Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка систем идентификации фитопатогенов различных таксономических групп методом FLASH-PCR
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Разработка систем идентификации фитопатогенов различных таксономических групп методом FLASH-PCR"
□03481162
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА
На правах рукописи
Рязанцев Дмитрий Юрьевич
РАЗРАБОТКА СИСТЕМ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФИТОПАТОГЕНОВ РАЗЛИЧНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП МЕТОДОМ Р1_А8Н-ПЦР
Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2009
003481162
Работа выполнена в группе молекулярной диагностики Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук
Научный руководитель:
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАСХН Сергей Кириакович Завриев
доктор биологических наук, профессор
Алексей Анатольевич Аграновский
Ведущая организация:
звета Д.00/019.С
доктор биологических наук, профессор
Лев Иванович Патрушев
Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии РАСХН
2009 г. в Ю
часов на заседании
Защита состоится
диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Автореферат разослан / 2009 г.
Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор физико-математических наук
В.А. Олейников
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Диагностика и идентификация патогенов важны в медицине, во многих отраслях сельского хозяйства (растениеводстве, животноводстве и ветеринарии), при контроле за состоянием окружающей среды и т.д. Так, вирозам, бактериозам, гельминтозам и микозам подвержены все без исключения растения. В сельскохозяйственном производстве это грозит большими потерями. Например, при заражении картофеля вирусами урожайность снижается в пределах от 10 до 80% (в зависимости от вируса и сорта картофеля), уменьшается содержание крахмала в клубнях, ухудшаются их качество и товарный вид.
Продовольственная и биологическая безопасность во многом зависит от четкого и постоянного контроля над фитосанитарным состоянием не только окружающей среды в целом, но и сельскохозяйственных растений, продуктов их переработки и кормов. Одним из основных методов осуществления такого контроля является высоко специфичная и эффективная диагностика и идентификация фитопатогенов.
Традиционные методы диагностики болезней растений основаны на таких подходах как визуальная диагностика болезни по симптомам и по морфологии возбудителя, микроскопия, использование растений-индикаторов. Все эти методы позволяют определить болезнь и ее возбудителя, но для этого требуют выполнения ряда обязательных условий: явного проявления симптомов (в то время как многие болезни развиваются латентно), больших затрат времени и средств для выделения патогена в культуру и его идентификации (в то время как многие фитопатогены сложно культивировать), наличие теплиц для выращивания растений-индикаторов. Диагностику фитопатогенов традиционными методами затрудняет также большое разнообразие и быстрое появление новых штаммов и рас, дающих нехарактерные симптомы. Сильно затруднена традиционная диагностика при
1
больших объемах анализируемого материала, например, при проверке на наличие карантинных организмов, когда нужна быстрая детекция патогена с максимальной чувствительностью (Borman et al., 2008; McCartney et al., 2003; Atcins & Clark, 2004; Rosso, 2007; Lopez et al., 2003; Lopez et al., 2009).
Таким образом, сегодня традиционные методы диагностики фитопатогенов далеко не всегда эффективны, что обусловливает необходимость создания и постоянного усовершенствования специфичных и чувствительных тестов, не требующих большого количества материала для анализа и пригодных для рутинной диагностики. Поэтому на смену традиционным методам приходят все более чувствительные молекулярные технологии, такие как различные модификации иммуноферментного анализа (ИФА, чувствительность ~103-105 ед. патогена/мл) и полимеразной цепной реакции (ПЦР, чувствительность ~10-102 ед. патогена/мл). Еще в диагностике распространено использование микрочипов, позволяющих одновременно анализировать большое число образцов, а также различать последовательности нуклеотидов с гомологией около 80%. Однако этот метод обладает невысокой, сравнимой с ИФА, чувствительностью и требует сложного и дорогого оборудования.
Использование SCAR-маркеров (sequence characterized amplified region) — ДНК-маркеров, основанных на ПЦР одного локуса, дающей один фрагмент с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов, позволяет четко детектировать и идентифицировать вид или штамм организма по специфической последовательности нуклеотидов фрагментов его генома, метод обладает гораздо большей чувствительностью по сравнению с ИФА, достаточно прост и позволяет существенно сократить время, затрачиваемое на анализ, которое в случае ПЦР не превышает 2-3 часов. Метод ПЦР дает возможность максимально автоматизировать процесс диагностики, а ПЦР «в реальном времени» (ПЦР-РВ) хотя и требует дорогостоящего оборудования, но
2
позволяет осуществлять количественный анализ (Saponari et al., 2008; Osman et al., 2008; Gil-Salas etal., 2007; Agindotan et al., 2007; Lopez etal., 2009).
Для рутинной диагностики фитопатогенов в России наиболее оптимальным и перспективным сегодня является метод ПЦР в формате FLASH (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization). Этот метод позволяет использовать недорогое, но высококачественное оборудование российского производства, что снижает стоимость оснащения диагностических лабораторий, экономит время анализа и сводит к минимуму риск контаминации рабочего пространства продуктами реакции, неизбежно сопутствующей анализам результатов ПЦР методом гель-электрофореза.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка новой стратегии диагностики фитопатогенов при помощи SCAR-маркеров с детекцией результатов в формате FLASH, что позволяет просто и эффективно детектировать патогенные организмы. В качестве объектов исследования были выбраны 18 фитопатогенов разных систематических групп, являющихся особо важными и/или карантинными организмами (далее К означает, что данный патоген является объектом внешнего или внутреннего карантина в РФ): X, Y, А, М и S вирусы картофеля (X-, Y-, А-, М- и SBK), вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК), вирус метельчатости верхушки картофеля (ВМВК), вироид веретеновидности клубней картофеля (ВВКК), возбудители кольцевой гнили картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus), аскохитоза тыквенных и томатов (Didymella spp.), гнили плодов (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), рака томатов (С. michiganensis subsp. michiganensis), вилта кукурузы (Pantoea stewartii subsp. stewartii, K), бурой гнили картофеля (Ralstonia solanacearum, К), бледная и золотистая картофельные цистообразующие нематоды (Globodera pallida и G. rostochiensis, К), сосновая стволовая нематода (Bursaphelenchus xylophilus, К) и ее вид-двойник (В. mucronatas, К), вирус ризомании сахарной свеклы (Beet necrotic
3
yellow vein virus). Для контроля корректности выделения РНК и реакции обратной транскрипции также была разработана тест-система на ген актина картофеля.
В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
1. Разработать стратегию диагностики фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH.
2. Создать SCAR-маркеры для детекции фитопатогенов методом FLASH-ПЦР по унифицированному алгоритму.
3. Клонировать и протестировать положительные контроли.
4. Оптимизировать методы выделения нуклеиновых кислот из различных материалов (культур микроорганизмов, тканей растений, нематод, семян, почвы и т.п.).
5. Разработать регламент производства тест-систем для рутинной диагностики перечисленных выше фитопатогенов в формате FLASH-ПЦР.
Научная новизна и практическая значимость работы. Основным научным результатом исследований является разработка новой стратегии диагностики фитопатогенов при помощи SCAR-маркеров и создание 18 тест-систем в формате FLASH-ПЦР. Тест-системы на перечисленные выше патогены в формате FLASH-ПЦР разработаны впервые и не имеют аналогов в нашей стране, а также за рубежом. Во всех тест-системах используются оригинальные праймеры и зонды. Полученные результаты открывают новые возможности для рутинной диагностики фитопатогенов, в том числе ряда особо вредоносных и карантинных. Впервые продемонстрировано, что зонд типа «молекулярный маячок» разрушается ферментом с 5'-3' экзонуклеазной активностью в ходе элонгации цепи ДНК при ПЦР.
Практическая значимость работы определяется тем, что созданные тест-системы просты и удобны для рутинного применения и позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью определять детектируемые
4
фитопатогены. Диагностические системы разработаны в едином формате РЬАЯН-ПЦР, рассчитанном на недорогое оборудование отечественного производства.
Внедрение работы. На базе проведенных исследований создан производственный регламент, на основе которого ЗАО «НПФ ДНК-Технология» наладило опытное производство диагностических наборов на основе разработанных тест-систем (см. приложение). Тест-системы были апробированы во ВНИИ картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха РАСХН (Красково, Московская обл.), во ВНИИ карантина растений МСХ РФ (Быково, Московская обл.), в Научно-практическом центре НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству (Самохваловичи, Беларусь), во ВНИИ фитопатологии РАСХН (Бол. Вяземы, Московская обл.), компанией НЬВ (Нидерланды). Эти тест-системы могут и уже используются в профильных НИИ и лабораториях, осуществляющих фитосанитарный контроль. Тест-системами для карантинных объектов в настоящее время активно пользуются лаборатории службы карантина растений РФ.
Апробации работы и публикации. Результаты работы были доложены на международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», международной конференции «Грибы и водоросли в биоценозах», международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», международном научно-практическом совещании «Паразитические нематоды растений, биоразнообразие, изучение, коллекции», всероссийской научно-координационной конференции «Использование мировых генетических ресурсов ВИР в создании сортов картофеля нового поколения». По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы, включающего 229 названий, и приложений. Работа изложена на 149 машинописных страницах, содержит 36 рисунков и 5 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Стратегия диагностики. Разрабатываемые диагностические системы должны быть простыми в применении и обеспечивать анализ в максимально короткое время. Ниже приведена стандартная схема анализа для разрабатываемых диагностических систем и указана примерная длительность отдельных его этапов (рис. 1).
I. Пробоподготовка
Выделение ДНК 40-60 мин
Выделение РНК 40-60 мин
I
Обратная транскрипция с random праймером. Позволяет проводить ПЦР на разные вирусы с одной ОТ-смсси -50 мин
Z2Z"
2. ПЦР-90 мин
III
3. Детекция результатов - 5 мин
положительный результат
пол синельный результат
отрицательный результат ■
недостдеерный результат ■
0 2 4 6 S 10 12 14 16
■ CreuCwKa ек
Рис. 1. Этапы проведения диагностики методом ГЬА8Н-ПЦР.
Таким образом, при детекции результатов на флуориметре «Джин», общая длительность анализа не превышает 2-3 часов. Для детекции флуоресценции нет необходимости открывать пробирки с продуктом ПЦР, что практически исключает риск контаминации.
Оптимизация методов выделения нуклеиновых кислот. С учетом уже упомянутых требований к разрабатываемым тест-системам, а также специфики объектов диагностики возникла необходимость адаптации наборов реагентов производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология» для выделения нуклеиновых кислот (НК) из растений и культур микроорганизмов.
Для выделения РНК из растительной ткани использовали набор «Проба-НК» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»), При оптимизации выделения РНК протокол, рекомендуемый производителем, был модифицирован следующим образом: добавлены этапы гомогенизации растительной ткани в лизирующем буфере, а также увеличена скорость центрифугирования после инкубации в лизирующем буфере - с рекомендованных 2000 об/мин до 13000 об/мин, что способствовало более эффективной очистке гомогената от дебриса.
Выделение ДНК из культур микроорганизмов, растительного материала и из смывов с поверхности семян проводили с помощью набора «Проба-ГС» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») в соответствии с протоколом производителя. Однако потребовалось модифицировать этап подготовки образцов для выделения ДНК в зависимости от природы диагностируемого объекта. В случае с бактериальной культурой пробоподготовка заключалась в приготовлении суспензии в 50 мкл лизирующего буфера. При выделении ДНК из культуры гриба, имеющего плотный мицелий, или из растительной ткани около 50 мг ткани помещали в пробирку с 50 мкл лизирующего буфера и гомогенизировали. При диагностике патогенов, сохраняющихся на поверхности семян, вначале проводили смыв с поверхности 50-100 семян буфером, содержащим 0.1 М хлорид натрия, 0.01 М Tris С1, рН 8.0, 0.025 М EDTA, 0.5 % SDS, затем проводили центрифугирование в течение 15 мин при 13 000 об/мин, осадок ресуспендировали в 50 мкл лизирующего буфера.
Выделение ДНК из отдельных нематод рода Bursaphelenchus и цист нематод рода Globodera проводили по следующей схеме. Нематоды или цисты
7
помещали в пробирку, добавляли 50 мкл буфера STE (10 мМ Tris НС1, рН 8.0, 1 мМ EDTA, 0.1 М хлорид натрия), гомогенизировали, инкубировали 5 мин на кипящей водяной бане и центрифугировали 5 мин при 13 ООО об/мин, надосадочную жидкость использовали для амплификации ДНК соответствующей нематоды.
Выбор типа флуоресцентно-меченого зонда для ПЦР в формате FLASH. При детекции результатов ПЦР по интенсивности флуоресценции после амплификации необходимо, чтобы непрореагировавшие зонды имели низкий уровень флуоресценции. Мы остановились на зондах двух типов: «молекулярные маячки» и TaqMan.
Теоретически зонды типа «молекулярный маячок» должны иметь меньший уровень фоновой флуоресценции, так как у них флуорофор и тушитель тесно сближены (Marras et al., 2002). Для проверки этого утверждения мы проанализировали несколько зондов разного типа, причем специфичная часть зондов TaqMan и «молекулярных маячков» была одинаковой (см. табл. 1,4). Следует отметить, что на 5-конце зонда PSSh825p 5 нуклеотидов не гомологичны матрице, что характерно для «молекулярных маяков», а у зонда LRVp640b 5'-конец полностью гомологичен ДНК-мишени, что характерно для TaqMan. Как видно из табл. 1, фоновая флуоресценция для TaqMan в 1.25-2 раза выше, а уровень разгорания в 1.33-1.5 раза ниже аналогичных показателей «молекулярного маячка».
В то же время считалось, что принцип действия «молекулярного маячка» при ПЦР-РВ, в отличии от действия TaqMan, заключается не в разрушении зонда, а только в его гибридизации на ДНК-мишени (Tyagi&Kramer 1996; Goel et al., 2005). Хотя при использовании фермента с 5'-3' экзонуклеазной активностью зонд, отжигающийся на цепь ДНК, должен разрушаться Taq-полимеразой, публикаций на эту тему в литературе нет.
Таблица 1. Сравнение уровней фоновой флуоресценции и разгорания зондов типа TaqMan и Molecular Beacon (концентрация и последовательность зондов одинаковы)___
Название зонда и его тип Фоновая флуоресценция, ед. отношение TaqMan/Beacon Уровень разгорания (ед. фона) отношение Beacon/TaqMan
PSSh825p Molecular Beacon 120 1.25 8 1.33
TaqMan 150 ó
LRVp640b Molecular Beacon 120 2.08 12 1.50
TaqMan 250 8
Для проверки этого утверждения нами были проведены соответствующие эксперименты. Капиллярный электрофорез продуктов ПЦР, полученных при использовании Тац-полимеразы с 5'-3' экзонуклеазной активностью, показал как наличие целого зонда (рис. 2, пик 1), так и его фрагментов (пики 2), в то время как электрофорез продуктов ПЦР, проведенной с Тая-полимеразой без 5'-3' экзонуклеазной активности (№едРо1, ЗАО «Синтол», РФ), показал присутствие только нативного зонда. Также был проведен эксперимент, показавший, что при использовании фермента без 5'-3' экзонуклеазной активности (№ецРо1) в ходе РЬАБН-ПЦР увеличение интенсивности флуоресценции происходит в значительно меньшей степени (рис. ЗА), тогда как количество продукта реакции судя по электрофореграмме одинаково (рис. ЗБ).
Рис. 2. Капиллярный электрофорез продуктов ПЦР с Тац-полимеразой с 5'-3' экзонуклеазной активностью (А) и без нее (Б).
Таким образом, зонд типа «молекулярный маячок» на самом деле работает по принципу зонда TaqMan, обладая при этом более низким уровнем фоновой флуоресценции, что особенно важно для ПЦР в формате FLASH.
112 2
^(ЙЙЩ^ ^рЯЩ^ ЩЙИЩЬ
3 3 4 4
Рис. 3. Сравнение уровня разгорания «молекулярных маячков» при использовании ферментов с (1, 3) и без (2, 4) 5'-3' экзонуклеазной активностью (А). Электрофореграмма продуктов ПЦР при использовании ферментов с (1, 3) и без (2, 4) 5'-3' экзонуклеазной активностью (1, 2 — PSSh825p, 3-4 — LRVp640b).
ПЦР в формате FLASH. В ходе ПЦР зонд отжигается на ДНК-матрицу, и ДНК-полимераза разрушает его благодаря 5'-экзонуклеазной активности, отщепляя флуорофор. После реакции, при низкой температуре, непрореагировавшие зонды принимают «исходную» конформацию и в отличие от флуорофоров, высвободившихся в ходе реакции, не флуоресцируют (рис. 4). Поэтому в FLASH-ПЦР зонды типа «молекулярный маячок» гораздо эффективней, так как благодаря контактному тушению флуоресценции они дают меньший уровень фона по сравнению с зондами типа TaqMan.
Т<55°
ДНК
,Петля, образованная специфической последовательностью Стебель из 5-6 GC-nap /
........Лолиметиленовый спейсер V
Гаситель флуоресценции ____________Флуорофор
Taq-полимерэза
3' Щ,
Т>70°С
Рис. 4. Принцип действия зонда типа «молекулярный маячок» в ходе ПЦР в формате FLASH.
Этот принцип реализован в методе РЬАБН-ПЦР, который уже применяется в медицинской диагностике (Ёлов и др., 2005; Лаптинов, 2005).
В целях унификации диагностических тест-систем мы использовали один и тот же состав реакционной смеси (за исключением олигонуклеотидов), а также одинаковую программу амплификации для идентификации всех фитопатогенов.
Универсальная программа амплификации включала следующие этапы (при этом для оптимизации использовали две температуры отжига праймеров: 64 и 67°С): 93°С — 90 сек; 93°С — 20 сек, 64°С/67°С — 5 сек, 67°С — 5/10 сек, 5 циклов; 93°С — 1 сек, 64°С/67°С — 5 сек, 67°С — 5/10 сек, 40 циклов. Состав реакционной смеси для амплификации включал в 35 мкл: 3.5 мкл 10х буфера (750 мМ Трис-НС1, рН 8.8, 200 мМ сульфат аммония, 0.1% Твин-20), 1 мМ каждого сЮТР, 1 мкМ праймеров, 0.1-0.2 мкМ зондов, 2.5 ед. Тая-полимеразы и 5 мкл раствора ДНК и 0.5 мкл раствора плазмиды для внутреннего контроля (ВК, см. Результаты и обсуждение). Для снижения уровня неспецифической амплификации применяли горячий старт: реакционную смесь разделяли слоем парафина на две части — олигонуклеотиды, буфер и сШТР в одной, а ДНК и Тая-полимера — в другой. Таким образом, начало реакции возможно только после прогрева смеси до температуры выше 60°С.
В ходе постановки ПЦР, помимо пробирок с исследуемыми образцами, положительным и отрицательным контролями (К+ и К-), ставили контроль фонового уровня флуоресценции: две пробирки с реакционной смесью без Taq-полимеразы. Уровень флуоресценции в этих пробирках принимали за фоновый (Ёлов и др., 2005). Положительным считали результат, при котором уровень флуоресценции не менее чем в 2.1 раза превышал фоновое значение.
Также использовали систему экзогенного ВК, построенную по принципу мультиплексной ПЦР, при которой происходит одновременная амплификация целевого фрагмента генома патогена и ДНК ВК. В качестве матрицы для ВК
11
использовали плазмиду, содержащую вставку размером 560 п.н., фланкированную инвертированными последовательностями, гомологичными праймеру, используемому для амплификации вставки (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»). Размер ампликона ВК составляет 560 п.н., что позволяет в геле четко отличать его от ампликонов с ДНК/кДНК фитопатогенов, длина которых подбиралась в пределах 100-320 пар оснований. Зонд для детекции амплификации ВК содержит флуорофор HEX, излучающий на длине волны 570 нм, что позволяет четко отличать его от флуорофора FAM, который входит в состав зондов для специфических мишеней и который излучает на длине волны 520 нм. Следует отметить, что при необходимости детекцию результатов при использовании разработанных тест-систем можно также проводить на детектирующем амплификаторе в режиме ПЦР-РВ и методом гель-электрофореза.
Общая стратегия подбора праймеров осуществлялась по следующему алгоритму: сначала проводили поиск последовательностей нуклеотидов геномов патогенов, имеющихся в банке генов (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), затем их выравнивали и отбирали наиболее вариабельные внутри вида последовательности ДНК/РНК. При выборе последовательностей прежде всего обращали внимание на возможность подбора специфичных праймеров и высокую копийность гена, позволяющую разработать более чувствительную и специфичную диагностическую систему. При подборе праймеров для идентификации бактерий прежде всего анализировали внутренние транскрибируемые спейсеры генов рРНК, а также гены патогенности; грибов и нематод — интроны различных генов и внутренние транскрибируемые спейсеры генов рРНК; для детекции вирусов в первую очередь брали во внимание гены, экспрессирующиеся с субгеномных РНК, что позволяет повысить относительную чувствительность тест-системы (табл. 2).
При подборе праймеров было необходимо учитывать, что они должны детектировать максимальное количество штаммов и изолятов конкретного фитопатогена, но при этом не давать ложноположительных реакций, например, с родственными видами. Также при подборе праймеров учитывали требования и к самим тест-системам, такие как максимальная чувствительность, универсальность и простота в обращении. Исходя из сказанного, были сформулированы требования к праймерам и зондам:
> Праймеры должны быть строго специфичны к определенному фитопатогену. Допускаются единичные нуклеотидные замены на 5'-конце праймера. На З'-конце праймера должны находиться как минимум два нуклеотида, не гомологичных последовательности НК родственных организмов, от которых необходимо отличать исследуемый патоген.
> Температура отжига праймеров должна находится в пределах 64-67°С.
> На нуклеотидный состав праймеров вводятся следующие ограничения: процент вС оснований в праймере должен составлять около 40-60%; праймер должен содержать не более 3-4 повторяющихся нуклеотидов; на З'-конце последние 2-4 нуклеотида праймера должны быть А или Т; праймеры не должны образовывать стабильных шпилечных структур и димеров.
> Праймеры должны фланкировать фрагмент размером 100-350 п.н., так как небольшой фрагмент амплифицируется эффективнее, и при детекции методом гель-электрофореза можно легко отличить фрагмент, амплифицируемый с матрицы патогена от фрагмента, амплифицируемого с матрицы ВК.
> Температура отжига зонда должна составлять около 75°С.
> Шпилечная структура зонда должна состоять из 5-6 ОС пар.
> Особенно строгие требования предъявляются к вторичной структуре зонда: при моделировании вторичной структуры зонда с помощью
программы шй)И (mfold.bioinfo.rpi.edu) (при температуре 37°С) должна наблюдаться классическая для «молекулярного маячка» структура: формироваться шпилька из 5-6 вС пар 3'- и 5'-концевых нуклеотидов и петля из 20-24 нуклеотидов; в петле допускаются 2 пары спаренных нуклеотидов с низкой энергией связи (две пары АТ или пара АТ+вС).
После подбора праймеры проверяли на специфичность, проводя ПЦР на ДНК/кДНК видов, наиболее близких к объекту исследования (как правило, относящихся к тому же роду), а также живущих в одной с ним экосистеме. Если праймеры не отжигались на ДНК этих видов, то они считались специфичными.
Характеристики разработанных праймеров и зондов. Для обеспечения максимальной специфичности для большинства патогенов было сконструировано по несколько пар праймеров, в некоторых случаях — к различным генам (табл. 2-4). В табл. 2 дан список генов-мишеней для подбора праймеров к различным фитопатогенам. Подобранные пары праймеров проверяли на специфичность и отбирали наиболее пригодные для диагностики. Как видно из табл. 3, не все пары праймеров оказались строго специфичными в принятых условиях реакции, поэтому их выбраковывали и не использовали в дальнейшей работе. В случае, если обе пары праймеров оказывались специфичными, проводили дополнительное тестирование на чувствительность при разных степенях разведения ДНК/кДНК и отбирали более эффективную пару.
На следующем этапе конструировали зонды. Так как специфичность реакции обеспечивается праймерами, зонды для родственных патогенов могут быть универсальными, и для подбора зонда можно использовать всю фланкируемую праймерами последовательность, что позволяет подобрать зонд оптимальной структуры (табл. 5).
Качество зонда контролировали по ряду показателей. Во-первых, по уровню фоновой флуоресценции в пробирке без добавления Тац-полимеразы.
14
Это значение показывает, насколько эффективно гасится флуоресценция в зонде, принявшем шпилечную конформацию. Вторым параметром качества зонда является максимальный уровень разгорания зонда, наблюдаемый в пробирке с положительным результатом ПЦР (измеряется в единицах фонового уровня). Пригодным для работы признавался зонд, показывающий не менее чем 8-кратное увеличение фонового уровня флуоресценции при положительном результате, при том что фоновый уровень флуоресценции составляет не более 150 ед. Высокий уровень фоновой флуоресценции свидетельствует о неэффективном ее гашении вследствие неправильного фолдинга зонда, а низкий уровень флуоресценции после амплификации говорит о нестабильной гибридизации зонда с ДНК-матрицей, например, вследствие неполной гомологичности специфической части зонда ДНК-матрице. Следует также отметить, что в ряде случаев оптимизации работы зондов удалось добиться при увеличении их концентрации в реакционной смеси с 0.1 до 0.2 мкМ (табл. 4).
Разработка SCAR-маркеров для видовой дифференцировки фитопатогенов. Алгоритм разработки SCAR-маркеров и создания диагностических тест-систем для различных патогенов универсален. Поэтому в автореферате подробно рассмотрены все этапы разработки тест-систем на примере диагностики сосновых стволовых нематод рода Bursaphelenchus.
Основными этапами при создании тест-систем являлись: разработка SCAR-маркеров для видовой дифференцировки фитопатогенов, для чего проводили поиск и выравнивание последовательностей нуклеотидов, имеющий полиморфизм, подбор специфичных праймеров и их верификацию; перевод тест-системы в формат FLASH, для чего подбирали флуоресцентно-меченый зонд типа «молекулярный маячок»; проверка работы тест-системы и разработка положительного контроля. На каждую созданную диагностическую систему был разработан регламент для внедрения в производство на базе ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (приложение).
Таблица 2. Области геномов и номера депонированных в банке генов последовательностей НК, использованных при подборе праймеров и зондов._
Наименование объекта Участок генома Номера последовательностей
Картофель мРНК гена актина 5Тиб0486, Х55751, 5Тиб0488
ввкк Геномная РНК АГ369530, АУ532801-4, АУ372397, Х17268,451895, А3583449, АУ962324, Х52038-40, АУ360446, М88678, Х76846, Х76845, У09381-У09383, У08852, АР483470-73, М93685, М14814, А.ГО07489, Х52036, АУ492075-84, АУ937179-93, М36163, АР454395, АР458986, АР458987-93, АР459007, АУ152840, Х97387, Х58388, АУ152841, АР458997, АУ518939-40,1)23058, А.1634596, АУ673974, АР458989-96, Ш3060, АУ492078, Е00278, АУ493559, У09886, ЫС_002030, АШ5261, Х76848.У09887, У09888, Х76847, Ш3059, М16826, М38345
ХВК 5'-нетранслируемая область/ген ВО* АВ056718, АР 172259, АР373782,000344, М31541, М38480, М63141, М95516, N0 001455, Х55802, Х72214, 223256
ВМВК Ген БО АР508250-57, АУ196094, АУ277633, 00102381, АЛ24991, АЛ43719
ВСЛК А07940-43, АР022782, АР271214, АР271215, АР296280, АР539791, АУ007727, АУ307123, 013753, М89926, 877421, Ш3777, Ш4377, XI3906, Х773-26
МВК Ген БО/11К белок ТБГ АР023877, АМ37481, АУЗ11394, АУЗ 11395,014449, N0001361, Х57440, Х85114
SBK Ген РЗРГГ У15617, У15618, У15619, У15620, У15621, У15622, У15623, У15624
YBK З'-концевая область генома А08776, АР237963, АР522296, АУ166866, АУ166867, АУ745494, АУ745492, АУ884982-85, 00008213, N0001616, и09509, 000441, АР345650
АВК АР543212, АР543709, АД 131400, А1131401, АЛ31403, А3296311, N0004039, г21670, АШ7035, УП422-25, У10126, У10125, У10250, У10079, Х91967, Х91968, Х91966
В. mucronatus ВТС1' АМ179514, АУ347914, АУ347915, АУ347916, и93554
В. xylophilus АМ157747, АМ179515, АУ347911, АУ347912, АУ347913, Ш2464
G. pallida АРО16871, АР016868, АР016870, АР016869, АР016867
G. rostochiensis 185-ВТС1 АРО16872, АРО 16873, АР016874, АР016875, АР016876, АР016877, АР016878
С. michiganensis subsp. sepedomcus ВТС1 и09378,1Ю9379, и09380, 00437513, 1109378, 1)09381, Ш9382
ВНПЖС Ген БО А1634732, А.1634738, А.1634741, А«34736, АШ4733, А1634740, АШ4735, АШ4739, АМ779752, А1634734, А1634737
Я. зо1апасеагит Ген АЮ А У192718-АУ192721, Е11795355, Еи795356, Еи795350, Еи795359
01с^уте(1а/Азсос/1у[а ВТС1 АР297228, АУ157875-89, ОАР428164-70, ОАР428534
Р. саго1о\'отт ьнЬяр. сигоип'огит ВТС1-ВТС2 АР448592, АР448594, АР448596, АР234289, АР232677, АР232684, АР232679, АР232680, АР232685-АР23268587
165 рРНК АР373187, АР373188, АР373189, АР373185, АР373182, АР373183, АР373180, АР373176. АР373177, АР373190, АР373193, АР373194
Р. Ь1ем аг1и эиЬзр. 5{еп-аг(И Ген НКРЬ АР282857
* БО — белок оболочки, РЗРП — РНК-зависимая РНК-полимераза, ВТС — внутренний транскрибируемый спейспер.
Таблица 3. Структура и характеристики сконструированных праймеров. Олигонуклеотиды, отобранные для
использования в тест-системах, выделены жирным шрифтом.
Объект Название Последовательность 5'-3' "/овС N5 Размер амликона Та 5р Бп
ВВКК ЬТ\'ГОМ сотсс;ттсстс;тс,с.ттсаслсс 59 - 320 64 + н/о»
5ТУг280 сттсл(;ттс;тттсслссс;с;с.тл 50 -
ВМВК МТ2ГО94 АСТСАССАТСАТССААССТТТСАС 57 - 270 64 + н/о
МТ2г358 СССТвССТСААТТАСАТССАСС 60 -
ВСЛК 1.К\Т543 СААСАСвССТСССТСАССААС 62 - 250 64 + и/о
ЬЯ\'г797 ССАСТССТТАТССТСАССССС 62 -
ХВК УХ1г290 СТСТТАСССССТССАТОТСТАТС 52 - 280 64 + ю-6
УХ1Я)31 САААСССАССАСССССАА 61 -
УХ2г360 ТСССТТЛТСТАСАССТАСТТЛТССТСС 44 - 167 64 + ш-'
УХ2П30 АТСААТССТССССАААСТССТ 48 -
МВК УМ1г500 САСОТТАТАТАТТАААТАСОАТТТААТОСС 27 - 200 64 - н/о
УМ 1 ООО ТАОСТАООТОТСАСАСОТССТАТСО 52
УМ2г1020 СССАТСТСТТТСТСССТАТТСТС 42 - 160 64 + н/о
УМ2М0 СССТСССАТССССПТСАСТ 60 -
БВК УБ1г697 ТСАССАСССААССАТАТССв 55 - 278 64 + ю-6
У5Ш14 АССССТГСТССАСАСАСТСТСАС 57 -
УЭ2г436 СТСАОАСТСГОТОСАСААСССО 55 - 255 64 + ю-1
У82Л81 САТООССАТСОТСТТСТСАААО 50 -
YBK VYI210 ACATCACGAACACCAGTGAGGG 55 - 241 64 + h/o
VYr450 GATAAAAGTAGTACAGGAAAGCCAAAATA 30 -
VYr370 CACATGTTCTTGACTCCAAGTAGAGTATG 41 - 64 - h/o
АВК VAI326 CCCTGACAGTTGAAACATAAAACCA 57 - 230 64 + h/o
VAr560 CGTGAAGGGGGTGTAACCGAA 40 -
Актин картофеля ACTf2 TGTTGGTGATGAAGCTCAATCGA 300 64 + h/o
ACTrRNA CCATGACAATACCAGTTGTACGACC
В. mucronatus Bmf90 CGTCACGAAAACGTGGAGCA 55 12 280 64 + h/o
Bmr370 AAGTGATCCACCGGAGTAACTTAAATT 40 2
В. xylophilus Bxf90 GTCACGATGATGCGATTGGTG 55 12 280 64 + h/o
Bxr370 GTGATCCACCGGAGTAACTTAAAGC-3' 48 2
G. pallida GpF TGAGTCAGTGTGGGCAACACCA 50 - 140 67 + h/o
GpR GACGACAACAGCAATCGTCGAG 55 2
G. rostochiensis GrF AAACTCGGGGACGATTATGCGT 55 - 300 67 + h/o
GpR CGACAACAGCAATCGTCGGC 60 2
С. michiganensis subsp. sepedonicus cl$280 GACCCTTTCCGTCGTCCTGTT 60 4 140 67 + h/o
Cls462r CGTTTCGCCTCCCCGAAG 67 3
R. solanacearum rsl90f AACGCCAAACGGTGCGAAC 55 6 300 67 + h/o
rs490r CCGAAGGTCGACATGTTGACA 55 6
ВНПЖС rizof GGGCTTATAGAGCTGCTAGAGTCACC 50 - 320 64 + h/o
ri/or GACGCAAGAGCAGCCATAGC 60 -
Didymella/Ascochyta didy70 CTTTGCCTGCCATCTCTTACCC 55 - 300 64 + h/o
didy300 GCGTTCAAAGATTCGATGATTCA 39 -
P. carotovorum. subsp. carotovorum PeCC4f CAAGCGCACCTGTTGATGCG 60 2 320 64 + h/o
PeCC4r TGCATCACTCACACCACATTACTGTT 42 6
PeCC 170 GCT AAT ACC GCA TAA CCT CGC AA 48 5 320 64 - h/o
PeCC496 CTT CTG CGA GTA ACG TCA АТС GAT 42 3
C. michiganensis subsp. michiganensis CIM280 GACCCTTTCCGTCGTCCTGTT 55 4 140 64 + h/o
CIm462r CGTTTCGCCTCCCCGAAG 58 3
P. stewartii subsp. stewartii pssf675 GAGCACTCATTCCGACCACATC 58 7 220 64 + h/o
pssr890 CTATCAGTCTGCCTGAGCACCCT 52 2
н/о - не определялась, N3 - количество специфичных нуклеотидов на З'-конце праймера, Та — температура отжига, Эр -специфичность, Бп - относительная чувствительность. ** - указано для некоторых патогенов, имеющих близких родственников с высокогомологичной последовательностью нуклеотидов.
Таблица 4, Структура и характеристики сконструированных зондов. Олигонуклеотиды, отобранные для использования в тест-системах, выделены жирным шрифтом. Подчеркиванием выделена специфичная часть зонда. _
Объект Название Последовательность (ВН01)-5'-...3'-(РАМ) А" Фон С*
ВВКК БТУр2 СССССАТСССТСААССССТССТССССв 13 100 0.1
вмвк МТ2р265 ССТССАССТТСТАССССАТСТАСАСТССАСС 8 150 0.1
ВСЛК ЫПрб-ШЬ СССССАССАССАСССТСААСССАСССССС 12 120 0.2
1ЖУр640 ССССОАООАССАООСТСААОСОООО 2 100 0.2
ЬЯУ1640Ь (ТацМап) (РАМ1ССА00АС(ВН01 ЮАООСТСААОССА 8 250 0.2
ХВК УХ2р270 СОСССАСААТССААСОАСТТСОССАССССС 10 100 0.1
МВК УМ2р980Ь СССССАТТСАТСАССССАССТАССССС 10 90 0.2
ввк УвIр590 СССССАТААТССССТТСТССССТСАССССС 9 90 0.2
У81р518 СТССОСТТССССААТОАТСТСАТАОАСОСССАО 3 130 0.2
АВК УАр480 СТСССААСАСТСАСТТТСАСТСССАААТСССАС 9 100 0.2
УАр510 СООТООССТТАСТТОТТАТАТАОАСССАССО 2 150 0.2
УВК УУрЗЗО СССАСАСАСАСССАСАССАСССАССАТСТССС 8 60 0.1
Актин картофеля АСТр ССССТСАСССААССАССТСТСААТССТААСССС 10 60 0.1
Виг*арИе1епсИи$ Вр280 СССССТТТТСААТССТАСССТСССССС 20 40 0.1
01(>Ь(к1ега Ортр СССССАСАССССССТСТССАТАСАТТСТТССССС 15 70 0.1
Я. 5о1апасеагит гер2 ССССССААААСААССТССАСССТАТССССС 18 50 0.1
ВНПЖС пгор ССвССТССТАСАСАСАСТСССТТСАТССССС 10 75 0.2
Ои/утеНи/ Л5сосИу1а 0[с1ур4 СССССТТСААСААСССАТСТСТТССТТСТССССС 10 75 0.2
Б1ёурЗ ССОССАОААССААОАОТСССТТОТТСААООСГ.О 2 300 0.2
Didyp2 ссосссттААаттттстссААТсвоссаосас 2 150 0.2
Didyp сасссасссАттасАСААААСттААоаасо 2 255 0.2
Р. сагоюуогит зиЬзр. сагоЮуогит РеССр4 ССвССТАССАСАСТССССТТТСАССССвС 10 100 0.2
С1а\чЬас1ег т[сЫ%апе№15 с1Мр2 ССССТСААТСТААСАТССТССССТССАСССС 12 44 0.1
Р Меч'агШ эиЬзр. з1еюаг1П Р58И825р СССССССАТСТТСТТСТССААССТСАААССССС 8 125 0.2
Р58Ь8251 (ТацМап) (РЛМЮАТСТТСТГВНОПТСТООААСаТСАААССОС 6 150 0.2
*А- амплитуда разгорания, ед. фона. С- концентрация, мкМ.
После анализа последовательностей нуклеотидов нематод Bursaphelenchus, представленных в банке генов, в качестве мишени для подбора специфических праймеров были отобраны последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров (ВТС): ВТС1, отделяющий ген 18S рРНК от гена 5.8 рРНК и ВТС2, отделяющий ген 5.8 рРНК от гена 28S рРНК. Последовательности ВТС были выбраны благодаря тому, что гены, кодирующие рДНК, многокопийны, а вариабельные последовательности спейсеров позволяют надежно идентифицировать виды рода Bursaphelenchus.
ам179514_вм ay347915_bm ay347914_bm ay347916_bm u93554_bm am179515_bx am157747_bx ay347913_bx ay347912_bx u924 64_bx
am179514_bm ay347915_bm ay347914_bm ay347916_bm u93554_bm am179515_bx am157747_bx ay347913_bx ay347912_bx u924 64_bx
am179514_bm ay347915_bm ay347914_bm ay347916_bm u93554_bm am17 9515_bx am157747_bx ay347913_bx ay347912_bx u92464 bx
Bm(x)90
(50) tatgacacattcattcgtgctcgtcacgaaaacgtgga--1 (8) tatgacacattcattcgtgctcgtcacgaagacgtgga--g<
gCTTCGGTTGC GCC--|CAGGATGTGGGTTCG
(8) tatgacacattcattcgtgctcgtcacgaa|ac T ga--(50) tatgacacattcattcgtgctcgtcacgaalfccgtgga—i
(50) TATGACACATT (50) TATGACACATTi (8) TATGACACATTi (8) TATGACACATTi (50) TATGACACATTi 275 Bp280
:GTGCT CGTCACGATG t с agcg -.TTCGTGCTCGTCACGATG T -ClATTI
ittcgtgctcgtcacgaIg igogIttI
iTTCGTGCI'CGTCACGATG T CGATTgi •-TTCGTGC ' GTCACGATG T CC-ATT1
a ca tcg
IcttcggttgcIgc—г IcttcggttgcIgc—я IcttcggttgcIgc—i ÉcttcggttgcIgc--
аса gatgcgggttcg
аса gatgcgggttcg
а . gatgcgggttcg
|са gatgtgggttcg
g gatgj ■ggttcg
g GATGj Bggttcg
ica ga?d ■ggttcg
g gatq Iggttcg
1 gato ■ggttcg
349
(268) cgagcgtaggattgaaaagcccgag|ggctgccc|gacaaaacattcattttacatttattttgttggaaaagBa (225) cgagcgtaggattgaaaagcccgaghggctgccccgacaaaacattcattttacatttattttgttggaaaagga (225) cgagcgtaggattgaaaagcccgag|ggctgccccgacaaaacattcattttacatttattttgttggaaaagga
(225) (268) (275) (273) (231)
cgagcgtaggattgaaaagcccgag|ggctgccccgacaaaacattcattttacatttattttgttggaaaagga cgagcgtaggattgaaaagcccgag|ggctgccc|gacaaaacattcattttacatttattttgttggaaaa(^
cgagcgtaggattgaaaagcccgag|ggctgccc|gacaaaacattcattttacatttattttgttggaaaagaj
cgagcgtaggattgaaaagcccgagaggctgccc^gacaaaacattcattttacatttattttgttggaaaaga cgagcgtaggattgaaaagcccgagaggctgcccIgacaaaacattcattttacatttattttgttggaaaag^ (231) cgagcgtaggattgaaaagcccgagaggctgcccBgacaaaacattcattttacatttattttgttggaaaagb
(273) cgagcgtaggattgaaaagcccgagaggctgcccfgacaaaacattcattttacatttattttgttggaaaagg
350 Bm(x)370r 387
(343) atttaagttactccggtggatcacttggctcgcgggtc
(300) ATTTAAGTTACTCCGGTGGATCACTT"gctcgcgggtc
(300) A_____
(300) A__'Ji
(343) A _i '
(350) _
(348) С. . . _-. :
(306) ctttaagttactccggtggatcacttggctcgcgggtc (306) ctttaagttactccggtggatcacttggctcgcgggtc (348) çtttaagttactccggtggatcacttggctcgcgggtc
Рис. 5. Выравнивание последовательностей нуклеотидов фрагмента ВТС1 нематод В. тисгопаШз (ВМ) и В. ху1орЫ1ш (ВХ). Праймеры и зонд выделены подчеркиванием.
Общая гомология генов 18S, 5.8S и 28S рРНК у видов Bursaphelenchus составляет около 99%, а гомология для ВТС1 (310 п.н.) и ВТС2 (315 п.н.) составляет 86% и 76%, соответственно. Для подбора праймеров мы выбрали ВТС1, так как при его амплификации образуется фрагмент заданной длины
(280 п.н.), кроме того, последовательность ВТС1 содержит вариабельные участки, позволяющие подобрать специфические праймеры, а также консервативные регионы, необходимые для подбора универсального зонда для двух видов нематод (рис. 5, табл. 3).
Далее осуществлялась эмпирическая проверка специфичности синтезированных праймеров, для чего проводили амплификацию с ДНК каждой из детектируемых нематод (рис. 6). Из рисунка видно, что полученные праймеры работают строго специфично. Исключение составляет дорожка 1 (рис. 6). Наличие фрагмента с праймерами к обоим видам объясняется контаминацией при отборе особей. В дальнейшем, при повторном анализе амплификация шла строго специфично.
А а" -Т
/ \ А А
ИМММУНЕЦНЙМММММ)« в-500 ГН 10 / \
т — тш-'** • -250 пн
с с
I \
т в
\ /
,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 IX 12 13 14 М Б 'тс.
. I \ /
»мяпнвмвмиммым и"500 ™
г:-;250 пн
т т
\ / т ^ „ с
с — а
I I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 М =
в.....- с
I
Рис. 6. Электрофореграмма результатов ПЦР с з — с
праймерами к В. тисгопШт (А) и В. ху1орМ1ш 5. ......... ^...... ^.............. 3.
(Б). 1-6 - ДНК В. ху1орМ1т, 7-12 - ДНК В. Рис. 7. Предсказанная вторичная тисгопсИш, 13-14 - отрицательный контроль, структура для зонда Вр280.
В табл. 4 суммированы данные о всех подобранных зондах. Проверку эффективности зондов проводили методом РЬА8Н-ПЦР с добавлением зонда в концентрации 0.1 мкМ. В случае если сигнал был низок (3-5 ед. фона), концентрацию зонда повышали до 0.2 мкМ. Если повышение концентрации не приводило к желаемому результату — подбирали новый зонд. На рис. 7
приведена смоделированная вторичная структура зонда Вр280 для детекции нематод рода ВипарИекпсИш. Данный зонд показал уровень разгорания в 20 ед. фона при фоновом уровне 50 ед. и концентрации 0.1 мкМ, что говорит о его высоком качестве.
Таблица 5. Проверка ингибирования ПЦР амплификацией ВК.
Объект Конечное разведение, при котором есть сигнал во РЬАЗН-ПЦР Объект Конечное разведение, при котором есть сигнал во РЬАБН-ПЦР
Без ВК свк Без ВК свк
МВК 10" 10" ВВКК 10"' Ю-9
SBK Ю"6 10'6 ХВК 10"9 10-"
YBK ш-4 10" ВМВК ю-" 10"
АВК ю-5 10! ВСЛК 10 s Ю-5
ВНПЖС ю-5 Ю-5 В. xylophilus 10" 10"
Актин картофеля ю-9 10-' R. solanaceartim 10"5 10"s
В. mucronatus 10" 10" С. michiganensis subsp. sepedonicits 10 s Ю-5
Didymella/ Ascochyta ю-5 10 s С. michiganensis subsp. michiganensis ю-5 Ю-5
P. carotovorum subsp. carotovorum 10's 10 s P. stewarlii subsp. stewarlii 10"s 10-'
G. pallida 10"6 10* G. rostochiensis 10"6 Ю-6
Для проверки эффективности ПЦР и отсутствия ингибирования специфической реакции амплификацией ВК проводили РЬАБН-ПЦР в двух вариантах: с ВК и без него (рис. 8-9, табл. 5) с рядом разведений анализируемой ДНК. Для этого подбирали такое разведение плазмиды для ВК, при котором ингибирование отсутствовало (исходная концентрация плазмиды 400 нг/мкл). Для систем с температурой отжига праймеров 64 и 67°С это разведение составило 10"8 и 10"7 раз, соответственно.
Как видно из этих рис. 8 и 9, положительный сигнал отмечен при одном и том же разведении при амплификации ДНК обоих видов как с ВК, так и без него, что свидетельствует об отсутствии ингибирования специфической реак-
ции амплификацией ВК.
Используя описанный выше алгоритм разработки диагностических систем в формате РЬА8Н-ПЦР, мы разработали все 18 тест-систем для диагностики и идентификации перечисленных выше фитопатогенов.
Buraphelenchus п
Ме-1 10е-2
•W
jcronatus, без ВК IHHH 23,9
Юе-2 ИГ 10е-3
10е-3 етг
Юе-4 В 1:8?
10е-4 В ):8?
Юе-4 я 1:8?
10
15
20
25
30
Юе-1 Юе-2
Buraphelenchus mucronatus, с ВК
^^■■■■НШЯ 16
\\\\\\\\\\ Л 115.9
■■■ННЯН 15,1
Юе-2 R85S Юс-З SSSS
Юе-З
Юе-4 Kf^
Юе-4
Юе-4
к- Kfc
10
15
■:. 18.7 20
25
Рис. 8. Результат ПЦР в формате FLASH на В. mucronatus с различными разведениями ДНК.
Юе-1
10е-2 Р5
Юе-2 ^
Юе-З gg
Юе-З В"
Buraphelenchus x^ophilis, с ВК
Buraphelenchus xylophilis, без ВК
fit,«.
Ш5
Юе-4 Bg^Z
Юе-4 RiSss
20.2 20,1
Юе-4 PMSSSSSSSS
К- P^gWw
10
15
20
25
Юе-1 ^flP
Юе-2 B4SF
Юе-2 ^ЗДР
Юе-З В5Я5Р
Юе-З Юе-4 Юе-4 Юе-4
К" " '''I fi!
10 12 14 16
Рис. 9. Результат ПЦР в формате FLASH на В. xylophilus с различными разведениями ДНК.
В мировой практике существует целый ряд тест-систем для диагностики сосновых стволовых нематод. Ниже сравним уже существующие тест-системы с разработанными и обратим особое внимание на возможность их применения в рутинной диагностике. Применяемые в мировой практике тест-системы для идентификации нематод Bwsaphelenchus основаны на трудоемких, пригодных
только для использования в научных лабораториях методах, таких как ПЦР-ПДРФ с праймерами к ВТС1-2 (Han et al, 2008), RAPD-анализ (Braasch et al, 1995), а также классическая ПЦР с праймерами к межгенным и внутренним транскрибируемым спейсерам рДНК (Kang et al, 2004; Matsunaga & Togashi, 2004), генам белков теплового шока (Leal et al, 2005) и сателлитной ДНК (Castagnone et al, 2005).
Существует также диагностическая система, основанная на современном методе ПЦР-РВ с TaqMan зондами и праймерами к генам белков теплового шока Hsp70 (Leal et al, 2007). Следует отметить, что данная система не оптимизирована для количественного определения нематод, поэтому применение сложной техники ПЦР-РВ, требующей дорогого оборудования и расходных материалов, на наш взгляд, не оправдано. Еще одним недостатком данной системы детекции сосновых стволовых нематод методом ПЦР-РВ является отсутствие интегрированной системы ВК.
Разработанные нами на основе FLASH-ПЦР тест-системы для диагностики сосновых стволовых нематод имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с существующими и полностью удовлетворяет всем предъявляемым к современным диагностическим системам требованиям. Так, они характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью за счет использования флуоресцентной детекции результатов; максимальной автоматизацией большинства этапов анализа, что уменьшает вероятность субъективной оценки результатов; стандартизацией этапов анализа за счет наличия системы контролен, включающей внутренний, положительный и отрицательный контроли; высокой производительностью системы; сокращением количества манипуляций/этапов; компьютеризацией ввода и вывода данных анализов и совместимостью с программным обеспечением по статистической обработке результатов.
Рис. 10. Диагностика вирусов картофеля методом РЬА8Н-ПЦР. По оси абсцисс отложена интенсивность флуоресценции, по оси ординат — номера образцов. Черный столбец — специфика, серый столбец — ВК. 1-12 — образцы инфицированных растений картофеля, 13 — К+, 14 — К-, 15 — вода, 16-17 — фон. Ус) — анализ на ВВКК, Ь — ВСЛК, — ВМВК, У — УВК, А — АВК, X — ХВК, М — МВК, Б — БВК, Ак — актин.
Для более полного представления о практической значимости проведенных исследований ниже приведены результаты применения разработанных тест-систем. На рис. 10 суммированы результаты тестирования 12 различных полевых образцов картофеля на основные вирусы и ВВКК, а также тестирование семян огурцов на зараженность аскохитозом (рис. 11).
Из рис. 10 видно, что некоторые из исследованных растений были инфицированы одним или одновременно несколькими патогенами. В частности, образец № 1 одновременно инфицирован ВВКК, ВСЛК и YBK, № 4 -ВВКК, ХВК и YBK, а № 7 - YBK и МВК. Результаты FLASH-ПЦР, представленные на рис. 10, сравнивали с данными ИФА-диагностики. Все образцы, в которых, по данным ИФА, отмечена инфекция, также дали положительный результат при диагностике тест-системами на основе FLASH-ПЦР. Однако в ряде случаев метод ПЦР обнаруживает наличие инфекции, не выявляемое ИФА ввиду недостаточной чувствительности, а также специфичности последнего. Так, в образце № 4 с помощью FLASH-ПЦР мы обнаружили наличие АВК, а в образце № 8 - ХВК. Тест на мРНК актина картофеля (Ак) во всех образцах был положительным, что свидетельствует о корректности выделения РНК и реакции обратной транскрипции.
На рис. 11 представлены результаты ПЦР на аскохитоз огурца различных партий семян с детекцией в формате электрофореза (А) и в формате FLASH (Б). Из рисунка видно, что данные классической ПЦР и ПЦР в формате FLASH полностью коррелируют. Для проверки достоверности результатов ПЦР полученные специфические фрагменты были проклонированы и секвенированы (номера в банке генов: FJ748550-FJ748553). Показано, что полученные фрагменты ДНК принадлежат грибам Didymella bryoniae и Phoma sp., которая является анаморфой возбудителя аскохитоза.
Резюмируя все выше сказанное, можно заключить, что разработанные в ходе данной работы тест-системы в формате РЬАвН-ПЦР имеют целый ряд существенных преимуществ, перечисленных ранее, и полностью удовлетворяет всем предъявляемым к современным диагностическим системам требованиям, а следовательно, могут эффективно применяться для диагностики и идентификации соответствующих фитопатогенов.
■ 9
A so 322 477 478 491 2185 2382 - +
■в Протопоп 0 Оператор: j fess
| Пробирка Образец Результат | 1 '1 I -
«• НШ 0.06 10.0в
2/0 322 *■ 10.02 0.94
ЗЮ 477 + 8.74 «.88
4ЛЗ 478 ♦ 10.00 0.94
5/0 6/0 491 2185 ♦ 8.21 ♦ 8,32 7,13 7.08
7/0 2382 ♦ 7.00 8.94
8/0 0.89 10.01
9/0 0.02 10.00
10« + 1.0«
И/фон(сМу) фон 11» liO 0.97
12At»0H(didy) фон ф« 087
юч*ния 76, SO' 100,00'
W mm Fem Г mm Rox
W mm Hex Г — Cys
pa
— ! !
*m „ ... .
■a я |
1 J 3 4 J i i
Рис. 11. Диагностика аскохитоза огурца методом ПЦР (А) и FLASH-ПЦР (Б). 80, 322,477, 478, 2185, 2382 — номера партий семян. «-» —- К-, «+» — К+.
выводы
1. Разработана общая стратегия диагностики фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH.
2. Подтверждено, что зонд типа «молекулярный маячок» обладает меньшим уровнем фоновой флуоресценции, чем TaqMan, и также, как и TaqMan, разрушается Taq-полимеразой с 5'-3' экзонуклеазной активностью, а следовательно лучше всего подходит для ПЦР в формате FLASH.
3. Созданы SCAR-маркеры для детекции 18 фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH по унифицированному алгоритму.
4. Для каждой тест-системы сконструированы и проклонированы положительные контроли.
5. Разработанные тест-системы внедрены в производство на базе ЗАО «НПФ ДНК-Технология».
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи
1. Рязанцев Д.Ю., Абрамов Д.Д., Завриев С.К. (2006). ПЦР-диагностика основных патогенов картофеля. Вопросы картофелеводства. Актуальные проблемы науки и практики. М.: ВНИИ картофельного хозяйства, с. 242-248.
2. Завриев С.К., Рязанцев Д.Ю., Кошкина Т.Е. и Абрамов Д.Д. (2007). Эффективный и экономичный метод чувствительной диагностики и идентификации патогенов картофеля. В сборнике: Картофелеводство России: актуальные проблемы науки и практики. М.: ФГНУ «Росинформагротех», с.100-103.
3. Zavriev S.К., Ryazantsev D., Abramov D. and Koshkina T. (2007). Effective and efficient approach to potato pathogen sensitive détection and identification. In: "Potato production and innovative technologies". A.J. Haverkort and B.V. Anisimov (Eds). Wageningen Academic Publishers, p. 255-261.
4. Абрамова C.JI., Рязанцев Д.Ю., Воинова T.M. и Завриев С.К. (2008). Диагностика фитопатогенных грибов Septoria tritici и Stragonaspora nodorum методом FLASH-ПЦР. Биоорганическая химия, 34: 107-113.
5. Кулинич О.А., Рысс А.Ю., Чернецкая А.Ю., Пономарев В.Л., Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К. (2008). Использование ПЦР-диагностики для идентификации карантинных видов нематод. Защита и карантин растений, №8: 36-39.
6. Рязанцев Д.Ю., Абрамова С. Л., Евстратова С. В., Гагкаева Т. Ю., Завриев С. К. (2008). Диагностика токсиногенных грибов рода Fusarium методом FLASH-PCR. Биоорганическая химия, 34: 716-724.
7. Рязанцев Д.Ю., Ребриков Д.В., Дробязина П.Е., Завриев С.К. (2008). Диагностика основных фитопатогенов огурца и томата при выращивании в закрытом грунте методом полимеразной цепной реакции в формате FLASH с использованием диагностических наборов производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология». Методические указания. М.: ВНИИ фитопатологии РАСХН. 21 с.
8. Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К. (2009). Эффективный метод диагностики и идентификации вирусных патогенов картофеля. Молекулярная биология, 43: 558-567.
9. Рязанцев Д.Ю., Абрамов Д.Д., Дробязина П.Е., Приходько Ю.Н., Завриев С.К. (2009). Диагностика ряда карантинных фитопатогенов методом полимеразной цепной реакции в формате FLASH при помощи диагностических
наборов производства ООО «АгроДиагностика». Методические указания. М.: ФГУ Всероссийский Центр Карантина Растений. 27 с.
10. Рязанцев Д.Ю., Абрамов Д.Д., Завриев С.К. (2009). Диагностика карантинных фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH. Сельскохозяйственная биология, №3: 114-117.
Материалы конференций
1. Рязанцев Д.Ю. (2006). ПЦР-диагностика основных патогенов картофеля. Материалы конференции "Грибы и водоросли в биоценозах". МГУ, с. 130-131.
2. Рязанцев Д.Ю., Абрамов Д.Д, Завриев С.К. (2008). Детекция ряда карантинных фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH. Материалы международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино, 21-24 октября, с. 76.
3. Рязанцев Д.Ю., Абрамова C.JL, Евстратова C.B., Гагкаева Т.Ю., Завриев С.К. (2008). ДНК-технологии для диагностики и идентификации токсигенных патогенов зерна и продуктов его переработки. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва, с. 364-365
4. Завриев С.К., Рязанцев Д.Ю., Абрамов Д.Д. (2008). Разработка систем для детекции и идентификации карантинных нематод Bursaphelenchus и Globodera на основе FLASH-PCR. Материалы международного научно-практического совещания «Паразитические нематоды растений, биоразнообразие, изучение, коллекции». ВНИИ фитопатологии РАСХН, Голицыно, 8-9 апреля 2008.
5. Рязанцев Д.Ю., Абрамов Д.Д, Завриев С.К. (2009). Детекция ряда карантинных фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH. Материалы всероссийской научно-координационной конференции «Использование мировых генетических ресурсов ВИР в создании сортов картофеля нового поколения». Санкт-Петербург, 28-29 июля. с. 265-272.
Приложение
№. от
- ?>-.[ спсральный директор ) i пф ДНК-Технология»
_ _Д.Ю. 'Трофимов
«УТВЕРЖДАЮ» [ спсральный директор
/
Г
J
АКТ
О внедрении результатов работ
Настоящим актом подтверждается, что для диагностических наборов, разработанных в группе молекулярной диагностики Института биоорганической химии им, академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и предназначенных для экспресс-определения следующих фнтопатогенов: X, Y, А, М и S вирусов картофеля, вируса скручивания листьев картофеля (BCJ1K), вируса метельчатости верхушки картофеля (ВМВК), вироида веретеиовидности клубней картофеля (ВВКК), возбудителей кольцевой гнили картофеля (Clavibacler michiganensis subsp. scpcdoniais), аскохитоза тыквенных и томатов (Didymella spp.), гнили плодов (Peclobactcrium carolmnrum subsp. carotovorum), рака томатов (С. michiganensis subsp. mkhigatwnsis), вилта кукурузы (Pantoea stewarlii subsp. stewartii), бурой гнили картофеля (Ralstonia solcmacearum), бледной и золотистой картофельных цистообразуюших нематод (Globodera pallida и G. rostochiensis), сосновой стволовой нематоды (Bursaphelenchus xylophilus) и ее вида-двойника (В. mucronatus), вируса ризомании сахарной свеклы (Beet necrotic yellow vein virus), — разработан комплект научно-техиической документации и на базе производственных мощностей ЗАО «ППФ ДНК-Технология» организован опытцо-промышлепный выпуск диагностических наборов.
Директор по науке д.б.л.
Д.В.Ребриков
Заказ № 173-а/09/09 Подписано в печать 29.09.2009 Тираж 75 экз. Усл. п.л. 2
ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рязанцев, Дмитрий Юрьевич
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Введение. Обзор методов диагностики фитопагогенов.
Иммунохимические методы.
Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.
Микрочипы (microarray).
ДНК маркеры.
Выбора локуса для видовой дифференциации SCAR-маркерами.
Методы диагностики, основанные на амплификации нуклеиновых кислот.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Альтернативные методы амплификации нуклеиновых кислот.
Методы с флуоресцентной детекцией результатов амплификации.
Различные подходы к флуоресцентной детекции результатов ПЦР.
Методы с флуоресцентой детекцией результатов после амплификации.
Флуоресцентная детекция результатов в других системах амплификации.
Краткая характеристика фитопатогенов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Реактивы, оборудование и штаммы микроорганизмов.
Выделение нуклеиновых кислот и реакция обратной транскрипции.
Выравнивание нуклеотидных последовательностей, дизайн праймеров и зондов.
Полимеразная цепная реакция в формате FLASH.
Общая стратегия подбора праймеров.
Детекция результатов ПЦР.
Клонирование положительных контролен.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Стратегия диагностики.
Выбор типа флуоресцентно-меченого зонда для ПЦР в формате FLASH.
Адаптация наборов для выделения нуклеиновых кислот.
Разработка SCAR-маркеров и диагностических тест-систем для видовой дифференцировки фитопатогенов.
Выбор участка генома, подбор праймеров.
Подбор и апробация зондов, проверка ингибирования ПЦР амплификацией ВК.
Сравнение существующих диагностических систем с разработанными.
Апробация тест-систем на полевых образцах.
ВЫВОДЫ.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Рязанцев, Дмитрий Юрьевич
выводы
1. Разработана общая стратегия диагностики фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH.
2. Подтверждено, что зонд типа «молекулярный маячок» обладает меньшим уровнем фоновой флуоресценции, чем TaqMan, и также, как и TaqMan, разрушается Taq-полимеразой с 5'-3' экзонуклеазной активностью, а следовательно лучше всего подходит для ПНР в формате FLASH.
3. Созданы SCAR-маркеры для детекции 18 фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH по унифицированному алгоритму.
4. Для каждой тест-системы сконструированы и проклонированы положительные контроли.
5. Разработанные тест-системы внедрены в производство на базе ЗАО «НПФ ДНК-Технология».
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рязанцев, Дмитрий Юрьевич, Москва
1. Апасов И.В. (2007). Ризомания в России: мифы или реальность? Сах. Свекла. №8, 10-6.
2. Баранов В.И., Ушаков В.В. (2000). Разработка и внедрение в практику элитного семеноводства картофеля технологии ускоренного промышленного производства оздоровленного материала картофеля: Отчет о НИР / Пущ. высш. агробиотехнол. Колледж. Пущино, 8.
3. Блоцкая Ж.В. (1998). Биоразнообразие вирусов картофеля// Защита и карантин растений. №7, 41.
4. Гринько H.H. (2003). Аскохитоз огурцов Защищенный грунт. Защита и карантин растений. №4, 32-33.5. Ёлов A.A., Федоров H.A., Жибурт Е.Б., Кофиади И.А., Трофимов Д.Ю. (2005). Здравоохранение и медтехника. №2. С. 10.
5. Зайнуллин A.A., Зайнуллина A.C. (2003). Разработка тест-системы на основе ОТ-ПЦР для определения вируса картофеля М (PVM). Материалы отчет. Сес. молодых ученых ТатНИИСХ/Татар.НИИСХ. Казань, 22-29.
6. Лаптинов И.А. (2005). ПЦР-диагностика без электрофореза. Лабораторная диагностика России. Ежегодный справ. Мир медицины. М. Изд-во "Человек", 2004/2005.
7. Логинова Г.Л. (1993). Вирусы и продуктивность картофеля 1993./ Селекция, семеноводство и технологии возделывания картофеля на Северо-Западе РФ. 44-48.
8. Перечень вредителей, возбудителей болезней растений, сорняков, имеющих карантинное значение для Российской Федерации (Утвержден МСХ РФ в 2003 г.). (2003).
9. Перечень карантинных вредителей, болезней растений и сорняков для стран СНГ. 6-я конференция по карантину растений государств -участников Содружества Независимых Государств и государств Балтии от 12-14 августа 1997 года. (1997).
10. П.Трускинов Э.В. (2001). Андийские вирусы картофеля. Защита и карантин растений. №3, 34-5.
11. Фолимонова С.Ю., Фолимонов A.C., Аграновский A.A., Атабеков И.Г. (1998). Идентификация штамма У-вируса картофеля, вызывающего кольцевой некроз клубней, с помощью иммуноспецифической ПНР. Доклады РАСХН. №5, 16-17.
12. Хромова Л.М., Завриев С.К., Аршава Н.В., Бойко В.В. (2001). Диагностика PSTV-D методом RT-PCR. Биотехнология на рубеже двух тысячелетий. 39-40.
13. Abu-Halaweh М., Bates J., Patel B.K. (2005). Rapid detection anddifferentiation of pathogenic Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by real-time PCR. Res Microbiol. 156, 107-14.
14. Afonina I., Metcalf M., Mills A., Mahoney W. (2008). Evaluation of 5'-MGB hybridization probes for detection of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis using different real-time PCR instruments. Diagn Microbiol Infect Dis. 60, 429-32.
15. Agindotan B.O., Shiel P.J., Berger P.H. (2007). Simultaneous detection of potato viruses, PLRV, PVA, PVX and PVY from dormant potato tubers by TaqMan real-time RT-PCR. J Virol Methods. 142, 1-9.
16. Agrios G.N. (1988). Plant Pathology, 3rd ed. Academic Press, Inc. New York. 803pp.
17. Allen R.C., Rogelj S., Cordova S.E., Kieft T.L. (2006). An immuno-PCR method for detecting Bacillus thuringiensis CrylAc toxin. J Immunol Methods. 308, 109-15.
18. Alvarez A.M. Integarted approaches for detection of plant pathogenic bacteria and bacterial diseases. (2004). Annual Review of Phytopathology. 42, 339-66
19. Angelini E., Luca Bianchi G., Filippin L., Morassutti C., Borgo M. (2007). A new TaqMan method for the identification of phytoplasmas associated with grapevine yellows by real-time PCR assay. J Microbiol Methods. 68, 613-22.
20. Atallah Z.K., Stevenson W.R. (2006). A Methodology to Detect and Quantify Five Pathogens Causing Potato Tuber Decay Using Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction: Phytopathology. 96, 1037-45.
21. Atkins D.S., Clark I.M. (2004). Fungal diagnostics: a mini review. J. Appl Genet. 45, 3-15.
22. Balme-Sinibaldi V., Tribodet M., Croizat F., Lefeuvre P., Kerlan C., Jacquot E. (2006). Improvement of Potato virus Y (PVY) detection and quantitation using PVY(N)- and PVY(0)-specific real-time RT-PCR assays. J Virol Methods. 134, 261-6.
23. Bartels R. (1971). Potato Virus A. Description,of plant viruses. №54.
24. Beckhoven van J.R., Stead D.E., van der Wolf J.M. (2002). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by AmpliDet RNA, a new technology based on real time monitoring of NASBA amplicons with a molecular beacon. J Appl Microbiol. 93, 840-9.
25. Belkum A van ., Niesters H.G. (1995). Nucleic acid amplification and related techniques in microbiological diagnostics and epidemiology. Cell Mol Biol. 41, 615-23.
26. Belkum van A. (1994). DNA fingerprinting of medically importantmicroorganisms by use of PCR. Clin Microbiol Rev. 7, 174-84.
27. Bellis P., Schena L., Cariddi C. (2007). Real-time Scorpion-PCR detection and quantification of Erwinia amylovora on pear leaves and flowers. European Journal of Plant Pathology. 118, 11-22.
28. Bentsink L., Leone G.O., van Beckhoven J.R., van Schijndel H.B., van Gemen B., van der Wolf J.M. (2002). Amplification of RNA by NASBA allows direct detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in potato. J Appl Microbiol. 93, 647-55.
29. Berg T., Tesonero L., Hailstones D.L. (2006). A multiplex real-time PCR assay for detection of Xanthomonas campestris from brassicas. Lett Appl Microbiol. 42, 624-30.
30. Bergervoet J.H., Peters J., van Beckhoven J.R., van den Bovenkamp G.W., Jacobson J.W., van der Wolf J.M. (2008). Multiplex microsphere immunodetection of potato virus Y, X and PLRV. J Virol Methods. 149, 63-68.
31. Bextine B., Blua M., Harshman D., Miller T.A. (2005). A SYBR green-based real-time polymerase chain reaction protocol and novel DNA extraction technique to detect Xylella fastidiosa in Homalodisca coagulata. J Econ Entomol. 98, 667-72.
32. Birch D.E. (1996). Simplified hot start PCR. Nature. 381, 445-6.
33. Bluhm B.H., Cousin M.A., Woloshuk CP. (2004). Multiplex real-time PCR detection of fumonisin-producing and trichothecene-producing groups of Fusarium species. J Food Prot. 67, 536-43.
34. Boonham N., Pérez L.G., Mendez M.S., Peralta E.L., Blockley A., Walsh K., Barker I., Mumford R.A. (2004). Development of a real-time RT-PCR assay for the detection of potato spindle tuber viroid. J Virol Methods. 116, 139-46.
35. Boonham N., Walsh K., Smith P., Madagan K., Graham I., Barker I. (2003). Detection of potato viruses using microarray technology: towards a generic method for plant viral disease diagnosis. Jornal of Virological method. 108, 181-7.
36. Borman A.M., Linton Chr.J., Miles S.-J., Johnson E.M. (2008). Molecular identification of pathogenic fungi. Jornal of Antimicrobial Chemotherapy. 61, Í7-Í12.
37. Braasch H., Burgermeister W, Pastrik K.-H. (1995). Differentiation of three Bursaphelenchus species by means of RAPD-PCR. Nachrichtenblatt des Deutschen Pflanzenschutzdiensts 47, 310-314.
38. Brownie J., Shawcross S., Theaker J. (1997). The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucl. Acids Res. 25, 3235-41.
39. Bulman S.R., Marshall J.W. (1997). Differentiation of Australian potato cyst nematode (PCN) populations using the polymerase chain reaction (PCR). N Z J Crop Horticult Sei. 25:123-9.
40. Burggraf S., Olgemöller B. (2004). Simple Technique for Internal Control of
41. Real-Time Amplification Assays. Clinical Chemistry. 50, 819-25.
42. Burokiene D. (2006). Early detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensi in tomato seedlings. Agronomy Research. 4 (Special issue), 1514.
43. Bustamante P.I., Hull R. (1998). Plant virus gene expression strategies. EJB Electronic Journal of Biotechnology. 1.
44. Bystricka D., Lenz O., Mraza I., Piherovad L., Kmochd S., Sipc M. (2005). Oligonucleotide-based microarray: A new improvement in microarray detection of plant viruses. Journal of Virological Methods. 128(1-2), 176-82.
45. Chen R., Huang W., Lin Z., Zhou Z., Yu H., Zhu D. (2004). Development of a novel real-time RT-PCR assay with LUX primer for the detection of swine transmissible gastroenteritis virus. J Virol Methods. 122, 57-61.
46. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Bull. OEPP. (2005). Organisation Europ. et mediterraneene pour la protection des plantes. Oxford, 35, 275-83.
47. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Bull. OEPP. (2004). Organisation europ. et mediterraneenne pour la protection des plantes. Oxford, 34, 323-5
48. Coplin D.L., Majerczak D.R. (2002). Identification of Pantoea stewartii subsp. stewartii by PCR and strain differentiation by PFGE. Plant Disease. 86, 30411.
49. Coutelle C. (1991). New DNA-analysis techniques (minireview). Biomed BiochimActa. 50,3-10.
50. Cubero J., Wolf van der J., Beckhoven van J., Lopez M.M. (2002). An internal control for the diagnosis of crown gall by PCR. J. Microbiol Methods. 51, 38792.
51. Dang C., Jayasena S.D. (1996). Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J. Mol. Biol. 264, 68-278.
52. Degola F., Berni E., Dall'Asta C., Spotti E., Marchelli R., Ferrero I., Restivo F.M. (2007). A multiplex RT-PCR approach to detect aflatoxigenic strains of Aspergillus flavus. J Appl Microbiol. 103,409-17.
53. Deiman B., van Aarle P, Sillekens P. (2002). Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Mol Biotechnol. 20, 163-79.
54. Diagnostic Beet necrotic yellow vein virus (benyvirus). (2006). European and Mediterranean Plant Protection Organization. Blackwell Publishing Ltd PM 7/30 (2).
55. Diagnostic protocol for regulated pests Bursaphelenchus xylophilus. (2002). EPPO Standards. PM 7/4(1) English.
56. Diagnostic protocols for regulated pests PM 7/40. (2004) EPPO Standards. OEPP/EPPO Bulletin 34, 155-7.
57. Dreier J., Bermpohl A., Eichenlaub R. (1995). Southern hybridization and PCR for specific detection of phytopathogenic Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Phytopathology. 85, 462-8.
58. Du Z., Chen J., Hiruki C. (2006). Optimization and application of a multiplex RT-PCR system for simultaneous detection of five potato viruses using 18S rRNA as an internal control. Plant Dis. 90, 185-189.
59. Du Z., Jin B., Liu W., Chen L., Chen J. (2007). Highly sensitive fluorescent-labeled probes and glass slide hybridization for the detection of plant RNA viruses and a viroid. Acta Biochim Biophys Sin. 39, 326-334.
60. Faggioli F., Pasquini G., Barba M. Comparison of different methods of RNA isolation for plum pox virus detection by reverse transcription-polymerase chain reaction. (1998). Acta Virol. 42,219-21.
61. Fessehaie A., De Boer S.H., Lévesque C.A. (2003). An Oligonucleotide Array for the Identification and Differentiation of Bacteria Pathogenic on Potato. Phytopathology. 93, 262-9.
62. Filion M., St-Arnaud M., Jabaji-Hare S.H. (2003). Direct quantification of fungal DNA from soil substrate using real-time PCR. J Microbiol Methods. 53, 67-76.
63. Finetti Sialer M.M., Rosso L. (2007). Molecular detection in integrated pest and disease managemtnt. General Concepts in Integrated Pest and Disease Management. 305-28.
64. Fischer A., von Eiff C., Kuczius T., Omoe K., Peters G., Becker K. (2007). A quantitative real-time immuno-PCR approach for detection of staphylococcal enterotoxins. J Mol Med. 85, 461-9.
65. Gill P., Ghaemi A. (2008). Nucleic acid isothermal amplification technologies: a review. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 27(3):224-43.
66. Glen M., Smith A.H., Langrell S.R.H., Mohammed C.L. (2007). Development of nested polymerase chain reaction detection of mycosphaerella spp. and its application to the study of leaf disease in eucalyptus plantations. Phytopathology. 97, 132-44
67. Goel G, Kumar A, Puniya AK, Chen W, and Singh K (2005) Molecular beacon: a multitask probe. J Appl Microbiol. 99, 435-442.
68. Goldmeyer J., Kong H., Tang W. (2007). Development of a Novel One-Tube Isothermal Reverse Transcription Thermophilic Helicase- Dependent Amplification Platform for Rapid RNA Detection. Journal of Molecular Diagnostics. 9, 639-44.
69. Grothaus G.D., Bandla M., Currier T., Giroux R., Jenkins G.R., Lipp M., Shan G., Stave J.W., Pantella V. (2006). Immunoassay as an analytical tool in agricultural biotechnology. J AO AC Int. 89, 913-928.
70. Guglielmo R, Bergemann S.E., Gonthier P., Nicolotti G., Garbelotto M. (2007). A multiplex PCR-based method for the detection and early identification of wood rotting fungi in standing trees. J Appl Microbiol. 103, 1490-507.
71. Han H., Han B.Y., Chung Y.J., Shin S.C. (2008). A Simple PCR-RFLP for Idenficiation of Bursaphelenchus spp. Collected from Korea. Plant Pathol. J. 24, 159-63.
72. Harris S, Jones DB. (1997). Optimisation of the polymerase chain reaction. Br JBiomed Sci. 54, 166-73.
73. Harrison B. D. (1984). Potato leafroll virus. Description of plant viruses. №291.
74. Harrison B.D., Reavy B. (2002). Potato mop-top virus. Description of plant viruses. №389.
75. Hassan M., Myrta A., Polak J. (2006). Simultaneous detection and identification of four pome fruit viruses by one-tube pentaplex RT-PCR. J
76. Virol Methods. 133, 124-9.
77. Havis N.D., Oxley S.P., Piper S.R., Langrell S.R. (2006). Rapid nested PCR-based detection of Ramularia collo-cygni direct from barley. FEMS Microbiol Lett. 256,217-23.
78. Henry C.M., Barker I., Morris J., Hugo S.A. (1995). Detection of beet necrotic yellow vein virus using reverse transcription and polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods. 54, 15-28.
79. S6.Hermansson A., Lindgren P-E. (2001). Quantification of Ammonia-Oxidizing Bacteria in Arable Soil by Real-Time PCR. Applied and Environmental Microbiology. 67, 972-6.
80. Hiroyuki U., Shinya T. (2005). A One-Step Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction System for the Simultaneous Detection and Identification of Multiple Tospovirus Infections. PHYTOPATHOLOGY. 95, 166-71
81. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand, D.H. (1991). Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA. 88, 7276-80.
82. Horita M., Yano K., Tsuchiya K. (2004). PCR-based specific detection of Ralstonia solanacearum race 4 strains. J Gen Plant Pathol. 70, 278-83.
83. Kalantidis K., Denti M.A., Tzortzakaki S., Marinou E., Tabler M., Tsargris M. (2007). Virpl is a host protein with a major role in Potato Spindle Tuber Viroid infection in Nicotiana plants. Journal of virology. 81, 12872-80.
84. Kekarainen T., Savilahti H., Valkonen J.P.T. (2002). Functional Genomics on Potato Virus A: Virus Genome-Wide Map of Sites Essential for Virus Propagation. Genome Res. 12, 584-94.
85. Kellogg D.E., Rybalkin I., Chen S. (1997). TaqStartTM Antibody: "Hot Start" PCR Facilitated by a Neutralizing Monoclonal Antibody Directed Against Taq DNA Polymerase. Biotechniques. 16, 1134-7.
86. Kerlan C. (2006). Potato Virus Y. Description of plant viruses. №414.
87. Kleppe K., Ohtsuka E., Kleppe R., Molineux I., Khorana H.G. (1971). Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, 341-361.
88. Koenig R., Lesemann D.-E. (1989). Potato Virus X. Description of plant viruses. №354;
89. Kogovsek P., Gow L., Pompe-Novak M., Gruden K., Foster G.D., Boonham N., Ravnikar M. (2008). Single-step RT real-time PCR for sensitive detection and discrimination of Potato virus Y isolates. Journal of Virological Methods. 149(1), 1-11.
90. Kovarova M., Draber P. (2000). New specificity and yield enhancer of polymerase chain reactions. Nucleic Acids Res.Jul. 28, E70-e70.
91. Kramer M.F., Coen D.M. (2001). Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization. Curr Protoc Cell Biol. Appendix 3'.Appendix 3F.
92. Kubista M., Andrade J.M., Bengtsson M., Forootan A., Jonak J., Lind K., Sindelka R., Sjoback R., Sjogreen B., Strombom L., Stahlberg A., Zoric N.2006). The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95125.
93. Kumar S, Balakrishna K, Batra HV. (2008).Enrichment-ELISA for detection of Salmonella typhi from food and water samples. Biomed Environ Sci. 21(2), 137-43.
94. Lam, http://ihome.cuhk.edu.hk/~z045513/ coursematerial/blast.pdf
95. Lamhoujeb S., Fliss I., Ngazoa S.E., Jean J. (2008). Evaluation of the Persistence of Infectious Human Noroviruses on Food Surfaces using Molecular Beacon-Based Nucleic Acid Sequence-Based Amplification. Appl Environ Microbiol. Epub ahead of print.
96. Langrell S.R. (2005). Development of a nested PCR detection procedure for Nectria fuckeliana direct from Norway spruce bark extracts. FEMS Microbiol Lett. 242,185-93.
97. Leal I., Green M., Allen E., Humble L., Rott M. (2005). An effective PCR-based diagnostic method for the detection of Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) in wood samples from lodgepole pine. Nematology. 7, 833-42.
98. Leal I., Green M., Allen E., Humble L., Rott M. (2007). Application of a real-time PCR method for the detection of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, in wood samples from lodgepole pine. Nematology. 9, 351-62.
99. Lee I.-M., Bartoszyk I.M., Gundersen D.E., Mogen B., DAavis R.E.1997). Nested PCR for Ultrasensitive Detection of the Potato Ring Rot Bacterium, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Applied and Environmental Microbiology. 63, 2625-30.
100. Lee L., Kaplan I.B., Ripoll D.R., Liang D., Palukaitis P., Gray S.M. (2005). A surface loop of the potato leafroll virus coat protein is involved in virion assembly, systemic movement, and aphid transmission. J Virol. 79, 1207-14.
101. Leijon M., Mousavi-Jazi M., Kubista M. (2006). LightUp probes in clinical diagnostics. Mol Aspects Med. 27, 160-75.
102. Leone G., van Schijndel H., van Gemen B., Kramer F.R., Schoen C.D.1998). Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogeneous, real-time detection of RNA. Nucleic Acids Res. 26, 2150-5.
103. Liming S.H., Bhagwat A.A. (2004). Application of a molecular beacon-real-time PCR technology to detect Salmonella species contaminating fruits and vegetables. Int J Food Microbiol. 95, 177-87.
104. Ling K.S., Wechter W.P., Jordan R. (2007). Development of a one-step immunocapture real-time TaqMan RT-PCR assay for the broad spectrum detection of Pepino mosaic virus. J Virol Methods. 144, 65-72.
105. Loeffler J., Hebart H., Cox P., Flues N., Schumacher U., Einsele H. (2001). Nucleic acid sequence-based amplification of Aspergillus RNA in blood samples. J Clin Microbiol. 39, 1626-9.
106. Lopez M.M., Bertolini E., Olmos A., Caruso P., Gorris M.T., Llop P., Penyalver R., Cambra M. (2003). Innovative tools for detection of plant pathogenic viruses and bacteria. Int Microbiol. 6, 233-43.
107. Lopez M.M., Llop P., Olmos A., Marco-Noales E., Cambra M., Bertolini E. (2009). Molecular tools solving the challenges posed by detection of plant pathogenic bacteria and viruses? Curr. Issues MoL. Biol. 11, 13-46.
108. Lopez R., Asensio C., Guzman M.M., Boonham N. (2006). Development of real-time and conventional RT-PCR assays for the detection of potato yellow vein virus (PYVV). J Virol Methods. 136, 24-9.
109. Lou X.J., Panaro N.J., Wilding P., Fortina P., Kricka L.J. (2004). Mutation detection using ligase chain reaction in passivated silicon-glass microchips and microchip capillary electrophoresis. Biotechniques. 37, 396-8.
110. Lynch J.R., Brown J.M. (1990) The polymerase chain reaction: current and future clinical applications. Med Genet. 27, 2—7.
111. MadaniaM., Subbotin S.A., Moensa M. (2005). Quantitative detection of the potato cyst nematode, Globodera pallida, and the beet cyst nematode, Heterodera schachtii, using Real-Time PCR with SYBR green I dye. Molecular and Cellular Probes. 19, 81-6.
112. Maliogka V., Dovas C.I., Efthimiou K., Katis N.I. (2004). Detection and differentiation of Comoviridae species using a semi-nested RT-PCR and a phylogenetic analysis based on the polymerase protein. Journal of phytopathology. 152, 404-9.
113. Markoulatos P., Siafakas N., Katsorchis T., Moncany M. (2003). Multiplex PCR: rapid DNA cycling in a conventional thermal cycler. J Clin Lab Anal. 17, 108-12.
114. Markoulatos P., Siafakas N., Moncany M. (2002). Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. J Clin Lab Anal. 16, 47-51.
115. Marone M., Mozzetti S., De Ritis D., Pierelli L., Scambia G. (2001). Semiquantitative RT-PCR analysis to assess the expression levels of multipletranscripts from the same sample. Biol Proced Online. 16, 19-25.
116. Matsunaga K., Togashi K. (2004). A simple method for discriminating Bursaphelenchus xylophilus and B. mucronatus by species specific polymerase chain reaction primer pairs. Nematology. 6, 273-7.
117. McCartney H.A., Foster S.J., Fraaije B.A., Ward E. (2003). Molecular diagnostics for fungal plant pathogens. Pest Manag Sci. 59, 129-42.
118. Menzel W., Jelkmann W., Maiss E. (2002). Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. J Virol Methods. 99, 81-92.
119. Mills D., Russel B.W. (2003). Parameters for Specific Detection of Clavibacter michiganensis subsp, sepedonicus in Potato Stems and Tubers By Multiplexed PCR-ELISA. Amer J of Potato Res. 80, 223-34.
120. Monis P.T., Giglio S. (2006). Nucleic acid amplification-based techniques for pathogen detection and identification. Infect Genet Evol. 6, 212.
121. Morris J., Clover G.R.G., Harju V.A., Hugo S.A., Henry C.M. (2001). Development of a highly sensitive nested RT-PCR method for Beet necrotic yellow vein virus detection. Journal of Virological Methods. 95, 163-9.
122. Mumford R.A., Seal S.E. (1997). Rapid single-tube immunocapture RT-PCR for the detection of two yam potyviruses. J Virol Methods. 69, 73-9.
123. Nazarenko I, Lowe B, Darfler M, Ikonomi P, Schuster D, Rashtchian A. (2002). Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeled with a single fluorophore. Nucleic Acids Res. 30, e37.
124. Nazarenko I., Pires R., Lowe B., Obaidy M., Rashtchian A. (2002b). Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucleic Acids Res. 30, 2089-195.
125. Nickerson D.A., Ankener W., Delahunty C., Kwok P.Y. (2001). Genotyping by ligation assays. Curr Protoc Hum Genet. Chapter 2, Unit 2.6.
126. Nie X., Bai Y., Molen T.A., Desjardins D.C. (2008). Development of universal primers for detection of potato carlaviruses by RT-PCR. J Virol Methods. 149, 209-216.
127. Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R. (2007). Detecting antigens by quantitative immuno-PCR. Nat Protoc. 2, 1918-30.
128. Nilsson M. (2006). Lock and roll: single-molecule genotyping in situ using padlock probes and rolling-circle amplification. Histochemistry and Cell Biology. 126, 159-164.
129. Nowaczyk K., Dobosz R., Kornobis S., Obrepalska-Steplowska A. (2008). TaqMan REAL-Time PCR-based approach for differentiation between Globodera rostochiensis (golden nematode) and Globodera artemisiae species. Parasitol Res. 103,577-81.
130. Olmos A., Bertolini E., Cambra M. (2007). Isothermal amplification coupled with rapid flow-through hybridisation for sensitive diagnosis of Plum pox virus. J Virol Methods. 139, 111-5.
131. Osman F., Leutenegger C., Golino D., Rowhani A. (2008). Comparison of low-density arrays, RT-PCR and real-time TaqMan RT-PCR in detection of grapevine viruses. J Virol Methods. 149, 292-9.
132. Pantoea stewartii subsp. stewartii. Diagnostic protocols for regulated pests. (2004). OEPP/EPPO Standards PM 7/60. Bulletin 36, 111-115.
133. Park S.H., Kim H.J., Kim J.H., Kim T.W., Kim H.Y. (2007). Simultaneous detection and identification of Bacillus cereus group bacteria using multiplex PCR. J Microbiol Biotechnol. 17, 1177-82.
134. Pasquini G., Simeone A.M., Conte L., Barba M. (1998). Detection of plum pox virus in apricot seeds. Acta Virol. 42,260-3.
135. Pastrik K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coapmlifications of host DNA. Eur. J. Plant Pathol. 106, 155-165.
136. Pastrik K.H., Rainey F.A. (1999). Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by Polymerase Chain Reaction-based techniques. Journal of Phytopathology. 147, 687-93.
137. Peiman M., Xie C. (2006). Development and evaluation of a multiplex RT-PCR for detecting main viruses and a viroid of potato. Acta Virol. 50, 12933.
138. Penyalver R., Garcia A., Ferrer A., Bertolini E., Lopez M.M. (2002). Detection of Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi in olive plants by enrichment and PCR. 66, 2673-7.
139. Persson P., Sletten A. (1995). Fatty acid analysis for the identification of Erwinia carotovora subsp. atroseptica and E. carotovora subsp. Carotovora. EPPO Bull. 25:151-156.
140. Poussier S., Cheron J.-J., Couteau A., Luisetti J. (2002). Evaluation of procedures for reliable PCR detection of Ralstonia solanacearum in common natural substrates. Journal of Microbiological Methods. 51, 349 — 59.
141. Provost G. Le., Iskra-Caruana M.L., Acina I., Teycheney P.Y. (2006). Improved detection of episomal Banana streak viruses by multipleximmunocapture PCR. J Virol Methods. 137, 7-13.
142. Punithalingam E., P. Holliday. (1972). Didymella bryoniae. CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria. №332.
143. Ralstonia solanacearum. Bull. OEPP. (2004). / Organisation europ. et mediterraneenne pour la protection des plantes. Oxford, 34, 173-8.
144. Randhawa P.S., Pannu S.S., Schaad N.W. (2001). Improved bio-PCR test for detection of Acidovorax avenae subsp citrulli in watermelon and cantaloupe seeds. APS/MSA/SON Joint Meeting. Salt Lake City, august, 2529.
145. Ratti C., Clover G.R., Autonell C.R., Harju V.A., Henry C.M. (2005). A multiplex RT-PCR assay capable of distinguishing beet necrotic yellow vein virus types A and B. J Virol Methods. 124, 41-7.
146. Rekhviashvili N., Stevens G., Scott L., Stevens W. (2006). Fluorogenic LUX primer for quantitation of HIV-1 by real-time RT-PCR. Molecular Biotechnology. 32, 101-109.
147. Rigotti S., Gugerli P. (2007). Rapid identification of potato virus Y strains by one-step triplex RT-PCR. J Virol Methods. 140, 90-94.
148. Rose E.A. (1991). Applications of the polymerase chain reaction to genome analysis. FASEB J. 5, 46-54.
149. Roy A., Fayad A., Barthe G., Brlansky R.H. (2005). A multiplex polymerase chain reaction method for reliable, sensitive and simultaneous detection of multiple viruses in citrus trees. J Virol Methods. 129, 47-55.
150. Rumsby G. (2006). An introduction to PCR techniques. Methods'Mol Biol. 324, 75-89.
151. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-4.
152. Sakthivel N., Mortensen C.N., Mathur S.B. (2001). Detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in artificially inoculated and naturally infected rice seeds and plants by molecular techniques. Appl Microbiol Biotechnol. 56, 435-41.
153. Sano T., Smith C.L., Cantor C.R. (1992). Immuno-PCR: Very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science. 258, 120-2.
154. Saponari M, Manjunath K, Yokomi RK. (2008). Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription
155. PCR (TaqMan). J Virol Methods. 147, 43-53.
156. Schaad N.W., Frederick R.D. (2002) Real-time PCR and its application for rapid plant disease diagnostics. Plant Pathol. 24: 250-8.
157. Schneider W.L., Sherman D.J., Stone A.L., Damsteegt V.D., Frederick R.D. (2004). Specific detection and quantification of Plum pox virus by realtime fluorescent reverse transcription-PCR. J Virol Methods. 120, 97-105.
158. Schonfeld J., Heuer H.,van Elsas, J.D., Smalla K. (2003). Specific and Sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Soil on the Basis of PCR Amplification of fliC Fragments. Applied and Environmental Microbiology. 69, 7248-56.
159. Shim C.K., Seo I.K., Jee H.J., Kim H.K. (2006). Genetic Diversity of Didymella bryoniae for RAPD Profiles Substantiated by SCAR Marker in Korea. Plant Pathology Journal. 22, 36-45.
160. Siebert P.D., Larrick J.W. (1992). Competitive PCR. Nature. 359, 557-8.
161. Singh R.P., Valkonen J.P.T., Gray S.M.,. Boonham N,. Jones R.A.C, Kerlan C., Schubert J. (2008). Discussion paper: The naming of PVY. Archives of Virology. 153,1-13.
162. Somai B.M., Keinath A.P., Dean R.A. (2002b). Development of PCR-ELISA for detection and differentiation of Didymella bryoniae from related Phoma species (2) ; 2002, vol. 86, no7, pp. 710-716 (40 ref.)
163. Song W.Y., Kim H.M., Hwang C.Y., Schaad N.W. (2004). Detection of Acidovorax avenae ssp. avenae in rice seeds using BIO-PCR. Journal of phytopathology. 152, 667-76.
164. Spooner D., van Treuren R., de Vicente M.C. (2005) Molecular markers for genebank management. IPGRI Technical bulletin № 10. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy.
165. Szemes M., Bonants P., Weerdt de M., Baner J., Landegren U., Schoen C.D. (2005). Diagnostic applications of padlock-probes — multiplex detection of plant pathogenes using universal microarrays. Nucleic acid Research. 33, e70.
166. Tabler M., Tsagris M. (2004). Viroids: petite RNA pathogens with distinguished talents. Trends Plant Sci. 9, 339-48.
167. Tamada T. (2002). Beet necrotic yellow vein virus. Description of plantviruses. №391.
168. Tamura K., Dudley J., Nei M., & Kumar S. (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution. 24:1596-1599.
169. Templeton N.S. (1992). The polymerase chain reaction. History, methods, and applications. Diagn Mol Pathol. 1, 58-72.
170. Teycheney P.Y., Acina I., Lockhart B.E., Candresse T. (2007). Detection of Banana mild mosaic virus and Banana virus X by polyvalent degenerate oligonucleotide RT-PCR (PDO-RT-PCR). J Virol Methods. 142, 41-9.
171. Tian P., Mandrell R. (2006). Detection of norovirus capsid proteins in faecal and food samples by a real time immuno-PCR method. J Appl Microbiol. 100, 564-74.
172. Toth I.K., Avrova A.O., Hyman L.J. (2001). Rapid Identification and Differentiation of the Soft Rot Erwinias by 16S-23S Intergenic Transcribed Spacer-PCR and Restriction Fragment Length Polymorphism Analyses. Appl Environ Microbiol. 67, 4070-6.
173. Tyagi S, Bratu DP, and Kramer FR (1998) Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53
174. Tyagi S., Landedren U., Tazi M. (1996). Extremely sensitive, background-free gene detection using binary probes and QP replicase. Proc. Nat. Acad. Sci. 93, 5395-400.
175. Varga A., James D. (2006). Use of reverse transcription lopp-mediated isothermal amplification for the detection of Plum pox virus. J. Virol. Methods. 123,213-20.
176. Verchot-Lubicz J., YE C.-M., Bamunusinghe D. (2007). Molecular biology of potexviruses: recent advances. Journal of general virology. 88, 1643-55.
177. Vigano F., Stevens M. (2007). Development of a multiplex immunocapture-RT-PCR for simultaneous detection of BMYV and BChV in plants and single aphids. J Virol Methods. 146, 196-201.
178. Vincent M., Xu Y., Kong H., (2004). Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO reports. 5, 795-800.
179. Vora G.J., Meador C.E., Stenger D.A., Andreadis J.D. (2004). Nucleicacid amplification strategies for DNA microarray-based pathogen detection. Applied and enviromental microbiology. 70, 3047-54.
180. Vosberg H.P (1989). The polymerase chain reaction: an improved method for the analysis of nucleic acids. Hum Genet. 83, 1-15.
181. Wang L., Li P.C.H. (2007). Flexible Microarray Construction and Fast DNA Hybridization Conducted on a Microfluidic Chip for Greenhouse Plant Fungal Pathogen Detection. J. Agric. Food Chem. 55, 10509-16.
182. Wang L., Li P.C.H. Yu H.-Z., Parameswaran A.M. (2008). Fungal pathogenic nucleic acid detection achieved with a microfluidic microarray device. Analytica chimica acta. 610, 97-104.
183. Weller S.A., Elphinstone J.G., Smith N.C., Boonham N., Stead D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Appl Environ Microbiol. 66, 2853-8.
184. Wells J.M., Moline H.E. (1991). Differentiation of the soft-rotting Erwinia of the carotovora group by fatty acid composition. J. Phytopathol. 131, 22-32.
185. Westin L., Xu X., Miller C. (2000). Anchored multiplex amplification on a microelectronic chip array. Nature Biotechnol. 18, 199-204.
186. Wetter C. (1971). Potato Virus S. Description of plant viruses. №60.
187. Wetter C. (1972). Potato Virus M. Description of plant viruses. №87.
188. Xu L.Z., Larzul D. (1991). The polymerase chain reaction: basic methodology and applications. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 14, 20921.
189. Zeng Q.Y., Hansson P., Wang X.R. (2005). Specific and sensitive detection of the conifer pathogen Gremmeniella abietina by nested PCR. BMC Microbiol. 5, 65.
190. Zhang D., Wu J., Ye F., Feng T., Lee I., Yin B. (2006). Amplification of circularizable probes for the detection of target nucleic acids and proteins. Clinica chimica acta. 363, 61-70.
191. Zhang W., Bielaszewska M., Pulz M., Becker K., Friedrich A.W., Karch H., Kuczius TJ. (2008). New immuno-PCR assay for detection of low concentrations of shiga toxin 2 and its variants. Clin Microbiol. 46, 1292-7.
192. Zhang Y., Zhang D., Li W., Chen J., Peng Y., Cao W. (2003). A novel real-time quantitative PCR method using attached universal template probe. Nucleic Acids Res. 31, el23.
193. Zhao W-J., Chen H-Y., Zhu S-F., Xia M-F., Tan T-W. (2007) One-step detection of Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis. Journal of Plant Pathology. 89:349-51.
194. Zijlstra C., van Hoof R. A. (2006). A Multiplex Real-Time Polymerase Chain Reaction (TaqMan) Assay for the Simultaneous Detection of Meloidogyne chitwoodi andM. fallax. Phytopatology. 96, 1255-62.
195. Zizyte M., Staniulis J., Zitikaite I. (2006). Identification of Beet necrotic yellow vein virus isolate detected in Lithuania. Agronomy Research 4 (Special issue), 475-478.
196. Zouhar M, Rysanek O., Kocova M. (2000). Detection and differentiation of the potato cyst nematodes Globodera rostochiensis and Globodera pallida by PCR. Plant Protection Science. 36, 81-84.
-
Рязанцев, Дмитрий Юрьевич
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2009
-
ВАК 03.00.03
- Разработка систем идентификации грибов - возбудителей экономически значимых болезней зерновых культур методом ПЦР
- Биоразнообразие бактерий родов Rhizobium и Xanthomonas и создание молекулярной системы их идентификации и диагностики
- Эколого-биологические особенности сибирских штаммов грибов рода Fusarium, распространенных на зерне пшеницы
- Продукция индолил-3-уксусной кислоты и её генетический контроль у различных групп бактерий
- Электрофоретические и антигенные свойства полипептидов сальмонелл и идентификация их геномов полимеразной цепной реакцией
