Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии гидролитического ферментного препарата циторецифен

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии гидролитического ферментного препарата циторецифен"

УКРАЇНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

ТОДОСІЙЧУК ТЕТЯНА СЕРГІЇВНА

УДК 57.083.12/. 13:577.15.07

РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ГІДРОЛІТИЧНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТУ ЦИТОРЕЦИФЕН

03.00.20 — Біотехлологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук

Київ-2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному технічному університеті України “КШ” • Українському державному університеті харчових технологій Міністерства освіти науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Шинкаренко Любов Миколаївна,

Міністерство освіти і науки України,

начальник управління прикладних досліджень та розробої

Офіційні опоненти: доктор технічних наук, професор

Єжов Валерій Микитович,

Нікітський ботанічний сад - національний науковий цент) директор

доктор технічних наук, професор Маринченко Віктор Опаиасович,

Український державний університет харчових технології кафедра біотехнології продуктів бродіння, екстрактів і напоїв, професор

Провідна організація: Український науково-дослідний інститут спирту т

біотехнології продовольчих продуктів,

відділ технології продуктів бродіння і мікробного синтезу.

Міністерство аграрної політики України, м. Київ

Захист відбудеться ЛР грудня 2000 р. о /'^‘годині на засіданні спеціалізоване вченої ради Д 26.058.03 в Українському державному університеті харчови технологій за адресою: 01003, м. Київ-33, вул Володимирська, 68, корп.А, ауд.311.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Українського державногі університету харчових технологій, за адресою:

01003, м. Київ-33, вул. Володимирська, 68

Автореферат розісланий ^^листопада 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат технічних наук, доцент

Ромоданова В.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТАЦІЙНОЇ РОБОТИ

Група гідролаз, субстратом для дії яких є клітинна стінка мікроорганізмів, дістала назву цитолітичних або літичних ферментів. Надзвичайно широкі сфери їх практичного застосування обумовлені здатністю лізоензимів до часткового або повного гідролізу мікробних клітин. Серед основних напрямків їх використання: аналітичні дослідження будови мікробних клітин та отримання їх структур; застосування як основи антисептичних засобів (медичних, ветеринарних, миючих) та харчових консервантів; утилізація відходів та підвищення поживної цінності субстратів.

Складна епідеміологічна та екологічна ситуація в Україні додає особливого значення антимікробним засобам ферментного походження. Адже гострота проблеми інфекційних захворювань пов'язана також із тривалим використанням антибіотичних речовин, що зумовлює розвиток антибїотикорезистентності збудників та ускладнює процес лікування.

Перспективним напрямком використання лізоензимів є деградація мікробних клітин з метою отримання біологічно- та імуноактивних структур, які є основою лікувально-профілактичних препаратів та продуктів функціонального харчування.

Актуальність теми. Повідомлення щодо відкриття нових продуцентів лізоензимів та розробок промислових технологій з їх використанням, що надходять з провідних “біотехнологічних” країн світу, таких як СІЛА, Японія, вказують на перспективність даного наукового напрямку і потребу у ферментних препаратах широкого спектру цитолітичної дії.

Поряд з цим, особливу актуальність робіт у даній галузі визначає обмежена кількість вітчизняних промислових продуцентів лізоензимів, а тим більше, ефективних технологій цих препаратів. Високий рівень витрат на виділення ферментних препаратів додає особливого значення вибору оптимальних шляхів отримання продукту, адже співвідношення витрат на виділення продукту до витрат на його біосинтез при отриманні ферментів складає 2:1.

Враховуючи сказане, актуальним та важливим є пошук продуцентів лізоензимів (або підвищення та стабілізація біосинтетичної активності вже відомих культур) та розробка технологій ферментних препаратів, що знайдуть застосування в самих широких галузях науки, медицини, промисловості та народного господарства.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися в рамках виконання НТУУ “КПГ науково-дослідних робіт за замовленнями ДКНТ та Міносвіти України: № 4305 “Наукові основи регуляції біосинтезу бактеріолітичних ферментних комплексів мутантів стрептоміцетів” (№ державної реєстрації 01974017546) та № 4309 “Розробка технології отримання харчової домішки з імунокоригуючими властивостями на основі лактолізатів” (№ державної реєстрації 019711017545).

Дисертант була відповідальним виконавцем НДР у 1996-1998 рр. Автором особисто проводилися дослідження біосинтетичної здатності отриманого продуцента ферментного комплексу, визначення технологічних режимів культивування. Дисертанту належить ідея та реалізація апаратурної та технологічної схем виробництва ферментного препарату, що включено до затвердженої нормативно-технічної документації.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є розробка ефективної технології гідролітичного ферментного препарату широкого спектру цитолітичної дії з використанням продуцента Зггеріотусеа гєсіГєішб \аг. Іуіїсш з підвищеною біосинтетичною здатністю.

Вибір мети роботи обумовив необхідність вирішення таких основних задач: •отримання високоактивного промислового продуцента ферментного комплексу на основі визначення впливу застосованого хімічного мутагену №■ метил-М-нітрозосечовини на мінливість культури та характеристику ферментного комплексу, що синтезується;

•встановлення властивостей та спектру дії ферментного комплексу штаму-мутанта;

•визначення особливостей біосинтезу цільового продукту отриманим мутантним штамом та технологічних параметрів його культивування; •встановлення технологічних режимів виділення і очищення ферментного препарату;

•створення технологічної та апаратурної схем виробництва ферментного препарату;

•розробка та затвердження нормативно-технічної документації на технологію гідролітичного ферментного препарату цитолітичної дії;

•визначення напрямків практичного використання одержаного ферментного препарату циторецифен.

Об'єкт дослідження - процес біосинтезу ферментного комплексу культурою БігерЮтусез гєсіґєпзіб уаг. Іуіїсиз.

Предмет дослідження - технологічні режими та умови отримання гідролітичного ферментного препарату.

Методи дослідження - традиційні, спеціальні мікробіологічні, генетичні дл* селекції продуцента. Стандартні біохімічні, фізико-хімічні методи для визначенні основних показників біосинтезу - вмісту білка, сухих речовин, pH, концентраці біомаси, продуктивності культури, амінного азоту, редукуючих речовин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено ефективністі застосування М-метил->І-нітрозосечовини для підвищення біосинтетичної здатност культури БігерЮтусез гєсіГєішб уаг. Іугісиз методом індукованого мутагенезу Визначені умови обробки, що дозволяють збільшити біосинтетичну здатнісп продуцента у 1,5-2 рази.

з

Встановлено, що дія мутагену привела до збільшення частки

низькомолекулярних компонентів (18-22 Ю) у складі ферментного комплексу, що зумовлює загальне підвищення його літичної активності.

Дістало подальший розвиток дослідження умов культивування отриманого продуцента. Визначено вплив основних параметрів біосинтезу ферментного препарату на спрямованість та інтенсивність процесу.

Встановлені біохімічні характеристики ферментного комплексу дозволили обгрунтувати використання баромембранної технології в процесі

післяферментаційної обробки культуральної рідини та очищення ферментного препарату.

Визначено спектр літичної дії циторецифену та характер взаємного впливу ферментного препарату і біосубстратів макроорганізму, наповнювачів готових лікарських форм, ферментів різної специфічності.

Практичне значення одержаних результатів. Отримано продуцент гідролітичного ферментного комплексу з підвищеною у 1,5-2 рази біосинтетичною здатністю. Штам депоновано в депозитарії ІМВ НАНУ за номером Streptomyces recifensis var. lyticus IMB Ac-5001, одержано позитивне рішення на видачу патенту України за заявкою на продуцент ферментного комплексу.

Розроблена нова технологія гідролітичного ферментного препарату широкого спектру цитолітичної дії з використанням одержаного продуцента.

Розроблена та затверджена нормативно-технічна документація на виробництво продукту (Тимчасові технологічний та технічний регламенти), запропонована технологія пройшла дослідно-промислові випробування на Ладижинському ДП “Ензим”.

Економічна доцільність розробки визначається розрахованим рівнем собівартості продукту (310 грн/кг) у порівнянні з існуючим препаратом аналогом пепсинормом (470 грн/кг).

Соціальний ефект результатів роботи полягає у можливості використання продукту у складі антисептичних засобів і для отримання біологічно активних субстанцій, особливо, зважаючи на зростання рівня антибіотикорезистентності більшості патогенних мікроорганізмів та зниження імунітету населення.

Особистий внесок здобувана. Автором особисто досліджено умови біосинтезу ферментного комплексу отриманим штамом культури, визначені властивості ферментного комплексу штаму-мутанта, запропоновані апаратурна та технологічна схеми виробництва препарату. Ряд лабораторних та виробничих досліджень, написання публікацій та розробка НТД виконані в співавторстві зі співробітниками кафедри біотехнології НТУУ “КПГ, кафедри генетики Львівського національного університету ім. І Франка, цеху ГЛЗ Ладижинського ДП “Ензим”, кафедри біотехнології мікробного синтезу УДУХТ, Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Інституту епідеміології та інфекційних захворювань ім. Л.В.Громашевського, Інституту отоларингології ім. О.С. Коломийченко.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були викладені й обговорені на засіданнях кафедри біотехнології НТУУ “КПГ, Міжнародній науково-технічній конференції “Проблеми фізичної і біомедичної електроніки” (Київ, 1997 p.), V конференції “Genetics, metabolism and application” (Нідерланди, 1996 p.), на Міжнародній науково-технічній конференції ’’Розробка та впровадження прогресивних ресурсоощадних технологій та

обладнання в харчову та переробну промисловість” (Київ, 1997 p.), на

’’Професорсько-викладацькій конференції присвяченій 100-річчю хіміко-технологічного факультету НТУУ “КШ” (Київ, 1998 p.).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 8 робіт, в тому числі 4 статті у наукових журналах, 2 статті у збірниках наукових праць, 2 тези конференцій. Отримане позитивне рішення про видачу патенту України.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, п'яти розділів, висновків, списку використаних бібліографічних джерел з 214 найменувань та 5 додатків. Робота викладена на 192 сторінках машинописного тексту, містить 26 таблиць та ілюстрована 33 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність дисертаційної роботи, сформульовано

мету та задачі дослідження, показано наукову новизну та практичну цінність

роботи, наведено відомості про особистий внесок, апробацію, структуру та обсяг роботи.

У першому розділі “Розробка технології мікробного синтезу: від продуцента до готової форми продукту” на основі аналізу та узагальнення даних літератури, наведена характеристика основних етапів одержання гідролітичних ферментних препаратів. Визначені основні групи мікробних продуцентів лізоензимів, особливості їх біосинтезу, а також субстратна специфічність літичних ферментів. Проаналізовані методи селекції промислових продуцентів на основі мутаційної мінливості із застосуванням мутагенів різної природи. Встановлені перспективні методи виділення та очищення ферментних препаратів в промислових умовах. Розглянуто аспекти практичного використання та ринок лізоензимних препаратів.

У другому розділі “Матеріали і методи досліджень” наведена характеристика об'єктів та методів досліджень, викладено методики проведення експериментів.

В роботі використовували продуценти літичного ферментного комплеску Streptomyces recifensis var. lyticus - штами 2435 (вихідний), К70, М4, S4 (похідні варіанти) та мутантний штам ІМВ Ас-5001, отриманий в процесі роботи, - з музек кафедри біотехнології НТУУ “КПІ”. В дослідженні застосовували препарати лізоензимного комплексу штаму ІМВ Ас-5001, отримані в лабораторних те

дослідно-промислових умовах на ДП “Ензим” з активністю 90 - 300 тис. од./г ( по відношенню до Lactobacillus bulgaricus).

Основні показники біосинтезу ферментного комплексу продуцентом визначали стандартними біохімічними та фізико-хімічними методами. Літичну активність (ЛА) клонів, штамів, ферментних препаратів визначали за здатністю до деградації клітин мікробних тест-культур, протеолітичну - за казеїнолітичною активністю та активністю серинових протеїназ.

Продуценти з підвищеним рівнем біосинтезу лізоензимного комплексу отримували, використовуючи індукований мутагенез - обробку спор культури N-метил-М-нітрозосечовиною в дозі 30 мг/мл впродовж 2 год в термоміксері “Eppendorf”.

Процес біосинтезу в лабораторних умовах проводили у трилітровому ферментері. Для визначення режиму очищення препарату мікро- та ультрафільтрацією використовували лабораторну фільтраційну камеру, досліджуючи різні типи мембран, їх селективність, робочий тиск процесів.

Вирощування продуцента у промислових умовах проводили у ферментері об'ємом їм3 (Nordon, Франція), розділення культуральної рідини - на сепараторі фірми Westfallia (Франція), очищення та концентрування ферменту проводили на плоскорамній касетній фільтраційній установці Millipor (Франція).

Статистичну обробку проводили з застосуванням t-критерію Ст'юдента для малих вибірок на 0,05 рівні значущості. Для характеристики біосинтетичних процесів розраховували рівняння регресії, які пов'язують рівні факторів з виходом процесу в області поверхні відгуку, що вивчалася. Перевірку адекватності рівнянь здійснювали по F-критерію Фішера. Статистичну обробку результатів проводили з використанням комп'ютерних програм Statgraphics, Harvard Chart XL 2.0, Excel Microsoft Office 97.

У третьому розділі “Отримання мутантів Streptomyces recifensis var. lyticus та вивчення їх властивостей” наведені результати роботи по селекції продуцента гідролітичного ферментного комплексу з підвищеним рівнем біосинтезу продукту.

Мінливість досліджуваної культури (Бабенко та ін., 1984; Кілочек, 1989) обмежувала можливість її промислового використання, однак широкий спектр літичної дії ферментного комплексу продуцента зумовив перспективність роботи по стабілізації та підвищенню його біосинтетичної здатності.

Визначення спонтанної мінливості досліджуваних штамів культури по відношенню до тест-культур Staphylococcus aureus та Lactobacillus bulgaricus дозволило встановити вищу мінливість лактолітичної активності (коефіцієнт варіації CV=15-80 %) у порівнянні із стафілолітичною (CV=ll-25 %). ЛА кожного клону оцінювали за здатністю лізувати тест-культуру і характеризували індексом літичної активності (ІЛА), що розраховували поділом діаметра зони лізису навколо колонії на значення діаметра самої колонії. Характеристика розподілу клонів за величиною

ІЛА в залежності від умов мутагенїзації, дозволила визначити оптимальну дозу Ы-метил-М-нітрозосечовини (ЗО мг/мл впродовж 2 год), що забезпечує підвищення біосинтетичної здатності культури.

На основі аналізу впливу мутагену на розподіл ІЛА клонів штамів, їх мінливість та динаміку утворення “плюс”— та “мінус”-варіантів встановлено вищу ефективність мутагенезу по відношенню до штаму 84: майже у 2 рази знижується коефіцієнт варіації (з 45 до 27 %), стафілолітична активність за ІЛА збільшується у

1,5-2 рази, лактолітична - у 2-2,5 рази. Дані, наведені на рис. 1, показують загальний перерозподіл величин ІЛА клонів штаму внаслідок мутагенної обробки.

80 -- __ _ - —■

40 — — _

0 £ГТ ТІ,

0 12 3 4 5 6 7

а)

ІЛА

100

80

60

40

20

0

З 4 б)

ІЛА

в)

г)

Рис. 1 Розподіл (%) величин ІЛА клонів штаму S4 до обробки МНС ( 11) та після неї (□):

а), б) - тест-культура L. bulgaricus; в), г) - тест-культура St. aureus; а), в) - 3 доба росту; б), г) - 7 доба росту.

Дані, отримані при культивуванні мутантних штамів на рідкому середовищі (табл. 1), свідчили, що рівень ЛА окремих варіантів загалом мав ту ж тенденцію вияву, що і при вирощуванні на твердому середовищі на попередніх етапах. Більшість мутантів Б4 виявили рівень ЛА синтезованого ферментного комплексу у

1,5-2,0 рази вищий за такий вихідної культури.

Із статистичною достовірністю 95% встановлено, що впродовж 10 генерацій коливання рівнів ЛА мутантного варіанту 73/1 загалом знаходиться у межах 7 % відносно початкової, що може свідчити про стабільність закріплення ознаки.

Таблиця 1

Динаміка біосинтезу ферментного комплексу мутантними варіантами ___________________культури Б. гєсіГєибіб уаг. Іугісш_____________________

Вихід- ний штам Мутант- ний варіант Активність, ОД./МЛ (стафілолгги’піа / лактолітична) Активність, % до контролю (стафілолітична / лактолітична) на 72 годину вирощування

Години вирощування

24 48 72

S4 73/1 1200 /1600 2090 / 5620 3240/ 11450 153,3/210,1

36/1 1300/1100 2310/4820 2860/10850 136,2/199,1

71/4 900/1000 1890 / 2600 2330/ 3820 110,9/ 70,0

3/4 1000 / 1200 2150/4820 2530 / 9450 120,5/173,4

М4 71/3 800 / 900 1850/3200 2450 / 6340 116,6/116,3

43/1 800 /1200 1800/4800 2520/ 7350 120,0/134,8

2435 61/3 700/1100 1850/3640 2350/6585 111,9/120,8

18/1 600 /1000 2000 / 3450 2840 / 6250 135,2/114,6

2435 (контроль) 600 /1000 1300/3500 2100/5450 100/100

При дослідженні особливостей вияву ЛА ферментного комплексу мутантного штаму встановлене розширення температурного та pH діапазону, де відмічається висока активність ферментів. Так, при зниженні температурного оптимуму (45-50°С) літичної дії комплексу до 30-40°С глибина лізису суспензії тест-культури ферментним комплексом мутанту на 5-10% більша, ніж аналогічний показник вихідного штаму.

При електрофоретичному дослідженні складу ферментних комплексів відмічено перерозподіл вмісту окремих ферментів комплексів вихідного та мутантного штамів культури. У ферментному комплексі мутанту 73/1 виявляється вищий вміст ферментів-білків з молекулярними масами біля 18-22 kD відносно вихідного штаму та одночасне зниження відсотку компоненту масою 58-60 kD, що, вірогідно, й визначає підвищення загального рівня активності комплексу.

Дослідження спектра літичної дії ферменту показало, що препарат у концентрації 120 од./мл суспензії клітин (ЗхЮ9 клітин у мл) вже при 37 °С здатний руйнувати 50-98% клітин більшості досліджених тест-культур (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Escherichia coli) і на 10-30 % знижує густину суспензій більш стійких патогенів (Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, Salmonella typhi).

Отриманий мутантний штам культури Streptomyces recifensis var. lyticus з підвищеним у 1,5-2 рази рівнем біосинтезу депоновано у Депозитарії Інституту мікробіології та вірусології НАНУ за номером ІМВ Ас-5001, одержано позитивне рішення на видачу патенту України за заявкою на продуцент гідролітичного ферментного комплексу.

У четвертому розділі “Встановлення технологічних режимів одержання ферментного препарату циторецифен” викладені результати дослідження умов культивування отриманого продуцента, визначені технологічні параметри біосинтезу та виділення продукту, подані технологічна та апаратурна схеми процесу.

Визначені базові компоненти поживного середовища для вирощування отриманого продуцента та їх концентрації, що забезпечують високі показники біосинтезу ферментного комплексу: соєве борошно (0,8%) та глюкоза (0,6%). Встановлено, що заміна глюкози в середовищі гідролізованим крохмалем (1%) призводить до зниження інтенсивності біосинтезу в межах 5 %, що є незначним. В той же час, очевидна економічна доцільність такої заміни й визначила використання гідролізованого крохмалю у складі промислового поживного середовища при розробці технології.

Ефективність біосинтезу значною мірою визначає pH поживного середовища та інтенсивність аерації при культивуванні. Експериментально показано, що початковий рівень pH 8,0-8,5 забезпечує накопичення продукту з високою літичною активністю та широкою специфічністю.

Режим аерації в процесі біосинтезу визначали, враховуючи піноутворюючу здатність культуральної рідини, яку виражали коефіцієнтом спінення ц. Встановлено, що найбільш ефективним режимом аерації продуцента при вирощуванні Є 0,4-0,5 Уповітря ^середовища*™, ЩО забезпечує високий рівень біосинтезу продукту та не приводить до підвищеного ціноутворення (ч 150-160 см) (рис.2).

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Інтенсивність аерації,

Уіов. Л£р.Х»»

Рис. 2 Вплив інтенсивності аерації на біосинтез цільового продукту та піно-утворюючу здатність культуральної рідини Б. гесіГеїкіз \ит. Іуіісиз Ас-5001.

0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Концентрація піногасника, %

Рис. З Вплив концентрації піногасника на біосинтез цільового продукту та піноутворюючу здатність культуральної рідини Б. гесіГеїшз у. Іуіісш Ас-5001.

Однак, визначена піноутворююча здатність культуральної рідини зумовила необхідність внесення в поживне середовище піногасника. В ході дослідження виявлено, що ефективною концентрацією використаного піногасника (пропінол Б-400) є 0,05-0,1 %, що значно знижує коефіцієнт ціноутворення середовища (з 150 до 110 см) та зберігає високу активність продукту - 10-11 тис. од./мл (рис.З).

Дослідження впливу концентрації та фізіологічного стану посівного матеріалу на процес біосинтезу ферментного комплексу дозволило встановити, що максимальний рівень синтезу активного продукту відбувається при внесенні 2-5% культури продуцента.

Перевірку та уточнення технологічних параметрів біосинтезу ферментного препарату продуцентом Бігеріошусез гєсіґєпбіб уаг. Іудеїв ІМВ Ас-5001 проводили в процесі дослідно-промислових випробувань технології на Ладижинському ДП “Ензим”. Культуру вирощували в ферментері об'ємом їм3 при додержанні наступного режиму: температура (28 ± 1)°С, початковому pH 8,0-8,2 , аерації 0,4-

0,5 Упойтря/УсередовищаХ хв, частоті перемішування 300 хв'1 (рис. 4 ).

1 р 100 г 40 г-д14

С? S : 90 35 " °12

^0,8 о А 6 = 0,6 в ’ я “і80 : І7о - І.бо ’ А зо S25 U S Гхю - jf 8

Ё : £50 -«20 ’ £ “ 0Q

св «0,4 - ! 40 О СЗ о!5 • К £ : а6 - сd

У ' н ‘п здукт и> о _іЗ 10 ' «5 • я 4 • У ** Г S

§0,2 - ,&20 - . н

о. С ■ с : ю 5 1§ 2 : Ё • оз

0 - 0 0 0

Тривалість вирощування, год

Рис. 4 Динаміка біосинтезу ферментного комплексу продуцентом S. recifensis v. Iyticus Ас-5001 в ході дослідно-промислової ферментації.

Процес накопичення лізоензимів різної спрямованості в часі при вирощуванні культури описується розрахованими рівняннями: у=0,75-8,01х+4,85х2+0,47х3-0,1 їх4 (по St. aureus), у=0,55-14,08х-14,25х2-2,67х3+0,15х4 (по Е. соїі) та у=0,75-8,01х+4,85х2+0,47х3+0,1 їх4 (по С. albicans).

Розділення культуральної рідини проводили на сепараторі періодичної дії Westfallia (Франція) в режимі, що забезпечував найбільш ефективне відділення біомаси продуцента, а саме: частота обертання барабану 5000-6000 хв'1 , тиск на вході в апарат 0,2 МПа.

Для очищення продукту використовували баромембранні методи: відділення високо- та низькомолекулярних баластних речовин відповідно мікро- та ультрафільтрацією.

В якості фільтруючих елементів при мікрофільтрації використовували анізотропні мембрани ВНДІСС (ацетатцелюлоза)- МФА-0,2; МФА-0,55 та мембрани Міліпор: Мїї GSWP-0,22, НА\УР-0,45 (ацетилцелюлоза); Вістах-200, Вістах-500 (модифікований поліефірсульфон) однакової пористості.

Робочий тиск, МПа —МФА-0,2 (1) МФА-0,55 (2)

■ МР-0,22 (3) • МР-0,45 (4)

3 4 5

Тип мембрани

— Вістах-0,2 (5)

— Вістах-0,5 (6)

Рис. 5 Характеристика процесу мікрофільтрації фугату культуральної рідини продуцента при використанні різних типів мембран.

Результати дослідження процесу мікрофільтраційного очищення продукту (рис. 5) дозволили встановити доцільність використання поліефірсульфонних мембран Вістах-200, що при робочому тиску 0,2-0,3 МПа забезпечують високу ефективність процесу: 89%-ний вихід продукту та очищення по білку у 1,4 рази. Саме цей тип мембран найменше піддавався впливу явищ концентраційної поляризації та ущільнення фільтруючих елементів, що виявляється у зниженні продуктивності процесу та втраті продукту.

Для ультрафільтраційного очищення та концентрування продукту використовували мембрани ВНДІСС: УАМ-30, УАМ-200 (ацетатцелюлоза);

мембрани Міліпор: РІХЇС (целюлоза), РТСС, Вісшах-5 (поліефірсульфон). Встановлена відсутність прямої залежності між розмірами пор фільтруючого елементу (у досліджуваних межах) та продуктивністю ультрафільтрації. Остання, у більшій мірі, залежала від матеріалу мембрани (рис. 6).

и

90

80

□

^70

С-4-| |60 Я 50

Робочий тиск, МПа —ф— УАМ-30 (1) —О— УАМ-200 (2)

40 >- 40

• РИЗС (3) ■ РГСС (4)

1,8 *’7@ I,6 ^

3

с.

1,5 I

15

1,4 о ’ с я

із §

1,2 I

1,1 I

2 3 4

Тип мембрани

• Вістах-5 (5)

Рис. 6 Характеристика процесу ультрафільтрації мікрофільтрату при використанні різних типів мембран.

Максимально селективною (85%) до літичного ферментного комплексу виявилася мембрана Вістах-5, що забезпечує високу продуктивність процесу, 83%-вий вихід продукту та очищення мікрофільтрату по білку у 1,7 раз.

Таким чином, в процесі мікро- та ультрафільтраційного очищення ферментного комплексу з використанням мембран Вістах, відбувається п'ятикратне концентрування фугату культуральної рідини, очищення продукту по білку у 2,3 рази та підвищення питомої літичної (цільової) активності з 4000 до 9060 од./мг білка при загальному виході продукту 60%.

Дослідження умов стабілізації цільової активності продукту в ультраконцентраті та при його розпилювальному висушуванні проводили, вносячи 1% речовин-стабілізаторів різної природи - солі, цукри, білки. При розпилювальному висушуванні з'ясувалася перевага №2804 як стабілізатора та термопротектора, що навіть при критичних режимах висушування (температурі на виході з камери 90°С) зберігав до 65 % активності продукту. Оптимальний режим висушування дозволив отримати продукт із залишковою активністю 90%, вологістю 5% та лактолітичною активністю 300 тис. од./г.

Встановлення особливостей біосинтезу продуцента ензимного комплексу — штаму-мутанта Б. гєсіґєпбіз уаг. 1 упоїв ІМВ Ас-5001, визначення технологічних параметрів виробничого культивування та методів виділення і очищення продукту покладені в основу технології ферментного препарату циторецифен. Розроблені принципові апаратурна та технологічна схеми виробництва подані на рис. 7 та рис.8.

Рис. 7 Апаратурна схема виробництва циторецифену:

1 -змішувач поживного середовища, 2 - стерилізатор поживного середовища, 3 - стерилізатор піногасника, 4 - інокулятор, 5 — ферментер, 6 — сепаратор, 7 — збірник фугату, 8 — ультрафільтраційна установка,

9 - збірник мікро-фільтрату, 10 - збірник-змішувач ультраконцентрату, 11- розпилювальна сушарка; трубопроводи: -1.0- вода, - 2.0- пара, -3.0- стерильне повітря, -4.0- холодоагент, -5.0- каналізація.

За даними проведених експериментів створено Тимчасові технологічний та технічний регламенти на виробництво ферментного препарату, а сама технологія пройшла дослідно-промислові випробування на ДП “Ензим” (м. Ладижин), результати яких подано у відповідному акті.

Музейна культура продуцента_________

Стерильне повітря

Поживне середовище

Піногасішк

Змінні фільтруючі елементи __________

Змінні фільтруючі елементи

Стабілізатор

Стерильне повітря Вода очищена

Поліетиленові пакети

Рис. 8 Принципова технологічна схема виробництва циторецифену.

У п'ятому розділі “Дослідження напрямків практичного використання циторецифену” наведені результати роботи, що дозволяють розглядати отриманий ферментний препарат як основу антисептичних медичних та миючих засобів, а також як інструмент для одержання біологічно активних структур мікробних клітин.

Цитолітичну активність циторецифену виявляли як при оптимальних умовах дії ферментного препарату (pH 7,0 , температура 50 °С), так і в умовах протікання

запального процесу у макроорганізмі - 37°С та pH 5,0. Встановлено, що зниження температури інкубації реакційної суміші від оптимальної в цілому є більш суттєвим фактором вияву ефективності препарату, ніж зміна pH. Однак, і за таких умов залишкова літична активність циторецифену лишається на рівні 60-70%.

а)

St. aureus Str. thermophilus

B. cereus

C. gravis Jft. aeruginosa 213

E. coli 74 Sh. zonnei 8/2 Salm. typhi Jfif. pneumoniae 539 Pr. rettgeri 115 C. albicans

100 80 60 40 20

^Рівень деградації, % ■ pH 5 □ pH 7

100

Рис. 9 Спектр цитолітичної дії циторецифену в залежності від умов інкубації реакційної суміші: при 37°С (а) та 50°С (б).

В ході досліджень визначені ефективні дози препарату по відношенню до використаних тест-культур, що впродовж 30-60 хв приводять до деградації 60-95% мікробних клітин. Так, дія препарату в дозі 160-180 од./мл клітинної суспензії з густиною 0,8 оптичних одиниць приводить до руйнування 80-95% таких мікробних патогенів як St. aureus , Ps. aeruginosa, Вас. cereus, Pr. rettgeri, Cor. gravis, E. coli. Більш стійкими до дії циторецифену виявилися Sch. zonnei, С. albicans, Salm. typhi, Kl. pneumoniae, клітини яких піддавалися руйнуванню на 40-70% лише при дозі препарату 250 од./мл.

Порівняння цитолітичної дії циторецифену та препаратів-аналогів (лізоциму, трипсину), що використовували при однаковому навантаженні по білку, показало вищу питому активність отриманого препарату. В однакових умовах стафілолітична активність циторецифену виявляється у 80%-вій деградації клітин, в той час, як аналогічний показник для трипсину і лізоциму становить ЗО та 43 % відповідно.

Висока залишкова активність циторецифену в присутності біосубстратів макроорганізму (клітинна тканина, кров) та при поєднанні з використаними наповнювачами лікарських форм (полісахаридами, асросилом) вказує на ефективність препарату як медичного засобу. Визначений кращим серел наповнювачів полісахарид ксантан дозволяє зберегти до 80% активності препарату

та, створюючи гельову консистенцію в концентрації 10,0 мг/мл, пролонговує дію ферменту та робить зручним його застосування.

Характер взаємного впливу циторецифену та ферментних препаратів, що містяться у миючих засобах - протеїнази, ліпази - також вказує на можливість створення миючих засобів з антисептичними властивостями.

Встановлена ефективність використання циторецифену для лізису молочнокислих бактерій (Lactobacillus delbrueckii), клітинні структури яких є джерелом біологічно активних речовин, що можуть бути основою лікувально-профілактичних засобів та продуктів функціонального харчування. В процесі роботи визначені оптимальні режими деградації біомаси лактобацил для одержання препаратів клітинних структур різної глибини лізису, яка у свою чергу обумовлює рівень біологічної активності кінцевої субстанції. Так, при 50°С циторецифен у концентрації 30 од./млрд клітин L. delbrueckii через 1 год на 100 % руйнує клітинну суспензію густиною 0,8 опт. од. та через 2 год суспензію густиною 50 опт. од.

Встановлення ефективності дії ферментного препарату у більш густих клітинних суспензіях дозволяє використовувати його у промислових технологіях біологічно активних клітинних структур, де очевидна економічна доцільність обробки висококонцентрованих суспензій.

ВИСНОВКИ

Результатом виконаної роботи є розробка науково обгрунтованої технології гідролітичного ферментного препарату циторецифен з використанням баромембранних методів виділення та очищення. Ефективність запропонованої розробки підтверджена актом промислових випробувань технології на Ладижинському державному підприємстві “Ензим”.

Одержані результати дозволяють зробити наступні основні висновки:

1.На основі дослідження впливу мутагену М-метил-ІЧ-нітрозосечовини на мінливість та біосинтетичну здатність продуцента Streptomyces recifensis var. lyticus встановлено, що обробка культури мутагеном в дозі ЗО мг/мл впродовж 2 год приводить до підвищення продуктивності культури у 1,5-2 рази. Стабільність вияву підвищеного рівня продуктивності культури, визначена зі статистичною достовірністю 95%, дозволяє говорити при генетичне закріплення набутої в результаті мутагенезу ознаки.

2.Аналіз складу ферментного комплексу мутантного штаму у порівнянні з батьківським виявив відносне збільшення низькомолекулярних компонентів (1822 kD), що можуть бути віднесені до мурамідаз. Вказаний перерозподіл вмісту окремих ферментів у складі комплексу внаслідок дії М-метил-КІ-нітрозосечовини, очевидно, й зумовив підвищення його загальної активності.

3.Показана можливість заміни в поживному середовищі глюкози гідролізованим крохмалем. Визначено концентрації базових компонентів, що зумовлюють біосинтез високоактивного ферментного препарату: соєве борошно -0,8%, гідролізований крохмаль - 1,0%.

4.Встановлені технологічні режими культивування продуцента, що забезпечують отримання цільового продукту високої активності та широкої специфічності: температура (28±1) °С, початкове pH 8,0-8,2 , аерація 0,4-0,5 VnoeiTp„ /Усередовшшххв, частота перемішування 300 хв"1, концентрація піногасника в середовищі 0,1%.

5.Показана ефективність застосування баромембранних методів в технології ферментного препарату, що дозволяють у короткий термін очистити та сконцентрувати продукт на одному обладнанні (плоскорамній ультрафільтраційній установці “Millipor”) зі змінними фільтруючими елементами. Встановлено, що оптимальний ефект очищення та концентрування досягається при використанні поліефірсульфонних мембран “Вісмах” з номінальною молекулярною масою, що відсікається, 5 та 200 kD для ультра- та мікрофільтрації відповідно при селективності мембран 80-85%.

6.Визначені режими очищення та концентрування ферментного препарату, що зумовлюють високу продуктивність процесу та отримання якісного продукту: мікрофільтраційне очищення при робочому тиску 0,15 МПа та продуктивності 140л/(м2-год), ультрафільтраційне концентрування при робочому тиску 0,5-0,6 МПа та продуктивності 155 л/(м2-год).

7.Розроблена технологія гідролітичного ферментного препарату забезпечує очищення ферменту у 2,5 рази, вихід продукту до 60% при літичній активності (по відношенню до Lactobacillus bulgaricus) 250-300 тис.од./г.

8.Встановлений температурний діапазон літичної активності циторецифену (37-50°С) поряд зі здатністю до деградації широкого спектру клітин патогенних мікроорганізмів обумовлює можливість застосування ферментного препарату у складі антисептичних медичних та миючих засобів. Визначені ефективні дози препарату: циторецифен у концентрації 120 од./мл суспензії клітин (ЗхЮ9 кл/мл) здатний руйнувати 50-98 % клітин St. aureus , Ps. aeruginosa, Вас. cereus, Pr. rettgeri, Cor. gravis, E. coli, у концентрації 250 од./мл - до 40-70% Sch. zonnei, С. albicans, Salm. typhi, Kl. pneumoniae.

9.Визначені режими використання циторецифену для деградації біомаси Lactobacillus delbrueckii з метою отримання біологічно активних клітинних структур, що можуть бути основою лікувально-профілактичних засобів та продуктів функціонального харчування.

Отриманий мутантний штам-продуцент депоновано в депозитарії ІМВ НАНУ за номером ІМВ-Ас-5001, одержано позитивне рішення про видачу патенту України.

На основі проведених досліджень розроблені та затверджені Тимчасові технологічний та технічний регламенти на виробництво гідролітичного ферментного препарату, проведені дослідно-промислові випробування технології ш Ладижинському ДП “Ензим”.

Розрахована собівартість отриманого ферментного препарату складає

0,31 грн/г у цінах 1999 року. Собівартість препарату, близького за специфічністю ді до циторецифену, пепсинорму - 0,47 грн/г.

Основний зміст робота викладено у публікаціях:

1. Отримання мутантів Streptomyces recifensis var. lyticus зі зміненою бактеріолітичною активністю / Тодосійчук Т.С., Шинкаренко JI.M., Федоренко В.О., Басілія Л.І. // Мікробіол. журн. - 1998. - № 4. - С.49-56.

2. Вплив наповнювачів лікарських форм на бактеріолітичну активність

ферментного комплексу з Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/M /

Тодосійчук T.C., Жолнер Л.Г., Шинкаренко Л.М., Касперський В.О. // Наукові вісті НТУУ “КПГ. - 1998. - №1. - С.141-145.

3. Шинкаренко Л.М., Жолнер Л.Г., Тодосійчук Т.С. Вплив біосубстанцій макроорганізму на активність ферментного препарату з Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/M // Експрес-новини: наука, техніка, виробництво. - 1998. - № 3. -С.48.

4. Шинкаренко Л.М., Жолнер Л.Г., Тодосійчук Т.С. Визначення спектра дії ферментного препарату з Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/M // Експрес-новини: наука, техніка, виробництво. - 1998. - № 4. -С.49.

5. Тодосійчук Т.С., Шинкаренко Л.М., Поводзинський В.М. Вивчення біосинтетичної здатності штамів-мутантів Streptomyces var. lyticus 2435. - К.: Наукові праці УДУХТ. - 1998. - № 4. -С.127-129.

6. Лошнцкий П.П., Тодосийчук Т.С., Шинкаренко Л.Н. Влияние нетеплового электромагнитного излучения на биосинтез молочнокислых бактерий // Тематический вып. сб. «Электроника и связь» по материалам Международной научно-технической конференции “Проблемы физической и биомедицинской электроники”. - К.: НТУУ “КПГ. -1997. -С.120-125.

7. Shinkarenko L.N., Skripets E.Y., Todoseychuk T.S. A new technology for the production of immunocorrectors and adjuvants, based on lactic acid bacteria antagonists // Abstracts of Fifth symposium on Lactic acid bacteria “Genetics, metabolism and application”. - Netherlands: Veldhoven.- 1996. - P.41.

8. Тодосійчук T.C., Шинкаренко Л.М., Поводзинський В. М.. Використання гідролітичних ферментів для одержання препаратів-імунокоректорів мікробного походження // Тези доп. Міжнар. наук.-техн. конф. ’’Розробка та впровадження прогресивних ресурсоощадних технологій та обладнання в харчову та переробну промисловість”. - К.: УДУХТ. -1997. -С. 45.

АННОТАЦИЯ

Тодосийчук Т.С. Разработка технологии гидролитического ферментного препарата циторецифен. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. Украинский государственный университет пищевых технологий, Киев, 2000.

В диссертации представлены экспериментальные исследования и практические данные по разработке технологии гидролитического ферментного препарата циторецифен с использованием полученного продуцента Streptomyces recifensis var. lyticus IMB Ac-5001.

Продуцент ферментного комплекса с повышенной в 1,5-2 раза продуктивностью был получен обработкой родительского штамма Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 мутагеном Ы-метил-К-нитрозомочевиной. Споровая суспензия штамма инкубировалась в течении 2 часов с мутагеном в концентрации 30 мг/мл, определенной как оптимальная для стимуляции биосинтетической способности культуры.

Полученный мутантный штамм-продуцент гидролитического ферментного комплекса S. recifensis var. lyticus IMB Ac-5001 депонирован в Депозитарии Института микробиологии и вирусологии НАНУ им. Д.К. Заболотного.

Анализ состава ферментного комплекса мутантного штамма показал относительное увеличение доли низкомолекулярных компонентов (18-22 kD), которые могут быть отнесены к мурам ид азам. Отмеченное перераспределение содержания отдельных ферментов в составе комплекса вследствие действия мутагена, очевидно, и обусловило повышение общего уровня его литической активности.

Получение ферментного препарата циторецифен проводили выращивая продуцент S. recifensis var. lyticus IMB Ac-5001 в жидкой питательной среде на основе соевой муки и гидролизованного крахмала. После отделения биомассы продуцента сепарацией фильтрат очищали и концентрировали, используя баромембранные методы — микро- и ультрафильтрацию.

В лабораторных и производственных условиях на основании экспериментальных данных установлен тип мембранных элементов для микро- и ультрафильтрации, а также режимы данных процессов, обеспечивающие эффективную очистку и получение высокоактивного продукта. В работе использовали лабораторную фильтрационную ячейку и плоскорамную ультрафильтрационную установку “Millipor”. Оптимальный эффект очистки и концентрирования обеспечивается при использовании полиэфирсульфонных мембран “BicMax” с номинальными отсекаемыми молекулярными массами 5 и 200 kD для ультра- и микрофильтрации соотвественно при селективности мембран 80-85%.

Высокая продуктивность баромембранных процессов (140-155 л/м2-ч) и получение качественного продукта обеспечивается при рабочем давлении микрофильтрационной очистки 0,15 МПа, улырафильтрации - 0,5-0,6 МПа.

Исследование стабилизирующего действия ряда веществ на активность ферментного комплекса в ультраконцентрате и в процессе распылительной сушки показало целесообразность внесения 1% Na2S04 перед сушкой.

Разработанная технология гидролитического ферментнго препарата обеспечивает очистку фермента в 2,5 раза, выход продукта до 60% при остаточной влажности 5% и целевой (литической) активности по отношению к Lactobacillus bulgaricus 250-300 тис. ед./г. Рассчитанная себестоимость полученного ферментного препарата составляет 0,31 грн/r в ценах 1999 г.

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены Временные технологический и технический регламенты производства

гидролитического ферментного препарата, проведены опытно-промышленные испытания технологии на Ладыжинском ГП “Энзим”.

Установлен температурный диапазон литической активности циторецифена (37-50°С) и способность к деградации широкого спектра патогенных микроорганизмов. Это обуславливает возможность применения полученного ферментного препарата в составе антисептических медицинских и моющих средств. Определены эффективные дозы препарата: в концентрации 120 ед./мл суспензии клеток (3x109 кл/мл) препарат способен разрушать до 90% клеток St. aureus, Ps. aeruginosa, Вас. cereus, Pr. rettgeri, Cor. gravis, E. coli; в концентрации 250 ед./мл - до 40-70% Sch. zonnei, С. albicans, Salm. typhi, Kl. pneumoniae.

При изучении вариантов лекарственной формы циторецифена исследован ряд наполнителей и способов соединения с препаратом. Определенный как оптимальный полисахарид ксантан позволяет сохранить до 80% целевой активности

и, создавая гелевую консистенцию в концентрации 10,0 мг/мл, пролонгирует действие фермента и делает его применение удобным.

Показана целесообразность использования циторецифена для деградации биомассы Lactobacillus delbrueckii с целью получения биологически активных клеточных структур, которые могут быть основой лечебно-профилактических средств и продуктов функционального питания.

Ключевые слова: продуцент, мутагенез, культивирование, ферментный препарат, литическая активность, тест-культура, баромембранные методы очистки, спектр действия, антимикробное средство.

АНОТАЦІЯ

Тодосійчук Т.С. Розробка технології гідролітичного ферментного препарату циторецйфен. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. Український державний університет харчових технологій, Київ, 2000.

В дисертації подані результати експериментальних досліджень по розробці технології гідролітичного ферментного препарату циторецифен з використанням отриманого продуцента Streptomyces recifensis var. lyticus IMB Ac-5001.

Продуцент ферментного комплексу з підвищеною у 1,5-2 рази продуктивністю був отриманий обробкою батьківського штаму Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 мутагеном М-метил-К-нітрозосечовиною.

Розроблена технологія передбачає виробниче культивування продуцента у рідкому поживному середовищі, відділення біомаси сепарацією, очищення та концентрування продукту з використанням баромембранних методів — мікро- та ультрафільтрації, стабілізацію та розпилювальне висушування ферментного препарату. Запропонована схема виділення забезпечує очищення ферменту у 2,5 рази, вихід продукту до 60% при залишковій вологості 5% та літичній активності 250-300 од./г.

На основі проведених досліджень розроблені та затверджені Тимчасові технологічний та технічний регламенти виробництва гідролітичного ферментного

препарату, проведені дослідно-промислові випробування технології на Ладижинському ДП “Ензим”.

Показана можливість використання циторецифену у складі антимікробних медичних та миючих засобів, а також як інструменту для отримання біологічне активних мікробних структур, що є основою лікувально-профілактичних препаратії та продуктів функціонального харчування.

Ключові слова: продуцент, мутагенез, культивування, ферментний препарат, літична активність, тест-культура, баромембранні методи очищення, спектр дії антимікробний засіб.

ANNOTATION

Todosijchuk T.S. Development of a technology of hydrolytic enzyme preparatior cytorecifen. - Manuscript.

Dissertation submitted for the competition for a science degree of Candidate o: Technical Science on speciality 03.00.20 - biotechnology. Ukrainian State University o: Food Technologies, Kiev, 2000.

There are a results of experimental investigation by the development of e technology of hydrolytic enzyme preparation cytorecifen with the using of the receivec producer Streptomyces recifensis var. lyticus IMB Ac-5001 are given in the dissertation.

The producer of enzyme complex with the 1,5-2 time higher productivity wa: received by the treatment of a native strain Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 bj mutagen N-metyl- N-nitrosourea.

The developing technology is foresee of producing cultivation of producer in і liquid medium, separated the biomass by a separation, purification and concentration o product by the using of baromembranes methods - micro- and ultrafiltration, stabilizatioi and drying of enzyme preparation. Proposing scheme of a separating is secure o purification of enzyme in 2,5 time, way out of product to 60% when the remnantinj moisture is 5% and the lytic activity is 250-300 thous. un./g.

On the base of the conducting investigation there were create and ratify Th< Temporary technological and technical rule of the production of hydrolytic enzymi preparation, there were carry out the experimental-industrial testing the technology on th< Ladygyn SF “Enzyme”.

There were show the possibility of using the cytorecifen in composition o antimicrobial medicine and washing means, as well as the instrument for the receiving o biologycaly active microbe structure, what are the base of treatming-profilactmj preparations and the products of function nourishment.

Kev words: producer, mutagenesis, cultivation, enzyme preparation, lytic activity test-culture, baromembranes methods of purification, spectrum of action, antimicrobia means.

Подяка. Автор висловлює глибоку вдячність доценту кафедри біотехнологі мікробного синтезу УДУХТ, к.т.н. В.М. Поеодзинському за корисні порадь методичну і практичну допомогу в інженерній реалЬації розробки та створень технічної документації.