Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка способа получения свиного гамма-интерферона и изучение его некоторых физико-химических и биологических свойств

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка способа получения свиного гамма-интерферона и изучение его некоторых физико-химических и биологических свойств"

;t . í

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАДИ 1НСТИТУТ МЖРОБЮЛОГП I В1РУСОЛОГП IM. Д.К. ЗАВ0Л0ТН0Г0

На правах рукопису

IBAHEHKO ВАЛЕР 1Й КОСТЯНТИНОВИЧ

Р03Р0БКЛ СПОСОБУ ОТРШЛШЯ СВШЖОГО ГАМА-111ГЕРФЕРОИУ I ВИВЧЕ1ШЯ ЙОГО ДЕЯНИХ Ф13ИКО-Х1МШНХ ТА ВЮЛОГ1ЧННХ ВЛАСТИВОСТЕЙ

03.00.06 - в!русолог!я

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобуття вченого ступени кандидата б!олог1чних наук

КИiВ-1994

Робота виконана у в1дд1д1 в1рус!в м1кроорган18м1в 1нсти-туту м1кроб1олог11 1 в1русолог1Ч 1м. Д.К. Заболотного HAH УкраЧни

Науковий кер!вник:

доктор б1олог1чних наук, професор, академ!к АТНУ Я.Г.К1шко

0ф1ц1йн1 опоненти: доктор медичних наук В.А. Борисов

кандидат б!ол. наук О.Ю. Повниця

Ведуча орган1зац1я: НДI еп!дем1ологИ i пфекщйнвд

хвороб 1м. Л.В. Громашевського MCG УкраЗни

Захист в!дбудеться "16" листопада "1994 року о ю" годин i на зас1данн1 Спец1ап1вовано1 Ради Д.016.06.01 при 1нсти-тут1 м1кроС1олог!1 1 в1русологП iM. Д. К. Заболотного HAH Укра1ни за адресою: 252143, Ки1в-143, вул. Заболотного 154.

3 дисертац1ею можна ознайомитись в б1бл1отец1 1нституту м1кроб1ологП 1 в1русолог11 1м. Д. К. Заболотного HAH Укра1ни.

Автореферат роз!сланий '46 " жоВтня. 1994 року

Вчений секретар Спец1ал1зовано1 Ради

3 А Г А ЛЬИ А ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

АюлуальШапь проблем/. В!дкритий у 1957 р. /Isaaks, Llndenmann/ 1нтерферон привертае увагу спец1ап!ст1в молеку-лярно'1 ШологП, 6i0TexH0Ji0ri'i, медицини та ветеринар!5. Це пояснюеться виключно важливим значениям як теоретичного вив-чення рол! 1нтерферону, так i ййго практичного застосуванкя.

1мунний гама - 1нтерферон (г-!нтерферон) вперше було виявлено в надосадов!й р1дин1 культури л!мфоцит1в перифер1й-но'1 кров! людини, оброблено! ф!тогемаглютин1ном /Wheelock. 1065/. Пройшо майже 30 рок!в з моменту в1дкриття 1мунного 1нтерферону i в наш час уявлення про функцП та роль га-ма-1нтерферону в значнш Mipi розширились.

AKTyajibHicTb вивчення 1нтерферону визначаеться не т1ль-ки антив!русною i протипухлинною д1ею, але й гммуномодулюю-чими та рад1опротекторнйми активностями /Gresser, 1977/. Широкий спектр 6i0J0ri4H0'i активност1 гама-1нтерферону прояв-ляеться в посиленн1 експресП антиген!в г1стосуй!сност1 I та II клатв не тхльки на л1мфоцитах, але й на imimx типах Kii-тин. Гама-1нтерферон посилюе бактеридидну i протипухлинну дш макрофаг!в, безпосередньо приймае участь у фазах 1мунно1 в1дпов!д1 розп!знавання, прол1ферацП та диференц!ювання, стимулюе здатн!сть природних к!лерних кл1тин захищати орга-н!зм в!д BipycHiix 1нфекц1й.

Антив1русна активн1сть !нтерферону - лише одна з його ,функц!й, тод! як, можливо, головною являеться регуляц!я кл1-тинних активностей, пов'язаних з ростом, диференвдюванням i корекц!ею !мунно! в!дпов1д1.

1нтерферони продукуються клгтинами багатьох, можливо, ycix вид!в хребетних. Кр!м 1нтерферон1в людини, докладно

вивчен1 !нтерферони мишей, курей, качок, у яких добре охарактеризован! а- 1 в-1нтерферони.

Природн! свиняч! а- 1нтерферони привертають увагу дос-л!дник1в тим, шр мають до 647. гомологП а людським «Интерфероном /Lefevre, La Bonnardiere, 1986/. Ц1 1нтерферони активно вивчаються в багатьох лаборатор!ях св1ту /Соловьев и др., 1080; La Bonnardiere et al., 1984; La Bonnardiere et al., 1086; Piasecki,1988).

• 3 моменту свого в!дкриття в 1969 p. /Richmond/ свинячий Г-!нтерферон до сьогодн1шнього дня практично не вивчений, тому викликае 1нтерес п1дб1р нових 1ндуктор1в г-1нтерферону, як1 е нетоксичними i нетк!дливими i як! дозволяють отримува-ти С!лъш високоактивний препарат, а також вивчення деяких ф!аико-х!м1чних 1 б1олог1чних властивостей свинячого гама- интерферону в пор1вняльному аспект! з биып дослдаеним людським Интерфероном.

Мела ва аалач/ досл1дяешя. Мета роботи - п!дб!р нових 1ндуктор1в гама-1нтерферону, вивчення умов б!осинтезу i деяких ф!вико-х!м1чних та б1олог1чних властивостей свинячого гама-1нтерферону.

Для викоиання ц!е'1 мети були поставлен! так1 основнх задач! досл!джень:

- провести скрин!нг нових !ндуктор1в гама-!нтерферону;

- розробити нов! гпдходи для одержання препарат1в свииячого гама-1нтерферону, використовуючи нетрадиц!йн! кл!тини-про-дуценти та ищуктори !нтерферону;

- охарактеризувати деяк1 ф!зико-х1м!чн! та б!олог!чн! влас-тивост! отриманого препарату гама-1нтерферону;

Иаукова новизна. В результат! вивчення отриманого препара-

- 3 -

ту свинячого гама-1нтерферону було вперше:

- пШбран1 HOBi ефективн1 1ндуктори гама-1нтерферону - бак-тер!йний лектин Bacillus subtllis 668 1MB та лектин 8 трави "золотий дощ" /Позитивне ршення на винах 1д CPCP N4935373, A.C. СРСР N1561273 /;

- розроблена 1 апробована оптимальна схема б1осинтеву препарату свинячого гама-1нтерферону / позитивне ршення Держ-патенту Укра'1'ни N94030717/;

- розроблен1 методи очистки гама-1нтерферону свиней, вста-новлена його молекулярна маса та визначеиа 1зоелектрична точка;

- препарату свинячого гама-1нтерферону властива модулююча д!я на функщональну активйсть фагоциИв кров1 свиней;

- свинячий гама-1нтерферон захищае гомологi4Hi кл!тини, людсък1 клгтини L-41 та щйтини бика MDBK в!д дП Bipycy везикулярного стоматиту.

Праютчиа Шпигель робот. Експериментальне вйвчення б1осинтезу гама-1нтерферону з використанням нових 1ндукто-р1в, його деяких ф1зико-х!м1чних та б!олог1чних властивостей дозволило розробити нормативно-техн!чну документац1ю, 1нс-трукцш по його використанню, а також впровадити щ> розробку на Ладижинському ВБФО "Ензим".

Апробац1я робот. Результата досл1джень були виклэден! на науково - практичн1й нарад! "В1русолог1я народному госпо-дарству" (Ки1в, 1987)*, 11-th International Lectin Conference (Tartu, 1989), Всесоюзн1й нарад1 "Використання 1нтерферон1в в ветеринарП" (Ки'1в, 1989), 8-th International Congress of Virology (Berlin, 1990), Всесоюзна нарад1 "Сучасн1 аспекти застосування 1нтерферон1в i 1нших 1муномодулятор1в (Москва,

1990), I установчому з"[зд1 Укра1нського мiкроб1олог íчного товариства (Одеса, 1993).

ПублНацП. За матер1алами дисертацП опубл1ковано 10 роб!т, отримано 2 авторських св1до-цтва СРСР, 1 позитивно р1шення Держпатенту СРСР на винах!д та 1 позитивне р1шення Держпатенту Украпш на патент УкраТни.

Обсяг та структура дисертацП. Робота викладена на 116 • аркушах друкованого тексту (враховуючи 15 малюнк1в та 11 таблиць). Дисертац1я складаетьоя 1з вступу, сгляду л!терату-ри, розд!лу матер!ал1в та метод!в досл!джень, 3-х роад1л1в власних досл!джень, роздхлу обговорення результат^, виснов-к!в та списку використано5 л!тератури.

3 М I С Т Р О Б О Т И

MamepiaJAi na метода досм^дхень

Загальну популяц1ю клатин селез!нки свиней, Т- 1 В -л1мфоцити вид1ляли в1дпов1дно Hunt (1990).

Moho- i пол1нуклеари вид!ляли 1з гепариниэовано! кров! свиней шляхом. центрифугування на град!ент1 пЦльност! ф1-кол-верограф1ну "1.6 (р-1,077 г/см3 1 1,12 г/см3). Моноцити i нейтроф1ли вид1ляли 1з в!дпов1дних фракщй шляхом адгезП на пластиков!« поверхн1 (протягом 40 'хв. при 37°С ), п1сля чого кл1тини эшмали механ!чно, в1дмивали i тдраховували. Жит-ТЕздатн1сть моноцит!в i нейтрофШв оц1нивали п!сля фарбу-вання трипановим син!м.

Як 1НДуктори 1нтерферону використовували комерц1йний препарат рослинного лектину Concanavalln A (Pharmacia), 1-фукозоспециф1чний очищений лектин i3 рослини "золотий дощ" (Laburum anagyroldes Medlk), поаакл1тинн1 лектини, що вид1-лен1 is культурально! р1дини бактер!й роду Bacillus (В.

subtllis 316M, В. subtilis 668, В. polymyxa), що являють собою гл!копротеКни, як1 мають ун!кальну специф1чн1сть до cia-лових кислот; високу питому активн!сть з молекулярной масою 120000'Д (отриман! з вгдд!лу промислових MiKpoopraHi3MiB 1MB НАНУ в1д Е.О. Коваленко i 1.0. Симоненко). Досл1дження проводили з нашвочищеними лектинами В. subtilis 316U (гемаглю-тинуюча активн!сть ГАА - 1 : 512, концентрац!я б1лка 0,81 мг/мл), В. subtilis 668 1MB (ГАА - 1 : 5536, конценграц1я б1лка 0,69 мг/мл). В. polymyxa 112 (ГАА - 1 : 16384, кон-центрац1я 01лка 0,62 мг/мл) i очищеними В. subtilis 31614 (питома активн1сть лектину 2560 титр-1/мг б!лка), В. subtllis 668 1MB (питома активн1сть лектину 42024 титр-1/мг б1лка).

Активн1сть препарат!в т-1нтеферон!в вианачали м1кроме-тодом по пригн1ченню цитопатичного ефекту тест-в1руса везикулярного стоматиту (штам 1нд1ана) в доз1 100 ТЦД50 на гомо-лоПчних кл1тинах ПСП, СПЕВ /Grossberg et al., 1984/.

Очистку г-1нтерферону починали прецип1тац1ею б1лк1в 80Z сульфатом амонШ. Осаджен! б1лки хронатографували на колонц1 з великопористим склом CPG-10 (Sigma) в!дпов!дно Braude /1983/. Отриман! фракцП анал!8ували на вм!ст б1лка за методом Jloypi, а також на антив1русну активность. ФракцП, що мають антив!русну активн!сть п1сля хроматограф!! на CPG, оО'вднували i вносили в пластикову колонку (D-3 см), запов-нену Con A-Sepharose (Pharmacia) /Rinderknecht, 1984/. У фракц!ях, отриманих nicjw хроматограф!1 з вастосуванням Con A-Sepharose вивначали к1льк1сть б!лка 1 антив1русну актив-HiCTb. Ti з них, як! мали антив!русну активШсть, об'еднува-ли 1 д1ал18увапи проти 0,2М амон!й-ацетатного буферу

(рН-6,0) + 0,15М NaCl. Д1ал1зат концентрували ва допомогою Aquacid-2 (Calbiochem). Б1лковий концентрат розд!ляли гелъ-ф!льтрац!ею на колонц1 8 б!огелем Р-100 (1,6x95 см), полередньо в1дкал1брованою б!лкаыи в в1домою молекулярной масою (БСА-68000, овальбум1н-43000, х!мотрипсиноген-25000, РНКаза А-13700, Serva) в!дпов!дно Yip et al.,1981.

Досл1ди по i воелектрофокусуванню свинячого т-!нтерферо-ну проводили в1дпов!дно Havel1 /1977/.

Чистоту вид!леного 1нтерферону та його молекулярну масу визначали ва допомогою електрофорегу в пол!акрилам1дному ге-л! за методом Laenmli /1970/.

Тип отриманого 1нтерферону визначали по його здатност1 збер!гати активн1сть при закисленн! pH до 2,5 досл!джуваного зразка i прогр!ванн! при 56°С на протяз1 30 хвилин /Georgiades et al., 1984/. А також ва допомогою реакцП нейтрал1зацП отриманого 1нтерферону з моноклональними анти-т!лами до препарат1в a i г-1нтерферон!в, люб'язно наданих проф. Freundt (Дан1я).

Вплив Интерферону на показники фагоцитарно! активнос-т1 í бактерицидну активн!сть фагоцитуючих (Штин кров! свиней визначали загальноприйнятими'методиками /Карлов is cni-вавт.,1985; Сп!вак, 1988/.

Антитоксичну активн!сть npenapaTiB гама-1нтерферону in vitro та in vivo визначали за методом Зуево! i3 ствавт. /1985/.

Вивначення антипрол!феративно1 активност! препарат!в гaмa-iнтepфepoнy проводили шляхом 6ioxiMi4Horo анал!зу синтезу кл!тинно1 ДНК /Малиновская, Литовченко, 1985/.

Результати досл!джень обробляли методами статистично'1

- г -

обробки /Ашмар1н i3 cniaBT., 1962/. Результата, що подан! граф1чно, оброблен! за допомогою программ Grapher верс!я 1.75, ф1рми Golden Software та табличного процесору Quattro Pro Bepciï 4.0 ф!рми Borland International Inc..

Результат досл/джешя та ïx обговоретш

Отримання будь-якого типу природних 1нтерферон1в, особливо т, вимагае 1ндив1дуального п!дходу як в п!дбор! кл1-тин-продуцент)в, 1ндуктор1в, метод!в i умов культивування кл!тин-продуцент1в, так 1 способ!в очистки отриманого 1нтер-ферону.

Серед ycix кл!тинних популяц1й основними продуцентами г-1нтерферояу б спленоцити /Weck et al., 1983/, Т-кл1тини i п{эиродн! к1лери /Young, Hardy, 1990/. При кооперацИ ц!х кл!тин з макрофагами посилюеться синтез г-1нтерферону /Ratllf et al., 1982/. Багато р1зновид!в лгмфощтв i макрофаг^ мае селез1нка. Ось чому для отримання кл1тин-продуцен-т1в г-1нтерферону.ми використовували селез1нку свиней!

Серед 1ндуктор1в т-1нтерферону в наш час в1дома велика KiJibKlcTb як синтетичних, так i природних речовин. Але, нез-важаючи на де пошук нових 1ндуктор1в т-1нтерферону продовжу-еться /Young, Hardy, 1990/. Таке становище пов'язано з тим, що б1льш!сть кин1 використованих 1ндуктор1в т-1нтерферону, не В1дпов1дае вимогам, зокрема, медицини. До того х способи видалення залишк1в 1ндуктор1в, довол1 дорог1 /Kauppinen et al., 1986/.

В осташий час серйозну увагу вчених викликають лектини бактер1й. Вони являють собою пол1фуйкц!ональн1 речовини з широким спектром б1олог1чно'1 активност1, що приймають участь в процесах обм1ну речовин i забезпечують взаемод1ю кл1тин

Mix собою i навколишн1м середовищем /Шдгорський i 8 cniaBT., 1992/. Виходячи э цих м1ркувань, нами було проведено скри-в1нг in vivo i in vitro серед позашцтинних лектинхв споро-утворюючих аеробних бактер1й роду Bacillus, як мсшшвих íh-дукторав г-интерферону. Використання цих лектин1в як iHTep-фероноген1в виявилось виг1дним за. дек1лькома причинами: простота отримання, ненпидливють для орган1зму як тварини, так 1 людини.

Як було встановлено (in vitro), оптимальними концентратами лектину В. subtllis 668 1MB (натвочищений) для продукт'i г-1нтерферону були 50 мкг/мл i 100 мкг/мл (мал. 1а). При чому доза в 50 мкг/мл на протяз1 досл!джуваного часу викликала продукц1ю 1нтерферону, за к1льюстю пор!внюваного э такою в контрол1 (Con A), i складала через 72 години куль-тивування 213,3±73,1 Од/мл. Bei íhihí бактер!йни лектини (на-п1вочи1ден!) виявились б1льш слабкими 1нтерфероногенами (мал. 1а). Максимавьн1 титри антив1русно1 актквност! - 85,3± 35,9 Од/мл - В. subtllis 316М i 69,3±9,2 Од/мл - В. polymyxa через 72 години iHKyöaqi i при дозах 50 мкг/мл i 100 мкг/ мл • в!дпов1дно, що icTOTHO в1др1зняеться в1д контролю (Con А).

Лектин is трави "золотий дощ" (Laburum anagyroides MeáiK) in vitro також мав певн! 1нтерфероногенн1 властивост1 (мал.1а). При доз1 лектину 25 мкг/мл спостер1гали найб^льшу продуюДю 1нтерферону - 180,7 ± 60,0 Од /мл.

0чмден1 лектини in vitro (мал.16) випвиллсь бШш слабкими 1ндукторами т-интерферону, тж частково очицен!. Серед них найбШшу хндукторну здатн1сть мав лектин B.subtllls 668 1MB (1б0,0±18,5 Од/мл) при використант в концентрац!ях 25-50 мкг/мл. 1нтерфероногенна активн1сть очиценого лектину

В В ГА В В Г

Сол», 10 100

60 Im« лектину. мчи/мл

24 24 24 S4 4U 48 4(1 48 73 72 72 72 Час. eoôuilu

А.-В.Й

жкя/жл

24 84 84 46 48 48 '72'72'72' Час. еоЗцни

Мал. 1. Первинний скринтг нап!вочищених (a) i очищених (б) лектин!в за "ix 1нтерфероногенними властивостями А - В. polymyxaj Б - В. subtilis 316М; В - В. subtilis 668 IVB; Г - Laburum anagyriodes Medik;

В. subtilis 316М коррелювала з активн1стю нал1вочищеного лектину, лише доза, що дозволяв викликати найб1льшу продук-цш 1нтерферону, була меншою i складала 30 мкг/мл. Максимальн1 активност! 1нтерферону спостер1гали на 72 год. б1осинтезу. Слабка !нтерфероногенна активн!сть очищение бак-тер!йних лектин!в ложе бути пов'язана з тим, що вони лаб1ль-hí 1 в процес1 очистки втрачаеться íx активнЮТь. Не виклю-чено, що молекули лектшйв, як1 мають р!зну стуШнь агрега-ц!"í можуть утворювати moho-, ди - або пол1мери, що в свою чергу може зм1нювати ix властивост!, зокрема, здатн1сть 1н-дукувати синтез гама-1нтерферону.

При визначенн! хнтерфероногенноЧ актигност! лектшйв в орган1зм1 мишей СВА (табл.1) було встановлено, що найб1льш bhcokí титри 1нтерферону в сироватвд були визначен1 через 4 години п1сля введения у лектин1в В. subtllis 668 (нап1вочи-щений) - 153,6±57,2 Од/мл 1 Laburum anagyroides Medi к -179,2±52,6 Од/мл при доз! 50 мкг/кг. Через 24 години теля введения, спостер!гаяи зменшення píbhh синтезу интерферону в досл1джуваних сироватках як в досл!д!, так i в контрол!.

В результат! первинного скрин1нгу in vitro i in vivo нами булм обран! для подалъшо! роботи як 1вдуктори т-антер-ферону два лектини: бактер!йний лектин В. subtilis 668 (на-п!вочищений) i рослинний лектин Laburum anagyroides Medik.

ОдHiею i3 властивостей лектин1в е стимуляц!я росту i под!л л1мфоцит!в, як1 перебувають у cnoKoí - м1тогенна ак-TUBHiCTb. В1домо,що 6ijibfflicTb лектин!в, hkí використовуються для 1ндукцП гама-1нтерферону, е i м!тогенами. Досл!ди, проведен! нами по вивченню м1тогенних властивостей лектин1в бактерiй роду Bacillus i рослинного лектину "золотий дощ"

Мал. 2. Визначення м1тогенно1 активности нал1вочищених лектин1в

А - В. polymyxa; Б - В. subtilis 316М;

В - В. subtilis 668 1MB; Г - Laburum anagyriodes Medik.

Таблица "1

1идугаЦя 1нтерферону лектинами в орган!гм1 мишей СВА

Лектин Активн1сть 1нтерферону в сироватц1 (Од/мл)

Час 1ндукцП (год) i доза лектину (мкт/кт)

. 4 24

50 500 50 500

В.subtilis 668 ПИВ (натвочищений) В.subtilis 668 IKE (очищений) В.subtilis 316М (нап1вочшцений) В.subtilis 316М (очищений) В.polymyxa Laburum anagyroides Medik Con A 153,6+57,2 138,7+13,3 38,4±14.3 37,3± 4,6 14,0± 4,5 179,2±70.1 115,2+28,6 76,8±28,6 69,3+ 9,2 51,2±17,5 48,2±13,9 28,8± 7,2 217,б±52,6 236,8±42,9 31,2± 7,2 21,3+ 9,2 15,6± 3,8 13,3± 4,6 14,8± 2,7 48,0±15,0 59,2±10,7 31,2+7,2 28,8+8,7 31,6±7,8 26,7 9,2 16,8±1,8 28,8±8,7 33,5±3,6

показали, (мал. 2), що во! досл!джен! в р1зних концентрациях бактер1йн! лектини виявились слабкими м!тогеками, як в по-р1внянн1 8 контрольним препаратом Con А, так i рослинним лектином Laburum anagyroldes Medlk. Ця властив1сть бактер!й-них лектин!в в!др1зняе Ix в!д загальнов!домих лектин1в - 1н-дуктор!в т-1нтерферону. Вважаеться, що м1тогенна активн!сть лектин1в 1 утворення л!мфокин!в не зв'язан! /Liener et al., 1986/.

Важливе значенння при отриманн! будь-якого типу iHTep-ферону, зокрема г-!нтерферону, мають також так! умови як прайм1нг, його час, к1льк!сть кл1тин в б!осинтез!, трива-л!сть б!осинтезу. Використовуючи !ндуктор В. subtllls 668 IMB (40 мкг/мл), нами були п!д!бран! оптимальн! умови для одержання г - 1нтерферону (мал.За). Такими виявились; доза сс-1нтерферону для праймшгу - 1000 Од/мл, час прайм1нгу - 4 години, к!льк1сть кл1тин в б1осинтез! - 1х107 - 2,5х107 кл/мл 1 час б!осинтезу - 48-72 години. Активн!сть !нтерферо-ну, отриманого за такими умовами складала 2140,8±£35,3 Од/мл - 2218,7*295,7 Од/мл. До того ж титри !нтерферону, отриманого п1д впливом бактер!йного лектину, спiвпадали з такими ж, отриманими п!д впливом комерц1йного препарату Con А.

Под1бн1 досл1ди по оптим!зац!1 продукцИ т-интерферону були проведен! i для рослинного лектину Laburum anagyroldes Medlk (25 мкг/мл). В даному випадку оптимальними умовами були: доза «-1нтерферону для прайм!нгу - 1500 Од/мл, час прай-м!нгу - 4 години, к1льк!сть кл!тин в б!осинтез! -5х106-2,5х107 кл/мл, час бЮсинтезу - 24-72. години. Як нас-л!док, титр !нтерферону вже через 24 години культивування складав 2218,7*295,7 Од/мл, в наступним невначним зб!льшен-

- 13 -А В А В А В

2.6« 10-7 1*10-7 6*10-в

{г* 24 48 48 7Z 72/ lg4 В4 48 40 72 72' j Ч5£ ed85hïî g

Б А Б А Б

А Б A H А Б

lat Й« 48jjfl_7S 72/ 184 Si 48 40 7g 72> -1 j Час; Boüiuiü д

2.5*10-7 1*10-7 6*10-6 1*10-в Kalmue/ju

Мал. 3. Bv.6ip оптимальних умов продукцП свинячого г-1нтерферону з 1ндуктором нап1вочщеним бактер!йним лектином В. subtilis 668 IMB (a) i 1ндуктором рослин-ним лектином Laburum anagyriodes Medik (б)

а) А - В. subtilís 668 IMB; Б - Con А.

б) А - Laburum anagyriodes Medik; Б - Con А.

I - Час прайм1нгу 2 години; II - Час прайм!нгу 4 години.

ням на 48-72 годинах б1осинтезу - 2389,3±295,7 Од/мл, 2432,0±256,0 Од/мл (мал.36).

Динам!ка продукцП' т-1нтерферону була типовою, характерною для 1ндуктор1в, як1 застосовуються зараз для 1ндукц15 синтезу гама-iнтерферону: СЕА /Lee et al.,1990/, ФГА /Wheelock, 1965/, Con A /Friedman, Cooper,1967/, TPA /Vilcek et al., 1982), i дозволяе ' отримувати через 24-72 години кудьтивування кл!тин-продуцент1в акТивн!сть л1мфок!ну в межах 1хЮ2 - 104 Од/мл.

Привизначенн! типу основних кл!тин - продуцент1в 1н-терферону було встановлено, що 1нтерферон, 1ндукований лёк-тинами Laburum anagyroides Medlk та В. subtllls 668 1MB, найб1льш активно продукуеться загальною поп у ля ц! ею кл!тин селез1нки (спленодитами) 1 Т-л1мфоцит1в, що в1дпов!дае даним 1нших досл1дник1в / Weck et al., 1983; Young, Hardy, 1990/.

Для очистки отриманого iнтерферону на основ! даних л1-тератури, була п1д!брана схема очистки л1мфок1ну, яка включала в себе ряд посл!довних стад1й. Початковим етглом очистки свинячого г-Нтерферону була прецип1таЩя загального б!л-ка сульфатом амон!ю. Ця процедура давала на виход1 i?% кон-центравдю 1нтерферону i приблизно двократну ступ1нь його очистки, що погоджуеться з результатами Braude /1983/. Вико-ристовуючи спостереження De Ley et al./ 1980/, Van Damme et al. /1981 /, що гама-1нтерферон мае здатнЮТь зв'язуватись з CPQ - склом 1 елююватись з нього буфером, який BMimye ciJib високо! конце нтрацП ! 50% ет!ленгл1коль. Цей хроматограф!ч-ний зас!б дозволив зд!йснити як бчистку, так i концентруван-ня гама-!нтерферону. Тому наступним етапом була хроматогра-ф!я на СР6-скл1 (мал. 4а). При !мобШзацП б1лка на гранули

CPG досягали повне зв'яэування iнтерферону. Повну елюЩю 1н-терфероново'1 активност! досягали т1льки при 20% концентрацП етиленглаколю в буферг елюцп. Цей хроматограф!чний зас1б дозволив отримати 100% штерферону is специф1чною активнЮтю 6,4хЮ4 Од/мг б1дка. Цей результат в1др!зняеться в!д даних, отриманих при очищенн1 людського гама-1нтерферону, 1 може бути пояснений тим, що в залежност1 в!д розм1ру пор CPQ-скла зм1гаоеться 1 ступ!нь чистоти 1нтерферону, тому в нашому ви-падку неох!дне було застосування 1нших хроматограф1чних мат-риць для подальшо! очистки r-свинячого 1нтерферону. Вагато досл!дник1в вводили Con А-сефарозу в схеми очистки /Yip et al., 1981; Braude, 1983; De Ley, Clayes, 1984; /. Свинячий tí-интерферон ефективно зв'язувався з Con A-Sepharose (мал.46). Повну елюц!ю 1нтерфероновоЧ активное^ досягали при внесенн1 в елююючий буфер 0,1 М «-метил-D-манозиду, в той час, як основна частина дом1шкових б!лк!в виходила до Ui 6Í стад i'i. На виход1 було отримано !нтерферон 1з специф1ч-ною активн1стю б,9х104 Од/мг б1лка. Подалъша очистка гама- i нтерферону на б1огел1 Р-100 дозволила отримати практично noBHlcno симетричну форму niKy елюцп 1нтерфероново'1 актив-hoctí (мал.4в). Це засв1дчуе, що популяц!я молекул свинячого i-iнтерферону, яка отримана в результат! використання приве-деного набору метод!в очистки, е в!дносно гомогенною i мае молекулярну масу 51000 дальтон. Такий результат е тотожйй з ощнкою молекулярной маси для людського iнтерферону /De Ley et al.,1980; Yip et al., 1981/. Bci етапи очистки дозволили збШшити специф!чну активн!сть препарат!в !нтерферону до 7хЮ4 Од/мг б1лка.

На останньому етап! очистки - гель-фгльтрацП на б!оге-

20 40 б'О

Ноиери фракций

нал. 4. Посл1довл1 стада i очистки свинячого г-1нтерферону

хроматограф!ею на скл1 CPG-10 (a). Con А-сефароз1 (С), б1огел! Р-100 (в).

-©—©-б1лок за JIoypi; г-1нтерфероц.

а: 1 - буферний розчин (20 мМ фосфат натр!я, рН 7,4 + 0,15 NaCl)

II,III.IV - буферний розчин +5, 20 1 50% етиленгл!колю в1дпов!дно! б: I - буферний розчин;II - буферний розчин + 0,1М а-метил-D-маннозид; III - буферний розчин + й-метил-D-маннозид + 35% етиленгл!колю в1дпов1дно;

в: буферний розчин (0,2 М амон1й - ацетат, рН 6,0). л! Р-100 - к1льк!сть быка у фракц!ях, що м1стять 1нтерферо-нову активн1сть, була нижчою, н!ж дозволяв визначити метод Лоура. Тому про стугпнь очистки 1нтерферону на датй стад i'i модна було поб1чно твердити лише за результатами електрофо-резу в ПААГ. Ствставляючи електрофоретичну рухом1сть основ-но1 забарвлено? смуги з рухомЮтю маркерних б!лк1в, можна оц1нити молекулярну масу 1нтерферон-вм1сно'1 фракцП. В нашо-му випадку вона виявилась в межах 28000-30000 дальтон. Р1з-

нидя в молекулярн!й Maci, що визначаеться електрофорезом 1 гель-ф1льтрац1Бю, характеризуе конформац!йн1 особливост! на-тивно'1 молекули Интерферону /De Ley et al., 1980; Nathan et al., 1981; Yip et al., 1982/.

При проведенн1 i аоелектрофокусування гама-i нтерферону було встановлено, що практично вся Птерферонова активн1сть сконцентрована в одному в1дносно вузькому niui, який харак-теризуеться величиною pl, що дор!внюе 8,4-8,8. Значения ц1ех величини, дуже близьке до pl антив!русних активностей людсь-кого гама-Нтерферону /Ylp.et al.,- 1982; Georg!ades et ah, 1984/.

При встановленн! типу отриманого i очищеного нами !н-терферону ми виходили з того, що г - !нтерферон не стаб1ль-ний при низьких значениях pH (2,0-2,5) i до прогр1вання при 56°С на протяз1 oflHie'i години, не абер!гае i б!олог!чну ак-тивн!сть в присутност! ДСН /Stewart et al., 1974/. Проведен! експерименти засв!дчили, що отриманий !нтерферон е гама -типу, так як в пор!внянн1 з альфа-!нтерфероном bíh !нактиву-еться при t-56° С на протяз1 30 хвилин i при змШ pH до 2,0 в!н втрачав свою активн!сть. KpiM того, в!дпов!дно Georgia-des et al. /1984/ було проведено досл!дження впливу р1зних х1м!чних речовин i фермент1в на антив!русну здатн!сть t-íh-терферону в пор!внянн! з альфа - !нтерфероном. Гама - iHTep-ферон виявився б!льш чутливим до 1онних дётергент1в, менш чутливим до впливу не!онних, в пор!внянн! з а-!нтерфероном. Заключним етапом при встановленн! типу отриманого Нтерферону була реакц1я нейтрал!зац!1 з моноклональними антит1лами до а 1 г- 1нтерферон1в. Вона показала, що отриманий !нтерфе-рон нейтрал!зувався моноклональними антит!лами до г-!нтерфе-

рону. Таким чином, отриманий 1нтерферон можна в1днести до г-1нтерферон1в.

При досл!дженн! деяких б!олог!чних властивостей свиня-чого гама- !нтерферону було встановлено, що в систем! in vitro в!н мав значку 1муномодулюючу здатн!сть по в!дношенню до мононуклеарних фагоцит!в. Гама-!нтерферон значно 8б1лыпу-вав фагоцитарну ! бактерицидну активн!сть моноцит!в 1 нейт-роф!л!в. Ц! результати узгоджуються з досл!дженнями Koeffler et al. /1984/, Фрейдлин /1989/.

1нтерферон-гама е л!мфок!ном, що здатний 1нг1бувати не-в!русн1 1нфекц!йн! агенти, мае деяку антитоксичну активн1сть /Turco et al., 1984; Nakane 1988; Byrne et al., 1989/. Проведен! досшди in vitro i in vivo по встановленню наявност! антитоксично! дП npenapaTiB свинячого гама-ЮТерферону показали, що сам !нтерферон не мае так! властивост!. Ця здат-HicTb, мабуть, б!льш властива л!мфок!нам, що продукуються в npoueci !нтерфероногенезу. Це припущення п!дтверджуеться там, що очищений т-1нтерферон мае низьку антитоксичну актив-

HiCTb.

З'ясування особливостей антипрол!феративно1 д!1 гама- !нтерферону на сьогодн!шн!й час детально вивчаеться, ос-к!льки часто виявляеться в1дпов!дн1сть uie'i д!1 in vitro i in vivo /Blalock et al., 1980; Fleischman, 1982/. Дан1 отри-ман! нами, по вивченню антипрол!феративно! дП гама^нтерфе-рону свиней показали, що пригн!чення синтезу ДНК при внесен-Hi р!зних за антив1русною активн!стю доз 1нтерферону було б!льш виразним через 24 години, н!ж через 48 годин. До цього терм!ну ч1тко виявляли залежн1сть пригн!чення редупл!кацП кл!тинно! ДНК в!д антив!русно! активност! внесеного !нтерфе-

- го -

рону. Судячи з отриманих результат!в i даних л!тератури /Czarniecki et al., 1984; Криспин i8 сп!авт., 1986; Парфенов le сп1авт., 1987/ ыожна стверджувати, що гама-1нтерферон як людини, так i свиней мае б1льш виранений антипрол!феративний ефект на одиницю антив1русно! активност! в пор1внянн1 8 альфа - 1нтерфероном.,

Свинячий гама-1нтерферон ефективно захищав гомологичн! кл!тини СПЕВ та ПСП в1д д11 Blpycy везикулярного стоматиту, в менш1й Mipl кл1тини людини - L-41 (70,2±13,7 Z) та кл1тини Оика - MDBK (46,3±9,82).

Таким чином, отриманий свинячий гама-1н?ерферон sa дея-кими ф1зико-х!м1чними, 61олог1чними власти:!остями та меха-hîbmom д!1 е близьким до людського гама-1нтерферону.

В И С И О В К и

1. Шд1брано нов1 ефективн1 1ндуктори для б1осинтезу гама-1нтерферону свиней - бактер!йний лектин Baclllus subtllls 668 IMB та рослинний лектин Laburum anagyroldes Medik, цим 1ндукторам властив1 слабк! м1тогенн! потенцП.

2. ЗПдно з розробленими оптимальними умовами прайм 1нгу 1 б1осинтезу було отримано гама-1нтерферон свиней, власти-boctI якого Суло досл!джено в р1зноман1тних експериментах.

3. Розроблена ефективна схема очистки отриманого 1нтер-ферону, встановлена його молекулярна маса, яка складае 28000-30000 Д, та визначена 1зоелектрична точка (8,4-8,8).

4. Встановлено, що гама-1нтерферон в систем! In vitro i in vivo мае слабку антитоксичну д!ю.

б. Препарата свинячого гама-1нтерферону виявляють моду-люючу д1ю на поглинальну i бактерицидну активн1сть фагоцит1в кров! свиней in vitro, зб1льшуючи ïx показники б!льш як уд-

- 21 -

Biui та проявляють високу антипрол1феративну активн1сть.

6. Свинячий гама-1нтерферон ефективно захищав гомоло-гичн! клИини СПЕВ та ПСП в1д д i i Bipycy везикулярного стоматиту, в менш!й Mipi кл1тини людини - L-41 (70,2+13,7 %) та кл1тини бика - MDBK (46,3±9,8%).

7. 0триман1 дан1 дозволили створити нормативно-техн!чну документац1ю i застосування на виробництво свинячого гама- 1нтерферону, яка п1сля затверждення в установленому порядку передана для промислового випуску препарату на Лади-жинське ВБФО "Ензим" та Управл1нню ветеринарно'1 медицини Ук-pa'iHH - для використання в ветеринарн!й практиц1.

Перелгк poOim, onyOjiiicoBaiiux ва натер1алаш дисергяац!i

1. Иваненко В.К., Жолобак Н.М., Фильчаков И.В. Изучение антитоксической активности, продуцирующейся в процессе ин-терфероногенеза. //Научно практическое - совещание "Вирусология народному хозяйству" (Киев, апрель 1987 г.): Тез. докл.- Киев: КГУ, 1987. - С.28.

2. Spivak N.Ya., Ivanenko V.K., Kovalenko E.A. Study of interferonogenic activity of bacterial lectins //In: Abstracts INTERLEC - 11, 11-th International Lectin Conference, Tartu university, Estonian Academy of Sciences, June 4-9, 1989.- P. 67.

3. Иваненко В.К., Карпов А.В., Спивак Н.Я., Кишко Я.Г. Сравнительная характеристика препаратов свиных альфа и гамма - интерферонов" // Всесоюзный семинар "Использование интер-феронов в ветеринарии" (Киев, октябрь 1989 г.): Tee. докл. -Киев: 1989. - С.10-11.

4. Ivanenko V.K., Karpov A.V., Grabchenko N.I. et al. The induction of r - interferon by bacterial lectins // In:

Abstracts 8-th International Congress of Virology, Berlin: 1990.- P." 339.

6. Kishko Ya.G., Ivanenko V.K. The perspective of interferon preparations using for prophylaxis and treatment of virus diseases in agricultural animals //In: Abstracts 8-th International Congress of Virology, Berlin: 1990. - P. 340.

6. Иваненко В.К., Коваленко Э.A., Варбанец Л.Д. и др. Бактериальные гликопротеины - новые, перспективные индукторы интерферона //Современные аспекты применения интерферонов и других иммуномодуляторов (сборник научных трудов), Москва: 1990. - С. 44.

7. Kovalenko Е.А., Simonenko I.A., Getman Е.I., Spivak N.Ya., Ivanenko V.K., Skripal I.O., Podgorsky V.S. Isolation, properties and some application aspects of extracellular lectins of spore - forming aerobic bacteria //In: Abstracts 6-th Europ. Sympos. on Carbohydrate chemistry, Edinbourgh; Scotland, 8-13 Sept., 1991. - P. 65.

8. Карпов А.В., Иваненко В.К., Кишко Я.Г. и др. Получение и очистка свиного гамма-интерферона //Вопросы вирусологии - 1993.- 36, N2. С.78-81.

9. А. с. N 1561273 СССР МКИ А 61 .К 37/66. Способ получения гамма-интерферона сельскохозяйственых животных / Кишко Я.Г.,Спивак Н.Я., Назарук М.И., Иваненко В.К. и др. -13.01.88, ДСП N 390.

10. А. с. N 1645093 СССР МКИ А 61 К 37/66, 35/50. Способ получения интерферона /Кишко Я.Г., Спивак Н.Я., Карась О.Я., Иваненко В.К. и др. ДСП N 286.

11. Индуктор гамма-интерферона. Положительное решение от

. - 23 -

20.01.92, N4935373 / Кишко Я.Г., Иваненко B.K., Лазоренко Л.В., Подгорский B.C., Коваленко Э.А., Симоненко И.А., Геть-ман Е.

12. Cnoci6 виготовлення гама-ан1маферон!в та пристр!й для иого зд1йснення. Позитивне р1шення Держпатенту УкраТни в1д 10.03.1994р., N94030717 /Кшко Я.Г., Гваненко В.К., Ду-манський В.Д., Селезньов О.В.

13. Кишко Я.Г., Иваненко В.К., Коваленко Э.А., Подгорский B.C. /ТУ 15-9. 1/15 "Гамма-суиферон". Утв. Главным Управлением ветеринарии Украины 23 апреля 1992 г.

Иваненко В.К. "Разработка способа получения свиного гама-интерферона и изучение его некоторых физико-химических и биологических свойств".

Рукопись дисертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06-вирусоло-гия.

Защита состоится в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины, Киев, 1994.

Разработан способ получения . свиного гама - интерферона (ï-ИФН) с помощью новых индукторов - бактериального и растительного лектинов. Были подобраны оптимальные условия его продукции. Физико-химические исследования свиного r-ИФН показали, что он является гликопротеином с изоэлектрической точкой 8.4-8.8, молекулярной массой 28000-30000. Разработана схема очистки лимфокина, включавшая в себя преципитацию сульфатом аммония и хроматографию на CPG-стекле, Con A-Sepharose и биогеле Р-100. Эти методы очистки позволили получить r-ИФН со специфической активностью 7*104 Ед/мг белка. Полученный препарат обладал антивирусным, антипролифера-

- 24 -

тивным и иммуномодулирующими свойствами.

Ivanenko V.K. "The development of the method for pigs gamv.a- interferons obtaining and studying of Its physico-chemical and biological characteristics".

The manuscript of dissertation is presented for competition of scientific degree of philosophy doctor in accordance with the speciality - 03.00.06., Virology.

The public discuss of the main results dissertation , will be in the Institute of Microbiology and Virology of NAS of Ukraine, Kiev,1994.

The obtaining method of the pigs gamma-interferone (r-IFN) is carried out using modern immunomodulators -bacterial and plant's lectins. The optimal conditions of its productlonn have been devised. The data of physico-ciiemical studying the pigs r-IFN are demonstrated the late is the glycoprotein with an isoelectric points around 8,4-8,8 and molecular weight from 28000 to 30000. The scheme of limfokine purification including the precipitation by ammonium sulphate and chromatographic separation on CPG-glass, Con-A-Sepharose and biogel P-100 was carried out. These purification methods have been resulted the т-IFN with the specific activity around of 7*104 units per mg of protein. The obtaining preparation of r-IFN possessed an antiviral, antiproliferative and immunomodulation effects.

Ключов! слова: гама - Птерферон, лектини, б1осинтез, очистка, 61олог1чн1 властивост!.