Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Холестерингидроксилаза/лиаза млекопитающих: топогенез и функционирование в дрожжах и бактериях

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Холестерингидроксилаза/лиаза млекопитающих: топогенез и функционирование в дрожжах и бактериях"

09-4 1270

На правах рукописи

НОВИКОВА ЛЮДМИЛА АЛЕКСАНДРОВНА

Холестерингидроксилаза/лиаза млекопитающих: топогенез и функционирование в дрожжах и бактериях

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н, Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор [Лузиков Валентин Николаевич! Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Колесников Александр Александрович

доктор биологических наук, профессор Карпов Вадим Львович

доктор биологических наук Патрушев Лев Иванович

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

имени Г.К. Скрябина РАН, г. Пущиио-на-Оке.

Защита состоится <&>июня 2009 г. в часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, строение 40, МГУ имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан пая 2009 г. Ученый секретарь

диссертационного совета, (|

кандидат биологических наук С4^^'*^--И.А.Крашенинников

1 - И И И С К А Я 2000

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Центральную роль в биосинтезе физиологически активных веществ и окислении ксенобиотиков играют ферментные системы с цитохромом Р450 в качестве терминальной оксидазы, осуществляющей гидроксилирование молекул субстратов [Nelson et al., 1996]. Цитохромы Р450, обеспечивающие синтез стероидных гормонов, регулируют жизненно-важные функции в организме млекопитающих (эмбриональное развитие, процесс половой дифференциации, ответ на стресс и т.д.); нарушения синтеза стероидных гормонов приводят к серьезным заболеваниям и даже летальному исходу [Miller, 1988; Payne and Hales, 2004].

Первую ключевую стадию синтеза стероидных гормонов осуществляет холестерингидроксилазная/лиазиая система, включающая FAD-содержащий белок адренодоксииредуктазу (AdR), железосодержащий белок адреиодоксин (Ad) и цитохром P450scc (цитохром Р450 холестериигидроксилаза/20,22-лиаза, CYP11A1). AdR и Ad обеспечивают перенос электронов от NADPH к цитохрому P450scc, катализирующему трансформацию холестерина в прегненолон - исходное соединение для синтеза всех стероидных гормонов. Ряд деталей сложного процесса топогенеза основного компонента системы - цитохрома P450scc, пока ие выяснен (не определены механизм тканеспецифичного импорта белка в митохондрии, способ включения белка в мембрану в отсутствие «классических» траисмембраиных доменов и др.). Есть основания полагать, что исследования белков холестерингидроксилазной/лиазной системы и их вариантов (полученных с использованием методов генной инженерии) в созданных в данной работе гетерологических моделях расширят общие представления о топогенезе митохоидриальных белков, которые в виде предшественников адресуются в определенные компартменты митохондрии. Изучение особенностей тканеспецифичного импорта предшественника P450scc может служить источником информации для лучшего понимания механизма импорта белков.

Актуальность работ rio созданию микроорганизмов, осуществляющих коэкспрессию белков холеетериигидроксилазной/лиазной системы, обусловлена интересом к сборке и функционированию сложных Р450-монооксигеназных систем. Такие трансгенные микроорганизмы могут быть использованы в качестве гетерологических моделей для изучения ряда фундаментальных проблем (регуляция экспрессии гетерологических генов, топогеиез белков в гетерологических системах, регуляция стехиометрии компонентов Р450-систем, принципы функционирования «миогоцеитровых» ферментов и систем, осуществляющих

согласованные процессы электронного транспорта, взаимодействия с субстратами и активации молекулярного кислорода и др.).

Изучение структурно-функциональных свойств цитохромов Р450, обеспечивающих синтез стероидных гормонов, и механизмов регуляции биосинтеза стероидных гормонов служит необходимой предпосылкой, с одной стороны, для выяснения биохимических основ различных нарушений стероидогенеза и разработки подходов к коррекции дисфункции коры надпочечеников, а с другой стороны, для конструирования биотехнологических систем направленного синтеза физиологически активных стероидов. Изучение монооксигеназной системы цитохрома P450scc и в теоретическом, и в прикладном плане представляется особенно важным, поскольку экспрессия белков данной системы в микроорганизмах позволит решить ключевую проблему синтеза С21 -стероидных гормонов. Цель и задачи исследования. Целыо работы являлось изучение особенностей топогенеза и функционирования белков холестерингидроксилазной/лиазной системы (ХГ/Л системы) в клетках дрожжей и бактерий. Основное внимание было уделено изучению топогенеза основного и наименее изученного компонента ХГ/Л системы - цитохрома P450scc. В число основных экспериментальных задач входили:

- выбор гетерологической модели для изучения топогенеза цитохрома P450scc;

- выяснение возможности импорта предшественника цитохрома P450scc в митохондрии нестероидогенных клеток;

- изучение специфики поведения предшественника цитохрома P450scc в митохондриях дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также выяснение роли протеиназ и шапероиов в топогенезе цитохрома P450scc;

- изучение особенностей поеггранслокационных стадий топогенеза цитохрома P450scc (зрелой формы) с использованием гетерологической модели экспрессии па основе клеток Escherichia coli, и возможности функционального сопряжения цитохрома P450scc с рсдокс-системой бактерий;

- реконструкция ХГ/Л системы в клетках Saccharomyces cercvislaa и Escherichia coli с использованием методологии экспрессии гибридных (слитых) двух- и трехкомпонептпых белков, составленных из компонентов ХГ/Л системы; изучение характеристик гибридных белков и принципов формирования и взаимодействия каталитических доменов в гибридных молекулах;

- конструирование клеток Escherichia coli, способных осуществлять коэкспрсссшо всех компонентов ХГ/Л системы (цитохрома P450scc, AdR и Ad) и изучение свойств экспрсссируемых белков;

- создание гетерологической модели для изучения двух монооксигеназных систем цитохромов P450scc и Р45017а, катализирующих первые стадии стероидогенеза млекопитающих, на основе клеток дрожжей Yarrowia lipolyticcr,

- тестирование полученных трансгенных штаммов микроорганизмов, осуществляющих экспрессию белков ХГ/Л системы, на способность осуществлять биотрансформациго холестерина в прегненолон.

В процессе выполнения работы осуществлялось конструирование плазмид, способных направлять синтез рекомбинантных белков и их модифицированных вариантов в бесгслеточной системе, а также в используемых штаммах дрожжей и бактерий, и проводилась работа по дизайну рекомбинантных белков.

Научная новизна и практическая значимость работы. При изучении импорта синтезированного в бесклеточной системе предшественника цитохрома P450scc в изолированные митохондрии из разных источников получены данные, указывающие на принципиальную возможность исследований особенностей топогенеза P450scc в модельных системах на основе иестероидогенных клеток. Впервые предложен путь преодоления ткаиеспецифических ограничений импорта P450scc в гетерологические митохондрии путем замены N-коицевой адресующей препоследовательности.

Установлено, что критическим моментом топогенеза цитохрома P450scc в дрожжах S. ccrevislae япляется не собственно импорт P450scc, а побочные процессы, имеющие место при импорте белка в митохондрии - протеолиз (под действием протеиназы Pirnlp) и агрегация импортированного белка в матриксе, которые контролируются митохондриальной системой шапероиов mtI-Isp70/Mdjlp/Mgelp. Эти данные объясняют низкое содержание каталитически активного P450scc в дрожжевых митохондриях и позволяют наметить пути для преодоления данной проблемы. Впервые показано, что субстратная специфичность протеиназ Pimlp и т-ААА может перекрываться.

При изучении топогенеза зрелой формы P450scc обнаружено, что характеристики рекомбинантного цитохрома P450scc, синтезированного в клетках Е. coli, соответствуют характеристикам иатипиого белка, что указывает на возможность использования модельной системы па основе Е. coli для изучения, в частности, нестандартного механизма включения Р450.чсс в мембрану. Впервые осуществлена реконструкция в клетках Е. coli функционально активной ХГ/Л системы. Получены результаты, указывающие на возможность взаимодействия цитохрома P450scc млекопитающих с редоке-компонентами бактериальной клетки.

Результаты работы по конструированию и экспрессии в бактериях и дрожжах слитой ХГ/Л системы показали, что объединение полипептидных цепей функционально связанных

ферментов в одну молекулу не обязательно приводит к увеличению интегральной активности системы и что формирование каталитических доменов в слитых белках зависит от порядка их расположения в слитой полипептидной цепи. Выявлен ряд общих проблем формирования и функционирования слитых полиферментных систем (деформация активных центров, структурные ограничения для их взаимодействия, подверженность протеолизу). Из числа двойных гибридов найден активный вариант, способный при совместной экспрессии с недостающим компонентом ХГ/Л обеспечить высокий уровень трансформации 22(R)-гидроксихолестерина в прегненолон.

Разработан новый подход для введения нескольких чужеродных кДНК в геном дрожжей Y. lipolyiica, включающий (1) ко-интеграцию множества копий разных кассет экспрессии с гетерологическими кДНК с использованием интегративных векторов в области повторяющихся элементов генома дрожжей (rDNA или участки LTR zeta) и (2) конструирование диплоидных штаммов с использованием гаплоидных трансформамтов разного полового типа. Получены штаммы дрожжей Y. llpolytica, способные ко-экспрессировать белки ХГ/Л системы и цитохром Р45017а и осуществлять превращение холестерина в прегненолон и далее в 17а-гидроксипрегиенолои. Использованный методический подход может быть полезен для осуществления гетерологической экспрессии в клетках дрожжей других полиферментных систем или сложных белков, состоящих из нескольких субъединиц.

Полученные данные расширяют представления о специфике поведения белков стероидтрансформирующих систем млекопитающих в клетках микроорганизмов и могут являться основой для дальнейших исследований, связанных с развитием новых ферментативных методов биотрансформации стеринов или созданием тест-систем для скрининга лекарственных препаратов на основе микроорганизмов, продуцирующих цитохромы Р450.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на VII международной конференции «Cytochrome Р450 Biochemistry and Biophysics» (Москва, 1992), IV симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 1997), II съезде биохимического общества Российской Академии Наук (Пущино, 1997), международной конференции «Biocatalysis-2000. Fundamentals and applications» (Москва, 2000), международной конференции «Ксенобиотики и живые системы» (Минск, Беларусь, 2000), III Всероссийском съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), VI съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2004), IV международном симпозиуме VAAM (Association for General and Applied Microbiology) «Intracellular protein cataboüsm» (Оснабрюк, Германия, 2007), EMBO Workshop (Гамбург, Германия, 2007), XVIII

Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), ERA-IB Joint Call: «Industrial biotechnology for Europe: an integrated approach», Partnering Workshop (Франкфурт-на-Майне, Германия, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), IX международном симпозиуме «Cytochrome Р450 Biodiversity and Biotechnology» (Ницца, Франция, 2008), семинаре отдела молекулярных основ онтогенеза НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ и конференции, посвященной 70-летию В.Н. Лузикова (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы (/// ссылок). Объем работы составляет страниц машинописного текста, работа включаетрисунка и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа была направлена иа выяснение особенностей топогенеза и функционирования белков-компонентов холестериигидроксилазиой/лиазиой системы (ХГ/Л системы) коры надпочечников млекопитающих, включающей цитохром P450scc (цитохром Р450 холестериигидроксилазу/20,22-лиазу), адренодоксинредуктазу (AdR) и адренодоксин (Ad), в дрожжах (Saccharomyces cerevlsiae и Yarrowia lipolylica) и бактериях (Escherichia coli). Цитохром P450scc, AdR и Ad синтезируются в виде предшественников в цитозоле и импортируются в митохондрии, где они подвергаются протеолитичеекому процессиигу, связывают кофакторы и принимают определенную конформациго. Известно, что цитохром P450scc включен во внутреннюю митохондриапьиую мембрану, AdR ассоциирована с внутренней мембраной, a Ad является растворимым белком матрикса.

Объективные сложности изучения белков ХГ/Л системы в митохондриях стсроидогениых органов (наличие в клетках стероидогенных органов нескольких изоформ цитохромов Р450 и ограниченное количество материала для исследований) стимулировали создание искусственных моделей для их изучения in vitro, а затем и in vivo, осуществляя гетерологическую экспрессию белков в метках микроорганизмов.

1. ИЗУЧЕНИЕ ТОПОГЕНЕЗА ЦИТОХРОМА Р450$сс С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ

Термин «топогенез белков» связывает понятия биогенеза (т.е. синтеза, модификации, сворачивания, олигомеризации и т.д.) белковых молекул с топографией процессов, составляющих это понятие [В1оЬе1, 1980; Лузиков, 2006]. Топогенез митохондриальиых белков, синтезирующихся в цитоплазме, включает в себя их синтез, транспорт через мембраны, распределение между митохондриальными компартментами (сортинг) и включение в белковые комплексы. Импорт белков в митохондрии осуществляется в соответствии с универсальным механизмом, который предполагает, что любой белок, имеющий специфическую адресующую аминокислотную прспоследовательность и способный к обратимому разворачиванию, должен включаться в митохондрии из любого источника. Известны, однако, случаи когда этот процесс имеет тканеспецифичиый характер. Так, долгое время считалось, что предшественник цитохрома Р450ясс (рР450эсс) способен включаться только в митохондрии стероидогенных тканей [Оц1зЫта е! а1., 1985; МаШсйа с! а1., 1986]. Поскольку система эндогенного гидроксилирования стероидов существует в ограниченном числе тканей, нельзя было исключить, что митохондрии специализированных стероидогенных органов имеют уникальные ферментные системы и/или транспортные факторы. В связи со сказанным были необходимы исследования по гстерологическому импорту рР4505сс, особенно с использованием филогенетически отдаленных источников белка и митохондрий.

Для изучения импорта рР450бсс в гетерологнческие митохондрии использованы две модельные системы. Одна из них включает бесклеточную систему синтеза исследуемого белка или выделенный белок и изолированные митохондрии из разных источников. Другой подход состоит в экспрессии исследуемого белка в дрожжевых мутантах, дефицитных по отдельным компонентам митохондриальной системы импорта белков-предшсствснииков, и контроле за его сортингом в различные митохондриальные компартменты и последующими превращениями.

1.1. ИМПОРТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ЦИТОХРОМА Р450«сс БЫКА В МИТОХОНДРИИ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ Импорт рР450ясс быкп в растительные митохондрии

Впервые обнаружено, что рР450зсс быка, имеющий природную препоследоватслыюсть, синтезированный //? (трансляция мРНК рР450эсс, полученной с использованием

плазмиды рТиТ/рР450зсс и полимеразы фага Т7, в бесклеточной системе - лпзатс рстикулоцитов кролика), в модельной системе включается в изолированные растительные

митохондрии и подвергается протеолитическому процессингу, принимая размеры зрелой формы (mP450scc) (рис. 1). Последнее предполагает наличие в указанных митохондриях условий (или факторов), обеспечивающих транслокацию белка через митохондриальные мембраны, и эндопептидазы, способной процессировать этот белок. Полученный результат означает, что, либо импорт-процессинг pP450scc не является строго тканеспецифичным процессом, как это считалось ранее [Matocha et al., 1986], либо исследуемые растительные митохондрии участвуют в метаболизме стероидов и обладают специализированным аппаратом для импорта-процессиига митохондриальных цитохромов Р450.

2 g 1 ■ Синтез и импорт pP450scc быка в митохондрии

Протеиназа К - - + семядолей сои. 1 - транскринционно-трансляционная

смесь, полоса соответствует pP450scc с молекулярной массой 56 кДа; 2 - митохондрии после инкубации с тР4^5оТсс транскрипционно-трансляционной смесью, нижняя полоса соответствует mP450scc с молекулярной массой 53 кДа; 3 - митохондрии после инкубации с транскрипционно-трансляционной смесью и обработки протеиназой К, обе формы P450scc нечувствительны к протеиназе К, т.е. локализованы внутри митохондрий. Анализ методом Ds-Na-электрофореза в ПААГ и авторадиографии.

Гстерологический импорт предшественника цитохрома P450scc с модифицированной N-коицевой последовательностью

Сконструирована рекомбииантиая ДНК, обеспечивающая экспрессию

модифицированного предшественника P450scc (6His-pP450scc), содержащего на N-конце адресующей последовательности 13 дополнительных аминокислот, В из которых несут

положительный заряд (рис. 2).

+ ++++++ +| + + +

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly lie Arg Met Leu Ala Arg Gly Leu Pro Leu Arg Ser Ala Leu Val Lys

+ + + - ___

Ala Cys Pra Pro lie Leu Ser Thr Val Gly Glu Gly Trp Gly His His Arg Val Gly Glu Gly Ala Gly | mP450scc |

Рис. 2. Модифицированная препоследовательность рекомбинантного 6His-pP450scc. Стрелкой обозначено начало природной препоследователыюсти pP450scc.

После экспрессии в клетках Е. cotí рекомбинаитиый белок выделен из клеточного лизата (аффинная очистка с использованием системы QIAexpress фирмы QIAGEN). Эксперименты по импорту 6His-pP450scc в изолированные митохондрии печени крысы, в которые, как было известно, способен импортироваться природный pP450scc [Ogishima et al., 1985], показали, что добавочные аминокислотные остатки не препятствуют ни импорту, ни

последующему процессингу белка (рис. ЗА). В аналогичных экспериментах показана способность модифицированного pP450scc импортироваться в изолированные митохондрии сердца крысы (нестероидогенной ткани), а также в митохондрии дрожжей, претерпевая при этом нормальный протеолитический процессинг (рис. ЗБ, ЗВ).

Таким образом, оказалось, что тезис о тканеспецифичности импорта pP450scc неприменим к его модифицированной форме 6His-pP450scc. Возможно, присоединение пептида, обогащенного положительно заряженными аминокислотными остатками, к N-концу pP450scc увеличивает «силу» адресующего сигнала и способствует более легкому проникновеиию препоследовательности внутрь гетерологических митохондрий.

Рис. 3. Импорт 6His-pP450scc в митохондрии печени крысы (А), сердца крысы (Б) и дрожжей Candida valida (В). Анализ проводили методом иммуноблоттинга. А: / - контрольная проба, не содержавшая 6His-pP450scc; 2, 3 -импортированный 6His-pP450scc до (2) и после (5) обработки митохоидрий протеиназой К; 4 -6His-pP450scc, выделенный из Е. coli; 5 -mP450scc из митохондрий коры надпочечников быка. Б и В: 1 - 6I-Iis-pP450scc, выделенный из Е. coli и mP450scc из митохоидрий коры надпочечников быка; 2,3 -импорт 6His-pP450scc, пробы до (2) и после (3) обработки митохондрий протеиназой К; 4 - контрольная проба, не содержавшая 6His-pP450scc.

В целом, приведенные выше данные продемонстрировали, что для изучения цитохрома P450SCC можно использовать модельные системы на основе иестероидогеиных клеток, и впервые указали на то, что именно структура адресующей препоследовательности может быть важным фактором, влияющим на «тканеспецифичность» импорта. Так как изложенный подход не позволял оценить возможность формирования холофермеита цитохрома P450scc в гетерологических митохондриях, на следующем этапе работы синтез pP450scc был осуществлен в клетках дрожжей S, cerevisiae.

1 2 3 4 5 А ■ВИЙ—• - 6His-p450scc

P450SCC

Б

6His-p450scc P450SCC

s -

12 3 4

6His-p450scc • P450SCC'"

12 3 4

1.2. СИНТЕЗ И НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ТОПОГЕНЕЗА ЦИТОХРОМА Р450.чес БЫКА В ДРОЖЖАХ 5. сегм'тае

Экспрессия модифицированной формы цитохрома Р450зсс с преиоследовательностыо субъедшшцы IV дрожжевой цитохром с-оксидазы

Для экспрессии в дрожжах 5. сет1в1ае модифицированной формы цитохрома Р450зсс с препоследовательностью субъединицы IV цитохром с-оксидазы дрожжей (Сох1У) на основе шаттл-вектора рУеБР1/8-2 создана плазмида рУеОР/рСох^-Р450зсс. Замена препоследовательности цитохрома Р450зсс на рСох1У была предпринята для осуществления эффективного импорта белка в митохондрии дрожжей. Из результатов Вестерн-иммуноблотинга митохондриальных фракций, полученных из клеток коры надпочечников быка и из клеток сегеуШае (штамм 2805), трансформированных плазмидой рУеВР/рСох1У-Р450зсс и культивированных после индукции промотора в течение 18-20 час (рис. 4А), видно, что (1) рСох1У-Р450зсс свободно транслоцируется в митохондрии, используя адресующую препоследовательность дрожжевого белка, и правильно процессируется с образованием тР450зсс, и что (2) содержание рекомбинантного белка в дрожжевых митохондриях примерно равно содержанию цитохрома Р450эсс в митохондриях коры надпочечников.

1 г

-67

Р4503СС— ** «И*

— 43

3 4 Б Рис. 4. Экспрессироваипый

\У:<.'л в дрожжах рСохГУ-Р4508СС — Р4505СС импортируется в

. '< •• митохондрии (А), но его

■ _ , | ■ ['•'.''.',, процессировакная форма

ШШтЖшШ- ■ ШШИшш№

.ЛКЛЛ--... -ч ,»ни»! имеет очень низкое

сродство к дрожжевой митохоидриапьиой мембране (Б). Анализ методом иммуноблоттинга. А: У -митохондрии дрожжевых клеток, трансформированных плазмидой рУеВР/рСох^-Р450зсс, 2 -митохондрии коры надпочечников. Справа - положение и молекулярные массы белков-маркеров в кДа. Б: митохондрии и СМЧ коры надпочечников быка (У, 2) и митохондрии и СМЧ трансформированных дрожжей (5, 4) соответственно. На дорожки нанесено равное количество белка исследуемых фракций.

Однако, несмотря на высокое содержание Р4508СС в дрожжевых митохондриях, даже при использовании значительных количеств препарата (до 4,5 мг митохондриальиого белка на мл пробы) не удавалось зарегистрировать характерный разностный спектр гемопротеииа (восстановленная форма, связавшая СО, против восстановленной формы). Эти данные

указывали на то, что количество ферментативно активного цитохрома P450scc в дрожжевых митохондриях невелико.

При фракционировании митохондрий было обнаружено, что относительное содержание процессированной формы цитохрома P450scc (от общего содержания в митохондриях) во фракции внутренней мембраны дрожжевых митохондрий (ультразвуковые СМЧ) значительно меньше, чем в СМЧ, приготовленных из коры надпочечников (рис. 4Б). Изучение состояния цитохрома P450scc в митохондриях показало, что осложнения возникают на стадии сворачивания полипептидной цепи и/или ее включения в мембрану -лишь небольшая часть импортированных молекул включается во внутреннюю мембрану, где белок проявляет способность трансформировать 22(Я)-гидроксихолестерии в прегненолон в реконструированной системе, включающей изолированные Ad и AdR быка и NADPH-регенерирующую систему (0,03+0,01 нмоль прегненолона/мии на 1 мг белка СМЧ, данные четырех экспериментов по экспрессии pCoxIV-P450scc). Это свидетельствует о способности цитохрома P450scc связывать гем и приобретать правильную ориентацию во внутренней мембране дрожжевых митохондрий. Однако, основная часть импортированного белка находится в матриксе в виде несолюбилизируемых детергентом агрегатов. В составе агрегатов он, очевидно, лишен нативной третичной структуры и, следовательно, не имеет спектральных характеристик, присущих цитохрому P450scc,

Роль митохондриальпых протеиназ и системы шаперонов в топогенезе цитохрома P450scc

Для выяснения деталей гетерологического импорта в дрожжевые митохондрии предшественника цитохрома P450scc быка с собственной препоследовательиостыо была использована классическая схема синтеза/импорта белков in vitro. [З53]-Меченый pP450scc получали в бесклеточной системе транскрипции-трансляции с использованием плазмиды pTUT/pP450scc. В экспериментах in vitro по импорту pP450scc в изолированные дрожжевые митохондрии обнаружено, что транслокация предшественника в митохондрнальный матрикс протекает легко, однако его превращение в зрелую форму (отщепление N-коицевой препоследовательности) осуществляется с низкой эффективностью (рис. 5). В отличие от ситуации в митохондриях коры надпочечников молекулы P450scc не встраивались во внутреннюю митохондриалькую мембрану, а накапливались в матриксе (рис. 5), что согласуется с даниыми о локализации белка при экспрессии гибрида pCoxlV-P450scc в дрожжевых клетках.

Рис. 5, Импортированный in vitro в дрожжевые митохондрии цитохром P450scc не встраивается во внутреннюю мембрану. После импорта [35S]-pP450scc митохондрии фракционировали методом карбонатной экстракции. После обработки митохондрий 0,1 M Na:COi и центрифугирования проб (125000g, 30 мин) образцы фракций анализировали Ds-Na-электрофорезом в ПААГ е последующей авторадиографией (верхняя панель) или нммуиоблоттингом (нижняя панель). Маркерные белки: цитохром /ъ (белок межмембраипого пространства), переносчик аденнновых нуклеотидов (ААС, белок внутренней мембраны) и Mgelp (белок матрнкса). M - митохондрии, С и О - супернатапт и осадок, полученные после карбонатной экстракции митохондрий.

Так как основная часть молекул цитохрома P450scc не встраивается в митохоидриальную мембрану дрожжей, можно было предположить, что импортированный цитохром P450scc не способен приобретать в гетсрологических митохондриях нативиую конфирмацию и, как развернутый белок, деградирует в митохондриальиом матриксе. Такого рода деградация под действием серииовой АТФ-зависимой протеиназы Pimlp была показана для модельных рекомбинантных белков, характеризующихся затрудненным сворачиванием [Wagner et at., 1994]. Стабильность импортированного цитохрома P450scc в дрожжевых митохондриях изучали в ходе эксперимента, описаниого в подписи к рис. б. Обнаружено, что P450scc подвергается АТФ-зависимому протеолизу - инкубация митохондрий в присутствии АТФ-регенерирующей системы приводила к уменьшению количества цитохрома P450scc (рис. 6А), хотя интактность митохондрий при этом не нарушалась, что оценивалось по содержанию белка межмембранного пространства - цитохром с-пероксидазы (рис. 6Б). При отсутствии АТФ в среде инкубации деградация цитохрома P450scc полностью прекращалась (рис. 6Л).

Рис. 6. Импортированный in vitro в дрожжевые митохондрии Р450йсс деградирует АТФ-завиеимым образом (А), при этом интактность митохондрий не нарушается (Б). После импорта и разобщения мембранного потенциала валшюмицииом (2 мкМ) митохондрии инкубировали при 37°С в присутствии (+АТФ) или а отсутствие АТФ в матриксе (-АТФ). Для удаления пеимпортированого белка аликвоты митохондрий обрабатывали трипсином и осаждали центрифугированием, белки анализировали Ds-Na-

+ АТФ

-АТФ

- ССРО

15 30 4 5 60 Время(мин)

гчектрофореюм в НАЛГ с последующими авторялиографисП (А) или нммуноблоттппгом (Б). ССРО -белок мсжмсмбранного пространства цитохром с -иероксилачи.

Для того чтобы выяснить, какая из АТФ-чависимых митохондриальных протенназ. локализованных во внутреннем комнартменте митохондрий (растворимая ссриновая протсиназа Рип1р или мембранная мегаллопротеиназа т-ААА (протсолнтнческий комплекс УЫ0р/У1а12р), ответственна за деградацию апо-цнтохрома Р4508СС, был проведен ряд экспериментов, в которых оценивалась стабильность Р4505СС в митохондриях из различных мутантов дрожжей, дефицитных по протеолитическим активностям Рпп1р или У1а10р/У!а12р.

Дефадация цитохрома Р450эсс была полностью блокирована как и митохондриях из штамма с разрушенным геном Р1М1 (Д/ию/), так н в митохондриях, содержащих только протеолитнчески неактивный вариант Р1т1'™|,Ар (рис. 7А),

Время (мин) Время (мин)

О Г~Ц

Рис. 7. Цитохром Р450хсс деградирует в дрожжевых митохондриях под действием иротснииш 1'пн1р. А: Протеолнч цитохрома Р450.чсс полностью блокирован в митохондриях, содержащих неактивную 1>пп1р (Д/л'ш//Рт1|''"",Ар), но протекает в митохондриях с немутирошшиой Рнп1р (Л/)Ш|//Рпн1р). Б: Иротеолт цитохрома Р450»сс имеет место в митохондриях с протеолитнчески неактивным У1а10р/У1и12р комплексом (Дг/а/О. Д|'И/2/Уш10'"'";р, У1а 12",н''р). А и Б: Митохондрии с импортированным Р450«сс инкубировали при 37"С\ пробы анализировали, как

описано в подписи к рис. б. В: Цитохром P450scc образует агрегаты в отсутствие протеиназы Pimlp, но не в отсутствие Ytal0p/Ytal2p комплекса. После импорта и разобщения мембранного потенциала валиномицином митохондрии инкубировали при 37°С 15 мин в присутствии АТФ, обрабатывали трипсином для удаления неимпортированого белка и лизировали в буфере, содержащем 0,1% Тритон Х-100, 10 мМ MOPS/K.OH, рН 7,2, 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 0,5 мМ PMSF, агрегаты осаждали (25000g, 15 мин), белки осадка и супернатанта анализировали Ds-Na-электрофорезом в ПААГ с последующей авторадиографией. А-В: Содержание белков оценивалось лазерным денситометрированием. За 100% принято содержание импортированного P450scc (pP450scc+mP450scc) в митохондриях перед их инкубацией при 37°С.

В контрольных экспериментах стабильность Р450 оценивалась в митохондриях из штамма Дpiml, в котором экспрессировалась Pimlp дикого типа (Ap/m//Pimlp) (рис. 7 А), а также в митохондриях из штаммов AytalO и Aytal2, экспрессирующих только мутированные Yta 10E559Qp и Ytal2E6l4Qp (рис. 7Б). В этих штаммах, имеющих pet фенотип, существенно нарушено функционирование митохондрий. Тем не менее, в митохондриях из указанных штаммов (Apim//Pimlp, ДytalO и Aytal2) деградация цитохрома P450scc имела место, хотя и была менее эффективной, чем в митохондриях из штамма дикого типа, вероятно, вследствие низкого содержания АТФ в митохондриальном матриксе.

Ранее было показано, что в отсутствие Pimlp развернутые белки образуют агрегаты в митохондриальном матриксе [Rep et al., 1994]. Обнаружено, что новоимпортированный pP450scc агрегировал в митохондриях из Дpiml штамма, но не агрегировал в митохондриях из àytalO и Aylal2 штаммов, характеризующихся отсутствием функционального Ytal0p/Ytal2p комплекса (рис. 7В).

Полученные данные позволяют заключить, что протеолиз импортированного P450scc опосредуется растворимой протеиназой Pimlp, и что P450scc находится в дрожжевых митохондриях в развернутом состоянии.

Известно, что деградация развернутых белков в митохондриальном матриксе возможна только при наличии функционирующих шапероиов Ssclp (mt-hsp70) и Mdjlp (обеспечивает связывание белков с Ssclp) [Wagner et al., 1994]. Для выяснения роли митохондриальиой системы шапероиов в деградации цитохрома P450scc использованы митохондрии из температурочупствительных мутантов sscl-3, mdjl-7 и mgel-3 (Mgelp - фактор нуклеотидного обмена для Ssclp). При инкубации таких митохондрий, содержащих импортированный цитохром P450scc, при непермиссишюй температуре его протеолиз не наблюдался ни в одном из трех случаев (рис. 8А). В то же время белок агрегировал в митохондриях из мутантов sscl-3, и mdjl-7, но не агрегировал в митохондриях из мутанта mgel-3 (рис. 8Б).

Представленные данные могут быть суммированы следующим образом. После импорта цитохром Р450зсс, по-видимому, остается связанным с пИ-Ь5р70, как это следует из общего механизма импорта, причем это взаимодействие носит обратимый характер и опосредуется белками Мсфр и 1^е1р. Молекулы цитохрома Р450зсс, которые, по неизвестным пока причинам, не встраиваются в мембрану и не сворачиваются в нативную третичную структуру, находящиеся в комплексе Р4505СС-тЫ1зр70, специфически узнаются протеиназой Рип1р и подвергаются протсолизу. Если нарушено связывание Р450зсс с гШ-Ьбр 70, в комплексе с которым белок-субстрат поддерживется в растворимом виде (например, в мутантах 5*с1-3 и тф1-7), то белок агрегирует, и последний процесс протекает быстрее, чем деградация.

Рис. 8. Протеолиз цитохрома P450scc требует функционирования мнтохондриалыюй системы шаперонов. А: Деградация цитохрома P450scc нарушена при нспсрмиссивной температуре (37°С) в митохондриях из темпсратурочувствитсльных мутантов sscl-3, mdjl-7, mgel-3. G: Агрегация цитохрома P450scc имеет место в митохондриях из sscl-З и mdjl-7 мутантов, но не наблюдается в митохондриях из mgel-З мутанта. Пробы анализировали, как описано в подписях к рис. 6 и 7.

Модифицированный вариант цитохрома P450scc с N-концевым трансмембранным доменом деградирует под действием Ytal0p/Ytal2p протеиназы при участии митохондриальной системы шаперонов

Слабое сродство цитохрома P450scc к внутренней митохондриальной мембране дрожжей было искусственно преодолено введением в его полипептидную цепь гидрофобного участка, играющего роль трансмембраиного домена в FiFo-АТФ-азе Neurospora crassa. С этой целью была сконструирована плазмнда, позволяющая синтезировать in vitro гибридный белок Su9(l 12)-АР450, в котором последовательность из 75

А

Б

N-концевых аминокислотных остатков mP450scc была заменена на адресующую препоследовательность и первый трансмембранный домен 9 субъединицы FiFo-АТФ-азы, которые способны обеспечивать включение белков во внутреннюю мембрану по механизму «реэкспорта» [Rojo et al., 1999].

Гибридный белок Su9(112)-AP450 эффективно связывался с внутренней мембраной дрожжевых митохондрий, тем не менее, домен цитохрома P450scc не приобретал нативной конформации (показано в экспериментах по ограниченному трипсинолизу озвученных митохондрий, содержащих Su9(l 12)-ДР450 согласно Ou et al., 1986 и Усанову и др., 1990) и подвергался протеолизу.

В экспериментах с использованием митохондрий из дрожжевых мутантов показано, что деградация Su9(112)-AP450 (в отличие от немодифицированного P450scc) полностью блокирована в митохондриях с протеолитически неактивным Ytal0p/Ytal2p комплексом (рис. 9А), но осуществляется в митохондриях, содержащих как протеолитически активную, так и неактивную протеиназу Pimlp (рис. 9Б).

О 10 20 30 40 SO 60 Время (мин)

(9 20 90 40 » 00 Время (мин)

10 20 30 40 ВО ВО Время (мин)

Рис. 9. Деградация импортированного Su9(l 12)-ДР450 осуществляется под действием протеолитического комплекса Ytal0p/Ytal2p (А, Б) и контролируется митохондриальной системой шаперонов (В). А: Протеолиз Su9(112)-AP450 блокирован в митохондриях, содержащих протеолитически неактивный Ytal0p/Ytal2p комплекс. Б: Протеииаза Pimlp не оказывает влияния на этот процесс. В: Протеолиз Su9(l 12)-ДР450 блокирован при иепермиссивной температуре в митохондриях из мутантов sscl-3, mcljl-7 и mgel-З. Анализ проб проводили, как описано в подписях к рис. б и 7.

Скорость протеолиза Su9(l 12)-ДР450 в штамме с pet фенотипом была снижена, однако, это скорее связано с дефицитом внутримитохондриального АТФ, чем с частичным вовлечением Pimlp в деградацию белка, так как введение Pimlp в митохондрии из Apiml

штамма не стимулировало протеолиз Su9(l 12)-АР450 (рис. 9Б). Таким образом, можно сделать вывод, что главная роль в этом процессе принадлежит мембранному протеолитическому комплексу Ytal0p/Ytal2p. Как и в случае цитохрома P450scc, протеолиз мембранного белка Su9(l 12)-ДР450 контролируется митохондриапьной системой шаперонов (рис. 9В).

В данной работе впервые показано перекрывание субстратной специфичности протеиназ Pimlp и Ytal0p/Ytal2p. Деградация молекул цитохрома P450scc АТФ-зависимыми протеиназами (участие Pimlp или Yta 1 Op/Ytal 2р определяется локализацией полипептидпой цепи P450scc в митохондриях), по-видимому, инициируется не наличием специфических сайтов у мишеней, а их ненативной конформацией. Представленные данные предполагают существование универсального механизма удаления из митохондриального матрикса развернутых полипептидных цепей, склонных к агрегации и, вследствие этого, представляющих помеху для функционирования митохондрий и жизнедеятельности клетки в целом.

Изучение топогенеза цитохрома P450scc в митохондриях дрожжей S. cerevisiae в какой-то мере подтвердило тезис о его «тканеспецифичности», которая проявляется в дрожжах на стадии процессинга и внутримитохондриальной компартментализации.

1.3. ИЗУЧЕНИЕ ТОПОГЕНЕЗА ЦИТОХРОМА P450scc

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДЕЛЬНОЙ ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ СИС ТЕМЫ Экспрессия mP450scc в клетках Е. coll: внутриклеточная локализация и каталитические свойства

При экспрессии кДНК зрелой формы цитохрома P450scc (лишенной N-концсвой митохондриальной адресующей последовательности, mP450scc) в клетках Е. coli было неожиданно обнаружено, что функционально активный цитохром присутствует не только в мембранной, но и в растворимой (супернатант после высокоскоростного центрифугирования гомогената) фракции клетки, причем в обеих фракциях рекомбинантный белок находится примерно в равных количествах и преимущественно в нативном состоянии (проявляет характерный СО-разностный спектр с максимумом при 450 нм). Обработка вывернутых мембранных частиц (ВМЧ) О,IM ЫагСОз с последующим осаждением показала, что, как и в митохондриях коры надпочечников, основная часть молекул mP450scc включена в бактериальную мембрану. Наличие характерных фрагментов (26 и 29 кДа), образующихся при обработке трипсином ВМЧ, содержащих P450scc [Он et al, 1986; Усанов и др., 1990], свидетельствует о том, что белок встраивается в мембрану

бактерий в той же ориентации, что и во внутреннюю мембрану митохондрий коры надпочечников (рис. 10).

Рис. 10. Ориентация рекомбинантиого цитохрома P450scc в плазматической мембране Е. coli. Ds-Na-электрофорез в ПААГ с последующим имунноблоттингом обработанных трипсином препаратов сферопластов (дорожка 1) и вывернутых мебранных частиц (дорожка 2), полученных из клеток E.coli, трансформированных шшмидой pTrc99A/mP450scc. Справа -

1 О

1 молекулярные массы белков-маркеров в кДа.

Для того, чтобы выяснить, возможно ли существование каталитически активной растворимой формы цитохрома P450scc, был проведен анализ растворимой фракции клеток и сравнительный анализ свойств mP450scc, присутствующего в субклеточных фракциях бактерий и выделенного из коры надпочечников быка.

-67 -43

-25

Активность,0/»

Рис. II. ЖХВД и ХГ/Л активность компонентов фракции супернатанта, полученной после центрифугирования гомогената Е.соИ (12000(^, 1 час). Приведены профили элюции в различных буферных системах; А: буфер А (50 мМ Ыа-фосфат, рН 7,2, 0,1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ); Б: буфер А+Э (буфер А, содержащий 0,3% Эмульгеиа 913); В: буфер А+Э+Иа (буфер А+Э, содержащий 0,5 М №С1).

Кривые I - поглощение элюатов при 418 нм (Аш); кривые 2 (активность) - степень трансформации холестерина в прегнеиолон (% от активности изолированного Р450всс) после добавления к элюатам Ас1, АсЖ и МАБРН.

С использованием метода ЖХВД установлено, что присутствующий в «растворимой фракции» цитохром P450scc не является истинно растворимым, а находится исключительно в составе S400 кДа липопротеидных частиц. Только данная фракция частиц обладала способностью превращать холестерин в прегнеиолон, что исключает возможность существования цитохрома P450scc в высокоскоростном супернатанте Е. coli в мономерной форме (рис, 11).

Время удерживания, мин

Отсутствие иативных олигомсров P450scc в составе супернатанта подтверждено тем, что P450scc, присутствующий в этой фракции, не связывался с Ad-сефарозой (как это происходит при выделении P450scc из нативных митохондрий). Лишь после делипидизации частиц супернатанта 0,5% холатом Na и разделения белков (фракционирование сульфатом аммония) цитохром P450scc был выделен с помощью аффинной хроматографии (выход P450scc составил -20%). О содержании в "растворимой фракции" фрагментов мембраны, включающих P450scc, свидетельствуют также результаты распределения между супернатантом и нерастворимой фракцией гомогената (120000 g, 2,5 час) активности маркерного белка цитоплазматической мембраны сукцинатдсгидрогсназы и содержания рекомбинантного белка (85%, 15% и 87%, 13% соответственно). Сравнение констант диссоциации комплексов цитохрома P450scc с холестерином и Ad и доступности центров связывания холестерина и Ad для разных препаратов показало, что функциональное состояние цитохрома P450scc, обнаруженного в составе высокоскоростного супернатанта, более сходно с состоянием белка в мембранной фракции, чем с состоянием белка, выделенного из коры надпочечников быка (Таблица 1).

Таблица I. Функциональные характеристики цитохрома P450scc

в составе различных препаратов

Препараты: 1 - P450scc, выделенный из митохондрий коры надпочечников (плюс 0,3% Эмулыеп); 2 и 3 - осадок и супернатант после центрифугирования гомогената Е. coll при 120000 g в течение 1 час

(плюс 0,3% Эмульгеи) соответственно; 4 - то же, что и препарат 3, без детергента.

Параметр Препараты

1 2 3 4

Удельное содержание, нмоль/мг белка 18,0±2,0 0,0410,02 0,0210,015 0,0210,017

Кдис для холестерина, мкМ (доступность субстрат-связывающего центра,%) 60,2±!5,2 (60,4±10,3) 50,1±10,1 (55,0±5,4) 40,314,5 (55,116,5) 35,415,6 (75,414,8)

Кдис для Лd, мкМ (доступность Ad-cвязывaloщeгo центра, %) 0,12±0,02 (90,1±4,5) 0,45±0,15 (95,3±4,0) 0,5010.05 (80,216,1) 0,8010,1 (85.116.3)

Уровень ферментативного восстановления,% + ЫАОРН + ЫАОРН + Аё + АаЯ » 90,313,4 * 80,216,1 5,212,0 85,014,4 80,414,4 85,115,3

Активность при измерении трансформации 22(11)-гидроксихолестсрина, мин'1 +ЫАОРН + ЫАОРН + Аё + АсШ * 26,113,2 * 30,114,2 0,510,2 32,211,5 2,610,5 27,012,7

Активность при измерении трансформации холестерина, мин'1

+ NADPH * * 0,09±0,03 0,35+0,15

+ NADPH + Ad + AdR 3,8±0,5 2,9±0,б 3,0±0,3 3,3±0,3

Приведенные данные - среднее значение ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов; * Нет эффекта

Присутствие функционально-активного цитохрома P450scc в клетках E.coli исключительно в составе цитоплазматической мембраны согласуется с представленными выше данными о том, что при импорте P450scc в матрикс митохондрий дрожжей белок не способен принимать нативную конформацию, и позволяет сделать вывод о том, что стадия встраивания синтезированной полипептидной цепи в мембрану необходима для формирования каталитически активной холо-формы цитохрома P450scc.

Соответствие характеристик mP450scc, синтезирующегося в клетках E.coli (включение в мембрану, каталитические и спектральные свойства), характеристикам нативного белка указывает на то, что рекомбииантные клетки Е. coli можно использовать в качестве модели для изучения деталей топогенеза цитохрома P450scc.

Сравнительное изучение топогенеза цитохрома F450scc и его гибридов с адренодоксииом

Данные о роли N- и С-концевых последовательностей в сворачивании цитохромов Р450 получены в основном при изучении белков с делегированными или несущими мутации концевыми участками. В данной работе в клетках Е. coli осуществлена экспрессия рекомбинаитных кДНК, кодирующих гибридные белки Ad-P и P-Ad, включающие аминокислотную последовательность mP450scc, с N- или С-концом которой слита последовательность зрелой формы небольшого (12 кДа) белка Ad. Предполагалось, что наличие гидрофильного домена Ad, сохраняющего свойства нативного белка (см. далее) и, следовательно, расположенного на поверхности плазматической мембраны, может создавать конформациониое напряжение в структуре mP450scc, «фиксируя» концы молекулы у поверхности мембраны, и влиять на свойства P450scc. Проведен сравнительный анализ мембранной топологии, субклеточной локализации и функциональных свойств рекомбинаитных белков mP450scc, Ad-P и P-Ad.

Обнаружено, что наличие дополнительной аминокислотной последовательности Ad (184 аминокислотных остатка) на концах P450scc-flOMena не препятствует включению белков в плазматическую мембрану (по данным карбонатного теста) и связыванию тема (Таблица 2). Можно отметить, что при экспрессии в клетках Е, coli других модельных белков с модифицированным N-коицом получены аналогичные результаты: несмотря на удаление более 50 аминокислот (Al-53mP450scc) и экранирование N-конца mP450scc протяженной

19

аминокислотной последовательностью, включающей 52 аминокислоты (Ш8брР450зсс), модельные белки, как и ^модифицированный тР450зсс, обнаруживались в клеточной мембране.

Слияние И-конца Р450эсс с Ад несущественно влияет на процесс сворачивания домена Р450зсс (Р450/Р420 = 1); при модификации С-конца значительно увеличивается фракция белка с неправильно свернутым Р450зсс (Р450/Р420 = 0,2). Удельная активность (в расчете на содержание Р450-формы) Р-Ас! примерно равна активности немодифицировашгого тР450зсс, модификация И-конца Р450зсс в белке Ас1-Р приводит к снижению активности фермента на 30%. Таким образом, С-концевая область последовательности Р450зсс более, чем И-концевая, важна для обеспечения правильного сворачивания и стабильности белка, а >1-концевая область молекулы Р450эсс, по-видимому, играет роль в поддержании структуры каталитически-активного фермента.

Таблица 2. Спектральные и каталитические свойства цитохрома Р4505СС

и гибридных белков Ас1-Р и Р-Ас1 в составе препаратов вывернутых мембранных частиц (ВМЧ)

Параметр Варианты Р450зсс

тР450зсс Ас1-Р Р-Ас1

Количество Р450 (нмоль/мг белка ВМЧ) 0,14 ±0,03 0,08 ± 0,03 0,02 ± 0,005

Количество Р420 (нмоль/мг белка ВМЧ) 0,04 ±0,012 0,09 ± 0,02 0,09 ± 0,03

Р450/Р420 3,5 ±0,6 0,9 ± 0,4 0,2 ± 0,06

Суммарное количество гемопротеина 0,18 ±0,031 0,17 ±0,05 0,11 ±0,035

Р450 + Р420 (нмоль/мг белка ВМЧ)

Количество белка по результатам иммуноблотгинга 0,24 ± 0,08 0,21 ±0,08 0,16 ±0,06

(нмоль/мг белка ВМЧ)

Эффективность включения гема (%) 75% ± 10% 80% ± 12% 70% ± 13%

Удельная активность (моль прогестерона/моль 3,4 ±1,4 0,98 ± 0,34 4,8 ± 1,7

Р450-формы х мин-')

Приведенные данные - среднее значение ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов. Наличие продукта реакции определяли методом ИФА.

Взаимодействие цитохрома Р450всс с бактериальными рсдокс-белками

В высокоскоростном супернатанте, полученном при фракционировании рекомбинантных клеток Е.соИ, цитохром Р450зсс при добавлении МАОРН подвергается одноэлектрониому восстановлению с участием собственных электрон-транспортных белков

бактерии (ферредоксина и ферредоксинредуктазы) (рис. 12А) и катализирует превращение холестерина и 22(К.)-гидроксихолестерина в прегненолон (Таблица 1,рис.12Б).

По сравнению с химическим восстановлением дитионитом натрия, уровень эндогенного ферментативного восстановления Р450бсс в данном препарате достигает 80%, но резко снижается при добавлении детергента (Рис. 12А). Ингибирующее действие детергента указывает на то, что в супернатанте содержатся комплексы, включающие цитохром р4505сс и бактериальные редокс-белки. Активность белка во фракции супернатанта составила около 10% от активности реконструированной системы, содержащей оптимальные с точки зрения стехиометрии количества Р450всс/Ас1/АсШ.. Вероятно, это связано с низкой степенью структурно-функциональной гомологии между митохондриальными и бактериальными редокс-белками или невысоким содержанием последних. Приведенные результаты являются первым свидетельством возможности функционального сопряжения цитохрома Р450эсс млекопитающих с электрон-транспортной системой бактерий и, соответственно, возможности включения Р450зсс в метаболические пути бактерии.

Рис. 12, Цитохром Р450бсс способен функционировать, используя в качестве редокс-партнеров белки бактерии Е.со11. А. СО-разностный спектр фракции супернатанта,

полученной после

центрифугирования гомогената Е.соЧ (120000ё, 1 час), в буфере без детергента (/) и в присутствии 0,3% Эмульгена 913 (2). Спектры регистрировали через 15 мин после добавления МАОРИ в отсутствие Ас1 и Ас111. Е. Ферментативная активность фракции супернатанта. Пробы инкубировали с холестерином в присутствии НАРРИ, Ас! и АсШ. (/), в присутствии только ИАОРН (2), в присутствии ЫАБРН и Эмульгена 913 (3) в течение 10 мин (1) или 30 мин (2, 3). Кривая 3 демонстрирует эффект ингибироваиия Эмульгеиом ^ОРН-зависимой реакции.

в в 10 12 14 18 Время удерживания, мин

2. РЕКОНСТРУКЦИЯ СТЕРОИДГИДРОКСИЛИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ ЦИТОХРОМА P450scc МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Совместная экспрессия компонентов ХГ/Л системы млекопитающих в клетках микроорганизмов осуществлялась с использованием трех подходов, используемых для коэкспрессии белков.

2.1. СОВМЕСТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ ХГ/Л СИСТЕМЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

В КЛЕТКАХ Е. coli

Один из подходов, используемых для коэкспрессии белков, заключается в использовании плазмиды, в которой кДНК, кодирующие различные белки, находятся в составе одной транскрипционной единицы, а между парами кДНК введены линкеры, содержащие сайт связывания рибосомы. В этом случае при транскрипции образуется одна протяженная mRNA, но осуществляется трансляция индивидуальных белков.

На основе плазмиды pTrc99A/P450scc [Wada et al., 1991] были сконструированы две генетические конструкции для коэкспрессии трех зрелых белков ХГ/Л системы: pTrc99A/P450scc/AdR/Ad, в которой кДНК цитохрома P450scc, AdR и Ad находятся в составе одной транскрипционной единицы (рис. 13А), и pTrc/P450-AdR.Ad, включающая кДНК двух белков (P450scc и AdR) в составе одной кассеты экспрессии, а кДНК Ad - в составе отдельной транскрипционной единицы.

А

Промотор

Терминатор

•»P450SCC б

в

123 4 5 6 7 89 10

Рис. 13. Совместная экспрессия всех компонентов ХГ/Л системы в клетках Е. coll. А: Схема плазмиды pTrc99A/P450scc/AdR/Ad, содержащей кДНК цитохрома P450scc, AdR и Ad в составе одной кассеты экспрессии. Б: Экспрессия цитохрома P450scc (о), AdR (б) и Ad (в) в клетках Е. coll, трансформированных плазмидами pTrc99A/P450-AdR.Ad и pTrc99A/P450scc/AdR/Ad. 1-3 - фракции

контрольных клеток Е. coli. Клеточные фракции: низкоскоростной осадок (1, 4, 7), цитозоль (2, S, 8), мембранная фракция (Ü, 6, 9). 10 - Белки, выделенные из клеток коры надпочечников быка. Слева -положение и молекулярные массы белков-маркеров в кДа. Анализ методом Ds-Na-ПААГ-электрофореза с последующим иммуноблоггингом.

В клетках Е. coli эти плазмиды направляют синтез всех трех белков, внутриклеточная локализация которых соответствует локализации соответствующих белков в митохондриях клеток коры надпочечников (рис. 13Б).

Для оптимального функционирования ХГ/Л системы in vivo Ad должен находиться в избытке по отношению к другим белкам [Усанов и др., 1987; Hanukoglu et al., 1986], Ожидалось, что использование плазмиды pTrc/P450-AdR.Ad обеспечит более эффективную трансляцию Ad с собственной короткой молекулы мРНК, чем плазмида pTrc99A/P450scc/AdR/Ad. Однако определение соотношения экспрессируемых белков показало, что использование данной конструкции не приводит к увеличению содержания Ad rio отношению к содержанию других компонентов ХГ/Л системы.

В гомогенатах рекомбинаитных клеток регистрируется характерный СО-разностный спектр с максимумом при 450 нм, что свидетельствует о наличии функционально-активного цитохрома P450scc. Гомогенаты клеток, культивируемых в условиях индукции экспрессии гетерологических кДНК в течение 48 час, демонстрируют ХГ/Л активность в отношении 22(К)-гидроксихолестерина в системе ш vitro (1,6+0,7 и 3,1+0,4 пмоль прегненолона/мин на 1 мг белка гомогената при использовании pTrc99A/P450scc/AdR/Ad и pTrc/P450-AdR.Ad соответственно, результаты не менее трех измерений). Активность существенно не увеличивается при добавлении в среду реакции одного из изолированных белков ХГ/Л системы, что указывает на наличие в клетках каталитически активных форм всех трех белков. Однако приведенные величины значительно меньше активности гомогената клеток, экспрессирующих один цитохром P450scc, измеренной в присутствии изолированных AdR и Ad (14,1+0,8 пмоль прегиенолона/мии на 1 мг белка гомогената). Низкая активность ХГ/Л-системы в клетках Е. coli, возможно, связана с недостатком кофакторов, необходимых для образования активных белков данной системы, или с тем, что значительная часть молекул цитохрома P450scc, AdR и Ad (30-50% от суммарного содержания) присутствует в клетках в неактивной форме в составе телец включения (рис. 13Б).

2.2. ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СЛИТЫХ

РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, СОСТАВЛЕННЫХ ИЗ КОМПОНЕНТОВ ХОЛЕСТЕРИНГИДРОКСИЛАЗНОЙ/ЛИАЗНОЙ СИСТЕМЫ

Другой методический подход, использованный для коэкспрессии белков ХГ/Л системы - экспрессия гибридных (слитых) молекул, включающих белки-компоненты ферментативной системы, искусственно объединененные в единую полипептидную цепь. Указанный подход упрощает процедуры трансформации и молекулярного клонирования; снимает проблемы синхронизации процессов синтеза, транспорта и внутриклеточной компартментализации индивидуальных компонентов мультиферментных систем.

Идея создания слитых Р450-систем, объединяющих в составе одной полипептидной цепи все компоненты, необходимые для катализа, возникла после того, как были обнаружены природные «слитые» монооксигеназы [Narhi and Fulco, 1986; McMillan et al., 1992], в частности, бактериальный цитохром Р450-ВМЗ, демонстрирующий очень высокую каталитическую активность (более 1500 оборотов).

С целью повышения активности природной системы цитохрома P450scc сконструированы двух- и трехкомпонентные гибридные белки, составленные из цитохрома P450scc, Ad и AdR коры надпочечников (рис. 14).

NHj-|l'jSIIKe (b)j-AS-| AdR ^J-TDCAS Ad |"TAALALAD "COOH P-AdR»Ad(Ь-ll) KH,^ -TDM'S Ad К |-TDCA.S-| All )-COOII P-AdR-Ad (ll)

Nll3-^ AdR DGAS-j Ad ^-TDCTS -|lM5(lwill| COOH AdR-AtI-P(ll)

NT Ij-jy^ftweilot'TDOTS -[77]. COOH P-Ad (ll)

NH,Ц Ad |«TDCTS"jIM^I^eOTTj-COOH Ad-P(li)

N4,-| Adu }-Tnr,As^ Ad coon AdR-Ad (h)

Рис, 14. Схематическое представление гибридных белков, экспрессируемых в клетках S. cerevisiae или Е. coli. Для конструирования использовались кДНК, кодирующая цитохром P450scc быка (Ь), и кДНК, кодирующие белки AdR, Ad и P450scc человека (h).

При изучении гибридных белков внимание было уделено не только каталитическим свойствам, но и таким аспектам, как сворачивание отдельных доменов в составе общей полипептидной цепи, формирование активных центров доменов и взаимодействие между компонентами системы в составе слитого белка.

Экспрессия гибридных белков в клетках S. cerevisiae На основе вектора pYeDP/pCoxIV-P450scc при использовании искусственной слитой кДНК, кодирующей pP450scc-AdR-Ad [Harikrishna et al., 1993], сконструированы кДНК, кодирующие pP450scc(h)-AdR(h)-Ad(h) (гомологический вариант pF2(h), h - Auman) и р-CoxlVP450scc(b)-AdR(h)-Ad(h) (гетерологический вариант pF2(b-h), включающий P450scc быка (b - bovine) с адресующей N-концевой препоследовательностью субъединицы IV дрожжевой цитохром с-оксидазы (CoxIV). Кроме этого, была создана плазмида pTUT/p-CoxIVP450scc(b)-AdR(h)-Ad(h) для проведения экспериментов по изучению свойств белка F2(b-h) в системе синтеза/импорта in vitro.

Использованные плазмиды обеспечивали экспрессию гибридных белков pF2(b-h) и pF2(h) в дрожжах S. cerevisiae, однако после импорта в митохондрии белки подвергались интенсивному протеолизу (рис. 15). Для pF2(b-h) и pF2(h), выявляемых в дрожжевых митохондрях, получены сходные результаты. В митохондриях кроме полноразмерных гибридных белков с молекулярной массой 121 кДа, обнаружены иммунореактивные белки меньшего размера, которые являются продуктами протеолиза (минорные продукты, реагирующие с антителами к Ad (рис. 15Б), так как они включают последовательность Ad, который является концевым компонентом в составе гибридного белка), а также, возможно, продуктами преждевременной терминации трансляции F2. Два из них соответствуют по размерам P450scc (рис. 15А) и AdR-Ad (рис. 15Б).

Получены данные, указывающие на то, что деградация F2 осуществляется внутри митохондрий: обработка митохондрий трипсином и протеиназой К перед проведением электрофореза не изменяет картину, наблюдавшуюся после иммуноблоттинга F2 (фрагменты белков находятся внутри митохондрий); при инкубации митохондрий in vitro с течением времени содержание полноразмерного F2 заметно уменьшается; кроме того, некоторые фрагменты F2 (например, AdR-Ad) не могут импортироваться в митохондрии в случае их образования в цитоплазме из-за отсутствия адресующего сигнала.

Для определения локализации в митохондриях дрожжей слитого белка F2, синтезированного in vivo, митохондрии обрабатывали увеличивающимися концентрациями дигитонина в присутствии протеиназы К. Устойчивый к протеиназе F2 в значительном количестве обнаруживается даже тогда, когда протеиназой расщепляется не только цитохром

Ь2, находящийся в межмембранном пространстве, но и белок матрикса 1^е1р (рис. 16А). Фракционирование митохондрий посредством щелочной экстракции показало, что большая часть белка Б2 находится в матриксе и лишь незначительная часть встроена во внутреннюю митохондриальную мембрану (рис. 16Б).

ргв-сох1\/-Р450гсс Р4505СС >

\

-200 -116

— 66,2 -45

аск-ас1

-200 - 116 -66,2

' 2 _

I г

Рис. 15. Анализ белков митохондриальной фракции клеток, экспрессирующих рекомбинантиый белок Б2 (20 час индукции синтеза белка) (А, Б, дор. 1), методом иммуноблоттинга с использованием антител к цитохрому Р450зсе (А) или к АсЗ (Б). В качестве контроля использованы митохондрии из клеток, продуцирующих рСох!У-Р4505сс (А, дор. 2) или рАсЖ-Ас! (Б, дор. 2).

Рис. 16. Локализация в митохондриях дрожжей гибридного белка Р2(И) (Р450зсс-Ас111-Ас1), синтезированного в клетках 5. сеге\/Ыае. Митохондрии обрабатывали протеиназой К (50 мкг/мл) в присутствии различных концентраций дигитоиииа (А) и 0,1М раствором №гССЬ. (Б). Образцы анализировали Оз-Иа-электрофорезом в ПААГ с последующим иммуноблоттиигом. А: Маркерные белки: цитохром А2 (белок межмембранного пространства) и Mgelp (белок матрикса). Б: / -митохондрии, 2 - осадок (30 мим, 125000g), полученный после карбонатной экстракции митохондрий.

Полученные данные указывают иа то, что топогенез Р2, как и топогенез экспрессированного в дрожжах Р4508СС, осложнен побочными процессами.

->

«й

с^ ьг-> 'чм и1ЙГ и!» аа

Мде1р-> *

0 0,025 0,05 0,075 0,1 0,15 Дигитонин (%)

Б

1 2

Взаимодействие каталитических доменов в гибридном белке P450scc-AdR-Ad

Митохондрии и ультразвуковые СМЧ из дрожжевых клеток, экспрессирующих F2(h) или F2(b-h), проявляли гидроксилазную активность при использовании 22(R)-гидроксихолестерина в качестве субстрата. Средняя активность митохондрий в случае F2(b-h) составляла 0,03+0,008 пмолей прегненолона/мин на 1 мг митохондриального белка (из 8 независимых экспериментов); ХГ/JI активность СМЧ была обычно в 5-7 раз выше.

Активность митохондрий, содержащих гибридный белок F2(b-h), возрастала при добавлении к разрушенным митохондриям очищенных цитохрома P450scc или смеси Ad и AdR быка в 17 и 25 раз соответственно, что свидетельствует об ограниченной способности к взаимодействию каталитических доменов гибридного белка и о доступности их активных центров добавленным индивидуальным белкам (P450scc, Ad и AdR).

Экспрессия трехкомпонентные слитых белков в клеткаxE.coli

Так как низкое содержание активных слитых ХГ/Л в митохондриях дрожжей препятствовало их более подробной характеристике, для экспрессии гибридных белков были использованы клетки Е. coli. Для экспрессии зрелых форм белков F2(h) и F2(b-h) были сконструированы плазмиды pTrc99A/F2(h) (рис. 17А), pTrc99A/F2(b-h) и pTrc99A/AAP(h), включающая кДНК, кодирующую гибридный белок AdR(h)-Ad(h)-P450scc(h) (AAP), в котором СООН-конец P450scc, функционально важный для его правильного сворачивания, является свободным (рис. 14).

Анализ гомогенатов трансформированных клеток (индукция экспрессии гибридных белков в течение 24-48 час) показал, что в клетках синтезируются полноразмериые гибридные белки (рис. 17Б).

Б

« 1

"F2 / 92,5 —

66,2 — --

Рис. 17. Экспрессия гибридных белков, составленных из компонентов ХГ/Л системы, в клетках Е. coli. А: Схема плазмиды, содержащей кДНК, кодирующую белок P-AdR-Adx(b-h). Б и В: Ds-Na-ПААГ-электрофорсз и иммуиоблотгииг гомогенатов нетрансформированных (дор. 1) и

трансформированных клеток, содержащих тройные (Б) и двойные (В) гибридные белки. На дорожку наносили 100 мкг белка гомогенатов. Прокрашивание осуществляли с использованием антител к Ad. Слева показано положение и размеры белков-маркеров в кДа.

Для тройных гибридных белков, продуцируемых в клетках Е. coll, был установлен ряд интересных фактов: (1) белки F2(b-h), F2(h) и ААР подвержены внутриклеточному протеолизу, причем для разных гибридных белков набор низкомолекулярных продуктов, иммуногенных по отношению к антителам к P450scc, AdR и Ad, различен - основным продуктом протеолиза F2(b-h) и F2(h) является 65-кД белок, в случае ААР - 33-кДа белок (Рис. 17Б), следовательно, указанные белки имеют разную структуру вследствие разного взаимного расположения белковых доменов; (2) значительная доля рекомбинантных белков встраивается в мембрану клеток Е. coll (показано при карбонатной экстракции фракции ВМЧ и их обработке 1% Тритоном Х-100); (3) спектры клеточного гомогената не характерны для интактного P450scc и (4) гомогенаты бактериальных клеток, экспрессирующих тройные гибридные белки, проявляют ХГ/JI активность с 22^)-гидроксихолестерииом в качестве субстрата, которая увеличивается при добавлении экзогенных индивидуальных белков, входящих в состав гибридного белка, при этом степень активации разных гибридиых белков различна (Таблица 3).

Таблица 3. Холестерингидроксилазная/лиазная активность гибридиых белков п гомогеиатах рекомбинантных клеток Е. coll

Активность, пмолей прегненолона х мин"'х мг"' белка гомогената

Белок Добавки

p450scc AdR Ad AdR+Ad Без добавок

P-AdR-Ad(b-h) 2,68 + 0,185 2,73 ¿0,41 1,8 + 0,30 — 0,898 ±0,523

P-AdR-Ad(h) 0,058 + 0,033 0,063 + 0,02 0,35 + 0,071 — 0,029 + 0,020

AdR-Ad-P(h) — — — — 0,065 ±0,010

P450scc 0,002 + 0,001 0,002+0,001 0,003 + 0,001 36,99+12,99 —

Приведенные данные - среднее значение ± стандартное отклонение из не менее, чем трех экспериментов по измерению активности в гомогеиатах клеток Е. coll.

Следует отметать, что активности слитых ХГ/Л не менее чем на порядок ниже активности, измеренной в гомогенате клеток, экспрессирующих цитохром Р4508сс, в присутствии индивидуальных белков AdR и Ad. Этот вывод подтвержден при изучении белка Р2(Ь-11), выделенного при проведении аффинной хроматографии клеточных лизатов о адренодоксин-сефарозой. Удельная активность изолированного слитого белка - 0,03-0,06 моль образующегося прегненолона на моль Р2(Ь-И) в 1 мин - соответствует 1-2% от активности системы, реконструированной из изолированных Р450зсс, AdR и Ас1, взятых в

молярном соотношении 1:1:1. Низкая активность слитых ХГ/Л, вероятно, связана с тем, что в гибридных белках доля правильно свернутых каталитических доменов невелика (на что указывает высокое содержание продуктов протеолиза), или эти домены не могут эффективно взаимодействовать друг с другом.

Согласно предполагаемым механизмам взаимодействия Ad с AdR и P450scc, для достижения эффективного внутримолекулярного транспорта электронов в слитой ХГ/Л домены Р450 и AdR должны быть расположены таким образом, чтобы они могли либо формировать временный тройной комплекс с Ad («кластерный механизм» [Турко и др, 1988]), либо последовательно взаимодействовать с Ad («челночный» механизм [Lambeth et al., 1979]). Реализация «челночного» механизма требует высокой взаимной подвижности доменов - слитая молекула должна иметь подвижную конформацию, что делает ее потенциальной мишенью для внутриклеточных протеиназ. В данной работе, а также в работе [Harikrishna et al., 1993], обнаружено существование обратной связи между активностью и устойчивостью к протеолизу слитых ХГ/Л: так, наиболее активный вариант ААР присутствует в клетках в незначительных количествах при высоком содержании его фрагментов (рис. 17А, Таблица 3), что согласуется с «челночным» механизмом функционирования ХГ/Л системы.

Таким образом, эксперименты по изучению свойств слитых ХГ/Л, продуцируемых в клетках дрожжей и бактерий, не подтвердили предположение, согласно которому слияние последовательностей компонентов системы может привести к увеличение ХГ/Л активности вследствие более эффективного внутримолекулярного переноса электронов, В отличие от ряда двухкомпонентных монооксигеназ, описанных в литературе [Shibata et al„ 1990; Sakaki et al., 1994; Wilks et al., 1995; Shet et al., 1996], трехкомпонентная слитая ХГ/Л менее активна при сравнении с системой, в которой активность обеспечивается взаимодействием отдельных компонентов.

Гетсрологичсская экспрессия двойных гибридных белков в клетках Е. cotl

Сворачивание гибридных белков изучалось с использованием более простых моделей -двухкомпонентных белков AdR-Ad, Ad-P450scc (Ad-P) и P450scc-Ad (P-Ad) (рис. 14), составленных из зрелых форм белков человека. Данные белки продуцировали в бактериальных клетках и анализироваиы по той же схеме, что и тройные гибридные белки -определяли их уровень экспрессии, локализацию, активность и спектральные характеристики. При экспрессии в клетках Е. coll, трансформированных плазмидами pTrc99A/P-Ad(h), pTrc99A/Ad-P(h) или pTrc99A/AdR-Ad(h), двойные гибриды, в отличие от трехкомпонеитных, не подвергаются протеолизу (рис. 17В).

Для оценки корректного фолдинга двойных белков была измерена их каталитическая активность в клеточном гомогенате в присутствии недостающего компонента ХГ/Л системы (рис. 18А-В). Определение активности гибридных молекул в присутствии дополнительного количества индивидуальных белков, входящих в их состав, выявило наличие в каждом белке лимитирующего компонента: в белках P-Ad и Ad-P это P450scc, а в белке AdR-Ad - Ad. При добавлении одного из изолированных белков в реакционную среду активность P-Ad, Ad-P и AdR-Ad может быть восстановлена до уровня активности полностью реконструированной системы (рис. 18А-В). На рис. 19 представлены предполагаемые схемы взаимодействий между компонентами слитых двухкомпонентных белков и их экзогенными партнерами.

Оказалось, что формирование одних и тех же доменов в составе разных гибридных белков осуществляется по-разному. Так, в случае белков P-Ad и Ad-P при добавлении P450scc активность увеличивается в 20 и 10 раз соответственно (рис. 18А, 18Б).

Рис. 18. Холестерингидрокснлазная/лиазная активность гомогепатов, содержащих гибридные белки P-Ad (A), Ad-P (Б) и AdR-Ad (В), и увеличение активности при добавлении индивидуальных компонентов слитого белка. Величины являются средними + стандартное отклонение из трех экспериментов.

В зависимости от позиции относительно Ad, цитохром P450scc в составе гибридов обнаруживается преимущественно либо в нативном (Ad-P), либо в инактипированпом (P-Ad) состоянии (СО-разностные спектры препаратов имеют максимумы при 450 им и 420 им соответственно), в то время как Ad в них активен. Тот факт, что даже нативпый Р450 не способен эффективно взаимодействовать с функционально активным доменом Ad, позволяет

предполагать, что в домене Р450 молекулы Аё-Р участок связывания Ас1 экранирован и домены слитого белка (способные взаимодействовать с экзогенными партнерами) не в состоянии эффективно взаимодействовать друг с другом.

Рис. 19. Предполагаемые схемы взаимодействий компонентов двойных гибридных белков (клетчатые фигуры), соответствующих недостающих компонентов ХГ/Л системы (белые фигуры) и добавленных индивидуальных белков (серые фигуры-активирующие компоненты). Темным цветом выделены центры связывания Р450зсс, А(Ж и Ас1. Толстые стрелки - эффективное взаимодействие, пунктирные стрелки - неэффективное. А: Р-Ас! в комбинации с Ас® (1) и Ас®+Р4508сс (2); Б; Ас1-Р в комбинации с АсИ* (1), АсШ+Аё (2) и АсИМ-Р4508СС (3). В: АсШ-Ас1 в комбинации с Р450зсс (1) и Р4508сс+А<1 (2).

Чрезвычайно низкая активность гибрида Ас1К.-Ас1 при добавлении в пробу экзогенного Аё возрастает в 200 раз (до уровня активности реконструированной системы) (рис. 18В), что указывает либо на отсутствие нормального активного центра у Ас1, входящего в состав слитого белка, либо на его неспособность взаимодействовать с активным центром АсШ вследствие недостаточной взаимной подвижности. Таким образом, даже в двухкомпоиеитных фрагментах слитой ХГ/Л системы возникают определенные трудности: нарушение формирования одного из активных центров и/или их стерическое разобщение.

Результаты проведенных исследований четко показывают, что при сворачивании слитых белков, составленных из компонентов ХГ/Л системы, формирование каталитических доменов в составе общей полипептидной цепи зависит от природы и взаимного расположения аминокислотных последовательностей отдельных доменов и что их аранжировка осуществляется в результате некоего кооперативного процесса, определяющего нативность отдельных доменов и результирующую активность слитых монооксигеназ.

А

Б

В

2.3. ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ НАЧАЛЬНЫЕ СТАДИИ СТЕРОИДОГЕНЕЗА МЛЕКОПИТАЮЩИХ, В ДРОЖЖАХ Уаггопт Пропса: НОВЫЙ ПОДХОД К КОНСТРУИРОВАНИЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ

Выбор дрожжей Yarrowia lipolytica в качестве микроорганизма-реципиента для реконструкции ХГ/Л системы представлялся перспективным, поскольку данный вид дрожжей адаптирован к трансформации гидрофобных соединений. Это достигается благодаря наличию в этих дрожжах эффективных систем поглощения и внутриклеточного транспорта гидрофобных субстратов, наличию характеризующихся высокой активностью цитохромов Р450 (семейство CYP52), высокому уровню экспрессии компонентов, обеспечивающих транспорт электронов, и селективным механизмам выведения окисленных продуктов [Mauersberger et al., 1996]. Предполагалось, что в случае реконструкции ХГ/Л системы в дрожясах У. lipolytica будет решена проблема, связанная с проникновением в клетку холестерина - субстрата ХГ/Л системы, и выведением в культуральиуго среду продукта реакции.

Интегративные вектора, содержащие кДНК зрелых форм белков холестерин-трансформирующей системы и слитого белка mAd-mP450scc (Ad-P) под контролем регулируемого промотора и терминатора изоцитратлиазы (индукция этанолом и алканами, репрессия глюкозой; [Juretzek et al., 2001; Förster, 2001]), были сконструированы на основе мультикопийных интегративных плазмид р64РТ и р67РТ, способных интегрироваться в повторяющиеся элементы в геноме дрожжей (последовательности, обеспечивающие интеграцию - rDNA или LTRzeta ретротранспозона Yltl, маркер для селекции игаЗс!4 и plCLl-SpM-lCLlt [Schmid-Berger et al., 1994; Förster, 2001]). На рис. 20 в качестве примера приведены схемы сконструированных плазмид р67-серии - p67Ad-P и p67AdR.

Для введения в дрожжевой геном трех гетерологических кДНК, кодирующих Ad, AdR и P450sce, была использована трансформация гаплоидных реципиеитиых штаммов дрожжей К lipolytica E129L, Е150 смесью идентичных векторов, включающих разные кассеты экспрессии. На первой стадии работы использовались 2 вектора, один из которых включал кДНК AdR, а второй - генетически сшитую кДНК, кодирующую слитой белок Ad-P (p67AdR+p67Ad-P (рис. 20) и p64AdR+p64Ad-P).

На следующей стадии для котраисформации гаплоидных штаммов были также использованы интегративные вектора, обеспечивающие экспрессию кДНК цитохрома P450scc (p67Pb, iovine) и цитохрома Р45017а (p67IC17a, [Juretzek et al., 1999]), катализирующего следующие стадии стероидогенеза после цитохрома P450scc.

Рис. 20. Многокопипные интегративные вектора p67Ad-P (А) и p67AdR (Б) для экспрессии Ad-P и AdR в У. lipolytica. Вектора содержат последовательность, обеспечивающую интеграцию в геном -фрагмент LTR zeta, селективный маркер - ген игаЗсМ и экспрессионную кассету pICLlD-Sp/¡l-(reHX)-ICLlt. Перед проведением интегративной трансформации вектора линеаризовали эндонуклеазой рестрикции Wo/I. Sal I - фрагменты из p64Ad-P (plCLI-Ad-P) и p64AdR (pICLl-AdR) использовались в качестве зондов для детекции методом Саузерн-гибридюации гена ICLI и 1штегративных векторов, включающих кДНК гетерологических белков.

Методом Саузерн-гибридизации показана интеграция в геном до 3 векторов (по меньшей мере, 8-12 копий от 1 до 3 векторов) при одновременной трансформации клеток гаплоидных реципиеитиых штаммов У. lipolytica смесью 2-х или 3-х идентичных векторов р64- или р67-серии, включающих кассеты экспрессии с разными гетерологическими кДНК (рис. 21 А). Количество копий разных векторов в дрожжевом геноме было определено при использовании в качестве зонда &Д-фрагмента вектора p67Ad-P, включающего участки последовательности промотора и кДНК Ad-P (рис. 20А), выявляющего фрагмент, происходящий из гена изоцитратлиазы (присутствует в геноме в количестве 1 копии, служит внутренним стандартом для определения количества копий интегративных векторов), и фрагменты, происходящие из кассет экспрессии, входящих в состав интегративных векторов (вследствие присутствия в них pICLl).

т.лн. м t1 т2 тэ т4 ts т10 т11 т12 т14 т1в к м

Рис. 2I. Детекция интегратнвных векторов в геноме трансформаитов К /ipolylica EI29L после котрансформации тремя плазмидами рй7-серин (p67Ad-P, p67AdR и р671С17а) методом Саузери-гибридизации (А) и ориентация векторов в мультикопийных траисформамтах (Б). При анализе хромосомной ДНК дрожжей (рестрицированой эндонуклеачой EcuKV) в качестве зондов использованы So/I-фрагмент вектора p67Ad-P (pICLl-AxP) (рис. 20) (А) и URAi-iонд (Б). Маркеры молекулярной массы (М) - препарат Я-ДНК, рестрицироваиной EcoRVHmcHü, Tl - TIS -трансформаиты E129L, К - контрольный штамм E129L, г - фрагмент геномной копни ICLI, в -фрагменты кассет экспрессии из интегративнмх векторов. Продемонстрирована возможность одновременной интеграции в геном дрожжей до трех интеративных векторов (штаммы Т2 и ТЗ).

Ориентация векторов, интегрированных в геном )'. lipolytica, определена при проведении Саузерн-гибридизации с использованием (У/Ш-зопда но наличию характерных фрагментов, выявляемых в препарате рестрицироваиной хромосомной ДНК. Обнаружено, что мультикопийные вектора встраиваются преимущественно в одни сайт интеграции, образуя тандемы с преобладающей ориентацией — «голова - хвост», редко - ((голова к голове» (рис. 21 Б). Вектора с разными кассетами экспрессии обнаруживаются в одном кластере.

Для увеличения количества и получения разных комбинаций кассет экспрессии гетерологических «ДНК в одном штамме, проведено конструирование диплоидных штаммов с использованием гаплоидных трансформаитов разного полового типа - штаммов )'. lipolvlica E129L (МАТА) и El50 (МАТВ), скрещивание которых дает нрототрофлый диплоидный штамм (рис. 22А). Скрещивание гаплоидных трансформаитов обеспечило комбинацию до 4 кассет экспрессии (или до 5 разных векторов) в одном диплоидном штамме (рис. 22А, 22Б).

ЛИТА ku2-270ftli-f Ad Pli

р|С1И«итроллчч»мад жсг^есснл

DES DE6 0E7 »ES DE9 DE10

Adit Afllt AdR AdR AdR

Ad Ad A4 Ad Ad

№ PI) Pb Pb

147 P17

p6ÏJW

ретл*

pS7Pb PS7CVP1T

M T1 Т20 Т9 T11 DE DE DE DE DE DE DE DE DE M E123 Eisa E129 E150 61 63 51 52 53 71 84 92 101

4,27 3,53

2,03. 1,90-

, „ .m» - — *• 3,7 в p67Pb

«M» KM* «M* ** »- 2,0» pS7IC17a

p67AdR

5, ¡5 «V*» «m» , , , «m. • , ,14, ..... - m и—к . I ■*• 5,вв p64AdR

4,97-^» M .. *» gg ~ ^ аИ 4.9b p67Ad

, , «ft - * *** «м m* цц „ Iff £ 4,5 г 1CL1E129L

Рис. 22. Конструирование диплоидных штаммов дрожжей У. lipolytica DE5-DE10 для коэкспрессии белков ХГ/Л системы (цитохрома P450scc, AdR и Ad) и цитохрома Р45017а (А) и анализ методом Саузерн-гибридизации штаммов DE5-DE10 и отдельных гаплоидных трансформантов У. lipolytica (Б). Скрещивание гаплоидных штаммов Е150 Т9 (p67Ad) и Е129 T1 l(p67AdR+p67Pb) использовано для комбинирования трех кассет экспрессии (для цитохрома P450scc, AdR и Ad) в диплоидном штамме DE6. ДНК: рестрикция Ncol, зонд для гибридизации - Sa/I-фрагмеит из p67Ad-P (pICLl-Ad-P) (рис. 20), маркеры молекулярной массы (М) - препарат Х-ДНК, рестрицироваиной EcoRVHindm.

Получены диплоидные штаммы, обеспечивающие экспрессию кДНК всех белков ХГ/Л системы (DEI - DE6), белков ХГ/Л системы и цитохрома Р45017а (DE5) и контрольные штаммы (DE7-DE10), в которых отсутствуют кассеты экспрессии для одного из указанных белков (рис. 22Б), используя которые можно, в частности, проверить способность редуктазы или ферредоксииа дрожжей выполнять функции редокс-партиеров гемопротеидов млекопитающих. Можно отметить, что при котрансформации клеток У. lipolytica несколькими

плазмидами были получены наборы штаммов не только с разной комбинацией, но и е разным количественным соотношением кассет экспрессии с разными гетерологическими кДНК, что позволяет выбирать для последующего скрещивания трансформанты с желаемым соотношением числа копий кассет экспрессии для разных белков.

Следует отметить, что данная работа выполнялась в рамках международного научного проекта (грант ШТАБ). Конструирование рекомбинантиых штаммов У. 11ро1уПса проводилось совместно с В. Йовковой и доктором Ш. Мауерсбергером (Технический университет г. Дрездена, Германия).

Экспрессия полноразмерных белков ХГ/Л системы в рекомбинантиых клетках, выращенных в условиях индукции экспрессии гетерологических кДНК этанолом, показана методом Вестерн-блоттинга (рис, 23).

В

AdP-ОвкДв

p460scc—» ' - AdR •

Р450 DCS SL6 Е12Ч Ad—» SB»

5т.нд»рт контроль AdR DES DÉS DEÍ-13 Б1М 12кДа

ст!нд»рг контроль л Ad

çfc ст»нд«рт

Рис. 23. Результаты иммунодетекции цитохрома P450scc (A), AdR (Б), Ad и слитого белка Ad-P (В) в гомогенатах клеток диплоидных штаммов У. lipolytica DEI-13, DE6 и DES. Клетки растили в присутствии индуктора ЕЮН (1%) в течение 48 час (А, Б) или 24 час (В). Анализ методом иммуноблоттинга. В качестве стандартов использованы белки, изолированные из коры надпочечников быка. Справа - положение и молекулярные массы белков-маркеров в кДа.

В системе in vitro с использованием метода ИФА показано, что холестерингидроксилаза/лиаза, экспрессироваииая в клетках У, lipolytica (24 час роста в присутствии индуктора), способна трансформировать 22^)-гидроксихолестерин в прегненолон (для штамма DE6 активность составила 2,5 пмоль прегиеиолона/мин иа мг белка гомогената). Для определения ХГ/Л активности в системе in vivo проводили анализ стероидных продуктов, присутствующих в культуральиой среде и гомогенатах клеток, методом ГЖХ. Экспрессия активных белков системы цитохрома P450scc млекопитающих в штаммах Г. lipolytica DE5 и DE1-13 подтверждена способностью клеток, культивируемых в присутствии индуктора экспрессии гетерологических кДНК (1% Et-OH) и холестерина, осуществлять биотрансформацию холестерина в прегненолон (рие. 24А, 24Б). Важным

является то, что клетки У. Иро1уИса способны выводить продукт реакции в среду культивирования (рис. 24А и Б), в клеточных гомогенатах продукт ХГ/Л реакции не выявлен.

А

20 „ 25 30

Время удерживания, i

Pm 17И-НР

-1——г™ 25

!■ У

Chol

Время иультивмртеиния в присутствии холестерина

__ 2 чес (1)

-. б чес

- 24 час (3)

Сокращения: Chol-холестерин, Pro -прегненолон, 17п-НР- гидроксипрегненолон

27,5

29,5

Рис. 24. Биотраисформация холестерина рекомбинантными штаммами Y. lipofylica DES (экспрессия P450scc, Ad, AdR и Р45017а) (А) и DE1-13 (экспрессия Ad-P450scc, AdR, Ad и Р45017а) (Б). Представлены результаты анализа органических экстрактов внеклеточной среды, полученной после культивирования штаммов DE5, DE1-13 и контрольного штамма Е129 в присутствии индуктора экспрессии белков (1% ЕЮН) и холестерина (50 мкМ) и штамма Е129 в присутствии индуктора, но в отсутствие холестерина в течение 24 час. А: Стрелками указаны времена удерживания использованных стандартов - прогестерона, прегнеиолона и холестерина. Стероиды экстрагировали из 6 мл культуральной жидкости, растворяли в 50 мкл хлористого метилена, на анализ брали 1 мкл. Анализ проводили методом ГЖХ.

О функциональной экспрессии Р45017а в штаммах DE1-, DE4- и DE5-wmoB свидетельствует наличие биотрансформации индуцированными клетками холестерина в прегненолон и далее в 17а-гидроксипрегненолон (DE1-13 - рис. 24В), a также прогестерона в 17а-гидроксипрогестерон. Продукты биотрансформации холестерина и прогестерона идентифицированы методами ВЭЖХ и ГЖХ, определение активности Р45017а проведено группой профессора В.М. Шкуматова, НИИ ФХП, г. Минск.

Таким образом, получены рекомбинантные штаммы Y. lipolytica, способные осуществлять экспрессию функционально активных белков двух систем цитохромов Р450 млекопитающих, что позволяет обеспечить сопряжение трансформации холестерина до прегненолона (прогестерона) с синтезом 17а-гидроксилироваиных производных.

В работе показано, что при использовании метода, описанного выше, можно конструировать трансгенные дрожжи Y. lipolytica, способные экспрессировать 6 гетерологических белков (при скрещивании клеток, включающих по 3 разных кассеты экспрессии с гетерологическими кДНК), что, в частности, делает возможным создание новых штаммов, коэкспрессиругагцих большее количество белков, участвующих в процессе стероидогенеза. Очевидные преимущества алкан-утилизирующих дрожжей У. lipolytica в плане их использования для биотрансформации гидрофобных стероидов позволяют предполагать, что эти дрожжи могут эффективно примеиеиятьея в биотехнологии.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что предшественник цитохрома P450scc (pP450scc) из клеток коры надпочечников быка с собственной или модифицированной N-коицевой адресующей препоследовательностыо способен импортироваться в митохондрии из разных источников (семядоли сои, печень и сердце крысы, дрожжи Candida valida и Saccharomyces cerevisiae), что обеспечивает возможность изучения его топогенеза в модельных системах на основе нестероидогенных клеток. Структура адресующей препоследовательности является важным фактором, влияющим на тканеспецифичность импорта pP450scc в митохондрии.

2. Процесс топогенеза цитохрома P450scc в дрожжах S. cerevlsiae осложнен на стадиях сворачивания полипептидной цепи в митохондриях и/или включения белка в митохондриальную мембрану. Критическим моментом топогенеза pP450scc в дрожжах являются конкурирующие процессы, протекающие при импорте белка в митохондрии: протеолиз под действием растворимой митохондриалыюй протеииазы Pimlp и агрегация

импортированного белка в матриксе, которые контролируются митохондриальной системой шаперонов Ssclp(mtHsp70)/Mdjlp/Mgelp.

3. Впервые показано, что субстратная специфичность митохондриальных протеиназ дрожжей S. cerevisiae - растворимой протеиназы Pimlp и мембранной протеиназы Ytal0p/Ytal2p - может перекрываться.

4. Установлено, что ориентация в мембране, каталитические и спектральные свойства рекомбинантного цитохрома P450scc, синтезированного в клетках Escherichia coli, соответствуют характеристикам нативного белка, что указывает на возможность использования данной модельной системы для изучения деталей топогенеза цитохрома P450scc. Встраивание синтезированных полипептидных цепей цитохрома P450scc в мембрану является необходимой стадией для формирования каталитически активного белка. С-Концевая область последовательности P450scc более чем N-концевая, важна для обеспечения правильного сворачивания и стабильности белка; N-концевая область молекулы P450scc обеспечивает поддержание структуры каталитически активного фермента.

5. Впервые показано, что цитохром P450scc млекопитающих способен осуществлять ферментативную реакцию, используя в качестве редокс-партнеров белки бактериальной клетки.

6. Впервые осуществлена совместная экспрессия в клетках Е. coll всех белков-компонентов холестерингидроксилазной/лиазной системы млекопитающих, однако траисгениые штаммы Е. coli осуществляют биотрансформацию холестерина в прегненолон с низкой эффективностью,

7. Созданы системы эффективной экспрессии в клетках S. cerevisiae и Е. coli трех- и двухкомпонеитных гибридных (слитых) белков, составленных из компонентов холестерингидроксилазной/лиазной системы. Показано, что формирование активных центров каталитических доменов в гибридных белках зависит от порядка расположения аминокислотных последовательностей, составляющих гибридный белок. В слитых белках наблюдается деформация активных центров каталитических доменов, и, кроме того, существуют структурные ограничения для их взаимодействия.

8. Объединение аминокислотных последовательностей белков холестерингидроксилазной/лиазной системы в гибридную молекулу не приводит к увеличению холестерингидроксилазиой/лиазной активности гибридного белка по сравнению с системой, в которой активность обеспечивается взаимодействием индивидуальных компонентов.

9. Разработан новый способ конструирования рекомбинаитных штаммов Yarrowla llpofyilca, способных осуществлять совместную экспрессию нескольких гетерологичеоких

белков, который включает (1) коинтеграцию множества копий разных кассет экспрессии с чужеродными кДНК с использованием интегративных векторов в области повторяющихся элементов генома гаплоидных дрожжей (rDNA или участки LTR zeta) и (2) конструирование диплоидных штаммов путем скрещивания разных гаплоидных трансформантов. Таким путем можно конструировать дрожжи Y. lipolytica, способные одновременно экспрессировать 6 гетерологических белков.

10. Получены рекомбинантные штаммы дрожжей Y. lipolytica, способные коэкспрессировать все белки холестерингидроксилазной/лиазной системы, а также белки холестерингидрокоилазной/лиазиой системы и цитохром Р45017а, и осуществлять начальные стадии стероидогенеза млекопитающих - биотрансформацию холестерина в прегненолон и далее в 17а-гидроксипрегненолон. Продукты биотрансформации холестерина секретируются в культуральную жидкость.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Novikova L.A., Zubatov A.S., Luzikov V.N. Multiplicity of mitochondrial proteinases in yeast.//FEBS Lett., 135,245-249, 1981.

2. Новикова Л.А., Драчева C.M., Зубатов A.C., Лузиков В.Н. Митохондриальные протеиназы дрожжей Saccharomyces cerevisiae: электрофоретическое выявление, субстратная специфичность и чувствительность к ингибиторам. // Биохимия, 47(8), 1401-1408,1982.

3. Новикова Л.А., Исаева Л.В., Крыиецкий Е.Ю., Лузиков В.Н. Синтез предшественника адренодоксина быка in vitro и его импорт в дрожжевые митохондрии. // Молекуляр. биология, 26(1), 135-141,1992.

4. Novikova L.A., Isayeva L.V., Krynetsky E.Yu., Luzikov V.N. Import of the in vitro synthesized bovine adrenodoxin precursor into yeast mitochondria. In: Cytochrome P450 Biochemistry and Biophysics. Proceedings of the 7th International Conference (Archakov A.I., Bachmanove G.I., eds.), INCO-TCN, Moscow, 1992, pp. 419-421.

5. Luzikov V.N., Novikova L.A., Whelan J„ Ilugosson M„ Glaser E. Import of the mammalian cytocrome P450(scc) into plant mitochondria. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 199,33-36, 1994.

6. Лузиков B.H., Новикова Л.А., Спиридонова B.A., Исаева Л.В., Вилаи Д., Хыогоссои М., Глазер Э. Конструирование гетерологических митохондрий: импорт предшественника цитохрома P450scc быка в растительные митохондрии. // Биохимия, 59(7), 1098-1101, 1994,

7. Novikova L.A., Savel'ev A.S., Luzikov V.N. A modified form of the cytochrome P450scc precursor: A new approach in studies of protein import into mitochondria. // Biochem, Biophys. Res. Commun., 203, 866-873, 1994.

8. Novikova L.A., Savel'ev A.S., Zvyagilskaya R.A., Luzikov V.N. Modification of the targeting presequence of the bovine cytochrome P450scc precursor lifting tissue-specific restrictions on its mitochondrial import. // FEBS Lett., 378,182-184, 1996.

9. Новикова Л.А., Савельев A.C., Звягильская P.A., Лузиков В.Н. Импорт модифицированной формы предшественника цитохрома P450sce в митохондрии из различных источников. // Биохимия, 60(7), 995-1004, 1995.

10. Савельев А.С., Новикова Л.А., Друца В.Л., Исаева Л.В., Черноголов А.А., Усанов С.А., Лузиков В.Н. Синтез и некоторые аспекты топогенеза цитохрома P450scc в дрожжах. // Биохимия, 62(7), 908-916, 1997.

11. Лузиков В.Н., Савельев А.С., Новикова Л.А., Лангер Т., Нойперт В. Роль протеиназ в биогенезе митохондрий: контроль за импортом чужеродных белков. Материалы IV симпозиума "Химия протеолитических ферментов", стр. 39. Москва, 1997.

12. Savel'ev A.S., Novikova L.A., Kovaleva I.E., Luzikov V.N., Neupert W„ Langer Т. ATP-dependent proteolysis in mitochondria: m-AAA protease and Piml protease exert overlapping substrate specificity and cooperate with the mtHsp70 system. // J. Biol. Chem., 273, 20596-20602, 1998.

13. Savel'ev A.S., Kovaleva I.E., Novikova L.A., Isaeva L.V., Luzikov V.N. Can foreign proteins imported into yeast mitochondria interfere with Piml p protease and/or chaperone function? // Arch. Biochem. Biophys., 363, 373-376,1999.

14. Novikova L.A., Nazarov P.A., Savel'ev A.S., Drutsa V.L., Sergeev V.N., Luzikov V.N. Interaction of catalytic domains in cytochrome P450scc-adrenodoxin reductase-adrenodoxin fusion protein imported into yeast mitochondria. International Conference «Biocatalysis-2000. Fundamentals and applications». Moscow, 10-15 June 2000, pp. 133-134.

15. Новикова Л.А., Назаров П.А., Савельев А.С., Друца В.Л., Сергеев В.Н., Миллер В.Л., Лузиков В.Н. Взаимодействие каталитических доменов в слитом белке цитохром P450scc-адренодоксинредуктаза-адреиодоксии, импортированном в дрожжевые митохондрии. // Биохимия, 65(12), 1362-1366, 2000.

16. Шкуматов В.М., Усова Е.В., Радкж В.Г., Фролова Н.С., Новикова Л.А., Назаров П.А., Друца В.Л., Лузиков В.Н. Чужеродные, "сшитые" белки в бактериях Е, coli: синтез, локализация, выделение и свойства тройного белкового гибрида холестеринтрансформирующей системы. Тезисы международной конференции "Ксенобиотики и живые системы". Минск, 1-3 ноября 2000, 89-90.

17. Шкуматов В.М., Усова Е.В., Радюк В.Г., Фролова Н.С., Райков А.В., Новикова Л.А., Назаров П.А., Друца В.Л., Лузиков В.Н. Новые подходы к синтезу стероидов. // Избранные научные труды БГУ, серия Химия, т.5,446-459,2001.

18. Nazarov P. A., Drutsa V. L., Miller W. L., Shkumatov V.M., Luzikov V. N., Novikova L. A. Some features of formation and functioning of fused cholesterol hydroxylase/lyase. // DNA Cell Biol., 22(4), 243-252, 2003.

19. Kovaleva I.E., Novikova L.A., Nazarov P.A., Qrivennikov S.I., Luzikov V.N. Effects of various N-terminal adressing signals on sorting and folding of mammalian CYP11A1 in yeast mitochondria. // Eur.J.Biochem., 270, 222-229,2003.

20. Шкуматов В. M., Радюк В. Г., Фалертов Я. В., Виноградова А. А., Новикова Л. А., Лузиков В. Н. Самодостаточная холестеринтрансформирующая активность «растворимой» фракции клеток Escherichia coli, экспрессирующих цитохром Р45011А1. Шестой съезд Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (6-8 октября, г. Минск, Беларусь), Сборник статей; часть 1, стр.290-292,2004.

21. Виноградова А. А., Лузиков В. Н„ Новикова Л. А. Использование клеток Escherichia coli в качестве модельной системы для изучения топогенеза митохондриалыюго цитохрома pP450scc. // Вестник молодых ученых МГУ, 1,31-41,2004.

22. Шкуматов В. М., Радюк В, Г., Фалертов Я. В., Виноградова А. А., Лузиков В. Н., Новикова Л. А. Экспрессия цитохрома P450scc в клетках Escherichia coli: внутриклеточная локализация и взаимодействие с бактериальными редокс-белками. // Биохимия, 71(8), 10911102, 2006.

23. Шашкова Т.В., Лузиков В. Н., Новикова Л. А. Совместная экспрессия всех компонентов холестерингидроксилазной/лиазной системы в клетках Escherichia coli. И Биохимия, 71(7), 996-1001,2006.

24. Shkumatov V.M., Falertov Y.V., Mauersberger S„ Barth G., Novikova L.A., Luzikov V.N. Recombinant microorganisms for the synthesis of steroids and testing of medicines. EMBO Workshop «The chemistry and biochemistry of catalysis by biological systems». June 20-22 2007, EMBL Hamburg, Abstracts p20 (invited oral presentation) and p46.

25. Виноградова A.A., Лузиков В H., Новикова Л. А. Сравнительное изучение топогенеза цитохрома P450scc (CYP11А1) и его гибридов с адрекодоксииом при экспрессии в клетках Escherichia coli. // Биохимия, 72(2), 247-254,2007.

26. Faletrov Y.V., Frolenkov К.А., Novikova L.A., Luzikov V.N., Mauersberger S„ Barth G, Shkumatov V.M. Transgenic yeasts for pharmacological investigations. 9th International Symposium on Cytochrome P450 Biodiversity and Biotechnology, Nice, France, June 8-12,2008, Abstracts P-67.

27. Novikova L.A., Yovkova V., Faletrov Y.V., AgaLarov J.A., Luzikov V.N., Shkumatov V.M, Barth G., Mauersberger S. Functional expression of the cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450scc system in Yarrowla lipolytica. (Association for General and Applied Microbiology) and GBM (Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie) Joint Annual meeting, Frankfurt-Main, Germany, March 09-11 2008, Abstracts PH07, pi37, Biospektrum Sonderausgabe Tagungsband 2008.

28. Novikova L.A., Yovkova V., Faletrov Y.V., Agalarov J.A., Luzikov V.N., Shkumatov V.M., Barth G., Mauersberger S. Functional expression of the cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450scc system and of Р450Ы7 in the yeast Yarrowia lipolytica. 9th International Symposium on Cytochrome P450 Biodiversity and Biotechnology, Nice, France, June 08-12 2008, Abstracts P-68.

29. Minenko A.N., Novikova L.A., Luzikov V.N., Kovaleva I.E. Import of hybrid forms of CYP11A1 into yeast mitochondria. // Biochim. Biophys. Acta, 1780, 1121-1130,2008.

30. Новикова JI.A., Фалетров Я.В., Ковалева И.Е., Мауерсбергер Ш., Лузиков В.Н., Шкуматов В.М. От структуры и функции ферментов биосинтеза стероидов к новым генно-инженерным технологиям. // Успехи биологической химии, 49, 159-210,2009.

Для заметок

Заказ №101/05/09 Подписано в печать 20.05,2009 Тираж 100 зкз, Усл. п.л. 2,75

ООО "Цифровичок", теп. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; е-таН:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Новикова, Людмила Александровна

I. ВВЕДЕНИЕ

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА П.1. МОНООКСИГЕНАЗНЫЕ СИСТЕМЫ ЦИТОХРОМОВ Р

II. 1.1. Цитохромы Р

И. 1.2. Монооксигеназные системы

И. 1.3. Биосинтез стероидных гормонов в клетках млекопитающих

II. 1.4. Реконструкция стероидтрансформирующих систем и взаимозаменяемость электронтранспортных белков микроорганизмов и млекопитающих

ГЛАВА П.2. ХОЛЕСТЕРИНГИДРОКСИЛАЗНАЯ/ЛИАЗНАЯ СИСТЕМА КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

И.2.1. Состав и функционирование холестерингидроксилазной/лиазной системы

И.2.2. Характеристика цитохрома P450scc (CYP11А1)

И.2.2.1. Структурная организация цитохрома P450scc

И.2.2.2. Топогенез и топология цитохрома P450scc

И.2.3. Характеристика адренодоксина

И.2.4. Характеристика адренодоксинредуктазы •

ГЛАВА II.3. МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ И ПОДХОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ IN VIVO

II.3.1. Методические подходы, используемые для совместной экспрессии белков

И.3.2. Экспрессия гибридных (слитых) молекул, включающих компоненты Р450-монооксигеназных систем

II.3.3. Системы гетерологической экспрессии белков-компонентов холестеринмонооксигеназной/лиазной системы

ГЛАВА II.4. МЕХАНИЗМЫ, ВОВЛЕЧЕННЫЕ В КОНТРОЛЬ ЗА СБОРКОЙ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕМ МИТОХОНДРИЙ

II.4.1. Импорт белков в митохондрии

И.4.2. Деградация митохондриальных белков

ГЛАВА II.5. РЕКОНСТРУКЦИЯ СТЕРОИДГИДРОКСИЛИРУЮЩИХ СИСТЕМ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ

IL5.1. Трансгенные микроорганизмы для биотехнологии и фармакологических исследований

II.5.1.2. Дрожжи Yarrowia lipolytica 80 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 84 III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1П.1. Материалы

III.I.1. Реактивы и ферменты 86 III.I.2. Использованные штаммы микроорганизмов и плазмиды

III.2. Методы

111.2.1. Общие методы

111.2.2. Методы работы с ДНК

111.2.3. Конструирование плазмид

111.2.4. Методы, использованные при работе с клетками Escherichia coli

111.2.5. Методы, использованные при работе с дрожжами

Saccharomyces cerevisiae

111.2.6. Методы, использованные при работе с дрожжами

Yarrowia lipolytica

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА IV.1. ИЗУЧЕНИЕ ИМПОРТА ЦИТОХРОМА P450SCC С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ IV. 1.1. Импорт предшественника цитохрома P450scc быка в митохондрии из различных источников

IV. 1.1.1. Импорт pP450scc быка в растительные митохондрии

IV. 1.1.2. Гетерологический импорт предшественника цитохрома P450scc с модифицированной N-концевой последовательностью

ГЛАВА IV.2. СИНТЕЗ И НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ТОПОГЕНЕЗА ЦИТОХРОМА P450SCC БЫКА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae

IV.2.1. Экспрессия модифицированной формы цитохрома P450scc с препоследовательностью субъединицы IV дрожжевой цитохром с оксидазы

IV.2.2. Роль митохондриальных протеиназ и системы шаперонов в топогенезе цитохрома P450scc

IV.2.3 Влияние цитохрома P450scc на дыхательную систему и сопрягающий аппарат дрожжевых митохондрий

ГЛАВА IV.3. ИЗУЧЕНИЕ ТОПОГЕНЕЗА ЦИТОХРОМА P450SCC С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДЕЛЬНОЙ ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

1У.3.1. Экспрессия цитохрома P450scc в клетках Escherichia coli: внутриклеточная локализация и взаимодействие с бактериальными редокс-белками

IV.3.2. Сравнительное изучение топогенеза цитохрома P450scc и его гибридов с адренодоксином при экспрессии в клетках Escherichia coli

ГЛАВА IV.4. РЕКОНСТРУКЦИЯ СТЕРОИДГИДРОКСИЛИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ ЦИТОХРОМА P450SCC МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ

IV.4.1. Совместная экспрессия всех белков холестерингидроксилзной/лиазной млекопитающих в клетках Escherichia coli

IV.4.2. Особенности формирования и функционирования слитых рекомбинантных белков, составленных из компонентов холестерингидроксилзной/лиазной системы

IV.4.2.1. Гетерологическая экспрессия слитых белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

IV.4.2.2. Свойства слитых белков, синтезированных в клетках Escherichia coli

ГЛАВА IV.5. ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ НАЧАЛЬНЫЕ СТАДИИ СТЕРОИДОГЕНЕЗА МЛЕКОПИТАЮЩИХ, В ДРОЖЖАХ Yarrowia ljpolytjca: НОВЫЙ ПОДХОД К КОНСТРУИРОВАНИЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Холестерингидроксилаза/лиаза млекопитающих: топогенез и функционирование в дрожжах и бактериях"

Центральную роль в биосинтезе физиологически активных веществ (стероидов, витаминов группы D, желчных кислот и др.) и окислении ксенобиотиков играют ферментные системы с цитохромом Р450 в качестве терминальной оксидазы, осуществляющей стереоселективное гидроксилирование молекул субстратов [Nelson et al., 1996; Werck-Reichardt, Feyereisen, 2000; Pachecka et al., 2008; Miller, 2008].

Цитохромы P450, обеспечивающие синтез стероидных гормонов, регулируют жизненно-важные функции в организме млекопитающих и, в частности, человека регуляция беременности, эмбриональное развитие, процесс половой дифференциации,

- » углеводный и водно-солевой обмен, ответ на стресс и т.д.); любые нарушения синтеза стероидных гормонов приводят к серьезным заболеваниям и даже летальному исходу [Luft, 2001; Schuster, Bernhardt, 2007]. Изучение структурно-функциональных свойств этих цитохромов Р450 и механизмов регуляции биосинтеза стероидных гормонов служит необходимой предпосылкой для выяснения биохимических основ различных нарушений стероидогенеза и разработки подходов к коррекции дисфункции коры надпочечеников.

Первую ключевую стадию синтеза стероидных гормонов в организме I млекопитающих осуществляет холестерингидроксилазная/лиазная ■ (ХГ/Л) система, включающая цитохром P450scc, железосодержащий белок адренодоксин (Ad) и FAD-содержащий белок адренодоксинредуктазу (AdR). AdR и Ad обеспечивают перенос электронов от NADPH к цитохрому P450scc, катализирующему трансформацию холестерина в прегненолон, являющийся предшественником всех стероидных гормонов (кортикостероидов, минералкортикоидов, андрогенов и эстрогенов) [Payne, Hales, 2004; Miller, 2008].

Объективные сложности изучения белков ХГ/Л системы в митохондриях стероидогенных органов (наличие в клетках стероидогенных органов нескольких изоформ цитохромов Р450 и ограниченное количество материала для исследований) являются стимулом для создания искусственных моделей для их изучение in vitro, а также in vivo, осуществляя гетерологическую экспрессию белков в клетках микроорганизмов.

Трансгенные микроорганизмы, экспрессирующие белки ХГ/Л системы, могут быть использованы в качестве гетерологической модели для изучения ряда фундаментальных проблем биохимии и молекулярной биологии (регуляция биосинтеза физиологически активных веществ на субклеточном и молекулярном уровнях; структурно-функциональные аспекты белок-белкового и белок-лигандного узнавания; молекулярная организация ферментных систем, осуществляющих согласованные процессы электронного транспорта, взаимодействия с субстратами и активации молекулярного кислорода; взаимозаменяемость электронтранспортных белков в Р450-системах и др.).

Есть основания полагать, что исследования белков XT/JI системы и их вариантов (полученных с использованием методов генной инженерии) в гетерологических моделях' расширят общие представления о топогенезе митохондриальных белков и о принципах формирования сложных митохондриальных систем, компоненты которых в виде . предшественников адресуются в митохондрии (где они подвергаются процессингу, ковалентной модификации, связывают простетические группы и т.д.), принимают определенную конформацию и встраиваются в мембраны. В/ частности, изучение особенностей импорта предшественника P450scc в гетерологические митохондрии представляет интерес для выяснения судьбы чужеродных белков, попадающих в эти органеллы в результате ошибочного адресования, что имеет место при некоторых патологических состояниях. л1

С учетом консервативности молекулярной организации монооксигеназных систем и универсальности построения цитохромов, Р450, знания, полученные при изучении XT/JI системы, могут быть использованы и-для других цитохром Р450-монооксигеназ.

Результаты исследований в.областигмонооксигеназного катализа, накопленные за последние 30 лет, позволяют в настоящее время реализовать ряд задач прикладного характера. К ним относятся, в частности, (1) создание тест-систем . на основе субстратспецифичных цитохромов Р450 для использования при разработке и анализе новых противомикробных средств и модификаторов путей. биосинтеза стероидов и (2) разработка экономически эффективных и экологически чистых методов ферментативного синтеза гормонов (химический синтез которых не эффективен, энергоемок, экологически опасен или вообще невозможен).

Результаты исследований стероидтрансформирующих Р450-монооксигеназ в гетерологических моделях служат основой для развития новых подходов, имеющих целью реконструкцию монооксигеназных систем в клетках микроорганизмов для создания метаболических аналогов стероид синтезирующих органов млекопитающих. По-прежнему актуальны работы, направленные на разработку новых методов создания рекомбинантных штаммов.

Изучение цитохрома P450scc представляется особенно важным и в теоретическом, и в прикладном плане,, поскольку экспрессия в микроорганизмах монооксигеназной системы цитохрома P450scc позволит решить, ключевую проблему синтеза С21-стероидных гормонов, т.е. обеспечить превращение холестерина (или его аналогов) в прегненолон.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Новикова, Людмила Александровна

VI. выводы

1. Установлено, что предшественник цитохрома P450scc (pP450scc) из клеток коры надпочечников быка с собственной или модифицированной N-концевой адресующей препоследовательностью способен импортироваться в митохондрии из разных источников (семядоли сои, печень и сердце крысы, дрожжи Candida valida и Saccharomyces cerevisiae), что обеспечивает возможность изучения его топогенеза в модельных системах на основе нестероидогенных клеток. Структура адресующей препоследовательности является важным фактором, влияющим на тканеспецифичность импорта pP450scc в митохондрии.

2. Процесс топогенеза цитохрома P450scc в дрожжах S. cerevisiae осложнен на стадиях сворачивания полипептидной цепи в митохондриях и/или включения белка в митохондриальную мембрану. Критическим моментом топогенеза pP450scc в дрожжах являются конкурирующие процессы, протекающие при импорте белка в митохондрии: протеолиз под действием растворимой митохондриальной протеиназы Pimlp и агрегация импортированного белка в матриксе, которые контролируются митохондриальной системой шаперонов Ssclp(mtHsp70)/Mdjlp/Mgelp.

3. Впервые показано, что субстратная специфичность митохондриальных протеиназ дрожжей S. cerevisiae - растворимой протеиназы Pimlp и мембранной протеиназы Ytal0p/Ytal2p - может перекрываться.

4. Установлено, что ориентация в мембране, каталитические и спектральные свойства рекомбинантного цитохрома P450scc, синтезированного в клетках Escherichia coli, соответствуют характеристикам нативного белка, что указывает на возможность использования данной модельной системы для изучения деталей топогенеза цитохрома P450scc. Встраивание синтезированных полипептидных цепей цитохрома P450scc в мембрану является необходимой стадией для формирования каталитически активного белка. С-Концевая область последовательности P450scc более чем N-концевая, важна для обеспечения правильного сворачивания и стабильности белка; N-концевая область молекулы P450scc обеспечивает поддержание структуры каталитически активного фермента.

5. Впервые показано, что цитохром P450scc млекопитающих способен осуществлять ферментативную реакцию, используя в качестве редокс-партнеров белки бактериальной клетки.

6. Впервые осуществлена совместная экспрессия в клетках Е. coli всех белков-компонентов холестерингидроксилазной/лиазной системы млекопитающих, однако трансгенные штаммы Е. coli осуществляют биотрансформацию холестерина в прегненолон с низкой эффективностью.

7. Созданы системы эффективной экспрессии в клетках S. cerevisiae и Е. coli трех- и двухкомпонентных гибридных (слитых) белков, составленных из компонентов холестерингидроксилазной/лиазной системы. Показано, что формирование активных центров каталитических доменов в гибридных белках зависит от порядка расположения аминокислотных последовательностей, составляющих гибридный белок. В слитых белках наблюдается деформация активных центров каталитических доменов, и, кроме того, существуют структурные ограничения для их взаимодействия.

8. Объединение аминокислотных последовательностей белков холестерингидроксилазной/лиазной системы в гибридную молекулу не приводит к увеличению холестерингидроксилазной/лиазной активности гибридного белка по сравнению с системой, в которой активность обеспечивается взаимодействием индивидуальных компонентов.

9. Разработан новый способ конструирования рекомбинантных штаммов Yarrowia lipolytica, способных осуществлять совместную экспрессию нескольких гетерологических белков, который включает (1) коинтеграцию множества копий разных кассет экспрессии с чужеродными кДНК с использованием интегративных векторов в области повторяющихся элементов генома гаплоидных дрожжей (rDNA или участки LTR zeta) и (2) конструирование диплоидных штаммов путем скрещивания разных гаплоидных трансформантов. Таким путем можно конструировать дрожжи Y. lipolytica, способные одновременно экспрессировать 6 гетерологических белков.

10. Получены рекомбинантные штаммы дрожжей Y. lipolytica, способные коэкспрессировать все белки холестерингидроксилазной/лиазной системы, а также белки холестерингидроксилазной/лиазной системы и цитохром Р45017а, и осуществлять начальные стадии стероидогенеза млекопитающих - биотрансформацию холестерина в прегненолон и далее в 17а-гидроксипрегненолон. Продукты биотрансформации холестерина секретируются в культуральную жидкость.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интенсивное изучение ферментов, осуществляющих процесс стероидогенеза, заметно расширило представления о строении и функционировании монооксигеназных систем и стероид-гидроксилаз, участвующих в синтезе стероидных гормонов. Успешное клонирование кДНК этих ферментов открыло дорогу для современных молекулярно-биологических исследований с использованием систем гетерологической экспрессии на основе клеток млекопитающих, дрожжей и бактерий.

Первые работы в этой области бьши посвящены клонированию и изучению свойств экспрессированных индивидуальных белков стероид-трансформирующих систем [Morochashi et al., 1984; Sikorski et al., 1989; Sakaki et al., 1992 и др.]. С развитием белковой инженерии появились работы, направленные на изменение свойств цитохромов Р450, таких как связывание с мембраной или субстратная специфичность, а с развитием рекомбинантных технологий, позволяющих осуществлять коэкспрессию белков, появились работы по созданию трансгенных штаммов, синтезирующих не отдельные белки, а все компоненты какой-либо из Р450-монооксигеназных систем. Последнее поколение работ основано на идее создания микроорганизмов, способных синтезировать компоненты нескольких Р450-монооксигеназных систем и осуществлять несколько стадий или даже весь каскад последовательных реакций стероидогенеза млекопитающих [Urban et al., 1993; Duport et al., 1998; Hayashi et al., 2000; Inouye et al., 2001; Bernhardt, 2006; Szczebara et al., 2003]. Такие работы проводятся как с целью создания моделей для фундаментальных исследований (изучения свойств и молекулярных механизмов функционирования и взаимодействия отдельных ферментов и монооксигеназных систем, участвующих в процессе стероидогенеза), так и с практическими целями - например, с целью создания моделей для скрининга лекарственных препаратов или трансгенных штаммов для синтеза различных стероидов.

Многочисленные работы, представленные в литературе, продемонстрировали возможность осуществления экспрессии активных белков-компонентов полиферментных стероидтрансформирующих систем в клетках микроорганизмов. Однако к настоящему моменту еще нет информации о создании биотехнологически перспективного трансгенного микроорганизма, содержащего эффективно функционирующую систему цитохрома P450scc и, благодаря этому, осуществляющего лимитирующую стадию стероидогенеза млекопитающих - конверсию холестерина (или его аналогов) в прегненолон. В мировой практике давно предпринимаются попытки экспрессии белков ХГ/Л системы в микроорганизмах, однако как следует из результатов данной работы, основная проблема заключается в экспрессии функционально активного цитохрома P450scc.

Очевидно, что функционирование чужеродного белка или ферментативной системы может зависеть от типа клетки или тканеспецифического контекста, в котором проявляется его активность, и что для успешного создания трансгенных микроорганизмов необходимо предварительное изучение свойств гетерологических белков (в частности, особенностей их топогенеза) в используемых организмах-хозяевах.

Изучать топогенез цитохрома P450scc (CYP11A) в нативных условиях - в митохондриях клеток стероидогенных тканей, на фоне существующих в них молекул четырех разных цитохромов Р450, находящихся на разных стадиях топогенеза - очень сложно. Данная работа была направлена на поиск подходящей гетерологической модели для изучения деталей топогенеза и функционирования данного белка. Нами было создано несколько гетерологических систем экспрессии цитохрома P450scc и-других белков ХГ/Л системы млекопитающих in vivo и in vitro. Мы попытались выяснить возможности разных модельных систем для изучения указанных белков и системы в целом.

К моменту начала данной работы в отношении топогенеза P450scc было известно, что он синтезируется в цитоплазме стеридогенных клеток в виде предшественника, импортируется в митохондрии, подвергается в них протеолитическому процессингу и включается во внутреннюю митохондриальную мембрану. Эти данные были получены в, исследованиях с использованием синтезированного in vitro pP450scc и изолированных S митохондрий коры надпочечников [Ogishima et al., 1985]. На основании результатов, полученных при изучении импорта белка in vitro в митохондрии разных тканей (см., например, [Matocha, Waterman, 1986]), считалось, что топогенез цитохрома P450scc тканеспецифичен и в природе сборка комплекса белков ХГ/Л системы происходит только в стероидогенных клетках. В данной работе в модельной системе in vitro нам удалось осуществить импорт предшественника цитохрома P450scc с собственной или модифицированной N-концевой адресующей препоследовательностью в гетерологические митохондрии из разных источников (семядолей сои, печени и сердца крысы, дрожжей Candida valida и Saccharomyces cerevisiae). Наши данные и данные по экспрессии активного P450scc в COS-1 клетках [Zuber et al., 1988] продемонстрировали, что способность импортировать и процессировать pP450scc не является свойством, строго-присущим митохондриям стероидогенных тканей. Позже было показано, что цитохром P450scc действительно синтезируется и обеспечивает синтез важных биологически-активных стероидов не только в стероидогенных тканях, но и в клетках центральной и периферической нервной системы [Compagnone et al., 1995] и в сердечной ткани [Kayes-Wandover, White, 2000].

Использование трансгенных дрожжей, экспрессирующих предшественник P450scc и его рекомбинантные формы с разными адресующими препоследовательностями, оказалось непригодным для изучения деталей процесса топогенеза белка, в частности, включения цитохрома P450scc во внутреннюю мембрану митохондрий и его превращения в холо-фермент. В данной гетерологической системе pP450scc преимущественно накапливается в митохондриальном матриксе вместо того, чтобы включаться во внутреннюю мембрану, как это происходит в митохондриях коры надпочечников - лишь незначительная часть гетерологического белка встраивается в мембрану, приобретая нативную конформацию, в которой P450scc способен взаимодействовать с добавленными извне адренодоксином и адренодоксинредуктазой, проявляя ХГ/Л активность.

Используя модельную in vitro систему, мы установили, что топогенез P450scc в дрожжах S. cerevisiae существенно осложнен на стадиях сворачивания полипептидной цепи в митохондриях и/или включения белка в митохондриальную мембрану, и что критическим моментом его топогенеза является не собственно импорт pP450scc, а побочные процессы, имеющие место при импорте белка в митохондрии — протеолиз (под действием протеиназы Pimlp) и агрегация импортированного белка в матриксе, которые контролируются митохондриальной системой шаперонов mtHsp70/Mdjlp/Mgelp. То есть, топогенез pP450scc в дрожжах находится под контролем определенных регуляторных механизмов (включающих взаимодействие транспортирующих систем с механизмами, в которые вовлечены митохондриальные протеиназы).

Полученные результаты стимулировали поиск адресующих последовательностей дрожжевых белков, способствующих более эффективному встраиванию P450scc в мембрану дрожжевых митохондрий. При изучении поведения в митохондриях белка Su9(l 12)-ДР450, который эффективно связывался с внутренней мембраной, было обнаружено, что цитохром P450scc и в этом случае не приобретал нативной конформации и также подвергался протеолизу, но уже под действием связанного с внутренней мембраной протеолитического комплекса Ytal0p/Ytal2p (ш-ААА протеиназа).

Несмотря на то, что дрожжевая система гетерологической экспрессии оказалась неподходящей для изучения особенностей формирования и функционирования P450scc, при ее использовании нам удалось получить некоторые интересные результаты. Так, в данной работе впервые показано, что субстратные специфичности митохондриальных АТФ-зависимых протеиназ - растворимой протеиназы Pimlp и мембранной протеиназы Ytal0p/Ytal2p, перекрываются. Представленные данные предполагают существование универсального механизма удаления из митохондрий развернутых (неспособных свернуться в третичную структуру) полипептидных цепей, склонных к агрегации и, вследствие этого, представляющих помеху для функционирования митохондрий и жизнедеятельности клетки в целом.

Кроме того, впервые было изучено влияние массивных количеств чужеродных белков (P450scc и гибрида AdR-Ad), импортированных in vivo в дрожжевые митохондрии, на биогенез этих органелл и получены данные о том, какие количества импортированных гетерологических белков способны составить конкуренцию за шапероны и протеиназы с природными мишенями последних. Данные о том, что гибрид AdR-Ad, импортированный в матрикс дрожжевых митохондрий in vivo (не агрегируя в нем) в количестве до 0,2% от общего митохондриального белка, не влияет на развитие дыхательного аппарата клетки, но подавляет протеолиз и стимулирует агрегацию P450scc, включенного в те же митохондрии, свидетельствуют об ограниченных размерах фонда митохондриальных шаперонов и протеиназ, играющих ключевую роль в формировании дыхательных комплексов, что устанавливает определенные рамки для экспрессии гетерологических митохондриальных белков в дрожжах.

На следующем этапе работы мы изучали свойства цитохрома P450scc в модельной прокариотической системе - клетках Е. coli, синтезирующих зрелую форму данного белка. Поскольку P450scc бьш обнаружен не только в мембранной, но и в растворимой фракции рекомбинантных клеток, в первую очередь заслуживал внимания следующий вопрос: является ли встраивание в мембрану необходимым условием для правильного сворачивания полипептидной цепи цитохрома P450scc. При проведении детального анализа установлено, что в «растворимой» фракции активный цитохром P450scc находится исключительно в составе сложных липопротеидных частиц, следовательно, встраивание в мембрану является необходимой стадией топогенеза для формирования каталитически-активной конформации P450scc.

В связи с тем, что в бактериях в случае экспрессии митохондриальных белков нет необходимости экспрессировать белки-предшественники, возникают вопросы о структурно-функциональной организации этих белков в отсутствие митохондриальных адресующих последовательностей. Изучение характеристик зрелого P450scc в клетках Е. coli показало, что каталитические и спектральные свойства, а также ориентация в мембране P450scc, синтезирующегося в клетках бактерий, аналогичны характеристикам нативного белка. На основании того, что экспрессия зрелой формы белка (лишенной N-концевой препоследовательности) приводит к формированию активного фермента, можно заключить, что сворачивание полипептидной цепи цитохрома P450scc в митохондриях осуществляется после отщепления адресующей препоследовательности. Наши данные и данные Wada с соавт. [Wada et al., 1991] указывают на то, что клетки бактерий, синтезирующие цитохром P450scc млекопитающих, могут служить адекватной моделью для изучения процессов, обеспечивающих формирование мембранной холо-формы белка (внедрение в липидный бислой, присоединение гема, сворачивание полипептидной цепи mP450scc в каталитически-активную конформацию).

При экспрессии в клетках Е. coli модифицированных вариантов P450scc (Ad-P и Р-Ad) была предпринята попытка выяснить роль N- и С-концевых последовательностей полипептидной цепи P450scc в процессе ее сворачивания, сопровождающегося формированием гем-связывающего центра и участков связывания субстрата и Ad. Обнаружено, что модификация концевых участков полипептидной цепи P450scc не влияет на включение белка в цитоплазматическую мембрану и на эффективность связывания гема, однако, оказывает влияние на формирование гем-связывающего центра и каталитическую активность белка.

Кроме того, в данной работе впервые показана возможность функционального сопряжения цитохрома P450scc млекопитающих с электрон-транспортной системой Е. coli и, соответственно, возможность включения P450scc в метаболические пути бактерии.

Положительные результаты, полученные при сравнении свойств нативного и рекомбинантного P450scc, экспрессируемого в клетках Е. coli, позволяли надеяться, что в клетках микроорганизмов удастся реконструировать полную ХГ/Л систему.

Совместная экспрессия трех компонентов ХГ/Л системы в клетках микроорганизмов осуществлялась в данной работе с использованием трех подходов, используемых для коэкспрессии белков. При использовании полицистронных (тандемных) плазмид впервые получены клетки, в которых одновременно синтезируются рекомбинантные цитохром P450scc, AdR и Ad, которые локализуются в клетке аналогично нативным белкам и образуют активную ферментативную систему. К сожалению, ХГ/Л система, реконструированная из индивидуальных белков в клетках Е. coli, осуществляет биотрансформацию холестерина в прегненолон с низкой эффективностью. Пока непонятно, с чем это связано, возможными причинами могут являться недостаток кофакторов, необходимых для образования активных белков данной системы, неподходящее окружение во внутреннем компартменте клетки [Black et al., 1994; Headlam, Tuckey, 2000] или присутствие значительной части молекул рекомбинантных белков в клетках в неактивной форме в составе телец включения.

С учетом имевшихся в литературе данных (см. Главу II.3.2) с целью получения более активной системы цитохрома P450scc был использован другой, как казалось, наиболее простой методический подход для реконструкции системы — экспрессия гибридных (слитых) молекул, включающих белки-компоненты ХГ/Л системы, искусственно объединенные в единую полипептидную цепь. Конструирование гибридных белков представлялось перспективным как для получения информации о каталитических свойствах белков-компонентов в составе единой полипептидной цепи и механизме функционирования слитой полиферментной системы, так и с точки зрения биотехнологии - можно было надеяться, что искусственное объединение индивидуальных компонентов ХГ/Л системы в единую полипептидную цепь позволит избежать ряда сложностей в процессе ее формирования и, возможно, получить систему, обладающую более высокой активностью по сравнению с природной.

В данной работе впервые оценена удельная активность слитой холестерингидроксилазы/лиазы и осуществлено ее сравнение с активностью системы, реконструированной из изолированных P450scc, Ad и AdR. Обнаружено, что слияние последовательностей трех компонентов системы в общую полипептидную цепь приводит к получению не более, а значительно менее активной ХГ/Л системы, чем природная.

В работе по дизайну слитой холестерингидроксилазной/лиазной системы выявлен ряд общих проблем формирования и функционирования слитых полиферментных систем. Так, конформационная гибкость новой молекулы может оказаться недостаточной для эффективного взаимодействия каталитических доменов, либо, принимая необычную конформацию, искусственный белок может быть подвержен протеолизу, кроме того, в процессе сворачивания длинной полипептидной цепи могут возникать трудности как при связывании простетических групп и формировании активных центров доменов, так и при сворачивании самих доменов. t

При экспрессии разных вариантов слитой холестерингидроксилазы/лиазы нам не удалось получить эффективно функционирующую Р450зсс-систему, что делает нерациональным использование полученных штаммов в научных и практических целях.

Стало очевидным, что для реконструкции в клетках микроорганизмов ХГ/Л системы, обладающей высокой каталитической активностью, требуются другие экспериментальные подходы. Интересным объектом в качестве организма-хозяина нам представлялись «нетрадиционные» алкан-утилизирующие дрожжи Y. lipolytica, обладающие способностью к биотрансформации гидрофобных субстратов. Мы предполагали, что использование дрожжей Y. lipolytica для экспрессии цитохрома P450scc, Ad и AdR и, следовательно, для Р450-катализируемой конверсии гидрофобных ■ стероидных субстратов, может быть чрезвычайно продуктивным. В частности, такие данные были получены при экспрессии в клетках К lipolytica стероидтрансформирующего цитохрома Р450с17 [Juretzek et al., 2000; Shkumatov et al. 2006].

При конструировании рекомбинантных штаммов Y. lipolytica разработан новый подход для введения нескольких чужеродных кДНК в геном • дрожжей, включающий на первом этапе одновременную трансформацию гаплоидного штамма дрожжей смесью разных интегративных плазмид и на втором этапе - конструирование диплоидных штаммов с использованием гаплоидных трансформантов разного полового типа. ч

Используя этот подход, мы получили рекомбинантные штаммы Y. lipolytica, способные осуществлять коэкспрессию зрелых форм белков ХГ/Л системы (mP450scc, mAd и mAdR), а также коэкспрессшо белков ХГ/Л системы и цитохрома Р450с17, что позволяет осуществить сопряжение трансформации холестерина до прегненолона (прогестерона) с синтезом их 17а-гидроксилированных производных. Показано, что, используя указанный способ конструирования, можно получать трансгенные дрожжи Y. lipolytica, способные одновременно экспрессировать до 6 гетерологических белков, что может представлять интерес в плане реконструкции в дрожжах многокомпонентных полиферментных систем. К сожалению, пока в связи с низким уровнем экспрессии белков. ХГ/Л системы> данная модель не может быть использована для изучения топогенеза'и, функциональных свойств указанных белков, однако способность трансгенных штаммов осуществлять биотрансформацию стероидных субстратов свидетельствует о том, что экспрессируемые белки находятся в клетках Y. lipolytica в функционально активном v

СОСТОЯНИИ.

Настоящая работа и работа [Szczebara ' et al., 2003] показывают, что конструирование трансгенных дрожжей, синтезирующих активные зрелые формы белков Р4508сс-системы и обладающих способностью трансформировать холестерин (или его аналоги) в прегненолон, вполне реально.

Завершая анализ результатов, полученных в настоящем исследовании, можно заключить, что наиболее подходящей модельной системой для изучения топогенеза P450scc из использованных в данной работе является система на основе клеток Е. coli. В настоящее время она, в частности, успешно используется в нашей лаборатории для изучения» характера связывания P450scc с мембраной. Анализ литературных данных и собственных экспериментальных наблюдений позволяет утверждать, что при имеющемся, в природе многообразии полиферментных систем нельзя предсказать заранее, какой вариант гетерологической коэкспрессии белков будет оптимальным. Кроме того, необходимо учитывать, что свойства гетерологической системы в целом будут «корректироваться» ферментными системами клетки-хозяина. Очевидные преимущества алкан-утилизирующих «нетрадиционных» дрожжей Y. lipolytica в плане их использования для биотрансформации гидрофобных стероидных субстратов (в частности, как показано в данной работе, способность секретировать продукты биотрансформации в культуральную жидкость) позволяют предполагать, что эти дрожжи могут эффективно применяться в биотехнологии.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Новикова, Людмила Александровна, Москва

1. Азева Т., Гилеп А., Лепешева Г., Струшкевич Н., Усанов С. (2001) Сайт-направленный мутагенез цитохрома P450scc. Влияние замены остатков Arg425 и Arg426 на структурные и функциональные свойства цитохрома P450scc. Биохимия, 66(5), 564-575.

2. Гилевич С.Н., Гурьев О.Л., Шкуматов В.М., Чащин В.Л., Ахрем А.А. (1987) Сравнительноый анализ С27-стероид-гидроксилирующей системы из митохондрий печени быка. Биохимия, 52, 198-213.

3. Катцунг Б.Г. (1998) Базисная и клиническая фармакология. М.-СПб.: Бином-Невский Диалект, Т. 1, с. 608.

4. Клеменс М. Транскрипция и трансляция. Под ред. Хеймса Б. и Хиггинса С.М. М: Мир, 1987, стр. 282-288.

5. Ковалева И.Е., Гривенников С.И., Лузиков В.Н. (2000) О влиянии холестерина на поведение CYP11A1, импортированного в дрожжевые митохондрии in vivo. Биохимия, 65, 1425-1431.

6. Котельникова А.В., Звягильская Р.А. (1973) Биохимия дрожжевых митохондрий. Наука, Москва.

7. Лепешева Г.И., Усанов С.А. (1998) Сравнительная структурная и иммунохимическая характеристика рекомбинантного и природного цитохромов P450scc (CYP11А1). Биохимия, 63(2), 265-276.

8. Лузиков В.Н. (2009) Принципы контроля за формированием структур, осуществляющих дыхательные функции митохондрий. Успехи биол. химии, 49, 77-106.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Молекулярное клонирование. Мир, Москва.

10. Метелица Д.И. (1984) Моделирование окислительно-восстановительных ферментов, Наука и техника, Минск, с. 293.

11. Струшкевич Н.В., Азева Т.Н., Лепешева Г.И., Усанов С.А. (2005) Роль положительно заряженных остатков lys267, lys270, и arg411 цитохрома p450scc (CYP11A1) во взаимодействии с адронодоксином. Биохимия, 70, 664-671.

12. Турко И.В., Адамович Т.Б., Кириллова С.А., Усанов С.А., Чащин В.Л. (1988) Ковалентно связанный комплекс цитохрома Р450 с адренодоксином. Биохимия, 53, 18101816.

13. Чащин В.Л. (1985) Структура и функция монооксигеназных систем митохондрий коры надпочечников. Дисс. докт. хим. наук, Институт биоорганической химии АН Белоруси, Минск, с. 270.

14. Шкуматов В.М. (1991) Ферментные системы биосинтеза биологически активных веществ, содержащие цитохром Р-450. Дисс. докт. биол. наук, Институт Биохимии им. А.Н. Баха, Москва.

15. Шкуматов В.М., Усова Е.В., Фролова Н.С., Барт Г., Мауерсбергер Ш. (2006) Влияние модификаторов биосинтеза стероидов на биотрансформацию прогестерона рекомбинантными дрожжами, экспрессирующими цитохром Р450с17. Биомед. химия, 52, 298-308.

16. Шкуматов В.М., Радюк В.Г., Гапонова Г.И., Чащин BJL, Ахрем А.А., Сметан Г., Рукпауль К. (1988)' Ковалентно-сорбционная реконструкция стероидных гидроксилаз. Биохимия, 53, 1962-1971.

17. Шкуматов В.М., Усова Е.В., Радюк В.Г., Фролова Н.С., Райков А.В., Новикова Л. А., Назаров П.А., Друца B.JL, Лузиков В.Н. (2001) Новые подходы к синтезу стероидов Избранные научные труды БГУ, серия Химия, 5, 446-459.

18. Adams, D.J., Seilman, S., Amelizad, Z., Oesch, F., Wolf, C.R. (1985) Identification of human cytochromes P450 analogous to forms induced by phenobarbital and 3-methylcholanthrene in the rat. J. Biochem., 232, 869-876.

19. Agarwal, M.K. (1993) Receptors for mammalian steroid hormones in microbes and plants. FEBS Lett., 322,207-210.

20. Akhrem, A.A., Lapko, V.N., Lapko, A.G., Shkumatov, V.M., Chashchin, V.L. (1979) Isolation, structural organization and mechanism of action of mitochondrial steroid hydroxylating systems. Acta Biol. Med. Germ., 38, 257-273.

21. Akijama, S., Takahashi, S., Ishimori, K., Morishima, I. (2000) Stepwise formation of alpha-helices during cytochrome с folding. Nat. Struct. Biol. 7, 514-520.

22. Akiyoshi-Shibata, M., Sakaki, Т., Yabusaki, Y., Murakami, H., Ohkawa, H. (1991) Expression of bovine adrenodoxin and NADPH-adrenodoxin reductase cDNA in S.cerevisiae. DNA Cell Biol., 10,613-621.

23. Alberti, K.G.M.M., Bartley, W. (1969) The localization of proteolytic activity in rat liver mitochondria and its relation to mitochondrial swelling and aging. Biochem J., 11, 763-776

24. Amann, E., Ochs, В., Abel, K.-J. (1988) Tightly regulated tac promoter vectors useful for expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli. Gene, 69, 301-315.

25. Amerik, A.Y., Petukhova, G.V., Grigorenko, V.G., Lykov, I.P., Yarovoi, S.V., Lipkin, V.M., Gorbalenya, A.E. (1994) Cloning and sequence analysis of cDNA for a human homolog of eubacterial ATP-depen-dent Lon proteases. FEBS Lett, 340, 25-28.

26. Aoki, Y. (1978) Crystallization and characterization of a new protease in mitochondria of bone marrow cells. J. Biol. Chem., 253, 2026-2032.

27. Aoyama, Y, Yoshida, Y, Kubota, S, Kumaoka, H, Furumichi, A. (1978) NADPH-cytochrome P-450 reductase of yeast microsomes. Arch. Biochem. Biophys., 185, 362-369.

28. Arlt, H., Tauer, R., Feldmann. H„ Neupert, W., Langer, T. (1996) The YTA10-12 complex, an AAA protease with chaperone-like activity in the inner membrane of mitochondria. Cell, 85, 875-885.

29. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998

30. Azhar, S., Leers-Sucheta, S., d Raven, E. (2003) Cholesterol uptake in adrenal and gonadal tissues: The SR-BI «selective» pathhway connection. Front. Biosci., 8, s998-1029.

31. Azhar, S., Reaven, E. (2002) Scavenger receptor class BI and selective cholesteryl ester uptake: partners in the regulation of steroidogenesis. Mol. Cell. Endocrinol., 195, 1-26.

32. Banecki, В., Zylicz, M. (1996) Real time kinetics of the Dna/DnaJ/GrpE molecular chaperone machine action. J. Biol. Chem., 271, 6137-6143.

33. Barros, M.H., Nobrega, F.G. (1999) YAH1 of Saccharomyces cerevisiae: a new essential gene that codes for a protein homologous to human adrenodoxin. Gene, 233, 197-203.

34. Barth, G., Gaillardin, C. (1996) Yarrowia lipolytica. In Nonconventional yeasts in biotechnology (Wolf, K., ed.), A Handbook, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp. 313-388.

35. Bauer, M.F., Sirrenberg, C., Neupert, W., Brunner, M. (1996) Role of Tim23 as voltage sensor and presequence receptor in protein import into mitochondria. Cell, 87, 33-41.

36. Bergkamp, R.J., Kool, I.M., Geerse, R.H., Planta, R.J. (1992) Multiple-copy integration of the alpha-galactosidase gene from Cyamopsis tetragonoloba into the ribosomal DNA of Kluyveromyces lactis. Curr. Genet., 21, 365-370

37. Bernhard, R. (2006) Cytochrome P450 as versatile biocatalysts. J. Biotechnol., 124, 128145.

38. Bernhardt, R. (1995). Cytochrome P450: structure, function, and generation of reactive oxygen species. Re.v Physiol. Biochem. Pharmacol., 127:137-221.

39. Birboim, H.C., Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Asids Res., 76, 1513-1522.

40. Black, S.M., Harikrishna, J.A., Szklarz, G.D., Miller, W.L. (1994) The mitochondrial environment is required for activity of the cholesterol side-chain cleavage enzyme cytochrome P450scc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7247-7251.

41. Blobel, G. (1980) Intracellular protein topogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 496500.

42. Boeke, J.D., Xu, H., Fink, G.R. (1988) A general method for the chromosomal amplification of genes in yeast. Science, 239, 280-282.

43. Bohnert, M., Pfanner, N., van der Laan, M. (2007) A dynamic machinery for import of mitochondrial precursor proteins. FEBS Lett., 581, 2802-2810.

44. Bolliger, L., Deloche, O., Glick, B.S., Georgopoulos, C., Jeno, P., Kronidou, Horst, M., Morishima, N., Schatz, G. (1994) A mitochondrial homolog of terial GrpE interacts with mitochondrial hsp70 and is essential for viability. EMBOJ, 13, 1998-2006.

45. Boutry, M., Nagy, .F, Poulsen, C., Aoyagi, K., Chua, N.H. (1987) Targeting of bacterial chloramphenicol acetyltransferase to mitochondria in transgenic plants. Nature. 328, 340-342.

46. Brandriss, M.C., Krzywicki, K.A. (1986) Amino-terminal fragments of delta 1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase direct beta-galactosidase to the mitochondrial matrix in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol,. 6, 3502-3512.

47. Brandt, M.E., Vickery, L.E. (1992) Expression and characterization of human mitochondrial ferredoxin reductase in Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys., 294, 735-740.

48. Brueggemeier, R.W., Hackett, J.C., Diaz-Cruz, E.S. (2005) Aromatase inhibitors in the treatment of breast cancer. Endocr. Rev., 26, 331-345.

49. Brunoa, R.D., Njar., V.C.O. (2007) Targeting cytochrome P450 enzymes: a new approach in anti-cancer drug development. Bioorg. Med. Chem., 15, 5047-5060.

50. Cao, P., Bernhardt, R. (1999) Interaction of CYP11B1 (cytochrome Р-450цР) with CYP11A1 (cytochrome P-450scc) in COS-1 cells. Eur. J. Biochem., 262, 720-726.

51. Cao, P.R., Bulow, H., Dumas, В., Bernhardt, R (2000) Construction and characterization of a catalytic fusion protein system: P-450(l 1 beta)-adrenodoxin reductase-adrenodoxin. Biochim. Biophys. Acta, 1476, 253-264.

52. Cauet, G., Balbuema, D., Achstetter, Т., Dumas, B. (2001) CYP11A1 stimulates the hydroxylase activity of CYP11B1 in mitochondria of recombinant yeast in vivo and in vitro. Eur. J. Biochem., 268, 4054-4062.

53. Chacinska, A., Lind, M., Frazier, A.E., Dudek, J., Meisinger, C., Geissler, A., Sickmann,и

54. A., Meyer, H.E., Truscott, K.N., Guiard, В., Pfanner, N. Rehling, P. (2005) Mitochondrial presequence translocase: swithing between TOM tethering and motor recruitment involves Tim21 and Timl7. Cell, 120, 817-829.

55. Chashchin, V.L., Usanov, S.A., Lapko, V.N., Adamovich, T.B., Shkumatov, V.M., Akhrem, A.A. (1986) Chemistry of Peptides and Proteins (Voelter, W., Bayer, E., Ovchinnikov, Yu., Ivanov, V., eds.), Berlin -New York: Walter de Greyter and Co, pp. 177-189.

56. Chaurasia, C.S., Alterman, M.A., Lu, P., Hanzlik, R.P. (1995) Biochemical characterization of lauric acid omega-hydroxylation by а СYP4A1 /NADPH-cytochrome P450 reductase fusion protein. Arch. Biochem. Biophys., 317, 161—169.

57. Chen, C.D, Doray, В., Kemper, B. (1998) A conserved proline-rich sequence between the N-terminal signal-anchor and catalytic domains is required for assembly of functional cytochrome P450 2C2. Arch. Biochem. Biophys., 350, 233-238.

58. Cheng, M.Y., Pollock, R.A., Hendrick, J.P., Horwich, A.L. (1987) Import and processing of human ornithine transcarbamoylase precursor by mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA. 84(12):4063-4067.

59. Cheng, M.Y., Haiti, F.U., Horwich, A.L. (1990) The mitochondrial chaperonin hsp60 is required for its own assembly. Nature, 348, 455-458.

60. Churchill, P.F., Kimura, T. (1979) Topological studies of cytochromes P-450scc and P-45011 beta in bovine adrenocortical inner mitochonrial membranes. Effects of controlled tryptic digestion. J. Biol. Chem., 254, 10443-10448.

61. Cirigliano, M.C., Carman, G.M. (1984) Isolation of a bioemulsifier from Candida lipolytica. Appl. Environ. Microbiol., 48, 747-750.

62. Coghlan, V.M., Vickery, L.E., (1991) Site-specific mutations in human ferredoxin that affect binding to ferredoxin reductase and cytochrome P450scc. J Biol Chem., ;266, 1860618612.

63. Compagnone, N.A., Bulfone, A., Rubenstein, J.L., Mellon, S.H., (1995) Expression of the steroidogenic enzyme P450scc in the central and peripheral nervous systems during rodent embryogenesis. Endocrinology, 136,2689-2696.

64. Confalonieri, F., and Duguet, M. (1995) A 200-amino acid ATPase module in search of a basic function. BioEssays, 17, 639-650.

65. Constantino, P., Attardi, G. (1977) Metabolic properties of the products of mitochondrial protein synthesis in HeLa cells. J Biol Chem., 252,1702-1711

66. Coon, M.J., Vaz, A.D.N., McGinnity, F., Peng, H.-M. (1998) Multiple activated oxygen species in P450 catalysis. Drug Metab. Dispos., 26, 1190-1193.

67. Cullin, C., Pompon, D. (1988) Synthesis of functional mouse cytochromes P450 PI and chimeric P450 P3-1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Gene, 65, 203-217.

68. D'Silva, P.D., Schilke, В., Walter, W., Craig, E.A. (2005) Role of Paml6's degenerate J domain in protein import across the mitochondrial inner membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102,12419-12424.

69. De Leij, L. Witholt, B. (1977) Structural heterogeneity of the cytoplasmic and outer membranes of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 471, 92-104.

70. Degtyarenko, K.N., Archakov, A.I. (1993) Molecular evolution of P450 superfamily and P450-containing monooxygenase systems. FEBS Lett., 332, 1-8.

71. Desautels, M. (1986) Mitochondrial proteolysis. In: Fiskum, G. (ed) Mitochondrial physiology and pathology. Van Nostrand Rein-hold, New York, pp 40-65.

72. Desautels, M. Goldberg, A.L. (1982a) Demonstration of an ATP-dependent, vanadate-sensitive endoprotease in the matrix of rat liver mitochondria. J. Biol. Chem., 257, 11673-11679.

73. Desautels, M, Goldberg, A.L. (1982b) Liver mitochondria contain an ATP-dependent, vanadate-sensitive pathway for the degradation of proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 79, 18691873.

74. Deshavies, R.J., Schenkman, R. (1987) A yeast mutant defective at an early stage in import of secretory protein precursors into the endoplasmic reticulum. Ad. J. Cell Biol., 105(2), 633-645.

75. Dilworth, F.J., Black, S.M., Guo, Y.D., Miller, W.L. (1996) Construction of a P450c27 fusion enzyme: a useful tool for analysis of vitamin D3 25-hydroxylase activity. Biochem. J., 320, 267-271.

76. Dong, J., Porter, T.D. (1996) Coexpression of mammalian cytochrome P450 and reductase in Escherichia coli. Arch Biochem Biophys, 327(2), 254-259.

77. Dower, W.J., Mille,r J.F., Ragsdale, C.W. (1988) High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res., 16, 6127-6145

78. Dragan, C.A., Hartmann, R.W., Bureik, M. (2006) A fission yeast-based test system for the determination of IC50 values of anti-prostate tumor drugs acting on CYP21. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 21, 547-556.

79. Dragan, C.-A., Zearo, S., Hannemann, F., Bernhardt, R., Bureik, M. (2005) Efficient conversion of 11-deoxycortisol to Cortisol (hydrocortisone) by recombinant fission yeast Schizosaccharomacespombe. FEMS Yeast Res, 5, 621-625

80. Duport, C., Schoepp, В., Chatelain, E., Spagnoli, R., Dumas, В., Pompon, D. (2003) Critical role of the plasma membrane for expression of mammalian mitochondrial side chain cleavage activity in yeast. Eur. J. Biochem., 270(7), 1502-1514.

81. Duport, C., Spagnoli, R., Degryse, E., Pompon, D. (1998) Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast. Nat. Biotechnol., 16, 186-189.

82. Endo, Т., Eilers, M., Schatz, G. (1989) Binding of a tightly folded artificial mitochondrial precursor protein to the mitochondrial outer membrane involves a lipid-mediated conformational change. J. Biol. Chem., 264(5), 2951-2956.

83. Estabrook, R.W., Shet, M.S., Faulkne, K., Fisher C.W. (1996). The use of electrochemistry for the synthesis of 17 alpha-hydroxyprogesterone by a fusion protein containing P450cl7. Endocr. Res., 22, 665-671.

84. Fersht, A.R. (1997) Nucleation mechanisms in protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol., 7, 3-9.

85. Fickers, P., Benetti, P.H., Wache ,Y., Marty, A., Mauersberger, S., Smit, M.S., Nicaud, J.M. (2005) Hydrophobic substrate utilization by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications. FEMS Yeast Res, 5, 527-543.

86. Flores, C.L., Gancedo, C. (2005) Yarrowia lipolytica mutants devoid of pyruvate carboxylase activity show an unusual growth phenotype. Eukaryot Cell., 4(2), 356-364.

87. Forster A. (2001) Untersuchungen zur heterologen Expression von steroidwandelnden Cytochrom P450 Systemen in der Hefe Yarrowia lipolytica. Diploma thesis, Institute of Microbiology, Technische Universitat Dresden.

88. Forster A., Aurich A., Mauersberger S., Barth G. (2007) Citric acid production from sucrose using a recombinant strain of the yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol., 75, 1409-1417.

89. Fujita, K., Kamataki, T. (2002) Genetically engineered bacterial cells co-expressing human cytochrome P450 with NADPH-cytochrome P450 reductase: prediction of metabolism and toxicity of drugs in humans. Drug Metab. Pharmacokinet., 17, 1-22.

90. Gambill, B.D., Voos, W., Kang, P.J., Miao, В., Langer, Т., Craig, E.A., Pfanner, N. (1993) A dual role for mitochondrial heat shock protein 70 in membrane translocation of preproteins. J. Cell Biol., 123, 109-117.

91. Gatti, D.L., Tzagoloff, A. (1990) Structure and function of the mitochondrial bcl complex. Properties of the complex in temperature-sensitive corlmutants. J. Biol. Chem., 265, 2146821475.

92. Gavel, Y., von Heijne, G. (1990) Cleavage-site motifs in mitochondrial targeting peptides. Protein Eng., 4, 33 37.

93. Gerber, J (1999) Untersuchungen zur Optimierung des Elektronentransportsystems fur die Cytochrom P450 katalysierte Biotransformation von Steroiden in Yarrowia lipolytica. Diplomarbeit, Institut fur Mikrobiologie, TU Dresden.

94. Gizard, F., Lavallee, В., DeWitte, F., Hum, D.W. (2001) A novel zinc finger protein TReP-132 interacts with CBP/рЗОО to regulate human CYP11A1 gene expression. J Biol Chem., 276(36), 33881-33892.

95. Glover, L.A., Lindsay, J.G., (1992) Targeting proteins to mitochondria: a current overview. Biochem J., 284(Pt 3), 609-620.

96. Gomez-Lechon, M.J., Donato, M.T., Castell, J.V., Jover, R. (2004) Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Curr. Drug Metab., 5, 443462.

97. Gotoh, O. (1992) Substrate recognition sites in cytochrome P450 family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences. J. Biol. Chem., 267, 83-90.

98. Graham-Lorence, S., Peterson, J.A. (1996) P450s: structural similarities and functional differences. FASEBJ., 10, 206-214.

99. Grallert, H., Rutkat, K., Buchner, J. (2000) Limits of protein folding inside GroE complexes. J. Biol. Chem., 275, 20424-20430.

100. Grinberg, A.V., Hannemann, F., Schiffler, В., Muller, J., Heinemann, U., Bernhardt, R. (2000) Adrenodoxin: structure, stability, and electron transfer properties. Proteins, 40, 590-612.

101. Grivell, L.A. (1989) Nucleo-mitochondrial interactions in yeast mitochondrial biogenesis. Eur. J. Biochem., 182, 477-493.

102. Grivell, L.A. (1995) Nucleo-mitochondrial interactions in mitochondrial gene expression. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 30, 121-164.

103. Guengerich, F.P., Gillam, E.M., Ohmori, S„ Sandhu, P., Brian, W.R., Sari, M.A., Iwasaki, M. (1993) Expression of human cytochrome P450 enzymes in yeast and bacteria and relevance to studies on catalytic specificity. Toxicology, 82, 21-37.

104. Guengerich, F.P. (2001) Uncommon P450-catalyzed reactions. Current Drug Metab., 2, 93-115.

105. Guo, I.C., Shin, M.C., Lan, H.C., Hsu, N.C., Ни, M.C., Chung, B.C. (2007) Transcriptional regulation of human CYP11A1 in gonads and adrenal. J. Biomed. Sci., 14, 509515.

106. Gupta, M.K., Guryev, O.L., Auchus, R.J. (2003) 5alpha-reduced C21 steroids are substrates for human cytochrome P450cl7. Arch. Biochem. Biophys., 418, 151-160.

107. Haas, R., Heinrich, P.C. (1978) The localization of an intracellular membrane-bound proteinase from rat liver. Eur. J. Biochem., 91, 171-178.

108. Hakki, Т., Bernhardt, R. (2006) CYP17- and CYP1 IB-dependent steroid hydroxylases as drug development targets. Pharmacol. Ther., Ill, 27-52.

109. Hall PF (1984). Cellular organization for steroidogenesis. Int. Rev. Cytol., 86, 53-95.

110. Hanukoglu, I., Suh, B.S., Himmelhoch, S., Amsterdam, A. (1990) Induction and mitochondrial localization of cytochrome P450scc system enzymes in normal and transformed ovarian granulosa cells. J Cell Biol., 111(4):1373-1381

111. Hanukoglu, I., Hanukoglu, Z. (1986) Stoichiometry of mitochondrial cytochromes P450, adrenodoxin, NADPH-cytochrome P450 reductase. Eur. J. Biochem., 157, 27-31. 1

112. Hare, J.F. (1978) A novel proteinase associated with mitochondrial membranes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 83, 1206-1215.

113. Hare, J.F., Hodges, R. (1982) Turnover of mitochondrial inner membrane proteins in hepatoma monolayer cultures. J. Biol Chem., 257, 3575-3580.

114. Hare, J.F. (1990) Mechanisms of membrane protein turnover. Biochim. Biophys. Acta, 1031, 71-90.

115. Harikrishna, J.A., Black, S.M., Szklarz, G.D., Miller, W.L. (1993) Construction and function of fusion enzymes of the human cytochrome P450scc system. DNA Cell Biol., 12, 5, 371-379.

116. Hauet Т., Liu J., Li H., Gazouli M., Culty M., Papadopoulos V. (2002) PBR, StAR, and PKA: partners in cholesterol transport in steroidogenic cells. Endocr. Res., 28, 395-401.

117. Headlam, M.J., Tuckey, R.C. (2002) The effect of glycerol on cytochrome P450scc (CYP11 Al) spin state, activity, and hydration. Arch. Biochem. Biophys., 407, 95-102.

118. Headlam, M.J., Wilce, M.C., and Tuckey, R.C. (2003) The F-G loop region of cytochrome P450scc (CYP11A1),interacts with the phospholipid membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1617, 96-108.

119. Helvig, C., Capdevila, J.H. (2000) Biochemical characterization of rat P450 2C11 fused to rat or bacterial NADPH-P450 reductase domains. Biochemistry, 39, 5196-5205.

120. Herman С., Thevenet D., Dari R., Bouloe P. (1995) Degradation of cj32, the heat-shock regulator in Escherichia coli is governed by HflB. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92, 3516-3520.

121. Herrmann, J.M., Folsch, H., Neupert, W., Stuart, R.A. (1994a) in Cell Biology: A Laboratory Handbook, Vol. 1 (Celis, D.E., ed) pp. 538-544, Academic Press, Inc., San Diego.

122. Higman, M.A., Christen, L.A., Niles, E.G. (1994) The mRNA (guanine-7-)methyltransferase domain of the vaccinia virus mRNA capping enzyme. J. Biol. Chem., 269(21), 14974-14981.

123. Hiwatashi, A., Ichikawa, Y. (1982) Purification and properties of tightly bound reduced NADPH-adrenodoxin reductase of bovine adrenocortical mitochondria. J. Biochem., 92, 2, 335342.

124. Hoffman, C.S„ Winston, F. (1987) A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene 57:267-272.

125. Hoogenraad, N.J., Ward, L.A., Ryan, M.T. (2002) Import and assembly of proteins into mitochondria of mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta, 1592, 97-105.

126. Horie, S., Watanabe, T. (1975) Properties of high spin type P-450 preparation from bovine adrenal cortex mitochondria. J. Steroid Biochem., 6(3-4), 401-409.

127. Horst, M., Hilfiker-Rothenfluh, S., Oppliger, W., Schatz, G. (1995) Dynamic interaction of the protein translocation systems in the inner and outer membranes of yeast mitochondria. EMBOJ., 14, 2293-2297.

128. Ни, M.C., Hsu, N.C., Pai, C.I., Wang, C.K., Chung, B. (2001) Functions of the upstream and proximal steroidogenic factor 1 (SF-l)-binding sites in the CYP11A1 promoter in basal transcription and hormonal response. Mol. Endocrinol., 15, 812-828/

129. Huang S., Ratliff K.S., Matouschek A. (2002) Protein unfolding by the mitochondrial membrane potential. Nat. Struct. Biol., 9, 301-307.

130. Huang, M.C., Miller, W.L. (2001) Creation and activity of COS-1 cells stably expressing the F2 fusion of the human cholesterol side-chain cleavage enzyme system. Endocrinology, 142(6), 2569-2576.

131. Hurt E.C., Goldschmidt-Clermont M., Pesold-Hurt В., Rochaix J.D., Schatz G. (1986) A mitochondrial presequence can transport a chloroplast-encoded protein into yeast mitochondria. J Biol Chem, 261(25), 11440-11443.

132. Hutchinson, E.G., Tichelaar, W., Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K.R. (1989) Identification and electron microscopic analysis of a chaperonin oligomer from Neurospora crassa mitochondria. EMBOJ., 8, 1485-1490.

133. Ingelman, M., Bianchi, V., Eklund, H. (1997) The three-dimensional structure of flavodoxin reductase from Escherichia coli at 1.7 A resolution. J. Mol. Biol., 268, 147-157.

134. Ishimura, К., Fujita, H. (1997) Light and electron microscopic immunohistochemistry of the localization of adrenal steroidogenic enzymes. Microsc. Res. Tech., 36(6), 445-453.

135. Jindal; S., Dudani, A.K., Singh, В., Harley, C.B., Gupta, R.S. (1989) Primary structure of a human mitochondrial protein homologous to the bacterial and plant chaperonins and to the 65-kilodalton mycobacterial antigen. Mol. Cell. Biol., 9, 2279-2283.

136. John, M.E., John, M.C., Ashley, P., MacDonald, R.J., Simpson, E.R., Waterman, M.R. (1984) . Identification and characterization of cDNA clones specific for cholesterol side-chain cleavage cytochrome P-450. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5628-5632

137. Jordan, R., and McMacken, R. (1995) Modulation of the ATPase activity of e molecular chaperone DnaK by peptides and the DnaJ and GrpE heat shock oteins. J. Biol. Chem., 270, 4563-4569.

138. Jose, J., Bernhardt, R., Hannemann, F. (2001) Functional display of active bovine adrenodoxin on the surface of E. coli by chemical incorporation of the 2Fe-2S. cluster. Chembiochem., 2(9),695-701.

139. Joseleau-Petit, D., Kepes, A. (1975) A novel electrophoretic fractionation of Escherichia coli envelopes. Biochim. Biophys. Acta, 406, 36-49.

140. Juretzek, Т., Le Dall, M.T., Mauersberger, S., Gaillardin, C., Barth, G., Nicaud, J.M. (2001) Vectors for gene expression and amplification in the yeast Yarrowia lipolytica. Yeast, 18, 97-113.

141. Juretzek, Т., Mauersberger, S., Schunck, W-H., Nicaud, J.-M., Barth, G. (1999) Functional expression of heterologous cytochrome P450 in the yeast Yarrowia lipolytica and its use in biotransformation of steroids. Current Genetics, 35, 307-311.

142. Kakuta, Y., Horio, Т., Takahashi, Y., Fukuyama, K. (2001) Crystal structure of Escherichia coli Fdx, an adrenodoxin-type ferredoxin involved in the assembly of iron-sulfur clusters. Biochemistry, 40, 11007-11012.

143. Kamerbeek, N.M., Janssen, D.B., van Berkel, W.J.H., Fraaije, M.W. (2003) Substrate specificity and enantioselectivity of 4-hydroxyacetophenone monooxygenase. Adv. Synth. Catal., 6-7, 106-120.

144. Kamin, H., Batie, C., Lambeth, J.D., Lancaster J., Graham, L., Salerno, J.C. (1985) Paramagnetic probes of multicomponent electron-transfer systems. Biochem Soc Trans., 13(3), 615-618.

145. Kang, P.-J., Osterman, J., Shilling, J., Neupert, W., Craig, E., Pfanner, N. (1990) Requirement for hsp70 in the mitochondrial matrix for translocation and folding of precursor proteins. Nature, 348, 137-143.

146. Kayes-Wandover, K.M., White, P.C. (2000) Steroidogenic enzyme gene expression in the human heart. J. Clin. Endocrinol. Metab., 85, 2519-2525.

147. Kemper, B. (2004) Structural basis for the role in protein folding of conserved proline-rich regions in cytochromes P450. Toxicol. Appl. Pharmacol., 199, 305-319.

148. Kiebler, M., Pfaller, R., Sollner, Т., Griffiths, G., Horstmann, H., Pfanner, N., and Neupert, W. (1990) Identification of a mitochondrial receptor complex required for recognition and membrane insertion of precursor proteins. Nature, 348, 610-616.

149. Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. (1995) FtsH is required for proteolytic elimination of uncomplexed forms of SecY, an essential protein translocase subunit. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 4532-4536.

150. Knoell, H.E., Knappe, J. (1974) Escherichia coli ferredoxin, an iron-sulfur protein of the adrenodoxin type. Eur. J. Biochem., 50, 245-252.

151. Kostic, M., Pochapsky, S.S., Obenauer, J., Mo, H., Pagani, G.M., Pejchal, R., Pochapsky,i

152. T.C. (2002) Comparision of functional domains in vertebrate-type ferredoxin. Biochemistry, 41, 5978-5989.

153. Kozlov, D.G., Prahl, N. Efremov, B.D., Peters, L., Wambut, R., Kaprychev, I.V.,-Eldarov, M.A., Benevolensky, S.V. (1995) Host cell properties and external pH affect proinsulin production by Saccharomyces yeast. Yeast, 11, 8, 713-724.

154. Kraemer, F.B., Shen, W.J. (2002) Hormone-sensitive lipase: control of intracellular tri-(di-)-acylglicerol and cholesteryl ester hydrolysis. J. Lipid Res., 43, 1585-1594.

155. Kruse, K., Forster, A., Juretzek T, Mauersberger, S., Barth, G. (2004) Method for the biotechnological production of citric acid by means of a genetically modified yeast Yarrowia lipolytica. W02004/009828, DE10333144.

156. Krynetski, E.Yu., Drutsa, V.L., Kovaleva, I.E., Luzikov, V.N. (1995) High yield expression of functionally active human liver CYP2D6 in yeast cells. Pharmacogenetics, 5, 103109.

157. Kusano, K., Kagawa, N., Sakaguchi, M., Waterman, M.R., Omura, T. (2001a) Microsomal p450s use specific proline-rich sequences for efficient folding, but not for maintenance of the folded structure. J. Biochem. (Tokyo), 129, 259-269.

158. Kusano, K., Kagawa, N., Sakaguchi, M., Omura, Т., Waterman, M.R. (20016) Importance of a proline-rich sequence in the amino-terminal region for correct folding of mitochondrial and soluble microbial p450s. J. Biochem. (Tokyo,) 129, 271-277.

159. Kutejova, E., Durcova,.G., Surovkova, E., Kuzela, S. (1993) Yeast mitochondrial ATP-dependent protease purification and comparison with the homologous rat enzyme and the bacterial ATP-dependent protease La. FEBSLett., 329, 47-50.

160. Kutik, S., Guiarad, В., Meyer, H., Wiedemann, N., Pfanner, N. (2007) Cooperation of translocase complexes in mitochondrial protein import. J. Cell. Biol., 179, 585-591.

161. Lacapere, J.J., Papadopoulos, V. (2003) Peripheral-type benzodiazepine receptor: structure and function of a cholesterol-bonding protein in steroid and bole acid biosynthesis. Steroids, 68, 569-585.

162. Lacour, Т., Achstetter, Т., Dumas, B. (1998) Characterization of recombinant adrenodoxin reductase homologue (Arhlp) from yeast. Implication in in vitro cytochrome p4501 lbeta monooxygenase system. J. Biol. Chem., 273,23984-23992.

163. Lacour, Т., Ohkawa, H. (1999) Engineering and biochemical characterization .of the rat microsomal cytochrome P4501A1 fused to ferredoxin and ferredoxin-NADP(+) reductase from plant chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 1433, 87-102.

164. Ladokhin, A.S., White, S.H. (2001) Protein chemistry at membrane interfaces: non-additivity of electrostatic and hydrophobic interactions. JMol Biol., 309(3), 543-552.

165. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural protein during the assembly of the head bacteriophage T-4. Nature, 227, 680-685.

166. Lala, D.S., Rice, D.A., Parker, K.L. (1992) Steroidogenic factor I, a key regulator of steroidogenic enzyme expression, is the mouse homolog of fushi tarazu-factor I. Mol Endocrinol., 6, 1249-1258.

167. Lambeth, D., Kamin, H. (1976) Properties of complexes of reduced enzime with NADP+ and NADPH. J. Biol. Chem., 251, 4299-4306.

168. Lambeth, D., Seybert, D., Kamin, H. (1980) Adrenodoxin reductase adrenodoxin complex rapid formation and breakdown of the complex and a slow conformational change in the flavoprotein. J. Biol Chem., 255,4667-4672.

169. Lambeth, J.D., Seybert, D.W., Kamin, H. (1979) Ionic effects on adrenal steroidogenic electron transport. The role of adrenodoxin as an electron shuttle. J. Biol Chem., 254, 72557264/

170. Langer, T. (2000) AAA proteases: cellular machines for degrading membrane proteins. Trends Biochem. Sci., 25, 247-251.

171. Langer, Т., Lu, C, Echols, H., Flanagan, J., Hayer, M.K., Haiti, F.-U. (1992) Successive action of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of haperone-mediated protein folding. Nature, 356, 683-689.

172. Le Dall, M.T., Nicaud, J.M., Gaillardin, C. (1994) Multiple-copy integration in the yeast Yarrowia lipolytica. Curr Genet., 26(1), 38-44.

173. Leonhard, K., Sriegler, A., Neupert, W., Langer, T. (1999) Chaperone-like activity of the AAA domain of the yeast Ymel AAA protease. Nature, 398, 348-351.

174. Lewis, D.F., Lee-Robichaud, P. (1998) Molecular modelling of steroidogenic cytochromes P450 from families CYP11, CYP17, CYP19 and CYP21 based on the CYP102 crystal structure. J Steroid Biochem. Mol. Biol., 66\ 217-233.

175. Light, D., Walsh, C. (1980) Flavin analogs as mechanistic probes of adrenodoxin reductasedependent electron transfert of the cholesterol side chain cleveage cytochrome P-450 of the adrenal cortex. J. Biol. Chem., 255,4264-4477.

176. Lill, R., Neupert, W. (1996) Mechanisms of protein import across the mitochondrial outer membrane. Trends Cell Biol., 6, 56-61.

177. Lin, D., Shi Y., Miller, W.L. (1990) Cloning and sequence of the human adrenodoxin reductase gene. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87, 1955-1962.

178. Lin, H.L., Kent, U.M., Hollenberg, P.F. (2002) Mechanism-based inactivation of cytochrome P450 3A4 by 17 alpha-ethynylestradiol: evidence for heme destruction and covalent binding to protein. J. Pharmacol. Exp. Ther., 301,160-167.

179. Liu J., Rone, M.B., Papadopoulos, V. (2006) Protein-protein interactions mediate mitochondrial cholesterol transport and steroid biosynthesis. J. Biol. Chem., 281, 38879-18893.

180. Liu, Z., Simpson, E.R. (1999) Molecular mechanism for cooperation between Spl and steroidogenic factor 1 (SF-1) to regulate bovine CYP11A gene expression. Mol. Cell. Endocrinol., 153, 183-196.

181. Lopes, T.S., de Wijs, I.J., Steenhauer, S.I., Verbakel, J., Planta, R.J. (1996) Factors affecting the mitotic stability of high-copy-number integration into the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 12,467-477.

182. Lopes, T.S., Hakkaart, G.J., Raue, H.A., Planta, R.J. (1991) Mechanism of high-copy-number integration of pMIRY-type vectors into the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae. Gene, 105, 83-90.

183. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L., Randal, R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193,265-270.

184. Luciakova, K. Kuzela, S (1992) Increased steady state levels of several mitochondrial and nuclear gene transcripts in rat hepatoma with a low content of mitochondria. Eur J Biochem., 205, 1187-1193

185. Luft, F.C. (2001) Steroidogenesis and CYP enzymes. J. Mol. Med., 79, 549-550.

186. Luster, M.I., Lawson, L.D., Linko, P., Goldstein, J.A. (1983) Mitochondrial unique protein of rat steroidogenic tissues: Stoichiometry and localisation. Mol. Pharmacol., 23(1), 252257.

187. Luzikov, V.N. (1985) Mitochondrial biogenesis and breakdown. Plenum Press, New York.229; Luzikov, V.N. (1986) Proteolytic control over topogenesis of membrane proteins. FEBS Lett, 200, 259-264.

188. Maarse, A.C., Blom, J., Grivell, L.A., Meijer, M. (1992) MPI1, an essential gene encoding a mitochondrial membrane protein, is possibly involved in protein import into yeast mitochondria. EMBO J., 11, 3619-3628.

189. Maarse, A.C., Blom, J., Keil, P., Pfanner, N., Meijer, M. (1994) Identification of the essential yeast protein MIM 17, an integral mitochondrial inner membrane protein involved in protein import. FEBS Lett., 349, 215-221.

190. Mackett, M., Smith, G.L., Moss, B. (1984) General method for production and selection of infectious vaccinia virus recombinants expressing foreign genes. J. Virol., 49, 857-864.

191. Mandai, Т., Fujiwara, S., Imaoka, S. (2009) Construction and engineering of a thermostable self-sufficient cytochrome P450. Biochem. Biophys. Res. Commun., 384, 61-65.

192. Mandel, M., Higa, A. (1970) Calcium dependent bacteriophage DNA infection J. Mol. Biol., 53, 154.

193. Manna, P.R., Stocco, D. (2005) Regulation of the steroidogenic acute regulatory protein expression: functional and physiological consequences. Curr. Drug Targets Immune Endoc. Metab. Disord., 5, 93-108.

194. Manning-Krieg, U., Scherer, P.E., Schatz, G. (1991) Sequential action of mitochondrial chaperones in protein import into the matrix. EMBOJ., 10, 3273-3280.

195. Mansuy, D. (1998) The great diversity of reactions catalyzed by cytochromes P450. Сотр. Biochem. Physiol., Part C: Pharmacol., Toxicol. Endocrinol., 121, 5-14.

196. Manzella, L., Barros, M.H., Nobrega, F.G. (1998) ARH1 of Saccharomyces cerevisiae: a new essential gene that codes for a protein homologous to the human adrenodoxin reductase. Yeast, 14, 839-846.

197. Marg, A., Kuban, R.J., Behlke, J., Dettmer, R., Ruckpaul, K. (1992) Crystallization and X-ray examination of bovine adrenodoxin. J. Mol. Biol., 227, 945-947.

198. Marver, H.S., Collins, A., Tschudy, D.P., Rechcigl, M. (1966) 5-aminolevulinic acid synthetase. II. Induction in rat liver. J. Biol. Chem., 241, 4323-4329.

199. Mason, H.A. (1957) Mechanism of oxygen metabolism. Adv. Enzymol., 19, 79-223.

200. Mast, N., Andersson, U., Nakayama, K., Bjorhem, I., Pikuleva, I. (2004) Expression of human cytochrome P450 46A1 in Escherichia coli: effects of N- and C-terminal modifications. Arch. Biochem. Biophys., 428, 99-108.

201. Mathew, P.A., Mason, J.I., Trant, J.M., Waterman, M.R. (1990) Incorporation of steroidogenic pathway which produce Cortisol and aldosterone from cholesterol into nonsteroidogenic cells. Mol. Cell. Endocrinol, 73, 73-80.

202. Matocha, M.F., Waterman, M. (1986) Import and processing of P-450SCC and P-450(l 1) beta precursors by corpus luteal mitochondria: a processing pathway recognizing homologous and heterologous precursors. Arch. Biochem. Biophys., 250, 456-460.

203. Matocha, M.F., Waterman, M.,R., (1984) Discriminatory procyssing of the precursor forms of cytochrome P450scc and adrenodoxin by adrenocortical and heart mitochondria. J. Biol. Chem., 259, 8672-8678.

204. Mauersberger, S., Ohkuma, M., Schunck, W.-H., Takagi, M. (1996) Candida maltosa. In Non-conventional Yeasts in Biotechnology (Wolf, K., ed.), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp. 411-580.

205. Mayer, A., Nargang, F.E., Neupert, W., Lill, R. (1995) MOM22 is a receptor for mitochondrial targeting sequences and cooperates with MOM 19. EMBO J., 14, 4204-4211.

206. Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. (1995) Mitochondrial protein import: leversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane Irives partial translocation and unfolding. Cell, 80, 127-137.

207. Mellon, S.H., Griffin, L.D. (2002) Neurosteroids: biochemistry and clinical significance. Trends Endocrinol. Metab., 13, 35-43

208. Miles, C.S., Ost, T.W.P., Noble, M., Munro, A.W., Chapman, S.K. (2000), Protein engineering of cytochromes P-450. Biochim. Biophis. Acta, 1543, 383 407.

209. Miller, W.L. (2007) StAR search what we know about how steroidogenic acute regulatory protein mediates cholesterol import. Mol. Endocrinol., 21, 589-601.

210. Miller, W.L. (2008) Steroidogenic enzymes. Endocr. Dev., Karger, Basel, 13, 1-18.

211. Minenko, A.N., Novikova, L.A., Luzikov, V.N., Kovaleva, I.E. (2008) Import of hybrid forms of CYP11 Al into yeast mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1780, 1121—1130.

212. Mitani, F. (1979) Cytochrome P450 in adrenocortical miochondria. Mol. Cell Biochem., 24,21-43.

213. Miura, S., Ichikawa, Y. (1994) Interaction of NADPH-adrenoferredoxin reductase with NADP and adrenoferredoxin. J. Biol. Chem., 269, 8001-8006.

214. Monte, D., De Witte, F., Hum, D.W. (1998) Regulation of the human P450scc gene by steroidogenic Factor 1 is mediated by CBP/p300. J. Biol. Chem., 273, 4535-4591.

215. Moro, F., Sirrenberg, H.C., Neuper,t W. (1999) The TIM 17-23 preprotein translocase in mitochondria: composition and function in protein transport into the matrix, EMBO J., 18, 3667 3675.

216. Morohashi, K., Honda, S., Inomata, Y., Handa, H., Omura, T. (1992) A common transacting factor, Ad4-binding protein, to the promoters of steroidogenic P-450s. J. Biol. Chem., 267, 17913-17919.

217. Morohashi, K., Sogawa, K., Omura, Т., Fujii-Kuriyama, Y., (1987) Gene structure of human cytochrome P-450(SCC), cholesterol desmolase. J Biochem. (Tokyo), 29, 879-887.

218. Muller, A., Muller, J.J., Muller, Y.A., Uhlmann, H., Bernhardt, R., Heinemann, U. (1998) New aspects of electron transfer revealed by the crystal structure of a truncated bovine adrenodoxin, Adx (4-108). Structure, 6, 269-280.

219. Muller, J.J., Lapko, A., Bourenkov, G., Ruckpaul, K., Heinemann, U. (2001) Adrenodoxin reductase-sdrenodoxin complex structure suggests electron transfer path in steroid biosynthesis. J. Biol Chem., 276, 2786-2789.

220. Murakami, H., Yabusaki, Y., Sakaki, Т., Shibata, M., Ohkawa, H. (1990) Expression of cloned yeast NADPH-cytochrome P450 reductase gene in S. cerevisiae. J.Biochem. (Tokyo), 108(5), 859-865.

221. Murakami, H., Yabusaki, Y., Sakaki, Т., Shibata, M., Ohkawa, H. (1987) A genetically engineered P450 monooxygenase: construction of the functional fused enzyme between rat cytochrome P450c and NADPH-cytochrome P450 reductase. DNA, 6, 189-197.

222. Nabi, N., Omura, T. (1983) In vitro synthesis of NADPH-adrenodoxin reductase and adrenodoxin of bovine adrenal cortex, and the existence of a large precursor of adrenodoxin. J Biochem. (Tokyo), 94(5), 1529-1538.

223. Nakai, Т., Mera, Y., Yasuhara, Т., Ohashi, A. (1994) ATP-dependent proteolysis in yeast mitochondria. J. Biochem. (Tokyo), 116, 752-758.

224. Nakayama, K., Puchkaev, A., Pikuleva, I.A. (2001) Membrane binding and substrate access merge in cytochrome P450 7A1, a key enzyme in degradation of cholesterol. J. Biol. Chem., 276,31459-31465.

225. Narhi, L.O., Fulco, A.J. (1986) Characterization of a catalytically self-sufficient 119,000-dalton cytochrome P450 monooxigenase induced by barbiturates in Bacillus megaterium. J. Biol. Chem., 261, 7160-7169.

226. Neupert, W., Herrmann, J.M. (2007) Translocation of proteins into mitochondria. Annu. Rev. Biochem., 76, 723-749.

227. Nguen, V., Argan, C., Lusty, C.J., Shore, G.C. (1986) Import and processing of hybrid proteins by mammalian mitochondria in vitro. J. Biol. Chem., 261, 800-805.

228. Nishimoto, M., Clark, J.E., Masters, B.S.S. (1993) Cytochrome P450 4A4: expression in Escherichia coli, purification, and characterization of catalytic properties. Biochemistry, 32, 8863-8870.

229. Novikova, L.A., Zubatov, A.S., Luzikov, V.N. (1981) Multiplicity of mitochondrial proteinases in yeast. FEBS Lett., 135,245-248.

230. Nunnari, J., Fox, T.D., Walter, P. (1993) A mitochondrial protease with two catalytic subunits of nonoverlapping specificities. Science, 262, 1997-2004.

231. Ogishima, Т., Okada, Y., Omura, T. (1985) Import and processing of the precursor of cytochrome P-450(SCC) by bovine adrenal cortex mitochondria. J. Biochem. (Tokyo), 98, 781791.

232. Ohashi, M., Omura, T. (1978) Presence of the NADPH-cytochrome P-450 reductase system in liver and kidney mitochondria. J.Biochem. (Tokyo), 83, 249-260.

233. Ohe, Т., Ashino, Т., Akihirobe, A. (1997) Substituent elimination from p-substituted phenols by cytochrome P450. ipso-substitution by the oxygen atom of the active species. Drug Metab. Dispos., 25, 116-122.

234. Omura Т., Sato R. (1964) The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. II. Solubilization, purification, and properties. J. Biol. Chem., 239,2379-2385.

235. Omura, Т., Ito, A. (1991) Biosynthesis and intracellular sorting of mitochondrial forms of cytochrome P450. Methods Enzymol., 206, 75-81.

236. Oonk, R.B., Parker, K.L., Gibson, J.L., Richards, J.S., (1990) Rat cholesterol side-chain cleavage cytochrome P-450 (P-450scc) gene. Structure and regulation by cAMP in vitro. J. Biol. Chem., 265, 22392-22401.

237. Orme-Johnson N.R. (1990) Distinctive properties of adrenal cortex mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1020, 213-231.

238. Osterman, J., Voss, W., Kang, P.-J., Craig, E., Neupert, W., Pfanner, N. (1990) Precursor proteins in transit through mitochondrial contact sites interact with hsp70 in the matrix. FEBS Lett., 277, 281-284.

239. Ou, W., Ito, A., Morohashi, K., Fujii-Kuriyama, Y., Omura, T. (1986) Processing-independent in vitro translocation of cytochrome P450scc precursor across mitochondrial membranes. J. Biochem. (Tokyo), 100, 1287-1296.

240. Pachecka, J., Tomaszewski, P., Kubiak-Tomaszewska, G. (2008) Cytochrome P450 polymorphis-molecular, metabolic and pharmacogenetic aspects. I. Mechanisms of activity of cytochrome P450 monooxygenases. Acta. Pol. Pharm., 65, 303-306.

241. Pacifici, R.E., Davies, K.J.A. (1990) Protein degradation as an index of oxidative stress. Methods Enzymol., 186, 485-502.

242. Page, C.C., Moser, C.C., Chen, X., Dutton, P.L. (1999) Natural engeneering principles of electron tunneling in biological oxidation-reduction. Nature, 402(6757), 47-52/

243. Pajic, A., Tauer, R., Feldmann, H., Neupert, W., Langer, T. (1994) YtalOp is required for the ATP-dependent degradation of polypeptides in the inner membrane of mitochondria. FEBS Lett., 353, 201-206.

244. Palin, M.F., Berthiaume, L., Lehoux, J.G., Waterman, M.R., Sygusch, J. (1992) Direct expression of mature bovine adrenodoxin in Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys., 295, 1, 126-131.

245. Papadopoulos, V., Guarneri, P. (1994) Regulation of C6 glioma cell steroidigenesis by adenosine 3',5'-cyclic monophosphate. Glia, 10, 75-78/

246. Parce, J.W., Spach, P.I., Cunningham, C.C. (1980) Deterioration of rat liver mitochondria under conditions of metabolite deprivation. Biochem. J., 188, 817-822.

247. Parikh, A., Guengerich, F.P. (1997). Expression, purification, and characterization of a catalytically active human cytochrome P450 lA2:rat NADPH-cytochrome P450 reductase fusion protein. Protein Expr. Purif., 9, 346-354.

248. Parikh, A., Gillam, E.M., Guengerich, F.P. (1997) Drug metabolism by Escherichia coli expressing human cytochromes P450. Nat Biotechnol., 15(8), 784-788.

249. Parker, K.L., Schimmer, B.P. (1997) Steroidogenic factor 1: a key determinant of endocrine development and function. Endocr. Rev., 18, 361-377

250. Parmar, J., Key, R.E., Rainey W.E. (2008) Development of an adrenocorticotropin-responsive human adrenocortical carcinoma cell line. J. Clin. Endocrinol. Metab., 93, 45424546.

251. Payne, A.H., Hales, D.B. (2004) Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocr. Rev., 25, 947-970.

252. Pearce, D.A., Sherman, F. (1995a) Degradation of cytochrome oxidase subunits in mutants of yeast lacking cytochrome с and suppression of the degradation by mutation of ymel. J. Biol. Chem., 270, 20879-20882.

253. Pearce, D.A., Sherman, F. (1995a) Enhanced stability of a thermody-namically stable mutant form of yeast iso-1-cytochrome c. Mol Gen Genet., 249, 155-161.

254. Pearce, D.A., Sherman, F. (19956) Diminished degradation of yeast cytochrome с by interactions with its physiological partners. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3735-3739.

255. Pelham, H.R.B., Jackson, R.J. (1976) An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem., 67, 247-256.

256. Pechurskaya, Т.A., Harnastai, I.N., Grabovec, I.P., Gilep, A.A., Usanov, S.A. (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun., 353, 598-604.

257. Pfanner, N., Chacinska, A. (2002) The mitochondrial import machinery: preprotein-concducting channels with binding sites for presequence. Biochim. Biophys. Acta, 1592, 15 — 24.

258. Pfanner N., Geissler A. (2001) Versality of the mitochondrial protein transport machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biology, 2, 339 349.

259. Pfanner N., Wiedemann N. (2002) Mitochondrial protein import: two membranes, three translocases. Curr. Opin. Cell Biol., 14, 400 411.

260. Pfanner, N., Rassow, J., van der Klei, I.J., Neupert, W. (1992) A dynamic model of the mitochondrial import machinery. Cell, 68, 999-1002.

261. Pikuleva, I.A. (2004) Putative F-G loop is involved in association with the membrane in P450scc (P450 11A1). Mol. Cell. Endocrinol., 215, 161-164.

262. Pikuleva, I.A., Puchkaev, A., Bjorkhem, I. (200V Putative helix F contributes to regioselectivity of hydroxylation in mitochondrial cytochrome P450 27A1. Biochemistry, 40, 7621-7629.

263. Pikuleva, I.A., Tesh, K., Waterman, M.R., Kim, Y. (2000) The tertiary structure of full-length bovine adrenodoxin suggests functional dimers. Arch. Biochem. Biophys., 373, 44-55.

264. Pompon, D. (1988) cDNA cloning and functional expression in S.cerevisiae of beta-naphthoflavine-induced rabbit liver P450 LM4 and LM6. Eur. J. Biochem., 177, 285-293.

265. Pompon, D., Truan, G., Abecassis, V. (2003), Sequence mapping of combinatorial libraries on macro- and microarrays: bioinformatic treatment of data. Methods Mol Biol., 231, 199-211.

266. Prip, B.C., Westermann, В., Schmitt, M., Langer, Т., Neupert, W., Shwarz, E. (1996) Role of the mitochondrial DnaJ homologue, Mdjlp, in the evention of heat-induced protein aggregation. FEBS Lett., 380, 142-146.

267. Pritchard, M.P., Glancey, M.J., Blak,e J.A., Gilham, D.E., Burchell, В., Wolf, C.R., Friedberg, T. (1998) Functional co-expression of CYP2D6 and human NADPH-cytochrome P450 reductase in Escherichia coli. Pharmacogenetics, 8(1), 33-42.

268. Purvis, J.L., Canick, J.A,. Mason, J.I., Estabrook, R.W., McCarthy, J.L. (1973) Lifetime of adrenal cytochrome p-450 as influenced by ACTH. Ann. NY Acad. Sci., 21B2, 319-343

269. Ravichandran, K.G., Boddupalli, S.S., Hasermann, C.A., Peterson, J.A. (1993) Crystal structure of hemoprotein domain of P450BM-3, a prototype for microsomal P450's. Science, 261,731-736.

270. Rechsteiner, M., Hoffman, L., Dubiel, W. (1993) The multi-catalytic and 26s proteases. J. Biol. Chem., 268, 6065-6068.

271. Rehling, P., Pfanner, N., Meisinger, C. (2003) Insertion of hidrophobic membrane proteins into mitochondrial membrane A guided tour. J. Mol. Biol., 326, 639-637.

272. Rep, M., Grivell, L.A. (1996) The role of protein degradation in mitochondrial function and biogenesis. Curr. Genet., 30, 367-380.

273. Rep, M., Nooy, J., Guelin, E., Grivell, L.A. (19966) Three genes for mitochondrial proteins suppress null-mutations in both Afg3 and Real when over-expressed. Curr. Genet., 30, 206-211.

274. Rep, M., van Dijl, M., Suda, K., Schatz, G., Grivell, L.A., Suzuki, C.K. (1996a) Promotion of mitochondrial membrane complex assembly by a proteolytically inactive yeast Lon. Science, 274, 103-106.

275. Reverdatto, S.V., Beilinson, V.A., Fradkov, A.F., Polushin, N.N., Efimov, V.A. (1991) Plasmid vectors for 'unclonable' DNA constructions. (1991) Nucl. Acid. Res., 24, 306-307.

276. Rhee, S.K., Icho, Т., Wickner, R.B. (1989) Structure and nuclear localization signal of the SKI3 antiviral protein of Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 5, 149-158.

277. Roise, D., Theiler, F., Horvath, S.J., Tomich, J.M., Richards, J.H., Allison, D.S., Schatz, G. (1988) Amphiphilicity is essential for mitochondrial presequence function. EMBO J., 7, 649653.

278. Rojo, E.E., Guiard, В., Neupert, W., Stuart, R.A. (1998) Sorting of D-Lactate dehydrogenase to the inner membrane of mitochondria. J. Biol. Chem., 273, 8040-8047.

279. Rojo, E.E., Guiard, В., Neupert, W., Stuart, R.A. (1999) N-terminal tail export from the mitochondrial matrix: adherence to the procaryofir 'positive inside1 rule of membrane protein topology. J. Biol. Chem., 274,19617-19722.

280. Rowley, N., Prip-Buus, C., Westermann, В., Brown, C., Schwartz, E., Barrell, В., Neupert, W. (1994) . Mdjlp, a novel chaperone of the DnaJ family, is involved in mitochondrial biogenesis and protein folding. Cell, 77,249-259.

281. Ruckpaul K., Rein H. (eds) (1989) Basis and Mechanism of Regulation of Cytochrome P450,1. Akademie-Verlag, Berlin.

282. Ryan, K.R., Menold, M.M., Garrett, S., Jensen, R.E. (1994) SMS1, a high-copy suppressor of the yeast mas6 mutant, encodes an essential inner membrane protein required for mitochondrial protein import. Mol. Biol. Cell. 5, 529-538.

283. Saberi, M.R., Shah, К., Simons," С. (2005) Benzofuran- and furan-2-yl-(phenyl)-3-pyridylmethanols: synthesis and inhibition of P450 aromatase. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 20, 135-141.

284. Sagara, Y., Ito, A., Omura, T. (1984) Partial purification of a metalloprotease catalyzing the processing of adrenodoxin precursor in bovine adrenal cortex mitochondria. J Biochem., 96, 1743-1752.

285. Sagara, Y., Aramaki, H. (1998) Overproduction in Escherichia coli and characterization of the precise mature form of rat adrenodoxin. Biol. Pharm. Bull., 21, 1106-1109.

286. Sagara, Y., Wada, A., Takata, Y., Waterman, M.R., Sekimizu, K., Horiuchi, T. (1993) Direct expression of adrenodoxin reductase* in Escherichia coli and the functional characterization. Biol. Pharm. Bull., 7, 627-630.

287. Sakaki, Т., Inouye, K. (2000) Practical application of mammalian cytochrome P450. J. Biosc. Bioeng., 90(6), 583-590.

288. Sakaki, Т., Kominami, S., Takemori, S., Ohkawa, H., Akiyoshi-Shibata, M., Yabusaki, M.J. (1994) Kinetic studies on a genetically engineered fused enzyme between rat cytochrome P4501Al and yeast NADPH-P450 reductase. Biochemistry, 33, 4933-4939.

289. Sakaki, Т., Sawada, N., Komai, K., Shiozawa, S., Yamada, S., Yamamoto, K., Ohyama, Y., Inouye, K. (2000) Dual metabolic pathway of 25-hydroxyvitamin D3 catalyzed by human CYP24. Eur. J. Biochem., 267, 6158-6165.

290. Sakaki, Т., Shibata, M., Yabusaki, Y., Murakami, H., Ohkawa, H. (1989) Expression of bovine cytochrome P450cl7 cDNA in Saccharomyces cerevisiae. DNA, 8, 409-418.

291. Sakaki, Т., Shibata, M., Yabusaki, Y., Murakami, H., Ohkawa, H. (1990) Expression of bovine cytochrome P450c21 and its fused enzymes with yeast NADPH-cytochrome P450' reductase in Saccharomyces cerevisiae. DNA Cell Biol., 9, 603-614.

292. Sakaki, Т., Shinkyo, R., Takita, Т., Ohta, M., Inouye, K. (2002) Biodegradation of poly chlorinated dibenzo-p-dioxins by recombinant yeast expressing rat CYP1A subfamily. Arch. Biochem. Biophys., 401, 91-98.

293. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (eds) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989

294. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, F.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467.

295. Sawada, N. Sakaki, Т., Kitanaka, S., Takeyama, K., Kato, S., Inouye, K. (1999) Enzymatic properties of human 25-hydroxyvitamin D3 la-hydroxylase. Eur. J. Biochem., 265, 950-956. s

296. Scherer, P.E., Manning, U., Jeno, P., Schatz, G., Horst, M. (1992) Identification of a 45-kDa protein at the protein import site of the yeast mitochondrial inner membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11930-11934.

297. Schiffler, В., Bureik, M., Reinle, W., Muller, E.C., Hannemann, F., Bernhardt, R. (2004) The adrenodoxin-like ferredoxin of Schizosaccharomyces pombe mitochondria. J. Inorg. Biochem., 98, 1229-1237.

298. Schiffler, В., Kiefer, M., Wilken, A., Hannemann, F., Adolph, H.W., Bernhardt, R. (2001) The interaction of bovine adrenodoxin with CYP11A1 (cytochrome P450scc) and CYP11B1 (cytochromeP450 lip). J. Biol. Chem., 276, 36225-36232.

299. Schleyer, M., Neupert, W. (1985) Transport of proteins into mitochondria: transnational intermediates spanning contact sites between outer and inner membranes. Cell, 43, 339-350.

300. Schlossmann, J., Neupert, W. (1995) Assembly of the preprotein receptor MOM72/MAS70 into the protein import complex of the outer membrane of mitochondria. J. Biol. Chem. 270, 27116-27121.

301. Schmid-Berger, N., Schmid, В., Barth, G. (1994) Yltl, a highly repetitive retrotransposon in the genome of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. J Bacteriol., 176:2477-2482.

302. Schmidlin, J., Anner, G., Billeter, J.R., Wetterstein, A. (1955) Synthesis in aldosterone-series. I. Total synthesis of racemic aldosterone. Experientia, 11(9), 365-368.

303. Schmitt, M., Neupert, W., Langer, T. (1995) Hsp78, a Clp homologue within mitochondria, can substitute for chaperone functions of mt-hsp70. EMBOJ. 14, 3434-3444.

304. Schneider, H.C., Berthold, J., Bauer, M.F., Dietmeier, K., Guiard, В., Brunner, M., Neupert, W. (1994) Mitochondrial Hsp70/MIM44 complex facilitates protein import. Nature, 371, 768-774.

305. Schneider, H.C., Westermann, В., Neupert, W., Brunner, M. (1996) The leotide exchange factor MGE exerts a key function in the ATP-dependent le of mt-Hsp70-Tim44 interaction driving mitochondrial protein import. EMBO J., 15, 5796-5803.

306. Schuster, I., Bernhardt, R. (2007) Inhibition of cytochromes P450: existing and. new promising therapeutic targets. Drug Metabol. Rev., 39, 481-499.

307. Schwarz, D., Kisselev, P., Pfeil, W., Pisch, S., Bornscheuer, U., Schmid, R.D. (1997) Evidence that nonbilayer phase propensity is important for the side chain cleavage activity of cytochrome P450scc. Biochemistry, 36, 4262-4270.

308. Schwarz, D., Kruger, V., Chernogolov, A.A., Usanov, S.A., Stier, A. (1993) Rotation of cytochrome P450SCC (CYP11A1) in proteoliposomes studied by delayed fluorescence depolarization. Biochem. Biophys. Res. Commun., 195, 889-896.

309. Schwarz, D., Richter, W., Kruger, V., Chernogolov, A., Usanov, S., Stier, A. (1994) Direct visualization of a cardiolipin-dependent cytochrome P450scc-induced vesicle aggregation J. Struct. Biol., 113, 207-215.

310. Seaton, B.L., Vickery, L.E. (1992) Expression of human ferredoxin in Saccharomyces cerevisiae: import of the protein and assembly of the 2Fe-2S. center. Arch. Biochem. Biophys., 294, 603-608.

311. Sewer, M.B., Dammer, E.B., Jagarlapudi, S. (2007) Transcriptional regulation of adrenocortical steroidogenic gene expression. Drug Metabol. Rev., 39, 371-388.

312. Seybert, D.W., Lancaster, J.R., Jr., Lambeth, J.D., Kamin, H. (1979) Participation of the membrane in the side chain cleavage of cholesterol. Reconstitution of cytochrome P-450scc into phospholipid vesicles, J. Biol. Chem., 254, 12088-12098.

313. Shank-Retzlaff, M.L., Raner, G.M., Coon, M.J., Sligar, S.G. (1998) Membrane topology of cytochrome P450 2B4 in Langmuir-Blodgett monolayers. Arch. Biochem. Biophys., 359, 8288.

314. Sheng W.G., Cheng X.B. (2002) Using of two-step integrating technology, transducted the H and L chain gene of humanized Fab fragment of anti-HB-sAg antibody into the genome of methylotropic yeast Pichiapastoris. J. Biochem. Mol. Biol., 18, 546-550.

315. Shet, M.S., Fisher, C.W., Estabrook, R.W. (1997) The function of recombinant cytochrome P450s in intact Escherichia coli cells: the 17 alpha-hydroxylation of progesterone and pregnenolone by P450cl7. Arch. Biochem. Biophys., 339,218-225.

316. Shibata M., Sakaki, Т., Yabusaki, Y., Murakami, H., Ohkawa, H. (1990) Genetically engineered P450 monooxygenases: construction of bovine P450cl7/yeast reductase fused enzymes. DNA Cell Biol., 9, 27-36.

317. Shkumatov, V.M., Usanov, S.A., Chashchin, V.L., Akhrem, A.A. (1985) Cytochrome P-450 dependent pathways in corticosteroid hormones biosynthesis. Pharmazie, 40, 757-766.

318. Sibbesen, O., De Voss, J.J., Montellano, P.R. (1996) Putidaredoxin reductase-putidaredoxin-cytochrome p450cam triple fusion protein. Construction of a self-sufficient Escherichia coli catalytic system. J. Biol. Chem., 271, 22462-22469.

319. Sidhu, R.S., Bollon, A.P. (1987) Analysis of alpha-factor secretion signals by fusing with acid phosphatase of yeast. Gene, 54, 175-184.

320. Sikorski, R.S., Hieter, P. (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics., 122(1), 1927.

321. Singer, T. P. (1974) Determination of the activity of succinate, NADH, choline, and alpha-glycerophosphate dehydrogenases. Methods of Biochemical Analysis (Glick, D., ed.), 22, Wiley, NY, pp. 123175.

322. Sitte, N., Drung, I., Dubiel, W. (1995) Identification of a novel ATP-dependent proteolytic activity in mitochondrial intermembrane space. Biochem. Mol. Biol. Int., 36, 871-881.

323. Sivozhelezov, V., Nicolini, C. (2005) Homology modeling of cytochrome P450scc and the mutations for optimal amperometric sensor. J. Theor. Biol., 234, 479-485.

324. Smerdon, G.R., Walton, E.F., Aves, S.J. (1998) Stable production of human gastric lipase by chromosomal integration in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Appl Microbiol Biotechnol 49, 45-50.

325. Smettan, G., Shkumatov, V.M., Pommerening, K., Ruckpaul, K. (1985) Cytochrome p-450. Biochemistry, Biophysics and Induction of Cytochrome P-450 (Vereczkey, L., Mayar, K., eds.), Budapest: Akademie Kiad, pp. 207-210.

326. Smith, L.L. In: Biotechnology, Chapter 2 Steroids, 1988, pp 31-78.

327. Solish, S.B., Picado-Leonard, J., Morel, Y., Kuhn, R.W., Mohandas, Т.К., Hanukoglu, I.,

328. Miller, W.L. (1988) Human adrenodoxin reductase: Two mRNAs encoded by a single gene on chromosome i7cen-q25 are expressed in steroidogenic tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7104-7108.

329. Sollner, Т., Rassow, J., Wiedmann, M., Schlossmann, J., Keil, P.', Neupert, W., Pfanner, N. (1992) Mapping of the protein import machinery in the mitochondrial outer membrane by crosslinking of translocation intermediates. Nature, 355, 84-87.

330. Steinborn, G., Gellissen, G., Kunze, G. (2007) A novel vector element providing multicopy vector integration in Arxula adeninivorans. FEMS Yeast Res, 7,1197-1205.

331. Subramanian, M., Katyare, S.S., Fatterpaker, P., Sreenivasan, A. (1975) A protease in rat liver mitochondria: its physiological significance. Ind. J. Biochem. Biophys., 12, 307-310.

332. Suhara, K., Nakayama, K., Takikawa, O., Katagiri, M. (1982) Two forms of adrenodoxin reductase. Eur. J. Biochem., 125, 3, 659-664.

333. Suhara, K., Takemori, S., Katagiri, M., Wada, K., Kobayashi, H., Matsubara, H. (1975) Estimation of labile sulfide in iron-sulfur protein. Anal. Biochem., 68(2), 632-636.

334. Suzuki, C.K., Rep, M., van Dijl, J.M., Suda, K., Grivell, L.A., Schatz, G. (1997) ATP-dependent proteases that also chaperone protein biogenesis. Trends Biochem. Sci., 22, 118-123.

335. Suzuki, C.K., Suda, K., Wang, N., Schatz, G. (1994) Requirement for the yeast gene LON in intramitochondrial proteolysis and maintenance of respiration. Science, 264, 273-276.

336. Sz'abo, A., Langer, Т., Schroder, H., Flanagan, J., Bukau, В., and Hartl, F.U. (1994) The ATP hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp70 system DnaK, DnaJ, and GrpE. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10345-10349.

337. Та, D. Т., Vickery, L. E. (1992) Cloning, sequencing, and overexpression of a 2Fe-2S. ferredoxin gene from Escherichia coli. J.Biol.Chem., 267, 11120-11125

338. Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, Т., Ohsumi, Y. (1992) Auto-phagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. J. Cell. Biol., 119, 301-311.

339. Tauer, R., Mannhaupt, G., Schnall, R., Pajic, A., Langer, Т., Feldmann, H. (1994) YtalOp, a member of a novel ATPase family in yeast, is essential for mitochondrial function. FEBS Lett., 353, 197-200.

340. The QIAexpressionist: A Laboratory Manual. (1992) DIAGEN GmbH, QIAGEN Inc., Hilden.

341. Tsujita, M., Ichikawa, Y. (1993) Substrate-binding region of cytochrome P-450SCC (P-450 XIA1). Identification and primary structure of the cholesterol binding region in cytochrome P-450SCC. Biochim. Biophys. Acta, 1161, 124-130.

342. Tuls, J., Geren, L., Lambeth, J.D., Millett, F. (1987) The use of a specific fluorescence probe to study the interaction of adrenodoxin with adrenodoxin reductase and cytochrome P-450scc. J. Biol. Chem., 262, 10020-10025.

343. Tzagoloff, A., Barrientos, A., Neupert, W., Herrmann, J.M. (2004) AtplOp assists assembly of Atp6p into the F0 unit of the yeast mitochondrial ATPase. J. Biol. Chem., 279, 19775-19780.

344. Uhlmann, H., Beckert, V., Schwarz, D., Bernhardt, R. (1992) Expression of bovine adrenodoxin and site-directed mutagenesis of 2Fe-2S. cluster ligands. Biochem. Biophys. Res. Commun., 188, 1131-1138.

345. Ullrich, V. (2006) Cytochrome P450 and biological hydroxylation reactions. Heidelberg (Springer Berlin), pp. 67-104.

346. Ungermann, C, Guiard, В., Neupert, W., and Cyr, D.M. (1996) The and Hsp70/MIM44-dependent reaction cycle driving early steps of protein import into mitochondria. EMBOJ. 15, 735-744.

347. Ungermann, C, Neupert, W., Cyr, D.M. (1994) The role of Hsp70 in conferring unidirectionality on protein translocation into mitochondria. Science. 266, 1250-1253.

348. Urban P., Truan G., Gautier J.C., Pompon D. (1993) Xenobiotic metabolism in humanized yeast: engineered yeast cells producing human NADPH-cytochrome P-450 reductase, cytochrome b5, epoxide hydrolase and P-450s. Biochem Soc Trans., 21(4), 1028-34.

349. Usanov, S.A., Chashchin, V.L., Akhrem, A.A. (1990) in Molecular Mechanisms of Adrenal Steroidogenesis and Aspects of Regulation and Application (Ruckpaul, K., Rein, H., eds.), Frontiers in Biotransformation, Vol. 3, Berlin:Akademie-Verlag, pp. 1-57.

350. Usanov, S.A., Chernogolov, A.A., Chashchin, V.L. (1990) Is cytochrome P450scc a transmembrane protein? FEBSLett., 275, 33-35.

351. Van der Laan, M., Risser, M., Rehling P. (2006) Mitochondrial preprotein translocases as dynamic molecular machines. FEMS Yeast Res., 6, 849-861.

352. Van Dyck, L., Pearce, D.A., and Sherman, F. (1994) PIM1 encodes a mitochondrial ATP-dependent protease that is required for mitochondrial function in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 269, 238-242.

353. Vickery, L.E. (1997) Molecular recognition and electron transfer in mitochondrial steroid hydroxylase systems. Steroids, 62, 124-127.

354. Vijakumar S., Salerno J. C. (1992) Mjltcular modeling of 3-D structure of cytochrome P450scc. Biochim. Biophys. Acta, 1160, 281 -286.

355. Voellmy,W.V., Goldberg,A.L. (1981) ATP-stimulated endoprotease is associated with the cell membrane of £ coli. Nature. 290, 419-421.

356. Voice, M.W., Zhang, Y., Wolf, C.R., Burchell, В., Friedberg, T. (1999) Effects of human cytochrome bs on CYP3A4 activity and stability in vivo. Arch. Biochem. Biophys., 366, 116-124.

357. Voisine, C., Craig, E.A., Zufalln von Ahsen, O., Pfanner, N., Voos, W. (1999) The protein import motor of mitochondria: unfolding and trapping of preproteins are distinct and separate functions of matrix Hsp 70. Cell, 97, 565 574.

358. Von Heijne, G. (1988) Transcending the impenetrable: how proteins come to terms with membranes. Biochim. Biophys. Acta, 947, 307-333.

359. Vonrhein, C., Schmidt, U., Ziegler, G.A., Schweiger, S., Hanukoglu, I., Schulz, G.E. (1999) Chaperone-assisted expression of authentic bovine adrenodoxin reductase in Escherichia coli. FEBS Lett., 443,167-169.

360. Vonrhein, C., Schmidt, U., Ziegler, G.A., Schweiger, S., Hanukoglu, I., Schulz, G.E. (1999) Chaperone-assisted expression of authentic bovine adrenodoxin reductase in Escherichia coli. FEBS Letters, 443, 167-169.

361. Voos, W., Gambill, B.D., Laloraya, S., Ang, D., Craig, E.A., Pfanner, N. (1994) Mitochondrial GrpE is present in a complex with hsp70 and preproteins in transit across membranes. Mol. Cell. Biol., 14, 6627-6634.

362. Wada, A., Mathew, P.A., Barnes, H.J., Sanders, D., Estabrook, R.W., Waterman, M.R. (1991) Expression of functional bovine cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450 (P450scc) in E.coli. Arch. Biochem. Biophys., 290, 376-380.

363. Wada, A., Waterman, M.R. (1992) Identification by site-directed mutagenesis of two lysine residues in cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450 that are essential for adrenodoxin binding. J. Biol. Chem., 267, 22877-22882.

364. Wagner, I., van Dyck, L., Savel'ev, A.S., Neupert, W., Langer, T. (1997) Autocatalitic processing of the ATP-dependent PIM1 protease: Crucial function of a pro-region for sorting to mitochondria. EMBO J., 17, 7317-7325.

365. Wagner, I., Arlt, H., van Dyck, L., Langer, Т., Neupert, W. (1994) Molecular chaperones cooperate with PIM1 protease in the degradation of misfolded proteins in mitochondria. EMBO J., 13, 5135-5145.

366. Wan, J.T., Jarrett, J. (2002) Electron acceptor specificity of ferredoxin (flavodoxin):NADP+ oxidoreductase from Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys., 406, 116126.

367. Wang, H.-P., Kimura, T. (1976) Purification and characterization of adrenal cortex mitochondrial cytochrome P-450 specific for cholesterol side-chain cleavage activity. J. Biol. Chem., 251, 6068-6074.

368. Wartmann, Т., Bellebna, C., Boer, E., Bartelsen, O., Gellissen, G., Kunze, G. (2003) The constitutive AHSB4 promoter—a novel component of the Arxula adeninivorans-based expression platform. App.l Microbiol. Biotechnol., 62, 528-535.

369. Watabe, S., Kimura, T. (1985) ATP-dependent protease in bovine adrenal cortex. Tissue specificity, subcellular localization, and partial characterization. J. Biol. Chem., 260, 5511-5517.

370. Watanabe, N., Inoue, H., Fujii-Kuriyama, Y. (1994) Regulatory mechanisms of cAMP-dependent and cell-specific expression of human steroidogenic cytochrome P450scc (CYP11A1) gene. Eur. J. Biochem., 222, 825-834.

371. Watts, K.T., Lee, P.C., Schmidt-Dannert, C. (2004) Exploring recombinant flavonoid biosynthesis in metabolically engineered Escherichia coli. Chembiochem., 5(4), 500-507.

372. Weber, H., Kurischko, C. (1989) Sexual behaviour in the alkane-utilizing yeast Yarrowia lipolytica. Yeast, 5, 279-85.

373. Werck-Reichhart, D., Feyereisen, R., (2000) Cytochrome P450: a success story. Genome Biology, 1, 3003.1-3003. .

374. Wery, J., Gutker, D., Renniers, A.C., Verdoes, J.C., van Ooyen, A.J. (1997) High copy number integration into the ribosomal DNA of the yeast Phaffia rhodozyma. Gene, 184, 89-97.

375. Westermann, В., Prip, B.C., Neupert, W., Schwarz, E. (1995) The role of the GrpE homologue, Mgelp, in mediating protein import and protein folding in mitochondria. EMBO J., 14, 3452-3460.

376. Westermann, В., Gaume, В., Herrmann, J.M., Neupert, W., Schwarz, E. (1996) Role of the mitochondrial DnaJ homolog Mdjlp as a chaperone for mitochondrially synthesized and imported proteins. Mol. Cell. Biol., 16, 7063-7071.

377. Westermann, В., Prip, B.C., Neupert, W., Schwarz, E. (1995) The role of the GrpE homologue, Mgelp, in mediating protein import and protein folding in mitochondria. EMBO J., 14, 3452-3460.

378. Wilks, A., Black, S.M., Miller, W.I., Ortiz De Montellano, P.R. (1995). Expression and characterization of truncated human heme oxygenase (hHO-1) and a fusion protein of hHO-1 with human cytochrome P450 reductase. Biochemistry, 34, 4421-4427.

379. Williams P.A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E.F., McRee D.E. (2000) Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptation for membrane binding and functional diversity. Mol. Cell., 5, 121 -131.

380. Wimley, W.C., White, S.H. (1996) Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces. Nat. Struct. Biol.,'3, 842-848.

381. Woods, S.T., Sadleir, J., Downs, Т., Triantopoulos, Т., Headlam, M.J., Tuckey, R.C. (1998) Expression of catalytically active human cytochrome P450scc in Escherichia coli and mutagenesis of isoleucine-462. Arch. Biochem. Biophys., 353, 109-115.

382. Woodward R., Sondheimer F., Taub D., Heusler K., McLamore W. (1952) J. Am. Chem. Soc., 74,4223.

383. Xia, J., Kemper, B. (2005) Structural Determinants of constitutive androstane receptor required for its glucocorticoid receptor interacting protein-1-mediated nuclear accumulation. J.Biol. Chem., 280, 7285-7293.

384. Yamamoto, R., Kallen, C.B., Babalola, G.O., Rennert, H., Billheimer, J.T., Strauss III, J.F. (1991) Cloning and expression of a cDNA encoding human sterol carrier protein 2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 463-467.

385. Yasuhara T, Mera Y, Nakai T, Ohashi A (1994) ATP-dependent proteolysis in yeast mitochondria. J Biochem., 1, 1166-1171.

386. Yoshihisa, Т., Ito, K. (1996) Pro-OmpA derivatives with a Hise tag in their N-terminal "Translocation Initiation Domains" are arrested by Ni2+ at an early post-targeting stage of translocation. J.Biol.Chem., 271, 9429-9436.

387. Youngblood GL, Nesbitt MN, Payne AH 1989 The structural genes encoding P450scc and P450arom are closely linked on mouse chromosome 9. Endocrinology. 125,2784-2786.

388. Zeghouf M, Fontecave M, Coves J. (2000) A simplifed functional version of the Escherichia coli sulfite reductase. J Biol Chem., 275, 37651-37656.

389. Zheng, X., Rosenberg, L.E., Kalousek, F., Fenton, W.A., (1993) GroEL, GroES, and ATP-dependent folding and spontaneous assembly of ornithine transcarbamylase. J. Biol. Chem., 268, 7489-7493.

390. Zollner, A., Pasquinelli, M.A., Bernhardt, R., Beratan, D.N. (2007) Protein phosphorilation and intermolecular electron transfer: a joint experimental and computational study of a hormone biosynthesis pathway. J. Am. Chem. Soc., 129, 4206-4216.

391. Zubatov, A.S., Mikhailova, A.E., Luzikov, V.N. (1984) Detection, isolation and some properties of membrane proteinases from yeast mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 787, 188195.

392. Zuber, M.X., Mason, J.I., Simpson, E.R., Waterman, M.R. (1988) Incorporation of steroidogenic pathway which produce Cortisol and aldosterone from cholesterol into nonsteroidogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 699-703.1. VIII. БЛАГОДАРНОСТИ

393. Я хочу выразить благодарность моим коллегам, которые принимали участие в этой работе. Выполнение этой работы стало возможным благодаря участию многих людей.

394. Я глубоко благодарна преподавателям кафедры биохимии Биологического факультета, благодаря труду которых у меня появился интерес к научной работе и навыки работы в лаборатории.

395. Я искренне благодарна своему учителю Валентину Николаевичу Лузикову, под руководством которого я проработала много лет. Валентин Николаевич инициировал эту работу, и без его идеологической и практической поддержки она вряд ли могла бы состояться.

396. Большое спасибо Б.Ф. Ванюшину за внимательное отношение к нашей1 работе и постоянную моральную поддержку, без которой эта работа не была бы написана.

397. Также не могу не выразить искреннюю признательность A.M. Копылову, моему первому учителю в области молекулярной биологии, и В.Л. Друца за полезные советы и большую помощь, оказанную при конструировании плазмидных конструкций.

398. Я благодарю всех членов моей семьи, которые терпеливо переносили все трудности и помогали мне на всех этапах создания этой работы.