Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка препаративного метода выделения цитохрома Р-450 из алканокисляющих дрожжей Candida Maltosa

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка препаративного метода выделения цитохрома Р-450 из алканокисляющих дрожжей Candida Maltosa"

Научно-исследовательский проектно-кснструкторский институт прикладной биохимии

На правах рукописи

, ПЕРСИЯНОВЛ ТАТЬЯНА БОРИСОВНА ' "

РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТИВНОГО МЕТОДА ЩДЕЯЕШЯ ЩЕГОХРСМА Р-450 КЗ АЛШ10ККСЛЯХВД1Х ДРОНЕЯ CANDIDA И ALTOS А

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте биосинтеза белковых веществ.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Нина Борисовна Градова; кандидат биологических наук Евгений Рубенович Давидов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Александр- Борисович Капитанов; доктор биологических наук, профессор Вячеслав Михайлович Девиченский.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской Академы наук.

Защита состоится MAS- 1994 Гч

в № часов на заседании Спениалдзировахщого совета Д ,098.09.01 в Научно- исследовательском црооктно-конструкторском институте прикладной биохдаии. по адресу: 125299, г. Москва, улица Кл.ары- Цет>км», д. 4-/6ч

С диссертацией momio ознакомиться в библиотеке Научно- исследовательского проектно- конструкторского института прикладной биохимии.

Автореферат разослан J/UbfirtTUZ^ ¡994 г.

Ученый сенранаръ специализированного совета, кандидат биологических наук

И.И.ГУСЕВА

Актуальность работа.

Монооксигзнаэи занимают ключевую позицию в метаболических процессах аэробных микроорганизмов, способных деградировать 51 утилизировать а качестве субстрата соединения. которие представляют собой продукты метаболизма животных, растений и микроорганизмов. Это преэде всего метан, али^-зтическио, алициклические, ароматические гетероциклические углеводорода. Данная способность аэробных микроорганизмов определяет их огромнуп экологическую роль. Основным компонентом монооксигеназной системы, локализованной в эвдоплвзмвтичесхом ротикулуме клеток. является гемсодержагшй белок цитохром Р-450. Большинство исследование, сконцентрировано на изучено; цитохромов Р-450 разлгпшх оргзнов млекопитающих, и недостаточно изучена цитохромы Р-450 шкроорганизмов. Однако, к настоящему моменту проведенные исследования показали возможность широкого практического применения фермента.

Клетки бактерий, в частности БаЫог&Иа 1урЫтг1т, или дрожжей, содержащие цитохром Р-450, могут быть использовали в экспресс-анализах образцов почв, воздуха к продуктов питания на содержание • в них потенциально мутагенных и канцерогенных соединений.

Другой потенциалъной областью применения цитохромзд Р-450 является его использование для' синтеза химических соединений, в основном лекарственных препаратов. Обычно для этих целей используются, иммобилизованные комплексы цитохрома Р-450' и НДДФ!Ь зависимой Р-450 редуктазы в присутствии НАДФН.

Аналитическое использование цитохромов Р-450 в биохимическом мониторинге является -новой областью применения, в частности определение в. стоках хлорсодеркащнх пестицидов, хлороформа и ряда других потенциально опасных для животных и . человека компонентов, ,' загрязняющих окружащую среду.

Перспективное терапевтическое применешю .цитохрома Р-420 может быть в области дотоксикации кокных покровов.

Широкая'субстратная специфичность цитохрома Р-450 оказалась уникальным явлением. В ' биохимии ферментов исследования в этом . направлении привели к открытию множественности форм цитохрома Р-450.

Несмотря на успехи в изучении физико-химических свойств

множественных ферм цитохрома Р-450 из тканей кивотных и из микроорганизмов, все они были получены только в" лабораторных условиях, к производство яткх препаратов не реализовано.. Игроков использование цитохрома Р-450 сдерживается из-за отсутствия технологии получения индивидуальных его форм.

Ранее в лаборатория биохимии ГосНШсинтезбелок были проведены работы по выделению, очистке'и характеристике множественных ф:)рм цитохрома Р-450 алканокисляхшх дрохкой Candida maltosa штате« ВСЗ-779. Сложность аппаратурного оформления разработанной схегды ъздедения фермента Р-450, предполагающей использование ■ на многих стадиях ультрацентрифугирования, и многостадкйность процесса, приводящая к дополнительным потерям фэрглента, явились , причиной разработки новых технологических процессов получения препаратов цитохрома Р-450 высокой степени чистота и направленных на повышение выхода целевого продукта.

Цель» настоящего исследования являлась разработка более эффективного технологического способа получения высокоочиценного препарата цитохрома Р-450 из биомассы алканокислякщих дроякей,-

Задачи исследования:

- разработка и определение оптимальных условий , применения легкомасштабируемых методов (микро- -и. Ульграфильграция, метод многофазных полимерных систем) первых стадий очистки цитохрома Р-450. Подбор селективных условий проведения хроматографической очлетхи для получения препарата с высоким выходом и высокой удэлъной активностью. Исследование некоторых физико-химических, иммунных свойств форм цитохрома Р-450;

- разработка схемы выделения цитохрома Р-450 в комплексе с другими гидрофобными ферментами (алкогольсксидаза высоих , спиртов, КШЕН-зависимая Р-450' редуктаза, цнтохром bg). Изучение иекоторах физико-химических свойств этих- ферментов;

- получение препаратов водорастворимых белков (каталаза, супероксидаксмутазэ) с использованием метода разделения в многофазных системах.

Научная новизна:

Впервые на основании использования методов фракционирования тешерок к многофазных полимерных систем, позволивших достигнуть селективного перераспределения ферментов, получош высокоочяшеюшв ;зреайрата гкдрофойных белков, . участвующих в процессе окисления су Острота: двух форт/ цитохрома Р-450, алкогавьоксидазв выезих

спиртов, ЩДФН-зависимой Р-450 редуктазы, цитохрома Предлоазна принципиальна« • схема разделения всдорастЕоримых формантов (супероксиддисмутаза, каталаза), основанная на сочетании тех жэ методов.

Показано существование в клетках дрожкей Candida valiosa, по-крайнеЯ мере, двух форм цитохрома Р-450, и изучень их некоторое физихо-химическио и иммунные свойства. Исследованы свойства алкогольоксидазы высших спиртов, а также выявлены возможности фактического применения фермента.

Практическая значимость работы:

Разработанная схема я лабораторнкй регламент выделения цитохрома Р-450 позволяет провести последующее промышленное масштабирование процесса выделения и очистки цитохрома ?-450 к других компонентов системы. Реиение вопроса комплексного выделения водорастворимых и мебраносзлзанных белков, прямо и косвенно 'связзшшх с окислением гидрофобного субстрата, позволит значительно повысить экономическую эффективность производства цитохрома'Р-450.

Апробация работа: материалы работы долохеш и обсувдены в завершенном. виде на расяиренном заседании кзфздрч "Промыплешая биотехнология" РХТУ им. Д.И.Менделеева 17 ноября 1993 г.

Публикации : по материалам диссертации получена разрешения на выдачу 3 патентов РФ и опубликовано 7 тезисов докладов на Всесоюзных и Международных конференциях.

О^ъем и структура работы: диссертация ,состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, ьызодсз. Работа изложена на 106 страницах, машинописного текста и иллюстрирована 27 таблиц-ми и 41 рисунком. Библиография включает 207. названия расот, из них 190 на иностранных языках.

ЭКСПЕгаМЕНТЛЛЬНАЯ ЧАСТЬ .

Материалы и методы. В работе использован штамм Candida maltosa В СБ 779 из музея ГосНиисинтез белок. Культивирование проводили- r¡o методу (Соколов D.M., 1987). 3 работе использовались дезинтегратор ЛИ (СССР), центрифуга. К-70 (ГДР), центрифуга "Bectam" (США), оборудование дпя хроматографкчсского разделения фирмы "Pharmacia" (Швеция). Определение содержания л активности ферментов проводили на спектрофотометре "Specord М-40" (ГДР): цитохрома Р-450 по

методу (Ошига Т., Sato Я., 1964), цитохрома по методу (Ozols J. 1974), НАДФН-зависшлой Р-450 редуктази по методу ('¿asters В.S.S., I9GV), каталазы по методу (Juck Н., 1963). Активность алкогольоксвдазн высишс спиртов измеряли по методу (Ильченко 1983), супероксиддасмутазы по методу (Beaushamp С.Т., 1974). Белок определяли методом (Lowry О.Н., 1951) и модифицированным методом с осалсденкем ТХУ (Albertsson А.Р:, 1975). Электрофорез в ПЛАТ производили по методу (Laeinrali .U.K.,- 1970). Спектральные характеристики ферментов изучались с использованием спектрофотометра "Sfrlmadzu 300" (Япония). Константы связывания СО с цитохромом Р-450 определяли методом импульсного фотолиза (Давыдов P.M., 1980). Исследования методом ВЭЖХ 'проводили на системе фирмы "Waters". Иммунологические свойства цитохрсма P-4S0 исследовели методом Western блоттинга (Kargsl Е., 1989). К-терминальная аминокислотная последовательность определена (Schunck Vi.-Н., 1989). Математическую обработку результатов проводили методом стандартных квадратичных отклонений.

Оснорнкв результаты работы g gx обсуждение. .

Аналитический метод выделения цитохрома Р-450, предпалагадаиЗ двухстадийяое осазвдекие шкросом, солюбилизацию кгпфосомальрой фракции, двухстадийяое фракционирование сульфатом ащэяда с использованием на Есех .стадиях метода ультрацентрифугированвд, позволяет получить препарат цитохрома Р-450 .со степень» очистная 2-2,5 раза (удельное содержание 0,8-1,2 нМ/мг белка). Прецарэт данной чистоты наносился на колонку o-Sepharose СЬ-4§ (гидрофобная хроматография).

Задача, которую мы ставили перед собой на первых этапах работы,-заключалась р получении препарата цитохрома Р-450 е применением эффективных технологичных методов, ' которые бу обеспечивали максимальное отделения сопутствующих ' гидрофобных бедаео? # позволяли достичь наибольшей степени очистки ферм&шд ще Ц& лервых. стадиях выделения без использования вцсокоскороеткото центрифугирования. - .

Нами была исследована возможность использования двух уетодов 1) мс-тод глшфйфааьхрании; 2) меход многофазного разделения э ецстемв згдесеть-жидкость с использованием полимеров (ПЭГ-даксФран-фосол).

0-..'.счт.г цитэхрэма Р-450 с использс.за/шед' методов юпфофильтрацик. .

Для выдь.чения цитохрома. Р-450 из гомогепата биомассы дрояжс-Л была исследована возможность использования метода микрофильтргшии. Изученц условия солюбилкзации' к фильтрации, обеспечиваксио его .максимальней еылод. \

Гомогэкат, полученный на-первой стадии обкей схем:, содерхсл в своем;составе фракцию мхкросомальных мембран с локализовавшим в шЬс ферментом андоплазматического ретикулума клетки - цитохромсм Р-450. Солюбилиззция'цитохрома Р-450 Оыла проведена по методу, описанному (№1зесяап А., 1382). ■

Далее фильтрацию проводили либо под - давлением на плоских кптроцеллэтлозкпх мембранах с размером пор 1000000 Да, либо чере~ кассетные - полисуЛЬфошше ■ мембраны кшз "РППсогГ фирмы ")Я1"11роге" с-размерами , лор 0,2 мкм и поверхностью 0,42 м".

-. Исследовано влияние таких параметров как температура, рН сред; на процесс фильтрации цитохрома Р-450.

. • Полученные даяние показали,- что температура (0-15°) и рН среда (6,8-7,6} в 'Изучаемых нами пределах практически не оказывают влияния па уровень сол>эбилкзз'лии и фильтрации цитохрома Р-450. 'Фильтрация белков солтобилизирсванной суспензии мембран была -затруднена, и в фильтрат переходило только 5-6£ форманта при пятикратней прок&вке'. ретентата ' буфером. Следовательно, причина •имитирования фильтрации через мембрану могла быть связана с не солюбилизирсвашшмк компонентами.

3 результате сшжения концентрации белка от 15 мг/мл до 5 мг/мл при той же концентрации детергента, предполагающего -увелкчетм глуб^аш содаобилизаакк,. 'и кизкоскоростаого центрифугирования . (120002-20 мин) материала перед фильтрацией наблюдал!; поа^низ вцхода цитохрома ; Р-450 в пермеато до 605, а при увеличено; количества -прошвок буфером - до 80-853. Удельная, активность 'порученного препарата цитохрома Р-450 1.,4-Г,6 нМ/мг белка. . Результаты представлены в- таблице I.,

• Таким образом, показана' ' принципиальная во2мо:с--.кть яря выделении цитохрома Р-450 аамеш стадий ультрацектрифугкровакня кз микрофильтрацию. Недостатком этого- способа выделения является большой расход, -буферных растворов, .содержащих значительнее количества детергентов и глицерина.

На следуете:/ этапе ■ проврделннх исследовягагй нами бил а изучена вопмокность применения другого технологичного метода при выделении ■ цитохрома Р-450, а именно, метода многофазных полимерных систем.

Таблица I.

влияние предварительного низкоскоростного центрифугирования и концентрации белка в рет-ентате на процесс фильтрации Р-450 пт:п использовании! установки "М1111роге" - ■ с кассетными тангенциальными мембранами с размером пор 0,2 мкм

Стадия ьцделэния Л опыта Содержание Р-450 (Ш) Удельное содержание Р-450 (нМ/мг бежа) Выход Р-450 {%)

С-олюСилизат 375003 1 2 3 3860 4950 8400 0,29 о!зо 0,31 100 100 100 '

Фильтрат солабшкэата через мембрану с размером пор 0,2 мкм 1 2 з' • 735. 2690 - 3750 ' 0,65 1,40. ■ 1,41-' 19 ; 63 56

Примечание: I - солюбилизация Б?500в при концентрации .белка• 14^15-мг/мл; предварительное центрифугирование перед фильтрацией 12000»15 мин. ^

2;3 - солзобилизация Б7500г при концентраций белка 4-& Кг/мл; м . предварительное центркфугафрвани© перед фильтрацией

Как показали проведенные эксперимента, ресход файбвЫх систем сокращался, если в качестве исходного -материала- применяли не грубнй клеточный экстракт, а Р-450-содержшцую шхросомалъную Срака-:».

Получение микросоиальной Фракции методом ©еаздвния ПЭГ' ШХ) в

иояаш Са2+.

Известно, что . цятохром- Р-450! локализован . в. мембранах зздолдазматического ретикулума. Следователько;..первый эт.ан очистки, цктсхрома Р-450 включает выделение мембран эндоплазмаияёского" ретикулума микросомальной фракции.

В лабораториях исследованиях для получения Р-450-содэржащих мшсросом обычно ■ используют ' методу ■ ДОК®ренциального ¡-ан^рмфугированил с уснорежш 100-160. тыс.^. Метода . трудоемки и нило2^-эк'.г;глнк. ....-",...'•'' - -

исследована возможность использовании Для ', выделения, 1,г/.кр:'СС;мзльноа - фракции, • сохраняюще* • внеоку» актигность

а

содержащихся в них ферментов, низкоскоростного центрифугирования при введении ингредиентов, вызывающих агрегацию мембран (ионы (Xappell 0., 1982). ПЭГ 6000 (Sadler АЛ'., 1935)). 3 результате оптимизации условий процесса, было определено, что осаздениа микросомальпой^рнкции было более полным при использовании 5 мМ калий-фосфатного буфера. рН 7,6 при введении 18 мМ Са2+. При применении агрегирующего ингредиента ПЭГ БООО отмечено, что процесс протекает более глубоко в 100 Ш калий-фосфатном буф-зро, рН 7,0, и добавлении ПЭГ 6000 до конечной концентрации 6%.

При сравнение трех методов (таблица 2)., которые могут быть применимы на этапе выделения микросомалыюй фракции можно считать, что . методы. в которых применяется кизкоскоросткои центрифугирование, конкурентноспособнк я, вместе с тем, обладают большим технологическим преимуществом при проведении препаративного выделения ферментов.

••..'-■■'■ Таблице 2.

Содержание ферментов в микросомальной фракции при различных методах, выдел'эния. .

Ферменты Р-450 ■ Ь5 А ОХ BSD

Метод выделения МШфОСОМ ВЫХОД (56)- Удельн. содержание (нЫ/мг) Выход <*) Удельн. содержание (НМ/МГ) Выход Удельн. активность (Е/мг) Выход (*>, Удельн. активность (Е/МГ)

Осаждение микроссм 105000g 94 : 0,52 S5 0,51 ' 95 0,88 96 0,32

Осаждение микросом Са2+ 93 0,43 96 0,52 ' 95 0,87 96 0,32

Осаждение 97 0.51 93 0,54 98 . 0,99 93 .0,37

Вчлзленка цитохроиэ Р-450 при поноси распределения в многофазных системах. Анализ литературных данных работ Альбертсона показал, что для выделения гидрофобных белков может быть использован оригинальный метод распределения в многофазных полимерных системах.

Сетгаоте исследователи (Xarenlampl S.O., 1986) использовали этот

i:=,roд выделения с ексэккм выходом фракции, обогащенной цктохромом Р-450, при обработке грубого , клеточного, экстракта* САтябидазированного 1% тритоном х-100, в многофазной . полимерной системе (ПЭГ 6000-Декстран 500-Фккол 4С0>. В- основе-фасонирования в многофазных- ■ системах лажи? . избирательное распределение макромолекул между • разами за счет различий . в гидрофобных свойствах, которые определяют степень • гйтрсфобюго , ¡гссимодеЕетвия белков с детергентом тритоном .Х-100,- используемым -солюбилкзачих мембранных белков.,С одной стороны, .тритон Х-100 сбрпоуе? 'с-щеллы с цитохромом Р-450 и другими 'гидрофобшш ' белками. С другой стороны, детергент содержит ;в. своей структур®-"1ЕГ-цегз:" в качестве гидрофильных групп, что определяет его L'.'icc::y ю аф^иш-ость к ПЭГ-фазе. -

Каик была исследована•возможность.применения данного метода для; виделекип цнтсхрома Р-450, a. также -, других -ферментов' иокооксигэназкой 'системы. . (НАДФН-завискмая Г-450' ,'редуктаза,; цитохром Ье) и фермента, 'участвующего в ; дальнейшем окислений спирта* (алкогольоксидаза• высших спиртов) .из. алканокнсляшда дрожгей Candida, mit osa. '• •.'■■•'.

Для выделения цитохрома Р-450 была использована шПфосомальнаЯ, Фракция, полученная путем осаждения 6% .ЮГ, которая ..подвергалась солюбилязации и дальнейшему распределению-в трехфазной полимерной1 системе. При использовании фазовых систем было исследовано влияние, на" с&доктявность распределения ферментов и степень их очистки: концентрации, белковой фракции,- изменения' еэличины . pli. ионной силы, катконного 'созтаза буфера, использовёжого . 1Гри,' солыбилазации. Показано, что наиболее эффективное /распределение' осуп;остЕЛязтся в .75 мМ QNWoinffl- или натрий-фосфатном : буфйре рН 7,G, при концентрациях белка в солюбйлизате ;5^10 мг/мл.. <Оробый га.'терьс представляет выявлешюе в этих. " .условиях . .. разделение цитохрома Р-450 и алкогольоксидазы высших -спиртов, что, вероятно, объясняется различием в гидрофобных свойствах двух этих-;'ферментов.

Разделение 'солюбилязированйшс• 'белксв -в- трехфазной. . системе r.oj.H:,!-3poB позволило достигнуть 6-7 кратной очистки цитохрома Р-450 пра 75-SOS выходе с.удельным содержащем фермента 2,7-2,9 -нМ/мг

CiA'Uib. - - :-'-,-• --•.'.'

Для гохиолзгячееког© использования етого -, способа очистка vt'.-p-îïH'ia не сглодаю разработать, способ, удаленяя :п^лимера. ^'В (Aiber.tsdcn ' Р.А:, 1у74) • описана ..возможность

использования для -этой пели сульфата аммония путем обраьовшгал двухфазно?'"системы (ПЭГ-солевоЯ раствор). Для делгагидолизацни цитохрома Р-450 к перераспределения его з солевую фазу, несодеркащую ПЗГ, необходимо наличие второго детергента - холата натрия.: ■ ';-'<-—'

'. Результата исследования влияния концентрации' доба-ляомой сода на перемещение,.ферментов б нижнюю фазу показали, что переход цитохрома Р-450 был .обеспечен в наибольшей степени, ес.и: для образовашл-двухфазной ПЭГ-водно-солевоя системы использовалась 20% концентрация насыщения-сульфата аммония. При этом достигали дополнительную, очистку цитохрома Р-450 от сопутствующих белков, удельное содержание фермента увехичквалось в 1,5 раза. ' Метод многофазных систем достаточно прост для' реализации, истребует слогной аппаратуры и больших затрат времега. Однако, необходимы пол!2,1ррыг .которые в нгсей стране выпускаются в ограниченных количествах ("стол, Декстран). Кроме того, з трехфазной, -системе, -затруднено отделение одной из фаз. Это определило поиск возможностей использования другой схекц выделения к-фракционирования -дрожжевых'мембранных белков с 'помощью одного полимера ПЭГ 6000'кл» его 'аналога. Необходимо било определить » этих .условиях концентрации .з системе детергента тритона Х-ЮО для распределега!я белков в. ГСЗГ-фязе и осадке. В тЬжо время, окла необходимость-.исследовашм Елгягая физико-химических ш^аметров самсй системы на процесс Фракционирования.

Выделение цитохрома Р-450 при использовании длл .' ;'■ ,фракционирования полимера ПЗГ 6000.

• Использование способа очистки цитохрома'Р-450 и сопутствующих ферментов фракцисшфованием'полимером показало, что данный метод обладает достаточно рысокой селективностью, основанной па га^шидуальных -', свойствах • ферментов • -• их относительной пирсфобнссти., Глубина.процесса отделения зависит от ко'-мзнтрацйй фракцз'гакруюЬ-'х' веиестз, их типа, от концентрации тритона Х-ЮО и 'ряда других-,параметров.

' В связи с,'эп®, в•;серии экспериментов . изучали влияние концентрации тритона Х-1.00 на процесс экстракции ферментов в ПЗГ'.-фазу при обработке . ерлюбилизата микрссомальной фракции полимером. Была' 'проанализирована возможность применения при фракционировании различных полимеров (ПЭГ 6000, гидропол 294) в

связи с поиском аналога, полимера, выпускаемого отечественной прсд^клтость». Ориентируясь на ранее полученные данные, со*.гЛк^:зацйю проводили при следующих параметрах: 75 мМ «сюнвй-воофатный буфер рН 7;6, содержаний 10% глицерина, 0,1 .мМ ?Л"А, 0,1 м.М ДТЕ, I" холата натрия при переменной концентрации тритона Х-100, при температуре 4°С и перемешивании в течение' 2 чагоз: концентрация- белка составляла 5-10 мг/мл. Концентрация лм/мс-ра при фракционировании - 8%. Результаты экспериментов представлена на рисунках I и 2.

Наибольшая разница ыевду выходами цитохрома ■ Р-450 и г^огольохслдазы наблюдалась при концентрации тритона Х-100 -0Д5. При этих ' условиях- в • осадке оставалось 70 - 80% алкогольоксидазы от ее исходного уровня в микросомальной фракции.' "оказано, что большая степень экстракции ферментов в. полимерную ф.ззу достигалась при фракционировании гидрополом 294, что может Слть определено большим сродством тритона Х-100 к данному полимеру. '

При проведении солюбилизации белков микросом натрия 1% и; тритоном Х-100 0,1й с последующим фракционированием полимером ■ установлено, что увеличение концентрации полимера от 6% до 12%, .приводило к снижению содержания ферментов (цитохром Р-450 от 85-95% до 45-55%, АОХ от 30-55Й до 5-14%) в супернатанте. При использовании в качестве фракционирувдего агента гидропола 294, выход ферментов в полимерную фазу был вше.. Однако, удельное содержание цитохрома Р-450, по которому • в данной - случае оценивалась эффективность разделения, . достигала максимальной -•величины при обработке.солюбилизата 8% ПЭГ 6000. Этот параметр был принят нага:, как рабочей (ряс. 2). ; . , ■ ■.

Результаты этих'экспериментов позволили прийти к заключению/ что получение препарата цитохрома Р-450 с • максимальной степенью очистки (1,5-1,8 -нМ/мг белка) и достаточно большим1 выходом, достигащим 75-85%, ' возможно при' • фракциощфовании солюбялхзированных белков в среде вышеуказанного состава • о '0,1* тритона Х-100 при концентрации фракционирующего агента ПЭГ6000-83.

Удаление полимера осуществляли с помощью двухфазной системы ПЗ?-раствор сульфат шхвдя. 3 результате перораолределекия $ер»»а?а удельное содержание цитохрома Р-450 возрастало в 1,5 раза , еостаазаго 2,£-2,8 аМ/мг белка.

7

д.

<¡>

С5 ICG

i0

& so

О а SC

о .

1 ' 40

О

К 20

£3

а

a, m o rc

3 Й ° Ы

o

L,b .1,0

Концентрация тритона л-ICC (?)

Рис. I. Глпялио кст:онгса:5:н тритоиа X-ICO и типа пол'моип на поре ход фору.онтов в полаю düvm <Sw/ —ä— _ глксгольокскда™. ' КЭ'.'ОСШ: —в—

алюго/ьоксаглзй. гкдрснсл Г.04;---*— - P-4GQ.

ПЭГ6000;---в---Р-450, гидропол 2Г>4.

J> Й

■t. о о о

Is-

ц

« s

п

з аз

« 3

L2« ГО

о с;

IÏ

К

о

ILO 80

6 G

40

20

S

ï

tU

1—■—в ■

- Концентрация полжсрэ (í)

F

i.C

Ti ■'-h "ri

í.o 3

S

v>

Рис. 2. ГЗа!.^;'У.ость содс-п^'л.'ия 1!»р.'й?.чтон auiroxpw. Г-4П0, аькогяльоксидрза} и суп>»рштапто ХОООЖг.'Ф ¡зри i раКЦКеККГЧИХЦШ'.! 'p>.1 от

полимиш (ПЭГ СООО. гидропол 204).

—л— алкогодьс-ксидчаа, ¡П)Гй>"«0; —я---

плкогчш.ок'-чдпзп. гияропдя ?.04:'--А--- F-4Í-0,

ГПГгЗООО:--а---i'--i50.' 1".:дт>:-.пол —о— удедьтгоо

седотеаш» P-4SÛ, ГЮГССПО;---о----yjWAMivV

сод0.«к1ни0 , гидропол 2Э4 .*

Очистка Р-450 и разделение на форкы при использовании, колоночной хроматографии.' • -Для повииенмя чистоты препарата цитохрома Р-450 была проведена, гидрофобная хроматография на o-Sepharose CL-4B.' / '•

Раствор сульфата аммония, ' ' содержащий ; ' 'исслё^уемыб' • бёлкй, обрабатывали смолой Blo-Beads .SIî-2 для ' . удаления ' остатков ' детергентов, главным образом.тритона X-IGO. С целью'- .углубления. ' процесса делипидолизации.фермента в "образец добавляли ,хйла,т натрия • до 0,'5% и-увеличивали ионную силу буфера ' (20% от. концентрации. , насыщения сульфата агония) при хроматогра$кческом раздолен:®./При. зтпх условиях возрастало гидрофобное взаимодействие цитохрома £'—:£0 с лигандами o-Sepharose . CL-4B, что ' при ;;йрояе'дёкии'. ' гидрофобной хроматографии обеспечивало, • получение- .'-препарата цдтохрема Р-450 с большей степенью чистоты.-Элюцию цитохрома,Р-450 : цре-водазя в присутствии 0,12% тритона' X-IGO. . В. результате'. этой/; стадии фракционирования очистка основной/фракции ¿;Цй,т0хррма Р-450 ' характеризовалась следундоли ' параметрами:, '.выход. -7.0%,' . удельное ' -.ол&ртняв 8-10 Ш/мг белка. Повторное • 'использований пщрсфр'бти: : хроматографии позволило получить, йрепарат ' /с ,80й' . - содержанием 'главного -компонента (удельное 0одержаше.16,5.нМ/мг^ел^а): /Данные- ., по процессу выделения-, цитохрома' Р-4Ь0 .'представлены' ,в 'таблице.' -3 ♦'•"'< ;

«орш цитохрома. Р-450 .разделяли, на' колок?» с гидрокешапагйтом.' При этом выделяли две фракции,/ которые обладали.-"• ■свойствами,;'', присущими цитохрому Р-450, и были. определены, как/цитйхром Pr450j и. ■ • цитохром Р-450о. Отцоаениэ содержания цитохромоз •• ?-/lSOj;s.Pr45Qj''" ,в у. общей Фракции било равно 1:3. -детергенты, мвочЩШШ; ?—■150 удаляли при, использовании ./ :хроматографии на гкдроксилшатито.• • Оодвм&ыэ лрэпаратЦ/Ké '-содержали "цитохрома ,/ ШХ'Ш-цитохром P-450-редуктааи и алкогольоксидазы еисших спиртов.-'

Ьизико-хиьыческие и ишушше свойства '.фррм цитохрома £-450. -

При исследовании очкдошшс пранаратов • цито-хтоьюВ. ; P--450j / -и - • Р-4ЬОр методом аа>-электроф6ре'за! ь по^акршамйдном ■ голе обнаруживаюсь по одной /{омишрумсей/полосе с молекуЛ{фной --массой Р-4ЬС; - 500~0 Да, P-45Û2' -, 5Ï0Q0 Да/. ЫолекуЛйрная/м,асса~ karas.taix,.' ^-•паратое цитохромов- Р-450 ¡метод ЮКХ) . -/408'300, - 306000, 2С »iXXJttSGOO Да. й^рм&нт, .c^yiTypi'..'-'

и гредс-тьвлзбт оосоя. кЫшле'кс из 8,:- 'в! или; "4-, /равный;:яЬ./,''мйсс,а/;',

Таблица 3.

Очистка цитохрома Р-450 из алканокисляюеих дронхей СзлсПйз ггаНоза.

Стадия обработки '- . Цитохром Р-450

Оосее сод-ни0 (нмоль) Удельное сод-ние ', ¡коль ? 1 мг ¡5/ Выход ' {%) Степень очистки

Микросомы' ',.'' •6076,0 . 0,43 100,0 1.0.

Водйо.-полимерная • фззфвяя еитема ,■ (coЛeвaя'фаза.), • 4812,0 ' 2,65 . 79,0 . 6,2

2-е студенк - -' ..• ' о-Бёр'пагозе .С-Т^чв* '--''•',"'..* - : 1684,0 .' 1246,2 16,50. ' ' 14,00 ' 22,5. 20,3 ' 38,4 32,6

' Г1!дрйксилапатнт ' . Р-453.. ■/.'•'- ?-4Г:0, - / 284,0. ^ 1049,0'. 16,00 .16,50 . ' 4.7 17,3 37,2 38,4

, Лц^йокскл апатит* . Р-450- "' / • ■,/ ;■/ ?-4502 • . 174.4 . 879,2 х-7,00 , 16,50'. 2,3 13,8: 39,6 37,2 .

Примечание: ** фракция цитэхрома Р-450 с максимальной удельной • '.■•'.'..'. .'активной-'активностью,-- которая разделялась на

■'".' :колойке ¡с гидсоксилйпзтнтом

** .хрдмйюера&а'яа- гкдрЬксшяпаГяте для удаления .

' ■>. ' ■■ '' Детергента ., ' , . ,

Тазжчие форм , било локйзанЬ при определении констант связывания СО с цитоХромами Р-450^ и Р-4502' методом импульсного. фотолиза. - Реькцм' Ь СО каждой изолированной формц .йгасива'лась одностадийной клкетюйй. второго порядка, -при этом''константы ско^юсти комйлексдобрззовашга • ''с-\6о,: .определялись для ' Р-4501 - 5 '"(1.3510.'Г5)>106 М*V1. Р-450-, - (3,2040.20)»Ю5^"^"1. '

Сиектрц окисленных а Еосстааовле;пп1Г. цитохромов. Р-4501 .и, Р-4502 . отличалась- по наборам характор^-лических-1 полос поглощения. 'Яифферекциальныэ спектры -.датаонит-СО' : восстановленного против датионит Еосстанозл^тюго фермента различались' по ./максимумам. поглбщо№*.я:: для цитохр-ома Р-450т - ?.мах=449 -для/адтохрома. Р^-ДбОз - НМ.' . _■'■-.

■ субстратного Взаимодаястаия- было

отмечено, что цитохром Р-4502 имел I тип .взаимодействия с гексадеканом и IIM тип с лауриповой кислотой, тогда как цитохром Р-450т не взаимодействовал с гексадеканом .и характеризовался .1 типом взаимодействия с лауриновой кислотой. Таким образом, можно с достаточной степенью достоверности утверждать, ' что в процессе работы были разделены и очищены < две формы цитохрома Р-450, отличающиеся субстратной специфичностью.

С полученными препаратами были проведены. . ювлуно логические исследования в лаборатории профессора Мюллера (ГДР), . занимающейся изучением форм цитохрома Р-450 ажанокислякщкх дрожжей. Как показали исследования методом NC-блоттанга сушестзует различие в им:, унологическкх характеристиках цитохрома ■ P-450j к Р-4502. В лаборатории профессора Шшера была также . определена ¡I-термннальная. аминокислотная последовательность для . двух счищенных форм цитохрома Р-450 и показано отличие цитохрома P-450j от описанных ранее двух форм Р-450Cfflj и Р-450^ из Candida maltона.(Kargel Е., 1939) . '

Выделение и очистка сопутствующих ферыентов.

Воделенив и очистка алкогольоксидазы высших спгртов.

С целью изуче!шя возможности . получения препарата алкогольоксидази высших спиртов в качестве сопутствующего продукта при Еыделении цитохрома 1-450 из- парафиноктсляхщих. дрожжей был использован осадок, получегный на стадии фракционировать В% ПЭГ 6000 солюбил!зата микросом. Ос?док, содержаний 70-80% активности алкогольоксидазы юкроесмальной Фракцш: с удельной активностью 1.6-1,8 Е/мг болка, подвергался повторной, солсбилизации и фракционированию полимором.

Селективная экстракция. алкогольоксидазы достигалась при фракцноггировании солххЗилизата осадка в буфере о повышенной. ионной силой, содержащего IS холата натрия и 1% тритона Х-100. Максималышй выход фермента б полимернуй фазу наблюдался при использовании в качестве фракционирующего агента гидропола 294 (рис. I и рис. 3).

Отделение фермента! от полимера осуществлялось в двухфазной системе (гидропол 294-расгвор сульфата аммония). Результаты исследования рабочих ко1щектраций . фракциошфушего агента, представленные на рисунке 4, показштют, что вксои1й выход - 60% и удельную активность'фермента 12-14 Е/мг балка достигали прн

I

о

Концентрация тритона I-IGG {%)

Piic. 3. Влияние .концентшщи буфера и концентрации тритона X-.fCO HD СОДеОТЛПйЭ ожогольоксядлск высспх спиртов в яо.тамзряой ф. од при фрохшоящювяаша гщрзполои 2Р4 . ■

—-i»-—' 75 .»!,! аммоний-фосФятшй: — 150 мМ avMointa-iîociîQTamt;—*— 2¡¿5 ísK а%ионий-фэсфат1Шй.

i

Концентрация пол;!.\;еуя {%)

Рас. 4. Содержим«' к удельная Grm;rc:ocíb злкогсяыжсад'iji ьмсамх cTjiiMon Р водно-сол^ьой -teso в зависимости от концеu'i'pauî»! лцропегл 2à-t ига расдагдвлрняи ' в двуя;.8зпся curvovo (гвдрояод - водно-солевой

концентрации гидропола 2Э4 - 8%. ", . V

Последующая хроматография -на колонке с - гидроксилапатитом позволила,получить препарат алкогольоксидазы высхих-'спиртов с удельной активностью' 45-43 . Е/мг белка. Выход . фермента ' после колоночной хроматографии - 31-35% от 'содержания . 'в мпкросомах. Результаты, полученные , в процессе- выделения,' •.представлена : в таблице 4. • . .-■""'.''•'.

, Таблица 4. .••.'..

Выделение и очистка алхогольохсидазы выспих спиртов и. цнтохрома Ъ5 из осадка после фракционирования ПЭГ 6000. . ■' .'---'

Стадия очистки '. . ЛОХ .

Активность (5) '- Удельная активно- • сть ,' (Е/мг ' белка) Степень, очистки Содержание , (%) Удель-: ное содержа -■кие' ¿.цУмг . белка) Степень очистки

Микросомальная ■Франция 100 1,14 : 1,о; 100/ ■ 0.49 .. , I.C- -

Осадок после. фоакшююгосва-гая ПЭГ бб00 .74 '1.60. . ■ 41 ; ' 0,3.¿ 0,8 ;

Полимерная фа' за после фракционирования гидропол 294 : 61 7,20 ,' 6.3 ■ -23-;, . I.S6- 4,0

Солевая фаза 'двухфазной, -системы (гид-: оопол-солевой раствор) 54 11,50 ; 10,0. ' 30 • 2,80 i 5.7

- ГАП .•; 35 , 47,50,. "41.7, 35,00, 71.4

Характеристика препарата алхогольоксадазы. виспих спиртов. Молекулярная масса нативной алкогольоксидаэы, определяемая методом гедь-фильтрашт на кс-ло.'ке : ТОУОРЕАВЬ }П/-55, равна 560000 -Да, • а ■ денатурированного формекта,; . определяемая! ■ методом' элоктрофореза в пелиакрмамидном геЛ':. с ЗЗв - 69 XX) Да.-

аначенив константы: Мнхзэлиса ¿Км),. " .;'определенное , по -октанолу, равно 0,27 мМ. . / '•' "-.-

Максимальная удельная активность фермента проявлялась в диапазоне рН 7,7-7,8 и температур 38 - 39°С.' Энергия зктпзации реакции окисления спирта, рассчитанная по уравнению Аррениусэ, имела'зкач'енио 22,1 ккал/моль--1.

' Были исследоз&нн различных соединения, как потенциальные субстраты для мембраносвязакной алкогольсксидазы, выделенной из дрожжей Ссл&Ша тиоза, .растуийх на глканах.

Абсолютной, спектр' поглощения алкогольоксидазы характеризовался двумя максимумами поглощения в видимей области света при К=380 нм и Я=450 нм.

При- ■ использовании .полученного препарата фэрмонта алкогольоксидазы разработан способ качественного к количественного определения' высших спиртов • в производственных, потоках и органических, растворителях!, а.эмульсиях, состоящих из водной фазы и органического рчетворитвля.

Выделение к очистка НАДФН-зависшой цитохром Р-450 редукта:зы цитохрома Ь5.

' Следа я основной схеме выделения цитохрома Р-450, была .произведена очистка.побочных продуктов - препаратов НАДФН-цитохрсч Р-450 редуктазы к цитохрома Ь5.

., , В результате,.фракциогафоватя солзобилизата микросом полимером '.'■. ПЭГ6СХЮ .и разделения в двухфазной системе' (ПЭГ-солевой раствор! была, выделена , фракция, ' вхяхмавдая- наряду с щ-тохромом Г-450, ШЙЙ-завЙепмую. Р-450-редуктззу и. " цитохром Ь5; При последовательной. ., хроматографии на, ' о-Зерйагозе .01-43 и ША^-ЗерЫсе!! были получены .препараты редуктазы с удельной активностью 20,5 Е/мг белка (выход,- .49Ж), и практически гомогенный препарат цитохрома с выходом 23-252 и удельным - - содержанием 23-25-нМ/мг белка. Электрофорез в ДАЛГ «показал, что определяемая молекулярная .масса редуктазы - 79000 Да, а цитохрома Р6 - '15000 Да. . ...

' При даклем способе виде леки,я НЛДФН-зависимой цитохрем Р-450 редуктазы V. .цитохрома экстрагировалось в пэг-фазу при фракционяровшпга полимером:лий'ь 55-60%- цитохрома Ь5 (таблица 5). Г, '■'.' ре'зу'Л'ЬТ-ате 40-45%.фермента оставалось в осадко, который обладал -. 'основной (70-80%), активностью алкогольоксидазы высших сгафтов. При •-' "повторной •солобалийацйи холатом натрия и - Г» тритона Х-100, ' .'^»йййоййровшша; гидрополои 294 и перераспределении в систем*)

Таблица 5.

Выделение и очистка НАДФН-завксимой Р-450 ред/ктазы цитсхрома ..-.,•■

Стадия очистки МЭ Ь5

Активность {%) Удельная активность (Е/хг белка) Степень очистки Содержание (») Удельной со^ держа- ■ ние , (т'-Умг белка) Степень очистки

Мккросомальная Фракция 100 0,47 1.0 100 0,50 1.0

ПЭГ-фаза при Фракционировании ПЭГ 6000 96 • 2,46 5,2 " 59 1,60 3,2

Солевая фаза . двухфазной системы (ПЭГ-солевой раствор) 88 3,20 6,8 45 1,72 3,4

о-Зет)11аго8е С1--4В 71 5,20 ■ П'1 32 2,50 .: 5,о

5ЕАЕ-5ерЬасе11 49 20, оО 43,6 ' -23 .. П3.00 46,0

полимер-солевой раствор бил получен препарат алкогольоксидазы висаях спиртов (12-14-^./мг -белка), содержащий в своем составе цигохром Ъ5 в количестве ЗОЖ от его содержания в ЧгакросомальноЯ фракции. Разделение этит двух ферментов оеуаествлали хроматографией на колонка. с пигооксилапатитом. Результаты очистки цитохрома Ь5 представлен -в таблицах 4 и 5. '."..'-

Выделе кие водоряставриывх белков супороксиддксыутазы в • каталззы. ...

Нами били проведены эксперименты по очистке - двух • • гидрофильных белков из сконцентрировашюго пормеата, получокнрго на I стадии общей схемы (рис. 5) на основании сочетания тех хо методов (Фракционирования полимером и перераспределения в двухфазной системе). Этими Ферментами являются , супероксяшисмутаза к каталаза.

При изучении влияния концентрация ПЭГ €000 (£• ; - .12») на фракционирование растворимых Волков наблюдалось, что при

■ концентрация^ ПЭГ 6000 10-12% удельная активность интерьоуэдп ферментой-возрастала в два раза за счет выпадения балластных белков- £ осадок

Полученную ПЭГ-фазу подвергали воздействию различных концентраций- сульфата ?.шшя. При возрастами концентрации сульфата аммония от 20 до 50% насыщения наблюдалась тенденция предпочтительного' распределения супероксиддисмутази в солевой фракции' с ■повышение«'.удельного■ содержания в 2-4 раза, а-каталазы в ПЭГ-фаза и интерфазе £'удельное. .содераание каталазы в верхней фазе увеличивалось в 6-7 раз. При концентрации сульфата'аммония-40% от насыщения получали "" солевую- Сракцию, содержаау» 75л, супёрЬксиддисмутазы и Ю% катэлайй. . Исходя из выше приведения данных,, с целью пурзраспределения каталазы из верхней ПЗГ-фззы в солевой раствор,' снижали-.' концентрацию сульфата атония. При концентрациях 15% и 17,5,1 насыщения сульфата аммония наблкягля максимальный,переход каталазы до 1003 и .75%, соответственно. Удельное содержаний каталазы при этом возрастало в 8-8,5 раз. Степень очистки составляла 50-54 рака..

Общая схема выделения из дрожжей цитохроиа Р-450 и сопутствующих белков.

• На основаши-проведенных йсследовазвй - была разработана общая схема наделения мембранных ферментов; (цитохром Р-450, цитохром ъ5, НАДФК-завкарлая цитохром Р-450 редуктаза ), фермента пероксисом ' (злкогольокездаза .высших спиртов), водорастворимых ферментов

■ (суяероксиддисмутаза, хаталазз) из биомассы дрожжей СаМ1йа п&Нотэтамм- ВСБ-779(рис. 5) . 'В . 'основа выделения и очистки белков лежат метода фракцкокяровайия полимером -к многофазных систем, .пазволяквди ' проводать селективную экстракцию продукта в одну из фаз," '.Дополнительную очистку . ферментов- производили на гидрофобном носителе о-ЗерИагозе С1-43, а 'также ионнообмешшх смолах йЕАЕ-ЯерПасеИ и путроксшалатит. Можно.полагать, что более глубокая очистка, жмко? быть осуществлена при .прииениия того ае метода' многофазных систем и- при использовании повторного фракционирЬвания белков.

•. Используя фракционирование полотером и распределение белка в ■двухфазной системе,, достиг./« выхода-...'цатохромя Р-450 75-80% при яоьызек»п! его удельного содержания в 4-6 раз.. При дальнейшей хроматографа!,' на. • о-ЗерЬагозе , Й.-4Й Шло повыэояо удельное

Биомасса

Дезинтеграция |и ц/ф 7500g*2ÖMHH г_

Гомогенат

Микро-Iк ультрафильтрация

Ретентат

'^упеснатант } (ополи) j

Осуждение SÜ ПЭГ '

^Осадок

1.солеЗилизэция в 75 мМ К4>-<5уфере, ря 7,6, 0.1 мМ ЗДТЛ, 1%'Na-X, 0,1:5 'Triton Х-100 (1г), 0,1 мМ ДГБ, 10% глицерина 2 .Фракционирование

в/? ПЭГ З.Ц/ф *OQOCg«45.VKH

Сулернатант|

20% CA

So дно-фаза -солевая) i (

ГОГ-фаза

Осадок

Пермеат

Осьадение_ 10?ГШТ

Осадок (отходы)

Супернатанз

40;5 CA ;

• 'У - '■ •

Водно-солевая фаза СОД ПЭГ-фаза

Диализ, концентрирован::© 15Я CA

Кокцелтрат СОД

Водно-солевая фаза Kat

I Да ализ, . концэктри-!роаашм .

1 .Солкоилкгация; в •225 мМ АО-буфере, рн 7,6,0,1 мМ ■ЭДТА, 1 Ns-X, Ii? Triton Х-100 (1г.), -0,1 мМ ЯТЕ. 10S глицзрина

2. Фракционирование 8S г-.1ДТ>опол 2чД ,

3.Ц/ф lOOCOg"45ыин

Концентрат! Kat I

Хроматография на О-Зерпагоэе

Диализ

'Диализ

Хроматография на

ШЕ-ЗерЬасеИ

НДДФН-зашошая редуктазз

Осадок (отходы)

Хроматография на ГАП

И

| Сушзрнатант

го.1? са

Водно-солоеоЯ раствор

Диажз

Хроматография' на ГАП

Р-450 I Р-450 г А 0 X Ь5

Рис. 5. Схема выделения форм цитохрома Р-450 к сопутствующих ферментов

содеркаэдю вдтохромз Р-450 еще в 5-6 раз. В результате был получен препарат 70-80% чистота (16-17 нМ/мг бежа) с 40-45% от содержания В микросомалыюй фракции.

При разделении форм цитохрома Р-450 на гидрсксилапатите, выход Р-450| составлял 9-112, Р-4502 -33-35™ от содержания в михросоках.

При фракционировании полимером (гидропод 2Э4) м дальнейшем распределети в системе гидропод 294-солоеоЛ раствор Сил получен

препарат алкогольоксидазы с 50-55% выходом фермента (удельная активность 12-14 Е/мг белка). После очистки препарата с помощью ионообменной хроматографии на гидроксплапатите степень очистки вдзросла в 3-4 раза, удельная активность достигла 45-48, Е/мг белка, выход фермента составил 30-35% от содержания в микросомах.

Препарат НДДФН-зависимой Р-450 редуктазы получен при фракционировании в фазовой системе v последовательной хроматографией на o-Sepharose CL-4B и ' DEAE-Sephacell. Выход фермента - 48-53», степень очистки - 43-45 раз.

При выделении КАДФК-завискмой Р-450 редуктазн и алкогольоксидазы высших спиртов, как сопутствующей продукт,, был пслучен препарат цитохрома bg. Разделение фзриентов на колонках с ионообменными носителями DEAE-Sephacell и гидро.чсилапатитом позволило получить препарат цитохрома Ь5 с удельным содержанием Г.5-35 нМ/мг белка и выходом 40-4?*- от его содержания в микросомах.

При очистке водорастворимых ферментов в многофазных системах получены препараты супероксиддисмутазы с активностью 480-500 Е/мг белка, выход В5%, каталазы 2//«10ь Е/мг белка, выход ВЫ (выходы рассчитаны от содержания ферментов в фильтрате цосле проведения миг.рсфилътрации). *

ВЫВОДЫ.

I. Разработан способ выд.ленкя цитохрома Р-4^0 из биомассы дроюкей Candida tzaltoaa штамм ВСР-779 при использовании технологичных методов микрофильтрацкх, многофазных полимерных систем и метода фракционирования полимером.

2 Определены физико-химические параметры полимерной системы, позволяющие в наибольшей степени отделить сопутстзуудие гидрофобные , белки (главным образом алкогольоксидазу высших спиртов). При использовании данного метода ' получен .препарат цитохрома Р-450 с 70-80% выходом фер/,ентз и повышением ого удельного содержания до 2,6-2,8 нМ/мг болка.

Z. Разработан метод очистки цитохрома Р-450 на колонке с o-Sepharose CL-4B, . взшгсаксий .предварительную обработку биологического материала холатом натрия, а также применение буфера повышенной ионной силы при зроматографическом роздолечни белков, что позволило получить препарат цитохрома Р-450 с 40-4;5?; быходом и удельным содержанием 16-18 аМ/мг белка (80-90% -чистоты). 3. Впервые препаративно получены две формы цитохрома Р-450,

•отличавдиеся по физико-химическим и иммунном характеристикам: молекулярная масса, абсолютные и дифференциальные спектры, спектры взаимодействия с субстратами, кинетические константы взаимодействия с СО, терминальные аминокислотные последовательности. Показзно, что одна из форм цитохрома Р-450 имеет субстратную специфичность к н-алксну, а Еторая - к высокомолекулярной жирной кислоте.

4. Использование предложенных методов очистки цитохрома Р-450 позволило комплексно получить препараты алкогольоксидэзы еыож спиртов с 35-40" выходом (удельная активность 45-48 Е/мг белка ), цитсхрома bg с 40-43% выходом (уделгное содержание 25-35 нМ/мг белка) и НАДФН-зависимой цитохром Р-450 редухтазы с выходом 48-53S (удельная &ктивко<дъ 13-22 Е/мг белка).

5. Показана принципиальная возмоягность использования метода многофазных систем для избирательного выделения и очистки водорастворимых белков: супероксидцкмутазы к каталазы, косЕетю

.связанных с окисленном н-алкана.

6. Проведенные исследования явились основой для разработки схеш и лабораторного регламента комплексной переработки бисмзссы алкзнокисляквдгх дрожкей для препаративного выделения следуюпцк ферментов: цитохром Р-450, окисляющий н-алкан; цитохром Р-450,, окисляющий жирную кислоту; алкогольохекдаза высших спиртов; НЛДИ-зависимая цитохром Р-450 редуктаза; цитохром Ъ5;' судароксиддисмутаза; каталаза.

Ссновшз результаты диссертационной работы представлены в печатных работах:

1. ¿ватисова С.М., Персиянова Т.Б..- Использование полиолоз при препаративном виде ловки цитохрома Р-450 из дроаскей Candida irai t'osa. // Тбзисы- докладов конференции ■ молодых ученых "Современные проблемы биотехнологии «гикроорганизмов" г. Рига, -1987, стр.Г)]/

2. Соколов Ю.И., Аветисовз С.М.. Кс.,лов В.И., Персиянова Т.Б. Выделите а очистка двух форм цитохрома Р-450 из алканокислякдах дроэзизй. У/ Тезисы докладов III Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" г. Кобулегт, -I98G, стр.79

3; Соколов . Ю.И., Персиянова Т.Е., Дападсв Е.Р. - Очистка и характеристика злкогольексидаэи высших спиртов из алнанокислякзких дрсажй С.'злй'1(1а naitosa. // Тезисы докладов Всесоюзной ксн^дренц/и

"Достижения биотехнологии ( - агропромышленному комплексу" г.Черновцы, Украина, -1991, стр.153

4. Персишэва Т.Б., Соколов Ю.И., Давидов Е.Р. - Препаративное выделение алкогольоксидазы еысших спиртов из алканокксляюад; дрожжей Candida maltosa. // Тезисы докладов . на , Всесоюзно^ конференции "Достижения биотехнологии - агрояроыгдоенному комплексу", г, Черновцы, Украина, -1991, тар Л 54

5. Соколов Ю.И.. Давидов Е.Р., Аветксоза С.М., Персиянова Г.Б. -Патент РФ на "Способ получения микросомальной ■ фгракцик алканокиспящих дромсеС". по заявке 4923895/13 от 03.04.91., регтенпе о выдаче патента от 03.01.92.

6. Персияноза Т.Е.. Соколов Ю.И., Давидов Е.Р., Аветисова С.Ы., Автомонова Т.Н., Попова Л.А. - Патент РО на "Способ получения алкогольоксидазы • выселх спиртов" по заявке 5GI5366/I3 от 02.12.91., решение о выдаче патента от 21.07.93.

7. Персиянова Г.Б., Соколов Ю.И., Давидов Е.Р., Аветисова С.М., Автсмодова Т.Н.. Попова Л.А. -.Патент РЭ

на "Способ определения высших спиртов" по заявке *015367/13 от 2Л2.91., репениэ о выдаче патента от'21.07.93.

8. Sokoiov Y.I.•, Persianova Т.В. - Preparative isolation of two foras or cytochrome p-450 from alkane oxidising yeasts. Candida rcaltosa, their substrain specificity and characterisation. // Abstracts. 7-th International conference "Biochsnistry and Biophysics of Cytochrome Р-450, Structure and Junction, Blotechnol'oglcal and Ecological Aspects." -1991. Moscow, P.5-61. p.129

9. Aiauersberger S., Perslyar.ova T.B., Avetlsovi S.'i., Sokoiov УЛ., Kargel Kraft P.., Schuack W.-H., DavldOY E.R., Waller H.-G. - Characterization of two cytochrome P-450 foros purified from the yeast Candida maltosa. .// International syttposlisn cn Cytochromes P-450 of Microorganisms. -1991. Eerlin, p.65-66

10. Persiyanova T.B., Sokoiov Y.I. - Purification of two fOitna -of cytochrome P-450 from alkane-oxldlzing yeasts Candida maitcsa,. their characteristics and substrate specificity. // International symposium on Cytochromes P-450 of Microorganisms. -1991. Berlin, p.79-80