Молекулярная биология и физиология запрограммированной смерти дрожжей

Северин, Федор Федорович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная биология и физиология запрограммированной смерти дрожжей
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная биология и физиология запрограммированной смерти дрожжей"

Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

005001740

На правах рукописи

Северин Федор Федорович

Молекулярная биологня и физиология запрограммированной смерти дрожжей

03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в виде научного доклада

1 О НОЯ 2011

Москва-2011

005001740

Работа выполнена в Макс-Планк Институте клеточной биологии и генетики в г. Дрезден (Германия) и в отделе молекулярной энергетики микроорганизмов НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова

Научный консультант

академик РАН, доктор биологических наук,

профессор Скулачев Владимир Петрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Попов Василий Николаевич

доктор биологических наук Кушниров Виталий Владимирович

доктор биологических наук, профессор Виноградов Андрей Дмитриевич

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Защита состоится 25 ноября 2011 г. в 11м на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Диссертация в виде научного доклада разослана

октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Программируемая клеточная смерть (ПКС) является важным физиологическим процессом, необходимым многоклеточным организмам для онтогенеза, поддержания тканевого гомеостаза и иммунной защиты. Механизм запрограммированной смерти клетки - фундаментальная теоретическая и практическая проблема. Дрожжи - примитивные эукариоты, а также классический объект генетических исследований. Наиболее базовые модули каскада запрограммированной смерти клеток высших эукариот есть и у дрожжей, поэтому данные, полученные на дрожжах, могут служить отправной точкой для исследования аналогичных процессов в клетках высших организмов.

Поскольку ПКС означает самоубийство для одноклеточного организма, то не совсем ясно, почему и как данный механизм сохранился в процессе эволюции дрожжей. В последнее время появляется все больше данных, что многоклеточные организмы имеют программу самоуничтожения (гипотеза феноптоза). Таким образом, исследование физиологического самоубийства дрожжевой клетки актуально в формате изучения программ саморазрушения у высших организмов. Данные, полученные в последние десятилетия, показывают, что запуск таковой программы у дрожжей направлен на увеличение приспособленности выживших клеток. Действительно, многие из вариантов естественных сценариев активации ПКС Saccharomyces cerevisiae, в том числе, гибель в стационарной культуре, в течение мейоза, при половом процессе, вызванная вирусами, зависят от плотности культуры клеток. Интересно, что и у высших организмов половой процесс также может вызывать гибель: самцы некоторых кальмаров умирают сразу же после спаривания, а самцы сумчатых крыс умирают через две недели после гона от избытка собственных феромонов. Как известно, многие виды лососевых рыб также умирают сразу после нереста.

Быстрая запрограммированная смерть многоклеточных не обязательно сопряжена с размножением. Смерть больного организма ради выживания окружающих может быть выгодна потому, что препятствует распространению инфекции. Оказалось, что у высших животных существует механизм, убивающий их в ответ на появление Грам-отрицательных бактерий в крови. Введенные в кровь экспериметальных животных липополисахариды (LPS) клеточной стенки бактерий токсичны. Эта токсичность резко снижается при блокировании специализированного LPS-связывающего белка в крови, а также при ингибировании специализированных клеточных рецепторов LPS-белкового комплекса

Недавно был предложен термин для описания этого явления на заключительной стадии жизненного цикла - быстрый феноптоз.

Кроме того, в терминах гипотезы феноптоза старение многоклеточных организмов (то есть возраст-зависимая дегенерация) - основная контр-продуктивная программа, «медленный феноптоз». Дрожжи являются удобной моделью для исследования старения. Они тоже стареют: материнская клетка может произвести ограниченное количество дочерних (20-30), после чего умирает. В процессе старения клетка накапливает маркеры окислительного стресса, мутации в ядерной и мнтохондриапьной ДНК и другие повреждения. Интересно, что механизм старения дрожжей во многом схож с таковым у высших эукариот. Например, ортологи гена деацетилазы гистоиов SIR2 присутствуют у всех эукариот включая дрожжи. У дрожжей он называется SIR2, у млекопитающих - SIRT1. Активность этого белка у высших животных ингибирутся инсулин-подобными гормонами. Подавление активности инсулинового каскада с помощью методов генной инженерии, голодания или фармакологического вмешательства (резвератрол) приводит к увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных (мыши, черви С. elegans, мухи-дрозфилы). Введения дополнительной копии этого гена в ДНК дрожжей достоверно увеличивает продолжительность жизни. По-видимому, молекулярной основой этого явления служит то, что при повреждении (разрыве) ДНК дрожжей SIR2 уходит со специфических для себя мест на хромосомах, перемещается в места разрыва и там каким-то образом поддерживает целостность хромосом. Интересно, что SIRT1 делает то же самое при повреждении ДНК культивируемых клеток животных.

Недавно группой Ангелики Амон (Amon) было показано, что гаметогенез или активация транскрипции поздних генов гаметогенеза ведет к «обнулению» репликативного возраста и увеличению продолжительности жизни. Следовательно, стареющие дрожжи, имея возможность избавится от возраст-зависимых повреждений, отнюдь не всегда ее используют. Этот факт легко объясним в рамках гипотезы феноптоза.

Цели и задачи исследования.

Целью данного исследования было найти физиологический индуктор запрограммированной смерти дрожжевой клетки, а также исследовать механизм этого процесса, при этом наиболее детально - роль митохондрий и активных форм кислорода.

Задачи исследования:

1. Проверка гипотезы о том, что половой феромон может индуцировать

запрограммированную смерть дрожжевой клетки.

2. Определение роли митохондрий в запрограммированной смерти дрожжей, вызванной избытком феромонов.

3. Доказательство возможности «мягкого разобщения» с помощью липофильных катионов на интактных клетках дрожжей.

4. Сравнительный анализ защитного и повреждающего действия активных форм кислорода при генотоксическом стрессе клеток дрожжей.

5. Изучение взаимосвязи образования белковых агрегатов и дефектов в функционировании циклосомы при индукции запрограммированной смерти дрожжей.

Научная новизна работы.

В работе впервые исследованы механизм физиологической клеточной смерти дрожжей вызванный избытком полового феромона. Установлено, что гиперполяризация митохондрий играет ключевую роль в этом процессе, а именно инициирует генерацию активных форм кислорода (АФК).

Показано, что искусственное снижении мембранного потенциала митохондрий с помощью разобщителей снижает эффективность индукции запрограммированной смерти дрожжей. На основе этого наблюдения разработана экспериментальная система для тестирования физиологического эффекта разобщителей.

Произведен сравнительный анализ обычных разобщителей и проникающих катионов типа БкС}. Впервые показано, что проникающие катионы оказывают селективный протонофорный эффект на внутреннюю мембрану митохондрий, и при этом разобщение является «мягким», то есть его эффективность падает с падением потенциала на внутренней мембране.

Обнаружено, что АФК, которые генерирует клетка при генотоксическом стрессе, могут быть как защитными (при относительно небольшом повреждении), так и способствовать гибели клетки при относительно сильном стрессе.

Показано, что накопление полиглутамин-зависимых белковых агрегатов в дрожжевой клетке вызывает задержку клеточного цикла и частично активирует каскад запрограммированной смерти. Выживание клетки в этих условиях можно улучшить с помощью генетического нокаута ряда белков-субстратов циклосомы.

Научно-пракггическое значение работы.

Проведенные исследования открывают физиологические закономерности принятия решения «жизнь или смерть» на уровне одноклеточного организма, а также характеризуют роль митохондрий и АФК в принятии и исполнении этого решения. Данные, полученные в разработанной экспериментальной модели клеточной смерти, позволили разработать новые

вещества - мягкие разобщители, которые в перспективе могут быть использованы для лечения широкого спектра заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Избыток полового феромона индуцирует запрограммированную смерть дрожжей путем повышения концентрации кальция в клетке.

2. Избыточный кальций вызывает гиперполяризацию митохондрий, что увеличивает генерацию активных форм кислорода и смерть клетки.

3. Проникающие катионы обладают разобщающим действием и при этом менее токсичны при передозировке, чем анионные протонофоры.

4. Активные формы кислорода являются защитными при слабом генотоксическом стрессе и повреждающими при относительно сильном стрессе.

5. Причина токсичности белковой агрегации в дрожжевой модели полиглутамин-зависимых заболеваний - неспособность клетки расщеплять субстраты циклосомы.

Апробации работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2008-2010), европейской биоэнергетической конференции ЕВЕС (Москва 2006), конференции Гордона «Апоптоз» (2006), европейской конференции по клеточной смерти ЕСОО (2004, 2010), международной конференции по апоптозу дрожжей (Майами, 2005; Левен, 2008; Грац, 2009), конференции американского общества клеточной биологии (2007).

Публикации.

Основные положения диссертации опубликованы в 52 печатных работах (включая 7 обзоров) в журналах, рекомендованных ВАК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Половой феромон как индуктор смерти дрожжей

В последние десятилетия дрожжи стали популярным объектом для исследования запрограммированной клеточной смерти. Так, исследовалось появление маркеров апоптота после жестких воздействий на дрожжевые клетки. Эти работы воспринимались с долей пессимизма исследователями апопотоза у высших организмов, которые считали этот феномен лабораторным артефактом. Действительно, не совсем очевиден биологический смысл самоубийства в ответ на перекись, уксусную кислоту или осмотический шок. Мы поставили цель найти «мягкий» индуктор

физиологического самоубийства дрожжей. Мы исходили из предположения, что физиологическое самоубийство имеет смысл только в сообществе организмов: в этом случае смерть одной клетки может быть каким-либо образом скомпенсирована выигрышем в приспособленности ее ближайших родственников или клонов. Иными словами, искомый индуктор должен каким-то образом зависеть от плотности клеток в культуре. Концентрация полового феромона, который секретируется дрожжами, естественно зависит от их плотности. Гаплоидная дрожжевая клетка может обладать либо а, либо альфа типом спаривания, и секретировать либо а, либо альфа-фактор, соответственно. Оба феромона - схожие по структуре пептиды. Надо отметить, что в лабораторной практике альфа-фактор часто используется для синхронизации культуры в клеточном цикле. Под действием феромона клетки задерживаются в фазе 01 и отращивают отростки (так называемые шму). В методических указаниях по работе с дрожжевыми культурами отмечается, что передозировка альфа-фактора может быть токсична: в частности, она может замедлить выход из ареста после отмывки феромона.

Исходя из этих предпосылок, мы решили проверить, вызывает ли альфа-фактор запрограммированную смерть дрожжевых клеток. В большинстве сценариев апоптической смерти генерация клетками АФК - это один из основных этапов каскада. Для детекции АФК использовался НгОСР-ОА, это вещество становится флуоресцентным после окисления АФК. Оказалось, что после 90 мин. инкубации а-клеток с альфа-фактором примерно треть клеток становятся флуоресцентными, в то время как клетки без альфа-фактора и клетки альфа-типа с альфа-фактором не флюоресцируют (Рис. 1а). Следовательно, альфа-фактор может вызывать генерацию АФК клетками а-типа. Мы оттитровали концентрацию альфа фактора и выяснили, что для индукции АФК необходимо примерно в 10 раз более высокая концентрация, чем для формирования шму - морфолгического маркера половой дифференцировки (данные не приводятся).

Еще одним признаком апоптоза является деградация ядерной ДНК. Мы протестировали количество ДНК в клетке с помощью проточной флуоцитометрии (ИАСЗ). Оказалось, что высокая концентрация альфа-фактора вызывает накопление клеток с меньшим количеством ДНК чем в нормальных клетках в фазе С1 (Рис. 16), что является маркером деградации. С помощью окрашивания витальным красителем Флоксином Б мы также установили, что такая обработка феромоном приводит к смерти примерно 30% клеток (Рис. 1в).

фаза

АФК

Б 1С 2С

го

ИгШ/Тпз:

Рис.1. Альфа-фактор вызывает запрограммированную клеточную смерть. Клетки выращивались в жидкой УРО до плотности 106/мл. Концентрация альфа-фактора - 0,1 мг/мл. А, детекция АФК с помощью красителя Н2ОСР-ОА (10 мкМ). Масштаб - 50 мкм Б, Определение содержания ДНК в клетах методом цитофлуориметрии. В, окраска мертвых клеток Флоксином Б (0,4 мг/мл, 5 мин. инкубации с последующим фотографированием). Масштаб - 10 мкм.

Для исследования пути развития этого каскада клеточной смерти мы прежде всего протестировали роль киназы Э1е20. Эта киназа активирует МАП-киназную часть каскада феромонового ответа. Оказалось, что делеция 8ТЕ20 предотвращает генерацию АФК и смерть клеток (Табл. 1). Надо отметить, что МАП-киназный каскад играет ключевую роль в апоптозе животных клеток. Таким образом, прослеживается параллель между каскадами клеточной смерти у дрожжей и высших организмов. Активация 81е20 индуцирует экспрессию ряда белков. Чтобы проверить является ли эта индукция необходимой для активации каскада клеточного самоубийства мы проверили эффект ингибирования синтеза белка. Оказалось, что циклогексемид предотвращает генерацию АФК и смерть клеток (Табл. 1). Последующие этапы апоптоза у клеток высших эукариот обычно опосредованы митохондриями. Оказалось, что потеря клетками дрожжей также митохондриальной ДНК полностью ингибирует феромон-зависимую смерть (Табл. 1), и при этом не влияет на образование шму (данные не показаны). Интересно, что клетки без функционального цитохрома ц (делеция гем-лиазы) генерировали АФК но не умирали в ответ на альфа-фактор (Табл. 1).

Таблица 1. Феромон вызывает зависимые от митохондрий генераг/ию АФК и смерть дрожжей.

клетки

добавки

феромон другие

эффекты

% клеток с А ФК % мертвых клеток

алфа

а, реЛе

+ + +

циклогексимид

0,8±0,8

29,6±3,3

0,9±1,0

26,3±4,0

2,6±1,3

1,5±0,б

2,6±3,6

0,5±0,8

5,8±1,0

33,7±8,7

1,4±0,2

32,9±3,4

а, Дз1е20 а+альфа а+альфа а

а, без цитохрома ц +

33,5±12,7

0,5±0,6

24.3±4.0

хлорохин хлорохин хлорохин

не определено не определено не определено

Это показывает, что АФК в данном процессе (как и в апоптозе у животных) выполняют сигнальную функцию, а именно опосредуют выход цитохрома ц из митохондрий. Может ли феромон-зависимая смерть произойти в естественных условиях или является артефактом добавки неестественно большого количества феромона? Для проверки мы смешали клетки противоположных типов спаривания и покрасили смесь Флоксином Б. Примерно 1% клеток оказался Флоксин-содержащим (Рис. 1в). Такой низкий процент показал достаточно малую вероятность смерти при естественном спаривании, и это было вполне ожидаемым результатом. Следующим этапом мы повторили этот опыт в присутствии хлорохина - агента, не влияющего на вегетативный рост (Табл. 1) но ингибирующего последний этап слияния клеток, а именно гидролиз клеточных стенок. Оказалось, что примерно треть клеток в этом случае окрашивалось Флоксином Б (Рис. 1в). Таким образом, локальная концентрация феромонов в агглютинатах клеток при спаривании достаточно высока чтобы активировать каскад смерти, но слияние клеток предотвращает его развитие. Важно отметить, что хлорохин не влиял на смерть клеток а-типа по действием альфа-фактора (Табл. 1).

Таким образом, наши данные указывают, что смерть при спаривании является естественной частью процесса полового размножения дрожжей. Поскольку у дрожжей нет комплекса АПАФ, неожиданной кажется роль цитохрома ц в этом процессе. В настоящее время мы ищем белки, взаимодействующие с цитохромом ц в каскаде дрожжевой смерти.

2. Исследование роли митохондрий в феромон-зависимом каскаде смерти

«а

;г

Л в

О 5 20 80 Амиодарон, мкМ

а>

ч 2

а*

со

о « Ö

алыфгь фактор

Контр. NAC T0K0ysp1

Г|

тот днк

I й

к $

MSI» |

Рис. 2. Маркеры апоптоза и другие общие черты феромон- и амиодарон-зависимого каскада. А, амиодарон снижает количество колониия-образующих едениц в культуре. Б. альфа-фактор в концентрации 0,1 мг/мл обладает схожим с амиодароном эффектом. В, в пробы добавили 80 мкМ амиодарона. Другие добавки: 2 мкМ миксотиазола (миксо), 3 мМ нитропруссид натрия (нитро), 1 мМ фенил-тетраметилимидазол оксид (С-РТЮ), FCCP (F), 30 мМ NAC, 20 мкМ альфа-токоферол (токо). Г, выход цитохрома ц из митохондрий после 30 минут обработки 80 мкМ амиодароном. Клетки фиксировались 4% формальдегидом и окрашивались антителами к цитохрому ц. Фрагментация митохондрий в контроле -артефакт фиксации. Д, Е, детекция фрагментации ДНК после обработки амиодароном методами TUNEL и электрофореза. Ж, амиодарон, как и кальциевый ионофор, вызывает подъем [Са2+] в цитоплазме. Эффект амиодарона сильнее как показывает процент и показательные фотографии Fluo-3/АМ-положительных клеток.

Приведенные выше данные указывают на ключевую роль митохондрий в смерти дрожжей при спаривании. В то же время использованная модель не вполне удобна для детального изучения этой роли. Действительно, каскад смерти зависит от синтеза белка de novo, что затрудняет анализ быстрой кинетики митохондриальных изменений. Поэтому мы начали поиск способ активировать каскад феромон-зависимой смерти после (downstream of) активации синтеза специфических белков. Известно, что подъем [Са2+] в цитоплазме является промежуточным этапом ответа на феромон. Более того, по литературным данным даже малые концентрации альфа-фактора токсичны для клеток с мутациями по кальмодулину. Исходя из этого, мы проверили кальциевые ионофоры и амиодарон (фармакологический агент, вызывающий вход кальция в цитоплазму дрожжевой клетки) в качестве индукторов клеточной смерти. Эффект от добавки амиодарона был качественно похож на эффект ионофоров, но развивался быстрее (даннные не приводятся), поэтому большинство экспериментов проводилось с использованием амиодарона. Прежде всего, мы повторили данные лаборатории Корчезне (Courchesne) о токсичности амиодарона (Рис. 2а). Данные, приведенные на Рис. 2 (б,в) показывают практически большое сходство между феромон-и амиодарон-зависимыми смертями. В обоих случаях выживание стимулировалось инактивацией митохондриальной ДНК (Рис. 2в, столбик «пет»), делецией фермента, ответственного за присоединение гема к цитохрому ц (Рис. 2в, сусЗ), добавкой ингибиторов дыхания (миксотиазол или KCN), добавкой небольших концентраций разобщителя FCCP, антиоксидантов или делецией гена YSP1 (см. далее). Мутации по Са2+-кальмодулиновой системе способствовали смерти клеток под действием обоих индукторов. Мы также показали что, подобно феромону, амиодарон вызывает появление маркеров апоптоза в клетках: а именно выход цитохрома ц и фрагментацию ДНК (Рис. 2г,д,е). Мы также подтвердили, что амиодарон вызывает подъем концентрации Са2+ в цитозоле (Рис. 2ж).

концентрации амиодарона усиливают энергетическое сопряжение и максимальную скорость

дыхания. Возможно, эти эффекты опосредованы подъемом концентрации кальция в цитозоле. Что

касается энергетического сопряжения, то, в дрожжах отсутствует классическая Са -зависимая транзиторная пора (типичная для клеток животных, данные лаборатории Р.А. Звягильской), и при этом подъем [Са2+] в цитозоле снижает неселетивную прводимость митохондриальной мембраны (лаб. С. Урибе [ШЬе]). Ключевую роль [Са2+] подтверждает и тот факт, что амиодарон не действовал на изолированыые митохондрии (данные не приводятся).

10 16 Я 28 XI К «

амиодарон, мкМ

Рис.3 Эффект амиодарона на дыхание клеток дрожжей. 0,6-Ю7 клеток/мл; олигомицин (олиго), 10 мкг/мл; FCCP, 1 мкМ; амиодарон (амио); 7 мкМ миксотиазол (миксо).

Таким образом, посредством поднятия [Ca +] в цитозоле амиодарон активирует дыхание и сопряжение митохондрий. Отражается ли это на уровне мембранного потенциала? Для ответа на этот вопрос мы использовали митотрекер Orange. Этот краситель накапливается в митохондриях в зависимости от величины д'Р У на их внутренней мембране. Как показано на рис. 4 (а), в контрольных клетках окрашивание митохондрий заметно только при увеличенном контрасте микрофотографии. В то же время амиодарон в широком спектре концентраций вызывал заметное увеличение интенсивности окраски (Рис. 46). Важно отметить, что амиодарону требовалось около 5 минут чтобы вызвать такое

феромон

<о

О, lOKipacif

5 20 SO

амиодарон, мкМ

мертвые

мзда

«ш?

Рис. 4. Эффекты феромона и амиодарона на Ау/ митохондрий опосредованы подъеиау [Са]. Для полуколичественного определения Ду использовали митотрзкер Orange. А, 01 мг/мл альфа-фактор. Б, цифры под фотографиями указывают концентрацию амиодарона. В, Г, кальциевый ионофор А-23187 вызывает подъем Ду, генерацию АФК (В, Г) и смерть клеток (Г). Масштаб - 10 мкМ.

увеличение, в то время как альфа-фактор вызывал подобный эффект (Рис. 4а) не менее чем через 30 минут (данные не приводятся).

Известно, что аномально высокий ЛЧ' митохондрий может вызвать формирование АФК, которые, в свою очередь, являются интермедиатом каскада апоптоза. Чтобы проверить подобное развитие событий в нашей системе мы протестировали кинетику формирования АФК после добавки амиодарона. Аналогично альфа-фактору, амиодарон вызывал резкий подъем скорости окисления НзОСТ-ОА, при этом эффект амиодарона был значительно быстрее эффекта альфа-фактора (Рис. 5а,б). Как и ожидалось, подъем ЛЧ' несколько опережал подъем уровня АФК (Рис. 5а). Более того, тот факт, что антиоксиданты (К-ацстилцистеин и альфа-токоферол) в несколько раз повышали выживание после обработки амиодароном, указывает на функциональную роль АФК в каскаде смерти.

Достаточен ли вызванный амиодароном подъем [Са2+] в цитозоле для инициации клеточной смерти? Как показано на Рис. 4в,г, кальциевый ионофор А23187 также вызывал накопление АФК и клеточную смерть, но эффект амиодарона был сильнее (Рис. 2ж) Возможно, различие вызвано тем, что амиодарон вызывал значительно более быстрый подъем [Са2+] (данные не приводятся). Чтобы изучить роль ЛЧ' на внутренней мембране митохондрий в каскаде клеточной смерти, мы предотвратили его подъем добавкой БССР. Как и ожидалось, подъем ЛЧ' и АФК были заингибированы. Что существенно, РССР повышал в несколько раз выживание клеток (Рис. 2в). Следовательно, подъем ЛЧ* - не побочный эффект, а необходимый этап развития каскада. Как оказалось, 0,4 мкМ РССР было достаточно для этих влияний. Более высокий (6 мкМ) РССР оказывал негативное влияние на выживание (Рис. 2в), и этот негативный эффект не является специфичным для РССР, поскольку другой разобщитель (8Р6847) в относительно большой концентрации также снижал выживание (данные не приводятся).

Тот факт, что малые концентрации разобщителя снижают АФК, указывает на то, что они образуются в (2-цикле. Чтобы это проверить, мы использовали ингибиторы двух стадий (}-цикла. Оказалось, что миксотиазол снижал образование АФК, а антимицин, наоборот, усиливал их генерацию (Рис. 2в). Эти факты полностью соответствуют предположению о С2-цикле (Рис. 2в). Наконец, антиоксиданты М-ацетилцистеин и альфа-токоферол усиливали выживание (Рис. 2в), подтверждая функциональную роль АФК в каскаде смерти.

Фрагментация митохондриальных филаментов часто сопровождает апоптоз клеток животных. Мы также замечали, что в моделях феромон- и амиодарон-зависимой смерти клетки также фрагментируют митохондрии (Рис. 4а,б). Ответом на вопрос, является ли эта фрагментация этапом каскада или побочным явлением, послужил предпринятый нами генетический скрининг. С помощью случайной инактивации генов мы искали

40 30

•а

U го

к В

4S „

О 30 во 90 120 150 180

гр емя (мин)

Рис. 5. Кинетика роста Ау и уровня АФК под действием альфа-фактора и амиодарона. А, Д\|/ и АФК после добавки 80 мкМ амиодарона. Б, накопление АФК-содержащих клеток после добавки 0,1 мг/мл альфа-фактора. АФК детектировались с помощью 50 мкМ H2-DCF-DA Масштаб - 10 мкм.

делеционных мутантов, устойчивых к губительному действию альфа-фактора. Для этой мы мутировали дрожжи делеционной библиотекой (лаб. М. Снайдера). Потом мутированные клетки обрабатывались высокой дозой альфа-фактора, а после культура высевалась на твердую среду и выжившие мутанты вырастали в колонии. Кроме специфических мутантов по программе смерти, в первичном скрининге мы получали клетки с полностью инактивированным ответом на феромон (стерильные клетки, как мутант ste20), а также клетки с потерянной респираторной функцией митохондрий (петиты). Чтобы исключить последние две категории мы протестировали полученных

Т"---V

/ \ с феромон

без фероыо]

У i

'"„...,,„,.....Т~.„

щщ

It 1 ■не

Г,"" ' i (г - м

■ Г. ' " .-ч

■,- . jS ni

Б rcm,

бг, до 5 w. or:

Yspl-OFP

ддазй ran, 4 «.подарок

ïvïîtïOîpmp

АФК

H ¡И 1

Е чаи ■ а . Я

àysj»!, 30 se»

♦ fCC? 0,4 юМ 3D мш

даши т, LH,

+ *ккед»рен. НАС

Ayspt + лмкод*.рон

» ю1 Itf w*

фяусреецейцйХ

ssiKisS щ Ь ашн.

i'W iffWRH

фвувреетфнцяа

Рис. 6. Локализация и функция Yspl. А, ко-локализация Yspl-GFP и митотрэкера Orange. Масштаб - 10 мкм. Вверху показана рассчитанная структура Yspl, содержит плекстриновый домен и два транс-мембраиных домена. Б, Yspl необходим для фрагментации митохондрий после обработки амиодароном. Изображения получали путем объединения 20 оптических срезов через клетку. Масштаб - 10 мкм. В, Определение А1!1 и АФК в клетках методом FACS. Амиодарон (80 мкМ) был добавлен в момент времени 0 мин.

мутантов на способность спариваться и на способность роста на несбраживаемом источнике углерода.

феромон-зависимой смерти (данные не приводятся), так и при обработке амиодароном (Рис. 2в). Как показано на рис. 66, амиодарон вызывает полную фрагментацию митохондриальпых филаментов, а делеция YSP1 существенно снижает этот эффект. В то же время эта мутация не снизила подъем ДЧ" (Рис. 4а и 6в) и АФК (Рис. 6в), подтверждая, что амиодароц-завпсимая генерация АФК как таковая не является летальной, но служит сигнальным этапом каскада смерти. Поскольку амиодароновая модель клеточной смерти является схожей и одновременно более быстрой и эффективной по сравнению с феромон-зависимой системой, мы предприняли попытку скрининга генов, ответственных за амиодарон-зависимуга смерть.

Как и в случае с альфа-фактором был произведен случайный мутагенез клеток делеционпой библиотекой, после чего мутанты тестировали на устойчивость к амиодарону. Мы ожидали, что устойчивость может возникать как от инактивации непосредственной программы смерти, так и от гипер-стабилизации гомеостаза кальция. Чтобы исключить мутантов второго типа, выжившие клетки тестировали на способность накапливать митотрэкер Orange в митохондриях после обработки амиодароном. Иными словами, искали мутантов, похожих по фенотипу на Aysp 1. В результате было обнаружено, что инактивация гена YDR326c приводила к существенному (в 5 раз) увеличению выживания после обработки амиодароном (Рис. 76), и при этом не предотвращала генерацию АФК (Рис. 7а). Как и в случае с YSP1, делеция YDR326c существенно ингибировала амиодарон-зависимую фрагментацию митохондрий (Рис. 7в). Поскольку ген YDR326c к тому моменту был неохарактеризован, мы назвали его YSP2 (по аналогии с YSP1). Подобно YSP1, YSP2 не имеет выраженных гомологий среди генов высших организмов и предположительно кодирует продукт с транс-мембранным доменом.

Интересно, что в этом скрининге мы также выделили мутантов с делецией YSP1 (данные не приводятся), что еще раз указывает на сходство феромонового и амиодаронового каскадов смерти. Суммируя данные по этим двум каскадам, можно их объединить в одной схеме (Рис. 8). Схема предполагает, что феромон гипер-активирует МАР-киназный путь (этапы 2-4), что приводит к повышению концентрации кальция, достаточному для инициации митохондриальпых изменений (этапы 5-9), приводящих в итоге к клеточной смерти.

Рис. 7. Локализация и функция Узр2. А, в контроле после добавки амиодарона АФК окрашивают всю клетку, а в Аузр2 АФК - в структурах, морфологически похожих на митохондрии. Б, делеция УЗР2 повышает устойчивость и предотвращает фрагментацию митохондрий (В) после обработки амиодароном. Г, Снижение рН в среде вызывает образование АФК только в присутствии ацетата. Как и в панели А, заметна У8Р2-зависимое различие в локализации АФК. Г, делеция УЭР2 повышает устойчивость к ацетату, рН=3. Масштаб - 5 мкм.

Используется ли рассмотренный выше каскад в других сценариях физиологического самоубийства дрожжей? Классическая экспериментальная система для изучения смерти дрожжей -хронологическое старение, т. е. старение в стационарной культуре. Этот вид смерти можно считать активным. Действительно, дрожжи, помещенные в воду, не теряют жизнеспособности в течении года, а дрожжи в стандартной питательной среде (УРО) умирают через 2-3 недели после достижения стационарной плотности. Большой объем публикаций указывает, что основная причина смерти в стационаре - закисление среды из-за накопления уксусной кислоты. Кроме того, известно, что уксусная кислота вызывает появление маркеров апоптоза и смерть дрожжей (см. работы и обзоры Ф. Мадео [Мас1ео]).

Исходя из этих предпосылок, мы протестировали роль белка Узр2 в ацетат-зависимой смерти дрожжей. Оказалось, что делеция УБР2 не снижает АФК, индуцированные уксусной кислотой (Рис. 7г), и в то же время (как и делеция гомолога про-апоптозной протеазы, гена ИМАШ) в несколько раз увеличивает выживание (Рис. 7д).

феромон

(1) j,

рецептор

(2) : г

Asts20

(3)

амиодарон

подъем (Ca] в цитоплазме

И)

синтез белка

подъем скорости дыхания

/и уровня сопряжения

I I

И I

подъем |_ низкий FCCP g

-миксотиазол Я

циклогекснмид

р>1

АФК Ь (8) I

Уsp 1, Ysp2 -зависимая фрагментация митохондрий

падение выход цитохрома ц

ИАСк токоферол

Ayspl. &у$р2

<Ю)\

смерть кпетш

Рис. 8. Гипотетическая схема каскадов феромон- и амиодарон-зависимой смертей. Пояснения - в тексте.

Где пересекаются пути амиодарон- и ацетат-зависимой смертей? Наши данные указывают, что закисление цитоплазмы причиной токсичности ацетата. Известно, что ацетат может уравновешивать рН по разные стороны липидной мембраны пересекая ее в протонированной форме и диссоциируя протон в более щелочном компартменте. Другие способы снижения рН в цитозоле (с помощью пропионата или комбинации НС1-нигерицин) также приводили к АФК- и У5р2-зависимой смерти дрожжей (данные не приводятся). Простейшим объяснением этого факта является то, что при низких значениях рН супероксид, основной АФК производимый в митохондриях, протонируется и становится значительно более реакционно-способным. Итак, с одной стороны, по литературным данным кальциевый гомеостаз никак не связан с устойчивостью дрожжей к ацетату. С другой стороны, и амиодароновый и ацетатный каскады смерти зависят от АФК и Узр2. Исходя из этой логики, можно предположить, что эти пути сливаются на уровне АФК (Рис. 8).

3. Мягкое энергетическое разобщение дрожжей

Как следует из предыдущего раздела, мягкое разобщение, т. е. контролируемое снижение уровня мембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий, может повысить выживание дрожжей после стресса. Позитивный эффект мягкого разобщения распространяется и на высшие организмы. Поскольку увеличение проводимости внутренней митохондриальной мембраны приводит к «холостому» сжиганию калорий, оно может служить заменой ограничению по калориям, а также быть полезным при

гипотермии. Подобно случаю с дрожжами, мягкое разобщение может снизить уровень АФК в клетках высших эукариот и таким образом противостоять процессам старения и канцерогенеза.

Действительно, в лаборатории В.П. Скулачева было показано, что при гиперполяризации митохондрий небольшое (10%) снижение ЛТ вызывает 10-кратное снижение продукции АФК. Проблема заключается в том, что при передозировке разобщителя уровень ДЧ* может упасть ниже критического для генерации АТФ с очевидными токсическими последствиями (см. ссылки в PNAS 2010.107. 663-668).

Поэтому была поставлена задача найти вещество, которое избирательно снижает Af в митохондриях с высоким потенциалом. Мы обратились к липофильным проникающим катионов. Эти вещества (например, тзтрафенилфосфоний) способны проходить через бислойную мембрану поскольку их положительный заряд де-локализован по всей молекуле. Так как митохондрия -единственная отрицательно-заряженная органелла в клетке, то такие катионы избирательно накапливаются в митохондриях. До начала экспериментов у нас были предварительные данные о возможной разобщающей активности таких катионов (не приводятся). В рамках биомедицинского проекта «Ионы Скулачева» разобщающая активность проникающих катионов SkQl и С12-ТРР (Рис...) была подтверждена методом динамического моделироваия, а также экспериментально на моделях бислойной мембраны, липосом и митохондрий in vitro (PNAS 2010, 107. 663-668). Поскольку эти липофильные катионы специфически накапливаются в митохондриях, можно было ожидать, что их протонофорное действие (в отличие от стандартных разобщителей) будет также митохондриально-направленным. Для проверки этого предположения мы использовали измерение дыхания дрожжей внейтральной и кислой культуральных средах. Прежде всего, мы убедились, что закисление цитоплазмы существенно тормозит скорость дыхания (данные не приводятся). Таким образом, в кислой (но не в нейтральной) среде увеличение тока протонов через цитоплазматическую мембрану является ингибитором дыхания. В то же время увеличение проводимости внутренней мембраны митохондрий - стимулятор дыхания (см. раздел по амиодарону). Как показано на рис. 9а, при рН = 3.0 (в отличии от рН = 5.5) в среде анионный разобщитель FCCP стимулировал дыхание только в очень узком диапазоне концентраций. Катионный разобщитель С12-ТРР проявлял стимулирующие свойства в более широком окне концентраций, и график зависимости не имел колокообразной формы как в случае с FCCP (Рис. 96). Таким образом, С12-ТРР является митохондриально-направленным протонофором. Более широкий, чем у FCCP диапазон стимулирующих концентраций С12-ТРР также указывает на потенциал-зависимость его действия. Чтобы подтвердить, что высоко-

го

4 1 g I - il

Я О

VpWîo

К * HJ . (I

£FCCP],MKM

.te 1 ft w 32

»míe

« M « í* ti № «

[С12ТРР],МКМ

Рис. 9. Стимуляг^я дыхания клеток дрожжей добавками РССР и С12-ТРР. Инкубационная среда: 50 мМ фосфат калия указанных значений рН (доводили Н]Р04), 0,5% глюкоза.

энергизованные митохондрии наиболее подвержены действию новых разобщителей, мы сравнили их действие на обычные клетки и на клетки petite. Поскольку в случае petite ДЧ* митохондрий поддерживается не за счет дыхания а вследствии работы протонной АТФ-азы, его уровень значительно ниже такового в контрольных клетках. Следовательно, можно было ожидать, что превращение в petite вызовет устойчивость к катионам-разобщителям. Для проверки этого предположения мы использовали новую модификацию проникающего катиона - C12R1 (Рис. 10а). Дело в том, что разобщающее действие С12-ТРР происходит за счет симпорта этого иона с де-протонированной формой свободной жирной кислоты (PNAS 2010,107, 663-668). Разобщитель C12R1 содержит протонируемую аминогруппу, и вследствии этого может оказывать протонофорное действие и в отсутствии свободных жирных кислот (J Biol Chem. 2011, 286, 1783117840). Возможно, именно из-за этого различия C12R1 менее опасен при передозировке. В частности, C12R1, в отличие от своего непротонируемого аналога C12R4, не вызывает набухания митохондрий (J Bioenerg Biomembr. 2011, 43,175-180) - потому что не так сильно в них накапливается.

■ СЛ1

■ DNP

Рис. 10. А. Структура протонируемого разобщителя C12R1. Б, дрожжи форм Grande и Petite растили в присутствии C12R1 (10 мкМ) или DNP (0,5 мМ). 100% скорости роста - рост без добавок. Отклонения -стандартная ошибка среднего.

глкцерохгякямм гяюкма Grande Grande petite

100: * 80: € 60: £ 40Î 20:

C12R1

4. Защитное и повреждающее действие АФК при генотоксическом стрессе

Известно, что АФК участвуют не только в каскаде клеточной смерти, но и в сигнальных путях, не связанных со смертью. Более того, иногда АФК выполняют защитную роль. Так, в определенных случаях в ответ на ухудшение условий клетка вырабатывает количество АФК достаточное для индукции анти-оксидантных систем и таким образом «готовится» к более сильным стрессам. Рассматривая популяцию дрожжевых клеток, логично ожидать, что относительно небольшой стресс будет индуцировать защитные АФК, а высокий уровень стресса (достаточный для массированного повреждения генома клетки) вызовет АФК-индукторы каскада смерти. Чтобы проверить эту гипотезу мы обратились к модели генотоксического стресса. Группой Доетча (Оое15сЬ) было показано, что в ответ на повреждение ДНК метилметансульфонатом (ММС) дрожжи генерируют АФК. Мы проверили эффект анти- и про-оксидантов на выживание дрожжей после обработки различными дозами ММС. Оказалось, что менадион увеличил выживание дрожжей обработанных низкими концентрациями ММС, но его эффект был противоположным в случае высоких концентраций (Рис. 11а). Более того, антиоксидант ионол способствовал выживанию клеток после высоких доз ММС (Рис. 11а).

Чтобы убедится, что эти эффекты не являются специфическими для менадиона и ионола, мы протестировали другие анти- (альфа-токоферол, тролокс) и про-оксиданты (перекись водорода, антимицин). Оказалось, что после обработки низкой дозой ММС про-оксиданты, в отличие от анти-ксидантов, увеличивали выживание (Рис. 116). Мы также показали, что высокая концентрация С12-ТРР (10 мкМ) действует как мягкий прооксидант (Рис. 11г), и при этом защищает дрожжи от низких доз ММС (Рис. 11 в). Интересно, что вещество с локализованным положительным зарядом (СТАВ) обладало схожим с С12-ТРР но менее эффективным действием, а БОБ (липофильный анион с локализованным

II в

50 100 200 токоферол ыхМ

Рис. 11. Про-оксиданты защищают от токсичности ММС. А, эффекты менадиона (5 мкМ, точечная линия) и ионола (100 мкМ, пунктирная линия) и спиртового контроля (сплошная линия) на выживание дрожжей после обработки указанными концентрациями ММС, Б, процент выживших клеток после обработки 5 мкМ ММС в присутствии различных про- и антиоксидантов: Тролокс, 100 мкМ; перекись водорода (0,3 мМ); антимицин А, (2 мкг,мл). *р<0,01, *р<0,005 в соответствии с ¡-тестом по сравнению с контролем. В, выживание после обработки 5 мкМ ММС. С12ТРР, СТАВ — 10 мкМ, токоферол - 50 мкМ. Г, окраска клеток H2-DCF-DA после добавки контрольного растворителя (а), 10 мкМ С12-ТРР (б), 10 мкМ СТАВ (в), 35 мкМ SDS (г). Д, во сколько раз увеличили продукцию Н203 добавки, представленные в панели Г. Измерение методом Amlex Red/HRP. Е, морфология митохондрий необработанных клеток, а также клеток с 10 мкМ С12-ТРР, 10 мкМ С12-ТРР в присутствии 10 мкМ токоферола, и сЮ мкМ СТАВ. Масштаб -5 мкм. *р<0,01 в соответствии с t-тестом по сравнению с контролем.

зарядом) был неактивен в нашей системе(Рис. 11в,г,д). Впоследствии мы выяснили, что про-оксидантный эффект С12-ТРР связан с набуханием митохондри, которое вызвано накоплением в них С12-ТРР ((Рис. Не, а таюке I Вюепе^ ВюшешЬг. 2011, 43,175-180).

Как АФК защищают от низких доз мутагена? Во-первых, мы показали что эффект есть и на клетках, синхронизованных в клеточном цикле (Рис. 12а) . Следовательно, АФК не связан с обогащением культуру клетками содержащими двойной набор хромосом, которые более устойчивы к повреждениям ДНК. С другой стороны, защитный эффект исчезал при добавке ингибитора транскрипции актиномицина Д (Рис. 126). Таким образом, наиболее вероятно, что АФК активируют транскрипцию ферментов-репараз ДНК. Для проверки этой гипотезы мы сравнили опубликованные данные по глобальным изменениям в профилях экспрессии генов после окислительного и генотоксического стрессов. Оказалось, что транскрипционные ответы на эти стрессы во многом совпадают,

ММС, мкМ

40)

Рис. 12. Защитное действие про-оксидинтов опосредовано их эффектом на экспрессию генов. А, эффекты менадиона (5 мкМ, точечная линия), С12-ТРР (ШмкМ, точечно-пунктирная линия) и спиртового контроля (сплошная линия) на выживание синхронизованных нокодазолом (10 мк.мл) дрожжей после обработки указанными концентрациями ММС. *Р<0.05, **Р<0.005, ***Р=0.053. Б, выживание дрожжей, обработанных 5 мкМ ММС, в присутствии указанных добавок. Концентрации: С12-ТРР, 10 мкМ; менадион, 5 мкМ; актиномицин, 10 мкг/мл. *Р<0.01 по сравнению с соответствующей пробой без актиномицина. В, 1% (62) генов с максимальным увеличением экспрессии были выбраны для анализа совпадений. Их названия и функциональные категории (в соответствии с вСИ) представлены в правой панели.

совпадения включают ряд ДНК-связывающих белков (Рис. 12в), что подтверждает наше предположение. Важно отметить, что ответ на окислительный стресс развивается быстрее, чем на генотоксический (данные не приводятся). Это объясняет, почему клетки используют АФК для мобилизации защиты от мутаций. Суммируя вышеизложенное, объяснение роли АФК в ответе на повреждения ДНК укладывается в простой алгоритм: малое повреждение - малые АФК -транскрипция защитных белков; большое повреждение - высокие АФК - активация митохондриального этапа каскада клеточной смерти.

ММС

меиздиоа

5. Полиглутаминовые агрегаты белков и субстраты циклосомы

В этой части работы мы использовали дрожжевой каскад клеточной смерти для моделирования и исследования последствий образования полиглутамин-зависимых агрегатов белков в клетке. Агрегация белков с полиглутамин-богатыми фрагментами вызывает ряд нейродегенеративных заболеваний. Так, например, болезнь Хантингтона индуцируется тем, что мутация приводит к удлинению полиглутамин-богатого фрагмента белка хантинтитина. и белок начинает агрегировать. Дрожжи широко используются как модель для изучения молекулярных механизмов подобной агрегации. Типичный подход таков: дрожжи трансформируют плазмидой для экспрессии полиглутамин-богатого фрагмента мутированного белка хантингтина слитого с флуоресцентным белком. После индукции экспрессии этого химерного белка, например, 103С>-СРР ((2 - остаток глутамина в полипептиде, СРР - циановый флуоресцентный белок), анализируется степень его агрегации, размер агрегатов и т.п.

СЕР

АФК

О I» ЦЛГ V ПГ

И 1

к АЖ

Рис. 13. А, 103<3-СРР (но не 25(5-СРР) вызывает рост АФК (окраска 50 мкМ Н2-ОСР-ОА). Б, . СРР- синий цвет, иодид пропидия (окраска на мертвые клетки) - красный, РГГС-УАО-йпк (детекция каспазной активности) - зеленый. В, 12 часов экспрессии приводят к появлению заметной пропорции клеток с деградированной ДНК (количественный анализ ДНК методом РАСЭ, пик показан стрелкой).

Мы решили исследовать физиологические последствия агрегации, а именно проверить, не вызывает экспрессия 103С)-СРР в дрожжах последствий, похожих на дегенрацию нейронов при болезни Хантингтона. Оказалось, что, подобно больным нейронам, 103С)-СРР вызывает появление маркеров апоптоза в дрожжах: повышение митохондриальных АФК, активацию каспазной активности и фрагментацию ядерной ДНК (Рис. 13). Неожиданно, сходство обнаружилось и в локализации полиглутаминов. Нормальный хантингтин локализован в цитоплазме, а удлинение полиглутаминового фрагмента приводит к каспазо-зависимуму расщеплению белка и накоплению его в ядре. Оказалось, что и в дрожжах фрагмент нормальной длины (25С>-СРР) локализован в цитозоле, а 103С>-СРР перемещается в ядро через несколько часов после индукции экспрессии (Рис. 14 а), и это перемещение совпадает с началом 1030-зависимой задержкой роста (данные не приводятся) и накоплением клеток с деградированной ДНК (Рис. 13в). Несмотря на то, что 103(3-СРР не расщепляется в дрожжах (М. Шерман, личное сообщение),

его перемещения в ядро не происходит в мутанте с делетированной УСА1 - дрожжевой метакаспазой (Рис. 14 б,в).

Рис 14. А, Локализация 25Q-CFP и 103Q-CFP в клетках. Черно-белым показан CFP, цветные панели -наложение CFP (синий) и ДНК (красный), Короткие стрелки показывают клетки, в которых CFP практически полностью ко-локапизуется с ДНК. Длинная стрелка указывает на клетку с фрагментированным ядром. Б, деления YCA1 предотвращает ко-локализацию 103Q-CFP (зеленый) и ДНК (красный). В, количественный обсчет эффекта (как степени совпадения двух цветовых сигналов), представленного в панели Б. Масштаб - 10 мкМ.

Таким образом, дрожжи являются моделью не только для изучения механизма агрегации, но и для исследования ее пато-физиологических последствий. В дальнейшем мы исходили из следующей гипотезы: если 103Q-CFP инициирует каскад клеточной смерти, то с помощью случайной инактивации генов можно снизить его токсичность. Если это так, то определив инактивированный ген, можно предложить белок-мишень для лечения заболевания. Исходя из этой логики, мы предприняли генетический скрининг, методически похожий на таковые по устойчивочти к феромону и амиодарону. Мы обнаружили, что делеция ASE1 снижает токсичность экспрессии 103Q-CFP (Рис. 15). Asel стабилизирует веретено деления, а также является субстратом поздней формы циклосомы, APC-Cdhl. Циклосома - белковый комплекс, он присоединяет убиквитиновую цепочку к своим субстратам и таким образом направляет их для протеосомальной деградации. В основном этими субстратами являются циклины, ключевые регуляторы клеточного цикла. Мы

предположили, что агрегаты 103Q-CFP могут блокировать протеасому, и в этом случае накопление ее циклосомальных субстратов (например, Asel) может определять токсичность 103Q-CFP. Для проверки этого предположения мы нокаутировали несколько циклинов и обнаружили, что деления CLB2, как и гипер-экспрессия активатора циклосомы Cdhl, полностью устраняла токсичность экспрессии 103Q-CFP (Рис. 15). Интересно, что деления YCA1 также частично снижала токсичность 103Q-CFP (Рис. 15). Можно предположить, что этот эффект связан с измененной локализацией агрегатов в мутанте (Рис. 14б,в).

а §

I 16«

jf 14Й

| 12» s

g. 100 'S

I so

о 5

§ 69

£• 4«

3 о

2«

•I........■"""""—r

Дикий ЮЗО 1Ö3Q 103Q nm yeal asel

103 Q elb2

COH1

103O 103Q CDH1 yc*1 CDH1

Рис. 15. Делеции УСА1, А5Е1, С1^В2, а также гипер-экспрессия СМИ!, снижают токсичность экспрессии 103Q. Показаны выраженные в процентах отношения средних размеров колоний в условиях индукции ЮЗС^-СИР (среда с галактозой, т. к экспрессия ЮЗО-СТР индуцируется этим сахаром) к таковым в отсутствии экспрессии (среда без галактозы). Это отношения для контрольного штамма превышает 100% -возможно, так как суммарная концентрация углеводов в галактозо-содержащей среде превышает таковую в среде без индуктора экспрессии 103(2-СРР. Все 103(}-СРР-экспрессирующие штаммы демонстрируют статистически-достоверное отличие от исходного (2-й столбец), р<0,05.

Важно отметить, что при нейродегенеративных заболеваниях, связанных с агрегацией белка (не только болезнь Хантингтона, но и Паркинсона и Альцгеймера) наблюдаются нарушения клеточного цикла в нейронах (см. ссылки в Биохимия, 2009, 74, 231 -234).

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что накопление субстратов циклосомы - важная составляющая патогенеза ряда нейродегенеративных заболеваний. С целью нахождения потенциальных белков-мишеней для терапии таких заболеваний мы проанализировали

литературные данные по субстратам поздней циклосомы в нейронах. Оказалось, что протеолиз ключевого регулятора гликолиза, фосфофруктокиназы 2 (Ффк-2), катализируется APC-Cdhl. В результате гликолиз подавляется, и биоэнергетика нейронов основывается на дыхании. Искусственное подавление APC-Cdhl в культуральных нейронах приводит к переходу на гликолиз и окислительному стрессу (Nature cell biology 2009, Д, 747-752). С другой стороны, известно, что при упомянутых выше заболеваниях в нейронах активируют гликолиз, подавляется дыхание и развивается окислительный стресс. Таким образом, ингибирование Ффк-2 кажется перспективной стратегией для борьбы с агрегат-зависимыми нейродегенеративными заболеваниями. В настоящее время мы проводим поиск низкомолекулярных ингибиторов этого фермента.

Заключение

В наших исследованиях мы прежде всего показали, что не только обычные стрессы, но и безвредный для других организмов пептид-феромон вызывает смерть дрожжевой клетки, которая сопровождается маркерами апоптоза. При дальнейшем изучении этой модели выяснилось, что важным промежуточным этапом каскада клеточной смерти является повышение концентрации кальция в цитоплазме, которое вызывает ряд изменений в митохондриях. Оказалось, что, несмотря на существенные различия между митохондриями дрожжей и животных, митохондриальные этапы каскадов клеточной

смерти во многом совпадают: повышение потенциала на внешней мембране митохондрий вызывает генерацию АФК, которая в свою очередь приводит к фрагментации митохондриального ретикулума. Мы показали, что в дрожжах этот каскад можно прервать как минимум двумя способами. Во-первых, инактивация генов УБР1 и УБР2 не влияет на образование АФК, но предотвращает фрагментацию митохондрий и смерть клеток. Во-вторых, вещества-разобщители предотвращают гиперполяризацию митохондрий и таким образом снижают смертность в исследуемой модели. В дальнейшем мы использовали дрожжи как модель для изучения новых разобщителей. Было показано, что проникающие катионы класса ЭкС} обладают мягким и митохондриально-направленным протонофорным эффектом, что делает их перспективными для разработки медицинских препаратов на их основе.

Мы также изучали другие модели клеточной смерти дрожжей. Наши экспериментальные данные подтвердили предположение о роли АФК при повреждениях ДНК. При относительно небольших повреждениях клетки генерируют АФК для быстрой мобилизации защитных систем, а при более серьезных повреждениях АФК способствуют клеточной смерти. Исследование модели смерти от белковых агрегатов указывает, что причина их токсичности в перегрузке протеасомы. Важно, что наиболее опасным для клетки последствием этой перегрузки является накопление субстратов циклосомы. Основываясь на этом выводе и на литературных данных, мы предложили новый белок-мишень для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Выводы

1. Половой феромон способен вызывать физиологическое самоубийство дрожжей. Количества феромонов, которые вырабатывают дрожжи при спаривании, достаточно для индукции смертельного каскада.

2. Промежуточным этапом этого каскада является повышение кальция в цитозоле, что вызывает гиперполяризацию митохондрий, приводя к генерации активных форм кислорода (АФК). АФК индуцируют фрагментацию митохондрий, которая приводит к смерти клетки.

3. Смертельный каскад можно прервать либо на уровне фрагментации митохондрий с помощью делеции генов У5Р1 и У8Р2, либо на уровне гиперполяризации митохондрий с помощью разобщителей.

4. Проникающие липофильные катионы класса Бкф обладают протонофорным эффектом. Этот эффект специфичен для митохондрий. Чем более поляризованной является митохондрия, тем выше разобщающий эффект таких катионов.

5. Активные формы кислорода являются защитным фактором при слабом генотоксическом стрессе и повреждающим при относительно сильном стрессе.

6. Причина токсичности белковых агрегатов в дрожжевой модели болезни Хантингтона -нарушение клеточного цикла, вызванное накоплением субстратов циклосомы. Ингибирование активности субстратов циклосомы - перспективная стратегия для терапии агрегат-зависимой дегенерации нейронов.

Основные публикации

1. Kuznetsov, S.A., Rivera, D.T., Severin, F.F., Weiss, D.O., Langford, G.M. Movement of axoplasmic organelles on actin filaments from skeletal muscle. //Cell Motil Cytoskeleton - 1994- V.28, P.231 -242.

2. Sorger, P.K., Severin, F.F., Hyman, A.A. Factors required for the binding of reassembled yeast kinetochores to microtubules in vitro. Hi Cell Biol - 1994 - V.127, P. 995-1008.

3. Severin, F.F., Schuyler, S., Kaplan, K.B., Sorger, P.K., Hyman, A.A.

Interaction of yeast kinetochores with microtubules. // Molecular Biology of the Cell - 1996 - V.7, P. 3289-3289.

4. Blocker, A., Severin, F.F., Habcrmann, A., Hyman, A.A., Griffiths, G., Burkhardt, J.K. Microtubulc-associated protein-dependent binding of phagosomes to microtubules. //

J Biol Chem - 1996 - V.271, P.3 803-3 811.

5. Nadezhdina, E.S., Bukharova, T.B., Koretsky, V.V., Potekhina, E.S., Severin, F.F., Shanina, N.A., Solovyanova, O.B., Zinovkina, L.A. Identification of new molecular components of microtubules and centrosomes. // Cell Biol Int - 1997 - V21, P.885-887.

6. Blocker, A., Severin, F.F., Burkhardt, J.K., Bingham, J.B., Yu, H„ Olivo, J,C.,. Schroer, T.A., Hyman, A.A., Griffiths, G. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules.// J Cell Biol- 1997 - V137, P.113-129.

7. Severin, F.F., Sorger, P.K., Hyman, A.A., Kinetochores distinguish GTP from GDP forms of the microtubule lattice. // Nature - 1997 - V.388, P.888-891.

8. Severin, F.F., Shanina, N.A., Shevchenko, A,. Solovyanova, O.B., Koretsky, V.V., Nadezhdina, E.S. A major 170 kDa protein associated with bovine adrenal medulla microtubules: a member of the centrosomin family? // FEBS Lett -1997 - V.420, P. 125-128.

9. Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J.C., Hyman, A.A., Severin, F.F.

A role for microtubule dynamics in phagosome movement.// J Cell Sei-1998 - V.l 11, P.303-312.

10. Muller-Reichcrt, Т., Chretien, D., Severin, F.F., Hyman, A.A. Structural changes at microtubule ends accompanying GTP hydrolysis: information from a slowly hydrolyzable analogue of GTP, guanylyl (alpha,beta)methylenediphosphonate. // Proc Nati Acad Sei U S A - 1998 - V.95, P.3661-3666.

11. Severin, F.F., Kaplan, K.B., Sorger, PK., Hyman, A.A. In vitro assays for studying Saccharomyces cerevisiae kinetochore activity. // Methods Cell Biol - 1999 - V.61, P.145-153.

12. Biggins, S, Severin, F.F, Bhalla, N., Hyman, A.A., Murray, A.W. Studies on sister chromatid separation and segregation in budding yeast. //Faseb Journal -1999 - V13, P. A1583-A1583.

13. Biggins, S., Severin, F.F., Bhalla, N., Hyman, A.A., Murraw, A.W. The conserved protein kinase Ipll regulates kinetochore binding to microtubules in budding yeast. // Genes and Development - 1999 -V13, P.532-544.

14. Sassoon, I., Severin, F.F., Andrews, P., Taba, H., Kaplan, K., Ashford, A., Stark, M, Sorger, P., Hyman, A. Regulation of yeast Sacharomyces cerevisiae kinetochores by the type 1 phosphatase Glc7p. // Genes and Development - 1999 - V.13, P.545-555.

15. Nielsen E., Severin F.F., Backer M.J., Hyman A.A., Zerial M. Rab5 regulates Motility of Early Endosomes on Microtubules. //Nat Cell Biol - 1999 - V.6, P.376-382.

16. De Vos, K., Severin F.F., Van Herreweghe, F,. Goosens, V., Hyman, A.A, Grooten, J. Tumor necrosis factor inhibits kinesin-mediated transport of mitochondria by hyperphosphorylation of kinesin light chain. // J Cell Biol - 2000 - V. 149, P. 1207-1214.

17. Desai, A.B., Oegcma, K.F., Severin, F.F., Rybina, S., Hyman, A.A. Analysis of microtubule binding by budding yeast kinetochores in vitro. Molecular Biology of the Cell - 2001 - V.12, P.177A-177A.

18. Nielsen, E., Severin F.F., Hyman, A., Zerial, M. In Vitro Reconstitution of Endosome Motility Along Microtubules. // Methods Mol Biol - 2001 - V.164, P. 133-146.

19. Severin, F.F., Habermann, B., Huffaker, T., Hyman, T. Stu2 promotes mitotic spindle elongation in anaphase. // J Cell Biol - 2001 - V.153, P. 435-442.

20. Shanina, N.A., Ivanov, P.A., Chudinova, E.M., Severin, F.F., Nadezhdina, E.S. [Translation initiation factor eIF3 is able to bind with microtubules in mammalian cells]. // Mol Biol (Mosk). - 2001 - V.35, P. 638-646.

21. Severin, F.F., Hyman, A., Piatti, S. Correct spindle elongation at the metaphase/anaphase transition is an APC-dcpendent event in budding yeast. // J Cell Biol - 2001 - V.155, P. 711-718.

22. Severin, F.F., Hyman, A.A. Pheromone Induces Programmed Cell Death in S. cerevisiae. Curr Biol -2002-V.12, P. R233-R235.

23. Popov, A.V., Severin, F.F., Karsenti, E. XMAP215 Is Required for the Microtubule-Nucleating Activity of Centrosomes. // Curr Biol -2002 - V.12, P. 1326-1330.

24. LehtoT., MiaczynskaM., Zerial M., Müller D., Severin F.F. Observing the growth of individual actin filaments in cell extracts by time-lapse atomic force microscopy. // FEBS Letters - 2003 -V.551, P.25-28.

25. Hashimoto, O.H., Severin, F.F. , Lanoix, J. , Hatsuzawa, K. , Wada, I. , Nilsson, T. Coatomer I protein I (COPI) and rab proteins are needed for ER-Golgi transport and juxta nuclear positioning of the Golgi. // Cell Structure and Function - 2004 - V.29, P. 104-104.

26. Akhmanova, A., Severin, F.F. Thirteen is the Lucky Number for Doublccortin. // Developmental Cell-2004-V7.P.5-6.

27. Mimori-Kiyosue, Y., Grigoriev, I., Lansbergen, G., Sasaki, H., Matsui, C., Severin, F.F., Galjart, N„ Grosveld, F., Vorobiev, I., Tsukita, S., Akhmanova, A. CLASP 1 and CLASP2 bind to EB1 and regulate microtubule plus end dynamics at kinetochores and the cell cortex. // J Cell Biol - 2005 - V.168, P.141-153.

28. Pozniakovsky, A.I, Knorre, D.A, Markova, O.V, Hyman, A.A, Skulachev, V.P., Severin, F.F. Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast. // J Cell Biol -2005 - V. 168, P.257-269.

29. Knorre, D.A, Smirnova, E.A., Severin, F.F. Natural conditions inducing programmed cell death in yeast Sacharomyces cerevisiae. II Biochemistry (Mose) - 2005 - V.70, P.264-266.

30. Sokolov, S.S., Severin, F.F., Agaphonov, M.O., Kalebina, T.S. The metilotrophic yeast Hansenula polymorpha as the model for screening for genes involved in apoptosis. // FEBS Journal - 2005 - V.272, P.44-44.

31. Hocpfncr, S., Severin, F.F, Cabczas, A., Habcrmann, B., Runge, A., Gillooly, D., Stcnmark, H., Zerial, M. Modulation of Receptor Recycling and Degradation by the Endosomal Kinesin KIF16B. // Cell

- 2005 - V.121, P. 437-450

32. Pal, A., Severin, F.F., Lommer, B., Schevchenko, A., Zerial, M. Huntingtin-HAP40 complex is a Novel Rab5 Effector that controls Early Endosome Motility and is upregulated in Huntington Disease. // J Cell Biol - 2006 - V.172, P. 605-618

33. Sokolov, S.S., Pozniakovsky A.I., Bocharova, N.A., Knorre, D.A., Severin, F.F.

Expression of an expanded polyglutamine domain in yeast causes death with apoptotic markers. II Biophys. Biochem. Acta - 2006 - V. 1757, P. 660-666.

34. Sokolov, S.S., Knorre, D.A, Smirnova, E., Markova, O.V., Pozniakovsky, A.I., Skulachev, V.P., Severin, F.F. Ysp2 mediates death of yeast induced by amiodarone or intracellular acidification. II Biophys. Biochem. Acta-2006 - V.1757, P. 1366-1370.

35. Sandall, S., Severin, F F.., McLeod, I., Yates 3rd, J., Oegema, K., Hyman, A., Desai, A. Complex of SIil5-Birl (INCENP-Survivin) Connects Centromeres to Microtubules and is the Likely Tension Sensor Controlling Aurora B Activation.// Cell-2006-V. 127, P. 1179-1191.

36. Elie-Caille, C., Severin, F.F., Helenius, J., Howard, J., Muller, D.J., Hyman, A.

Straight GDP-Tubulin Protofilaments Form in the Presence of Taxol. // Curr Biol - 2007 - V.17, P. 17651770.

37. Pal, A., Severin, F.F., Hopfner, S., Zerial, M. Regulation of endosome dynamics by Rab5 and its Huntingtin-HAP40 effector complex in physiological versus pathological conditions. // Methods in Enzymology - 2008 - V. 438, P. 239-257

38. Severin, F.F., Meer, M.V., Smirnova, E.A., Knorre, D.A., and Skulachev, V.P.

Natural causes of programmed death of yeast Saccharomyces cerevisiae, II Biochim Biophys Acta - 2008

- V.1783, P.1350-1353

39. Knorre, D.A., Saprunova, V.B., Ojovan, S.M., Sokolov, S.S., Bakeeva, L.E., Severin, F.F. Mitochondrial matrix fragmentation as a protection mechanism of yeast Saccharomyces cerevisiae. II Biochemistry (Mose; - 2008 - V.73, P. 1561-1568.

40. Bocharova, N.A, Chavc-Cox, R, Sokolov, S.S, Knorre, D.A., Severin, F.F. Protein aggregation and neurodegeneration: clues from a yeast model of Huntington's disease. //

Biochemistry (Mose) - 2009 - V.74, P. 231-234.

41. Bocharova, N.A., Sokolov, S.S., Knorre, D.A., Skulachev, V.P., Severin, F.F. Unexpected link between anaphase promoting complex and the toxicity of expanded polyglutamines expressed in yeast. // Cell Cycle - 2008 - V.7, P.3943-3946.

42. Knorre, D.A., Krivonosova, T.N., Markova O.V., Severin, F.F. Amiodarone inhibits multiple drug resistance in yeast Saccharomyces cerevisiae. // Arch Microbiol - 2009 - V.191, P. 675-679.

43. Severin, F. F., Skulachev, V. P. Programmed cell death as a target to interrupt the aging program. // Advances in Gerontology - 2009 - V. 22, P.37-48

44. Ожован, С. M., Кнорре, Д. А., Северин, Ф. Ф., Бакеева Л. Е. Влияние амиодарона на ультраструктуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae. // Цитология - 2009 - Т.51, С.911 -916

45. Severin, F.F., Severina, 1.1., Antonenko, Y,N„ Rokitskaya, T.I., Cherepanov, D.A., Mokhova, E.N., Vyssokikh, M.Y., Pustovidko, A.V., Markova, O.V., Yaguzhinsky, L.S., Korshunova, G.A., Sumbatyan, N.V., Skulachev, M.V., Skulachev, V.P. Penetrating cation/fatty acid anion pair as a mitochondria-targeted protonophore. //Proc Natl Acad Sei U S A - 2010 V.107, P. 663-668.

46. Skulachev, V.P., Antonenko, Y.N., Cherepanov, D.A., Chernyak, B.V., Izyumov, D.S., Khailova, L.S., Klishin, S.S., Korshunova, G.A., Lyamzaev, K.G., Pletjushkina, O.Y., Roginsky, V.A.,Rokitskaya, T.I., Severin, F.F., Severina, 1.1,, Simonyan, R.A., Skulachev, M.V., Sumbatyan, N.V., Sukhanova, E.I., Tashlitsky, V.N., Trendeleva, T.A., Vyssokikh, M,Y., Zvyagilskaya, R.A. Prevention of cardiolipin oxidation and fatty acid cycling as two antioxidant mechanisms of cationic derivatives of plastoquinone (SkQs). // Biochim Biophys Acta - 2010 -

V. 1797, P. 878-889.

47. Knorre, D.A., Smirnova, E.A., Markova, O.V., Sorokin, M.I., Severin, F.F. Prooxidants prevent yeast cell death induced by gcnotoxic stress. // Cell Biol Int - 2011 - V.35, P. 431-435.

48. Knorre, D.A., Kulemzina, I.A., Sorokin, M.I., Kochmak, S.A., Bocharova, N.A., Sokolov, S.S., Severin, F.F. Sir2-dependent daughter-to-mother transport of the damaged proteins in yeast is required to prevent high stress sensitivity of the daughters. // Cell Cycle - 2010 - V.9, P. 4501-4505.

49. Kochmak, S.A., Knorre, D.A., Sokolov, S.S., Severin, F.F. Physiological Scenarios of Programmed Loss of Mitochondrial DNA Function and Death of Yeast. // Biochemistry (Moscow) - 2011 - V.76, P. 167-171.

50. Ojovan, S.M., Knorre, D.A., Markova, O.V., Smirnova, E.A„ Bakeeva, L.E., Severin, F.F. Accumulation of dodecyltriphenylphosphonium in mitochondria induces their swelling and ROS-dependent growth inhibition in yeast. // J Bioenerg Biomembr - 2011 - V.43, P. 175-180.

51. Antonenko, Y.N., Avetisyan, A.V., Cherepanov, D.A., Knone, D.A., Korshunova, G.A., Markova, O.V., Ojovan, S.M., Perevoshchikova, I.V., Pustovidko, A.V., Rokitskaya, T.I., Severina, I.I., Simonyan, R.A., Smimova, E.A., Sobko. A,A„ Sumbatyan, N.V., Severin, F.F., Skulachev, V.P. Derivatives of Rhodamine 19 as Mild Mitochondria-targeted Cationic Uncouplers. // J Biol Chetn - 2011 - V.286, P. 17831-17840.

52. Skulachev, M.V., Antonenko, Y.N., Anisimov, V.N., Chemyak, B.V., Cherepanov, D.A., Chistyakov, V.A., Egorov, M.V., Kolosova, N.G., Korshunova, G.A., Lyamzaev, K.G., Plotnikov, E.Y., Roginsky, V.A., Savchenko, A.Y., Severina, I.I., Severin, F.F., Shkurat, T.P., Tashlitsky, V.N., Shidlovsky, K.M., Vyssokikh, M.Y., Zamyatnin, A.A., Jr, Zorov, D.B., Skulachev, V.P. Mitochondrial-targeted plastoquinone derivatives. Effect on senescence and acute age-related pathologies. II Cuit Drug Targets - 2011 - V.12, P. 800-826.

Подписано в печать:

19.08.2011

Заказ № 5806 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Северин, Федор Федорович

Актуальность проблемы.

Программируемая клеточная смерть (ПКС) является важным физиологическим процессом, необходимым многоклеточным организмам для онтогенеза, поддержания тканевого гомеостаза и иммунной защиты. Механизм запрограммированной смерти, клетки - фундаментальная> теоретическая- и практическая проблема. Дрожжи — примитивные эукариоты, а также классический объект генетических исследований. Наиболее базовые модули- каскада запрограммированной смерти клеток высших эукариот есть и у дрожжей, поэтому данные, полученные на дрожжах, могут служить отправной точкой для исследования аналогичных процессов в клетках высших организмов.

Поскольку ПКС означает самоубийство для одноклеточного организма, то не совсем ясно, почему и как данный механизм сохранился ,в процессе эволюции дрожжей. В последнее время появляется все больше данных, что многоклеточные организмы" имеют программу самоуничтожения1 (гипотеза феноптоза). Таким образом, исследование физиологического самоубийства дрожжевой клетки актуально в. формате изучения программ саморазрушения- у высших организмов. Данные, полученные в последние десятилетия, показывают, что запуск таковой программы у дрожжей направлен на увеличение приспособленности выживших клеток. Действительно, многие из вариантов естественных сценариев активации ПКС Saccharomyces cerevisiae, в том числе, гибель в стационарной культуре, в течение мейоза, при половом процессе, вызванная вирусами, зависят от плотности культуры клеток. Интересно, что и у высших организмов половой процесс также может вызывать гибель: самцы некоторых кальмаров умирают сразу же после спаривания, а самцы сумчатых крыс умирают через две недели после гона от избытка собственных феромонов. Как известно, многие виды лососевых рыб также умирают сразу после нереста.

Быстрая» запрограммированная смерть многоклеточных не обязательно сопряжена с размножением. Смерть больного организма ради выживания ■ окружающих может быть выгодна потому, что препятствует распространению инфекции. Оказалось, что у высших животных существует механизм, убивающий их в ответ на появление Грам-отрицательных бактерий в крови. Введенные в кровь экспериметальных животных липополисахариды (LPS) клеточной стенки бактерий токсичны. Эта токсичность резко снижается при. блокировании специализированного LPS-связывающего белка в крови, а также при ингибировании специализированных клеточных рецепторов LPS-белкового комплекса.

Кроме того, в терминах гипотезы феноптоза старение многоклеточных организмов (то есть возраст-зависимая дегенерация) — основная контр-продуктивная программа, «медленный феноптоз». Дрожжи являются удобной моделью для исследования старения. Они тоже стареют: материнская клетка может произвести ограниченное количество дочерних (20-30), после чего умирает. В процессе старения клетка накапливает маркеры окислительного стресса, мутации в ядерной и митохондриальной ДНК и другие повреждения. Интересно, что механизм старения дрожжей во многом схож с таковым у высших эукариот. Например, ортологи гена деацетилазы гистонов SIR2 присутствуют у всех эукариот включая дрожжи. У дрожжей он называется SIR2, у млекопитающих — SIRT1. Активность этого белка у высших животных ингибирутся инсулин-подобными гормонами. Подавление активности инсулинового каскада с помощью методов генной инженерии, голодания или фармакологического вмешательства (резвератрол) приводит к увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных (мыши, черви С. elegans, мухи-дрозфилы). Введения дополнительной копии этого гена в ДНК дрожжей достоверно увеличивает продолжительность жизни. По-видимому, молекулярной основой этого явления служит то, что при повреждении (разрыве) ДНК дрожжей SIR2 уходит со специфических для себя мест на хромосомах, перемещается в места разрыва и там каким-то образом поддерживает целостность хромосом. Интересно, что SIRT1 делает то же самое при повреждении ДНК культивируемых клеток животных.

Цели и задачи исследования.

Задачи исследования:

1. Проверка гипотезы о том, что половой феромон может индуцировать запрограммированную смерть дрожжевой клетки.

2. Определение роли митохондрий в запрограммированной смерти дрожжей, вызванной избытком феромонов.

Научная новизна работы.

Произведен сравнительный анализ обычных разобщителей и проникающих катионов типа БкС). Впервые показано, что проникающие катионы оказывают селективный протонофорный эффект на внутреннюю мембрану митохондрий, и при этом разобщение является «мягким», то есть его эффективность падает с падением потенциала на внутренней мембране.

Обнаружено, что АФК, которые генерирует клетка при генотоксическом стрессе, могут быть как защитными (при относительно небольшом(повреждении), так и способствовать гибели клетки при относительно сильном стрессе.

Научно-практическое значение работы.

Проведенные исследования открывают физиологические закономерности принятия решения «жизнь или' смерть» на уровне одноклеточного организма, а также характеризуют роль митохондрий и АФК в принятии и исполнении этого решения. Данные, полученные в разработанной экспериментальной модели клеточной смерти, позволили разработать новые вещества — мягкие разобщители, которые в перспективе могут быть использованы для лечения широкого спектра заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту.

5. Причина токсичности белковой агрегации в дрожжевой модели полиглутамин-зависимых заболеваний — неспособность клетки расщеплять субстраты циклосомы.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2008-2010), европейской биоэнергетической конференции ЕВЕС (Москва 2006), конференции Гордона «Апоптоз» (2006), европейской конференции по клеточной смерти ЕСБО (2004, 2010), международной конференции по апоптозу дрожжей (Майами, 2005; Левен, 2008; Грац, 2009), конференции американского общества клеточной биологии (2007).

Публикации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Половой феромон как индуктор смерти дрожжей

В последние десятилетия дрожжи стали популярным объектом для исследования запрограммированной клеточной смерти. Так, исследовалось появление маркеров апоптоза после жестких воздействий на дрожжевые клетки. Эти работы воспринимались с долей пессимизма исследователями апопотоза у высших организмов, которые считали этот феномен лабораторным артефактом. Действительно, не совсем очевиден биологический смысл самоубийства в ответ на перекись, уксусную кислоту или осмотический шок. Мы поставили цель найти «мягкий» индуктор физиологического самоубийства дрожжей. Мы исходили из предположения, что физиологическое самоубийство имеет смысл только в сообществе организмов: в этом случае смерть одной клетки может быть каким-либо образом скомпенсирована выигрышем в приспособленности ее ближайших родственников или клонов. Иными словами, искомый индуктор должен каким-то образом зависеть от плотности клеток в культуре. Концентрация полового феромона, который секретируется дрожжами, естественно зависит от их плотности. Гаплоидная дрожжевая клетка может обладать либо а, либо альфа типом спаривания, и секретировать либо а, либо альфа-фактор, соответственно. Оба феромона — схожие по структуре пептиды. Надо отметить, что в лабораторной практике альфа-фактор часто используется для синхронизации культуры в клеточном цикле. Под действием феромона клетки задерживаются в фазе G1 и отращивают отростки (так называемые шму). В методических указаниях по работе с дрожжевыми культурами отмечается, что передозировка альфа-фактора может быть токсична: в частности, она может замедлить выход из ареста после отмывки феромона.

Исходя из этих предпосылок, мы решили' проверить, вызывает ли альфа-фактор запрограммированную смерть дрожжевых клеток. В большинстве сценариев апоптической смерти генерация клетками АФК - это один из основных этапов каскада. Для детекции АФК использовался HiDCF-DA, это вещество становится флуоресцентным после окисления АФК. Оказалось, что после 90 мин. инкубации а-клеток с альфа-фактором примерно треть клеток становятся флуоресцентными, в то время как клетки без альфа-фактораt и клеткиj альфа-типа с альфа-фактором не флюоресцируют (Рис. 1а). Следовательно, альфа-фактор может вызывать генерацию АФК клетками а-типа. Мы оттитровали концентрацию альфа фактора и выяснили, что для индукции АФК необходимо примерно в 10 раз более высокая концентрация, чем для формирования шму - морфолгического маркера половой дифференцировки (данные не приводятся).

Еще одним признаком апоптоза является деградация ядерной ДНК. Мы протестировали количество ДНК в клетке с помощью проточной флуоцитометрии (FACS). Оказалось, что высокая концентрация альфа-фактора вызывает накопление клеток с меньшим количеством ДНК чем в нормальных клетках в фазе G1 (Рис. 16), что является маркером деградации. С помощью окрашивания витальным красителем Флоксином Б мы также установили, что такая обработка феромоном приводит к смерти примерно 30% клеток (Рис. 1в).

Рис. 1. Альфа-фактор вызывает запрограммированную клеточную смерть. Клетки выращивались в жидкой УРО до плотности 106/мл. Концентрация альфа-фактора - 0,1 мг/мл. А, детекция АФК с помощью красителя Н2ОСР-ОА (10 мкМ). Масштаб - 50 мкм Б, Определение содержания ДНК в клетах методом цитофлуориметрии. В, окраска мертвых клеток Флоксином Б (0,4 мг/мл, 5 мин. инкубации с последующим фотографированием). Масштаб - 10 мкм.

Для исследования пути развития этого каскада клеточной смерти мы прежде всего протестировали роль киназы 81е20. Эта киназа активирует МАП-киназную часть каскада феромонового ответа. Оказалось, что делеция 8ТЕ20 предотвращает генерацию АФК и смерть клеток (Табл. 1). Надо отметить, что МАП-киназный каскад играет ключевую роль в апоптозе животных клеток. Таким образом, прослеживается параллель между каскадами клеточной смерти у дрожжей и высших организмов. Активация 81е20 индуцирует экспрессию ряда белков. Чтобы проверить является ли эта индукция необходимой для активации каскада клеточного самоубийства мы проверили эффект ингибирования синтеза белка. Оказалось, что циклогексемид предотвращает генерацию АФК и смерть клеток (Табл. 1). Последующие этапы апоптоза у клеток высших эукариот обычно опосредованы митохондриями. Оказалось, что потеря клетками дрожжей также митохондриальной ДНК полностью ингибирует феромон-зависимую смерть (Табл. 1), и при этом не влияет на образование шму (данные не показаны). Интересно, что клетки без функционального цитохрома ц (делеция гем-лиазы) генерировали АФК но не умирали в ответ на альфа-фактор (Табл. 1).

Таблица 1. Феромон вызывает зависимые от митохондрий генерацию АФК и смерть дрожжей. клетки добавки феромон другие эффекты клеток с А ФК % мертвых клеток а, реіке + + + циклогексимид

0,8±0,8 29,6±3,3 О О

33,5±12,7 0,5±0,6 24.3±4.0 не определено не определено не определено

0,9±1,

26,3±4,

2,б±1,

1,5±0,

2,6±3,

0,5±0,

5,8±1,

33,7±8,

1,4±0,

32,9±3, а, без цитохрома ц + а, Дз1е20 а+альфа а+альфа а хлорохин хлорохин хлорохин

Это показывает, что АФК в данном процессе (как и в апоптозе у животных) выполняют сигнальную функцию, а именно опосредуют выход цитохрома ц из митохондрий. Может ли феромон-зависимая смерть произойти в естественных условиях или является артефактом добавки неестественно большого количества феромона? Для проверки мы смешали клетки противоположных типов спаривания и покрасили смесь Флоксином Б. Примерно 1% клеток оказался Флоксин-содержащим (Рис. 1в). Такой низкий процент показал достаточно малую вероятность смерти при естественном спаривании, и это было вполне ожидаемым результатом. Следующим этапом мы повторили этот опыт в присутствии хлорохина — агента, не влияющего на вегетативный рост (Табл. 1) но ингибирующего последний этап слияния клеток, а именно гидролиз клеточных стенок. Оказалось, что примерно треть клеток в этом случае окрашивалось Флоксином Б (Рис. 1в). Таким образом, локальная концентрация феромонов в агглютинатах клеток при спаривании достаточно высока чтобы активировать каскад смерти, но слияние клеток предотвращает его развитие. Важно отметить, что хлорохин не влиял на смерть клеток а-типа по действием альфа-фактора (Табл. 1).

Таким образом, наши данные указывают, что смерть при спаривании является естественной частью процесса полового размножения дрожжей. Поскольку, у дрожжей нет комплекса АПАФ, неожиданной кажется роль цитохрома ц в этом процессе. В настоящее время мы ищем белки, взаимодействующие с цитохромом ц в каскаде дрожжевой смерти.

2. Исследование роли митохондрий в феромон-зависимом каскаде смерти ю К X

О 5 20 80 Амиодарон, мкМ а> jD cd t— альф а-фактор

Контр. NAC TOKoyspl

TUNELДНК 1 оо со I Sä к о

Приведенные выше данные указывают на ключевую роль митохондрий в смерти дрожжей при спаривании. В то же время использованная модель не вполне удобна для детального изучения этой роли. Действительно, каскад смерти зависит от синтеза, белка de novo, что затрудняет анализ быстрой кинетики митохондриальных изменений. Поэтому мы начали поиск способ активировать каскад феромон-зависимой смерти после (downstream of) активации синтеза специфических белков. Известно, что подъем [Са2+] в цитоплазме является промежуточным этапом ответа на феромон. Более того, по литературным данным даже малые концентрации альфа-фактора токсичны для клеток с мутациями по кальмодулину. Исходя из этого, мы проверили кальциевые ионофоры и амиодарон (фармакологический агент, вызывающий вход кальция в цитоплазму дрожжевой клетки) в качестве индукторов клеточной смерти. Эффект от добавки амиодарона был качественно похож на эффект ионофоров, но развивался быстрее (даннные не приводятся), поэтому большинство экспериментов проводилось с использованием амиодарона. Прежде всего, мы повторили данные лаборатории Корчезне (Courchesne) о токсичности амиодарона (Рис. 2а): Данные, приведенные на Рис. 2 (б,в),показывают практически большое сходство между феромон-и амиодарон-зависимыми смертями. В обоих случаях выживание стимулировалось инактивацией митохондриальной ДНК (Рис. 2в, столбик «пет»), делецией фермента, ответственного за присоединение гема к цитохрому ц (Рис. 2в, сусЗ), добавкой ингибиторов дыхания (миксотиазол или KCN), добавкой небольших концентраций разобщителя FCCP, антиоксидантов или делецией гена YSP1 (см. далее). Мутации по Са2+ -кальмодулиновой системе способствовали смерти клеток под действием обоих индукторов. Мы также показали что, подобно феромону, амиодарон вызывает появлениемаркеров апоптоза в клетках: а именно выход цитохрома ц и фрагментацию ДНК (Рис. 2г,д,е). Мы также подтвердили, что амиодарон вызывает подъем концентрации Са2+ в цитозоле (Рис. 2ж).

Поскольку дыхательная цепь митохондрий явно вовлечена в амиодарон-зависимую смерть (данные по миксотиазолу и KCN), мы решили проверить эффект амиодарона на дыхание. Оказалось, что дыхание клеток выращенных на сбраживаемом субстрате относительно слабое, не снижается добавкой ингибитора АТФ-синтазы олигомицина и лишь кратковременно стимулируется разобщителем (FCCP, 1 мкМ). Важно отметить, что в животных клетках такие дозы разобщителя существенно стимулируют скорость дыхания — поскольку разность потенциалов противодействует работе дыхательной помпы. Значительно более высокие концентрации FCCP (ЮмкМ) вызывали стабильную стимуляцию дыхания. Добавка низких концентраций амиодарона ингибировала дыхание в присутствии олигомицина и стимулировала дыхание на фоне низкой (1 мкМ) концентрации FCCP (Рис. За). Высокие концентрации амиодарона (вызывающие смерть клеток) вызывали временную стимуляцию дыхание с последующим сильным ингибированием (Рис. За,б). Наши данные указывают, что низкие концентрации амиодарона усиливают энергетическое сопряжение и максимальную скорость дыхания. Возможно, эти эффекты опосредованы подъемом концентрации кальция в цитозоле. Что касается энергетического сопряжения, то, в дрожжах отсутствует классическая Са -зависимая транзиторная пора (типичная для клеток животных, данные лаборатории Р.А. Звягильской), и при этом подъем [Са2 ] в цитозоле снижает неселетивную прводимость митохондриальной мембраны (лаб. С. Урибе [ШЬе]). Ключевую роль [Са2+] подтверждает и тот факт, что амиодарон не действовал на изолированные митохондрии (данные не приводятся). дрожжи дрожжи

Рис.3 Эффект амиодарона на дыхание кіеток дрожжей. 0,6-107 клеток/мл; олигомицин (олиго), 10 мкг/мл; FCCP, 1 мкМ; амиодарон (амио); 7 мкМ миксотиазол (миксо).

Таким образом, посредством поднятия [Са2 ] в цитозоле амиодарон активирует дыхание и сопряжение митохондрий. Отражается ли это на уровне мембранного потенциала? Для ответа на этот вопрос мы использовали митотрекер Orange. Этот краситель накапливается в митохондриях в зависимости от величины дч* ч» на их внутренней мембране. Как показано на рис. 4 (а), в контрольных клетках окрашивание митохондрий заметно только при увеличенном контрасте микрофотографии. В то же время амиодарон в широком спектре концентраций вызывал заметное увеличение интенсивности окраски (Рис. 46). Важно отметить, что амиодарону требовалось около 5 минут чтобы вызвать такое контроль

Ayspl

1 1 \ ' ч ( V V>4 V

• • ф V 1 * Щ0 ^^ феромон феромон

0, иэкграстТ амиодарон, мкМ с АФК мертвые A-2)W

Рис. 4. Эффекты феромона и амиодарона на Ау/ митохондрий опосредованы подъемом [Са]. Для полуколичественного определения Д\|/ использовали митотрэкер Orange. А, 01 мг/мл альфа-фактор. Б, цифры под фотографиями указывают концентрацию амиодарона. В, Г, кальциевый ионофор А-23187 вызывает подъем А\|/, генерацию АФК (В, Г) и смерть клеток (Г). Масштаб - 10 мкМ. увеличение, в то время как альфа-фактор вызывал подобный эффект (Рис. 4а) не менее чем через 30 минут (данные не приводятся).

Известно, что аномально высокий митохондрий может вызвать формирование АФК, которые, в свою очередь, являются интермедиатом каскада апоптоза. Чтобы проверить подобное развитие событий в нашей системе мы протестировали кинетику формирования АФК после добавки амиодарона. Аналогично альфа-фактору, амиодарон вызывал резкий подъем скорости окисления FbDCF-DA, при этом эффект амиодарона был значительно быстрее эффекта альфа-фактора (Рис. 5а,б). Как и ожидалось, подъем Д¥ несколько опережал подъем уровня АФК (Рис. 5а). Более того, тот факт, что антиоксиданты (N-ацетилцистеин и альфа-токоферол) в несколько раз повышали выживание после обработки амиодароном, указывает на функциональную роль АФК в каскаде смерти.

Достаточен ли вызванный амиодароном подъем [Ca ] в цитозоле для инициации клеточной смерти? Как показано на Рис. 4в,г, кальциевый ионофор А23187 также вызывал накопление АФК и клеточную смерть, но эффект амиодарона был сильнее (Рис. 2ж) Возможно, различие вызвано тем, что амиодарон вызывал значительно более быстрый подъем [Са2+] (данные не приводятся). Чтобы изучить роль ДЧ' на внутренней мембране митохондрий в каскаде клеточной смерти, мы предотвратили его подъем добавкой FCCP. Как и< ожидалось, подъем Д*Р и АФК были заингибированы. Что существенно, FCCP повышал в несколько раз выживание клеток (Рис. 2в). Следовательно, подъем AVP — не побочный эффект, а необходимый г этап, развития каскада. Как оказалось, 0,4 мкМ FCCP'было достаточно для этих влияний. Более высокий (6 мкМ) FCCP оказывал негативное влияние на выживание (Рис. 2в), и этот негативный эффект не является специфичным для FCCP, поскольку другой, разобщитель (SF6847) в относительно большой концентрации также снижал выживание (данные не приводятся).

Тот факт, что малые концентрации разобщителя снижают АФК, указывает на то, что они образуются в Q-цикле. Чтобы это проверить, мы использовали ингибиторы двух стадий ■ Q-цикла. Оказалось, что миксотиазол снижал образование АФК, а антимицин, наоборот, усиливал их генерацию (Рис. 2в). Эти факты полностью соответствуют, предположению о Q-цикле (Рис. 2в). Наконец, антиоксиданты N-ацетилцистеин и альфа-токоферол усиливали выживание (Рис. 2в), подтверждая функциональную роль АФК в каскаде смерти.

А мкготрэкер

АФК фаза

VI* л время (мин)

Рис. 5. Кинетика роста Л у и уровня АФК под действием альфа-фактора и амиодарона. А, Д\|/ и АФК после добавки 80 мкМ амиодарона. Б, накопление АФК-содержащих клеток после добавки 0,1 мг/мл альфа-фактора. АФК детектировались с помощью 50 мкМ Н2-Е)СР-ОА Масштаб - 10 мкм. делеционных мутантов, устойчивых к губительному действию альфа-фактора. Для этой мы мутировали дрожжи делеционной библиотекой (лаб. М. Снайдера). Потом мутированные клетки обрабатывались высокой дозой альфа-фактора, а после культура высевалась на твердую среду и выжившие мутанты вырастали в колонии. Кроме специфических мутантов по программе смерти, в первичном скрининге мы получали клетки с полностью инактивированным ответом на феромон (стерильные клетки, как мутант 51е20), а также клетки с потерянной респираторной функцией митохондрий (петиты). Чтобы исключить последние две категории мы протестировали полученных І V t>

З * З

Yipl -OFF митотрэкер Б дикий тип, дикий тил. ц > * •• -і» ч-7 «■*> А yipl.

20 мин

АсусЗ.

20 мин FCCP0.4wcM

20 мим дикий тип. И «

20 мин дикий ТИП. 5 W

ДИКИЙ ТИП.

0 мин дикий тип, üyspl, амиод»рон. МАС + *миод*рон

0 10' ІО' 10* »0* флуоресценция

Ду«рі. ЗО мм

FCCP 0,4 мкМ ЗО мим днш тип, ЗО мин дикий тип, 20 мин дикий псі. Омим ф/г/ор t сценция

Рис. 6. Локализация и функция Yspl. А, ко-локализация Yspl-GFP и митотрэкера Orange. Масштаб - 10 мкм. Вверху показана рассчитанная структура Yspl, содержит плекстриновый домен и два трансмембранных домена. Б, Yspl необходим для фрагментации митохондрий после обработки амиодароном. Изображения получали путем объединения 20 оптических срезов через клетку. Масштаб - 10 мкм. В, Определение AT и АФК в клетках методом FACS. Амиодарон (80 мкМ) был добавлен в момент времени 0 мин. мутантов на способность спариваться и на способность роста на несбраживаемом источнике углерода.

В результате мы нашли один ген, YHR155W, делеция которого не снижала концентрацию альфа-фактора, необходимую для индукции шму, и не препятствовала росту на глицерине (данные не показаны). Ген кодирует предположительно трансмембранный белок без выраженных гомологий с генами высших организмов и содержащий плекстриновый домен. Мы назвали белок Yspl (от yeast suicidal protein). С помощью микроскопии клеток, экспрессирующих Yspl слитый с зеленым флуоресцентным белком (GFP-Yspl) мы обнаружили, что конструкция ко-локализуется с митотракером (Рис. 6а), то есть с митохондриями. Как и ожидалось, инактивация YSP1 снижала смертность как в модели феромон-зависимой смерти (данные не приводятся), так и при обработке амиодароном (Рис. 2в). Как показано на рис. 66, амиодарон вызывает полную фрагментацию митохондриальных филаментов, а делеция YSP1 существенно снижает этот эффект. В то же время эта мутация не снизила подъем ДО (Рис. 4а,и*6в) и АФК (Рис. 6в), подтверждая, что амиодарон-зависимая генерация АФК как таковая не является летальной, но служит сигнальным этапом каскада смерти.

Поскольку амиодароновая модель клеточной смерти является схожей* и одновременно более быстрой и эффективной по сравнению с феромон-зависимой системой, мы предприняли попытку скрининга генов, ответственных за амиодарон-зависимую смерть.

Как и в случае с альфа-фактором был произведен случайный мутагенез клеток» делеционнош библиотекой, после чего мутанты тестировали на устойчивость к амиодарону. Мы ожидали, что устойчивость может возникать как от инактивации непосредственной программы смерти, так и от гипер-стабилизации гомеостаза кальция. Чтобы исключить мутантов второго типа, выжившие клетки тестировали на способность накапливать митотрэкер Orange в митохондриях после обработки амиодароном. Иными словами, искали мутантов, похожих по фенотипу на Ayspl. В результате было обнаружено, что инактивация гена YDR326c приводила к существенному (в 5 раз) увеличению выживания после обработки амиодароном- (Рис. 76), и при этом не предотвращала генерацию АФК (Рис. 7а). Как и в случае с YSP1, делеция YDR326c существенно ингибировала амиодарон-зависимую' фрагментацию митохондрий/ (Рис. 7в). Поскольку ген YDR326c к тому моменту был неохарактеризован, мы назвали его YSP2 (по аналогии с YSP1). Подобно» YSP1, YSP2 не имеет выраженных гомологии среди, генов высших организмов« и предположительно кодирует продукт с транс-мембранным доменом.

Интересно, что в этом скрининге мы г также выделили мутантов с делецией YSP1 (данные не приводятся), что еще раз указывает на сходство феромонового и амиодаронового каскадов смерти. Суммируя данные по этим двум каскадам, можно их объединить в одной схеме (Рис. 8). Схема предполагает, что феромон гипер-активирует МАР-киназный путь (этапы 2-4), что приводит к повышению концентрации кальция, достаточному для ,инициации митохондриальных изменений (этапы 5-9), приводящих в итоге к клеточной смерти.

В дикий тип йу*р ф V* «Г- - *! Ф — г"» «.V . /О .а ф * ^ Г контр Д(гр

Рис. 7. Локализация и функция Ул/?2. А, в контроле после добавки амиодарона АФК окрашивают всю клетку, а в Дувр2 АФК - в структурах, морфологически похожих на митохондрии. Б, делеиия УБР2 повышает устойчивость и предотвращает фрагментацию митохондрий (В) после обработки амиодароном. Г, Снижение рН в среде вызывает образование АФК только в присутствии ацетата. Как и в панели А, заметна У5Р2-зависимое различие в локализации АФК. Г, делеция У8Р2 повышает устойчивость к ацетату, рН=3. Масштаб - 5 мкм.

Используется ли рассмотренный выше каскад в других сценариях физиологического самоубийства дрожжей? Классическая экспериментальная система для изучения смерти дрожжей -хронологическое старение, т. е. старение в стационарной культуре. Этот вид смерти можно считать активным. Действительно, дрожжи, помещенные в воду, не теряют жизнеспособности в течении года, а дрожжи в стандартной питательной среде (УРЭ) умирают через 2-3 недели после достижения стационарной плотности. Большой объем публикаций указывает, что основная причина смерти в стационаре - закисление среды из-за накопления уксусной кислоты. Кроме того, известно, что уксусная кислота вызывает появление маркеров апоптоза и смерть дрожжей (см. работы и обзоры Ф. Мадео [Ма<1ео]).

Исходя из этих предпосылок, мы протестировали роль белка Увр2 в ацетат-зависимой смерти дрожжей. Оказалось, что делеция У8Р2 не снижает АФК, индуцированные уксусной кислотой (Рис. 7г), и в то же время (как и делеция гомолога про-апоптозной протеазы, гена ЫМАШ) в несколько раз увеличивает выживание (Рис. 7д). феромон рецептор

2) і т амиодарон подъем [Са] в цитоплазме синтез белка циклогекспмид подъем скорости дыхания ^ и уровня сопряжения подъем ДЧ*

7)1 I

Угр1, Узр2-зав н си мая фрагментация митохондрий падение выход цитохроыа низкий БССР миксотиазол

ИАС, токоферол

Дуфі. Дугр о X о смерть клетки

Рис. 8. Гипотетическая схема каскадов феромон- и амиодарон-зависимой смертег/. Пояснения — в тексте.

Где пересекаются пути амиодарон- и ацетат-зависимой смертей? Наши данные указывают, что закисление цитоплазмы причиной токсичности' ацетата. Известно; что ацетат может уравновешивать > рН по разные стороны липидной мембраны пересекая ее в протонированной форме и диссоциируя протон в более щелочном компартменте. Другие способы снижения рН в цитозоле (с помощью пропионата или комбинации НС1-нигерицин) также приводили к АФК- и Узр2-зависимой смерти дрожжей (данные не приводятся). Простейшим объяснением этого факта является то, что при низких значениях рН супероксид, основной АФК производимый в митохондриях, протонируется и становится значительно более реакционно-способным. Итак, с одной стороны, по литературным данным кальциевый гомеостаз никак не связан с устойчивостью дрожжей к ацетату. С другой стороны, и амиодароновый и ацетатный каскады смерти зависят от АФК и Увр2. Исходя из этой логики, можно предположить, что эти пути сливаются на уровне АФК (Рис. 8).

3. Мягкое энергетическое разобщение дрожжей

Действительно, в лаборатории В.П. Скулачева было показано, что при гиперполяризации митохондрий небольшое (10%) снижение Д1Р вызывает 10-кратное снижение продукции АФК. Проблема заключается в том, что при передозировке разобщителя уровень A*F может упасть ниже критического для генерации АТФ с очевидными токсическими последствиями (см. ссылки в PNAS 2010. 107. 663-668).

Поэтому была поставлена задача найти вещество, которое избирательно снижает ДЧ* в митохондриях с высоким потенциалом. Мы обратились к липофильным проникающим катионов. Эти вещества (например, тэтрафенилфосфоний) способны »проходить через бислойнуЮ' мембрану поскольку их положительный заряд де-локализован по всей' молекуле. Так как митохондрия — единственная отрицательно-заряженная органелла в клетке, то такие катионы избирательно накапливаются в митохондриях. До начала экспериментов у нас были предварительные данные о возможной разобщающей активности таких катионов (не приводятся). В рамках биомедицинского проекта «Ионы Скулачева» разобщающая активность проникающих катионов SkQl и С12-ТРР (Рис.) была подтверждена методом динамического моделироваия, а также экспериментально на моделях бислойной мембраны, липосом и митохондрий in vitro (PNAS 2010, 107. 663-668). Поскольку эти липофильные катионы специфически накапливаются в митохондриях, можно было ожидать, что их протонофорное действие (в отличие от стандартных разобщителей), будет также митохондриально-направленным. Для проверки этого предположения мы использовали измерение дыхания дрожжей внейтральной и кислой.культуральных средах. Прежде всего, мы убедились, что закисление цитоплазмы, существенно тормозит скорость дыхания (данные не приводятся). Таким образом, в кислой (но- не в нейтральной) среде увеличение тока протонов через цитоплазматическую мембрану является ингибитором* дыхания. В то же время увеличение проводимости внутренней мембраны митохондрий — стимулятор дыхания (см. раздел по амиодарону). Как показано на рис. 9а, при рН = 3.0 (в отличии от рН = 5.5) в среде анионный разобщитель FCCP стимулировал дыхание только в очень узком диапазоне концентраций. Катионный разобщитель С12-ТРР проявлял стимулирующие свойства в более широком- окне концентраций, и график зависимости* не имел колокообразной формы как в случае с FCCP (Рис. 96). Таким образом, С12-ТРР является митохондриально-направленным протонофором. Более широкий, чем у РССР'диапазон стимулирующих концентраций С12-ТРР также указывает на потенциал-зависимость его действия. Чтобы подтвердить, что высокоо гл г.* ы U хл %л 1. de1'4 g i " ё й «л â M ¡ 4 ОД £ 0.

A M ЖЯ

• •MlU >4 M

-им »-» V^«« m

0 » «

I » « .«« 1в

FCCP],MKM

• 10 12 1« 1« 1«

С,2ТРР|.МКМ

Рис. 9. Стимуляция дыхания клеток дрожжей добавками РССР и С12-ГРР. Инкубационная среда: 50 мМ фосфат калия указанных значений рН (доводили Н3Р04), 0,5% глюкоза. энергизованные митохондрии наиболее подвержены действию новых разобщителей, мы сравнили их действие на обычные клетки и на клетки petite. Поскольку в случае petite митохондрий поддерживается не за счет дыхания а вследствии работы протонной АТФ-азы, его уровень значительно ниже такового в контрольных клетках. Следовательно, можно было ожидать, что превращение в petite вызовет устойчивость к катионам-разобщителям. Для проверки этого предположения мы использовали новую модификацию проникающего катиона - C12R1 (Рис. 10а). Дело в том, что разобщающее действие С12-ТРР происходит за счет симпорта этого иона с де-протонированной формой свободной жирной кислоты (PNAS 2010, 107. 663-668). Разобщитель C12R1 содержит протонируемую аминогруппу, и вследствии этого может оказывать протонофорное действие и в отсутствии свободных жирных кислот (J Biol Chem. 2011, 286. 1783117840). Возможно, именно из-за этого различия C12R1 менее опасен при передозировке. В частности, C12R1, в отличие от своего непротонируемого аналога C12R4, не вызывает набухания митохондрий (J Bioenerg Biomembr. 2011, 43,175-180) - потому что не так сильно в них накапливается.

Для сравнения действий C12R1 и анионного разобщителя (динитрофенола, DNP) мы прежде всего подобрали их концентрации, которые в одинаковой степени снижали скорость роста контрольных клеток (grande) на среде с глицерином (Рис. 106). Несбраживаемый субстрат был выбран для того, чтобы дыхание митохондрий было максимально активно. Когда эти же концентрации были протестированы на клетках petite, оказалось, что DNP был более токсичен, чем на grande. В отличие от DNP, выбранная концентрация C12R1 совершенно не влияла на скорость роста petite-формы дрожжей (Рис. 106). Таким образом, мы подтвердили, что действие in vivo нового класса разобщителей положительно зависит от величины мембранного потенциала митохондрий. литературные данные по субстратам поздней циклосомы в нейронах. Оказалось, что протеолиз ключевого регулятора гликолиза, фосфофруктокиназы 2 (Ффк-2), катализируется APC-Cdhl. В результате гликолиз подавляется, и биоэнергетика нейронов основывается на дыхании. Искусственное подавление APC-Cdhl в культуральных нейронах приводит к переходу на гликолиз и окислительному стрессу (Nature cell biology 2009, Ц, 747-752). С другой стороны, известно, что при упомянутых выше заболеваниях в нейронах активируют гликолиз, подавляется дыхание и развивается окислительный стресс. Таким образом, ингибирование Ффк-2 кажется перспективной стратегией для борьбы с агрегат-зависимыми нейродегенеративными заболеваниями. В настоящее время мы проводим поиск низкомолекулярных ингибиторов этого фермента.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Северин, Федор Федорович

Выводы

3. Смертельный каскад можно прервать либо на уровне фрагментации митохондрий с помощью делеции генов У8Р1 и У8Р2, либо на уровне гиперполяризации митохондрий с помощью разобщителей.

4. Проникающие липофильные катионы класса БкС) обладают протонофорным эффектом. Этот эффект специфичен для митохондрий. Чем более поляризованной является митохондрия, тем выше разобщающий эффект таких катионов.

29. Knorre, D.A, Smirnova, E.A., Severin, F.F. Natural conditions inducing programmed cell death in yeast Sacharomyces cerevisiae. // Biochemistry (Mose) — 2005 — V.70, P.264-266.

31. Hoepfner, S., Severin, F.F, Cabezas, A., Habermann, B., Runge, A., Gillooly, D., Stenmark, H., Zerial, M. Modulation of Receptor Recycling and Degradation by the Endosomal Kinesin KIF16B. // Cell -2005-V. 121, P. 437-450

33. Sokolov, S.S., Pozniakovsky A.I., Bocharova, N.A., Knorre, D.A., Severin, F.F.

Expression of an expanded polyglutamine domain in yeast causes death with apoptotic markers. // Biophys. Biochem. Acta - 2006 - V.1757, P. 660-666.

34. Sokolov, S.S., Knorre, D.A, Smirnova, E., Markova, O.V., Pozniakovsky, A.I., Skulachev, V.P., Severin, F.F. Ysp2 mediates death of yeast induced by amiodarone or intracellular acidification. // Biophys. Biochem. Acta - 2006 - V.1757, P. 1366-1370.

35. Sandall, S., Severin, F F., McLeod, I., Yates 3rd, J., Oegema, K., Hyman, A., Desai, A. Complex of Slil5-Birl (INCENP-Survivin) Connects Centromeres to Microtubules and is the Likely Tension Sensor Controlling Aurora B Activation. // Cell - 2006 - V. 127, P. 1179-1191.

36. Elie-Caille, C., Severin, F.F., Helenius, J., Howard, J., Muller, D.J., Hyman, A.

Straight GDP-Tubulin Protofilaments Form in the Presence of Taxol. // Curr Biol - 2007 - V.17, P. 17651770.

38. Severin, F.F., Meer, M.V., Smirnova, E.A., Knorre, D.A., and Skulachev, V.P.

Natural causes of programmed death of yeast Saccharomyces cerevisiae. II Biochim Biophys Acta - 2008 - V.1783, P.1350-1353

40. Bocharova, N.A, Chave-Cox, R, Sokolov, S.S, Knorre, D.A., Severin, F.F. Protein aggregation and neurodegeneration: clues from a yeast model of Huntington's disease. //

Biochemistry (Mose) - 2009 - V.74, P. 231-234.

42. Knorre, D.A., Krivonosova, T.N., Markova 0,V., Severin, F.F. Amiodarone inhibits multiple drug resistance in yeast Saccharomyces cerevisiae. // Arch Microbiol - 2009 - V.191, P. 675-679.

43. Severin, F. F., Skulachev, V. P. Programmed cell death as a target to interrupt the aging program. // Advances in Gerontology - 2009 - V. 22, P.37-48

44. Ожован, C. M., Кнорре, Д. А., Северин, Ф. Ф., Бакеева JI. E. Влияние амиодарона на ультраструктуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae. II Цитология - 2009 -Т.51,С.911-916

45. Severin, F.F., Severina, I.I., Antonenko, Y,N„ Rokitskaya, T.I., Cherepanov, D.A., Mokhova, E.N., Vyssokikh, M.Y., Pustovidko, A.V., Markova, O.V., Yaguzhinsky, L.S., Korshunova, G.A., Sumbatyan, N.V., Skulachev, M.V., Skulachev, V.P. Penetrating cation/fatty acid anion pair as a mitochondria-targeted protonophore. //Proc Natl Acad Sei U S A - 2010 V.107, P. 663-668.

46. Skulachev, V.P., Antonenko, Y.N., Cherepanov, D.A., Chernyak, B.V., Izyumov, D.S., Khailova, L.S., Klishin, S.S., Korshunova, G.A., Lyamzaev, K.G., Pletjushkina, O.Y., Roginsky, V.A.,Rokitskaya, T.I., Severin, F.F., Severina, I.I., Simonyan, R.A., Skulachev, M.V., Sumbatyan, N.V., Sukhanova, E.I., Tashlitsky, V.N., Trendeleva, T.A., Vyssokikh, M,Y., Zvyagilskaya, R.A. Prevention of cardiolipin oxidation and fatty acid cycling as two antioxidant mechanisms of cationic derivatives of plastoquinone (SkQs). // Biochim Biophys Acta - 2010

V. 1797, P. 878-889.

47. Knorre, D.A., Smirnova, E.A., Markova, O.V., Sorokin, M.I., Severin, F.F. Prooxidants prevent yeast cell death induced by genotoxic stress. // Cell Biol Int - 2011 - V.35, P. 431-435.

51. Antonenko, Y.N., Avetisyan, A.V., Cherepanov, D.A., Knorre, D.A., Korshunova, G.A., Markova, O.V., Ojovan, S.M., Perevoshchikova, I.V., Pustovidko, A.V., Rokitskaya, T.I., Severina, I.I., Simonyan, R.A., Smirnova, E.A., Sobko. A,A„ Sumbatyan, N.V., Severin, F.F., Skulachev, V.P. Derivatives of Rhodamine 19 as Mild Mitochondria-targeted Cationic Uncouplers. // J Biol Chem - 2011 - V.286, P. 17831-17840.

52. Skulachev, M.V., Antonenko, Y.N., Anisimov, V.N., Chernyak, B.V., Cherepanov, D.A., Chistyakov, V.A., Egorov, M.V., Kolosova, N.G., Korshunova, G.A., Lyamzaev, K.G., Plotnikov, E.Y., Roginsky, V.A., Savchenko, A.Y., Severina, I.I., Severin, F.F., Shkurat, T.P., Tashlitsky, V.N., Shidlovsky, K.M., Vyssokikh, M.Y., Zamyatnin, A.A., Jr, Zorov, D.B., Skulachev, V.P. Mitochondrial-targeted plastoquinone derivatives. Effect on senescence and acute age-related pathologies. // Curr Drug Targets - 2011 - V.12, P. 800-826.

Информация о работе

Северин, Федор Федорович
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.00.03

Диссертация

Молекулярная биология и физиология запрограммированной смерти дрожжей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы