеотида были заменены на некомплементарные матрице с тем, чтобы в случае образования гетеродуплексов между короткими и длинными ПЦР-продуктами не происходило «ложного» накопления более длинного «мутантного» ПЦР-продукга.

Для того, чтобы иметь возможность разделять продукты разных реакций в одном капилляре, что повышает производительность метода и сокращает время анализа, праймеры планировались таким образом, чтобы длины продуктов разных реакций лежали в разных диапазонах длин. В рамках данной работы нами были выбраны три диапазона длин предполагаемых амплификатов: 120-140 п.н, 170-190 п.н, и 230-250 п.н.

4. Создание системы детекции полиморфизмов М235Т, Т174М и G(-6)A в гене ангнотензиногена человека.

На основе литературных данных были определены три мутации в гене ангнотензиногена человека (AGT), наиболее значимые с точки зрения их связи с предрасположенностью к гестозу и первичной гипертонии. Это две мутации, приводящие к аминокислотным заменам - М235Т и Т174М и одна мутация G(-6)A в промоторной области гена ангиотензиногена. Замена остатка 235 аминокислоты происходит в результате замены 1198Т на С. Замена остатка 174 аминокислоты обусловлена заменой 1015С на Т.

Фрагменты последовательностей промоторной области и экзона 2 гена AGT. содержащие рассматриваемые мугации, представлены на рис. 3 и 4, соответственно.

1 cccatgagcg ggcagcaggg tcagaagtgg

61 tgccctctgc cctctgcacc tccggcctgc

121 cccggggctg ggteagaagg cctgggtggt

181 tgctcccgtt tctgggaacc ttggcceega

241 gaccctgcac cggctcactc tgttcagcag

301 tggaagaggt cccagcgtga gtgtegette

361 ctggccaagt gatgtaaccc tc-ctctccag 421 atccccaccc eteagetata aatagggcat

481 tgttctgggt actacagcag aaggtaageg 541 teteteagga tgtaaatgag ctgtgggcta

сccccgtgtt gcctaagcaa gartctcccc atgtccctgt ggcctcttgg gggtacatct tggcctcagg ctgtcacaca cctagggaga ctcctgcaaa etteggtaaa tgtgtaactc

tgaaactctg catcgatcac taagacttcc tggeatetgt ccttctggcc agcctgtggt cctgtgcaca ggcagcctgg gaacaqctcc cgtgacccgg ccGggggaag aagetgeegt" А

ggggccccct ragctccttc tggtettgte ggaggaaaag greegggaga

Рис. 3. Фрагмент промоторной области гена ангиотензиногена человека {Accession No М24685), с обозначенными на нем мутацией G(-6)A и мраймерами AGT-prom-F3 (258 - 285) и AGT-prom-R2 (580 - 553) Полиморфный нуклеотид, а также последовательности праймеров выделены жирным шрифтом.

Создание системы детекции мутаций на основе АС-ПЦР с применением капиллярно! о электрофореза предполагает следующие этапы работы:

1. Амплификацию фрагмента генома, содержащего области с предполагаемыми мутациями, и отбор нормального, гетерозиготного и мутантного генотипов с помощью секвенирования ПНР-фрагментов.

2. Создание аллель-специфических праймеров согласно разработанной методологии и оптимизацию условий АС-ПЦР.

3. Анализ образцов с использованием автоматического анализатора ДНК на основе капиллярного электрофореза.

4. Подтверждение результатов анализа методом прямого секвенирования.

' 781 atggggccac cgtcctctcc ccaacgqctg tctttggcac cctggcctct ctctatctqq

841 gagccttgga ccacacdgct gacaggctac aggcaatcct gggtgttcct tggaaggaca 901 agaactgcac ctcccggctg gatgegcaca aggtcctgtc tgccctgcag gctgtacagg 961 gcctgctagt ggcccagggc agggctgata gccaggccca getgetgetg tccaCggtgg * T

1021 tgggcgtgtt caoagcccca ggcctgcacc tgaagcagcc gtttgtgcag ggcctggctc 1081 tctataccrc tgtggtcctc ccacgctctc tggacttcac agaactggat gttgrrgctg 1141 agaagattga caggttcatg caggctgtga caggatggaa gactggctgc tccctgaTgg

1201 gagccagtgt ggacagcacc ctggctttca acacctacgt ccacttccaa ggtaaqgcaa 1261 acctctctgc tggctctggc cctaggactt agtatccatg tgtagctgag atcagccaat 1321 Caggccttgg agatgggcag ggggcag

Рис. 4. Фрагмент экзона 2 гена ангиотензиногена человека (Accession No M246S6), с обозначенными иа нем мутациями Т174М (нуклеотидная замена С1015Т), М235Т (T1198С) и праймерами AGT-ex2-F (885 - 907) и AGT-ex2-R (1300 - 1278). Полиморфные нуклеотиды и последовательности праймеров выделены жирным шрифтом.

Таким образом, первая стадия нашей работы заключалась в амплификации фрагментов, содержащих области с предполагаемыми мутациями и определении их генотипов секвенированием по Сэнгеру. Образцы ДНК с известными сеношпами используются в дальнейшем при оптимизации условий АС-ПЦР.

В данной работе был амплифицирован 323-звенный фрагмент промоторной области гена AGT, с помощью праймеров AGT-prom-F3 и AGT-prom-R2 (рис. 3), содержащий область с предполагаемой мутацией G(-6)A и 416-звенный фрагмент экзона 2 того же гена с помощью праймеров AGT-ex2-F и AGT-ex2-R (рис. 4). содержащий область с возможными заменами Т174М и М235Т.

Для секвенирования использовали праймер AGT-prom-F3 для G(-6)A, AGT-ex2-F для Т174М и AGT-ex2-R для М235Т мутаций. Продукты секвенирования анализировали на автоматическом секвенаторе ALFexpress II (Amersham Biosciences. США). В результате секвенирования для каждой мутации были найдены образцы

ДНК с тремя возможными генотипами - гомозигота «нормальная», гомозигога «мутантная» и гетерозигота.

Следующая стадия нашей работы заключалась в создании аллель-специфических праймеров согласно разработанной методологии их конструирования. Конечные варианты последовательностей праймеров, размеры ПЦР-продуктов и маркера длины приведены в Табл. 1.

С целью исключения ложных результатов необходимо было подобрать такие условия реакции, при которых происходило бы сравнимое по эффективности удлинение обоих аллель-специфических праймеров при сохранении их специфичности Для этого мы варьировали температуру и время денатурации ДНК, гибридизации и удлинения праймеров, а также концентрации 1^С12, дНТФ и ДНК-полимеразы. Поскольку праймер А8-(1М)-МТ, специфичный к ДНК, несущей мутацию, за счет большей длины вступает в реакцию эффективнее праймера А8-(]М)-\УТ. специфичного к «нормальной» ДНК, то варьировали также и концентрации аллель-специфических праймеров с целью подобрать их оптимальное соотношение, при котором в случае гетерозиготной ДНК образовывались бы одинаковые по интенсивности сигналы во время разделения продуктов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза. В итоге, оптимальными были признаны условия, при которых реакционная смесь включала в себя 20 пмоль общего обратного праймера, 10 нмоль праймера Л8-(Ы)-\УТ и 8 пмоль праймера А8-(]М)-МТ. Оптимальные условия циклирования представлены в Табл. 1. Поскольку области ДНК, в которых расположены мутация 0(-6)А гена аншотензиногена и мутация С2046Т гена а1-коллагена типа 1 (см. ниже) богаты остатками гуанозина и цитидина, что значительно ухудшает плавление ДНК и требует более продолжительного времени и высокой температуры для ее денатурации, то предварительную денатурацию для двух этих мутаций проводили в течение 5 мин при 95°С, а время денатурации в повторяющихся циклах составило 40 сек.

Анализ продуктов АС-ПЦР проводили с помощью КЭ. На рис. 5 представлена элсктрофореграмма разделения продуктов АС-ПЦР, полученных при анализе полиморфизма М235Т (Т1198->С) в гене АОТ с помощью КЭ. В случае ДНК. гомозиготной по аллелю 1198Т, наблюдается один пик, соответствующий П1ДР-

Таблица 1. Праймеры и условия ПЦР, используемые для детекции точечных нуклеотидных замен с помощью АС-ПЦР

Ген Нуклеотидваи замена Название праймеров Последовательность праймеров (5'-3') Размер продуктов АС-ПЦР н маркера длины (п.н.) Условия цнклированив

VDR G45082—>А (BsmI) AS-BsmI-WT AS- BsmJ-MT Bsml-F JOE - CIGCAGAGCCTGAGTATTGGGAATTC JOE - AATTTTCATGTTGAGCAGAGCCTGAGTATTGGGAATCT ACTGCCCTTAGCTCTGCCTTG 125» 137 131 95 С - 2 мин, 30 циклов: 94 С-30 сек, 60'С - 30 сек, (62°С - 30 сек, в случае мутации С45082А), 72'С - 30 сек; 72°С - 5 мин

МТГФР С677—»T AS-MTHFR-WT AS-MTHFR-MT MTHFR-R JOE - CCGAAGGTGTCTGCGGGCGC JOE - GAGCTGGATCGTCGAGAAGGTGTCTGCGGGTGT AAGATCCCGGGGACGATGG 125 138 131

Фактор II G20210-*A AS-P-WT AS-P-MT P-F JOE -CCATAGCACTGGGAGCATTGAGGATC JOE - GCAGTTCACGCCTGAATAGCACTGGGAGCATTGAGGGTT GTTCCGCCTGAAGAAGTGGATACAGAA 174 187 180

Фактор V G1691->A (Leiden) AS-L-WT AS-L-MT L-F JOE • AATCAAGGACAAAATACC TGTATTCCAC JOE- GTCrGTCTGTCTCTTCAAGGACAAAATACC TGTATTCCGT GGCAGGAACAACACCATGATCAG 233 245 239

AGT C1015-*T (T174M) AS-174-WT AS-I74-MT 174-R JOE - GTGGCCCAGCTGCTGCTGTCAAC JOE - CATCAGATGCTACAGGCCCAGCTGCTGCTGTCGAT AAGrCCAGAGAGCGTGGGAGGAC 125 137 131

T1198-+C (M235T) AS-23S-WT AS-23S-MT 23S-F JOE -CCTGCTGTCCACACTGGCTCCAA JOE - ATCGCTCTAACAGGTGCTGTCCACACTGGCTCCGG CAATCCTGGGTGTTCCTTGGAAG 174 187 180

G(-6)—>A AS-G6A-WT4 AS-G6A-MT3 G6A-F3 JOE - AGTACCCAGAAC AACGGCAGCTTCTTCCATC JOE - GTAGTATAGGAGACCCAGAACAACGGCAGCTTCTTCCACT CTC.TGTTCAGCAGTGAA ACTCTGCATCG 236 245 239 95 С-5 мин, 30 циклов: 94°С - 40 сек, 58°С - 30 сек, (65°С - 30 сек, в случае мутации в2046Т), 72"С - 30 сек,

ER T938-»C (PvuII) AS-Pvu-WT AS-Pvu-MT Pvu-F JOE - ACAGTTCCAAATGTCCCAGAT JOE - ATTTTCCTATAATGAGTTCCAAATGTCCCAGGC TTTTGCAGGAATATACAATTAT 125 137 131

A984-»G (Xbal) AS-Xbal-WT AS-Xhal-MT Xbal-F JOE - TGCAATGCTCATCCCAACTAT JOE - AAATTCACAGATACCAATGCTCATCCCAACTGC ACTGATATCCAGGGTTATG7GG 174 186 180

COL1A1 G2046->T AS-COL-WT AS-COL-MT COL-R JOE - ggaccccacctgcccagggaattg JOE - ГААТААСААITTCCACCCCACCTGCCCAGGGAATCT GAAATAААААССАСAGGGTGAGAGGGGG РЗ 185 180 | 72 С - 5 мин

14- уникальное лля каждой мутации обозначение) и общего, среднее значение - в реакции с праймерами Л.Ч-1К)-МТ и общего, нижнее значение -размер соответствующего маркера длины. Жирным шрифтом в последовательностях праймеров обозначены нуклеотиды, соответствующие «нормальному» или *<мутантному» нуклеотиду ДНК-матрицы, подчеркиванием выделены нуклеотиды. некомплементарные ДНК-матрице.

продукту длиной 174 п.н., расположенный слева от маркера длины размером 180 п.н. (рис. 5, А). В случае ДНК гомозиготной по аллелю И98С пик соответствующего ПЦР-продукта (187 п.н.) наблюдается справа от маркера длины (рис. 5, Б). Пики обоих ПЦР-продутов (174 п.н. и 187 п.н.) наблюдаются по обе стороны от маркера длины в случае ДНК гетерозиготной по данному аллелю (рис. 5, В).

íL i '.А.. .....i А

.L . .-А—........: —^ 1ч* ,г. ... á ........

24 26 28 30 32 34 36 » 1 <

:,L, i j¡ , . j tí И 1 A:

..AAnjJU" - •: ■ ,¡ :

24 26

28 30 32

Время анализа, мин

Рис. 5. Электрофореграммы разделепия продуктов АС-ПЦР, полученных при анализе полиморфизма М235Т в rene AGT, с помощью КЭ. Каналы регистрации ПЦР-продуктов и маркеров длины (обозначены стрелками) представлены отдельно. На верхних электрофореграммах представлены пики, образуемые маркерами длины, размер которых составляет 131, 180 и 239 п.н. На нижних - пики, соответствующие анализируемым продуктам АС-ПЦР. А. Разделение продуктов, полученных при анализе ДНК, гомозиготной по аллелю 1198Т гена AGT (длина продукта - 174 п.н.). Б. Анализ ДНК, гомозиготной по аллелю 1198С (длина продукта - 187 п.н.). В. Анализ ДНК, гетерозиготной по полиморфизму М235Т (длина продуктов - 174 п.н. и 187 п.н.).

5. Создание системы детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолат-редуктазы (677С->Т>, Факторов II (20210С-*А) и V (1691С—>А) свертываемости крови человека.' Г -

- На основе литературных данных были определены три наиболее значимые мутации для предрасположенности к различным патологиям системы свертываемости

крови, как например, тромбофилия, варикозная болезнь. Это нуклеотидные замены в генах метилентетрагидрофоЛатредукгазы (МТГФР) (677С >Т), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—>А) свертываемости крови.

Первым этапом работы, как и в случае мутаций в гене ангиотензино1 ена, явилось секвенирование фрагментов геномной ДНК, содержащих область с предполагаемыми мутациями. В результате секвенирования были найдены образцы ДНК с тремя возможными генотипами. Следующим этапом нашей работы была разработка аллель-специфических праймеров. Подобранные праймеры, размер образующихся продуктов АС-ПЦР и маркера длины, а также оптимальные условия циклирования приведены в Табл. 1.

При разработке систем для детекции этих трех мутаций мы попытались также создать систему для их детекции на основе мультиплексной П1Ц', предполагающей анализ нескольких полиморфизмов в одной пробирке, по аналогии с уже существующей мультиплексной системой для детекции двух мутаций - Gl691А гена фактора V и С677Т гена метилентетрагидрофодатредуктазы (Ulvik А. et al 1998) Тем не менее, оказалось, что проведение в одной пробирке трех АС-ПЦР не приводит к получению достоверно воспроизводимых результатов. Поэтому мы полагаем, что более надежной является такая стратегия детекции нескольких мутаций, при которой АС-ПЦР для каждой мутации проводится отдельно, а анализ продуктов нескольких АС-ПЦР проводится в одном капилляре.

На рис. 6 представлена электрофореграмма разделения в одном капилляре продуктов, полученных в результате двух или трех различных АС-ПЦР и смешанных перед нанесением на гель. На рис. 6, А представлена электрофореграмма, полученная при анализе ДНК, гетерозиготной по мутации С677Т гена МТГФР, гомозиготной по 20210G аллелю гена фактора II и гетерозиготной по мутации G1691A гена фактора V свертываемости крови. В этом случае наблюдаются два пика (125 п.н. и 138 п.н.), расположенные по обе стороны от маркера длины, размером 131 п.н.; один пик, соответствующий продукту реакции длиной 174 п.н. и расположенный слева от маркера длины размером 180 п.н., а также два пика (233 п.н. и 245 п.н.). расположенных по обе стороны от маркера, длиной 239 п.н . соответственно.

На основе разработанных тест-систем было создано три набора реагентов- для выявления мутации Gl691А (Leiden) в гене фактора V системы свертываемости крови

I < I

Рис. 6. Электрофореграммы одновременного разделения продуктов двух и трех различных АС-ПЦР в одном капилляре. Каналы регистрации ПЦР-продуктов и маркеров длины (обозначены стрелками) представлены отдельно. На верхних электрофореграммах представлены пики, образуемые маркерами длины, размер которых соответствует 131 п.н., 180 п.н и 239 п h. На нижних - пики, соответствующие анализируемым продуктам АС-ПЦР. А. Разделение продуктов, полученных при анализе ДНК, гетерозиготной по мутации С677Т гена МТГФР (длина продуктов - 125 п.н. и 138 п.н.), гомозиготной по 20210G аллелю гена фактора II (длина продукта - 174 п.н.) и гетерозиготной по мутации Leiden гена фактора V свертываемости крови (длина продуктов - 233 п.н. и 245 п.н.). Б. Анализ гетерозиготы по полиморфизму G45082A гена VDR (длина продуктов - 125 п.н. и 137 п.н.) и гомозиготы по аллелю 2046Т гена COL1A1 (длина продукта - 185 п.н.). В. Анализ гомозиготы по аллелю 938С гена ER (длина продута - 137 п.н.) и гетерозиготы по полиморфизму A984G гена ER (длина продуктов -174 п.н, и 186 п н.).

методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции для определения генотипа пациентов по Ф5 (АСП-Ф5Л), для выявления мутации G20210 в гене протромбина человека методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции для определения генотипа пациентов по протромбину (АСП-ПР), а также для выявления мутации С677Т в гене метилентетрагидрофалатредуктазы человека методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции для определения i енотипа пациентов по МТГФР (АСП-МТГФР). Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ.

6. Создание системы детекции нуклеотидных >амен в генах al-коллагена чипа 1 (2046G—»Т>, рецептора витамина D3 (45082С->А) и эстрогенового рецептора a человека (938Т—С и 984А >G1.

На основе литературных данных были определены четыре наиболее значимые мутации для предрасположенности к остеопорозу. Это нуклеотидные замены в i енах al-коллагена типа 1 (COL1A1) (2046G-+T), рецептора витамина D3 (VDR) (45082G >А) и эстрогенового рецептора a (ER) человека (938Т—>С и 984A-^G).

Подобранные праймеры, размер образующихся продуктов АС-ПЦР и маркера длины, а также оптимальные условия циклирования приведены в Табл. 1.

При оптимизации условий АС-ПЦР для детекции мутации G2046- >T в гене COLI Al был проведен ряд полимеразных цепных реакций, в ходе которых варьировались температура отжига праймеров (55-68°С), время элонгации цепи (30-60 с), концентрации праймеров (10-30 пмоль), ферменты (Taq ДНК-полимераза, AmpliTaqGold ДНК-полимераза и Taq Platinum ДНК-полимераза). Поскольку, при оптимизации условий циклирования продукты АС-ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2 % агарозе, то АС-ПЦР проводили в варианте двух параллельных реакций, а не одной, как в случае капиллярного электрофореза, в одной из которых использовали праймеры AS-COL-WT и общий COL-R, а в другой - AS-COL-MT и COL-R.

Во время отработки условий ПЦР выяснилось, что использование AmpliTaqGold ДНК-полимеразы, которая позволяет предотвратить неспецифический отжиг праймеров и образование низкомолекулярных побочных продуктов во мног их случаях, в реакции с праймерами AS-COL-MT и общим в диапазоне температур 55-62°С не приводит к образованию целевого продукта. Вероятно, это связано с тем, что при первичном прогревании реакционной смеси до 95°С в течении 12 минут (такие условия необходимы для активации AmpliTaqGold ДНК-полимеразы), нужный участок ДНК меняет конформацию и препятствует работе фермента. Также есть вероятность того, что какой либо из используемых в реакции праймеров може1 ингибировать работу этой ДНК-полимеразы. Поэтому в дальнейшей работе использовали обычную Taq ДНК-полимеразу. Кроме того, время предварительной денатурации было увеличено до 5 минут вместо 2, поскольку амплифицируемая область является GC-богатой. Оптимальными были признаны следующие условия.

95°С - 5 мин, следующие 30 циклов: 95°С - 40 с, 65°С - 30 с, 72°С - 30 с; 72°С - 5 мин. Использование Тещ ДНК-полимеразы позволяет получить однородный целевой продукт необходимой длины, но при этом образуется значительное количество низкомолекулярных побочных продуктов (рис. 7, дорожки 1-10), что допустимо, но может затруднить интерпретацию результатов. Для того чтобы избежать образования низкомолекулярных продуктов, был использован еще один фермент - 'Гад Р1аШшт ДНК-полимераза, который состоит из Тад ДНК-полимеразы и смеси антител, специфически ингибирующих ее активный центр при температурах ниже 50°С. Реакцию проводили при условиях циклирования, оптимальных для обычной Гад ДНК-полимеразы. Использование этого фермента позволило получить однородный целевой продукт и полностью избавиться от побочных низкомолекулярных продуктов (рис. 7, дорожки 11-20).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Рис. 7. Электрофореграмма разделения в 2 %-ном агарозном геле ПЦР-фрагмснтов, содержащих предполагаемую мутацию G2146->T, полученных в результате проведения реакции с Taq ДНК-полимеразой (дорожки 1-10) и Taq Platinum ДНК-полимеразой (дорожки 11-20) Фрагменты, полученные в результате использования праймеров AS-COL-WT и COL-R, анализируются в нечетных с 1 по 19 дорожках, а праймеров AS-COL-MT и COL-R - в четных со 2 по 20 дорожках В качестве матриц использовались образцы ДНК гетерозиготы (дорожки 1-2, 7-8, 11-12, 17-18), гомозиготы «нормальной» (дорожки 5-6, 15-16) и гомозиготы «мутантной» (дорожки 3-4, 13-14) Дорожки 9-10 и 19-20 - контроль чистоты реагентов (реакции без добавления ДНК) Дорожка 21 маркер длины pUC 1%/Mspl, фрагменты которого имеют длину (см сверху вниз) - 501, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 67 п.н. Стрелкой обозначено местоположение на электрофореграмме целевых продуктов АС-ПЦР, длиной 173 и 185 п.н.

Электрофореграммы разделения продуктов АС-ПЦР в одном капилляре, полученных при анализе по одному полиморфизму в генах COLI AI и VDR, а также двух полиморфизмов в гене ER представлены на рис 6, Б и В, соответственно.

7. Исследование влияния способов выделения геномной ДНК на точность идентификации мутаций.

Используемая в ПЦР ДНК-матрица не должна содержать примесей (белков, полисахаридов и низкомолекулярных веществ), способных ингибировать действие ДНК-полимеразы, поскольку их наличие может приводить к неоднозначным и 1рудно интерпретируемым результатам. В случае АС-ПЦР, где праймеры содержа! некомплементарные матрице нуклеотиды, требования к качеству препарата амплифицируемой ДНК достаточно высоки. Поэтому, в настоящей работе было уделено отдельное внимание подбору оптимального способа выделения ДНК.

Были исследованы несколько вариантов пробоподготовки:

1. Методы выделения ДНК, основанные на использовании сорбентов нуклеиновых кислот (набор реактивов DIAfow™ DNA Prep 100 ( НПФ "Биоком", г. Москва) и набор реактивов для выделения ДНК (НПФ "Медиген", г. Новосибирск).

2. Метод, основанный на использовании сорбента Chelex 100.

3. Метод выделения ДНК, основанный на фенольной экстракции с использованием протеиназы К.

Преимуществом методов 1 и 2 является небольшая продолжительность выделения ДНК (не более 2 часов). В случае фенольной экстракции (метод 3) затраченное время составляет около 4 часов. Следует отметть, что при проведении АС-ПЦР с образцами ДНК, выделенными с использованием сорбента Chelex 100 (метод 2), иногда наблюдались ложноотрицательные результаты (рис. 8, дорожка 13). Вероятно, это связано с тем, что ДНК, выделенная этим способом, имеет низкую концентрацию и недостаточную чистоту для проведения АС-ПЦР. При использовании в реакции образцов ДНК, выделенных методами 1 и 3, результаты АС-ПЦР были воспроизводимыми в обоих случаях (рис. 8, дорожки 1-10), но образование более однородного продукта наблюдалось в реакциях с образцами ДНК, выделенными методом, основанном на использовании фенольной экстракции (рис. 8, дорожки 1-6).

Таким образом, в рамках нашей работы для выделения ДНК применяли метод фенольной экстракции с использованием протеиназы К, т.к. выделенная таким образом ДНК позволяет получить воспроизводимые и однозначно интерпретируемые результаты АС-ПЦР.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис. 8. Электрофореграмма разделения в 2 %-ом агарозном геле продуктов АС-ПЦР, полученных в результате анализа мутации С677Т в гене МТГФР Фрагменты, полученные в результате использования праймеров AS-MTIIFR-WT и MTHFR-R, анализируются в нечетных дорожках с 1 по 15, а праймеров AS-MTHFR-MT и MTHFR-R - в четных дорожках со 2 по 16 Разделение ПЦР-продуктов, полученных при анализе ДНК, выделенной при использовании протеиназы К и фенол ьной экстракции, представлено в дорожках 1-6, выделенной с помощью метода, основанного на сорбции нуклеиновых кислот - дорожки 7-10, выделенной с помощью Chelex 100 дорожки 11-14 Во всех трех случаях выделения в качестве матриц использовались одни и те же образцы ДНК гетерозиготы (дорожки 1-2, 7-8, 11-12), гомозиготы «мугантной» (дорожки 3-4, 9-10, 13-14) и гомозиготы «нормальной» (дорожки, 5-6) Дорожки 15-16 - контроль чистоты реагентов (реакции без добавления ДНК) Дорожка 17 - маркер длины pUC18/MspI, фрагменты которого имеют длину (см сверху вниз) - 501, 404, 331, 242,190,147,111, 67 п н Стрелкой обозначено местоположение целевых продуктов АС-ПЦР, длиной 125 и 138 п н

Таким образом, предлагаемая нами технология детекции мутаций на основе АС-ПЦР с применением капиллярного электрофореза включает в себя стадию выделения геномной ДНК, АС-ПЦР и анализ продуктов реакции с помощью автоматического анализатора на основе капиллярного электрофореза К преимуществам разработанной технологии можно отнести:

1. Генотипированне в одну стадию, исключающее постреакционную обработку ПЦР-продуктов.

2. Возможность детекции всех типов нуклеотидных замен и получение информации не только об их наличии в ДНК, но также и об их гомо- или гетерозиготноста.

3. Высокая производительность и быстрота за счет использования автоматических анализаторов ДНК.

4. Надежность и наличие внутреннего положительного контроля за счет того, что во время АС-ПЦР в одной пробирке протекают сразу две реакции, при этом одна из них должна пройти обязательно.

5. Однозначность интерпретации результатов анализа за счет использования маркера длины, расположенного между двумя возможными продуктами амплификации.

В рамках данной работы было разработано 10 систем для выявления точечных нуклеотидных замен в геномной ДНК человека на основе аллель-специфической ПЦР с применением капиллярного электрофореза для разделения продуктов АС-ПЦР.

При использовании данных систем было обследовано 139 беременных женщин с неосложненным течением беременности и с гестозом различной степени тяжести, наблюдавшихся и проходивших лечение в НЦ АГиП РАМН (г. Москва) на наличие мутаций в гене ангиотензиногена, метилентеграгидрофолатредуктазы, факторов II и V свертываемости крови А также, 130 больных с остеопорозом, наблюдавшихся в медицинском центре ОАО "Медицина" (г. Москва) и ГУНЦИТО им Н Н. Приорова (г Москва) на наличие мутаций, ответственных за предрасположенность к остеопорозу.

Результаты анализа нуклеотидных замен с помощью разработанных систем были выборочно подтверждены методом прямого секвепирования предварительно амплифицированных фрагментов ДНК, содержащих области с предполагаемыми мутациями, что свидетельствует о надежности разработанных систем.

ВЫВОДЫ

1. Разработана общая технология детекции мутаций в геномной ДНК на основе АС-ПЦР с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе капиллярного электрофореза.

2. Разработана общая методология конструирования аллель-специфических праймеров, позволяющая проводить анализ продуктов АС-ПЦР с помощью капиллярного электрофореза.

3. Разработаны тест-системы для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов И (2021 ОС—>А) и V (169Ш-*А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Г, Т174М, (¡(-6)А в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах а 1 -коллагена типа 1 (20460—►Т), рецептора витамина Ш (450820—>А), эегрогенового рецептора а (938Т-»С и 984А-^0).

4. Созданы наборы реагентов АСП-МТГФР, АСП-ПР и АСП-Ф5Л для детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G- >А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, соответственно. Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ.

5. При использовании разработанных тест-систем обследовано 139 беременных женщин с неосложненным течением беременности и с гестозом различной степени тяжести и 130 больных с остеопорозом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ванюшева О.В.. Шилов И.А., Карягина A.C., Файзуллин JI.3., Сухих Г.Т., Швец В.И. Разработка технологии идентификации аллелей однонуклеотидных полиморфных маркеров на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК // Биотехнология. 2005. № 4. С. 20-28.

2. Vanvusheva О.У., Shilov I.A., Karyagina A.S. Elaboration and usage of AS-PCR method for detection the Splpolymorphysm in collagen type I al gene, BsmI polymorphism in vitamin D receptor gene, and Xbal and PvuII polymorphisms in estrogen receptor a gene in women with postmenopausal osteoporosis // European J. Human Genetics. 2004. V. 12. Suppl. 1. P. 270.

3. Vanvusheva O.V. Shilov I.A., Karyagina A.S. Elaboration and usage of point mutation detection technology based on AS-PCR using automated DNA analyzer // European J. Human Genetics. 2005. V. 13. Suppl. 1. P. 360.

4. Ванюшева O.B.. Шилов И.А., Карягина A.C. Технология детекции точечных нуклеотидных замен на основе аллель-специфической ПЦР с применением капиллярного электрофореза // Материалы всероссийской науч.-практич. конференции «Окружающая среда и здоровье». Суздаль. 2005. С. 331-332.

5. Ванюшева О .В. Разработка системы детекции точечных мутаций на основе технологии аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК // Тезисы III Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». 2003. Москва. С. 30-31.

6. Mourachko L.E., Faisulin L.S., Ahmedova E.M., Mourachko A.V., Badoeva F.S., Sukhih G.T, Vanjusheva O.V.. Cvetkova T.N., Demchinskaya A.V., Karyagina A.S , Shilov I.A. C677T MTHFR mutation influence on homocysteine serum level and haemostasis in patients with physiological and gestosis pregnancy // J. Hungarian Family - friendly Society and Society of Pathophysiology of Pregnancy. 2002. Spccial ed.P.33.

7. Mourachko A.V., Faisulin L.S., Ahmedova E.M., Shilov I.A., Karyagina A S, Vanjusheva O.V. Methyltetrahydrofolate reductase C677T mutation rate in pregnant with varicose veins // J. Hungarian Family - friendly Society and Society of Pathophysiology of Pregnancy. 2002. Special ed. P. 34.

8. Кулаков В.И., Мурашко A.B., Файзуллин JI.3., Шилов И.А., Цветкова Т.Н., Карягина А.С., Разумихин М.В., Ванюшева О.В. Генетическая предрасположенность к варикозной болезни у беременных: возможное подтверждение? // Проблемы беременности. 2003. №7. С. 31 -35.

9. Мурашко JI.E., Ахмедова Е.М., Бадоева Ф.С., Сухих Г.Т., Файзуллин Л.З., Ванюшева О.В., Карягина А.С., Шилов И.А. Тромбофилические мутации и гипергомоцистеинемия у женщин с гестозом // Проблемы беременности. 2002. №6. С. 44-48.

10. Шилов И.А., Карягина А.С., Ванюшева О.В.. Цветкова Т.Н., Файзуллин Л.З., Ахмедова Е.М., Бадоева Ф.С, Мурашко JI.E., Сухих Г.Т. Исследование генетического полиморфизма метилентетрагидрофолатредуктазы у женщин с нормальным течением беременности и гестозом // Сб. трудов научно-практического симпозиума "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" Москва. 2002. С. 57-58.

11. Сухих Г.Т, Файзуллин J1.3., Ахмедова Е.М., Бадоева Ф.С., Казарян Л.М., Мурашко JI.E., Ванюшева О.В.. Цветкова Т.Н., Демчинская А.В., Карягина А.С.. Шилов И.А. Роль мутаций в генах, контролирующих различные функции системы кровообращения, в развитии гестоза // «Мать и дитя»: Материалы IV Российского форума. Москва. 2002. Т. 1. С. 589-590.

12. Сухих Г.Т., Мурашко JI.E., Ахмедова Е.М, Бадоева Ф.С., Файзуллин Л.З., Ванюшева О.В.. Цветкова Т.Н., Карягина А.С., Шилов И А. Влияние мутации С677Т в гене фермента 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы на риск развшия

тяжелых форм гестоза // «Мать и дитя»: Материалы V Российского форума. Москща. 2003. С. 228-229.

Ванюшева Ольга Владимировна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ЛИЦЕНЗИЯ ПД № 00608

Формат 60x84/16. 1,63 усл. п.л. Бумага офсетная 80 гр. Тираж 100 экз. Заказ №146

Отпечатано с готовых о/м в типографии ООО «Медина-Принт» ул. Новослободская д. 14/19 стр. 5 тел./факс: 787-62-21

"1 759J

РНБ Русский фонд

2006-4 16768

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Ванюшева, Ольга Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Роль точечных мутаций в патогенезе заболеваний человека и современные методы их детекции. (Литературный обзор).

1.1. Роль точечных мутаций в патогенезе различных заболеваний человека.

1.1.1. Мутации в генах факторов II, V свертываемости крови, метилентетрагидро-фолатредуктазы человека и их связь с предрасположенностью к тромбозам и гипергомоцистеинемии.

1.1.2. Мутации в гене ангиотензиногена человека и их связь с предрасположенностью к первичной гипертонии и преэклампсии.

1.1.3. Мутации в генах рецептора витамина D3, al-коллагена типа 1, эстрогенового рецептора а человека и их связь с предрасположенностью к остеопорозу.

1.2. Современные методы детекции точечных мутаций.

1.2.1. Метод детекции точечных мутаций, основанный на удлинении праймера на один нуклеотид.

1.2.1.1. Анализ точечных мутаций с помощью капиллярного электрофореза.

1.2.1.2. Анализ точечных мутаций с помощью флуоресцентной поляризации.

1.2.1.3. Анализ точечных мутаций с помощью масс-спектрометрии.

1.2.2. Метод детекции точечных мутаций на основе полимсразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени.

1.2.3. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфического олигонуклеотидного лигирования.

1.2.4. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической гибридизации олигонуклеотидов.

1.2.5. Методы детекции точечных мутаций, основанные на анализе конформацион

Ф ного полиморфизма ДНК.

1.2.5.1. Гетеродуплексный анализ.

1.2.5.2. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов

1.2.6. Методы детекции точечных мутаций, основанные на использовании эндонуклеаз.

1.2.6.1. Аллель-специфический анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции.

1.2.6.2. Анализ с использованием эндонуклеаз, специфичных к неспаренным нуклеотидам в ДНК.

1.2.7. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической полимеразной цепной реакции.

1.3. Практическая реализация технологии детекции точечных мутаций.

1.3.1.11аборы реагентов, основанные на удлинении праймера на один нуклеотид.

1.3.2. Наборы реагентов, основанные на полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени.

1.3.3. Наборы реагентов, основанные на использовании аллель-специфической гибридизации олигонуклеотидов.

1.3.4. Наборы реагентов, основанные на использовании эндонуклеаз и ферментов репарации.

1.3.5. Наборы реагентов, основанные на аллель-специфической полимеразной цепной реакции.

ГЛАВА 2. Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК. (Обсуждение результатов).

2.1. Разработка методологии конструирования аллель-специфических праймеров для АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом.

2.2. Создание системы детекции мутаций в генах факторов II (G20210A), V (G1691 А) свертываемости крови и метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т) человека методом АС-ПЦР.

2.2.1. Идентификация генотипов методом секвенирования.

2.2.2. Дизайн праймеров и оптимизация условий АС-ПЦР.

2.2.3. Клонирование фрагментов геномной ДНК человека, содержащих области с предполагаемыми мутациями в генах факторов II (G20210A), V (G1691 А) свертываемости крови и метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т).

2.3. Создание системы детекции полиморфизмов М235Т, Т174М и G(-6)A в гене ангиотензиногена человека методом АС-ПЦР.

2.3.1. Идентификация генотипов методом секвенирования.

2.3.2. Дизайн праймеров и оптимизация условий АС-ПЦР.

2.4. Создание системы детекции нуклеотидных замен в генах al-коллагена типа I (G2046T), рецептора витамина D3 (G45082A) и эстрогенового рецептора a человека (Т938С и A984G) методом АС-ПЦР.

2.4.1. Идентификация генотипов методом секвенирования.

2.4.2. Идентификация полиморфизма G45082A в гене рецептора витамина D3 с помощью эндонуклеазы рестрикции Bsm I.

2.4.3. Дизайн праймеров и оптимизация условий АС-ПЦР.

2.5. Анализ продуктов АС-ПЦР с помощью автоматических анализаторов ДНК с флуоресцентной детекцией.

2.5.1. Флуоресцентные красители, используемые для мечения ДНК.

2.5.2. Известные системы для автоматического анализа ДНК с использованием флуоресцентной детекции (приборы и используемые флуорофоры). ф 2.5.3. Анализ мутаций в генах ангиотензиногена, факторов II и V свертываемости крови, метилентетрагидрофолатредуктазы, рецепторов витамина D3 и эстрогенового (а), а также al -коллагена типа I человека.

2.6. Влияние способов выделения геномной ДПК на точность идентификации мутаций.

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть.

3.1. Реактивы и материалы.

3.2. Приборы и методы.

3.3. Общие методики.

3.3.1. Выделение ДНК с использованием протеиназы К и фенольной экстракции.

3.3.2. Выделение ДНК с использованием набора реагентов DIAtom™DNA Prep\00 фирмы «Биоком».

3.3.3. Выделение ДНК с использованием набора реактивов фирмы «Медиген».

3.3.4. Выделение ДНК с использованием сорбента Chelex 100.

3.3.5. Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция.

3.3.6. Электрофорез в агарозном геле.

3.3.7. Электрофорез в полиакриламидном геле.

3.3.8. Капиллярный электрофорез.

3.3.9. Секвенирование ПЦР-фрагментов с использованием 32Р-меченых праймеров поСэнгеру.

3.3.10. Секвенирование ПЦР-фрагментов с использованием Су5-меченых терминаторов по Сэнгеру.

3.3.11. Приготовление стандартов длины.

3.3.12. Проведение ферментативных реакций. ф 3.3.13. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК.

3.3.14. Трансформация клеток Е. coli и анализ клонов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК"

Возникновение многих заболеваний человека обусловлено наследственной к ним предрасположенностью, которая в большинстве случаев вызвана точечными нуклеотидными заменами (мутациями) в геномной ДИК. Наличие мутации в гомозиготном состоянии, а также доминантной мутации в гетерозиготном состоянии вызывает образование мутантного фенотипа, что обуславливает возникновение патологии или предрасположенности к ней, как в случае мультифакториальных заболеваний, возникновение которых происходит в результате совокупного влияния мутациий во многих генах и факторов окружающей среды. Поскольку мутации, обуславливающие наследственную предрасположенность, содержатся в геномной ДНК каждой клетки организма на протяжении всей жизни, то посредством их диагностирования можно узнать о предрасположенности к патологии задолго до ее развития. Это может помочь либо совсем избежать ее проявления, либо уменьшить риск возникновения осложнений во время болезни, назначить индивидуальное лечение. Таким образом, детекция мутаций является одной из важных задач современной медицинской диагностики.

0 отнести: трудоемкость, наличие стадии пост-реакционной обработки продуктов амплификации (это способствует контаминации), долгое время анализа и низкую производительность. Кроме того, наиболее используемый в клинической диагностике метод первой группы, основанный на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, имеет существенные ограничения по применению, поскольку требует наличия сайта рестрикции в месте предполагаемой мутации. Методы второй группы являются более предпочтительными с точки зрения использования их в клинической практике, т.к. они позволяют проводить генотипирование в одну стадию, что сокращает время анализа и значительно упрощает анализ. Эти методы также являются малопроизводительными, что ограничивает их широкое применение. Кроме того, метод аллель-специфического олигонуклеотидного лигирования характеризуется низким выходом продукта реакции.

Таким образом, представляется актуальным разработка новых, удобных в эксплуатации, быстрых, высокопроизводительных и надежных методов детекции известных точечных мутаций в ДНК. ф Целью данной работы была разработка метода для клинического использования на основе аллель-специфической полимеразной цепной реакции с применением автоматических анализаторов ДНК.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ванюшева, Ольга Владимировна

выводы

3. Разработаны тест-системы для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)A в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах al-коллагена типа 1 (2046G—*Т), рецептора витамина D3 (45082G—>А), эстрогенового рецептора a (938Т->С и 984A->G).

4. Созданы наборы реагентов АСП-МТГФР, АСП-ПР и АСП-Ф5Л для детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, соответственно. Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Ванюшева, Ольга Владимировна, Москва

1. Bertina R.M., Koeleman В.Р., Koster Т., Rosendaal F.R., Dirven R.J., Ronde H., Velden P.A., Reitsma P.H. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance activated protein С // Nature. 1994. V. 369. P.64-67.

2. Rosendaal F.R., Koster Т., Vandenbroulke J.P., Reitsma P.H. High risk of thrombosis in patients homozygous for factor V Leiden (activated protein С resistance) // Blood. 1995. V. 85. P. 1504-1508.

3. Cohen D. Inherited thrombophilia and pregnancy: complications, diagnosis, and treatment // Am. Biotech. Lab. 2002. V. 4. P. 22-24.

4. Gerhardt A., Scharf R.E., Beckmann M.W., Struve S., Bender H.G., Pillny M., Sandmann W., Zotz R.B. Prothrombin and factor V mutations in women with a history of thrombosis during pregnancy and the puerperium // N. Engl. J. Med. 2000. V. 342. P. 374-80.

5. Lin J., August P. Genetic thrombophilias and preeclampsia: a meta-analysis // Obstet. Gynecol. 2005. V. 105. P. 182-192.

6. Hobikoglu G.F., Akyuz U., Akyuz F., Ozer O., Guney D., Narin A., Unaltuna N. Factor V Leiden is a risk factor for myocardial infarction in young Turkish men // Acta. Cardiol. 2004. V. 59. P. 594-597.

7. Seligsohn U., Lubetsky A. Genetic susceptibility to venous thrombosis // N. Eng. J. Med. 2001. V. 344. P. 1222-1231.

8. Gadelha Т., Andre C., Juca A.A., Nucci M. Prothrombin 2021 OA and oral contraceptive use as risk factors for cerebral venous thrombosis // Cerebrovasc. Dis. 2005. V. 19. P. 49-52.

9. McGlennen R.C., Key N.S. Clinical and laboratory management of the prothrombin G20210A mutation //Arch. Pathol. Lab. Med. 2002. V. 126. P. 1319-1325.

10. Botto L.D., Yang Q. 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase gene variants and congenital anomalies: a huge review // Am. J. Epidemiol. 2000. V. 151. P. 862-877.

11. Park H., Kim Y.J., На E.H., Kim K.N., Chang N. The risk of folate and vitamin В (12) deficiencies associated with hyperhomocysteinemia among pregnant women // Am. J. Perinatol. 2004. V. 21. P. 469-475.

12. Kang S.S., Wong P.W., Bock II.G., Horwitz A., Grix A. Intermediate hyperhomocysteinemia resulting from compound heterozygosity of methylenetetrahydrofolate reductase mutations // Am. J. Hum. Genet. 1991. V. 48. P. 546-551.

13. Shen H., Newmann A.S., Hu Z., Zhang Z., Xu Y., Wang L., Ни X., Guo J., Wang X., Wei O. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms/haplotypes and risk ofgastric cancer: a case-control analysis in China // Oncol. Rep. 2005. V. 13. P. 355-360.

14. Rang S.S., Wong P.W., Susmano A., Sora J., Norusis M., Ruggie N. Thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase: an inherited risk factor for coronary artery disease // Am. J. Hum. Genet. 1991. V. 48. P. 536-545.

15. Grody W.W., Telatar M. Multiplex SNP analysis: screening factor V R506Q (Leiden) mutations //Am. Biotech. Lab. 2003. V. 2. P. 34-37.

16. Liew M., Pryor R., Palais R., Meadows C., Erali M., Lyon E., Wittwer C. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons // Clin. Chem. 2004. V. 50. P. 1156-1164.

17. Чистяков Д.А., Чугунов Jl. А., Шамхалова М.Ш., Шестакова М.В., Миленькая Т.М. Полиморфизм гена сосудистого рецептора ангиотензиногена II и микроангиопатии при инсулинзависимом сахарном диабете // Генетика. 1999. Т. 35. С. 1289-1293.

18. Jeunemaitre X., Soubrier F., Kotelevtsev Y., Liflon R., Williams C., Charru A. Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen // Cell. 1992. V. 71. P. 169-180.

19. Марри P., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: в 2-х томах. Т. 2. Пер. с англ. // М.: Мир. 1993.415 с.

20. Walker W., Whelton P., Saito IL, Russel R. Relation between blood pressure and renin, renin substrate, angiotensin II, aldosterone and urinary sodium and potassium in 574 ambulatory subjects // Hypertension. 1979. V. 1. P. 287-291.

21. Kang S.S., Wong P.W., Susmano A., Sora J., Norusis M., Ruggie N. Thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase: an inherited risk factor for coronary artery disease // Am. J. Hum. Genet. 1991. V. 48. P. 536-545.

22. Schunkert H., Hense II., Gimenez-Roqueplo A., Stieber J., Keil U. The angiotensinogen T235 variant and the use of antihypertensive drugs in a population-based cohort // Hypertension. 1997. V. 29. P. 628-633.

23. Staessen J., Ginocchio G., Wang J., Saavedra A., Soubrier F., Vlietinck R., Fagard R. Genetic variability in the renin-angiotensin system: prevalence of alleles and genotypes // J. Cardiovask. Rise. 1997. V. 4. P. 401-422.

24. Schunkert H., Hense H.W., Gimenez-Roqueplo A.P., Stieber J., Keil U., Riegger G.A., Jeunemaitre X. The angiotensinogen T235 variant and the use of antihypertensive drugs in a population-based cohort. // Hypertension. 1997. V. 29. P. 628-633.

25. Shoji M., Tsutaya S., Takamatu H., Yasujima M. Hypertension and gene polymorphisms // Rinsho. Byori. 2001. V. 49. P. 157-160.

26. Jeunemaitre X., Inoue I., Williams C.,Tichet J., Powers M. Ilaplotypes of angiotensinogen in essential hypertension // Am. J. Hum. Genet. 1997. V. 60. P. 1448-1460.

27. Sasaki N. The relationship of salt intake to hypertension in the Japanese // Geriatrics. 1964. V. 19. P. 735-744.

28. Caul field M., Lavender P., Newell-Price J., Farrall M., Kamdar S. Linkage of the angiotensinogen gene locus to human essential hypertension in African Caribbeans // J. Clin. Invest. 1995." V. 96. P. 687-692.

29. Mondry A., Loh M., Liu P., Zhu A.L., Nagel M. Polymorphisms of the insertion/deletion ACE and M235T AGT genes and hypertension: surprising new findings and meta-analysis of data // BMC Nephrol. 2005. V. 6. P. 1-11.

30. Caulfield M., Lavender P., Farrall M., Munroe, P., Lawson M., Turner P., Clark A. Linkage of the angiotensinogen gene to essential hypertension // New Eng. J. Med. 1994. V. 330. P. 1629-1633.

31. Fardella C., Zamorana P., Mosso L., Gomes L., Pinto M., Soto J. A(-6)G variant of angiotensinogen gene and aldosterone levels in hypertensives // Hypertension. 1999. V. 34. P. 779-81.

32. Yanai К., Nibu Y., Murakami K., Fukamizu A. A cis-acting DNA located between TATA box and transcription initiation site is critical in response to regulatory sequence in human angiotensinogen gene//J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 15981-15986.

33. Morishita R., Higaki J., Tomita N., Aoki M., Moriguchi A., Tamura K. Role of transcriptional cis-elements? Angiotensinogen gene-activating elements, of fngiotensinogen gene in blood pressure regulation // Hypertension. 1996. V. 27. P. 502-507.

34. Ward К., I lata A., Jeunemaitre X., Helin C., Nelson L., Namikawa C., Farrington P. A molecular variant of angiotensinogen associated with preeclampsia // Nature Genet. 1993. V. 4. P. 59-61.

35. Arngrimsson R., Purandare S., Connor M., Walker J., Bjornsson S., Soubrier F. Angiotensinogen: a candidate gene involved in preeclampsia? (Letter) // Nature Genet. 1993. V. 4. P. 114-115.

36. Morgan L., Baker F., Pipkin F., Kalsheker N. Pre-eclampsia and the angiotensinogen gene//Br. J. Obstet. Gynaecol. 1995. V. 102. P. 489-490.

37. Bouba I., Makrydimas G., Kalaitzidis R., Lolis D.E., Siamopoulos K.C., Georgiou I. Interaction between the polymorphisms of the renin-angiotensin system in preeclampsia // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2003. V. 110. P. 8-11.

38. Chesley L., Cooper D. Genetics of hypertension in pregnancy: possible single gene control of pre-eclampsia in the descendants of eclamptic women // Br. J. Obstet. Gynaecol. 1990. V. 97. P. 762-769.

39. Ikedife D. Eclampsia in multipara // BMJ. 1980. V. 1. P. 985-986.

40. Tornton J., Onwude J. Pre-eclampsia: discordance among identical twins // BMJ. 1991. V. 303. P. 1241-1242.

41. Pipkin F., Roberts J. Hypertension in pregnancy // J. Hum. Hypertens. 2000. V. 14. P. 705-724.

42. Morgan Т., Craven C., Ward K. Human spiral artery renin-angiotensin system // Hypertension. 1998. V. 32. P. 683-687.

43. Morgan J., Craven C., Nelson L., Lalouel J.M., Ward K. Angiotensinogen T235 expression is elevated in decidual spiral arteries // J. Clin. Invest. 1997. V. 100. P. 1406-1415.

44. Brenner D., Labreuche J., Poirier O., Cambien F., Amarenco P. Renin-angiotensin-aldosterone system in brain infarction and vascular death // Ann. Neurol. 2005. V. 58. P. 131-138.

45. Kiema T.R., Kauma H., Rantala A., Lilja M., Reunanen A. Variation at the angiotensin-converting enzyme gene and angiotensinogen gene loci in relation to blood pressure // Hypertension. 1996. V. 28. P. 1070-1075.

46. Guo G., Wilton A., Fu Y., Qui H., Brennecke S. Angiotensinogen gene variation in a population case-control study of preeclampsia/eclampsia in Australians and Chinese // Electrophoresis. 1997. V. 18. P. 1646-1649.

47. Риггз Б.Л., Мелтон Л.Д. Остеопороз: этиология, диагностика, лечение // М.: Невский диалект. Бином. 2000. 560 с.

48. Eisman J.A. Genetic of osteoporosis // Endocrine Rew. 1999. V. 20. P. 788-804.

49. Stewart T.L., Ralston S.H. Genetic of osteoporosis // J. Endocrinol. 2000. V. 166. P. 235-245.

50. Ilaussler M.R. Vitamin D receptors: nature and function // Annu. Rev. Nutr. 1986. V. 6. P. 527-562.

51. Morrison N.A., Qi J.C., Tokita A. Contribution of trans-acting factors alleles to normal physiological variability: vitamin D receptor gene polymorphism and circulating osteocalcin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 6665-6669.

52. Farrow S. Allelic variations of vitamin D receptor II Lancet. 1994. V. 343. P. 1242.

53. Gross C., Krishnan A.V., Malloy P.J., Eccleshall T.R., Zhao X.Y., Feldman D. The vitamin D receptor gene start codon polymorphism: a functional analysis of Fokl variants // J. Bone Miner. Res. 1998. V. 13. P. 1691-1699.

54. Morrison N.A., Qi J.C., Tokita A., Kelly P., Crofts L., Nguyen T.V., Sambrook P. N., Eisman J. A. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles // Nature. 1994. V. 367. P. 284-287.

55. Ingles S.A., Ross R.K., Yu M.C., Irvine R.A., La Pera G., Haile R.W., Coetzee G.A // J. Natl. Cancer Institute. 1997. V. 89. P. 6-10.

56. Кольман Я., Рем К. -Г. Наглядная биохимия // М: Мир. 2000. 322 с.

57. Grant S.F., Reid D.M., Blake G., Herd R., Fogelman I., Ralston S.T. Reduced bone density and osteoporosis associated with a polymorphic Spl binding site in the collagene type Ial gene // Natur. Genet. 1996. V. 14. P. 203-205.

58. Qureshi A.M., McGuigan F.E., Seymour D.G., Hutchison J.D., Reid D.M., Ralston S.H. Association between COLIA1 Spl Alleles and femoral neck geometry // Calcif. Tissue Int. 2001. V. 69. P. 67-72.

59. Weichetova M., Stepan J.J., Michalska D., Haas Т., Pols I LA., Uitterlinden A.G. COLIA1 Polymorphism contributes to bone mineral density to assess prevalent wrist fractures // Bone. 2000. V. 26. P. 287-290.

60. Liden M., Wilen В., Ljunghall S., Melhus H. Polymorphism at th Spl binding site in the COLIA1 gene does not predict bone mineral density in postmenopausal women in Swedish // Calcif. Tissue Int. 1998. V. 63. P. 293-295.

61. Sano M., Inoue S., Hosoi Т., Ouchi Y., Emi M., Shiraki M., Orimo II. Association of estrogen receptor dinucleatide polymorphism with osteoporosis // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1995. V. 217. P. 378-383.

62. Kobayashi S., Inoue S., Hosoi Т., Shiraki M., Orimo H. Association of bone mineral density with polymorphisms of the estrogen receptor gene in post-menopausal women // J. Bone Miner. Res. 1996. V. 11. P. 306-311.

63. Sowers M., Willing M., Burns Т., Deschenes S., Hollis В., Crutchfield M., Jannausch M. Genetic markers, bone mineral density and serum osteocalcin levels // J. Bone Miner. Res. 1999. V. 14. P. 1411-1419.

64. Gennari L., Becherini L., Masi L., Gonneli S., Cepollaro C., Martini S.,u

65. Montagnani A., Lentini G., Becorpi A.M., Brandi M. L. Vitamin D and estrogen receptor allelic variants, in Italian Postmenopausal women: evidence of multiple gene contribution to bone mineral density // J. Clin. Endocrin. Metab. 1998. V. 83. P. 933-944.

66. Barros E.R., Kasamatsu T.S., Ramalho A.C., Hauache O.M., Vieira J.G., Lazaretti-Castro M. Bone mineral density in young women of the city of

67. Sao Paulo, Brazil: correlation with both collagen type I alpha 1 gene polymorphism and clinical aspects // Brazilian J. Med. And Biol. Res. 2002. V. 35. P. 885-893.

68. Langdahl B.L., Gravholt C.H., Brixen K., Eriksen E.F. Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and bone mass, bone turnover and osteoporotic fractures // Eur. J. Clin. Invest. 2000. V. 30. P. 608-617.

69. Kikuchi R., Uemura Т., Gorai I., Ohno S., Minaguchi H. Early and late postmenopausal bone loss is associated with BsmI vitamin D receptor gene polymorphism in Japanese women // Calcif. Tissue Int. 1994. V. 64. P. 102-106.

70. Sokolov B.P. Primer extension technique for the detection of single nucleotide in genomic DNA //Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 3671.

71. Sanchez J.J., Borsting C., Morling N. Typing of Y chromosome SNPs with multiplex PCR methods // Methods Mol. Biol. 2005. V. 297. P. 209-228.

72. Ben-Avi L., Durst R., Shpitzen S., Leitersdorf E., Meiner V. Apolipoprotein E genotyping: accurate, simple, high throughput method using ABI Prism SNaPshot Multiplex System // J. Alzheimers Dis. 2004. V. 6. P. 497-501.

73. Ilina E.N., Malakhova M.V., Generozov E.V., Nikilaev E.N., Govorun V.M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (mass spectrometry) for hepatitis С virus genotyping // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. P. 2810-2815.

74. Li J., Butler J.M., Tan Y., Lin H., Royer S. Single nucleotide polymorphism determination using primer extension and time-of-flight mass spectrometry // Electrophoresis. 1999. V. 20. P. 1258-1265.

75. Ross P., Hall L., Smirnov I., Ilaff L. High level multiplex genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry // Nat. Biotech. 1998. V. 16. P. 1347-1351.

76. Xiao M., Phong A., Lum K., Greene R., Buzby P., Kwok P.-Y. Role of excess inorganic pyrophosphate in primer-extension genotyping assays // Genome Res. 2004. V. 14. P. 1749-1755.

77. Kornher J.S., Livak K.J. Mutation Detection using nucleotide analogs that alter electrophoretic mobility // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 7779-7784.

78. Syvanen A.C., Aalto-Setala K., Ilaiju L., Kontula K., Soderlund H. A primer-guided nucleotide incorporation assay in the genotyping of apolipoprotein E // Genomics. 1990. V. 8. P. 684-692.

79. Lee J.S., Anvret M. Identification of the most common mutation within the porphobilinogen deaminase gene in Swedish patients with acute intermittent porphyria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 10912-10915.

80. Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing // Genome Res. 2001. V. 11. P. 3-11.

81. Ahmadian A., Gharizadch В., Gustafsson A.C., Sterky F., Nyren P., Uhlen M., Lundeberg J. Single nucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing // Anal. Biochem. 2000. V. 280. P. 103-110.

82. Wilde J.T., O'Sullivan J.J., Roper J.L., Aerts P., Horowitz M., Navot N. A novel ELISA-based primer extension assay for the detection of the factor V Leiden mutation // British J. Haematology. 1999. V. 106. P. 427.

83. Andersen P.S., Jespersgaard C., Vuust J., Christiansen M., Larsen L.A. Capillary electrophoresis-based single strand DNA conformation analysis in high-throughput mutation screening // Hum. Mutat. 2003. V. 21. P. 455-465.

84. Marziali A., Akeson M. New DNA sequencing methods // Annu. Rev. Biomed. Eng.2001. V. 3. P. 195-223.

85. Kwok P.-Y. Methods genotyping single nucleotide polymorphisms // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001. V. 2. P. 235-258.

86. Chen X., Levine L., Kwok P.-Y. Fluorescence polarization in homogeneous nucleic acid analysis // Genome Res. 1999. V. 9. P. 492-498.

87. Greene R.A., DiMeo J.J., Malone M.E., Swartwout S., Liu J., Buzby P.R. Acyclo-prime, a novel method for SNP analysis using fluorescence polarization // Proc. SPIE.2002. V. 4626. P. 332-339.

88. Lyamichev V., Brow M.A., Dahlberg J.E. Structure specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases // Science. 1993. V. 260. P. 778-783.

89. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. V. 6. P. 986-994.

90. Alves A.M., Carr F.J. Dot blot detection of point mutations with adjacently hybridizing synthetic oligonucleotide probes //Nucl. Acids Res. 1988. V. 16. P. 8723.

91. Landegren U., Kaiser R., Sanders J., Hood L. A ligase-mediated gene detection technique // Science. 1988. V. 241. P. 1077-1080.

92. Sekiguchi J., Shuman S. Nick sensing by vaccinia virus DNA ligase requires a 5' phosphate at the nick and occupancy of the adenylate binding site on the enzyme // J. Virol. 1997. V. 71. P. 9679-9684.

93. Conner B.J., Reyes A.A. Detection of sickle cell beta S-globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 278-282.

94. Farr C.J., Saiki R.K., Erlich H.A., McCormick F., Marshall C.J. Analysis of ras gene mutations in acute myeloid leukemia by polymerase chain reactionand oligonucleotide probes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 1629-1633.

95. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 6230-6234.

96. Day I.N., O'Dell S.D., Cash I.D., Humphries S.E., Weavind G.P. Electrophoresis for genotyping: temporal thermal gradient gel electrophoresis for profiling of oligonucleotide dissociation // Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 2404-2412.

97. Dahlen P., Carlson J., Liukkonen L., Lilja H., Siitari H. Europium-labeled oligonucleotides to detect point mutations: application to PIZi-antitrypsin deficiency // Clin. Chem. 1993. V. 39. P. 1626-1631.

98. Tong D., Kucera E., Stimpfl M., Kolbl H., Leodolter S., Zeillinger R. Detection of p53 polymorphism at codon 72 by PCR and allele-specific oligonucleotide hybridization on microtiter plates // Clin. Chem. 2000. V. 46. P. 124-126.

99. Kozlowski P., Krzyzosialc W.J. Structural factors determining DNA length limitations in conformation-sensitive mutation detection methods // Electrophoresis. 2005. V. 26. P. 71-81.

100. Kleparnik K., Grochova D., Skopkova Z., Adam T. Detection of the major mutation M467T causing cystinuria by single-strand conformation polymorphism analysis using capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 57-64.

101. Esteban-Cardenosa E-, Duran M., Infante M., Velasco E., Miner C. High-throughput mutation detection method to scan BRCAI and BRCA2 based on heteroduplex analysis by capillary array electrophoresis // Clin. Chem. 2004. V. 50. P. 313-320.

102. Sozen M., Whittall R., Humphries S.E. Mutation detection in patients with familial hypercholesterolemia using heteroduplex and single conformation polymorphism analysis by capillary electrophoresis // Atherosclerosis Supplements. 2004. V. 5. P. 7-11.

103. Atha D.I I., Wenz H.M., Morehead 11., Tian J., O'Connell C.D. Detection of p53 point mutations by single strand conformation polymorphism: analysis by capillary electrophoresis//Electrophoresis. 1998. V. 19. P. 172-179.

104. Goodman M.F. DNA polymerase fidelity: misinsertions and mismatched extensions. In: Innis M.A. PCR strategies // San Diego: Academic Press. 1995. P. 17-31.

105. Arguello J.R., Little A.M., Pay A.L., Gallardo D., Rojas I., Marsh S.G., Goldman J.M., Madrigal J.A. Mutation detection and typing of polymorphic loci throughdouble-strand conformation analysis // Nat. Genet. 1998. V. 18. P. 192-194.ч

106. Kozlowski P., Krzyzosiak W.J. Combined SSCP/duplex analysis by capillary electrophoresis for more efficient mutation detection // Nucl. Acids Res. 2001. V. 29. P. e71.

107. Orita M., Suzuki Y., Sekiya Т., Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorohisms using the polymerase chain reaction // Genomics. 1989. V. 5. P. 874-879.

108. Hayashi K., Wenz H.M., Inazuka M., Tahira Т., Sasaki Т., Atha D.H. SSCP analysis of point mutations by multicolor capillary electrophoresis // Methods Mol. Biol. 2001. V. 163. P. 109-126.

109. Ellis L.A., Taylor C.F., Taylor G.R. A comparison of fluorescent SSCP and denaturing HPLC for high throughput mutation scanning // Hum. Mutat. 2000. V. 15. P. 556-564.

110. Tsang T.C., Bentley D.R., Nilsson I.M., Giannelli F. The use of DNA amplification for genetic counseling related diagnosis in haemophilia В // Thromb. Haemost. 1989. V. 61. P. 343-347.

111. Chen J., Viola M.V. A method to detect ras point mutations in small subpopulations of cells//Anal. Biochem. 1991. V. 195. P. 51-56.

112. Khan S.M., Jiang W., Culbertson T.A. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via "enriched" PCR amplification // Oncogene. 1991. V. 6. P. 1079-1083.

113. Zhao C., Xu G., Gao P., Yang J., Shi X., Tian J. Rapid identification of pathogenic bacteria by capillary electrophoretic analysis of rRNA genes // J. Separation Sci. 2005. V. 28. P. 513-521.

114. Ho H.-T., Chang P.-L., Hung C.-C., Chang H.-T. Capillaiy electrophoretic restriction fragment length polymorphism patterns for the Mycobacterial hsp65 gene // J. Clin. Microbiology. 2004. V. 42. P. 3525-3531.

115. Qiu P, Shandilya H, D'Alessio JM, O'Connor K, Durocher J, Gerard GF. Mutation detection using Surveyor nuclease // Biotechniques. 2004. V. 36. P. 702-707.

116. Till В., Burtner C., Comai L., Henikoff S. Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases // Nucl. Acids Res. 2004. V. 32. P. 2632-2641.

117. Marziali A., Akeson M. New DNA sequencing methods // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2001. V. 3. P. 195-223.

118. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 2503-2516.

119. Wu D.Y., Ugozzoli L., Pal B.K., Wallace R.B. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 2757-2760.

120. Sommer S.S., Cassady J.D., Sobel J.L., Bottema C.D. A novel method for detecting point mutations or polymorphisms and its application to population screening for carriers ofphenylketonuria//Mayo Clin. Proc. 1989. V. 64. P. 1361-1372.

121. Rust S., Funke H., Assmann G. Mutagenically separated PCR (MS-PCR): a highly specific one step procedure for easy mutation detection // Nucl. Acids Res. 1993. V. 21. P. 3623-3629.

122. Okayama H., Curiel D.T., Brantly M.L., Holmes M.D. and Crystal R.G. Rapid, nonradioactive detection of mutations in the human genome by allele-specific amplification//J. Lab. Clin. Med. 1989. V. 114. P. 105-113.

123. Gibbs R.A., Nguyen P.N., Caskey C.T. Detection of single DNA base differences by competitive oligonucleotide priming // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 2437-2448.

124. Chehab F.F., Kan Y.W. Detection of specific DNA sequences by fluorescence amplification: a color complementation assay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 9178-9182.

125. Kropp G.L., Fucharoen S., Embury S.H. Asymmetrically primed selective amplification/temperature shift fluorescence polymerase chain reaction to detect the hemoglobin constant spring mutation // Blood. 1991. V. 78. P. 26-29.

126. Li H., Cui X., Arnheim N. Direct electrophoretic detection of the allelic state of single DNA molecules in human sperm by using the polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 4580-4584.

127. Dutton C. and Sommer S.S. Simultaneous detection of multiple single-base alleles at a polymorphic site // Biotechniques. 1991. V. 11. P. 700-702.

128. Lo Y.M., Patel P., Newton C.R., Markham A.F., Fleming K.A., Wainscoat J.S. Direct haplotype determination by double ARMS: specificity, sensitivity and genetic applications //Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 3561-3567.

129. Sommer S.S., Groszbach A.R., Bottema C.D. PCR amplification of specific alleles (PASA) is a general method for rapidly detecting known single-base changes // Biotechniques. 1992. V. 12. P. 82-87.

130. Ferrie R.M., Schwarz M.J., Robertson N.H. Development, multiplexing and application of ARMS tests for common mutations in the CFTR gene // Am. J. Hum. Genet. 1992. V. 51. P. 251-262.

131. Germer S., Higuchi R. Single-tube genotyping without oligonucleotide probes // Genome Res. 1999. V. 9. P. 72-78.

132. Xiao M., Phong A., Lum K., Greene R., Buzby P., Kwok P.-Y. Role of excess inorganic pyrophosphate in primer-extension genotyping assays // Genome Res. 2004. V. 14. P. 1749-1755.

133. Decker K., Trager Т., Missel A., Heitz K., Kobsch S., Machura K., Laffert D. Optimizing probe hybridization in real-time PCR for quantification and SNP genotyping // Qiagen News. 2002. V. 4. P. 13-16.

134. Huang J., Lu J., Barany F., Cao W. Multiple cleavage activities of endonuclease V from Thermotoga maritima: recognition and strand nicking mechanism // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 8738-8748.

135. Vaughan P., McCarthy T.V. A novel process for mutation detection using uracil DNA-glycosylase//Nucl. Acids Res. 1998. V. 26. P. 810-815.

136. Shagin D.A., Rebrikov D.V., Kozhemyako V.B., Altshuler I.M., Shcheglov A.S., Zhulidov P.A., Bogdanova E.A., Staroverov D.B., Rasskazov V.A., Lukyanov S.

137. A novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from crab hepatopancreas//Genome Res. 2002. V. 12. P. 1935-1942.

138. Патрушев Jl.И. Экспрессия генов // М.: Наука. 2000. 527 с.

139. Rust S., Funke Н., Assmann G. Mutagenically separated PCR (MS-PCR): a highlyispecific one step procedure for easy mutation detection // Nucl. Acids Res. 1993. V.21.P. 3623-3629.

140. Locht L. Т., Kuypers A.W., Verbruggen B.W., Linssen P.C., Novakova I. R., Mensink E. J. Semi-automated detection of the factor V mutation by allele specific amplification and capillary electrophoresis // Thromb. Haemost. 1995. V. 74. P. 1276-1279.

141. Mitterer M., Lanthaler A.J., Mair W., Giacomuzzi K., Coser P. Simultaneous detection of FV Q506 and prothrombin 2021 OA variation by allele-specific PCR // Haematologica. 1999. V. 84. P. 204-207.

142. Hezard N., Cornillet-Lefebvre P., Gillot L., Potron P., Nguyen P. Multiplex ASA PCR for a simultaneous determination of factor V Leiden gene, G->A 20210 Prothrombin gene and C->T 677 MTIIFR gene mutations // Thromb. Haemost. 1998. V. 79. P. 1054-1055.

143. Niimi Т., Tomita ll., Sato S., Kawaguchi H., Akita K., Maeda H., SugiuraY., Ueda R. Vitamin D receptor gene polymorphism in patients with sarcoidosis // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 1999. V. 160. P. 1107-1109.

144. Jaramillo-Rangel G., Cerda-Flores R.M., Cardenas-Ibarra L., Tamayo-Orozco J., Morrison N., Barrera-Saldana H.A. Vitamin D receptor polymorphisms and mineral density in Mexican women without osteoporosis // Am. J. Hum. Biol. 1999. V. 11. P. 793-797.

145. Sambrook J., Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratoiy Manual // Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring I larbor Laboratoiy Press. 1989.

Информация о работе

Ванюшева, Ольга Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы