Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка системы экспрессии белков на основевиpyca Венесуэльского энцефаломиелита лошадейи исследование функционирования промоторасубгеномной 26S РНК этого виpyca

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы экспрессии белков на основевиpyca Венесуэльского энцефаломиелита лошадейи исследование функционирования промоторасубгеномной 26S РНК этого виpyca"

г • ОД

г о июн ь.

Министерство здравоохранения й медицинской промышленности Российской Федерации НПО "Вектор" Научно-исследовательский Институт Молекулярной Биологии

На правах рукописи

Дрыга Сергей Александрович

Разработка системы экспрессии белков на основе вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей и исследование функционирования промотора субгшомкой 265 РНК этого вируса.

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических

наук

Кольцове -1994

Работа выполнена в Научно-Исследовательском йнсгппуге Молекулярной Биологии, НПО "Вектор", министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук C.B. Нетесов.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Н.А. Колчанов Кандидат биологических наук И.Х. Урманов Ведущая организация: Институт Биоорганической химии СО РАН Защита диссертации состоится '^"а^ла 1994 г. в часов на заседании Специализированного совета К 098.08.01 при научно-исследовательском институте молекулярной биологии НПО "Вектор", по адресу: 633159, Новосибирская обл., Новосибирский р-он, п. Кольцово.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке научно-исследовательского института молекулярной биологии НПО "Вектор".

Автореферат разослан 4L?.

е^сча^л- 1994 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета

кандидат химических шу£) J л /-Шубина Т.Н.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время разработаны и применяются системы экспрессии в клетках эукариот, основанные на использовании систем репликации и транскрипции различных вирусов, геном которых состоит как из РНК, так и из ДНК (например вируса осповахцины, бакуло- и адено-вирусы, вирус саркомы Рауса, обезьлний вирус 40, вирус гепатита дельта, полиовирусы). Использование апьфавирусов для экспрессии белков имеет несколько преимуществ, по сравнению с другими вирусами: а) адьфавирусы могут инфицировать широкий спектр клеток, включая клетки ' насекомых, птиц и позвоночных, что позволяет изучать процессинг белков в разных клетках без получения разных рекомбинантных вирусов; б) могут быть синтезированы большие количества цитоплазматических РНК и белков; в) полноразмерные кДНК копии для получения in vitro инфекционных РНК-тран скриптов получены для нескольких апьфавирусов, включая вирусы Росс-Ривер, Леса Семлики, Синдбис и Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEE); эти копии позволяют быстро конструировать рекомбинантные молекулы РНК; г) для вируса Синдбис получен и охарактеризован набор мутантов, позволяющих модулировать свойства рекомбинантных вирусов. Для вируса VEE разработаны живые вакцинные штаммы, что в будущем может позволить использовать систему экспрессии, основанную на вакцинном штамме, для применения в качестве вакцины. Все это показывает перспективность разработки систем экспрессии, основанных на геноме ' альфавирусов.

Ко времени начала работы были опубликованы только две статьи, посвященные разработке системы экспрессии на основе вируса Синдбис с использованием дефектных интерферирующих вирусных частиц. Согласно последним публикациям из известных альфавирусов наиболее активно развиваются разработка и применение систем экспрессии, основанных на вирусах Синдбис и Леса Семлики. Причем доя вируса Синдбис разрабатывают» все стратегии экспрессии, а для вируса Леса Семлики только стратегия, основанная на использовании двух дефектных РНК, одна из которых не способна направлять синтез

структурных белков, а другая кодирует только их и не способна упаковываться в вирион.

Цель работы. В задачи настоящей работы входило конструирование лолноразмерных ДНК-копий рекомбинантных вирусов на основе вируса VEE, получение РНК, и, на этой основе, получение инфекционных вирусов и изучение их свойств. Основной целью данного исследования являлась разработка системы экспрессии белков на основе генетического аппарата вируса У ЕЕ.

Научиая воншв в практическая ценность работы. В результате проведенной работы сконструирован набор рекомбипантных плазмид, несущих полноразмерную кДНК вируса VEE со встроенным геном рге-Si-S вируса гепатита В, на матрице этих плазмид синтезирована инфекционная РНК и получены рекомбинантчые вирусы.

Впервые определен участок генома вируса VEE, вставка в который чужеродного гена приводит к его эффективной экспрессии. Показано, что механизм функционирования 26S промотора вируса VEE отличается от других альфавирусов.

На основе анализа полученных данных построена модель вторичной структуры 26S промотора альфавирусов и сформулированы условия, необходимые для его функционирования.

Изучена стабильность разработанной системы экспрессии при пассировании на культуре клеток и способность, экспрессироватъ целевой продукт как in, vitro, так и in.vivo. Показано, что иммунизация животных рекоыбинантным вирусом приводит к синтезу специфических к целевому продукту антител.

Изучено влияние вставки на биологические свойства рекомбииантного вируса. Обнаружено, что встройка дополнительного генетического материала в геном вируса по крайней мере не приводит к увеличсишо его патогенных свойств для животных, при сохранении .выхода вируса при заражении культуры клеток.

В качестве практического применения отработана методика выделения HBsAg из инфицированных рекоыбинантным вирусом клеток. Показано, что HBsAg, полученный таким путем, можно с успехом применять в иммуноферыснтпых тест-системах.

Объеи а структура даессрклет. Диссертация состоит из введения и трех глаз; Литературного обзора по структуре и решшкаши альфавирусов и векторным системам, основанным на их геноме (Гса^а

1), Материалов и Методов Исследования (Глава 2), Результатов и их обсуждения (Глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы (89 ссылок). Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 24 рисунка и 6 таблицы.

Лспробашш работы. Материалы диссертации докладывались на межведомственной конференции "Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекции" (Кольцове, 1993), IX Международном Конгрессе по Вирусологии (Glasgow. United Kingdom. 1993).

По материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Использовзнпые сокращенна. VEE - вирус Венесуэльского энцефаломиелита лошадей, SIN - вирус Синдбис, SFV - вирус Леса Семлики. LD50 - 50% летальная доза. ЦПД - цитопатическое действие. HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В, ПЦР -полимер азная цепная реакция.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБО ГЫ.

1. Комструкроааннс шезмяз.

Для получения реконбинантных плазыид, несущих полноразмерную кДНК VEE, использовали генные кассеты, н г сущие 3'-концевую область гена шР4 (от HindlII поз.7290) - 26S-npcM0T0p, негранслируемую область 26S РНК и ген preSi-S вируса гепатита В. Схема строения генных хассет приведена на рис.1. Для получения г синай кассеты ge-i в качестве источника 26S- промотора использован фрагмент HindlII-EcoRl плазмиды рс117; т.о. ген preS2-S присоединен к первому Mct-кодону гена белка С; для кассеты gc-2 использован соответствующий фрагмент плазмиды pel 15, при этом геп preS2-S присоединен к третьему Met-кодону гена С-бслка. Следовательно, при экспрессии с генной кассеты gc-1 должен синтезироваться нормальный pre-S2-S беяок, а с кассеты gc-2 может синтезироваться как нормальный prc-S2-S беяок, так и fusion-оепок с 10 аминокислотами от С белка

вируса VEE, так как не известно jочное начало трансляции С белка VEE.

Рекомбинантные плазмиды. нес\щие полноразыерную ДНК-копию вируса VEE со вставкой ¡к-i или gc-2 перед областью структурных генов (плазмиды pVEHB-25 и pVEHB-361, рис.2), получали в реакции четырехфрагментно! о липзрования с использованием следующих фрагментов :

1) BspI20I (поз.7501) - Pael (поз.11381) фрагмент плазмиды pVE57 , этот фрагмент несет последовательность pUC8, промотор РНК-полиыеразы фага Т7, 5'- и 3'- негранслируемые области и гены неструктурных белков вируса VEE шт. TRD;

2) Bspl20I (поз.7501) - EcoRI - Hindlll фрагменты генной кассета gc-1 или gc-2, фрагмент Bspl20 I- EcoR I-содержит 26S промотор и 5'-нетранслируеыый район 26S РНК, EcoR I-Hind Ill-содержит ген preSj-S;

3) Hind III (поз. 7290) - Рае I (поз. 11381) фрагмент кДНК штамма 230. который содержит промотор субгеномной РНК и гены структурных белков. Этот фрагмент содержится в пдазмиде рс139.

Для получения плазмид pVEHB-9 и pVEHB-24 (рис.2) генные кассеты клонировали в плазмиде pel 12, несушей З'-концевую часть гена бежа Е1 с сайтом Hind III. введенным непосредственно после терминаторного колона, и 26S промотор от сайта Hind III (поз.7290) до начала гена белка С. Затем собирали целевые плазмиды при актировании следующих фрагментов:

I) Sac II (поз.11200) - Рае I (поз. 11381) фрагмент плазмиды pVE230 [Колыхалов и др., 1992], этот фрагмент несет последовательность pUC8, промотор РНК-полимер азы фагаТ7, У- и 3'-

а)

Строям« гчнкьа кассет

старт 288* РНК

3)

гв4 гем ргеЗч-Э НВУ

И т п

Н А 1йМв* РН

этаот2вЗ*РНК г*_

п»4 С Г8МСЯ&-вНВ¥

И I п

н- А ЗЙМИ РН

испопыов«яы дая получения пплзшис

рУЕнв-гв

рУЕНВ-24

рУЕНВ-261 рУЕНВ-9

Рис. 1. Схема строения гашых кассет, состоящих из.гена ргс52-5 вируса гепатита В под конродем 265 промотора вируса УЕЕ.

а)

старт 42S РНК

Т? t*

АС

CTJLpT стерт

26S«PHK 26S РНК [♦ meS?-S (♦

>н

НЕЕ

*

Н

Bs f

f

Ре

pUCS

Ь)

старт 42S РНК

pUC8

старт

26S»PHKBs f* weSj-S f

Рис. 2. Схема строения рскомбинантиых плазмид pVEHB:

а) pVEHB-25 и pVEHB-361

б) pVEHB-24 и pVEHB-9

Н - сайт рестршяазы Hind III, В - Bspl20 I, Bs - Bsul5 I, P - Pst I. Pe-Pael.

нетранслируемые области и гены неструктурных белков вируса VEE штамма TRD, а гены структурных белков штамма 230;

2) Sac II - Bsp 120 I - Рас I фрагмент плазмид, полученных при клонировании генных кассет в рсП2. Район Sac II - Bsp 120 I несет 3'-концевую последовательность гена белка El, с сайтом Hind III, введенным после терминаторного кодона и З'-концевую последовательность гена белка мР4 (от Hind III, поз. 7290, до Bsp 120 I, поз.7501). Район Bsp 120 I - Pst I соответствует генной кассете, а район PstI- Pací содержит конец гена El и часть З'-нетранслируемой области.

Первичная структура использованных для клонирования фрагментов была подтверждена ссквекярованием, Для подтверждения структуры полученных плазмид серии pVEHB плазмидную ДНК гидролизовали различными рестриктазами н полученные фрагменты анализировали электрофорезом в 5% ПААГ. Такой анализ показал, что реегриктные карты, полученных плазмид серии pVEHB соответствуют требуемым.

Полученные таким образом плазыиды были использованы для синтеза полноразмерной РНК с использованием ДНК-зависимой РНК-полимер азы фага Т7. Этими РНК трансфицировалк кдепхи фвбробиастов эмбрионов кур, и, после появления ЦПД, харакеризоваяи и использовали полученные вирусные препараты для дальнейшей, работы.

2, Втямяешстгзхвюбжкшгич&жиесзонспа »яруса.

Возможные изменения биологических свойств рекомбинантных вирусов тестировали сравнением LD50 рекоыбинантного (VEHB-25), прототипного (VE-230) и вирулентного (TRD) вирусов, определенных доя мышей разного возраста при различных способах заражения. Данные по определению Ig(LD50) приведени и табл. 1. Как видно из

приведенных данных у вируса VEHB-25 несколько снижена патогенноегь для мышей 7-9 г., что привело к уменьшению lg(LD5o) при пк введении вируса (Р=0,05, различия при иц-введении статистически неразличимы с уровнем вероятности Р=0.05). В то же время встройка генной кассеты в геном вируса VEE снизила патогенность рекомбннантов для взрослых (12-14 г.) мышей, независимо от способа введения вируса. Так, 100% взрослых мышей выжило при пк-введениии 2x10? Б.О.Е./ыышь вируса VEHB-25.

3. Зкш^ессгза HBsAg jwiKOMÓKSEiirnibiM:! вирусам».

Для сравнения уровней экспрессии HBsAg рскоыбинантаыми вирусами серии VEHB монослой клеток Vero инфицировали разными вирусами с множественностью инфицирования (ы.о.и.) 1 Б.О.Е./кл. После полного лизиса клеток (40-72 часа) отбирали культуральную жидкость и намеряли в ней концентрацию HBsAg с использованием тест-системы "РекоматГеп-В" с чувствительностью 1 нг/мл (производства АО "Вектор-Бест", НПО "Вектор"). Результаты <• определения уровней экспрессии приведены в табл.2.

Несмотря на то, что выход вируса оказался практически одинаковым для всех рекомбннантов, количества секрсгируеыого антигена значительно различались. Интересно отметить, что количество определяемого HBsAg в случае VEHB-361 практически совпадает с расчетным количеством С белка (4.3x103 {вир.частиц} х 18G {ыолек. С белка в вирионе}=0,77х10б молск. С белка/клепсу и 0.8x10^ ыолек. HBsAg/кл.), в то время как в случае VEHB-25 количество HBsAg почти в десять раз больше (4.0x103x180=0.72x106 молекул С белка/клетку и 9,8x100 ыолек. HBsAg/кл.). Такое различие связано, видимо, с более эффективной трансляцией гибридной мРНК. При сравнении первичных структур 26S РНК вирусов VEHB-25 и VEHB-361

Таблица I.

Патогенность рекомбинантных вирусов УЕЕО.

Вирус 18<иЭ50), мьшш 7-9 г. 18(Ы>50), мыши 12-14 г.

гас2) иц ПК. ип

УЕ-230 9.25±1.04 10.10± 1.65 3.4Ш.21 9.40±1.70

УЕНВ-25 7.11+1.01 8.55+1.81 <13) 6.67±2.00

УЕ-57 9.90±1.00 10.65± 1.72 9.90±0.95 10.80+1.69

1) Мышей инфицировали 10-крагными разведениями вируса указанным способом. Титры исходных вирусов были проверены непосредственно перед заражением и составляли 10^ Б.О.Е./мл.

2) пк и иц - подкожное и интрацеребральное инфицирование мышей.

3)1£(1Л)5о) в этом случае не удалось определить, так как при введении 2x10? БОЕ все мыши выжили.

Таблица 2.

Экспрессия рекоыбинаитными вирусами УЕНВ.

Рекомбинантный Выход Внеклеточный НВ$А£

вирус вируса.

бое/кл п^т1х106 кл. молек./кл.

УЕНВ-25 4.0 х 103 390±70 . (9.8±1.8)х10б

УЕНВ-Зб! 4.3 х ЮЗ 32+7.7 (0.8±0.2)х10б

УЕНВ-24 6.0 х 103 <3.3 _

УЕНВ-9 3.3 х 103 <3.3 _

УЕ-230 8.0 х ЮЗ <3.3

' Уровни экспрессии определены в двух независимых экспериментах по инфицированию клеток, в каждом эксперименте концентрацию HBsAg определяли два раза.

видно, что окружение инициагорного Кодона для вируса VEHB-25 полностью соответствует правилам Kozak'a для эффективной инициации трансляции, a 26S РНК VEHB-361 -не совсем В соответствии с этими правилами для эффективной инициации синтеза белка как с 5'-, так и с 3'- стороны от инициаторного кодона должны находиться пуриновые основания. Для вируса VEHB-25 окружение подходит под правила (GaugA), а вслучае VEHB-361 - нет (Gaugu). Интересно отметить, что в случае вирусов SIN и SFV ситуация оказалась обратной вирусу VEE: на У-конце от ATG расположены пиримидиновые основания, а на З'-конце - пуриновые. Возможно, что такое различие связано с различиями в регуляции синтеза структурных белков, реализованной в данных вирусах, хотя и не обязательно.

Значительно более неожиданные различия обнаруживаются при сравнении синтеза HBsAg рекомбинантными вирусами VEHB-25 и VEHB-24. Аналогичные конструкции на основе других альфавирусов синтезируют сходные количества продуктов. Для исключения довольно-таки маленькой вероятности того, что произошло рыщеяление встроенного гена во всей популяции вируса, нами было проверено наличие гена preS2-S в вирусе VEHB-9 с использойаниеы ПЦР. Реакцию проводили с затравками, специфичными к последовательностям встроенного гена на матрице РНК, выделенной из вирусной суспензии. Анализ результатов показал наличие вставки. Для объяснения полученных различий в экспрессии разными векторами был проведен анализ возможных причин и в конечном счете произведен расчет возможных вторичнь'х структур района начала синтеза 26S РНК (на мйнус-цепи) для вирусов SIN, SFV и VEE. Наиболее выгодные по энергии структуры, полученные с помощью программы PCFOLD (алгоритм Zufcer, 1989) и визуализированные с помощью программы

EMOLECULE, приведены на рис. З-рис.6. В случае вирусов SIN и SFV (рис.3, для SFV структура не приведена ) точка начала синтеза субгеномной РНК лежит в неспаренной области размером 4-6 нуклеотидов. Этот элемент структуры сохраняется и при расчете вторичной структуры более протяженных участков РНК. В случае же вируса VEE точка начала субгеномной РНК лежит в неспаренной области размером всего 1 нт. (рис.4). Однако выяснилось, что область 7554-7560 комплементарна району 10935-10941, и, если предположить, что эти районы действительно взаимодействуют, то при расчете получается структура, в которой начало 26S РНК лежит в неспаренном районе длиной 2 нт. (рис.5). Косвенным подтвердением существования подобной структуры может служить расчет вторичной структуры, провезенный для области промотора субгеномной РНК мутантного вируса SIN - TotoCR4.1, описанного в работе [Grakoui et ai„ 1989]. Этот мутант получен введением 3 нт. вставки в 21 нт. консервативный район, непосредственно предшествующий началу синтеза субгеномной РНК. Такая вставка привела к резкому уменьшению синтеза 26S РНК, причем данный эффект проявился только' в cú-положении, поэтому авторы делают вывод, что эффект обусловлен не изменением С-концевой последовательности белка nsP4, а нарушением функционирования промотора. При проведении расчета вторичной структуры области начала синтеза 26S РНК для этого мутанта оказалось, что неспаренным остается только 1 нт., при этом шпилька, расположенная в районе сразу после начала синтеза 26S РНК, сохраняется, а общая энергия даже меньше, чем у прототипного штамма (рис.6). На наш взгляд это подтверждает правильность проведенных нами расчетов. Необходимо отметить, что при рассмотрении (-)-цехш консервативная последовательность, расположенная перед 26S промотором,

! 1

Tfi7fi

* í C T 6

ft т Tfi

S. 6* C£

Ve

ft-G- ft y

3"- a

ft G

start 26S RNA f ¿G 6 T S G T ft CJ'ft6 /

Energy = -14.7 kcrf/mol

Se: sincg26.jrc pos. 48-140

Рис. 3. Предполагаемая вторичная структура промотора 26S РНК зируса SIN. Показана (-) - цепь.

£»ТС I '«• I / I'«*««»•" '¡'с. 1 « *«ет

с« Vм

с ••

• С 'Л I

'Л /,«'», »'.«

А« 'с.'¿«'Л' - '

« Г « С* Г ,1

Еяеггу=-46.9 ЬаКпкЯ

ШлУввргош

Рис.4. Предполагаемая вторичная структура промотора 26Б РНК вируса УЕЕ. Показана (-) - цепь. Выделенный фрагмент комплементарен последовательности в области по геномной РНК 10928-10935.

I ,»•«*«•*""'«'с'

Л С V-

1 ,«"» С, V

«с

■V сУ

.„«в» «/ 'с

«- * с

стагг < 26? РНК

V

с,)с п' сс

I

10»»»

Епегбу=-58.71хе1Лао1 -Ше^еерша УТПйЕО вэлкмодцил вдо срйоеем 10955

Рис.5. Предполагаемая вторичная структура промотора 26Э РНК вируса УЕЕ, полученная при предположении, что существует взаимодействие срайоном 10928-10935. Показана (-) - цепь.

ГЙ" stan 26S RNA ST flr .. Energy—17.5 kcal/mol

lile:sincr4_l po&48-143

Рис.6. Предполагаемая вторичная структура промотора 26S РНК вируса TotoCR4.1, полученного встраиванием триплета в район промотора вируса SIN. Встроенные основания подчеркнуты.

комплементарна району Î8S рибосомальной РНК. Данный район (по существующей модели вторичной структуры 18S РНК [Hendriks et ai.. 1988]). находится в составе двухцепочечного участка, так же как и в (-)-пели РНК альфавирусов. В соответствии с изложенной модель*' вторичной структуры 26S-npoMOTOpa мы предполагаем, что этот райоп вступает во взаимодействие с белковыми факторами, участвующими i синтезе белка, что обеспечивает инициацию транскрипции.

4. Стабягыюпъ всшкн гетеролтпввго геш.

Одной из наиболее важных характеристик любой системы экспрессии является стабильность вставки экспрессируемого гена. Так как рекомбинантные вирусы VEHB содержат повторяющиеся последовательности в районе промотора 26S РНК, то по ним может происходить рекомбинация, приводящая к выщеплению гетерологичного гена. Для оценки этого параметра рекомбинантный вирус VEHB-25 клонировали по бляшкам по методу Дульбекко [Dulbecco & Vogt, 1954]. 27 выбранных клонов были затем использованы для проведения пяти последовательных пассажей на монослое клеток Vero. Анализ культуральной жидкости после каждого пассажа показал, что все клоны сохранили способность экспрессировать HBsAg. Один из клонов был реклонирован и в 20 вторичных клонах проверили экспрессию. Оказалось, что только 1 клон (5%) потерял способность синтезировать HBsAg. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что система экспрессии, основанная на вирусе VEE обладает стабильностью, вполне достаточной для длительного экспериментального использования.

5. Хартерюацш рекомбяшштного вируса VEHB-25 in rira.

Благодаря тому, что вирус VEE инфицирует широкий спектр

лабораторных и сельскохозяйственных животных, и существуют

аттенуированные штаммы этого вируса, данная система экспрессии кажется перспективной для разработки вакцин. Для проверки этого предположения нами была изучена способность рекомбинантного вируса VEHB-25 стимулировать специфический имунный ответ в кроликах (рис.8). С этой целью два кролика были иммунизированы вирусом VEHB-25 в дозе 10^ Б.О,Е./кролик, и реиммунизированы на 21 день после первой иммунизации тон же дозой. Временная зависимость титра анти-VEE- и анти-HBsAg- антител представлена на рис. 8. Из приведенных результатов видно, что титры антител в ИФА достигают 1:16000 для анти-VEE AT и 1:640 для анти-HBsAg после первой иммунизации. При этом симптомов заболевания у животных не наблюдалось. Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки данной системы экспрессии как потенциальной вакцины.

Таким образом, в результате работы был сконструирован ряд рекомбинантных плазмид Е. coli, несущих полноразмерную ДНК-копию генома вируса VEE со встроенным чужеродным геном. Исследование рекомбинантных вирусов, полученных на основе этих плазмид показало, что вирус VEE имеет несколько отличающуюся от других, исследованных на том же уровне альфавирусов, схему функционирования промотора субгсномной РНК. В процессе анализа рекомбинантных вирусов выяснилось, что встройка дополнительного гена длиной ок. 1009 оснований не привела к нарушению ростовых характеристик вируса. В то же время такая встройка не привела и к увеличению патогенных свойств вируса. На основании полученных данных можно заключить, что вектор для экспрессии, основанный на

Динамика появления антител после иммунизации кроликов рекомбинантным вирусом УЕНВ-25.

о

Время после иммунизации, днн

Рис. 8. Временная зависимость титров а1гш-УЕЕ (с-ЪУЕЕУ) и aнти-HBsAg (аЬНВзА§) антител в сыворотках кроликов, иммунизированных рекомбинантным вирусом УЕНВ-25. Приведены титры сывороток.

вирусе VEE, подобно другим векторам, основанным на альфавирусах, является многообещающим для использования как in vitro, так и in vivo.

ВЫВОДЫ:

1. Сконструирован набор плазмид, несущих полноразмерную кДНК-копшо генома вируса VEE с геном preS2-S вируса гешдояа В, встроенным в различные участки генома под контролем промотора, синтеза субгеномной РНК.

2. Путем синтеза полноразмерной РНК на матрице рекомбинантных плазмид и трансфекции клеток, получены рекомбинантные вирусы и определена их способность синтезировать HBaAg. Определены участки генома вируса VEE, вставка в которые приводит к наиболее эффективной экспрессии чужеродного гсщ.

3. Изучена стабильность рекоыбинантного вируса VEE, эксярессирующего в качестве гетерологичного гена ген preS2-S вируса гепатита В. Показано, что через пять пассажей на культуре клеток Vero 95% популяции рекомбинантаого вируса сохраняют способность к экспрессии целевого гена.

4. Изучена способность рекомбинантаого вируса VEE, экспрессирующего ген preS2-S вируса гепатита В, вызывать специфический иммунный ответ в иммунизированных животных. Показано, что заражение кроликов рекоибинаятныи вирусом приводит к появлению анти-HBsAg антител в сыворотке крови»

5. Изучено влияние вставки дополнительной генетической информации в геном вируса VEE на его биологические свойства. Обнаружено, что вставка не приводит к увеличению патогенных свойств вируса, а наблюдается даже некоторое их снижение.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих заботах:

1. Фролов И.З., Дрыга С.А., Колыхалсш A.A., Агапов Е.В., Нетесов С.В. Рекомбинантный вирус Венесуэльского энцефалита лошадей, экспрсссирующий HB sAg.,-Материалы межведомственной конференции "Изучение и профилактика особоопасных вирусных инфекций".// 1993,-Кольцово,-с.З.

2. FroJov I.V., Kolykhalov A.A., Dryga S.A., Agapov E.V., Netesov S.V Recombinant VEE virus expresses HBsAg,-] 993,- Proc. of IXth Internationa] congress of Virology.// 8-13 August 1993, Glasgow, Scotland,-W38-7, p.67

3. Фролов И.В., Дрыга С.А., Колыхалов A.A., Микрюкоиа Т.П, Агзлов Е.В, Нетесов С.В. Рекомбипзлтные вирусы Венесуэльского энцефаломиелита лошадей, экспрессирующие HBsAg.//-1993,- Докл. Акад. Наук РАН.-т. 332,- № 6,-с.789-791.

4. S.A. Dryga, V.A. Svyatchenko, N.N. Kiselcv. T.P.

E.Yu. Fursova, I.V. Frolov, A.A. Kolykhalov, E.V., Agapov, S ' . Netesov. Protein expression system based on the genome of Veyer. --.an Equine Encephalomielitis virus. Study of sites in viral genome remissive for insertion.// FEBS Lett, представлено.

-—G/C/i—

<У