Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка промышленной биотехнологии получения природных интерферонов I и их типов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка промышленной биотехнологии получения природных интерферонов I и их типов"

УКРА1НСБКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНШЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГ 1Й

УДК 663.1.033:676.53.2:615.339.678.245 Думанський Валентин Дмитрович

Р03Р0БКА ПРОМИСЛОВО! БЮТЕХНОДОГ'И ОТРИМАННЯ ПРИРОДНИХ 1НТЕРФЕР0Н1В I ТА II ШИВ

(03.00.23 - б1отехнолог1я)

РГ6 -М

На правах рукопису

Автореферат

дисертацП на здобуття вченого ступеня кандидата техн!чних наук

Ки1в - 1994

ДисертацЮо е рукопис.

Робота виконана в 1нститут1 м!крсб1олог11 1 в1русологП 1м. Д. К. Заболотного АН Укра1ни, Державному Ун1верситет1 Харчових Технолог1й.

Науков! кер!вники: - Доктор техн!чних наук,

старший науковий сп1вроб1тник Циганков Серг1й Петрович Доктор б!олог1чних наук, професор, академ!к АТН Укра'!ни }Дшко Ярослав Григорович 0ф1ц1йн1 опоненти: - Доктор медичнх Наук,

Пров1дна орган!оац!я: Ладижинське виробниче

б1офармацевтичне об'еднання "Енаим"

ка зас!данн1 Спевдал^зовано! ради Д 01.15.01 при Укра!нському Державному Ун1верситет1 Харчових Технолог1й за адресою: 252017, Ки1в, вул. Володимирська, 68 (ауд. А-311) 3 дисертац1ею ыожна ознайомитися в б1бл1отец1 Укра1нського Державного Ун1верситету Харчових Технолог1й Автореферат роз1слано "26" т^се (¡иГ 1994 р.

старший науковий сп!вроб1тник Борисов Вадим Анатол1йович Кандидат техн!чних наук, доцент

Шчко В1ктор1я Борис1вна

1994 р. о годин 1

Вчений секретар Спец1ал1зовано"1 ради кандидат техн1чних наук _

0.¡.Семенова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОВОТИ

1.1. Актуадьн1сть проблеми

Одним is пр1оритетних 1 перспективних напрямк1в розвитку нау-;оемних виробництз б б1отехнолог!я. Л1дируюче положения на сьогод-[1шн1й день займае б1отехнолог!я м1кробного синтезу, що вторично >бумовлено тривал!стю вивчення та широким спектром використання акроорган1зм1в в р1зних галузях практично! д1яльност1 людини. Але ice зростаючий 1нтерес викликае б1отехнолог1я за участю КЛ1ТИН ■варин, як! внасл!док диференц!ювання для виконання специфШних >ункц1й можуть служити продуцентами ун1кальних л!карських препара-■1в. Так, 1мунокомпетектн1 клтини, будучи специф!чними для вико-[ання функщй захисту внутр!шнього середовшда орган1зму В1Д 1нфек-Цйних агент1в BipycHoí i бактергально! етюлогп, мають вдатн1сть :интезувати In vitro та In vivo 1нтерферони р1зних тип1в, hkí е [риродними хмуномодуляторами, що входять в ф1з!олог1Чну систему [еспециф!чного вахисту оргашзму.

1нтерферони (1ФН), в1дкрит1 в 1957 р., являють собою специ-ii4Hi низькомолекулярн1 б1лки молекулярною масою близью 20 кЛ, що [ають против!русну активн1сть, протипухлинний ефект, 1муномодулда-[1 i рад1опротективн! властивост!, п1двищують 1муноб1олог1чну ре-LKTHBHicTb орган!зму. 1ФН продукуються багатьма, мабуть вс!ма ви-аш хребетних. KpiM 1ФН людини докладно вивчен1 1ФН мишей, курей качок. 1ФН специф1чн1 до виду хазя'^на, причому основа ц1е! спе-1иф1чност1 е, напевно, специф1чн1сть поверхн! 1ФН з поверхневими «цепторами кл!тини. Зг1дно 1снуючо"1 класиф!кац11, природн1 1ФН ули розд!лен1 на два типи: до I типу в1дносять а - 1 в - 1ФН. oí -ФН синтезуеться п!д д!ею 1ндуктору 1нтерфероногенезу - Bipycy вороби Ньюкасла чи Bipycy Сендай. II тип представлений 1муннкм г 1ФН, який продукуеться в суспенз!ях 1мунокомпетентних кл1тин при

стимуляцП м1тогенами - конканаваШном А, 1ншими рослинними чи бактер1йними лектинами.

1.2. Мета 1 завдання досд!дження

Метою досл1дження е розробка промислово'! б!отехнолог11 отри-мання природних 1ФН I та IÍ типхв. Завдання досл!дження:

- здхйснити виб1р матер!ал1в i метод1в отримання 1ФН;

- розробити конструкц1ю б!ореактора 1 досл!дити його Пдроди-нам1чн! i MacooßMiiiHi характеристики, можлив1СТь зберекення вих1дно1 асептики;

- досл!дити 1шттездатн1сть i 1нтерферонсинтезуючу активн!сть кл!тин в розроблених системах б!осинтезу;

- визначити оптимальн1 умови 1нтерфероногенезу в розроблених системах б!осинтезу;

- розробити промислову технолог!» отримання 1ФН I та II тип1в для впровадження на прадприемствах медико-б!олог1чного про-ф1лю.

1.3. Наукова новизна результат!в досл!джень

Розроблен! системи культивування л!мфо!дних кл1тин, обгрунто-ван! ix конструктивн1 параметри /A.c. N 1773936/.

Вивчено вплив Г1др0динам1чних умов культивування на життед!-яльнЮть та 1нтерферонсинтезуючу активн1сть кл1тин - продуценив.

П1д1бран1 оптимальн1 умови праймування i б1осинтезу 1ФН з ви-користанням розроблених систем культивування.

Обгрунтован1 оптимальн1 технолог1чн1 параметри процесу отримання 1нтерферон1в lili тип1в /Позитивне р!шення N 94030717/. 1.4. Практична значим!сть роботи 1 реал1вац1я ревультат1в досл1джень

Результати проведених досл!джень були покладен! в основу роз-

робки технологи отримання 1ФН I та II тип!в.

Розроблен1 технолог!! пройшли лабораторн1 i промислов1 випро-бування. Технология отримання а - 1ФН впроваджена на Кременчуцько-му з-д1 "Б1офармсинтез" та Дн1пропетровському X®. Технолог 1я отримання г - 1ФН впроваджуеться на Ладижинському ПБЮ "Ензим".

Розроблен! i передан! на виробництво промисловий регламент по виробництву а - 1ФН свиней ! велико! рогато! худоби, лабораторний регламент по виробництву \ - 1ФН свиней ! велико! рогато! худоби, вих!дн! данн1 на проектування виробництва а - 1ФН, рекомендац1! по п!дготовц! прим!щень i обладнання для виробництва г - 1ФН.

1.5. Апробац!я роботи

Матер!али теоретичних ! експериментальних досл!джень, що ВВ1ЙШЛИ в дисертацш, а також промислових випробувань викладен1 на конкурс! роб!т секцП м1кроб!ологГ1 1нституту м1кроб!олог1! i в1-русологП 1м.Д.К.Заболотного (Ки!в, 1992); International Symposium Mixing in Chemical and Bioreactors (Riga, 1992); I установчому a'!3fli Укра!нського м!кроб1олог1чного товариства (Одеса, 1993).

1.6. Публ1кац11 результата досл!джень

За результатами дисертацП спубл1кавано 3 прац1, 1в них 1 ав-торське св!доцтво, 3 прац1 подан1 до друку.

1.7. Структура та об'ем роботи

Дисертац1йна робота викладена в 6 розд1лах та скдадаеться 18 вступу, огляду л!тератури, матер!ал1в та метод!в досмпджень, ре-зультат1в та !х обговорення, висновк1в та списку л1тератури (143 джерела, в т.ч. в1тчиэняних 79), додатку. Робота викладена на 122 стор1нках друкованого тексту 1 1люстрована 2 таблицями та 29 малютками. Додаток м!стлть копП документ!в, що п1дтверджують прак-тичне використання результатов прац!.

- 4 -BMICT РОБОТИ

Огляд л1тератури

В оглядi л1тератури розглянут! основн! способи орган!зац!1 б1осинтеэу кл!тин ссавц!в, ix ф1з1олог1чн! особливост! i пов'язан! 8 цим шляхи управл1ння нагромаджування к1нцевого продукту. Приведен! i проанал1зован1 р!зн! системи культивування опорнозалежних кл1тин. В зв'язку о неперспективною "1х промислового використання розглянут! системи суспенз!йного культивування, типи перем1шуван-ня, досягнення гомогенность ! газозабезпечення. Визначен! основн! обмеження при культивуванн! суспенз!йних кп!тин, переваги ! недо-л1ки р!вних культуральних систем, проведена !х класиф!кац!я.

Дано визначення 1ФН i 'ix визнана класиф!кац1я. Розглянут! способи отримання природних 1ФН, умови !нтерфероногенезу i вплив б1олог!чних ! ф!зико - х1м!чних умов на утворення 1нтерферону, ди-нам1ка синтезу « - 1 г - ИН.

Матерхали i методи досл!дження

Об'екти: об'ектами досл1дження е складов1 технолог!! отримання природних !нтерферон!в: б!отична - спленоцити тварин як кл!ти-ни-продуценти та аб1отична складова - системи культивування.

В1руси: хвороби Ньюкасла (ВХН, штам Н), везикулярнрого стоматиту (ВВС, штам 1вд1ана).

1ндуктори: для отримування npenapaTiB I типу (а - 1ФН) вико-ристовували ВХН в концентрац!ях 10-30 ТЦД so/мл; при синтез! 1ФН II Tiuiy (г - 1ФН) !ндуктором служили бактер!йн! лектини, отриман1 1з Bacillus subtilis 668 IMB в концентрата I 20 - 40 мкг/мл.

Ко1ндуктори: при отримуванн! препарат!в I типу використовува-ли препарат кам1зол Б-58 в концентрацП 2.0 - 5.0 мкг/мл (або бро-

м1д-2,3,6-тетраг!дро-6 фен1л-7 карбомо!лмет1л!м1дазо (2,1-В) т!а-аол1я виробництва ЮХ АН Укра!ни).

Культури кл!тин: первинн! - спленоцити свиней та велико! рогато! худоби (ВРХ);

вторинн!: СПЕВ, ПСП, ВДВК.

Поживи! середовища: середовище 199 "М", середовище 1гла, сольовий розчин Хенкса.

Антиб!отики: пен1цилл!н - 100 од/мл, стрептом!цин -'50 ыкг/мл.

Методи отримування препарат!в 1ФН: отримування препарат!в складалось з приготування гл1тип-продуцентов 1ФН - спленоцит!в тварин, як! отримували а селез!нок шляхом !х дезагрегацН, в!дд1-лення агрегат1в ! з'еднувально! тканини, гемол1за еритроцит!в 1 вилучення з суспенз!! спленоцит!в. Спленоцити в концентрацП 2-4 * 108 кл!тин/мл праймували шляхом внесения в кл!тинну суспенз!я 100 Од/мл гомолог!чного а - 1ФН, i експонували на протяз1 2-4 годин при отриманн! « - 1ФН. При отриманн! г - IffiH доза гомолог1ч-ного 1ФН для праймування становила 1000 Од/мл при експозицП 4 го-дини. Праймування проводили при температур! 37°С. Е!осинтез ICH -!нтерфероногенез проводили при щ!льност! к!тин 6 - 8 * 106 при от-римувапн1 а - 1ФН 1 5.0*10б - 2.5*107 при отримуванн! г -ICH. 1н-дукц!ю !нтерфероногенезу проводили в залежност! в!д типу отриыу-ванного препарату. Суспенз!йний б!осинтез 1ФН проводили в розрсб-лених системах культивування, при сп1вв1дношенн! робочого об'ему реактора до геометричного об'ему 7 : 10, темпеатур1 37 ± 0.5°С, поверхнево! аерацП 0.20 ± 0.05 л/л * хвилину 1 частот! коливань 1.5 - 2.0 Гц. Стац!онарнИй синтеэ проводили в традиц!йних уыовах, при сп!вв1дношенн! робочого об'ему до геометричного об'ему культу-рально! посудини 1:1, без аерацП та перем!шування при т1й ае температур!. Штерфероногенез ot - 1ФН тривав 18 - 24 години, г -

1ФН - 24-48 годин. Закдочними этапами, п!сля В1дд1лення спленоци-т1в 1з !нтерферонм1стко! р1дини, в технолог!! отримання препарат1в I типу е 1нактивац11 залишкового в!русного 1ндуктору. 1нактивац!ю проводили шляхом доведеня рН до значения 2.6, ! експонуванн! на протяз1 72 годин при температур! 4 - 6°С, та подалыио! нейтрал!за-цп рН !нтерферонм1стко! р1дини п!сля !нактивацП до рН 6.8 - 7.2. В технолог!'! отримання препарат1в II типу наведен! вище заключи! етапи в1дсутн1. Готовою формою 1ФН е препарат, отриманий п1сля стерши зуючо! фхльтрацП та фасовки р!дко! форми препарату. Визна-чення якост! 1ФН проводили по показникам: антив!русно! активность випробування на стерильн!сть, нешк!длив!сть та токсичн!сть.

Визначення антив!русно! активност1 1ФН: проводили м1кромето-дом проти 100 ТЦЦ50 ВВС на гомолог!чних кл!тинах (бгозэЬе^ е1 а1., 1984).

Обл!к жкттездатност1 кл!тин: визначали методом виключення барвника живими кл1тинами при забарвленн1 0,17. розчином трипаново-го синього в 1зотон1чному розчин! ЫаС1.

Випробування збереження асептики б!ореактор1в 1 вабезпечення стерильност1 э'еднувальними 1 пробов1дб1рними пристроями: проводили при використанн! поживного середовища наотупного складу (г/л): ГЛЮКОЗИ - 20.0; МН4С1 - 1.0; КН2Р04 О-б; МгБ04*7Н20 - О.б; СаС03 - 25.0 з внесениям пептона - 50.0 1 метилового оранжового - 20.0. 1нкубац!ю, з метою виявлення контам1нацП, проводили при 37°С про-тягом 16 д1б на середовищ! МПА.

Визначення г!дродинам1чних характеристик: в розроблених системах б1осинтезу проводили за !нтенсивн1стю перем1шування, вико-ристовуючи параметры характерних час!в гомогешзац!! (Карлаш та 1н., 1983).

Визначення масообм1нних характеристик: досл1джували динам1ч-

ним методом визначення об'емного коеф1ц!енту масопередач! в систем! пов1тря-вода в використанням полярограф!чного мембранного датчика розчиненого кисню (Перт, 1978).

Математична обробка: результата досл1джень обробляли методами статистично! обробки (Ашмарин та 1н., 1962; Саутин та 1н., 1991). Результати, що подан! граф!чно, оброблен! за допомогою програми вгарЬег верс!я 1.75. Функц!ональн1 залежност1 подан1 у вигляд1 експонент та за допомогою куб!чного згладжування.

Результати та 1х обговорення

Загальнов1домо, що процес б1осинтезу по складност! реал1за-цП, впливу на рентабельн1сть виробництва та як!сть отримуваних продукт!в е головним етапом б1отехнолог!чного виробництва. Кл1ти-ни-продуценти 1ФН - спленоцити е кл1тинами, що позбавлен1 кл!тин-но1 ст1нки 1 чутлив! до механ!чного впливу та деформац!й, виклика-емих р1диною при створенн1 гомогенних умов. Неможлив1сть використання типових б!ореактор1в, що пов'язано з ф1з1олог1чними особли-востями кл1тин тварин, викликала необх1дн1сть розробки специф1чних для спленоцитарних кл1тин систем бюсинтезу. В з'вязку з цим були розроблен1 б!ореактор-и з використанням низькочастотних коливань, в яких досягаеться задовШне збереження к!лькост1 життездатних кл1-тин при б1осинтез1 1ФН та п!двищуеться 1х 1нтреферонсинтезуюча ак-тивн!сть.

Перша конструкция являв собою в1брац1йний б!ореактор (Мал.1.), в якому введения низькочастотних коливань створюеться коливальними рухами контактних елемент!в. В1ореактор мае так1 характеристики: сп1вв1дношення робочого об'ему до геометричного 7:10, ампл1туда коливань а - 6-10 мм, частота Г - 0.1-5.0 Гц, ок-сигенац1я забезпечуеться поверхневою аерац!ею. Геометричний об'ем

Мал.1. Схема в1брац1иного б!ореактора

1 - б1ореактор; 2 - штуцер п!дводу аэруючого газу; 3 - ф1льтр стерил1зацП аэруючого газу; 4 - штуцер в1дводу в1дпрацьован-ного газу; 5 - ф!льтр стерил1зац11 видпрацьованного газу; 6 -штуцер завантаження; 7 - термостатуюча сорочка; 8 - пробов!д-б!рник; 9 - штуцер п1дводу термостатуючого агента; 10 - штуцер вивантаження; 11 - шток; 12 - контактн! елементи перем!-шуючого пристрою; 13 - штуцер в1дводу.термостатуючого агента; 14.- перфорован! кон1чн1 елементи; 15 - аеруючий диск; 16 -с1льфоные з'вднення.

б!ореактор!в становив 0.3; 0.5; 2.0 та 20.0 л. Реципрокн! перемЬ щення штоку а контактними елементами зд!йснюються у вигляд! трапе-цевидних коливань, при яких швидк1сть опускания штоку вища швид-кост! його повернення до початкового положения. 0соблив1стю конс-трукцП б1ореактора е те, що в ньому передбачено розд!лення куль-турального об'ему на дв! зони: зону культивування, в як1й проходить б!осинтез, 1 зону аерування, в котр!й при пост!йному обмШ безшйтинно! суспензП в1дбувавться насичення киснем завдяки робо-т1 аеруючого диска. Таке р!шення викликане результатами експери-ментальних доавджень масообм1нних характеристик б!ореактора, та з'ясуванням впливу аеруючого диска на життБздатн1сть кл!тин-проду-цент!в - 1ФН. Так, було встановлено, що при використанн1 для окси-генад!} одн1е'1 лише поверхнево! аерацП значения К1а незначн1, що пов'язано з обмеженням питомо! поверхн! контакту фаз, яка визнача-бться в1льною поверхньою р!дини в реактор1: В той же час, коли застосування аеруючого диска значно покращуе масообм1нн1 характеристики, спостер1гавться висока швидк!сть загибел! кл1тин, яка пе-ревищуе тотомпй показник при стац!онарному б!осинтез1. Влкорис-тання перфорованих В1дхиляючих елемент!в дозволяв запоб1гти транспорту кл1тин еластичними контактними елементами в аерац1йну зону та формуе циркуляцШшй пот1к р!дини, що м!стить кл!тини, який створюеться в прист!нп1й зон! ! направлений в нижню частину б!оре-актора. Для досягненнп ефекту "м'якого" перем!шування використову-вали еластичн! контактн1 елементи перем!нного перетину, сегменто-ван! на окрем! елементи. Внасл!док знакоперем!нного руху штоку контактн! елементи вигинаються 1з-за опору р!дини. Прор!зи Д пере-м!нний перетин 8меншують жорстк!сть елемент1в ! створюють додатко-в1 зони турбул!зац!"1 суспензП.

1ншою системою культивування, яка застосовувалась в техноло-

гП отримання природних !нтерферон1в е пульсац!йний бюреактор (Мал.2). Геометричний об'ем систем культивування цього типу скла-дав в1д 0.3; Б.О та 20.0 л. Коеф1ц1ент заповнення - 7. В ц1й систем! перемШування досягаеться створенням зворотньо-поступового руху взаемод1Ючих фаз, що забезпечуе низьку !нтенсивн1сть перем!-шування з частотою 0.5 - 3.0 Гц. Коливання р!дини досягаеться зас-тосуванням пульсащйного перем!шувального пристроя, який розд1ле-ний еластичною випуклога мембраною, що под!ляе його на камеру заповнення кл!тинною суспенз!ею, та камеру п1дводу стиснутого пов1т-ря. При подач! пневматичного Дмпульсу в камеру п!дводу стиснутого поз!тря в!дбуваБться деформац!я мембрани, 1 як насл!док цього зм1-юоеться об'ем кл1тинно! суспенз!! в сум!жн1й камер!, при цьому кл!тинна суспенз!я виштовхуеться з камери в б1ореактор, створюючи цим самим занурений пот1к, який направлений до поверхн1 суспенз!! та п!двищуе р!вень кл!тинно! суспенз!! в б!ореактор1. В !нтервалах м1ж !мпульсами, завдяки випукл1й форм!, мембрани, що позбавлена за-лишково! деформац!!, вадбуваеться заповнення камери перем!щуючого пристрою суспенз1ею кл!тин, яка надходить з б!ореактора. Шсля надходження наступного пневматичного !мпульсу в1дбуваеться повторив виштовхування суспенз!! в бюреактор. Таким чином при робот! б1ореактора досягаються суспенз!йн1 умови, при яких кл!тини-проду-центи знаходяться в монодисперсному стан! завдяки коливанням юп-тинно! суспенз!I та П циркуляцП в напрямку в!д нижньо! частини б1ореактора до поверхн! розпод!лу фаз газ-р1дина з седиментац1йною зоною в латеральн1й частин!, що створюе замкнутий контур перем!шу-вання. Цикл!чн!сть заповнення камери кл!тинною суспенз!ею та 31 вштовхування, цим самим 1нтенсивн1сть перем!шуючих коливань в б!-ореактор1, регулюеться частотою пневматичних !мпульс!в, що пода-ються до пульсац!йного пристрою. 0ксигенац1я реактора може забез-

Мал.2. Схема пульсац1йного б!ореактора

1 - б!ореактор; 2 - пульсад!йний перемешуючий пристр1й; 3 -сферична мемебрана; 4 - камера заповнення кл1тинно! суспен-811; 5 - камера подводу стиснутого пов!тря; б - 7 - ф1льтри стершпзацП аеруючого 1 в1дпрацьванного пов1тря; 8 - 9 -щтуцери завантаження - вивантаження кл1тинно! суспенэП.

печуватися як поверхневою аерац1ею, так 1 барботажом культуралыю'1 р1дини стерильним пов!трям, яке подаеться в бЮреактор ва допомо-гою мембранного пульсатора.

Для в'ясування потенц1алу систем культивування та визначення оптимальних режим1в IX експлуатацП буди проведен! досл!дження г!дродинам1чних параметр1в в!брац!йно1 та пульсацДйно! систем б!о-синтеэу на основ! пор!вняння характерних час!в гомоген!зац!1 - тп, м!кроперем1шування - тмп, крупномаштабного переносу - тКп. релак-сацП - тр и покаэника технодог!чно! ефективност! гомогенизацИ -ВТ) (мал.З та мал.4, в1дпов!дно). Виявлена характерна залежнЮть ус1х часових характеристик в!д частота коливань накладених на систему для в!брац!йного б1ореактора. Для пульсащйного б!ореактора притаманний б!льш вузький спектр часових характеристик, що пов'-язано в генерацию вихрьових поток1в р1дини, спектр яких зм!нюеть-ся в1д частоти коливань 1 викликае посилення м1кроперем1шування. Значения коефЩ!бнт1в вц вказують на стаб1льн!сть в д!алазон1 0.Б-1.Б Гц 1 незначне аб1льшення при 2.0 Гц для в!брац!йного б1о-реактора, а також екстремальний характер 8алежност1 в!д частоти в пульсац1йному б!ореактор1. Таким чином 8'ясовано, що ефективний режим експлуатацП в1брац1йного реактора досягаеться при Г -1.5-2.0 Гц, а пульсац!йного при Г - 2.0 Гц.

3 метою виявлення оптимальних умов 1нтерфероногенезу, з'ясо-вували вшив г!дродинам1чних умов на життездатн1сть спленоцитав свиней в суспенв!йному б!осинтез! при Г - 0.1; 1.Б; 2.0 Гц в в1б-рац1йному б1ореактор1 в пор1внянн1 в життездатн!стю кл1тин в ста-ц1онарних умовах (мал. Б).

Встановлено, що г1дродинам1чн1 умови, створюванн1 при вищез-гаданих частотах, еабезпечують б!льш високий процент життездатних ка!тин, н1х при стац!онарному культивуванн!.

200

150-

. 100

50

№

"0.'5 '1.0 '1.5 ' 2.0 2.'

гЮО

и 80 |

•60 £ О)

40

20 § »

:0

Частота, Гц

Мал.З. Г1дродинам1чн1 характеристики вгбращйного бЮреактора

50 40-1 о 30 ^ 20 10

'5 ' 1.0

100

м

й

80 о

60 | §

1-1

20 I

О о

<3

—г-----1-1-1

1.5 2.0 2.5

.0

о

Е-<

Частота, Гц

1Л. 4. Г1дродинам1чн1 характеристики пульсац1йного б!ореактора

00000 Час гомоге!!1зац11;

час м1кроперем1шування; 00000 час макроперем1шування; ^^ час релаксацП;

технолоНчна ефективШсть гомоген1зацП.

ю

Мал. Б. Вплив г1дродинам1чних умов на життеэдатн1сть спленоцит1в свиней при б!осинтеа1 а - 1ФН

пппп^ стац1онарн1 умови б1осинтезу; ищу б1осинтез при частот! коливань 1.Б Гц; ниш б!осинтез при частот! коливань 2.0 Гц; б1осинте8 при частот1 коливань 0.1 Гц.

Р18ьке вниження життездатних кл!тин на протяв1 перших трьох годин при суспенз!йному б!осинтеэ! 1 6 годин в стац1онарних умовах пояснюеться адге81ею 1муноцит!в, як! м!стяться в кл1тинн!й суспен-вП 1 мають максимальну адгезивну эдатн1сть.

Досл!дження ефективност! використання в!брац1йного б1ореакто-ра в технолоПях отримання природних 1ФН оц1иовали по активном! отримуемих препарат!в а - та * - 1ФН свиней (мал. 6 та мал. 7,

в!дпов1дно).

Так ак?ивн!сть а - та г - 1ФН, отриманих при застосуванн! в!Срац!йного С1ореактора, перевищуе аналог1чний показник в препаратах, отримуемих при традиЩйному способ! б!осинтезу, в три рази.

На основ! результата досл!джень була зроблена спроба, вико-

Мал. 6. Продукц1я л - 1ФН свиней при суспенв!йному та стац!онарному б1осинтез!

Мал. 7. Продукц1я V - 1ФН свиней при суспензШюму та стац1онарному б1осинтез1

Ж Ни даЖ ппррИ

ристовуючи метод парно! кореляцП, виявити основн! розб1жност! м1ж стац1онарним 1 суспенз1йним б1осинтезом 1ФН (Табл.1).

Таблиця 1.

Показники б1олог1чних та ф!эико-х1м!чних коеф!ц!ент1в парно! кореляцП суспенз!йного 1 стац!онарного б!осинтезу а - 1ФН

Суспенз1йн! умови б1осинтезу

{?ху антив!русно! активност! 1ФН ! вм1стом живих кл!тин -0,084

Иху споживанням глюкози 1 вм1стом живих кл!тин 0,792

!?Ху показником еИ ! вм!стом живих кл!тин 0,709

> Стац1онарн! умови б!осинтезу

йху антив1русно1 активност! 1ФН ! вм!стом живих кл1тин -0,957

ИХу споживанням глюкози ! вм!стом живих кл!тин 0,791

Р?Ху показником еЬ ! вм!стом живих кл!тин 0,917

Rxv показник!в суспенз1йного 1 стац1онарного б1осинтезу

1?ху антив1русно1 активност! 1ФН 0,996

Г?Ху погодинного приросту активност! 1ФН 0,253

1?Ху споживанням глюкози 0,936

Кху погодинного в!дмирання кл1тин 0,269

Результата математичого анал!зу вказують на високу ступ1нь кореляцП процес!в б1осинтезу 1ФН в стащонарних 1 суспенз!йних умовах. В той же час ИХу град]ситу погодинного приросту антив!рус-но! активност! 1ФН в стац!онарних ! суспенз!йних умовах, як 1 за град1ентом швидкост! в!дмирання гл1ткн спостер1гаеться в!дсутн!сть кореляцП. Це вказуе на те, що, очевидно, процеси утворення 1ФН в суспенз1йних умовах за своею !нтенсивн!стю в!др!зняються в1д ста-ц1онарних. Очевидно, що подальше досл1дження цих процес!в дозволить розкрити причини виявленого феномена.

Наступи! досл!ження були пов'язан1 з встановленням оптималь-них умов отримання г - 1ФН. В зв'язку з тим, що г - 1ФН мае б!льш

ефективну л1кувальну 1 прсф!лактичну д1ю (перевищуючу в десятки раз!в ефективн1сть « - 1ФН) а його виробництво не пов'язане з ви-користанням в1русного !ндуктора, що ускладнюв та удорожчув виробництво, ця технолог1я е б1льш перспективною. В той же час !нтерфе-роногенез препарат1в II типу мае б!льш тривалий пер!од (24-72 год) н!ж при отриманн! препарат!в I типу (18-24 год). Тому, з метою п!двищення р!вня збереження асептики процесу використовували пульсации! б!ореактори, що на в!дм!ну в!д в!брац!йних не мають кр!з-нього вводу перем1шуючого пристрою, який в загрозою 1нфекЩювання.

Результати досл!джень по визначеиню оптимально! щ1льн!сть кл!тин-продуцент!в та впливу дози 1ндуктора !нтерфероногенеза на активн1сть отримуемих препарат!в г - 1ФН в пульсац!йному б!ореак-тор! приведен! в таблиц! 2.

Таблиця 2

Вплив щ1льност! спленоцит!в та дози бактер!йних лектин!в на ефективн!сть б!осинтезу т - 1ФН свиней в суспенз!йних ! стац!онарних умовах

Доза лектин!в, мкг/мл Щ!льн!сть кл!тин, кл/мл Середн!й титр, Од/мл

СУСПЕН31ЙН1 УМОВИ БЮСИНТЕЗУ

б 5.0 л 10® - 1.0 * 107 2.5 * 107 - 5.0 * 107 640.0 - 1024.0 1100.8 - 1280.0

10 5.0 * 10® - 1.0 * 107 2.5 * 107 - 5.0 * ГО7 1433.6 - 1843.2 1945.6 - 2048.0

20 5.0 * 10® - 1.0 * 107 2.5 * 107 - 5.0 * 107 1536.0 - 1996.8 2150.4 - 2150.4

40 5.0 * 10® - 1.0 * 107 2.5 * 107.- 5.0 * 107 1484.8 - 1945.6 2150.4 - 2150.0

СТАЦЮНАРН1 УМОВИ БЮСИНТЕЗУ

5.0 * 10® - 1.0 * 107 2.5 * 107 - 5.0 * 107 384.0 - 1365.0 1536;0 - 744.0.

При визначенн1 впливу тривалост! прайм!нгу на ефективн!сть 1нтерфероногенеза було встановлено, що експонування на протяз! 4 годин е оптимальним. Максимальну ативн1сть г - 1ФН було досягнуто при доз1 « - 1ФН для праймингу 1000 Од/мл.

3 наведених матер!ал!в видно, що при культивуваннх кл!тинно1 суспензП спленоцит!в свиней в суспенз!йних умовах в запропонова-ному б!ореактор1 у вс1х випадках мае м1сце найб1льш високий вих1д к1нцевого продукту г - 1ФН при б1лып низьких щ1льностях кл1-тин-продуцент!в - 5.0*10б - 2.Б*107 кл1тин/мл. При цьому також до-сягаеться 1стотна економ!^ лектину - його треба використовувати лише 10-20 мкг/мл кл!тинно! суспензП, а не 40 - як при стац1онар-ному б!осинтез1.

Таким чином, виготовлення г - 1ФН свиней та ВРХ за допомогою запропонованих б1ореактор1в дае оптимальний вих!д к1нцевого продукту, при пор!вняно низьких пЦльностях суспенз1й кл1тин-продуцен-т1в та низьких концентрац1ях лектин1в як 1ндуктор1в г - 1нтерфе-роногенезу. Це дае можлив!сть значно економити вих!дну сировин^ для отримання кл1тин-продуцент1в та бактер1йн1 лектини.

При подальшому досл!дженн1 суспенз1йного б1осинтезу а - та г - 1ФН в розроблених б!ореакторах вдалося досягти не т1льки п!дви-щення активност1 отримуемих препарат1в, а й пол1пшення економ1чних та технолог1чних показник1в. Було встановлено, що розроблен1 б!о-реактори дозволяють проводити б1осинтез 1ФН в безсироватков1й се-редовин1. Необх1дн1с1ть коштовно! сироватки ВРХ в поживному сере-довищ! при 1нтерфероногенез1 пов'язана з потребою СЦльш повного забезпечення кл1тин-продуцент1в в поживних компонентах, та змен-шенн! травмування кл!тин завдяки п1двищенню в'язкост! р!дкого се-редовища. Але наявн1сть 152 б1лк1в, як! входять в склад сироватки ВРХ, ' значно п1двищуе соб1варт!сть препарат1в. Поряд з цим спосте-

р!гався негативний вплив на тривал!сть заключних операц1й - стери-л!зуючу ф1льтрац1ю, та необх1дн1сть попереднього видалення клЬ тин-продуцент1в з штерферонскладово"! рхдини п1сля б!осинтезу шляхом низькошвидк1сного центрифугування. Використання безсироватко-во1 середовини дае можлив1сть уникнути стад1ю центрифугування та значно зменшити тривал1сть стерши зуючо! ф1льтрац11. При цьому зниження активност! отримуемих 1нтерферон1в I та II тип1в не спос-тер1гали.

Використання багато! поживно! середовини, температурний режим, та варт1сть збитк1в при контам1нацП б1осинте8у 1ФН вимагають особливо! уваги до асептики технолог 1чного процесу. Найб!лыпа в!-рог!дн!сть контам!нац!! пов'язана з порушенням герметичност! оди-ничних культуральних об*ем!в при внесен! реагент1в, в!дбору проб, переходом в1д одн!е! апаратурно - технолог 1чно1 стадП вирбництва до !нио!. Тому нами були розроблен! пристро!, використання яких дозволяв забезпечити вих1дну стерильн!сть при з'еднанн! стерильних об'ект!в, взятт! проб ! внесешго агент!в при б!осинтез! 1ФН.

Таким чином, результатом проведених досл!джень е розробка промислових технолоПй отримання природних 1ФН I та II типу.

Принципова апаратурна схема отримання 1ФН приведена на мал. 8.

Технолог!чн1 та апаратурн! схеми отримання « - та г - 1ФН наведен! в додатку.

отпгяш хтмнтгоддант 1*1

1-1

ПИЙИШГ ТА Б10СИИПЗ ГЯГО-ИН 3,

ПГЯМШГ ТЯ В10СШШ ЙЛЬЗД-МН

» --

в

1.10

1 / с

1.13. у с:

\ / 1.14 ^^

З.Ц|М

иддшш шмтгодоцшп) м стегишзуюм «мыглцм

О-»3-2

газлив

ЛЛЪМ-Ш 1М ШЯХ1ЩЯ|1В

пил-ми нл

ГОЭЛ1В

Э.1 1

Мал. 8 Принципова схема огримання а - та г - 1ФН

1.термос; 6.центрифуга;

2.гомоген1затор; 7.б1ореактор V-

3.ф1льтрувапьна л1йка; в.бшреактор V-

4.емн1сть 9.ф1лътрац1йна

5.центрифужн1 стакани; установка;

1.0 вода; 1.13 гомолог1чний

1.10 середовище 109 1.14 1ндуктор;

1.11 розчин НН4С1; 1.15 1зотон1чний

1.12 в!дходи ИаС!1; сировили;

--— головний пот1к; —

10. л!н1я розливу.

2.0 л; |----------

20.0 л; робота в зон!

| лам1нарного потоку | пов1тря

1ФН; 1.16 сироватка ВРХ;

3.0 стиснуте пов!тря;

3.1 стерильне пов!тря;

3.2 в1дпрацьоване ПОВ!трЯ;

----повтори! операцП.

- 21 -висновки

1. Створенн1 б!ореактори в10рац1йного 1 пульсац!йного типу для вир1шення задач1 отримання природних 1ФН. Обгрунтован! '1х конструктивн! параметри.

2. Встановлено, що ефективний режим експлуатацП, забезпечую-чий необх1дний р1вень г!дродинам1чних 1 масообм!нних характеристик для культивування 1мунокомпетентних кл!тин-продуцент1в 1ФН значо-диться в д!апазон! 1.5 - 2.0 Гц для в1брац!йного б1ореактора 1 2.0 Гц для пульсац!йного С1ореактора.

3. Встановлено, що умови праймування при отримуванн! « - 1ФН складагать 2 год при доз1 1ФН 100 Од/мл 1 щ1льност! кл!тин-продуцент 1в 2 - 4*108/мл, 1 4 год при доз! 1000 Од/мл ! аналог!чн!й щ!льност1 кл!тин при отримуванн! т -1ФН забезпечують ефективний синтез 1ФН.

4. Суспенз1йн! умови створюваем! в пульсаЩйному б1ореактор1 дозволяють вдв!ч! знизити концентрац1ю !ндуктору г - !нтерфероно-генезу - бактер!йного лектину Вас. БиЬйШэ 668 1МВ, пор!вняно з традиц!йним б1осинтезом, з 40 до 20 мкг/мл.

5.. Залропонований метод отримання кл!тин-продуцент!в 1ФН дозволяв в!дмовитися в!д використання. на стад!1 б!осинтезу 1ФН сиро-ватки ВРХ, що знижуе соб!варт!сть отримуваемих препарат!в та ско-рочуе тривал!сть ф!н!шно! стад!! - стершйзугачо! фыьтрацП !нтер-феронскладово! р!дини.

6. Б!осинтез 1ФН в розроблених б1ореакторах в1брац1йного ! пульсац!йноштипу при частот! 1.5 - 2.0 Гц, коеф!ц1ент! заповнення 7, поверхнев!й аерац11 0.20 ± 0.05 л/л*хв ! щ!льпост! кл!тин 2.5*10® - 5.0*107/мл при отримуванн! г - 1ФН ! 6.0 - 8.0*107/мл при отримуванн! а - 1ФН забезпечуе тпдвищення приросту антив!рус-

но! активист! в пор1внянн1 в препаратами, отриыуваемими традиц!й-ним методом.

7. Асептичн! з'еднання, розроблен! в процес! роботи, дозволя-ють вабеапечити асептику процес!в отримувапня 1Ф11.

8. Роэроблен1 технолог!!, передан! на ряд п1дприемств Укра1ни для впровадження в виробництво, забезпечують зб1лыпення отримання к!нцевого продукту - 1ФН не менше як вдв1ч1.

По тем1 дисертацП опубл1кован1 сл1дуюч! роботи:

1. А.с. 1773936 СССР МКИ4 С 12 М 1/04. Аппарат для культивирования микроорганизмов или клеток/ В.Д.Думанский, В.Н.Поводзинс-кий, Ю.В.Карлаш Я.Г.Кишко и др. - Опубл. 07.11.92, Бюл. N 41.

2. Karlach Y., Povodzinski V., Dumanski V., Biotechnology of the suspension cultivation of cells sensitive to mechanical effects// Abstracts, International Symposium "Mixing in Chemical and Bioreactors", Riga 1992, p.15

3. Карпов А.В., Иваненко В.К., Кишко Я.Г. Думанский В.Д. Получение и очистка свиного гамма - интерферона//Вопр. вирусологии -1093. - 38, N 2. - С. 78 - 81.

4. Думанский В.Д., Карлаш Ю.В, Поводзинский В.Н..Иваненко В.К. Культивирование клеток и асептика в биотехнологии получения естественных интерферонов//1 Установчий з'1зд Укр.м!кробаол. т-ва (Одеса, вересень 1993 р.): Тез. докл.- Микробиол. журн. - 1994. -74, N 4.

5. Иваненко В.К., Коваленко Е.А., Думанский В.Д., Кишко Я.Г. 1иунотропн1 властивост1 бактер1йних лектин1в//1 Установчий з'1зд Укр.м1кроб1ол. т-ва (Одеса, вересень 1993 р.): Тез. докл.- Микробиол. журн. - 1994. - 74, N 4.

6. Думанский В.Д., Цыганков С.П., Кишко Я.Г. и др. Влияние гидродинамических условий на интерферонсинтзируюшую активность спленоцитов свиней при получении альфа - интерферона//Микробиол. журн. - 1994. - в печати.

7. Позитивне р1шення Держпатенту Укра1ни (в1д 10.03.1994 р.) N 94030717. К1шко Я.Г., 1ваненко В.К., Думанський В.Д. та 1нщ. Спос1б виготовлення гама - ан1маферон1в та- пристр!й для його зд!йснення.