Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка системы экспрессии белков на основе вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей и исследование функционирования промотора субгеномной 26S РНК этого вируса

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы экспрессии белков на основе вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей и исследование функционирования промотора субгеномной 26S РНК этого вируса"

Министерство здравоохранения й медицинской промышленности Российской Федерации НПО "Вектор" Научно-исследовательский Институт Молекулярной Биологии

На правах рукописи

Дрыга Сергей Александрович

Разработка системы экспрессии белков на основе зируся Венесуэльского энцефаломиелита лошадей и исследование функционирования промотора субгепсмшш 268 РНК этого вируса.

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических

наук

Кольцов о - 1994

Работа выполнена в Научно-Исследовательское Институте Молекулярной Биологии, НПО "Вектор" министерства здравоохранения н медициною! промышленности Российской Федерации.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук C.B. Нетесов.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Н.А. Колчанов Кандидат биологических наук И.Х. Урманов Ведущая организация: Институт Биоорганической химии СО РАН Защита диссертации состоится "/(/. 03 1994 г в y^5iacoB на заседании Специализированной совета К 098.08.01 при научно-исследовательское институте молекулярной биологии НПО "Вектор" по адресу: 633159, Новосибирская обл. Новосибирский р-он, п. Кояьцово.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек« научно-исследовательского института молекулярно] биологии НПО "Вектор".

Автореферат разослан "¿¿6" ■ IsU-rftS^ 1994 г. Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических HayiQ j* /-Шубина Т.Н.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время разработаны и трименяются системы экспрессии в клетках зукариот, основанные на i спользовании систем репликации и транскрипции различных вирусов, ■сном которых состоит как из РНК, так и из ДНК (например вируса >словакцины, бахуло- я адено-вирусы, вирус саркомы Рауса, обезьяний шрус 40, вирус гепатита дельта, полиовирусы). Использование шьфав иргу сов для экспрессии белков имеет несколько преимуществ, по равнению с другими вирусами: а) альфавирусы могут инфицировать широкий спектр клеток, включая клетки насекомых, птиц и тозвоночных, что позволяет изучать процессинг белков в разных шелках без получения разных рексыбинантных вирусов; б) могут быть :интезированы большие количества цитоплазматических РНК и белков: з) полноразмерные кДНК копии для получения in vitro инфекционных РНК-гранскриптов получены для нескольких аггьфавирусов, включая зирусы Росс-Ривер, Леса Семлики, Синдбис и Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEE); эти копии позволяют быстро конструировать рекомбинантные молекулы РНК; г) для вируса Синдбис получен и охарактеризован набор мутантов, позволяющих модулировать свойства рекоыбинантных вирусов. Для вируса VEE разработаны живые вакцинные штаммы, что в будущем может позволить использовать систему экспрессии, основанную на вакцинном штамме, для применения в качестве вакцины. Все это показывает перспективность разработки систем экспрессии, основанных на геноме альфавирусов.

Ко времени начала работы были опубликованы только две статьи, посвященные разработке системы экспрессии на основе вируса Синдбис с использованием дефектных интерферирующих вирусных частиц. Согласно последним публикациям на известных альфавирусов наиболее активно развиваются разработка и применение систем экспрессии, основанных на вирусах Синдбис и Леса Семлики. Причем для вируса Синдбис разрабатываютз все стратегии экспрессии, а для вируса Леса Семлики только стратегия, основанная на использовании двух дефектных РНК, одна из которых не способна направлял, синтез

структурных белков, а другая кодирует только их и не способы: упаковываться в вирион.

Цель работы. В задачи настоящей работы входит конструирование полноразмерных ДНК-копий рекоибинангны: вирусов на основе вируса УЕЕ, получение РНК, и, на этой основ« получение инфекционных вирусов и изучение их свойств. Основно] целью данного исследования являлась разработка системы экспрессы белков на основе генетического аппарата вируса УЕЕ.

Научная но&кигэ и практическая ценность работы. В результат проведенной работы сконструирован набор рекомбипалтиых плазднц несущих полноразыерную кДНК вируса УЕЕ со встроенным геном рге 52-3 вируса гепатита В, на матрице этих плазыид синтезирован инфекционная РНК и получены рекомбинангчые вирусы.

Впервые определен участок генома вируса УЕЕ, вставка который чужеродного г ел а приводит к его эффективной экспрессю Показано, что кгхаиизм функционирования 268 промотора вируса УЕ отличается от других альфалирусов.

На основе анализа полученных данных построена ыодея вторичной структуры 26Б промотора алъфааирусов и сформулирован! условия, необходимые для его функционирования.

Изучена стабильность разработанной системы экспрессии пр пассировании на культуре клеток и способность, экспрессироват целевой продукткак т \iiro, так и ш.у/уо. Показано, что иыыуннзаци гззвотных рскомбинантным вирусом приводит к синтезу специфически к целевому продукту антител.

■ Изучено влияние вставки на биологические свойств реколгбкнантного вируса. Обнаругмно, что встройка дополнитеяьног генетического материала в геноы вируса по крайней мере не привод! ¡т увеличеншо его патогенных свойств для хивотных, при сохранен!! .выхода вируса при заражении культуры клеток.

В качестве практического применения отработана ыстодга; выделения КЕзАг; из инфицированных рекоыбинангиыы вкрусо клеток. Показано, что Ш5sAg, полученный таким путем, ыожно успехом применять б иыыуноферыентных тест-системах.

Объем в струет-ура дасссриада!. Диссертация состоит из введет; и трех глав: Литературного обзора по структуре и решшкаш альфавирусов и векторным системам, основанным на их генокв (Г^й;

1), Материалов и Методов Исследования (Глава 2), Результатов и их обсуждения (Глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы (89 ссылок). Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 24 рисунка и 6 таблицы.

Аппробаиня работы. Материалы диссертации докладывались на межведомственной конференции "Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций" (Кольцово, 1993), IX Международном Конгрессе по Вирусологии {Glasgow. United Kingdom. 1993).

По материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Использованные сокращения. VEE - вирус Венесуэльского энцефаломиелита лошадей, SIN - вирус Синдбис, SFV - вирус Леса Семлики, LD50 - 50% летальная доза, ЦПД - цигопатическое действие. HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В, ПЦР -полимеразная цепная реакция.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Коиструврвзавяе платана.

Для получения рекоибинанпшх плззмид. несущих полноразмерную кДНК VEE, использовали генные кассеты, несущие 3'-концезую область гена nsP4 (от Hindi! I поз.7290) - 26Б-промотор. нетрансаируемую область 26S РНК и ген preSi-S вируса гепатита В, Схема. строения генных кассет приведена на рис..!. Для получения генной кассеты ge-1 в качестве источника 26S- промотора использован фрагмент HindIII-EcoRI плазмиды рс117; т.о. ген preS2-S присоединен к первому Met-кодолу гена белка С; для кассеты gc-2 использован соответствующий фрагмент плазмиды pell5, при этом гея prcSi-S присоединен к третьему Met-кодону гена С-белка. Следовательно, при экспрессии с генной кассеты gc-I должен синтезироваться нормальный pre-S2'^ белок, а с кассеты gc-2 может синтезироваться как нормальный prc-S2-S белок, так и fusion-белок с 10 аминокислотами от С белка

вируса VEE, так как не известно i очное начало трансляции С белка VEE.

Рекомбинантные плазмиды. нес\щие полноразыерную ДНК-копию вируса VEE со вставкой ge-i или gc-2 перед областьх> структурных генов (плазмиды рУ'ЕИВ-25 и pVEHB-36i. рис.2), получали в реакции четырех фрагментно! о лигировання с использованием следующих фрагментов :

1) BspI20I (поз.7501) - Pací (поз.11381) фрагмент плазмиды р VE57, этот фрагыент несет последовательность pUC8, промотор РНК-полиыеразы фага Т7, 5'- и 3'- нетранслиу уеыые области и гены неструктурных белков вируса VEE шт. TRD;

2) Bsp 1201 (поз.7501) - EcoRI - HíndlH фрагменты генной кассеты gc-1 или gc-2, фрагмент Bsp 120 I- EcoR I-содержит 26S промотор и 5-незранслируеыый район 26S РНК, EcoR I-Hínd III-содержмт гея preS2-S;

3) Hind III (nos. 7290) - Рае I (поз. 11381) фрагмент кДНК штамма 230, который содержит промотор субгеномной ' РНК и гены структурных белков-. Этот фрагыент содержится в плазмиде рс139.

Для получения плазмид pVEHB-9 и pVEHB-24 (рис.2) генные кассеты клонировали в плазмиде pel 12. несушей З'-концевую часть гена белка El с сайтом Hind 1Г1. введенным непосредственно после терыинаторного кодона, и 26S промотор от сайта Hind III (поз.7290) до начала гена белка С. Затем собирали целевые плазмиды при лигировалии еле чующих фрагментов :

I) Sac II (поз.11200) - Рае I (поз. 11381) фрагыент плазмиды pVE23ö [Колыхалов и др., 1992], этот фрагмент несет последовательностьpUC8, промотор РНК-пошшеразы фагаТ7, 5'- и 3-

а)

Строение гсиньа кассет

старт 288* РНК

5)

ги4 геи ргеа^З НВУ

М » п

Н Л 1ЙМЙ РН

стаот2вЗ*РНК

С ггм огее^-З ИВУ

И 1 Н

н- А ЗЯМе* РН

использованы воя потуиии* галэющ:

рУ£Н6-26 рУЕНВ-24

рУЕНВ-ЗЯ р/ЕНЭ-Э

Рис. 1. Схема строения генных кассет, состоящих из.гена ргс52-5 вируса гепатита В под конролем 26Я промотора вируса УЕЕ.

а)

.старт 423 РНК стг.рг старт

26 Е* РНК 26£ РЕК В» I* ше5г5 _

I ♦

НВЕ К Ре

рис«

Ь)

рис$

Рис. 2. Схема строения рекомбинанпшх плазмид рУЕНВ:

а) рУЕНВ-25 и рУЕНВ-361

б) рУЕНВ-24 и рУЕНВ-9

Н - мштрестриктазы НЫ III, В - Вф120 I, Вв - Вш15 I, Р -Ре-РаеI.

негр анодируемые области и гены неструктурных белков вируса VEE штамма TRD, л гены структурных белков штамма 230;

2) Sac II - Bsp 120 I - Рае I фрагмент плазмид, полученных при клонировании генных кассет в pel 12. Район Sac II - Bsp 120 I несет 3'-концевуга последовательность гена белка El, с сайтом Hind III, введенным после терминаторного ко дона и З'-концевую последовательность гена белка nsP4 (от Hiad III, поз. 7290, до Bsp 120 I, поз.7501). Район Bsp 129 I - Pst I соответствует генной кассете, а район PstI- Рае! содержит конец гена El И часть З'-нетрансдируемой области.

Первичная структура использованных для клонирования фрагментов была подтверждена сеюкнированиеы. Для подтверждения структуры полученных плазмид серии pVEHB плазмидную ДНК шдролизовали различными рестриктазами и полученные фрагменты анализировали электрофорезом в 5% ПААГ. Такой анализ показал, что рестршлные карты полученных плазмид серии pVEHB соответствуют требуемым.

Полученные таким образом плазмиды были использованы для синтеза полноразыерной РНК с использованием ДНК-зависимой РНК-полимер азы фага Т7. Этиии РНК трансфицнровалк клетки фкбробластов эмбрионов кур, и, после появления ЦПД, харакеризовалн и использовали полученные вирусные препараты для дальнейшей работы.

1 Вшшввштга&бштм^саовававЕ^уса.

Возможные изменения биологических свойств рекомбинантных вирусов тестировали сравнением LD50 рекомбинантного (VEHB-25). прототипного (VE-230) н вирулентного (TRD) вирусов, определенных для мышей разного возраста при различных способах заражения. Данные по определению Ig(LD5o) приведены в табл. 1. Как видно из

приведенных данных у вируса VEHB-25 несколько снижена патогенноегь для мышей 7-9 г., что привело к уменьшению Ig(LD5o) при пк введении вируса (Р=0,05, различия при иц-введении статистически неразличимы с уровнем вероятности Р=0.05). В то же время встройка генной кассеты в геном вируса VEE снизила патогенноегь рекомбинантов для взрослых (12-14 г.) мышей, независимо от способа введения вируса. Так, 100% взрослых мышей выжило при пк-введениии 2х 10? Б.О.Е./ыышь вируса VEHB-25.

3. Эксвресош HBsAg реш№ашгпа>ш tspycam.

Для сравнения уровней экспрессии HBsAg рекомбинантными вирусами серии VEHB монослой клеток Vero инфицировали разными вирусами с множественностью инфицирования (ы.о.и.) 1 Е.О.Е./кл. После полного лизиса клеток (40-72 часа) отбирали культуральную жидкость и измеряли в ней концентрацию HBsAg с использованием тесг-сисгемы ТекоматГеп-В" с чувствительностью 1 нг/мл (производства АО "Вектор-Бест", НПО "Вектор"). Результаты определения уровней экспрессии приведены в табл.2.

Несмотря на то, что выход вируса оказался практически одинаковым доя всех рекомбинантов, количества секрегируеыого антигена значительно различались. Интересно отметить, что количество определяемого HBsAg в случае VEHB-361 практически совпадает с расчетным количеством С6елка'(4.3х103 {вир.частиц} х 180 {молек, С белка в вирионе}=0,77x10^ молезс. С белка/клетку и 0,8х 1 молек. HBsAg/кл.), в то время как в случае VEHB-25 количество HBsAg почти в десять раз больше (4.0х103х180=0.72х10<> молекул С бслкаЛслепсу и 9,8х!0^ мопек. HBsAg/кл.). Такое различие связано, видимо, с более эффективной трансляцией гибридной мРНК. При сравнении первичных структур 26S РНК вирусов VEHB-25 и VEHB-361

Таблица 1.

Патогенность росомбинантных вирусов УЕЕ').

Вирус 18<ЪГ>50), мыши 7-9 г. мыши 12-14 г.

гас2) иц ПК. иц

УЕ-230 9.25±1.04 10.10± 1.65 3.4111.21 9.40±1.70

УЕНВ-25 7.11+1.01 8.55+1.81 <13) 6.67+2.00

УЕ-57 9.90£1.00 10.65± 1.72 9.90±0.95 10.80+1.69

О Мышей инфицировали 10-кратными разведениями вируса указанным способом. Титры исходных вирусов были проверены непосредственно перед заражением и составляли 10^ Б.О.Е./мя.

2) пк и иц г подкожное и шгграцеребральное инфицирование мышей.

3)^(1Л)5о) в этом случае не удалось определить, гак как при введении 2x10? БОЕ все мыши выжили.

Тэблицз 2;

Экспрессия НВ&А§ рекоыбинантныыи вирусами УЕНВ.

Рекомбинантный Выход Внеклеточный НВ&А§

вирус вируса.

бое/кл п§/т!х106 кл. ыолек./кл.

УЕНВ-25 4.0 х ЮЗ 390±70 (9.8±1.8)х10б

УЕНВ-361 4.3x103 32+7.7 (0.8+0.2)х10*>

УЕНВ-24 6.0 х 10-3 <3.3 _

УЕНВ-9 3.3x103 <3.3 „

УЕ-230 8.0 х 103 <3.3

• Уровни экспрессии определены в . двух независимых экспериментах по инфицированию клеток, в каждом эксперименте концентрацию НБзА" определяли два раза.

видно, что окружение инициаторного кодона для вируса VEHB-2S полностью соответствует правилам Kozak'a для эффективной инициации трансляции, a 26S РНК YEHB-361 -не совсем В соответствии с этими правилами для эффективной инициации синтеза белка как с 5'~, так и с 3'- стороны от инициаторного кодона должны находиться пуриновые основания. Для вируса VEHB-25 окружение подходит под правила (GaugA), а б случае VEHB-361 - нет (Gaugu). Интересно отметить, что в случае вирусов SIN и SFV ситуация оказалась обратной вирусу VEE: на У-конце от ATG расположены пиримидиновые основания, а на З'-конце - пуриновые. Возможно, что такое различие связано с различиями в регуляции синтеза структурных белков, реализованной в данных вирусах, хотя и не обязательно.

Значительно более неожиданные различия обнаруживаются при сравнении синтеза HBsAg рекомбинантными вирусами VEHB-25 и VEHB-24. Аналогичные конструкции на основе других-альфавирусов синтезируют сходные количества продуктов. Для исключатя довольно-таки маленькой вероятности того, что произошло рыщепление встроенного гена во всей популяции вируса, наш« было проверено наличие гена preS2-S в вирусе VEHB-9 с использованием ПЦР. Реакцшо проводили с затравками, специфичными к последовательностям встроенного гена на матрице РНК, выделенной из вирусной суспензии. Анализ результатов показал наличие в статей. Для объяснения полученных различий в экспрессии разными векторами был проведен анализ возмогших причин и в конечном счете произведен расчет возможных вторичнь х структур района начала синтеза 26S РНК (на мИнус-цепн) для вирусов SIN, SFV и VEE. Наиболее выгодные по энергии структуры, полученные с помощью программы PCFOLD (алгоритм Zuker, 1989) и визуализированные с помощью программы

EMOLECULE, приведены на рис. З-рис.6. В случае вирусов SIN и SF\ (рис.3, для SFV структура не приведена ) точка начала синтез: субгеномной РНК лежит в неспаренной области размером 4-< нуклеотидов. Этот элемент структуры сохраняется и при расчет! вторичной структуры более протяженных участков РНК. В случае за вируса VEE точка начала субгеномной РНК лежит в неспаренш» области размером всего I нт. (рис.4). Однако выяснилось, что обласп 7554-7560 комплементарна району 10935-10941, и, если предположить что эти районы действительно взаимодействуют, то при расчет получается структура, в которой начало 26S РНК лежит в неспаренно? районе длиной 2 нт. (рис.5). Косвенным подтвердением существовал и. подобной структуры может служить расчет вторичной структуры проведенный для области промотора субгеномиой РНК мутантноп вируса SIN- TotoCR4.1, описанного в работе [Grakoui et al, I989J. Это мутант подучен введением 3 нт. вставки в 21 нт. консервативный район непосредственно предшествующий началу синтеза субгеномяой РНК Такая вставка привела к резкому уменьшению синтеза 26S РНК, црича данный эффект проявился только" в си-положении, поэтому автор! делают вывод, что эффект обусловлен не изменением С-концево) последовательности белка шР4, а нарушением функционировали промотора. При проведении расчета вторичной структуры обласп начала синтеза 26S РНК для этого мутанта оказалось, что неспаренны) остается только 1 нт., при этом шпилька, расположенная в районе сраз после начала синтеза 26S РНК, сохраняется, а общая энергия даж меньше, чем у прототипного штамма (рис.6). На наш взгляд эт подтверждает правильность проведенных нами расчетов. Необходим отмстить, что при рассмотрении (-)-цепи консервативна последовательность, расположенная перед 26S промоторов

TGTft ft 2

fi T Tfi

¿T«T TCTCC

TG T, V

ft

CX ?r

T.7'G_ 5 - T ft T

i fi G T ,

Stert 26S RNA t-T J®5TSGTfiC7ftGft Л

Energy = -14.7 KcaMmol

fi!e: sincg26.Jrc pos. 48-140

Рис. 3. Предполагаемая вторичная структура промотора 26S РНК руса SIN. Показана (-) - цепь.

l I

c"r>

'У

.»te i тж* I / ' ' *« т

т» / íl

e * »»

старт 26S РНК с, c i с' '' *'»* • С с*

t,i

ITtCI 1,1

С >

Есеггу=-46.9 txaltool

Рис.4. Предполагаемая вторичная структура, промотора 26Б РШ вируса. УЕЕ. Показана (-) - цепь. Выделенный фрагмен: комплементарен последовательности в области по геномной РН1-10928т10935.

л т1

Ч;,

с, о

с * , » ,« 1«, 'с I ,С|

!'4 св|.»»Л С

' стерт е 265 РНК '

С»<С1!

ч1

I

ш»

Еаегеу=-58.71х41Лоо1 Ше:увергаш учтеяо взаямоаеёсткл с рвотой 10955

е-

Рис.5. Предполагаемая вторичная структура промотора 26Б РНК вируса УЕЕ, полученная при предположении, что существует взаимодействие с районом 10928-10935. Показана (-) - цепь.

Iile:süicr4 1 pcs.48-143

Рис.6. Предполагаемая вторичная структура промотора 26S РН вируса TotoCR4.I, полученного встраиванием триплета в райо промотора вируса SIN. Встроенные основания подчеркнуты.

омплементарна району 18S рибосомальной РНК. Данный район (по ушествуютцей модели вторичной структуры I8S РНК [Hendriks et а!.. 988]). находится в составе двухцелочечного участка, так же как и и {-)-ели РНК альфавирусов. В соответствии с изложенной молелы-торичной структуры 26Б-промотора мы предполагаем, что этот раной ступает во взаимодействие с белковыми факторами, участвующими j интезе белка, что обеспечивает инициацию транскрипции.

4. Стабильность кшкя гетерологтвого rem.

Одной из наиболее важных характеристик любой системы кспрессии является стабильность вставки экспрессируемого гена. Так ак рекомбинантные вирусы VEHB содержат повторяющиеся оследователыюсти в районе промотора 26S РНК, то по ним может роисходить рекомбинация, приводящая к выщепленню ггерологичного гена. Для оценки этого параметра рекомбнналтный прус VEHB-25 клонировали по бляшкам по методу Дульбекко Dulbecco & Vogt, 1954]. 27 выбранных клонов были затем спользованы для проведения пяти последовательных пассажей на

онослое клеток Vero. Анализ культуральной жидкости после каждого *

ассажа показал, что все клоны сохранили способность сспрессировать HBsAg. "Один из клонов был рехлонирован и в 20 горичных клонах проверили экспрессию. Оказалось, что только 1 клон ;%) потерял способность синтезировать HBsAg. Таким образом, элученные данные свидетельствуют о том, что система экспрессии, аюванная на вирусе VEE обладает стабильностью, вполне зстаточной для длительного экспериментального использования.

5. Харажтерпззпня рекомбннаптиог» вируса VEHB-25 in vivo.

Благодаря тому, что вирус VEE инфицирует широкий спектр

¡.бораторных и сельскохозяйственных здгоотных, и существуют

атгенуированные шпшны этого £;;русо, даннан система экспрессии кажется перспективной для разработки вакцин. Для проверки этого предположения наши была изучена способность рекомбинантного вируса VEHB-25 стимулировать специфический имунныи ответ в кроликах (рис.8). С этой цедыо два кролика были иммунизированы вирусом VEHB-25 в дозе 10^ Б.О.Е./кролик, и реиммунизированы на 2] день после первой иммунизации той же дозой. Временная зависимость титра анги-VEE- и анти-HBsAg- антител представлена на рис. 8. Из приведенных результатов видно, что тигры анштея в ИФА достигают 1:16000 для анги-VEE AT и 1:640 для анти-HBsAg после первой иммунизации. При этом симптомов заболевания у животных не наблюдалось. Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки данной системы экспрессии как потенциальной вакцины.

Таким образом, в результате работы был сконструирован ряг рехоыбинантных плазыид Е. coli, несущих полноразмерную ДНК-копию генома вируса VEE со встроенным чужеродным геном Исследование рекоыбинантных вирусов, полученных на основе эти? плаз Ii ид показало, что вирус VEE имеет несколько отличающуюся о: других, исследованных на том же уровне апьфавирусов, схем; функционирования промотора субгеномной РНК. В процессе анализ: рскоибинантных вирусоз выяснилось, что встройка дополнительной гена длиной ок. 1000 оснований не привета к нарушению ростовы: характеристик вируса. В то же время такая встройка не привела и i увеличению патогенных свойств вируса. На основании получении: данных можно заключить, что вектор для экспрессии, основанный н

Динамика появления антител после иммунизации кроликов рекоыбинантным вирусом УЕНВ-25.

Время поме 1шнуш1зацип, дин

Рис. 8. Временная зависимость -пггров а!Пи-УЕЕ (яЬУЕЕУ) и анта-НВзАд (аЬНВяА^) антител в сыворотках кроликов, иммунизированных рекомбинаптныы вирусом УЕНВ-25. Приведены тигры сывороток.

вирусе VbE, подобно др углы векторах, с снованным на альфавирусах, является многообещающим для использования как in vitro, так и in vivo.

ВЫВОДЫ:

1. Сконструирован набор пяазмид, несущих полноразмерную кДНК-копжо генома вируса VEE с геном preS2-S вируса гепатша. В, встроенным в различные участки генома под контролем промотора синтеза субгеномной РНК.

2. Путем синтеза подноразмерной РНК на матрице рекомбинантных плазмид и трансфекции клеток, получены рекомбинашные вирусы и определена их способность синтезировать HBsAg. Определены участки генома вируса VEE, вставка в которые приводит к наиболее эффективной экспрессии чужеродного гезф.

3. Изучена стабильность рекомбинантного вируса VEE, экспрессирующего в качестве гетерологичного гена ген preS2-S вируса гепатита В. Показано, что через пять пассажей на культуре клеток Vero 95% популяции рекомбинантного вируса сохраняют способность к экспрессии целевого гена.

4. Изучена способность рекомбинантного вируса VEE, экспрессирующего ген preS2-S вируса гепатита В, вызывать специфический иммунный ответ в иммунизированных животных. Показало, что заражение кроликов рекомбинантным вирусом приводит к появлению антн-HBiAg антител в сыворотке крови.

5. Изучаю влияние вставки дополнительной генетической информации в геном вируса VEE на его биологические свойства Обнаружено, что вставка не приводит к увеличению патогенных свойств вируса, а наблюдается даже некоторое их снижение.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих заботах:

Фролов И.В., Дрыга С.А., Колыхало» А.А., Агапов Е.В., Негесов '.В. Рекомбинантный вирус Венесуэльского энцефалита лошадей, кспрессируюший HBsAg.,-Материалы межведомственной конференции Изучение и профилактика особоопасных вирусных инфекций".// 1993,-[ольцово,-с.З.

Frolov I.V., Kolykhalov А.А., Dryga S.A., Agapov E.V., Netesov LV Recombinant VEE virus expresses HBsAg,-J993,- Proc. of IXth ntemational congress of Virology.// 8-13 August 1993, Glasgow, Scotland,-V38-7, p.67

Фролов И.В., Дрыга С Л., Колыхапов А.А., Микрюкоаа Т.П, Агапов Е.В, Негесов С.В. Рекомбинзнтные вирусы Венесуэльского нцефзлоыиелкта лошадей, экспрессирующие IIBsAg.//-1993,- Докл. исад. Наук РАН.-т. 332,- № 6,-с.789-791.

S.A. Dryga, V.A. Svyatchenko, N.N. Kiselev, T.P. Milc^ u.l,-л i.Yu. Fursova, I.V. Frolov, A.A. Kolykhalov, E.V. Agapov, S ' . Netesov. 'rotein expression system based on the genome of Vevez::-.:an Equine Lncephalomielitis virus. Study of sites in viral genome permissive for isertioni/ FEBS Lett, представлено.

2-1