Разработка ПЦР тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей

Панина, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка ПЦР тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка ПЦР тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей"

На правах рукописи

004619284

ПАНИНА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

2 О ЯНЗ ¿011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004619284

На правах рукописи

ПАНИНА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (МГУПБ) и в ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») Россельхознадзора Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор,

академик РАСХН

Уша Борис Вениаминович

доктор биологических наук, профессор Обухов Игорь Леонидович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Матвеева Ирина Николаевна

доктор биологических наук Соколова Надежда Львовна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Московская

государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Защита диссертации состоится 24 декабря 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии.

По адресу: 141142, Московская обл., Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината, ВНИТИБП; vnitibp@mail.ri. тел/факс: (495) 526-43-74

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИТИБП.

Автореферат разослан 23 ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, кандидат биологических наук _Фролов Ю.Д.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.Актуалыюсть темы.

Стремительное распространение среди крупного рогатого скота губкообразной энцефалопатии (ГЭ) во многих странах мира в последнее десятилетие прошлого века заставило ученых вновь обратить внимание на прионные инфекции и послужило толчком к более тщательному изучению патогенеза болезни, биологии возбудителя, выявлению источников и факторов его передачи (White T.J., 1992.)

Помимо ГЭ к числу прионных болезней сельскохозяйственных и домашних животных, имеющих важную экономическую значимость относится также трасмиссивная энцефалопатия норок (ТЭН). Данное заболевание имеет длительный инкубационный период, сопровождается дистрофичными поражениями центральной нервной системы, развитием дегенеративного губкообразного состояния серого вещества головного мозга и 100%-ной летальностью. Возбудителем ТЭН, как и других трансмиссивных губкообразных энцефалопатий, является инфекционный прионный белок (PrPSc), являющийся модифицированной изоформой нормального прионового белка (РгРс). (Борисов Л.Б., 2002; Слугин B.C., 2004).

Установлено, что единственным источником возбудителя прионных болезней является мясокостная мука, полученная из тканей пораженных животных (Marsh R.F et al., 1990). Поэтому в конце 90-х годов XX века во всех странах Европейского Союза (ЕС) был введен запрет на использование мясо-костной муки из тканей млекопитающих .для кормления животных.

В эти же годы участились случаи ввоза из-за рубежа в различные регионы России кормов для животных разных видов, в том числе и пушных зверей, в состав которых входили ткани животного происхождения. Использование такой продукции несёт в себе риски заноса на территорию Российской Федерации возбудителей не только прионных, но и вирусных

болезней, представляющих серьёзную угрозу для пушного звероводства, в частности Алеутской болезни норок (АБН).

АБН наносит огромный экономический ущерб звероводческим хозяйствам в связи с высокой смертностью животных (70-80%), ухудшением качества пушнины, снижением плодовитости самок и необходимостью проведения дорогостоящих ветеринарно-санитарных мероприятий. Болезнь характеризуется медленным развитием инфекционного процесса и пожизненной виремией. В организме больных норок вирус локализуется в сыворотке крови, головном мозге, мезентериальных лимфатических узлах, почках, селезенке, печени, слюнных железах, кишечнике. Высокая восприимчивость животных к АБН, устойчивость возбудителя к внешним условиям, использование для кормления пушных зверей тушек забитых животных и мясокостной муки из таких тушек, высокая устойчивость возбудителя АБН к воздействию факторов внешней среды обусловили широкое распространение инфекции во всех странах, где занимаются разведением норок (Слугин B.C., 2004).

Средства специфической профилактики данных болезней не разработаны. Важнейшим мероприятием по предотвращению ТЭН, как и АБН, служит ветеринарно-санитарный контроль кормов, используемых в пушном звероводстве.

Несмотря на запрет в странах ЕС использования для кормления животных мясо-костной муки из тканей млекопитающих, вероятность попадания её в Российскую Федерацию достаточно велика, особенно с рыбной мукой, фальсифицированной добавками протеинов млекопитающих. В целях недопущения поставок на территорию Российской Федерации подобной продукции в 2004 году распоряжением Россельхознадзора (№ 13-36/1825 от 24.09.2004) был запрещен ввоз на территорию РФ кормов, кормовых добавок и сырья для их производства, предназначенных для пушного звероводства, содержащих ткани жвачных и плотоядных.

Установлен порядок проверки каждой партии поступающих в РФ кормов на наличие белков жвачных и плотоядных.

Однако, существующие методы определения видовой принадлежности животных белков в составе корма, такие как иммунодиффузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, РИД и ИФА оказываются малоэффективными, т.к. корма проходят термическую обработку, ведущую к денатурации белков, следствием чего является потеря ими видовой специфичности. В отличии от белков, ДНК более устойчива к термической обработке и не утрачивает своей информативной функции.

Поэтому применение молекулярно-генетических методов является перспективным для определения видовой принадлежности ДНК в составе продуктов и кормов, подвергавшихся термической обработке. Учитывая отсутствие доступных и информативных методик, необходимых для мониторинга и контроля как отечественных, так и импортных кормов, предназначенных для пушного звероводства, разработка ПЦР - тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в составе кормов для пушных зверей является весьма актуальной.

1.2.Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы являлась разработка тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей методом полимеразной цепной реакции.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить принципиальную возможность выявления ДНК пушных зверей с помощью полимеразной цепной реакции, провести поиск и анализ нуклеотидных последовательностей, синтезировать праймеры.

2. Оценить эффективность существующих способов выделения ДНК в различных видах кормов (комбикормах, премиксах, (в т.ч. рыбной и в мясокостной муке) в кормовых добавках.

3. Провести оценку аналитических характеристик разработанной ПЦР-тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей при тестировании различных видов кормов и кормовых добавок.

4. Провести комиссионные испытания разработанной ПЦР-тест-системы.

1.3. Научная новизна.

Впервые сконструированы оригинальные олигонуклеотидные праймеры для амплификации специфических последовательностей ДНК пушных зверей.

Разработан положительный контрольный образец ДНК (ПКО), являющийся генно-инженерной конструкцией, несущей вставку фрагмента гена су (В. ПКО позволяет контролировать работу амплификационной смеси и является маркером длины ПЦР-продуктов.

Впервые в России разработана тест-система ПЦР для идентификации ДНК пушных зверей в кормах, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 0,1% примеси тканей пушных зверей в исследуемом материале или 10 пг ДНК пушных зверей в пробе.

1.4. Практическая значимость работы.

Впервые в России разработана и внедрена в практику тест-система «ПЗ-ком» для идентификации ДНК пушных зверей методом полимеразной цепной реакции.

Внедрение в систему государственного контроля ПЦР тест-системы «ПЗ-КОМ» с декабря 2005 года позволило выявлять фальсификацию рыбной муки и кормов тканями пушных зверей, что имеет важное эпизоотологическое значение.

Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные нормативные документы:

- Инструкция по применению тест-системы «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции;

Технические условия на тест-систему «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции (ТУ № 9388-152-00494189-06).

С 2006 года на базе ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора аттестовано производство и налажен серийный выпуск тест-системы «ПЗ-КОМ». Рекламаций на тест-систему не поступало.

1.5. Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (2005-2009 гг.), а также на научных и практических конференциях: на научно-проблемных методических комиссиях ФГУ ВГНКИ (2005-2007 гг.); на 6-й Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2007» (Москва, 2007 г.); на Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», посвященной 75-летию ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006 г.); Втором съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Казань, 2009 г.), VII Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010 г.).

1.6. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, том числе две в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

1. Выбор праймеров для идентификации ДНК пушных зверей; оптимизация условий выделения и амплификации ДНК.

2. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы.

3. Комиссионные испытания, разработка нормативной документации и государственная регистрация тест системы «ПЗ -КОМ» в Российской Федерации.

1.8. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 113 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 170 источников, в том числе 155 иностранных). Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 4 таблицами. Приложение к диссертации содержит разработанные соискателем нормативную документацию и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.

2. СОБСТВЕНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Поиск нуклеотидных последовательностей проводили по базам данных GeneBank - Национального института здоровья США, EMBL - Европейской молекулярно-биологической лаборатории, DDBJ - Национального института генетики Японии и PDB - базы данных белковых последовательностей при помощи поисковой системы Entrez Национального центра биотехнологической информации США.

Анализ выбранных нуклеотидных последовательностей на вариабельность и поиск консервативных участков, необходимых для выбора праймеров проводили с помощью системы ClustalW Multi Sequnce Alignment. Специфичность выбранных праймеров теоретически изучали с помощью компьютерных программы FASTA (Pearson W.G., 2000) и BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

Выбранные праймеры были синтезированы ЗАО "Синтол" (г.Москва) фосфоамитидным методом на синтезаторе ASM-102 (г. Новосибирск).

Для оценки аналитической чувствительности и специфичности разработанной тест-системы использовали образцы ДНК из мышц норок, песца, хорька, куницы, курицы, свиньи, барана, крови песца, печени норки, хорька. ДНК сои и кукурузы получали из образцов кукурузной и соевой муки.

Выделение ДНК из различных образцов проводили методом аффинной сорбции на силикагеле с предшествующим лизированием пробы в гуанидинтиоцианате (Boom R. et al., 1990), а так же методом протеиназной обработки и осаждения этанолом с предварительной фенольной экстракцией (Маниатис и др., 1984).

В качестве ВКО использовали ДНК фага лямбда. Для амплификации фага применяли праймеры и условия амплификации, предложенные фирмой Perkin Elmer Cetus (США) в наборе GeneAmp kit.

ПЦР с выбранными праймерами проводили в реакционном буфере объемом 25 мкл следующего состава: каждого праймера по 5-15* пмоль, каждого дНТФ по 0,2 мМ, 0,5 ед Taq-полимеразы, трис-НС1 68 мМ, сульфата аммония 17 мМ, сульфата магния от 1 до 3 мМ*, твин-20 0,01 %, бычьего сывороточного альбумина 0,1 мг/мл. В качестве матрицы (ДНК-пробы) брали 10 мкл препарата ДНК. ПЦР проводили на амплификаторе ТЕРЦИК ("ДНК-технология"), по следующей программе: 95 °С - 2 мин, 1 цикл; 95 °С - 1 мин, 56°С* - 1 мин, 72 °С - 1 мин, 42 цикла; 10°С - хранение. Оптимальную концентрацию сульфата магния, концентрацию и температуру отжига праймеров подбирали в ходе работы.

Полученные ПЦР-продукты визуализировали методом электрофореза в 1,7% агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка тест-системы велась в несколько этапов:

• выбор гена-мищени для амплификации,

• выбор олигонуклеотидных праймеров,

• оптимизация условий ПЦР, разработка универсального метода выделения ДНК из кормовой муки и кормовых добавок, комбикормов, сухих кормов и мясного фарша.

• разработка контрольных образцов тест-системы.

3.1. Выбор гена-мишени для амплификации и олигонуклеотидных праймеров.

В качестве мишени для специфических праймеров при идентификации тканей животных в кормах и пищевых продуктах, можно использовать как ядерные, так и митохондриальные гены. Для этих целей применяют гены а-актинового семейства, ген 12 S рибосомной РНК (Rodríguez et al., 2003, 2004), 5S РНК (Rodríguez et al., 2001), некодирующие короткие элементы (SINEs) (Walker et al. 2003, 2004), ген гормона роста (Wolf and Lüthy, 2002), АТФ-синтазы (Kusama et al., 2004). При этом использование митохондриальных генов имеет ряд преимуществ, в первую очередь из-за их многокопийности, что обеспечивает высокую чувствительность ПЦР.

В результате анализа баз данных нуклеотидных последовательностей были выбраны 2 специфических праймера для амплификации ДНК пушных зверей, позволяющие детектировать наличие ДНК норки, хорька, куницы. Мишенью для праймеров служил фрагмент гена митохондриалыюго цитохрома В cytB. В реакционной смеси с помощью праймеров синтезируется фрагмент ДНК длиной 213 п.о. Структура каждого праймера удовлетворяет общепринятым правилам: отсутствие самокомплиментарности 3'-концов каждого олигонуклеотида, отсутствие комплеметартности 3'-концов прямых и обратного праймеров, отсутствие вторичных структур, отсутствие тугоплавких повторов (более 3-х GC) на 3'-конце каждого праймера, отсутствие многократных AT (или ОС)-повторов внутри каждого праймера. Длина выбранных праймеров составила 24-27 п.н., GC-состав -36%—48%.

3.2.Изучение специфичности выбранных праймеров.

С помощью специализированных программ FASTA и BLAST была показана гомология выбранных олигонуклеогидов только с фрагментом гена cytB куньих и семейтва псовых. Значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других животных и другими нуклеотидными последовательностями, представленными в базе данных не установлено. Поиск был проведен по 52061 последовательностям. Таким образом, предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью.

3.3. Подбор условий ПЦР,

Известно, что эффективность ПЦР зависит от температуры отжига праймеров, их концентрации, концентрации ионов Mg2+, а также от количества циклов амплификации и концентрации ДНК-матрицы. Варьирование этих параметров оказалось достаточным для получения стабильных результатов.

Количество ионов Mg2+ варьировали от 1 мМ до 3 мМ (рис. 1) В качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из мышц норки. При увеличении концентрации Mg2+ , как правило, происходит увеличение концентрации специфического продукта реакции, что наблюдается и в данном случае. Оптимальной концентрацией Mg2+ для тестируемых праймеров, которая обеспечивает высокий выход специфического продукта реакции без дополнительных неспецифических фрагментов выбрана концентрация ЗмМ.

3 мМ Mg2* 2 мМ Mg2' 1 мМ Mg" К! ;

mm **»ш mm .. 3 ш*® Рис. 1. Выбор оптимальной концентрации Mg2+

3 мМ Mg

9 * '' "

2 мМ Mg2*

1 мМ Mg2* К-

Эффективность амплификации при разных температурах отжига оценивали в диапазоне от 54 до 60 °С . В качестве ДНК-матрицы использовали последовательные 10-ти кратные разведения ДНК норки с концентрацией от 100 пг до 1 пг ДНК (т.е. от 102 до 1 генома) в ПЦР-пробе. Во всех случаях неспецифических реакций амплификации замечено не было. В результате проведенных экспериментов была определена оптимальная температура отжига, равная 56°С (рис.2). М К- К+ 54° 56° 58° 60°

¡1111111111|.-' Ш " - И

яг т ийиВ | гч I |

Рис. 2. Оптимизация температуры отжига праймеров

М - маркер молекулярных весов (100, 200, 300, 400, 500, 800 п.н.); К+ положительный контроль ПЦР; К- отрицательный контроль ПЦР

С целью предотвращения появления возможных неспецифических реакций была подобрана оптимальная концентрация праймеров. Количество праймеров в реакционной смеси варьировали от 5 до 15 пмоль

Как видно из рис. 3, оптимальное содержание праймеров - 10 пмоль, в то время как снижение количества праймеров в 2 раза ухудшало чувствительность ПЦР в 10 и более раз.

ПЦР позволила детектировать по 1 пг ДНК в одной пробе.

В результате проведенных экспериментов было подобрано оптимальное количество праймеров, равное 10 пмоль, обеспечивающее максимальную чувствительность при минимальном расходе реактивов.

К+ 1 2 3 К-

Рис. 3. Оптимизация концентрации нраймеров в ПЦР

К+ положительный контроль ПЦР; К- отрицательный контроль ПЦР; 1 -конгрнтрагрш праймеров 15 пмоль в реакционной смеси; 2 - концентрация праймеров 10 пмоль в реащионной смеси; 3 - концентрация праймеров 5 пмоль в реакционной смеси

Для исключения неспецифических реакций и увеличения чувствительности ПЦР была использована методика «горячего старта». В качестве ДНК-матрицы брали 10 пг ДНК норки, амплификацию ДНК проводили в нескольких повторах.

Амплификация без «горячего старта» давала дополнительные полосы на элекгрофореграмме отличные от специфических полос. Во всех дорожках геля (включая отрицательный контроль ПЦР - ТЕ-буфер), соответствующих амплификации без «горячего старта» отмечено наличие полосы ниже уровня 100 п.н., что соответствует побочному продукту амплификации - праймер-димерам. Очевидно, взаимодействие Тац-полимеразы с праймерами ниже температуры отжига привело к их самодостройке, несмотря на то, что при выборе праймеров они были проверены на отсутствие самокомплиметарности на 3'-концах. Следует отметить, что интенсивность специфической полосы (ДНК пушных зверей - 213 п.н.), при амплификации без «горячего старта» уступала таковой при его наличии, что подтверждает преимущественное накопление низкомолекулярного побочного продукта реакции при отсутствии «горячего старта». Таким образом, применение методики «горячего старта» позволяет добиться стабильных результатов и увеличить эффективность накопления специфического ПЦР-продукта.

3.4. Определение чувствительности и специфичности выбранной системы амплификации.

Для определения чувствительности использовали разведения ДНК с концентрациями от 105 до 1 генома в ПЦР-пробе.

Специфичность праймеров проверяли на ДНК свиньи, курицы, лосося, барана, сои и кукурузы, ДНК из печени хорька и норки, ДНК из крови песца, ДНК из мышц песца, хорька, куницы, норки в концентрации 0,1 мкг (103 геномов) в ПЦР-пробе. Амплификацию проводили при температуре, подобранной в п. 3.1 с использованием методики «горячего старта».

Во всех случаях амплификация 10 пг специфической ДНК (а иногда и 1 пг) давала яркий сигнал, легко учитываемый при электрофоретическом методе детекции. Таким образом, чувствительность ПЦР составила 10 копий ДНК в ПЦР-пробе (рис.4).

12 345678 9 К- М

Рис.4. Оценка чувствительности выбранной системы амплификации

М- маркер молекулярных весов (100, 200, 300, 400, 500, 800 п.н.); 1- 105 геномов; 2 ,3 — 104 геномов; 4,5 - 103 геномов; 6,7 - 102 геномов; 8,9 - 10 геномов; К-отрицательный контроль ПЦР

Амплификация с ДНК свиньи, курицы, барана, сои и кукурузы, лосося, лошади давала отрицательные результаты (рис. 5).

М К+ К- Кв 1 2 3 4 5 6 7 8 9

М 10 И 12 13

ЮТТ^ <Ш ЩИШ

Рис.5. Оценка специфичности выбранной системы амплификации

К+ положительный контроль ПЦР; К- отрицательный контроль ПЦР; Кв -отрицательный контроль выделения; М - маркер молекулярных весов (100, 200, 300, 400, 500, 800 пл.); 1 - ДНК хорька; 2 - ДНК норки; 3 - ДНК свиньи; 4 - ДНК курицы; 5 - ДНК спермы лосося; 6- ДНК барана; 7- ДНК сои; 8 - ДНК кукурузы; 9 -ДНКлошади; 10 - ДНК из печени хорька; 11 -ДНК из мышц песца; 12 - ДНК крови песца; 13-ДНК куницы

Проведенные тесты показали высокую чувствительность и специфичность выбранных праймеров и условий амплификации.

3.5.Подбор методов выделения (очистки) ДНК.

Анализ веществ, входящих в состав кормовой муки, показывает, что такой корм прежде всего отличается от нативных продуктов очень низким содержанием влаги (до 10%). Содержание белков в мясной, мясокостной, рыбной муке колеблется от 40 до 62%, жиров - от 11 до 15% (за исключением нежирной рыбной муки, где содержится до 2% жиров). В гораздо более высокой концентрации находятся макроэлементы; № (0,7-1,2%), К (0,6-1,7%), Са (0,3-1,4%), Mg (0,1-0,5%) и витамины. Белково-витаминно-минеральных концентраты (БМВК) и комбикорма содержат протеинов 12-36%, жиров 2,3-6,9%. Подобный состав требует предъявления особых требований к методике выделения (очистки) ДНК из

муки, поскольку субстракты белковой природы являются основным ингибитором ПЦР. Кроме того, избыточный солевой состав пробы, наличие биологически-активных веществ, избыток жиров, так так же могут влиять на результаты ПЦР.

Классическим методом выделения ДНК из биологического материала является фенол-хлороформная экстракция с предварительной обработкой испытуемого материала протеиназой К (Маниатис и др., 1984). Эта методика, позволяющая получать высокоочищенную ДНК, трудоемка, к тому же включает стадии переноса материала из пробирки в пробирку, что значительно увеличивает риск контаминации от пробы к пробе.

Альтернативой классической методике является метод аффинной сорбции ДНК на силикагеле (Boom R. et al., 1990). В данном случае сорбент вносится в пробирку с лизированным материалом, ДНК связывается с сорбентом, затем отмывается от ингибиторов промывочными растворами и элюируется с сорбента ТЕ-буфером. Возможность выделения ДНК в одной пробирке препятствует перекрестной контаминации и упрощает процесс. По качеству выделения ДНК метод афинной сорбции не уступает классическому, поэтому в нашей работе использовали методику сорбции ДНК на силикагеле. Было решено предварительно обрабатывать пробу протеиназой К в экстрагирующем буфере с детергентом, а полученный лизат подвергать обработке лизирующим раствором.

Для выделения ДНК из разных видов кормов было подобрано соотношение пробы и лизирующего раствора в пропорции 1:10. Выбранная методика обработки исследуемого материала обеспечивает высокий выход высокоояшценной ДНК. Разработанный метод выделения ДНК позволяет обнаружить до 1 % примеси тканей пушных зверей во всех исследуемых видах материала (куриная, рыбная, мясная мука, премикс, фарш мясной, субпродукты) (рис.6).

К+ К- 1 2 3 4 5 6 7 Kb

mm mm m*>

Рис. 6. Выявление ДНК пушных зверей в разных видах кормов.

К+ положительный контроль ПЦР; К- отрицательный контроль ПЦР; Кв -отрицательный контроль выделения; 1. Куриная мука, контаминированная 1% тканей норки; 2. Фарш свиной, контаминированный 1% тканей хорька; 3. Мука рыбная, содержащая 5% тканей норки; 4. Субпродукты мягкие говяжьи, содержащие 5% тканей норки; 5. Сухой корм, содержащий 3% тканей хорька; 6. 100% комбикорм Эффекта Бекон («Суомен Реку» Финляндия); 7. 100% мука мясная свиная (SNP Lingen GmbH, Германия).

3.6. Подготовка внутреннего контрольного образца (ВКО).

Для исключения ложноотрицательных результатов связанных с ошибками исследователя при выделении ДНК или постановке ПЦР, использовался внутренний контрольный образец (ВКО). В качестве ВКО использовали ДНК фага лямбда. Для амплификации фага применяли праймеры и условия амплификации, предложенные фирмой Perkin Elmer Cetus (США) в наборе GeneAmp kit. В ходе работы было проверено отсутствие амплификации ДНК фага лямбда с праймерами на ДНК пушных зверей, а также определена концентрация ВКО, добавляемого в исследуемую пробу. Так как в процессе выделения ДНК ВКО разводится в 100 раз, то в качестве оптимальной концентрации выбрали 1 пг в ПЦР пробе или 100 фг/мкл. Подобранная концентрация ВКО позволяла выявлять ложноотрицательные результаты при выполнениии ПЦР-анализа.

3.7. Подготовка отрицательного и положительного контрольных образцов.

В связи с многоступенчатостью ПЦР-анализа необходимо контролировать каждую его стадию. Важной задачей является не только исключение ложноотрицательных, но и ложноположительных результатов. Для этого на этапе выделения ДНК использовали отрицательный

контрольный образец (ОКО), а на этапе амплификации отрицательный контроль ПЦР (К-).

ОКО служит для оценки возможной контаминации реактивов для выделения ДНК. В качестве материала для ОКО тест-системы была выбрана сыворотка лошадей. Препарат сыворотки лошади был тщательно протестирован с выбранными на ДНК пушных зверей праймерами. Результаты теста показали отсутствие перекрестных реакций.

В качестве материала для отрицательного контрольного образца тест-системы использовали стандартный ОКО (ЦНИИЭ).

Отрицательный контроль ПЦР представляет собой реакционную смесь, в которой присутствуют все компоненты (праймеры, нуклеотиды, Taq-полимераза), за исключением ДНК-пробы и служит для контроля амплификационных реактивов. В разработанной нами тест-системе в качестве «К-» использовали ТЕ-буфер для элюции ДНК с сорбента.

Контроль работы амплификационной смеси и работы приборов осуществляли с помощью положительных контрольных образцов (ПКО). ПКО представляет собой генноинженерную конструкцию, содержащую фрагмент ДНК норки. ПКО получен путем клонирования по свободным А -концам в вектор рвЕМ-Т участков специфической ДНК, полученных в ПЦР. Была подобрана оптимальная концентрация ПКО, в дальнейшем применяемая в качестве рабочей концентрации диагностического препарата ПКО, затем проверена работоспособность смеси компонентов ПКО и создан производственный регламент приготовления диагностического препарата.

Амплификат положительного контрольного образца является маркером длины ПЦР-продуктов для последующей электрофоретической детекции, т.е. позволяет контролировать последний этап ПЦР-анализа.

3.8. Состав разработанной тест-системы.

Разработанная тест-система включает в себя четыре комплекта реагентов.

Первый - набор для выделения ДНК из исследуемого материала представляющий собой сорбированную на силикагеле ДНК.

Второй - набор для амплификации выделенной ДНК, включающий смеси для амплификации ДНК пушных зверей и ВКО. Амплификация проводится с «горячим стартом».

Третий - набор для электрофоретической детекции ПЦР-продукта.

Четвертый - набор контрольных образцов, включающий в себя положительный контрольный образец (ПКО) ДНК норок, ВКО и отрицательный контрольный образец (ОКО).

Состав тест-системы и методика анализа описаны в инструкции по применению тест-системы «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей методом полимеразной цепной реакции.

3.9. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы.

Определение чувствительности разработанной тест-системы проводили с образцами тканей пушных зверей с концентрацией 1%, 2,5%, 5%, 10% и 25%, содержащихся в мясном фарше. В процессе выделения ДНК в каждую пробу добавляли ВКО. Амплификацию полученной ДНК проводили с праймерами «ПЗ-КОМ» и праймерами «ВКО».

ПЦР-анализ позволял надежно обнаруживать примесь тканей пушных зверей в количестве 1% и выше, что свидетельствует о высокой чувствительности разработанного теста (рис. 7).

Проведенный анализ также подтвердил высокую специфичность разработанного ПЦР-теста: неспецифических реакций с 100% рыбной мукой, куриным фаршем и кукурузной мукой, а также их смесями обнаружено не было.

Ml 2 3 4 56 7 8 Кв К- К+ М

Внутренний контроль

ДНК пушных зверей

■ И

Рис. 7. Оценка специфичности и чувствительности тест-системы

М - маркер молекулярных весов (300, 400, 500, 1500 п.н.); К+ положительный контроль ПЦР; К- отрицательный контроль ПЦР; Кв - отрицательный контроль выделения; 1. - 2,5% мяса норки в мясном фарше; 2.-1% мяса норки в мясном фарше; 3. - 5% мяса норки в мясном фарше; 4. -10% мяса норки в мясном фарше; 5. - 25% мяса норки в мясном фарше; б. - 100% мясной фарш; 7 - рыбная мука; 8 -свиная мука

3.10. Комиссионные испытания ПЦР-тест-системы «ПЗ-КОМ».

В период с 03.05.06 г. по 05.05.06 г. в соответствии с приказом Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор) № 53 от 20.03.06 г. были проведены комиссионные испытания тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей методом ПЦР (ФГУ «ВГНКИ», г. Москва).

Для комиссионных испытаний была сформирована стандартизованная панель включающая 13 шифрованных образцов (куриная и рыбная мука, куриный и свиной фарш в разных соотношениях с мясом норки и песца. Результаты комиссионных испытаний обобщены в Таблице 1.

Как видно из таблицы тест-система для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом ПЦР оказалась высоко специфичной и чувствительной, позволяя обнаруживать в кормах от 1 % ДНК пушных зверей.

Таблица 1.

Результаты проведения комиссионных испытаний тест-системы «ПЗ-КОМ».

№ п/п № Результат ПЦР (наличие ДНК

ши Исследуемый материал пушных зверей)

фра ожидаем ый полученны й

1 10 Куриный фарш - -

2 7 Премикс для пушных зверей - -

3 5 Рыбная мука - -

4 3 Мука куриная с добавлением свиной - -

5 9 1% мяса норки в фарше из свинины + +

6 1 2,5% мяса норки в фарше из свинины + +

7 2 5% мяса норки в фарше из свинины + +

8 11 10% мяса норки в фарше из свинины + +

9 13 25% мяса норки в фарше из свинины + +

10 8 Мясная мука, контаминированная мясом + +

норки

11 12 Фарш из мяса песцов + +

12 4 Фарш из мяса куниц + +

13 6 Фарш из мяса хорьков + +

Тест-система «ПЗ-КОМ» успешно прошла комиссионные испытания и зарегистрирована в Россиской Федерации (ПВР-1-6.6/01811 от 29.12.06).

3.11. Изучение активности и стабильности ПЦР-тест-системы в зависимости от срока хранения.

Ежемесячно в течение года тест-систему «ПЗ-КОМ» проверяли по параметрам установленным в ТУ 9388-152-00494189-06.

Все компоненты тест-системы сохраняли высокую активность и стабильность в течение всего срока хранения (12 месяцев) при температуре (2-8)°С.

3.12. Тестирование кормов, кормовых добавок и сырья для их производства на наличие ДНК пушных зверей методом ПЦР.

Согласно Распоряжению Россельхознадзора № 13-3-6/1825 от 24.09.2004 запрещается ввоз на территорию Российской Федерации кормов, кормовых добавок и сырья для их производства, предназначенных для пушного звероводства содержащих белки жвачных и плотоядных. С 2005 года введен государственный контроль ввозимой на территорию РФ продукции (кормов, кормовых добавок и сырья для их производства (включая рыбную муку), предназначенной для скармливания пушным зверям.

За период с 1 декабря 2005 г. по 20 мая 2010 г. было исследовано 596 проб рыбной муки, кормов и кормовых добавок (таблица 2 и рис. 8). ДНК пушных зверей была обнаружена и выявлена в 36 образцах (6,04 %).

Таблица 2.

Выявление ДНК пушных зверей в кормах методом ПЦР

Период Общее количество образцов Количество (процент) образцов, содержащих ДНК пушных зверей

2005 год 132 11(8,3%)

2006 год 118 9 (7,6%)

2007 год 98 6(6,1%)

2008 год 123 6 (4,87 %)

2009 г. 87 3 (3,44%)

май 2010 г. 38 1 (2,63%)

Итого 596 36 (6,04%)

При исследовании 242 проб мясо-костной и рыбной муки, образцов субпродуктов и мясного фарша, предназначенных для кормления пушных зверей, фальсификация тканями пушных зверей была выявлена в 25 образцах

мясного фарша, 9 образцах мясо-костной и рыбной муки и 2 образцах субпродуктов говяжьих. Из 345 образцов куриной муки, сухих кормов (комбикормов и премиксов) ДНК пушных зверей не была выявлена ни в одном из образцов.

Рис.8. Динамика выявления образцов, содержащих ДНК пушных зверей в период с 1 декабря 2005 года по 20 мая 2010 года.

»-132

AJ73

■-38-

»11 ■-НВ-9-— —~в-6—

2005 год 2006 год 2007 год 2008 год 2009 год 2010 год

Общее количество образцов

Количество

фальсифицированных

образцов

Внедрение в систему государственного контроля ПЦР-тест-системы «ПЗ-КОМ» с декабря 2005 года по 20 мая 2010 года позволило выявлять фальсификацию рыбной муки и кормов разных видов. За указанный период было отмечено снижение (с 8,3% до 2,63%) фальсифицированной продукции (рыбной муки и кормов), подлежащей государственому контролю. Таким образом, использование ПЦР-тест-системы «ПЗ-КОМ» объективно усиливает контроль за качеством и безопасностью продукции, что имеет важное зпизоотологическое и экономическое значение.

4. ВЫВОДЫ

1. На основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей гена митохондриального цитохрома В сконструированы оригинальные праймеры и оптимизированы параметры ПЦР для идентификации ДНК пушных зверей.

2. Предложен универсальный способ выделения высоочищенной ДНК пушных зверей из разных типов кормов с использованием протеиназной обработки и последующей афинной сорбции её на силикагеле в присутствии высокой концентрации солей гуанидина.

3. Разработан положительный контрольный образец ДНК, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов.

4. При определении аналитических характеристик разработанной тест-системы установлено, что «ПЗ-КОМ» обладает 100% специфичностью и имеет предел аналитической чувствительности 0,1% примеси тканей пушных зверей в исследуемом материале или 10 пг ДНК пушных зверей в пробе ПЦР.

5. Тест-система «ПЗ-КОМ» позволяет выявлять в течение 4 часов фальсификацию разных видов кормов и кормовых добавок тканями пушных зверей, что имеет важное эпизоотологическое значение.

6. Внедрение в систему государственного контроля ПЦР-тест-системы «ПЗ-КОМ» за период с декабря 2005 по май 2010 года позволило снизить количество фальсифицированной продукции с 8,3% до 2,63%.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана и внедрена в практику тест-система «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей методом ПЦР. Тест-система предназначена для выявления ДНК пушных зверей при осуществлении государственного контроля ввозимой на территорию Российской Федерации продукции (кормов, кормовых добавок и сырья для их производства

(включая рыбную и мясо-костную муку), предназначенной для скармливания пушным зверям.

Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация

1. Инструкция по применению тест-системы «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей методом полимеразной цепной реакции (утверждена Россельхознадзором 29.12.06).

2. Технические условия на тест-систему «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции (ТУ № 9388-152-00494189-06).

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Панина Е.А. Применение полимеразной цепной реакции для

выявления ДНК пушных зверей./Панина Е.А.,.Обухов И.Л. //Сборник научных трудов ВГНКИ.-М., 2007.-Т.68.-С.158-161.

2. Панина Е.А. Идентификация ДНК пушных зверей в кормах методом ПЦР./ Панина Е.А., Обухов И.Л. //Ветеринария.-М., 2008. № 4.-С.56-57.

3. Панина Е.А. Выявление ДНК пушных зверей в кормах методом ПЦР./ Панина Е.А., Обухов И.Л.//Материалы второго съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России»-Казань, 2009.-С.463-465.

4.Панина Е.А. Государственный контроль импортированных кормов на ДНК пушных зверей/.Панина Е.А, Обухов И.Л..//Ветеринарный врач.-2010. № 3.-С.8-10.

5. Панина Е.А. Проведение государственного контроля кормов на содржание ДНК пушных зверей./ Панина Е.А., Обухов И.Л.//Молекулярная диагностика. Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием под редакцией Покровского В.И.-М., 2010. Т.2.-С .162-164.

Отпечатано в ООО «Мещёра», М.О., г. Щёлково, ул. Свирская, 8а Тир. 100 экз., заказ № 461

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Панина, Екатерина Александровна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальностъпроблемы.1.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическое значение работы.

Апробация диссертации.

Объем и структура диссертации.

ЧАСТЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Проблема определения видовой принадлежности мясных ингридиентов.

1.1 .Прионные болезни.

1.2. Алеутская болезнь норок.

2. Методы определения видовой принад лежности мясных ингредиентов в кормах.

3. Принцип полимеразной цепной реакции.

4. Подбор праймеров.

4.1. Дизайн праймеров.

4.2. Температура отжига.

5. Факторы, влияющие на ПНР.

5.1. Температура и время денатурации.

5.2. Температура и время элонгации.

5.3. Реакционный буфер.

5.4. Количество циклов амплификации.

5.5. «Горячий старт» ПЦР.

5.6. Контаминация в ПЦР и предложения по обустройству ПЦР-лаборатории.

5.7. Ингибирование ПЦР.

5.8. Внутренний контрольный образец (ВКО).

ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК и компьютерные программы для обработки этих данных.

2. Образцы сравнения ДНК.

2.1. Коммерческие препараты ДНК.

2.2. Самостоятельно полученные образцы ДНК.

3. Образцы мясного фарша, куриной, рыбной и мясокостной муки.

4. Образец сыворотки лошадей.

5. Методика выделения ДНК из цельной крови по Maniatis.

5.1. Выборочный лизис эритроцитов.

5.2. Обработка лейкоцитарного осадка протеиназой К.

5.3. Экстракция ДНК фенол-хлороформом с последующей преципитацией этанолом.

6. Оценка концентрации ДНК спектрофотометрическим методом.

7. Методика выделения ДНК сорбцией на селикагеле по Boom.

8. Методика проведения реакции амплификации.

8.1. Состав реакционной смеси, условия алтлификации.

8.2. «Горячий старт».

9. Методика проведения электрофореза в агарозном геле.

10. Методика обработки посуды хромовой смесью.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Выбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации ДНК пушных зверей.

2. Изучение специфичности выбранных праймеров.

3. Подбор условий ПЦР.

3.1. Оптимизация температуры отжига праймеров.

3.2. Подбор концентрации праймеров.

3.3. Применение «горячего старта».

4. Определение чувствительности и специфичности выбранной системы амплификации.

5. Подбор методов выделения (очистки) ДНК из муки.

6. Внутренний контрольный образец (ВКО).

7. Отрицательные и положительные контрольные образцы.

8. Состав разработанной тест-системы.

9. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы.

10. Комиссионные испытания ПЦР-тест-системы «ПЗ

KOM».

11. Изучение активности и стабильности ПЦР-тест-системы в зависимости от срока хранения.

12. Тестирование кормов на содержание днк пушных зверей методом ПЦР.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка ПЦР тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей"

Актуальность проблемы

В последние годы были отмечены случаи поставок в Российскую Федерацию кормов, предназначенных для пушного звероводства, фальсифицированных, а также контаминированных тканями плотоядных животных. Использование такой продукции приносит большой экономический ущерб пушному звероводству из-за опасности распространения трансмиссивной энцефалопатии и алеутской болезни норок.

Алеутская болезнь норок (АБН) или вирусный' плазмоцитоз — высоко контагиозная болезнь норок и хорьков, возникающая вследствие персистентной вирусной инфекции. Она характеризуется медленным развитием инфекционного процесса и пожизненной виремией. В организме больных норок вирус находится в сыворотке крови, головном мозге, мезентериальных лимфатических узлах, почках, селезенке, печени, слюнных железах, кишечнике. Высокая восприимчивость животных к АБН, устойчивость возбудителя к внешним условиям, использование в качестве корма тушек забитых зверей и мясокостной муки из таких тушек (Самуйленко А.Я., 2002).обусловили широкое распространение инфекции во всех странах, где занимаются разведением норок.

Болезнь наносит огромный экономический ущерб зверосовхозам в связи с высокой смертностью (70-80%), ухудшением качества пушнины, снижением плодовитости самок и необходимостью проведения ограничительных и ветеринарно-санитарных мероприятий.

Значение мероприятий по выявлению фальсификации кормов для животных в последние годы также сильно возросло в связи с открытием новых видов прионных болезней сельскохозяйственных и домашних животных, относящихся к группе трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ГЭ). Особую опасность для пушного звероводства представляет трансмиссивная энцефалопатия норок (ТЭН).

Данное заболевание имеет длительный инкубационный период, сопровождается дистрофичными поражениями центральной нервной системы, развитием дегенеративного губкообразного состояния серого вещества головного мозга и 100%-ной летальностью. Возбудителем ТЭН, как и других трансмиссивных губкообразных энцефалопатий, является инфекционный прионный белок (РгР8с), представляющий собой конформационно измененную форму нормального прионного белка (РгРс). Известна лишь оральная передача инфекции. Основным источником заражения норок ТЭН являются корма, содержащие сырье от как больных ГЭ овец, коз, крупного рогатого скота, так и больных ГЭ пушных зверей.

Средства специфической профилактики данного заболевания не разработаны. Важнейшим мероприятием по предотвращению ТЭН, как и АБН, служит ветеринарно-санитарный контроль кормов, используемых в пушном звероводстве.

Существующие методы определения видовой принадлежности животных белков в составе корма, такие как иммунодиффузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, РИД и ИФА оказываются малоэффективными, т.к. корма проходят термическую обработку, ведущую к денатурации белков, следствием чего является потеря ими видовой специфичности. Наиболее перспективным методом для определения видовой принадлежности ингредиентов животного происхождения в составе кормов является метод ПЦР.

С 1996 г. во всех странах Европейского Союза (ЕС) ввели запрет на скармливание животным мясокостной муки, приготовленной из млекопитающих. Однако из-за незаконного сбыта мясокостной муки в страны, не являющиеся членами ЕС, и фальсификации рыбной муки добавками протеинов млекопитающих по экономическим причинам риск заражения достаточно велик (Butler D., 1998, Worswick R., 2001).

В целях недопущения поставок на территорию Российской Федерации подобной продукции, в соответствии с письмом от 24.09.2004 № 13-3-6/1825 заместителя главного государственного ветеринарного инспектора Российской Федерации, запрещен ввоз на территорию РФ кормов, кормовых добавок и сырья для их производства, предназначенных для пушного звероводства, содержащих ткани жвачных и плотоядных.

Учитывая отсутствие тест-систем, необходимых для мониторинга и контроля импортируемых кормов, предназначенных для пушного звероводства, разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в составе кормов для пушных зверей весьма актуальна. В отличие от белков ДНК более устойчива к термической обработке и не утрачивает своей информативной функции. Поэтому применение молекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПНР) является перспективным для определения видовой принадлежности ДНК в составе продуктов и кормов, подвергавшихся термической обработке.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - разработать тест-систему для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры и разработать оптимальные параметры ПЦР для идентификации ДНК пушных зверей в кормах.

2. Оценить эффективность различных способов выделения ДНК из мясных кормов, комбикормов, премиксов, сухих кормов (в т.ч. рыбной и мясной муки).

3. Провести оценку аналитических характеристик ПЦР-тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей при тестировании кормов, поступающих по импорту в Россию.

4. Провести комиссионные испытания разработанной тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом ПНР.

Научная новизна работы

Впервые сконструированы оригинальные олигонуклеотидные праймеры для амплификации специфических последовательностей ДНК пушных зверей в формате электрофоретической детекции.

Разработан положительный контрольный образец ДНК (ПКО), являющийся генно-инженерной конструкцией, несущей вставку фрагмента гена су!В. ПКО позволяет контролировать работу амплификационной смеси и является маркером длины ПЦР-продуктов.

Впервые в России разработана ПЦР тест-система для идентификации ДНК пушных зверей в кормах, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 0,1% примеси тканей пушных зверей в исследуемом материале или 10 пг ДНК пушных зверей в пробе.

Практическое значение работы

Разработана и впервые внедрена в ветеринарную практику тест-система «ПЗ-ком» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции. и

Внедрение в систему государственного контроля ПЦР-тест-системы «ПЗ-КОМ» с декабря 2005 года по 20 декабря 2009 года позволило выявлять фальсификацию рыбной муки и кормов тканями пушных зверей, что имеет важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение.

Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные нормативные документы:

Инструкция по применению тест-системы «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции;

Апробация диссертации

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 1 страницах компьютерного текста, и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего источника, в том числе — иностранных). Диссертация иллюстрирована - рисунками и - таблицами. Прилагаются разработанные нормативно-технические и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Панина, Екатерина Александровна

ВЫВОДЫ

5. Тест-система «ПЗ-КОМ» позволяет выявлять ДНК пушных зверей в продукции животного происхождения в течение 4 часов, что имеет важное эпизоотологическое значение.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Инструкция по применению тест-системы «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции (утверждена 29.12.06)

6. Заключение

В конце XX века в России кормление плотоядных пушных зверей было дорогим, так как использовали в основном дефицитные пищевые продукты при высоком уровне белка в рационе. В последние годы под; воздействием рыночных реформ структура рационов пушных зверей! значительно изменилась. Зверохозяйства перестали централизованно получать- по твердым ценам основные корма, витамины, и медикаменты. В связи со снижением доходов при сокращении . спроса на отечественные меховые изделия, хозяйства стали испытывать трудности: с деньгами на; покупку кормов, которые составляют около 70% от себестоимости пушнины. Качество5закупаемых мясных и рыбных кормов резко ухудшилось. При этом в рационе животных увеличилась доля сухих белковых кормов животного, растительного и микробиального происхождения. Наряду с опасностью использования- в качестве корма тушек забитых зверей., пораженных ТЭН и АБН, а также мясокостной муки из таких тушек, появилась опасность использования кормов, поступающих из-за рубежа, фальсифицированных, а также контаминированных тканями; плотоядных животных. Использование такой продукции может принести большой экономический ущерб пушному звероводству из-за опасности распространения ТЭН и АБН.

Анализ литературных данных о применении метода ГТЦР для выявления видовой принадлежности мясных ингридиентов в кормах показывает, что данный метод обладает рядом преимуществ по сравнению с существующими методами, такими как иммунодиффузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, РИД и ИФА, так как сочетает в себе быстроту и простоту исполнения, а также потенциально высокую специфичность и чувствительность при выявлении патогенных микроорганизмов.

Тест-система на основе метода ПЦР должна обладать высокоэффективным методом выделения ДНК, системой амплификации обеспечивающую максимальную чувствительность, с последующей детекцией ПЦР-продукта, и набором контрольных образцов, позволяющим осуществлять контроль качества проведения каждого теста. Вышеперечисленные соображения послужили основой проведения собственных исследований.

ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа была выполнена в отделе биотехнологии Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») Федеральной службы по в.

1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК и компьютерные программы для обработки этих данных

На первом этапе был проведен анализ литературы и баз данных нуклеотидных последовательностей NCBI (Национальный центр биотехнологической информации, США). Отобранные нуклеотидные последовательности были выровнены с помощью системы ClastalW Multi Sequence Alignment с целью их последующего анализа на вариабельность и поиска консервативных участков, необходимых для выбора праймеров.

Специфичность выбранных праймеров теоретически изучали с помощью компьютерных программы FASTA (Pearson W.G. 2000) и BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

2. Образцы сравнения ДНК

В работе использовали коммерческие и самостоятельно полученные референс-препараты ДНК.

2.1. Коммерческие препараты ДНК.

ДНК тимуса теленка "ICN", США, кат.№ 195129; ДНК спермы лосося "ICN", США, кат.№ 101501; ДНК эритроцитов цыпленка "Reanal", Венгрия, кат.№ D-28; ДНК фага лямбда «СибЭнзим», г. Новосибирск, кат.№ Dil. Лиофилизированные образцы ДНК разводили в ТЕ-буфере (трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид (трис-НС1) 10 мМ, динатриевая соль этилендиамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА) 1 мМ, рН=8,0) до концентрации 0,5 мг/мл.

2.2. Самостоятельно полученные образцы ДНК.

Образцы ДНК получали из мышц норок, песца, хорька, куницы, курицы, свиньи, барана, крови песца, печени норки, хорька. ДНК сои и кукурузы получали из образцов кукурузной и соевой муки. Пробы обрабатывали протеиназой К. Из полученного лизата при помощи фенол-хлороформной обработки экстрагировали ДНК и преципитировали ее этанолом (Маниатис и др., 1984). Осадок ДНК растворяли в ТЕ-буфере. Концентрацию полученного препарата ДНК оценивали спектрофотометрически (см. п. 7 настоящей главы).

Референс-препараты ДНК хранили в аликвотах при минус 70°С. Различные концентрации ДНК получали при помощи последовательных 10-ти кратных разведений в ТЕ-буфере.

3. Образцы мясного фарша, куриной, рыбной и мясокостной муки

Образцы отбирали по ГОСТ 13496.0 «Комбикорма, сырье. Методы отбора проб», ГОСТ 8756.0 «Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытаниям» и ГОСТ 2671 «Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов», соблюдая все меры предосторожности препятствующие контаминации. Каждый образец предварительно измельчали и далее растирали до гомогенного состояния в стерильной посуде в количестве 1-2 г. Измельченный образец аккуратно переносили в пробирки типа эппендорф. Всю посуду, контактировавшую с образцами обрабатывали хромпиком. Образцы хранили при температуре -20°С.

4. Образец сыворотки лошадей

Сыворотка лошадей неспецифическая, неконсервированная по ТУ10.19.85-89. Федеральное Государственное Унитарное предприятие «Курская биофабрика — фирма «БИОК». Сыворотку использовали в анализе без предварительной подготовки.

5. Выделение ДНК из цельной крови

5.1. Выборочный лизис эритроцитов.

Образец цельной крови, взятой с консервантом (ЭДТА в конечной концентрации 0,3%) смешивали с гемолизирующим буфером (Трис-НС1 10 мМ, NH4CI 155 мМ, ЭДТА 0,1 мМ, рН=7,4) в отношении 1:2 (1 мл крови и 2 мл гемолизирующего буфера), инкубировали на льду 15-30 мин и центрифугировали с охлаждением до 10 °С 10 мин при 300-400 g. Супернатант с гемолизированными эритроцитами удаляли, а лейкоцитарный осадок тщательно ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера - PB S (NaCl 137 мМ, КС1 2,7 мМ, Na2HP04 10 мМ, КН2Р04 2 мМ, рН=7,4). Суспензию лейкоцитов осаждали на центрифуге в прежнем режиме и удаляли супернатант. Промывку PB S повторяли до полного удаления остатков эритроцитов (присутствие эритроцитов оценивалось по наличию красноватого окрашивания осадка). Отмытый осадок лейкоцитов тщательно ресуспендировали в 0,1 мл PBS и хранили при 2 — 8 °С в течение недели.

5.2. Обработка лейкоцитарного осадка протеиназой К.

Полученную методом 5.1. суспензию лейкоцитов смешивали с 1 мл экстракционного буфера для протеиназы К (Трис-НС1 10 мМ, ЭДТА 10 мМ, додецилсульфат натрия (ДСН) 0,5 %, рН=7,4) и выдерживали 1 ч при 37 °С. Далее к раствору добавляли протеиназу К до конечной концентрации 0,6 мг/мл и инкубировали не менее 3-х часов при 55 °С. Полученный лизат лейкоцитов охлаждали до комнатной температуры сразу же подвергали фенольной экстрации.

5.3. Экстракция ДНК фенол-хлороформом с последующей преципитацией этанолом.

К охлажденному лизату добавляли равный объем уравновешенного Трис-HCl (рН=7,4) фенола и тщательно перемешивали содержимое пробирки переворачиванием. Пробирку центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин, при этом раствор разделялся на две фазы: верхнюю — водную, содержащую ДНК и нижнюю - фенольную, содержащую белки. Верхнюю фазу, не задевая границу раздела фаз, аккуратно отбирали и переносили в новую пробирку. Фенольную фазу и границу раздела отбрасывали. К водной фазе добавляли равный объем смеси фенол: хлороформ:изоамиловый' спирт (25:24:1), перемешивали содержимое, повторяли центрифугирование в прежнем режиме, водную фазу переносили в новую пробирку. К водной фазе (второго порядка) добавляли хлороформ с изоамиловым спиртом (24:1) и повторяли экстракцию.

Далее к пробе добавляли 0,1 объема 3 М ацетата натрия (до конечной концентрации 0,3 М) и 2,5 объема 96 % этанола, тщательно перемешивали и оставляли не менее, чем на 30 мин при минус 20 °С для образования преципитата. Преципитат осаждали, при 8000^ и 10 °С в течение 10 мин. Супернатант удаляли, не задевая; осадка. Осадок промывали 70% этанолом, осаждали в прежнем режиме и подсушивали его при комнатной температуру до удаления остатков этанола. Сухой осадок растворяли в 1 мл ТЕ-буфера.

5. Оценка концентрации''ДНК спектрофотометрическим методом

Метод основан на зависимости интенсивности поглощения света от концентрации (с) вещества в растворе. Логарифм: отношения интенсивности падающего (/0) и прошедшего (/) через поглощающий слои толщиной (с/) света называется оптической плотностью? данного раствора (ОО) (1). Коэффициент пропорциональности (в), зависящий от природы растворенного вещества называется молярным коэффициентом поглощения (экстинкции).

00 = \<£-"- = сс<1 (1)

Максимум поглощения нуклеиновых кислот приходится, на 260 нм и создается- суммой поглощений- каждого; из нуклеиновых оснований. Для больших молекул двухцепоченой ДНК установлен средний коэффициент экстинкции (2) позволяющий оценить концентрацию ДНК не прибегая- к вычислению суммы;экстинкций каждого из нуклеотидов. 50——— (2) мкгхсм

Соотношение (2) означает, что концентрация-раствора ДНК, имеющего при длине волны 260 нм оптическую плотность равную 1 составляет 50 мкг/мл. Пользуясь этим- соотношением рассчитывали концентрацию полученных препаратов ДНК.

7. Выделение ДНК сорбцией на силикагеле

Методика основана на лизисе исследуемого материала при помощи специального хаотропного агента (гуанидина тиоционата) и последующем связывании нуклеиновых кислот частицами силикагеля в присутствии этого агента.

Исследуемый материал обрабатывали лизирующим раствором (гуанидина тиоционат 5,2 М, Трис-НС1 10 мМ, ЭДТА 12,5 мМ, тритон Х-100 2%, рН=8,0). Соотношение исследуемого материала и лизирующего раствора подбиралось в работе. Добавляли 20 мкл ВКО, если его использовали в данном анализе. Пробу инкубировали при 65 °С в течение 5 мин. Не растворившийся материал осаждали при 8000-10000 g 5 мин, супернатант переносили в новую пробирку. К супернатанту добавляли 20 мкл тщательно ресуспендированного сорбента, хорошо перемешивали на вортексе, давали отстоятся в течение 2 минут, снова перемешивали и отстаивали еще 10—12 минут. Пробирки центрифугировали при 2000 g 1 мин, супернатант удаляли.

Осадок сорбента тщательно ресуспендировали (промывали) в растворе для отмывки 1 (гуанидина тиоцианат 4,0 М, трис-НС1 10 мМ, ЭДТА 12,5 мМ, тритон Х-100 0,5 %, рН=8,0), повторяли центрифугирование в прежнем режиме и удаляли супернатант. Далее осадок дважды промывали раствором для отмывки 2 (трис-НС1 10 мМ, ЭДТА 1 мМ, хлорид натрия 5 мМ, спирт этиловый 50 %, рН=8,0), каждый раз осаждая сорбент при 8000 g 1 мин. Осадок сорбента высушивали при 65 °С в течение 10 мин в твердотельном термостате, после чего элюировали ДНК с сорбента низкосолевым буфером (ТЕ-буфер). Для элюции осадок тщательно ресуспендировали в ТЕ, инкубировали при 65 °С в течение 5 мин, периодически встряхивая. Сорбент осаждали при 8000-10000 g в течение 1 мин. Супернатант содержал ДНК.

8. Проведение реакции амплификации

8.1. Состав реакционной смеси, условия амплификации.

Реакцию амплификации проводили в объеме 25 мкл в реакционном буфере следующего состава: 66мМ Тпз-НС1 рН 8,3, 16,7 мМ (КН4)2804, 0,05 мг/мл БСА, 0,01% Т\уееп-20, 8% глицерин, 3,5 мМ MgC12, 0,2 мМ сЮТРб, по 0,4 мкМ праймеров, 2,5 ед Тщ ДНК-полимеразы. В качестве матрицы (ДНК-пробы) брали 10 мкл препарата ДНК. Чтобы избежать испарения, реакционную смесь сверху накрывали каплей минерального масла. Собственно реакцию проводили в термоциклере (амплификаторе) «Терцик» (ДНК-технология, Россия) с применением функции активного точного регулирования температуры, по следующей программе: 95 °С - 2 мин, 1 цикл; 95 °С - 1 мин, 56°С - 1 мин, 72 °С - 1 мин, 42 цикла; 10°С - хранение.

Отптимальную концентрацию праймеров и их температуру отжига подбирали в ходе работы.

8.2. «Горячий старт».

В качестве модификации реакцию проводили с использованием «горячего старта», для чего реакционную смесь делили на две составляющих. Смесь, в которой находились праймеры и нуклеотиды, предварительно разливали на дно пробирок для амплификации, на смесь наслаивали 10 — 15 мкл расплавленного воска, так, чтобы он образовал пробку. Сверху восковой пробки разливали вторую реакционную смесь, минеральное масло и вносили ДНК-пробу. Пробирки с «собранной» по такой схеме реакционной смесью ставили в нагретый не менее чем до 80°С амплификатор. Для удобства работы с прибором использовали функцию «паузы».

9. Проведение электрофореза в агарозном геле

Детекцию продуктов реакции амплификации проводили при помощи электрофореза в агарозном геле. Навеску агарозы массой 1,7—1,8 г помещали в термостойкую колбу, заливали 100 мл трис-боратного буфера (трисоксиметил)-аминометан 4,5 мМ, борная кислота 4,5 мМ, ЭДТА 1 мМ, этидия бромид 1 мкг/мл), доводили до кипения, остужали до 65-70°С и заливали в форму, так чтобы толщина геля была 5-6 см. На одном из концов геля с помощью специального приспособления («гребенки») формировали лунки. Застывший гель помещали в камеру для горизонтального электрофореза, расположив лунки ближе к отрицательному электроду, камеру заливали трис-боратным буфером, так чтобы он покрывал гель на 4—5 мм сверху. На дно лунок вносили по 10 мкл амплификата, подключали камеру к источнику тока, соблюдая полярность и проводили электрофорез при напряжении равном 10 В/см не менее 20 мин. Результаты электрофореза визуализировали облучением геля ультрафиолетовым светом на трансиллюминаторе «Биоком» (Россия) и документировали при помощи компьютерной система гель-документирования «Infinity».

10. Обработка посуды хромовой смесью

Обработку посуды проводили согласно общепринятой методике. В фарфоровую чашку емкостью 300-500 мл помещали 5 г тонко измельченного в ступке К2Сг207 (или 6 г Na2Cr207-2H20), приливали 100 мл концентрированной H2S04 (технической) и осторожно нагревали на водяной бане до полного растворения двухромовокислого калия (натрия). Ступки и пестики и т.п. после обработки проб выдерживали в растворе дезинфицирующего средства, мыли обычным способом, а затем обрабатывали хромовой смесью, которую наливали в очищаемую посуду на 1/4 или 1/3 объема, осторожно смачивали все стенки. Затем смесь выливали в сосуд, в котором она хранится, при этом смачивали края обрабатываемой посуды. Когда смесь сливали, добавляли немного водопроводной воды. При этом происходило разогревание, что способствало полному разрушению загрязняющих веществ. Очищаемую посуду наполняли водопроводной водой, еще раз ополаскивали для удаления остатков хромовой смеси и тщательно мыли волосяным ершом. Промывали водопроводной водой 5-6 раз, затем ополаскивали дистиллированной водой и сушили. Лицо, руки, одежду защищали от попадания брызг.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Панина, Екатерина Александровна, Щелково

1. Геллер В.И., Семикрасова А.Н. Трансмиссивная энцефалопатия норок. Кролиководство и звероводство, 2002; N 5

2. Гусева Е.В., Сатина Т.А., Рыбаков С.С. Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (обзор литературы). Владимир, 1997.

3. Зуев В.А., Завалишин И.А., Ройхель В.М. Прионные болезни человека и животных. / Руководство для врачей. -М.: Медицина, 1999. 192 е.: ил.

4. Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н., Шипулин Г.А. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных. // Ветеринария. 2000. - № 3. - С. 25-28.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская миробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. вузов. СПб.: СпецЛит, 2002. — 591 е.: ил.

6. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: пер. с англ. / Под ред. С.Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир, 1999. - 558 е., ил.

7. Монкс О., Костелло А., Вивере Э., Авилов В.М., Рыбаков С.С. Контроль губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Ирландии. // Ветеринария. 1998. - № 1. - С. 16-22.

8. Всероссийской научно-практической конференции. Москва; 2000 г. — С. 326-328.

9. Устин А.В:, Макаров В:В;//С;-х. биол., 1994, 2: 20^25.

10. Хохрин С.Н. Корма и кормление животных: Учебное пособие. СПб.: Издательство "Лань", 2002. — 512 с.

11. Altschul S.F., Boguski M.S., Gish W., Wootton J.C. Issues, in searching molecular sequence databases. // Nature Genet. —1994: — V. 6. P. 119-1291 .

12. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool: II J, Mol. Biol: 1990. -V. 215.-P. 403-410.

13. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffcr A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 33893402. .

14. Barttlett S.E., Davidson W.S. FINS (forensically informative nucleotide sequencing): A procedure for identifying the animal origin fo biological speciements. // Biotechniques. 1992. - V. 12. - P. 408-411.

15. Bassam B.J., Caetano-Anolles G. Automated "hot start" PCR using mineral oil and paraffin wax. // Biotechniques. 1993. - V. 14(1). - P. 30-34.

16. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank: update. // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32(Database issue). - P. D23-D26.

17. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank. // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 23-27.

18. Berger R.G., Mageau R.P., Schwab B., Johnston R.W. Detection of poultry and pork in cooked and canned meat foods by enzime-linked immunosorbent assays. J.Assoc, of anal. chem. 1988 - V.71. - P. 406-409.

19. Bloom ME, Kanno H, Mori S, Wolfinbarger JB. Aleutian mink disease: puzzles and paradigms. Infect Agents Dis. 1994 Dec;3(6):279-301. Review.

20. Bloom ME, Kanno H, Mori S, Wolfinbarger JB. Aleutian mink disease: puzzles and paradigms. Infect Agents Dis. 1994 Dec;3(6):279-301. Review.

21. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M.E., Van Der Noordaa J. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. // Journal of Clinical Microbiology. 1990. - V. 28(3). - P. 495-503.

22. Bradley R. Animal prion diseases. In: Prion deseases (by ed. Collinge J., Palmer M.S.). Oxford University Press. - 1997.

23. Brownie J., Shawcross S., Theaker J., Whitcombe D., Ferrie R., Newton C., Little C. The elimination of primer dimer-accumulation in PCR. // Nucleic

24. Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3235-3241.

25. Bruce M.E., Will R.G., Ironside J.W et al. Transmissions to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. // Nature. 1997. - V. 389 (6650).-P. 498-501.

26. Budowle B., Chakraborty R., Giusti A.M., Eisenberg A.J., Allen R.C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. // Am. J. Hum. Genet. 1991. V. 48(1)-P. 137-144.

27. Buntjer J.B., Lenstra J.A., Haagsma N. Rapid species identification in meat using satellite DNA probes. // Z. Lebesm. Unters. Forseh. 1995. - V. 201. - P. 577-582.

28. Butler D. Brain mix-up leaves BSE research in turmoil. // Nature. — 1998. — V. 413.-P. 760.

29. Butler D. Doubts over ability to monitor risks of BSE spread to sheep. // Nature. 1998. - V. 395. - P. 6-7.

30. Chen H., Zhu G. Computer program for calculating the melting temptrature of degenerate oligonucleotides used in PCR or hybridization. // Biotechniques. -1997.-V. 22(6).-P. 1158-1160.

31. Chenna R, Sugawara H, Koike T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, Thompson JD. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. // Nucleic Acids Res. -2003. V. 31(13). -P. 3497-3500.

32. Chikuni K., Tabata T., Kosugiyama M., Monma M., Saito M. // Meat Sciense. -1994.-V. 37.-P. 337-345.

33. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extractoin. // Anal. Biochem. -1987.-V. 162.-P. 156-159.

34. Cimino C.D., Metchette K.C., Tessman J.W., Hearst J.E. Isaacs S.T. Post-PCR sterilisation: a method for the polymerase chain reaction. // Nucleic Acids Res. 1991. -V. 19(1). - P. 99-107.

35. Collinge J., Sidle K.C.L., Meads J.E.A. Molecular analysis of prion stain variation and the aetiology of new variant CJD. // Nature. — 1996. — Y. 383 (6602)-P. 685-690.

36. Compton T. Degenerate primers for DNA amplification. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.). New York: Academic Press.-1990.-P. 39-45.

37. Court of auditors. Special report No 14/2001 on BSE. // Official Journal of European communities. 20.11.2001 - C 324/1.

38. Coyne V.E., James M.D., Reid S.J., Rybicki E.P. (ed.). Molecular Biology Techniques Manual. — Departament of Molecular and Cell Biology, University of Cape Town. 2001.

39. Dang C., Jayasena S.D. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. // J.Mol.Biol. 1996. -V. 264(2).-P. 268-278.

40. D'Aquila R.T., Bechtel L.J., Videler J.A., Eron J.J., Gorczyca P, Kaplan J.C. Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. // Nucleic Acids Res. 1991.-V. 11;19(13).-P. 3749.

41. Deslys J.P., Comoy E., Hawkins S., Simon S., Schimmel H., Wells G., Grassi J., Moyagh J. Screening slaughtered cattle for BSE. // Nature. 2001. - V. 409. -P. 476-477.

42. Dielfenbach C.W., Lowe T.M.F., Dveksler G.S. General concepts for PCR primer desin. // PCR Methods Appl. 1993. - V. 3. - P. S30-S37.

43. Dupont M., Goldsborough A., Levayer T., Savare J., Rey J.M., Rossi J.F., Demaille J., Lavabre-Bertrand T. Multiplex fluorescent RT-PCR to quantity leukemic fusion transcripts. // Biotechniques. 2002. - V. 33(1). — P. 158-164.

44. Ebbehoj K.F., Thomsen P.D. Species differentiations of heated meat product by DNA hybridization. // Meat Sei. 1991. - V. 30. - P. 221-234.

45. Eggert A., Brodeur G.M., Ikegaki N. Relative quantitative RT-PCR protocol for TrkB expression in neuroblastoma using GAPD as an internal control. // Biotechniques. 2000. - V. 28(4). - P. 681-691.

46. Ehlen T., Dubeau L. Detection of ras point mutations by polymerase chain reaction using mutation-specific, inosine-containing oligonucleotide primers. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. -V. 160(2). -P.441-7.

47. Erlich H.A. (ed.) PCR technology. Stockton Press, New York. - 1989 - 254 P

48. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent advances in the polymerase chain reaction. // Science. 1991. -V. 252(5013). - P. 1643-1651.

49. Frankel G., Giron J.A., Valmassoi J., Schoolnik G.K. Multi-gene amplification: simultaneous detection of three virulence genes in diarrhoeal stool. // Mol. Microbiol. 1989. - V. 3(12). - P. 1729-34.

50. Fugate H.G., Penn S.R. Immunodiffusion technique for the identification of animal species. // J. Assoc. Off Anal. Chem. 1971. - V. 54(5). - P. 11521156.

51. Fuqua S.A.W., Fitzgerald S.D. and McGuire W.L. A simple polymerase chain reaction method for detection and cloning of low-abundance transcripts. // BioTechniques. 1990. - V. 9(2) - P. 206-211.

52. Gelfand D.H., White T.J. Thermostable DNA polymeases. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.) New York: Academic Press. - 1990.-P. 129-141.

53. Gordon D.F., Quick D.P., Erwin C.P., Donelson J.E., Maurer R.A. Nucleotide sequence of the bovine growth hormone chromosomal gene. // Mol. Cell Endocrinol. 1983. -V. 33(1). P. - 81-95. Review.

54. Gorelenkov V., Antipov A., Leinine S., Daraselia N., Yuryev A. Set of novel tools for PCR primer design. // Biotechniques. 2001. - V. 31(6). - P. 13261330.

55. Grennan B., O'Sullivan N.A., Fallon R., Carroll C., Smith T., Glennon M., Maher M. PCR-ELISAs for the detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in poultry samples. // Biotechniques. 2001. - V. 30(3). -P. 602-610.

56. Hayden A.R. // J. Food Sci. 1981. - V. 46. - P. 1810-1813.

57. Henegariu O., Neerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H. Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. // Biotechniques. 1997. -V. 23.-P. 504-511.

58. Hoffman K., Fischer K., Muller E., Kemper V. Experiments to demonstrate the effectiveness of heat treatments applied to canned meats and meat-ans-bone meals. // Fleischwirtschaft. 1996. - V. 76. - P. 920-923.

59. Kaboev O.K., Luchkina L.A., Tret'iakov A.N., Bahrmand A.R. PCR hot start using primers with the structure of molecular beacons (hairpin-like structure). // Nucleic Acids Research. 2000. - V. 28 (21). - P. 94-95.

60. Kaboev O.K., Shevelev I.V., Luchkina L.A., Tret'iakov A.N., Shcherbacova O.G. // Bioorg. Khim. 1999. - V. 25. - P. 398-400.

61. Kainz P., Schmiedlechner A., Strack H.B. Specifity-enhanced hot-start PCR: addition of double-strand DNA fragments adapted to the annealing temperature. // Biotechniques. 2000. - V. 28(2). - P. 278-282.

62. Kang'ethe D.K., Lindquist K.J., Gathuma J.M. In: Biochemical identification of meat species, (ed. Patterson R.L.S.). — NY: Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York.- 1985.-P. 129-144.

63. Karlin S., Altschul S.F. Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. - V. 90.-P. 5873-5877.

64. Kellogg D.E., Snisky J. J., Kwok S. Quantitation of HIV 1 proviral DNA ralative to cellular SNA by the polymerase chain reaction. // Anal.Biochem. 1990. -V. 189.-P. 202-208.

65. Kidd K.K., Ruano G. Optimizing PCR. In: PCR 2. A pracrical approach, (ed. Mcpherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R.). Oxford University Press. - 1995.

66. Kim S., Kim T. Selection of optimal internal controls for gene expression profiling of liver disease. // Biotechniques. 2003. - V. 35(3). - P. 456-460.

67. Kimberlin R.H., Wilesmith J.W. Bovine spongioform encephalopathy: epidemiology, low dose expose and risk. // Ann. N.Y. Acad. Sci. — 1994. — V. 724.-P. 210-220.

68. Knoth K., Roberts S., Poteet C., Tamkun M. Gugkt degenerate, inisine-containing primers specifically amplkfy rare cDNA using the polymerase chain reaction. // Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16. - P. 10932.

69. Krawetz S.A., Pon R.T., Dixon G.H. Increased efficiency of the Taq polymerase catalysed polymerase chain reaction. // Nucleic Acids Research. — 1989. 17(2)-P. 819.

70. Kuipler M., Sanches R., Gaken J.A., Bignon Y.-J. Cloning and characterization of retroviral plasmid; pCCl, for combination suicide gene therapy. // Biotechniques. 2000. - V. 28(3). - P. 572-576.

71. Kusama, T., Nomura, T. and Kodowaki, K.(2004). Development of Primers for Detection of Meat and Bone Meal in Ruminant Feed and Identification of the Animal of origin. J. ofFoodProt. 67 (6): 1289-1292.

72. Kwok S. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.). Academic Press, San Diego, California. - 1990. - P. 142-5

73. Kwok S., Higuchi R. Avoiding false positives with PCR. // Nature (London). -1989.-V. 339.-P. 237-238.

74. Lasmezas C.I., Deslys J.P., Demainay R. et al. BSE transmission to macaques. // Nature 1996. - V. 381. - P. 743-744.

75. Latora D., Hopkins D., Campbell K., Hurley J.M. Multiplex allele-specific PCR with optimized locked nucleic acid primers. // Biotechniques. 2003. - V. 34(6).-P. 1150-1158.

76. Lee M.S., Chang K.S., Cabanillas F., Freireich E.J., Trujillo J.M., Stass S.A. Detection of minimal residual cells carrying the t(14;18) by DNA sequence amplification. // Science. 1987. - V. 237(4811). - P. 175-8.

77. Loh E.Y., Elliot J.F., Cwirla S., Lanier L.L., Davis M.M. Polymerase chain reaction with single-sided specificity: analysis of T cell receptor delta chain. // Science. 1989. -V. 243(4888). - P. 217-20.

78. Lopez R., Robinson S., Kibria A., Harte N., Patel G., Harper R., Quevillon E., Silventoinen V., Kallio K., Jokinen P. The European Bioinformatics Institute web site: a new view. // Bioinformatics. 2003- V. 19(4). - P. 546-547.

79. MacCallum L.J. Detection of PCR amplified products In: PCR essential data (ed. Newton C.R.). Oxford: John Wiley & Sons Ltd. - 1995.

80. Maddison D.R., Swofford D.L., Maddison W.P. NEXUS: an axtendible file format for systematic information. // Syst. Boil. 1997. - V. 46. - P. 590-621.

81. Malo M.S., Abedrapo M., Chen A., Mozumder M., Pushpakaran P., Alkhoury F., Zhang W., Fleming E., Hodin R.A. Improved eukaryotic promoter-detection vector carrying two liciferase reporter genes. // Biotechniques. 2003. — V. 35(6).-P. 1150-1154.

82. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (ed.). Molecular cloning, a laboratory manual. — New York: Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor 1982.

83. Manos M.M., Ting Y., Wright D.K., Lewis A.J., Broker T.R., Wolinsky S.M. Molecular Diagnostics of Human Cancer. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. - 1989. - 7. - P. 209-14.

84. Manz J. // Fleischwirtsch 1985. - V. 65. - P. 497-499.

85. Marsh RF, Bessen RA, Lehmann S, Hartsough GR Epidemiological and experimental studies on a new incident of transmissible mink encephalopathy. (1991) J Gen Virol 72 ( Pt 3): 589-594

86. Matthews J.L.K., Chung M., Matyas J.R. Persistent DNA contamination in competitive RT-PCR using cRNA internal standards: identity, quantity and control. // Biotechniques. 2002. - V. 32(6). - P. 1412-1417.

87. McPherson M.J., Harnes B.D., Taylor G.R. (ed.) PCR 2. A Practical Approach. Oxford University Press. - 1995.

88. Meyer R.} Candrian U., Luthy J. Detection of pork in heated products by the polymerase chain reaction. // Journal of AOAC International. 1994. - V. 77. -P. 617-622.

89. Meyer R., Hofelein C., Luthy J., Candrian U. PCR-RFLP analysis: a simple method for species identification in food. // Journal of AOAC International. — 1995.-V. 78.-P. 1542-1551.

90. Milgrom F., Tuggac Z.M., Witebsky E. Studies on species specificity. // J. Immunol. 1964. - V. 93. - P. 902-909.

91. Miyazaki S., Sugawara H., Gojobori T., Tateno Y. DNA Data Bank of Japan (DDBJ) for genome scale research in life science. // Nucleic Acids Res. 2003. -V. 31.-P. 13-16.

92. Moretti T., Koons B., Budowle B. Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaq Gold DNA polymerase. // Biotechniques. -1998. -V. 25(4). -P.! 716-722.

93. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. // Methods Enzymology (ed. R. Wu). -1987. V. 155. - P. 335-50. Academic Press, London.

94. Nakamura Y., Carlson M., Kraspcho K., White R. Isolation and mapping of a polymorphic DNA sequence (pMCT118) on chromosome lp D1S80. // Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16(19) - P. 9364.

95. Newton C.R. (ed.). PCR essential data. Oxford: John Wiley & Sons Ltd. -1995.

96. Orian J.M., O'Mahoney J.V., Brandon M.R. Cloning and sequencing of the ovine growth hormone gene. // Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16(18). - P. 9046.

97. Orrego C. Organizing a laboratory for PCR work. In: PCR Protocols: a guide to methods and applications. Academic Press. 1990.

98. Oste C. Amplifications. 1989 - V. 1. - P. 10.

99. Pearson W. R. Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA // Methods in Enzymology. 1990. - V. 183. - P. 63-98.

100. Pearson W. R., Lipman D. J. Improved Tools for Biological Sequence Comparison. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1988. V. 85. - P. 2444- 2448.

101. Pearson W.R. Flexible sequence similarity searching with the FASTA3 program package. // Methods Mol Biol. 2000. - V. 132. - P. 185-219.

102. Polz M.F., Cavanaugh C.M. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 37243730.

103. Powel S.J. Protocol optimization and reaction specificity. In: PCR essential data (ed. Newton C.R.). Oxford: John Wiley & Sons Ltd. - 1995.

104. Prusiner S.B. Prions. In: Fields Virology, third edition. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia. - 1996. - P. 2901-2950.

105. Prusiner S.B. The prion diseases. // Brain Pathol. 1998. - V. 8. - P. 499513.

106. Rodriguez, M.A., Garcia, T., Gonzalez, I., Asensio, L., Hernandez, P.E. and Martin R. (2004). PCR identification of Beef, Sheep, Goat, and Pork in Raw and Heat- Treated Meat Mixtures. J. of Food Prot. 67(1): 172-177.

107. Rodríguez, M.A., García, T., González, I., Asensio, L. Hernández, P.E. and Martin, R. (2003). Species Identification by PCR. J. of the Sci. of Food and Agri. 83(11): 1176-1181.

108. Rosenstraus M., Wang Z., Ghang S.-Y., DeBonville D., Spadoro J.P. An Internal Control for Routine Diagnostic PCR: Design, Properties, and Effect on Clinical Perfomance. // Journal of Clinical Microbiology. 1998. - V. 36(1). -P. 191-197.

109. Rossen L., Norskov P., Holmstrom K. and Rasmussen O.F. 1992. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solution. // International Journal of Food Microbiology. 1992. - V. 7.-P. 37-45.

110. Ruano G., Brash D.E., Kidd K.K. PCR: the first few cycles. // Amplifications. 1991. - V. 7. - P. 1-4.

111. Ruano G., Pagliaro E.M., Schwartz T.R., Lamy K., Messina D., Gaensslen R.E., Lee H.C. // Biotechniques. 1992. - V. 13. - P. 266.

112. Rudi K., Treimo J., Moen B., Rud I., Vegarud G. Internal controls for normalizing DNA arrays. // Biotechniques. 2002. - V. 33(3). - P. 496-502.

113. Rybicki E. PCR Primer Design and Reaction optimisation. In: Molecular Biology Techniques Manual, (ed. Coyne V.E., James M.D., Reid S.J., Rybicki E.P.) Departament of Molecular and Cell Biology, University of Cape Town. -2001.

114. Rychlik W., Rhoads R.E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. //Nucleic Acids Res. 1989. -V. 17(21). - P. 8543-8551.

115. Rychlik W., Spencer W.J., Rhoads R.E. Optimization fo the annealing temperature for DNA ampification in vitro. // Nucleic Acids Research. 1990. -V. 18(21). - P. 6409-6412.

116. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymarase. // Sience. 1988. - V. 239. - P. 487-491.

117. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restiction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. // Sience. — 1985. -V. 230.-P. 1350-1354.

118. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989. -V. 86(16). - P. 6230-4.

119. Sardelli A.D. 1993. Amplifications. 9: 1

120. Sarkar G., Kapeiner S., Sommer S.S. Formamide can drastically increase the specificity of PCR. // Nucleic Acids Research. 1990. - V. 18(24). - P. 7465.

121. Schiermier Q. Testing times for BSE. // Nature. 2001. - V. 409. - P. 658659.

122. Shams L., Kanitani Y., Shimojo S. Likely size of the French BSE epidemic. // Nature. 2000. - V. 408. - P. 787-788.

123. Shibata D., Namiki T., Higuchi R. Identification of a mislabeled fixed specimen by DNA analysis. // Am. J. Surg. Pathol. 1990. - V. 14(11). - P. 1076-8.

124. Sims R.J. Ill, Liss A.S., Gottlieb P.D. Normalization of luciterase reporter assays under condition that alter internal controls. // Biotechniques. — 2003. — V. 34(5).-P. 938-940.

125. Sinclair A.J., Slattery W.J. Identification of meat according to species by isoelectric focusing. // Aust. Vet. J. 1982. - V. 58(2). - P. 79-80.

126. Smith K.T., Long C.M. Bowman B, Manos M.M. Using cosolventa to engence PCR amplification. // Amplifications 1990. - V. 9/90(5). - P 16-17.

127. Stoesser G., Baker W., van den Broek A., Garcia-Pastor M., Kanz C., Kulikova T., Leinonen R., Lin Q., Lombard V., Lopez R. et al. (2003) The EMBL nucleotide sequence database. // Nucleic Acids Res. 2003. — V. 31. — P. 17-22.

128. Thweatt R., Goldstein S., Reis R.J.S. A universal primer mixture for sequense determination at the 3'ends of cDNAs. // Analytical Biochemisty. -1990.-V. 190.-P. 314-316.

129. Unseld M., Beyermann B., Brandt P., Hiesel R. Identification fo the species origin fo highly processed meat product by mitochondrial DNA sequences. // PCR Methods and Applications. 1995. - V. 4. - P. 241-243.

130. Vize P.D., Wells J.R.E. Isolation and characterization of the porcine growth hormone gene. // Gene. 1987. V. 55(2-3). - P. 339-44.

131. Wang A.W., Doyle M.V., Mark D.F. Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989. - V. 86. - P. 9717-9721.

132. Weant R.S., Edmunds P., Swaninathan B. 1990. Effect of ionic and nonionic detergents on the Taq-polymerase. // Biotechniques. 1990. - V. 9. — P. 308309.

133. Weissensteiner T., Lanchbury J.S. Strategy for controlling preferential amplification and avoiding false negatives in PCR typing. // Biotechniques. — 1996.-V. 21(6).-P. 1102-1108.

134. Wells G.A., Scott A.C., Johnson C.T., Gunning R.F., Hancock R.D., Jeffrey M., Dawson M., Bradley R. A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle. // Veterinary Record. 1987. - V. 121. - P. 419-420.

135. Westbrook J., Feng Z., Chen L., Yang H., Berman H. M. The Protein Data Bank and structural genomics. // Nucleic Acids Research. 2003. - Vol. 31(1). -P. 489-491.

136. White T.J., Madej R., Persing D.H. The polymerase chain reaction: clinical applications. //Adv. Clin. Chem. 1992. -V. 29. - P. 161-196.

137. Wilesmith J.W., Hoinville I.J., Ryan J.B.M. et al. Bovine spongiform encephalopathy: aspects of the clinical picture and analyses of possible changes 1986-1990.//Vet. Record.-1992.-V. 130.-P. 197-201.

138. Will R.G., Ironside J.W., Zeidler M.A. et al. A new variant of CreutzfeldtJakob desease in the UK. // Lancet. 1996. V. 347. - P. 921-925.

139. Willhauck M., Vogel S., Keilholz U. Internal control for quality assurance of diagnostic RT-PCR. // Biotechniques. 1998. - V. 25(4). - P. 656-659.

140. Williamson A.L., Rybicki E. Detection of genital human papillomaviruses by polymerase chain reaction amplification with degenerate nested primers. // J. Med. Virol. 1991. -V. 33(3). - P. 165-171.

141. Worswick R. BSE record set straight. // Nature. 2001. - V. 414. - P. 249.

142. Wright D.K., Manos M.M. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J. J., White T.J.). Academic Press, San Diego, California. - 1990. - P. 356-367.

143. Wu D.Y., Ugozzoli L., Pal B.K., Qian J., Wallace R.B. The effect fo temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and eficiency of amplification by the polymerase chain reaction. // DNA and Cell biology — 1991.-V. 10(3).-P. 233-238.

144. Yamada M., Hudson S., Tournay O., Bittenbender S., Shane S.S., Lang B., Tsujimoto Y., Caton A.J., Rovera G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. -V. 86.-P. 5123.

145. Yap E.P.H., McGee J.O.D. Short PCR products yeilds improved by lower denaturation temperatures. // Nucleic Acids Research. 1991. - 19(7). - P. 1713.

146. Zhang J., Madden T.L. PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. // Genome Res. 1997. - V, 7.-P. 649-656.

147. Walker. J.A., Hughes, D.A., Anders, B.A., Shewale, J., Sinha, S.K., Batzer, M.A. (2003). Quantitative intra-short interspersed element PCR for species-specific DNA identification. Anal. Biochem. 316(2): 259-69.

148. Walker. J.A., Hughes, Hedges, D.J., Anders, D.A., Laborde, M.E., Shewale, B.A., Sinha, J. and Batzer, M.A. (2004). Quantitative PCR for DNA identification based on genome-specific interspersed repetitive elements. Genomics. (83): 518-527.

149. Wolf, C. and Luthy, J. (2002). Quantitative competitive PCR for quantification of porcine DNA. Meat Sci. 61(4): 367-373.

Информация о работе

Панина, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Щелково, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка ПЦР тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы