Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка способа электромагнитной стимуляции продуцентов биологически активных веществ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка способа электромагнитной стимуляции продуцентов биологически активных веществ"

ТВ од

УКРАЖЫШЯ ДЕРЖАВШИ УН1ВЕРСЙТЕТ УЛРЧОВЛХ ТЕХНОЛОГИ!

На правах рукопису УДК 663.1: 076. 609. 513

ПОВАЛЯЕВЛ 1лояа Васм1вна

Р03Р0БКЛ СПОСОБУ ЕЛЕ1;ТР0М.\ГН1ТШ1 СТИМУЛИЦЙ ПРОДУЦЕНТ 1В БЮЛ0Г1ЧЮ АКГИВНИХ РЕЧОВЙН

Спец1альн1сть 03.00.23 - б1отехнолог1я

Автореферат дисертацН на эдобуття вчеиого ступени кандидата техн!чник наук

КИ1В -1993

Дисертац1е1и е рукопис.

Робота виконана в Украхнському Державному

Унхверелтет! Харчових Технологий, м.

Науковий кер!вник - кандидат технхшшх наук, доцент Шчко Вхктор1я Борис I в на

0ф1ц1йн1 опоненти - доктор техШчних наук, професор, академ1к А1Н УкраЛни Н1к1?1н Генад1й 'Олекс^йович

- кандидат бхслог1чних наук, старший науковий ш1вроб1тник БуглоЕа Тетяна Трифонхвна

Провхдна орган!зац1я - науково-техн1чний центр~прикладно£ бЮп^аюлэгх!, м. Обух1в

Захиат вхдбудеться "10" листопада 1993 р. о год^ на вас1-данн1 епец1шЛвовано1 ради К 068.17.03 при Укра!нському Державному Ук1верситет1 Харчових Техкодогхй ва адресов:

252017, м. Ки£в, в ул. Бэлодимирська, 68 (ауд. А-311)

3 дисертацею мояяа ознайомитися у бКШотоцх Укра1нського Державного Ун1верситета Харчових Технолог

Автореферат роэ1сланий -сР» ><№&. 1993 р.

Вчекий секрстар спэц1аа!еовано1 вчено! ради,

глндидат техн!чш1х наук, доцент Семенова О. I.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальн1сть теш. Вамливим аспектом ефекгивност! пирабшщтва б1олог1чно активних речовин м1кробним синтезом е використашш висо-копродуктивних штам!в, пр мають ц1нн! б!Осинтетичн1 властивост±. Нин! для створення пггам1в надсинтетик!в використовують геншПнже-нерн! методи, як! дозволяить р!эко п1двищиги накопичення цхльового продукту ферментац! ' Поряд з генно1нженерними штамами продовжуеться використання продуцент 1в, щр отримап± традицхйними методами. Шдтри-мання початково! б1осинтетично1 активност1 вироСничих щгамхв-проду-цент1в досить проблематично. Лроблеми э'являюгься при використшш1 генно1нженерних штам1в-мутант1в через те, шр часто при тривалому збер!ганнх спостерхгасться спонтанна м!нлив1сть культури. 1снуюгь численн! засоби збер!гання штам1в, але жодний з них не гарантуе стаб1льност! штама по основному його покаанику - продуктивное^. Тому нео5х!дно 1 в подалыдому продовжувати пошук спосо61в Шдвищення б1осинтетично! здатност! продуцентов. Численн! досл!дкення покаэу-пть, щр р1зноман1тн£ ф!зико-х1м1чн1 фагегори вдатн! певним чином впливати на метабол!чн! процеси м1кроорган1зм!в, випвляючи як 1нг1бугачу, так 1 стимулюючу д!ю на кл1тини в эалежност! в!д виду впливу, його 1нтенсивност1 та стану кл1тини. Серед таких вплив!в особливе м!сце займае група електромагн1тних фактор!в р!зних характеристик. Дане дослхдження спрямоване на розробку ефективного методу п1двишэннп бЮсинтегично! здатноет! продуцентхв б:олог!чно активних речовин а використанням властивост! кл!тин м!кроорган1зм1в ам!нювати метабол!зм пхд д£ею електромагн1тного поля.

Мета 1 задач! дослхдження. Метою досл1дження було вивчения впливу електромагн!тного поля, ир створюегься промисловим апаратом, на М1Кроорган1зми - промисловх продуценти б!олог!чно активних речовин 1 роэробка способу стимуляцН вас!вного матер!алу для отримання п!дви-

- г -

щених к1лькостей ц1льового продукту.

Означена мета вианачила основах задач! доел1дження:

- вивчити Д1Ю електромагнхтного поля на продуцента бхологхчно активних речовин, щр егдносяться до р1вних таксономхчних труп;

- визначити найОхльш ч/тливI до дхх ф1аиологхчн1 становища васхвного матер1алу продуцента;

- П1Д1брати оптимальнх параметри електроыагнхтно! стимуляцН б!осчнтеэу;

- дослхдити Д1Ю електромагнхтного поля на цхльов! продукти б£осинтеэу;

- вивчити можлив!сть отримання стимулюючого ефекгу накопичення цхльового продукту при кудьтивуваннх на оброблених електро-магнхгним полем середовищах;

- вивчити мохпив1ст1 вбереження 1 передач! ефакту електро-магн!тнох стимуляцН в наступних генерацхях культури при пересевах;

- обгрунтувати концепцхю, шр виэначае причини споетерхгаючих ефект1в.

Наукова новизна. В результат! вивчення електомагнхтного .поля лхн!йного хндукцхйного апарату на комплекс промислових м!кробних продуцентов, шр вхдносяться до р!аних таксономхчних груп, виявлена принципова можливхсть стимуляцН процес!в бхосинтеэу бхологхчно активних речовин. Шд!бран1 конкретно ушви отримання п1двищених к!ль-костей ц!льових продуктов ы1кробного синтезу. Встановлена бхологхчна активность вивчаемого поля по В1даошенню до ферментов та лектинхв, шр здеб£льшого пояснюе переххд клотин мхкрооргалхзмхв на новий ровень мегайолзаму. Внерше виявлена кореляцхя мхж величиною ефакту стимуляцН бхоеингезу 61олог1чно активних речовин, швидкхстю надход-

»ення помечено! по вуглецю глккози до юПтини ! тривал1стю д!! електромагн!тного поля на зас!вний материал. Наукова новизна роэроб-леного способу п!дтвердкена авторсышм св^доцтвом на винах!д N1592328 А 1 вхд 15. 09. 90.

IIa захист виносяться гак! науков! положения:

- отримання стимулюючого ефекту накопичешш б!олог!чно активних речовин промисловими мйфоорганхзмами-продуцентами можливе п!д впливом в1хрового ел!птичного електромагн!тного поля;

- використаннл електромагн!тного поля складно! конф!гурацН е дод!льшм для стимуляц!! м!кроорган1ам!в-продуцент!в Bcix таксоном!чних груп;

- причиною переходу м!кробно! кл!тини на р!вень метабол!зму, щр забезпечуе гйдвищення накопичення ц!льового продукту е !нтен-сиф!кац!я транспортних процесхв, активац!я ферментних систем, oMina стану макромолекул Шд д:ею електромагн!тного поля складно! конф!гурац!!;

- роэроблений на основ! теоретичиих та експериментальних досл!джень спосхб електромагн!тно! стимуляц!! продуцент!в мо. же бути реалхзований на б!отехнолог!чних п!дприемстах '!з

значним екоиом1Чним та еколог!чним ефектом.

Практична ц!нн!сть роботи обумовлена тим, щр доказана мож-ливхсть використаннп електромагн!тно! оСробки saciBHoro матер!алу промислових продуцент!в для отримання п!двищених к!лькостей ц!льово-го продукту. Роароблений спос!б електромагн!тно! стимуляц!i проду-дент!в б!олог!чно активних речовин характеризуемся простотою, технолог !чн!стю та '0коном!чнога ефэктивн!стю. Еколог!чним аспектом впро-£аджемня запропанованого способу в промислову практику е зниження KiJibKocTi ст!чиих вод та пов!тряних викид!в внасл!док вменшения чис-

ла ферм9нтад1й. Пропонуеться аикористання електромагн1тно1 обробки м1кроорган1гм1в у селекц!йн1й практиц! пздпрнемств галузх. Показана можливхсть отримання високого га сПйкого ефекту активацН ферменг-них I лектинових препаратов, .що дозволяе рекомендуваги електро-магнхтну обробку при промисловому використанн! фермент1в,

Апробацхя роботи. Матер1али дисертацх! допов£дались на Всесоюзна конференцИ "Разработка и внедрение вихревых электромагнитных аппаратов для интенсификации технологических процессов АВС-89" (Тамбов, 1989), Всесоюзной конференцИ "Методы получения, анализа и применения ферментов " С Юрмала, 1990), Республ1канськхй Науко-во-технхчнхй конференцН "Разработка и внедрение высокоэффективных ресурсосберегающих технологий, оборудования и новых видов шодевых продуктов в пищевую и перерабатывающую отрасли АПК" ( Киев, 1991), Симпоэ1ум1 "Химия лротеолитических ферментов" ( Москва, 1993), Ы1шароди1й иауксво-технхчнхй конферендИ "Розробка та апроваджэннл новых технолог!й та обладнання у харчову та переробну промисловост1" (Ки£в, 1993). По п£дсумках досл!джень опубл!ковало 10 наукових праць, серед яких - одне авторське св!доцтво на винах1д.

Структура та обсяг роботи. Матер!ал дисертацШю! роботи вюсла-дений в 4 роздхлах 1 складаеться 1в вступу, огляду л!тератури, ма-тер1ал!в та метод!в дослхдження, результатов та обговорення, вис-новкхв, додатк£в. Робота викладена на 150 стор!нках, вмхщуе 21 таблиц» та 10 малюнк1в. Список лхтератури включае 172 найменування вхтчизня-них та заруб1жнкх автор!в.

Зм1ст роботи. В огляд! л!тератури наведено анал!з сучасних да-них про реакцИ м1кроорган18м1в на деякх природнх та техногенн! фак-тори електромагн1тно£ природи. Показано, що гисока чутлив!сть мхкро-орган1ем1в до електромагн!тного поля обумовлюе в них морфологхчн!, Ф±зиолого-б1ох1м1чн1, культуральн! та генетичнх ам1ни. Ефективн1сть

дif електромагнхтного поля залежить вхд його характеристик. Добором параметрхв вплыву можливо добитися як !нгибуючого, так i стимулюючого ефекту на життедхяльн!сть MiitpoopraiiisuiB .

Ыатердали ! методи дослхджеяня. Дослхдження проводились в лабо-раторних та виробничих умовах. Як об* сети дослхджень використан! про-мислов! продуценти Ладиюшсъкого ааводу ферментних препарат1в: Реп. soi j tum шт. 1 M, Asp. aw amor i шт. 120/177, Вас. subtil is шт. 72; про-мисдов! продуценти Тргайльського Gioxiijimioro ааводу Brevibakterium sp. 22 и sp. Е-531; промисловий продуцент Плахгянського заводу кор-мових anTHGioTiiKiB Str. aiireofaciens шт. 019; npoMHcaoai продуценти Кихвського ааводу медичних препаратов Вас. poiyiryxa шт. ЕС 153-29/3, Str. aureofaciens шт. 633; Sacch. cerevisiae раса XII; продуценти , шр внаходяться на стадН впровадження Str. robeus шт. 605 (КТ1ХЦ), Str.' nignficans шт. 1MB 2082 t: Вас. subtil is шт. 316 Ü (Хн-т мхкробхологхх та в!руеолог!х хм. Д. К. Заболотного АНУкра!ни).

Джерелом електромагн!тного поля ( ЕШ1 ) е л!н!йний !ндукц!йний апарат (Л1А) промислового випуску, що працюе в!д мереж! промислового струму 50 Гц. Поле Л1А характеризуемся специфхчною просторовою структурою, створеною двома бхгучимя ыагнхтними полями, що направлен! назустрхч.' 1ндукц!я створеиого ЕШ складно! конф!гурац!! ета-новить 0,1 Тл. До ЕМП Л1А п!длягав васхвний матер!ал продуцент!в, що энаходився в споровому,, вегетативному станах, на щ!льних та р!дких кивильних середовииэх, у вигляд! водно! cycneHBii. Культиву-вания а метою отримання продукту б!осинтеву вд!йснювалось за стан-дартними або регламэнтниии схемами. Вялив ЕШ на промислов! продуценти вианачався за гм!ною накопичешга ц1льобих продуктов б!осинте-еу. Визначалшь ферментагшзи! акгивносгi: глюкоам!лазна. - глвкозоок-сидазним способонг-глюкозохзомераана - методом Dischod; прогеол!тич-на- методом ФОЛП i методом Ансона; елаетавна; л!пол!тична; /»-фрукто-

фуранозхдазна - лоляриметричним методом. Лкгивнхсть хлортетрацщихну вианачалась ххмхчним способом, полхмхксхну В - бхологхчним методом. Кхлькхсть Швину вианачалась методом електрофореву на бумазх. Вияв-лення лектинхв здШнювалооь методом гемаглютинадхх; вуглецьзв'яэу-юча специфхчнхсть лектинхв вианачалась по реакцх! !нг!бування ге-маглютинацхх. Kiлысеть Gijmy визначалась за методом Bradford. На-копичення MiKpoûHoï Схомаси визначалось ваговим методом. 1зоелект-ричне фокусування ферментних препарат1в лужно! сериново! протехнази проводили в борат-полхольн1й системх при град!ент! рН 9-12.

Для вивчення впливу ЕШ JIIA на транспорт глккоэи використаний рад!о!зотопний метод адаптований для дрхжджхв Sacch. cerevisias раса XII í багегер1й Вас. subtil is 316 П. Кл!тшш !нкубувались в роачин! глккози, пом1чен!й по атому вуглецю. Вхдб!р проб проводився кожн!

10 хвилин. Кд!тики в!дф!льтровувались i вх.дмивались на фхльтрах охолодженим роэчшгам солей цивильного середовищ. - Ойльтри з клхтина-

ми шсушувались при 60 °С на протяэ! 30 хвилин. К!льк1сть накопиче-Hoi (Штинами радхоактивно'х глюкози вианачалась при- радхометруваннх на сцинтиляцхйному лхчильнику 1217 RACKBETA (LKB/WALLAC) з викорис-танням сцинтиляц!йнох р!дини КО-103.

Результата, що подан! граф!чно були обробленх на 1ВМ-сум!сному персональному коми' тер! .за допомогою^ програми GRAPHER вере!! 1.75 ф!рми Golden Software, Ino. Функц!ональн! эалелщостх подан! у виг-ляд! пол!ном1В 2-4 CTyneHiB.

Резухьтати та !х обговорення. В робот i досл!джено впжв ЕМП JIIA на промислов! продуценти б!олог:чно активних речовин (БАР) та штамп,• пр -знаходяться у стад!! впровадяення (м!кром!цети, дрхида!, акти-ном1цети та бактер!! ). Зафхксоваио ефект стимуляц!! накопичення ц!льових продукт iв в насл!док обробки полем Л1А засхвного матер!алу продуцент!®. ЕфективШсть електромагнхтяо! (ЕМ) обробки зале лить вхд

тривалост! впливу, ф!зиолог1чного.стану зас!вного матер!алу, м!кроо-точення кл!тин продуцент !в.

Стимуляц1п б!осинтезу сол1зима продуцентом Реп. sol i tun у виг-ляд! водно! суспенз!! спор становила 40 7. при тривалост! обробки полем JIIA 20 хвилин. При зб!льшенн! експозиц!! до 30 i 40 хвилин фер-ментативна активн!сть культуральнох р!дини знижуеться в пор!внянн! з досягненим р!внем i складае 119 i 108 % в!дпов!дно до контролю. Сти-муляц!я б!осинтезу глккоам!лази продуцентом Asp. awamori в р!дкому середовищ! становила 18 Z при тривалост! обробки 30 хвилин. П!дзи-щення тривалост! обробки до 40 хвилин не веде до зб!льшэння ефекту активац!! ! складае при цьому 9%. ' Спостер!гались деяк! морфолог!чн! bmíhii, в!дпов!дн! зм!нам б!осинтетично! спромомюст!.

ЕШ JIIA виявляе стимулюючу д!ю на кл!тини др!ждж!в , яка поля-rae в аб!лыпеш1! накопичення б!смаси др!жддами Sacch. cerevislae на 12% при тривалост! обробки водно! суспенз!! зас!вного матер!алу 40 хвилин.

Д!ею ЕМП JIIA на продуцент« хлортетрацикл!ну Str. aureofaciens шт. 633 ! шт. 019 досягнуто зб!лыаення накопичення ц!льового продукту в культуральн!й р!дин! на 21 Z без зм!ни накопичення б!омаси при тривалост! обробки спорового зас!вного матерхалу 20 хвилин. Посл!довна обробка ЕШ1 спорового зас!вного матер!алу на протяв! 20 хвилин ! пот!м така ж обробка отриманого вегетативного аас!вного ма-тер!лу, призводить до гб!льшення накопичення хлортетрацикл!ну в культуральн!й р!дин! на 18 7. (табл, 1).

Д!я ЕМП JIIA на зас!вний матергал продуцент!в глюкозо!зомерази Str. robeus шт. 606 i Str. nigrificans urr. IMB Z082 виявляеться у зростанн! rffiQTO30iB0M9pEi3i¡0í активност! i збхльиенн! приросту б!ома-си, шр дае гидвищення продуктивном! в раз! 20-хвилшшо! оброб!Ш спор на 32 % в nopiBHmuii з контролем, в раз! посл!довно1 обробга!

спор 1 вегетативних кл!тин по 20 хвилин - на 7АХ (табл. 2).

Таблиця 1

Вплив ЕМП Л1А на б!осинтез хлортетрациклхну БИгерЬотусев.аигеоГааепз шт. 633

Вид засхвного материалу,оброб леного ЕШ Тривал1сть ДН , хвил. Активн1сть хлортетрацик-л!ну, Од/мл % эм1ни по в1дношенню до контролю

. контроль без обробки БВ70 ± 240 100

спори 20 40 60 7126 ± 193 6770 ±154 6352 ± 202 121 11Б 108

вегетативна ¡Штини 20 40 6175 ± 167 Б826 ±188. 105 100

спори 1 вегета-тивн! КЛ1ТИНИ 20+20 40 + 40 6920 ± 254 Б858 ±214 соо ■по ■гчч-*

Таблиця 2

Вплив ЕШ Л1А на б!осинтеэ глюкозо1зомерази 51герЬоягусез гоЬеив шт. 606

Вид зас!вного материалу, експовицхя ЕМП 20 хвил. Гдюкозо180-дараана актива сть, од/г % эм!ни ак-тивност! по в!двдиенню до контролю абсолютно суха бхомаса г/л Проду-ктив-н!сть, од/л % ЗМ1НИ продуктивном!

Без обробки 50,72±0,41 ' -100 10,38±0,24 526,6 100

(контроль)

Спори 57,31±0,50 113 12,16±0,30 696,9 132

Еегетативн! 55,28±0,33 109 11,92±0,18 658,9 125

ш11тини

Спори 1 веге- 68,57*0,45 135 13,40±0,25 918,8 174

тативнх

кл!тини

Для куль тури Яг. ацгеоГеаепз шт. 019 встановлено, шр ознака Шдвищено! б1осингетичнох спроможност! п1сля електромагШтно! обробки спор мае властив!сть релаксацН при постадхйному розмнояенн! вегетативного аас!вного матер!алу. Споатер1гаеться вирхвнювання б!осинтетично1 спроыожност! оброблено! культури до активност! конт-

роля nic-ira трьох nacaxin, тобто в третхй генерацН. Стимулпочий ефеит дхi поля JIIA спостерхгаеться при обробц1 зас!вного матер1алу бевпосередньо перед эас!вом 1 не niswime 1-2 години п!сля впливу. Падхння активносг! за три години збер!гання п!сля EU обробкк складае 12Х, а аа 4 години - 16%.

Для встановлення причин п!двипршш бхосинтетично! активност! актином!цет!в було проведене бхльш детальне вивчення процесхв, щр вхдбувакться п!сля елегаромапйтно! обробки культури Str. aureofaciens шт. 019. Мгкроскол1я перших годин розвитку спор у р!дкому середовищх вианачила б!льш однор!дне пророетання спор ! створення вегетативнгас гиф!в у BapiäHTi, щэ пройшов ЕМ обробку. Шдсумки моноклонових poaciBiB показали, пр ЕМ обробка спорового засхЕного матерхалу веде до niдвижения к1лькостх морфологхчниХ вархантхв, вхдповхдаючих високос рхвкю бхосингетичнох активности на 40%, пр пхдвищуе однорхдн1сть вегетативного aaciBiioro матер!алу 1 збхльшуе виххдний рхв.ень б!осинтетично! активном!. ■ Це явище мохе бути використано як заххд селекцхйно! робоги з актином!цетами на п!дприемствах галуз!.

Дхю ЕШ Л1А на бактер!! дослхджено на чотирьох продуцентах. До-сягнено зб!льшення накопичення пол!и!кс!ну В при обробц! спорового зас!вного магер!алу Вас. pol у туха на протяех 20 хвилин, шр склало 22%. Така к сама обробка плхекоеого зас!вного матер!алу Вас. subtilis шт. 72 дозволяе отримувати 10% зб!льшення накопичення лушох протеази в культуральнхй р!дин!,

Ефект стимуляц1! накопичення л!зину п!сля 20-хвилинно£ обробки культури ßrevibactenuiri sp. 22 ! sp. Е-531 на агаризованому середо-Biimi був неетхйким та лриймав значения 105-120 % по в!дношенню до контролю в залеиност! в!д початкового р!вня бхосинтетично! активности нродуцект!в С мал. 1). Шм!чено зб!льшення д!аметру колон!й

клхтин, up пхдлягали ЕМ обробцх. Так, дхаметр колон!й у контрольному

BapiaHTi пхсля 4 д!б вирощуваиня на ША при 30 °С складав 3-4 мм, ' а нхсля ЕМ обробки клхтин - Б-6 мм.

Д1я ЕМП ША призвела до вбхлылеиня культурою Вас. subtilis m.SfSb синтезу лулшох сериново! протехнави на 30-40 % 1 збхльшення накопичен-iin лектин1в в 4 рази пор1вняно з контролем при 40 хвилинах експозицхх ( табл. 3).

Таблица 3

Залели1сгь активносгх культурально! рхдини Вас. subtilis шт. 316 M вхд тривалостх обробки елекгромагнхишм полем

Трива- лхсть обробки, хвил. • А С Б , г/л Протеолхтична' активн!сть % змхни вхдносно контролю Лектинова активн1сть,

-1 титр / Ш1 -1 титр / г АСБ

ПО / мл го / г АСБ

0 контроль 2,45*0,14 1,44±0,11 587,1 ±11,40 100 ■ 4 1,63 ± 09,9

20 2,40±0,21 1,68±0,08 702,5 ±28,14 119 8 3,36 ± 0,29

40 2,43*0,10 2,0 ¿0,04 823,76*17,44 140 16 6,59 ± 0,27

60 2,42±0,18 1,85±0,04 767,48±40,60 130 16 6,65 ± 0,50

Величина ■ стшулюючого ефекту валекить Bin виххдного рхвня бхосинте-тично! спроможностх культури. Максимальний ефект активацП в1дмхчен при обробцх засхвного матерхалу у виглядх водно£ cycneHaii 18-годин-Hoi культури. Спостер£гаеться кореляц1я ефэкт!в активаци ка-аехнол1Тично£ i е лас таз но £ активностей при обробцх bcîx в api ami в засхвного waiepiajiy, шр буди дослхдженх. 06робка шрфолог1чних sapiaHTiB полем Л1А на протяз1 40 хвилин викликае збхлывення проте-олхтичнох активност1 в ycix вар1аптах, але не таке 1стотне, щоб в1дповхдати р!вню aimiEHOCTi р- i T-EapiamiB. Спостер1гаетьсп зболыаення posMipis кодонхй, що виросли э клхгил Вас. subtilis 316 M, якх п!длягали дН поля JIIA на протяа1 40 хвилин. Розмхр колонхй необроблених кл!тин становкв 10-13 мм, а д!аметр колонхй оброблених клхтин - 15-18 мм.

Шдсумки вивчення fliî ЕМП JIIA на промислов! продуценти бхолог1чно активних речовин, шр вхдноеяться до ргзних таксоном!чних труп, узагальненх в табл. 4 (стор. 12 ).

Зафхксоваяо auiuy активностей /т-фруктофураноз1даги Sacch. cerevisia раса XII, лужнох сериново£ проте!нази i лектинхв Вас. subtilis 316 M. При 20-хвилинн1Й обробцх полем JIIA cycneHaii кл.1тин Sacch. cerevisiae раса XII активн!сть ^-4руктофураноз1дааи зросла на 28% (мал. 2).

Естановлено п1двищення- протеолхтично! активное?! препарату луж-но£ оериново! проте!нази.лри д±i поля Л1А. Обробка-розчину препарату в фосфатному буфер! рВ=7,0 при експозицхх ЕМП SS-65 хвилин збхлылуе активность на 35%, а обробка в трис-борагному буфер! рН=12,0 при експозиц!£ 85-95 хвилин дае п!двишэняя активност! на 66% в!дносно контролю. Обробленх препарати б!лыа стаб!лш! при збер!ганн!. Поле JIIA впливае на ф!зико-ххм!чн! властивост! лужно! сериново! проте!на-

Таблица 4

Si я ЕМП JIIA на промисловх продуцента БАР рхзних таксономхчних груп

N ' Продуцент., штам Цхльовий продукт Ефегсс активацН Трива-лхсть об-робки, хвил. Фхвиологхчне становище продуцента

1 Pénicillium solitum шт. 1 M СОЛхЗхМ 140 20 водна суспеи--зхя спор

2 Asperglllus awamri шт. 120/177 глюкоам!лаза 118 30 вэгетативнх клхтини '

3 Saccharomyces cerevi-siae раса XII /э-фруктофуранозхдаэа -112 40 водна суспензия кл!тин

4 Streptomyces aureofa-ciens шт. 633 i 019 хлортетрациклхн 121 - 119 20 спори на агарх

5 Streotomyces rot&us шт. 606 Streptomvces nigrifi-cans шт. IMB 2082 глккоаохзомераза 135 20 спори х вегетативна клхтини

Б Bacil lus pol ymyxa, шт. БС-153-29/3- болхмхксин 122 20 спори на агарх

7 Brevibactenum sp. 22 i sp.E-531 лха!н 120 20 клхтини на агар1

8 Bacillus subtilis шт. 72 лужна протеаза 110 20 пл!вкова культура

9 Bacillus subtilis шт.316 M лужка серинова протехназа лектин 130 - 140 в 4 рази 40 40 водна суспен- зхя '.клхтин '

Мал. 2. Валив електромаг-HiTHoi обробки Sacch. се-revislae раса XII на актив-и!сть /*-фруктофуранозидази

«100

10 20 30 Триваш'сп обробки, явил.

зи, щр виявляеться в зм!н! !зоелектрично1 точки - в вих!дному препарат! максимальна к!льк!сть б!жу фокусуеться при pH 11,4-10,6, а в проб! я!сля 40 хвилин ЕМ д±£ - при pH 9,3-8,8 (мал.3).

Спсстер!гаеться зб!льшення питомо! гемаглютин!руючо! активном! у обробленого полем Л1А препарату лектина в 2 рази в пор!внянн! з контролем при тривалост! дН 40 хвилин. При цьому вуглеводна спед!ф!чн!сть обох препарат!в не виявляла як!ено! р1зииц!.

PaflioiaoTonHHM методом показано, шр обробка суспензН др!кдж!в Sacch cerevisiae на протяз! 30 хвилин полем Л1А призводнть до

зб!льшення швидкосг! транспорту глккози С14 в кл!тини на 30% в пор!внянн! з неекспонованими в ЕШ кл!тинами (мал. 4).

Вивчення зм!ни транспортних процес!в у бактер!й Вас. subtllis 316 М в залежност! вхд тривалост! ЕЯ обробки показала наявШсть прямо! залегаюст! м!ж шзидк!стю шстачаннл глякоэи в кл!тини ! три-вал!стю дН поля (мал. 5).

Мал. 3., Дзоедектричне фжусування препарат iE лужка! сернисто! проте!нази Вас. subtiiis 316 М А - контроль; Б - обробка полем

•-- Б!ЛОК Aggg

---- Протеол. активн!сть, Ag?g

----'— Град!ент pH

Пор!внюючи ц! дан! а результатами табл. 3, можна зробити висно-вок, пр при 40 хвилинах експозиц!! EMI зм!на швидкост! транспорту поживних речовин найб!льш сяриятлива для б!осинтезу кл!тиною вивчаю-чих речовин. Зб!льшення експозиц!! до 60 хвилин приводить до подаль-шого вростання швидкост! транспорту, однак продуктивна здатн!сть мае текденц!в до аниження. Причини збхльшення швидкост! постачання гдю-кози в кл!тини др1ид.и1в i бактерхй п!д впливом ЕШ Л1А, моиуть бути piSHOManiTHi. По-перие, швидк!сть просто! дифуз!! пхдвишуеться, якшр п!д д!ею ЕПМ в кл!тин! вЗДувагаься процеси, як! рхзко анижують концентрами глхкози. По-друге, може в!дбуватися активац!я фер-ментхв-переносник!в i Шдвищуватися швидк!сгь полегшей о! дифуз!!.

R50 s в

-«40

S30-

u20 ri о О

w g

( ) < i » j

/ / / / / / j S ' X / / Y • s* s /

i / —,— ....... г --—H-г—H -—.- -•—ri

Трпвал icTi шкубацЛ' , хвил.

Шл. 4. Вплив електромаг-HiTHoro поля нз транспорт

глюкози С14 у ДР1ЖДК1В Sacch. cerevisiaa раса XII оооо - обробка 7W7 - контроль

Нал. Б. Вплив електромаг-HiTHoro поля на транспорт

глюкози С*4 у бактерхй Bac. subtilis шт. 316 U оооо - контроль W7V - обробка 20 хвил. шиш - обробка 4.0 хвил. дддд - обробка 60 хвил.

20 40 60 ' 60 100 Трпвал ¡сть ¡тубащ"Г проб. хвил.

Таким чином, по подсумках експериментальних дослоджеиь мошна зробити висновок: ЕШ1 JIIA виявляе стимулюючу дою на продуцент!! БАР, шр призводить до подвшцення иакопичення Щльових продукт1в. 3 вико-рисганням рад!о!зотопного методу встановлено, що д!я поля JIIA обу-мовлюе прискорене постачання глюкози в кл£тини м1кроорганозм1В.

Анапоз експериментальних даних на основ! сучасних теор!й магн1Тоб!олог1чних ефектов дозволяе обгрунтуваги ионцэпц!ю, згодно

якох причинами аб!лыпення б!осинтетично! спроможностх промислових продуцентов БАР полем Л1А е активацхя ферментних систем кл!тии м!кроорган!зм!в, шр призводить до прискорення транспорту поживних речовин та створення продуктов метабол!вму. Припускаеться д!я елект-ромагн!тного поля на р!дкокристал1чний стан бЮлогхчних мембран, швидк1сть б!ох!м!чних реакц!й, ф!зичний стан макромолекул.

В роадхлх 4 на основ! теоретичних та експериментальних Д0СЛ1Д№НЬ роароблено способ електрамагнхтно! стимудяц!! продуцентхв БАР ! роаглянут! технхко-економзчнх аспекта його використання. Приведен! вар^анти типових процесуалышх схем використання способу при культивуванн! продуцент!в м!кром!цет!в, актином!цет!в ! бактер!й. На приклад! отримання хлортетрацикл!ну в умовах Плахтянського заводу кормових антиб!отик!в розроблена принципова технолог!чна схема, яка передОачае електромагн!тну обробку засхвного матер!алу продуценту (мал, 6, стор. 17). Показана моиаив!сть техн!чнога вд!йснення розроб-леного способу. Впровадження залропоноваш!■технологично! схеми доа-воляе зменшити к!яьк1сть ферментац!й на 15-1ВХ на р!к, щр д'ае еко-|юм!ю штер!альних, енергетичних та трудоЕИХ ресурсхв. Кр!м того, насл!дком скорочення к!лькост! ,ферментац!й е знюкення к!лькост! ст!чних вод 1 пов!тряних вик!д!в, вр визначае еколог!чне значения запропанованого способу.

Спос!б випробувано принаробц! досл!дних парт1й протиоп!кового ферментного препарату еластотерази в умовах Кихвського заводу мздич-них препаратов (цех К 6). Бих!д активном! в культуральн!й р!дин! контрольних ферк;ентац!й ( аа^вний матер!ал необроблений полем Л1А) складав 1,5-3,6 ПО/мл, в ферментац!ях а обробленим вас!вним матер! алом активн!сть складала 4,Б-Б,0 ПО/мл. Таким чином, виробнича програма може бути вд!йснена при скороченнх к!лькост! ферментац!й На 802.

Шл. 6. Технологична схема отримання хлортетрацикл!ну з використанням електро-магн1тнох стимуляцхх засхвного матерхалу продуцента.

1-вб1рник для кукурудаяного екстракту; 2-збхрник для кашалотового жиру; 3, 4-дозатори; 5-зм1шувач для приготування питомого середовища; В-гр1юча колона; 7-витримувач; 8-теп-лообмхнник; 9-ферментер; 10-головний фхльтр; И-хндивхдуальний фхльтр; 12-ф;льтр вхдпрацьованого повхтря; 13-чиста культура; 14-лабодаторний дхн!йнии 1ндукцхйнйй апа-рат; 15-вегетативний эасхвний матерхал в колбах; 1ь-зм1иувач для эасхвного середови-ЕЭ; 17-посхвний апарат; 18-л1нхйний хндукц1йний апарат в протоку.

Показана доцхдьнхсть використання ЕШ1 Л1А в селекд1йн1й прак-тиц! пхдтримуючого в!дбору при робот! в актином!цетами. Розроблена схема селокцхйного в!дбору, яка передбачае електромагн!тну обробку MOHoenopoBoí cycneiraii культур актиномЩетхв. Для Str. aureofaciens шт. 019 параметр»! обробки так! : !ндукц!я 0,1 Тл, частота 50 Гц, тривал!сть дИ 20 хвилин. Актчшахсть в!д1браних моно!волят!в контрольного вар!анту с клад ала 5250Ü70 ОД/мл, активн!сть монохзолят!в, отриманмх 1з обробленого полем вас1вного матер!алу складала 5Б64±206 ОД/мл. KpiM того , к!льк!сть морфологiчних BapianTiB з■ п!двищеною активнхстю п!сля обробки вростае приблизно в 1,5 рази. ЕМ обробка, як 8aci6 селекц!йно1 роботи, п!двишуе Ü ефективнхсть. Розроблена "1нструкц1я використання способу електромагн1тно! стимуляцИ продуцент б!олог!чно активних речовин для селекцхйно! роботи з акти-номхцетами" 1 прийнята до впровадження на Плахтянському завод! кор-мових aiiTuQíoTHKíв.

Висновки

. 1. При вивченн! дИ електромагн!тного поля лШйного !ндукЩйного впарату э параметрами: 1ндукц!я 0,1 Тл, частота 50 Гц на м!кроорган1зми - промислов! продуценти заф!ксована зм!на процес!в метабол!зму, шр приэводить до начопичення п!двишених к!лькостей б!олог!чно активних речовин.

2. Ефект активацН складав в!д 10 до 40 % для представникхв р!зних таксоном!чних груп (м!кром!цети - Реп. sol i tum шт. 1 M, Asp. awamri шт. 120/177¡ др!идж! - Sacch. cerevisiae раса XII; акти-ном!цети - Str. aureofaciens шт. 633 í шт. -019, Str. robeus шт. 606, Str. nigrlficsns "шт. IMB 20S2; 6aKTepif - Вас. pol у ту xa шт. БС-163-29/3, Brúvibacteriüm sp. 22 1 sp. E-531, Вас. subtilis шт. 72, Вас. subtilis шт. 316 H ) 1 залежав в!д тривалост! flii поля, ф!в1олог1чного стану аас!вного матер!алу, початкового р!вня б!осин-

- 19 -

тегичнof спроможносг! культури, мхкрооточенщ кл1тин.

3. Шдвищення б!осинтетично! спроможност! п!сля електро-MarniTHOi етимуляцН не закрхплюеться- генетично 1 мае властивхстъ релакаацП. Для Str. eureofaciens шт. 019 спостерхгаеться аникення бхосинтетично1 спроможност1 обробленох культури до р1вня контролю. п!сля трьох пасажхв.

4. Стимулюючий ефект fliï поля JIIA спостерхгаеться при обробц± аас!вного матер1алу бевпосередньо перед аасхвом на нивильне середо-вище та не пхзнхше 1-2 годин п!сля впливу.

6. В окремих випадках вхдм!чено амхиу морфологхчних оанак культур, що пов'яаана ai ам1ною б1осингетично1 спромоиюстх при електро-MarniTHift обробд1. Збхдьшення poBMipiB колонхй в!дм1чено у культур Brevibacterium sp. 22 i Вас. subtil is иг. 316 U. У культури Str. aureofaciens шт. 019 спостерхгалось гб!льшешш в 1,6 раэи к!лькост! морфолог1чних вар1антхв а високою бхосинтетичною активн!стю.

6. Обробка мвилыгаго середовища полем вкаааних параметрхв не призводить до пхдвищення бхосинтезу, одэ показано на прикладх культи-вування Вас. subtil is шт. 316 Ы

7. Показан активуючий вплив поля на ферменти: р-фруктофураноа и-дазу Sàcch. cerevisiae раса XII, - активнхсть я irai вроетае на 28 % i лумох сериновох проте1наэи, ефект &ктивацхi якох становить 35 i 55 %. в залежност! вхд рН буферного роачину. Оброблен! препарата харак-теризуються пхдвишзноп стабхльн1стю при зберхганн!.

8. Поле Л1А впливае на ф1зико-Х1М1Чн! властивостх макромолекул. Для обробленого препарату лулшох сериновох проте!нази позвано auiny !зоелектрично! точки з рН 11,4-10,6 у контрол! до рН 9,3-8,В.В 2 рази зросла гемаглютинуюча активнхсть обробленого розчину препарату лек-тину, при цьому вуглеводна спец1фхчн1сть не виявляе якосно! pianifui

а контрольним препаратом.

- ео -

9. 3 викорисганням радШзотопного методу показано, щр електро-магнхтна обробка призводить до зб!льшення швидкост! транспорту в Ш11тини глюкози, пом!чено! по атому вуглецю. Для дрхждххв 5ассЬ. сегеу|31 ае раса XII це 8б1льшення складало ЗОХ. Встановлена аалеж-н!сть м!ж тривалхстю д!1 поля ! швидкЮтю постачання глюкози в КЛ1ТИНИ бактер!й Вас. БиЬИИБ шт. 316 И.

10. Пропонуеться-гипотеза, зг!дно як!й причинами зб!льшення б!осинтетично! спрошюгает! промислових продуцент!в БАР полем Л1А ■€ активац!я ферментних систем кл±тин м1кроорган!эм1в, шр призводить до прискорення транспорту поживиих речовин 1 створенню продукт!в мета-бол!зму. Припускаеться вплив електромагн!тного поля на р!дкокрис-тал!чний стан б!омембран, швидк!сть б!Ох!м!чних реакций, ф!зичний стан макромолекул.

11. Розроблено спос!б електромагн!тно! стимуляц!! продуцент!в б!олог!чно активних речовин. Показана доц!льн!сть його використання в б!отехнолог1!, економ!чна ефективн!сть, наявн!сть еколог!чного ефекгу.

12. Рекомендуется використання способу електромагн!тно! стиму-ляц11 продуцент!в для селекц!йно1 роботи з актином!цетами на промислових п!дприемствах галуз!. Ефективк!сть селекц!йно! роботи п!двищу-еться за рахунок зб!лыиення !мов!рност! отримання активних морфо-лог!чних вар!анг!в.

Матер!али дисертац!! опубл!кован! в таких роботах:

1. Способ активации хлебопекарных дрожжей: А. с. 1592328 А1 СССР, КИИ С 12 Я 1/18 / Пичко К Б., Ельчиц С. а , Поваляева И. Е и др. - 1Б. 09.90. -Вал. N34.

2. Пичко В. Б. , Ежьчиц С. В., Поваляева И. В. Вшшмч олеюромчг-нитных полей лииейно-индукщошюго вращателя на активности клеток дрожжей // Разработка и внедрение вихречых электромагнитны< аппаратов для интенсификации технологических процессов - АВС-89: Тез. докл. Есесоюэ. конф.- Тамбов, 1989.-С. 41-42.

3. Ельчиц С. В., Шчко В. Б. , Поваляева И. К Внедрение линейно-индукционного арав'дтеля в технологические процессы микробиологических производств // Разработка и внедрение вихревых электромагнитных аппаратов длл интенсификации технологических процессов -АЕ0-а9: Тег. докл. Всесоюз. конф.- Тамбов, 1989.-С. 42-43.

4. Пичко В. Б. , Кудря В . А. , Поваляева И. В. Стимуляции действия и биосинтеза ферментов электромагнитным полем // Методы получения, анализа и применения ферментов: Тез. докл. Всесоюз. конф. - Юрмала, 1990.-С. 89.

5. Электростимуляция продуцента хлортетрациюшна / И. Е Поваляева, Е К. Пичко ,ЕЯ. Краснобрижий , Т. М. Беваенко; Киев. Технол. ик-т пищ. пром-сти.-Киев, 1991.- 9 е.- Рус.- Деп. в УкрНИИНТИ 13.05.91, M 663-УК91.

6. Влияние переменного электромагнитного поля на активность продуцента зластотеразы/ В. А. Кудря, ЕВ. Пичко, НЕ Колтукова, И. Е Поваляева // Микробиологический журнал. -1931. - Т. 53, N 2.-С. 28-32.

7. Поваляева И. В., Шчко а Е. , Ч/гуй Е А. Получение глюкозой- . зомеразы с использованием электростимуляции продуцента // Разработка и внедрение вкегкоаффективньн ресурсосберегающих технологий, оборудован::.! и новых видов пищевых продуктов в пищевую и перерабатывающую отрасли АПК: Тез. докл. Республ. науч. -тех. конф. 24-26 септ. 1991 г.- Киев, 1991,- С. 125.

8. Поваляева И. В., Колтукова IL а , Кудря Е А. Влияние электромагнитного поля на субтллизин Bacillus subtilis 316 M // Украинский биохимический журнал - 1993,- Т. 6Б, N 1.- С. 104-106.

9. Изучение действия электромагнитного поля на щелочную серино-вую протеиназу Bacillus subtilis / Е А. Кудря, В. В. Пичко, И. Е Поваляева, R В. Колтукова // Химия протеолитических ферментов: Тез. докл. симп. - Москва, 1993.- С. 123.

10. Поваляева I. В. , П1чко В . Б. , Чугуй В . О. Активация продуценте хлортетрациклхну // Розробка та вщювал-^ння нових технолог1й та обладнання в харчову та переробну промисловост±: Тез. докл. . Шянарод. науч.-тех. конф. 19-21 жовт. 1993 р. - Khîb,1993. - С.

П1дпипано до друку 4.10.93p фериат 60x84/16 ПапГр лрук. У»;ов. лрук. л. Т.О Тираж ГОР прииГрнии. Заказ

Нв'друковено ЦУОП ДНПП "Нлодяинконсерв" м. Ки1и,Саксагансъкого,