Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Начальные этапы окисления первичных спиртов в клетках дрожжей, растущих на различных субстратах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Начальные этапы окисления первичных спиртов в клетках дрожжей, растущих на различных субстратах"

р г 6 од

г 2 мая 1995

на правах рукописи

СИНГХ НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА

начальные этапы окисления

первичных спиртов в клетках

_ _ .___

дрожжей, растущих на

различных субстратах

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1995 г.

Работа выполнена в Лаборатории окислительного обмена веществ Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Т.В.Финогенова кандидат биологических наук, А.П.Ильченко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Ю.В.Евтодиенко кандидат биологических наук А.Г.Меденцев

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха,

РАН, Москва

Зашита диссертации состоится " 9 " ШЮШЬ- 1995 г. в /У час. на заседании специализированного совета Д 002.69.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, г.Пущино Московской обл., Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Афтореферат разослан''^ " 1995г.

Ученый секретарь специализированного совета

В.М.Вагабов

Актуальность проблемы. Широкое использование дрожжей для получения кормового и пищевого белка, а также других денных продуктов при росте этих микроорганизмов на первичных спиртах требует полного представления относительно механизмов деградации и ассимиляции этих соединений в дрожжевой клетке.

Изучение окислительного метаболизма первичных спиртов и особенно этанола дрожжами, кроме того, имеет медицинский интерес. Клетки дрожжей обладают наибольшим сходством с клетками высших эукариот, поэтому эти микроорганизмы могут представлять наилучшую модель для исследований, позволяющих понять метаболизм и его регуляцию в клетках млекопитающих и, в частности, человека. Очевидно, что, понимая биохимические изменения, которые происходят в дрожжевых клетках при адаптации и окислительном метаболизме данного спирта, можно приблизиться к пониманию процессов, идущих в организме человека.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было провести сравнительное изучение начального этапа окисления первичных спиртов в клетках дрожжей при росте на н-алканах, т.к. первыми продуктами их метаболизма в дрожжевой клетке являются высшие первичные спирты, и этаноле. В задачи экспериментального исследования входило:

1) исследование ферментных систем окисления высших первичных спиртов и этанола до соответствующих альдегидов,

2) изучение влияния различных условий культивирования на начальные этапы окисления первичных спиртов в клетках исследуемых дрожжей при росте на н-алканах и этаноле.

Научная новизна работы. Впервые в сравнительном аспекте на ряде дрожжевых организмов было показано многообразие форм различных алкогольоксидаз и установлены особенности их функционирования, локализации, и субстратной специфичности в зависимости от используемого источника углерода (н-алканы, этанол). Впервые было обнаружено, что алкогольоксидаза высших спиртов может быть растворимым ферментом. Эта растворимая алкогольоксидаза из УаггоЫа Иро1уйса выделена и охарактеризована.

Впервые были получены данные об алкогольоксидазе, функционирующей в клетках дрожжей, растущих в среде с высокой исходной концентрацией этанола. Новыми также являются данные по регуляторному воздействию различных концентраций этанола и соотношения ионов цинка и железа в среде культивирования на окислительный метаболизм этого спирта в клетках дрожжей.

Практическое значение работы. Работа представляет собой экспериментально-теоретическое исследование, полученные результаты, могут быть использованы при совершенствовании процессов выращивания дрожжей на этаноле. Разработан эффективный метод очистки алкогольоксидазы из У.Ыро1уйса. Благодаря широкой субстратной специфичности, данный фермент

может быть использован для различных практических целей, в частности,в парфюмерной промышленности.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения в ¿f главах, выводов и списка литературы ссылок). Работа изложена на ÍÓP страницах машинописного текста, включая рисунков и таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обьекты исследований. Основным объектом исследований служили дрожжи Torulopsis candida. В ряде экспериментов использовали дрожжи Yarrowia (Candida) llpolytica, Candida maltosa.

Культивирование. Дрожжи культивировали в минеральной среде Ридер со смесью микроэлементов [Burholder et al., 1944]. Культивирование проводили в ферментере типа АНКУМ-2М [Ильченко и соавторы, 1991; Ильченко и соавторы, 1994]. В качестве источника углерода использовались этанол (0.8-4.8 в /об) и н-алканы в концентрации 1% (об/об). В зависимости от целей эксперимента концентрация ионов железа составляла 0.050.5 мг/л, ионов цинка - 0.01-0.5 мг/л. Концентрацию этанола и ацетата в среде определяли методом газожидкостной хроматографии.

Получение бесклеточных экстрактов. Для получения бесклеточных экстрактов использовали дезинтеграцию клеток на ИБФМ-прессе, ДКМ-прессе и планетарной мельнице.

Спектрофотометрические свойства очипщнной каталазы изучали на спектрофотометре Shimadzu UV-120, динамику спектральных переходов каталазы регистрировали по двухволновой схеме на спектрофотометре Hitachi-365.

Количественное содержание цитохромов в интактных клетках определяли по дифференциальным спектрам поглощения. Спектры регистрировали на спектрофотометре Hitachi-365.

Определение уровня перекисного окисления в клетке вели по количеству малонового диальдегида [Гаврилов и соавт., 1987].

Определение поглощения кислорода интактными клетками и активности алкогольоксидазы (АО) проводили полярографичес-ки. Кроме того, активность АО определяли по скорости генерации гидроперекиси [Bystrykh et al., 1989].

Все электрофоретические исследования проводили на приборе для быстрого электрофореза Phast System с использованием стандартных готовых гелей по инструкциям к прибору.

Все использованные процедуры очистки были разработаны нами. Если не указаны другие условия, очистку проводили при 4°С.

Методы определения активностей ферментов и процедуры очистки подробно изложены в диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Окисление первичных спиртов в клетках дрожжей,

растущих на н-алканах. Известно, что первыми стабильными продуктами метаболизма н-алканов в дрожжевой клетке являются высшие первичные спирты. Ранее в нашей лаборатории было установлено, что при росте на н-алканах в клетках дрожжей Т.candida происходит индукция АО, специфически окисляющей высшие спирты. Эта АО была выделена и охарактеризована Ильченко и соавт. [1988]. Было установлено, что оксидаза высших спиртов представляет собой сильно гидрофобный белок, прочно связанный с мембранами клеточных органелл.

Как показали результаты проведенных нами экспериментов, гомогенаты, полученные из клеток Y.lipolytlca Н-222, выращенных на н-алканах, также окисляли различные первичные спирты. Это, вероятно, свидетельствует, что в их клетках функционирует оксидаза, подобная АО высших спиртов Т.candida. Однако фракционирование этих гомогенатов с помощью дифференциального центрифугирования (100 000g, 2 ч) показало, что большая часть (70%) АО-ной активности обнаруживалась в цитозольной фракции, но не во фракции мембран. Это позволило нам предположить, что АО высших спиртов Y.lipolyüca слабо или вообще не связана с мембранами клеточных органелл. Для изучения свойств этой АО фермент был нами очищен.

1. Очистка и свойства алкогольоксидазы Очистка алкогольоксидазы из Y.lipolytlca. Процедура очистки фермента суммирована в табл.1.

Таблица 1.

Очистка алкогольоксидазы из дрожжей Y.lipolytlca

Стадия очистки Общий Общая Уд1 Выход Степень белок активность акт-ть очистки

(мг) (Е) (Е/мгб.) %

Грубый экстракт 1040 42 0.04 100 -

(NH1)2S04(35-70%) 98 ДЕАЕ-сефароза 30 31 0.32 74 8

27 0.9 64 22

Ультрагель НА 5 26 5.2 62 130

Сефакрил S-200 1.2 23 19.5 55 488

АО была очищена в 488 раз с выходом 55 % и имела удельную активность 19.5 мкмоль/мин мг белка.

Свойства алкогольоксидазы. Выделенная АО имеет молекулярный вес 140 кДа. Фермент состоит из двух идентичных по молекулярной массе субьединиц. Изоэлектрическая точка для очищенной АО равна 5.5. Оптимум pH фермента равен 9.3. Сравнение выделенной оксидазы с другими оксидазами, способными окислять первичные спирты, показало, что по ряду свойств (молекулярная масса, субстратная специфичность, субъединичное

строение) она значительно отличается от метанол- и глицерол-оксидазы дрожжей [Kato et al., 1976; Shimizu eí al., 1971]. Выделенная нами оксидаза отличается и от аналогичной АО высших спиртов T.candida [Ильченко и Цфасман, 1988] (субклеточная локализация и субъединичное строение). Общим свойством этих двух АО является то, что наибольшую субстратную специфичность оба фермента проявляли к высшим первичным спиртам. Следует, однако, отметить, что очищенный нами фермент с высокими скоростями также окислял диоловые и терпеновые спирты, оксиспирты и оксикарбоновые кислоты (табл.2).

Сравнение субстратной специфичности препарата, полученного на стадии фракционирования высаливанием, с таковой для очищенного препарата показало, что последний не способен окислять целый ряд соединений которые окислялись грубым препаратом. Это позволяет нам предположить, что в "алкановых" клетках Y.lipolytíca, вероятно, присутствует несколько АО-з (табл.2).

Таблица 2. Окисление различных субстратов препаратами алкогольоксидазы на разных стадиях очистки (2).

Соединение Степень очистки Соединение Степень очистки

1 2 3 1 О 3

этанол 31 38 85 Ю-андецен-1-ол 100 173 192

сктанол 100 81 70 1-додецен 19 31 180

нонанол 100 43 49 1,2-эпоксидодецен 6 18 14

додеканол 100 100 100

татрадеканол 38 86 121 0-крезол 26 0 0

пенгадеканол 25 188 174 ОенэиловыЯ спирт 23 0 0

гексадеканол 1У 183 220 1,2-ди-0Н-бензол 6 0 0

гептадеканол 19 н. 0 205

октадеканол 15 н. 0 218

пристанол 80 0 0 16-ОН-С -ООН 16 40 0 0

1,8-С -диол 43 61 93 2-ОН-С -ООН 30 18 66

8 16

1,12-С -диол 88 74 74

12 гераниол 1166 30 Г.

í.ie-c -диол 33 71 74 цитронеллол 43 0 0

1В

Примечание:

1. Преципитат после высаливания сульфатом аммония (35-707. от насыщения).

2. Препарат после хроматографии на ДЭАЭ-сефарозее.

3. Препарат после хроматографии на Ультрагеле.

За 100 7. принималась активность алкогольоксидазы с додеканолом. . н. о. -не определяли.

2. Влияние условий культивирования на начальные этапы окисления высших первичных при росте исследуемых дрожжей на н-алканах.

Изучение индукции АО в неадаптированных клетках T.candida и С. maltosa показало, что внесение в среду культивирования

н-алканов сопровождалось быстрой индукцией и ростом активности этого фермента. Активность АО в клетках Т. candida достигала максимального значения в логарифмической фазе роста и оставалась на этом уровне до выхода культуры в стационар (рис.1). Аналогичный характер имела и динамика активности АО C.malto-sa, с той лишь разницей, что время максимальной индукции фермента у C.maltosa было значительно короче. Характер дина-мики активности АО при росте Т. candida и C.maltosa на н-алка-нах позволяет заключить, что реакция, осуществляемая АО, является основным путем окисления первичных спиртов в клет-ках этих дрожжей. Так как функционирование оксидазы непо-средственно зависит от присутствия молекулярного кислорода, представлялось целесообразным изучить влияние р02 на рост дрожжей и функционирование ферментов начальных этапов окисления первичных спиртов в условиях адаптации этих микроорганизмов к н-алканам.

Как видно из данных, представленных на рис.2А, внесение в среду н-алканов при р02 = 70% вызывало быструю индукцию АО и КАБ-зависимой альдегиддегидрогеназы (АлДГ). Достигнув максимального значения, активность обоих ферментов оставалась неизменной до момента переключения уровня аэрации. Резкое снижение уровня кислорода в среде (2%) вызывало быстрое увеличение активности АО и АлДГ. Однако, несмотря на это, заметного увеличения роста культуры не происходило. Можно предположить, что резкое возрастание активностей АО и АлДГ является ответом клетки на стрессовую ситуацию. Это предположение подтверждается тем, что обратное повышение уровня р02 до 70% приводило к снижению активности АО и АлДГ.

Изучение динамики активности этих ферментов в условиях адаптации к н-алканам, когда исходный уровень р02 был 2%, показало, что активность АО равна нулю (рис.2Б). Очевидно, что

Рис. 1. Динамика роста и динаыика активности алкоголвоксидазы яри выращивание Т. candida на 1 Х-ныг н-алканах. Внесение в среду н-адканоа указано стрелкой. Инокулш выращивали на 1 %-ноя глхэко-

при низкой концентрации кислорода имеет место репрессия индукции биосинтеза этого фермента. Видно, что АлДГ также репрессирована. Рост Т.candida при данных условиях культивирования отсутствует. Последующее повышение аэрации до 70% насыщения вызывало быструю индукцию АО и АлДГ, причем максимальные активности этих ферментов были значительно выше чем в случае адаптации к н-алканам при высокой аэрации среды (рис.2А). Повторное снижение уровня кислорода практически не влияло на активности исследуемых ферментов.

Рис. 2. ДИнашка роста дрожжей т. candida на 1 X н-алканах и динамика функционирования ферментных систем при изменении ро в среде KyxLтиаирования. Внесение 2 среду н-алканов указано стрелкой.

Таким образом, вышеизложенные результаты показали, что 1) кислород прямо или косвенно влиял на начальные этапы окисления высших первичных спиртов, 2) низкий уровень pOj (2%) репрессирует индукцию АО и АлДГ; как мы полагаем, активность АлДГ зависит от уровня растворенного в среде кислорода постольку, поскольку последний влияет на АО.

Представленые результаты свидетельствуют, что по крайней мере у алканутилизирующих дрожжей родов Torulopsis и Candida окисление высших первичных спиртов в клетке катализируется АО.

II. Исследование начальных этапов окислительного метаболизма этанола в клетках дрожжей Известно, что NAD-зависимые алкогольдегидрогеназы (АДГ) являются основными ферментами, осуществляющими взаимопревращение этанола и ацетальдегида в дрожжах с анаэробным типом обмена веществ. Полагают, что и в случае аэробного роста на этаноле окисление этого спирта в дрожжевой клетке катализирует АДГ. Однако результаты многочисленных исследований, проведенных на клетках эукариот, показали: имеются все основания считать, что при определенных условиях в окислении этанола кроме АДГ могут участвовать другие ферментные системы. На рис.3 представлена схема не АДГ-ных путей окисления этанола до ацетальдегида в клетках эукариот.

1. НАД(Щ__ этанол + 02 Рис.3.

МШ^Збиг P-45(JK^ 1. Микросомальная

НАДФ+ ацетальдегид + H¿0 этанолокисляющая

АО • система

2. этанол + Оа-----»«ацетальдегид + НаО^ 2. Алкогольоксидаза

каталаза 3. Пероксидазная

3. этанол + ------ацетальдегид + 2Н^О реакция каталазы

Представлялось целесообразным исследовать возможность и условия участия представленных на схеме ферментных систем в метаболизме этанола при аэробном росте дрожжей на этом спирте.

А. Алкогольдегидрогеназный путь.

Определение АДГ-ной активности у дрожжей Т.candida, растущих в среде с исходной концентрацией этанола 0.8%, показало, что она была высокой (табл.3).

Таблица 3.

Активность алкогольдегидрогеназы при выращивании T.candida в среде с различными исходными концентрациями этанола

Фаза роста культуры Этанол, % логарифмическая линейного роста

АД Г, мкмоль/мин мг белка

1ГБ-ЮТТШ5-U.l +U.U5-

1.2 0.03 + 0.002 0.002 + 0.0005

2.4 0.03 + 0.0005 0.007 + 0.0002

В результате электрофоретических исследований было установлено, что в "этанольных" клетках Т.сапс11с1а присутствует одна КАО-зависимая АДГ и три N АО-зависимых АлДГ (рис.4).

Рис. 4. Нативный электрофорез |*i4 частичноочищенных АДГ и АлДГ дрожжей Т. candida

трек 1 - АДГ (окраска на активность) трек 2 - АлДГ (окраска на активность)

Логично было предположить, что при увеличении исходной концентрации спирта в среде активность АДГ в клетках Т. candida также будет возрастать или оставаться такой, как при росте на 0.8 %-ном этаноле. Однако, при увеличении исходной концентрации спирта в среде активность АДГ падала (табл.3). Из данных, представленных в табл.4, • видно, что независимо от исходной концентрации спирта в среде культивирования исследуемые дрожжи накапливали в среде 5-7 г/л ацетата.

Таблица 4.

Экскреция ацетата и конечная концентрация биомассы при выращивании Т.candida на этаноле

Этанол, % Zn/Fe Ацетат, г/л Биомасса, г/л

10/1 5 - 6 6.0

0.8 1/5 5-6 6.0

1/50 следы 6.0

10/1 5 - 6 7.0

1.2 1/5 5-6 9.0

1/50 следы 9.0

10/1 6-7 7.5

2.4 1/5 6-7 12

1/50 следы 14.0

Следует отметить, что при переходе к высоким исходным концентрациям этанола скорость потребления спирта из среды

существенно не изменялась. Все это свидетельствует, что при росте дрожжей Т.candida в среде с высокой исходной концентрацией этанола в окислении этого спирта вместе с АДГ начинают участвовать другие ферменты (рис.3)

Б. Микросомальная этанолокисляющая система (МЭОС).

Изучение динамики биосинтеза цитохрома Р-450 - одного из основных компонентов МЭОС - показало, что в линейной фазе росте на этаноле в клетках Т.candida имела место его индукция. Максимальное количество этого цитохрома в клетках накапливалось к началу стационарной фазы. Характер динамики биосинтеза цитохрома Р-450 и его незначительная концентрация в клетке позволяют предположить, что вклад МЭОС в окисление этанола у данных дрожжей, по-видимому, минимален.

В. Алкогольоксидазный путь.

Как было установлено в ходе проведенных нами исследований, в первые часы культивирования на этаноле для клеток Т.candida была характерна высокая интенсивность дыхания, которая значительно превосходила таковую для этих же дрожжей, растущих в среде с глюкозой и н-алканами. Как видно из данных, представленных в табл.5, величина максимальной интенсивности дыхания возрастала пропорционально исходной концентрации спирта в среде.

Таблица 5.

Зависимость максимальной величины интенсивности дыхания клеток дрожжей T.candlda от начальной концентрации этанола в среде

Концентрация Интенсивность дыхания,

этанола,% (в/об) нмоль 02/мин.мг сух.биомассы

0,8 68 - 75

1.2 140 -145

2,4 314 -335

4.8 671 -715

В то же время, ни один из других параметров, характеризующих функционирование дыхательных цепей, не зависел от исходной концентрации этанола (табл.6). Это позволило нам предположить, что высокая интенсивность дыхания в начальный период роста на этаноле может отражать не только работу дыхательных цепей, но и функционирование в клетках Т.candida оксидазной системы, принимающей участие в окислении этого спирта.

При определении активности АО в гомогенатах, полученных из Т.candida, выращенных на 0.8 %-ном этаноле, было установлено, что незначительная оксидазная активность (менее 10 нмоль/мин мг белка) наблюдалась только в присутствии спиртов С4-С8, но не этанола.

Напротив, гомогенаты, полученные из клеток, отобранных в начальный период роста на 2.4%-ном этаноле, с высокими

скоростями окисляли различные первичные спирты, причем скорость поглощения кислорода увеличивалась с ростом длины цепи используемого спирта (табл. 7).

Таблица 6

Значения максимальных активностей цитохромоксидазы (ЦСО) и цитохром с пероксидазы (ЦСП) и максимальной концентрации цитохромов в зависимости от начальной концентрации этанола и соотношения ионов Zn и Ре

Концен- Zn/Fe ЦСО ЦСП цитохромы, нмоль/мг сух.вёса

трация мкмоль/мин мг белка а + а в с

этано-

ла, %

0.8 10/1 0,07 ± 2,0 ± 0,16- 0,11- 0,17-

0,01 0,20 0,17 0,12 0,19

1/50 0,65 ± 8,1 ± 0,16- 0,10- 0,17-

0,05 0,20 0,17 0,11 0,18

10/1 0,15 ± 2,1 ± 0,15- 0,16- 0,18-

0,05 0,14 0,17 0,18 0,20

1.2 1/50 0,9 ± 8,4 ± 0,15- 0,11- 0,17-

0,05 0,22 0,16 0,12 0,19

10/1 0,12 + 2,6 ± 0,16- 0,17- 0,20-

0,05 0,15 0,17 0,19 0,22

2.4 1/50 0,87 ± 11,5 ± 0,15- 0,08- 0,16-

0,05 0,20 0,16 0,09 0,17

Таблица 7.

Активность алкогольоксидазы в гомогенатах T.candida

Характеристика окисления Окисляемые спирты

CI С2 СЗ С4 С5 С9

Интенсивность дыхания,

нмоль/мин мг белка 82 116 127 128 141 201 Скорость генерации перекиси,

нмоль/мин мг белка н.о. 55 н.о. н.о н.о. 160

Это, по-видимому, свидетельствует, что при росте в среде с высокой исходной концентрацией этанола в клетках T.candida может функционировать АО.

Это предположение подтверждается результатами экспериментов, проведенных с гомогенатами T.candida, выращенных на 2.4% (рис.5). Видно, что при аэробных условиях в отсутствии экзогенного NAD внесение гомогенатов в среду инкубация (рН = 7.5), содержащую этанол, приводило к быстрому

потреблению спирта из среды. Мы полагаем, что в выбраных условиях инкубации исчезновение этанола из среды обусловлено функционированием АО. Наиболее эффективное потребление этанола из среды инкубации происходило в случае высокой концентрации спирта.

Рис.5.Потребление этанола бесклеточными гомогенатами дрожжей Т.candida в аэробных условиях в отсутствии экзогенного NAD. Среда инкубации: 50 мМ калий-фосфатный буфер (рН = 7.5) + этанол + 1.6 мг белка гомогената. 1 - исходная концентрация этанола 120 мг/мл; 2-60 мг/мл; 3-40 мг/мл.

Возникал вопрос: является ли эта АО новым ферментом, или она подобна оксидазам высших спиртов, и, в частности, АО, функционирующей в клетках этих же дрожжей при росте на высших первичных спиртах и н-алканах.

Фракционирование гомогенатов клеток T.candida, выращенных на 2.4 %-ном этаноле, дифференциальным центрифугированием (100 000 g, 2.5 часа) на цитозольную и мембранную фракции показало, что активность АО присутствовала как во фракции мембран, так и в цитозольной фракции. Наличие двух АО было подтверждено и результатами фракционирования белков этих гомогенатов путем высаливания. Фракция после 30 %-ного высаливания сульфатом аммония (фракция 1) подобно АО высших спиртов с наибольшими скоростями окисляла длинноцепочечны спирты, фракция после 70%-ного высаливания (фракция2) -только короткоцепочечные спирты С1-С5 (табл.8). Присутствие АО во фракции2 доказано электрофоретически (рис.6).

Таким образом, можно заключить, что при росте в среде с высокими исходными концентрациями этанола в клетках T.candida, по-видимому, функционируют две АО: одна по субстратной

Таблица 9. Окисление различных спиртов препаратами алкогольоксидазы, полученными при фракционировании белков гомогенатов Т,candida высаливанием.

нмоль 02/ мин мг белка Спирт 1 2

Рис.6. Нативный электрофорез фракции 2. трек 1 - АО дрожжей Т.candida,

трек 2 - метанолоксидаза Plchía pinus Белки окрашивали на активность.

Метанол - 620

Этанол 26.9 981

Пропанол 25.3 955

Бутанол 22.8 814

Пентанол 31.5 1215

Гексанол 38.4 -

Гептанол 38.1 -

Октанол 61.5 -

специфичности подобна АО высших спиртов, другая, как мы полагаем, является растворимым ферментом, она окисляет только короткоцепочечные спирты.

Изучение динамики активности АО при росте T.candida на 2.4%-ном этаноле показало, что максимальная активность фермента приходится на первые часы культивирования (рис.7). Это позволяет предположить, что данный фермент принимает участие в окислении этанола в начальный период роста, т.е. когда концентрация спирта в среде высока.

w и

5

а:

1 -О

о г

X

о

100 -

Рис. ?.Динамика активности алкогольоксидазы при росте Т. candida в среде с 2.4 ?. этанолом.

Г. Пероксидазная реакция каталазы.

Результаты проведенных нами экспериментов показали, что в условиях постоянной генерации перекиси гомогенаты "эта-нольных" клеток T.candida окисляли этанол. Как мы полагаем в условиях генерации перекиси исчезновение этанола из среды инкубации обусловлено пероксидазной функцией каталазы. Это предположение подтверждается тем, что 1) внесение в среду инкубации экзогенной перекиси ускоряло процесс потребления этанола из среды, 2) добавление специфического ингибитора каталазы - 3-амино,1,2,4-триазола - практически полностью прекращало реакцию. Представляло интерес выяснить возможность и условия функционирования каталазы как пероксидазы в интактных клетках T.candida.

Исследованиям на интактных клетках предшествовало определение спектроскопические свойства каталазы на частично-очищенном из "этанольных" клеток T.candida препарате фермента. Процедура очистки суммирована в табл.9.

Таблица 9

Очистка каталазы из T.candida, выращенных на этаноле

Стадия очистки Общий Общая Уд. Степень

белок активность активность очистки

(мг) (Е/100) (Е/мг белка)

Грубый экстакт 2400 4752 198 -

Обработка смесью

этанол + хлороформ 689.5 3792 550 2.8

Высаливание 229.5 1418 645 3.25

Гель-фильтрация 12.0 482.2 4018 20.3

Адсорбционнная

хроматография 2.54 309 12190 61.5

Нами было установлено, что каталаза дрожжей T.candida, выращенных на этаноле, обладает теми же спектральными характеристиками, что и каталаза клеток печени [Sies et al., 1973]. Исследование дифференциальных спектров на уровне интактных клеток T.candida показало что, для селективной регистрации интермедиатов каталазы (каталаза-Н202 и каталаза-KCN) следует выбрать пару длин волн 660-640 нм.

На рис.8 представлена динамикамика образования и разрушения каталазных интермедиатов в интактных клетках T.candida, выращенных на 2.4 %-ном этаноле.

Видно (кривая 1), что при аэрации клеточной суспензии (клетки отобраны в лог-фазе роста) происходило быстрое увеличение разницы поглощений Л А (660-640), что соответствует образованию комплекса каталаза-Н202 (комплекс I). При отключении аэрации происходило быстрое разложение комплекса I. Эти результаты позволили нам предположить, что в клетках, по-видимому, функционируют оксидазные ферментные системы,

-ммкн

,-0.005

Чмин

Рис.8. Динамика изменения состояния комплекса 1 в клетках Т. candida. Стрелками 'i указаны моменты j добавления соединений; цифрами - конечные концентрации добавля-этонм(ммодь) емых веществ.

I 1 i о,ь 0,-1

М

»KCNt-iM^) i

А'

Э

]¿A=

=000i

i 4 мин

Э5эиюисл

((МГКИь)

которые, окисляя эндогенные субстраты, генерируют перекись водорода. О значительной генерации Н2О2 свидетельствует 80 % -ное насыщение каталазнош гема перекисью (общее содержание гема соответствует увеличению Д А(660-640), после добавления к суспензии клеток КС1Ч). Напротив, для клеток, отобранных в начале стационарной фазы роста, аэрация суспензии приводила лишь к 30%-ному насыщению каталазного гема (кривая 2,3).

Из данных, представленных на рис.8, видно, что добавление к клеточной суспензии этанола сопровождалось уменьшением уровня комплекса I в следствие пероксидазной реакции фермента, т.е. каталаза действительно окисляет этанол. Внесение в клеточную суспензию небольших концентраций этанола (до 1мМ) вызывало незначительные изменения в уровне комплекса I, при внесении высоких концентраций этанола (3,5 мМ и выше) происходило быстрое и полное разрушение комплекса I, что, очевидно, свидетельствует: при высоких концентрациях этанола каталаза может эффективно функционировать как пероксидаза.

Таким образом, результаты проведенных нами экспериментов показали, что 1) в условиях аэрации в интактных клетках наблюдался высокий уровень образования комплекса!, 2) в интактных клетках в присутствии этанола каталаза функционирует как пероксидаза.

Ясно, что доля участия каталазы в общем процессе превращения этанола в ацетальдегид зависит от наличия мощного источника генерации перекиси в клетке. Представленные выше результаты свидетельствуют, что, по крайней мере, в логарифмической фазе роста на 2.4 %-ном этаноле в клетках Т.candida функционируют оксидазные ферментные системы, обеспечивающие высокий уровень образования гидроперекиси в клетке. Такой системой, в частности, может быть АО, функционирование которой было установлено в клетках дрожжей Т.candida, растущих в среде с 2.4 %-ном этанолом.

Полученные нами результаты позволяют предположить следующую схему начального этапа окислительного метаболизма этанола в клетках исследуемых дрожжей. При низкой исходной концентрации спирта в среде культивирования (0.8%) окисление этанола до ацетальдегида, по-видимому, главным образом катализируется NAD-зависимой АДГ. Не исключена, однако, и возможность участия каталазы в этом процессе. Но в следствие того, что при данных условиях культивирования удельная активность АДГ высокая, вклад каталазы, по-видимому, будет минорным. Напротив, в случае роста в среде с высокой исходной концентрацией этого спирта (2.4%) доля участия не АДГ-ных путей в окисление этанола возрастает. Во-первых, как мы полагаем, в начальные часы культивирования этанол окисляется в ходе реакции, осуществляемой АО. По мере активизации процессов генерации перекиси в клетке в метаболизм этанола, вероятно, включается каталаза. После снижения концентрации спирта до определенной величины его окисление начинает осуществляться NAD-зависимой АДГ. Нельзя также исключать возможность того, что превращение этанола в ацетальдегид может происходить при совместном функционировании АО и каталазы: окисляя этанол, АО генерирует перекись, которая используется каталазой в ее пероксидазной реакции превращения этанола в ацетальдегид. Подобный синергизм окисления другого низкомолекулярного спирта - метанола - предлагается для метанолутилизирующих дрожжей [Kawaguchi et al., 1989].

2. Влияние соотношения исходных концентраций цинка и железа на окислительный метаболизм этанола.

Известно, что по своей важности ионы цинка и железа занимают одно из ключевых мест в биологических системах. В частности, железо входит в состав различных компонентов митохондриальных цепей переноса электронов (ЦПЭ), а цинк - в активный центр дрожжевой АДГ. Поэтому представлялось целесообразным изучить влияние этих микроэлементов на метаболизм этанола в случае роста дрожжей на этом спирте. Оказалось, что независимо от исходной концентрации этанола

при соотношении Тп/¥е 10:1 и 1:5 клетки исследуемых дрожжей экскретировали в среду ацетат (табл.4), И только при соотношении 1:50 накопление ацетата в среде практически отсутствовало. Как мы полагаем, экскреция ацетата в среду культивирования является результатом несбалансированности окислительного метаболизма этанола. Одной из причин накопления этого соединения, в частности, может быть синтез недостаточного количества АТФ, которая главным образом генерируется при функционировании митохондриальных дыхательных цепей. Результаты проведенных нами экпериментов показали, что независимо рт исходной концентрации этанола и соотношения 2п/¥е для роста исследуемых дрожжей на этаноле была характерна активизация митохондриальных ЦПЭ в начальный период роста на этаноле. Об этом свидетельствуют высокая интенсивность дыхания, максимальная активность

Рис. 9.Динамика дыхания, активности цитохрси с сксвдаги и биосинтеза цитохрсмов при росте Т. candida на г. 4 х-яои этаноле и Zn/Fe 1:50.

цитохром оксидазы (ЦСО) и максимальный уровень биосинтеза дитохромов в этот период роста (рис.9,10). Вероятно, это можно объяснить необходимостью быстрого реокисления ЫАЕ)Н, которые образуются уже на начальных этапах окислительного метаболизма этанола.

В ходе изучения функционирования митохондриальных ЦПЭ при росте Т.сапсИйа на этаноле было установлено, что влияло на величину максимальной активности терминальных переносчиков дыхательной цепи ЦСО и цитохром с перокси-дазы (ЦСП). Она была наибольшей при Хп/^е 1:50 (табл. 6). Как видно из данных, представленных на рис.9, в случае роста Т.сапсИйа на 2.4 %-ном этаноле и 2п/Ре 1:50, не смотря на резкое падение интенсивности дыхания, уровень цитохромов

митохондриальных ЦПЭ оставался высоким в течении всего активного роста культуры (рис.9). Напротив, при Zn/Fe 10:1 одновременно с падением интенсивности дыхания происходило не менее резое снижение концентрации цитохромов в, с и а + аЗ, активность ЦСО была низкой (рис.10). Можно предположить, что при данных условиях культивирования функционирование митохондриальных ЦПЭ ингибируется продуктами окислительного метаболизма этанола (ацетальдегидом и ацетатом). При соотношении Zn/Fe 1:50 функциоирование дыхательной цепи, напротив, отвечает физиологическим потребностям клетки, о чем, в частности, свидетельствует отсутствие экскреции в среду ацетата. Таким образом, можно заключить, что при культивировании дрожжей на этаноле для эффективного функционирования митохондриальных ЦПЭ необходимо поддерживать высокую концентрацию ионов железа относительно ионов цинка.

ВЫВОДЫ

Проведено изучение начальных этапов окисления первичных спиртов в клетках исследуемых дрожжей. Получены следующие результаты:

1. Показано, что при росте на н-алканах окисление первичных спиртов в клетках исследуемых дрожжей осуществляется исключительно в ходе алкогольоксидазной реакции. В зависимости от вида дрожжей АО высших спиртов могут быть локализованы как в растворимой, так и в мембранной фракции клетки.

2. Впервые выделена и охарактеризована "растворимая" алкогольоксидаза, функционирующая в клетках Y.lipolytica, растущих на налканах. Она отличается от ранее известных оксидаз, способных окислять первичные спирты, своей широкой субстратной специфичностью, субъединичным строением и изоэлектрической точкой.

3. Установлено, что низкий уровень кислорода в среде культивирования репрессирует индукцию алкогольоксидазы в клетках дрожжей T.candlda, растущих на н-алканах.

4. Показано, что при выращивании на низких исходных концентрациях этанола окисление спирта в клетках исследуемых дрожжей осуществляется NAD -зависимой алкогольдегидроге-назой.

5. Установлено, что при высоких исходных концентрациях этанола в его окислении начинают участвовать алкогольоксидаза (-зы) и каталаза.

6. Показано, что высокий уровень комплекса каталаза-Н2О2 образуется в условиях аэрации клеточной суспензии. Разрушение этого комплекса в интактных клетках T.candida в присутствии этанола свидетельствует, что каталаза окисляет этанол, функционируя как пероксидаза.

7. Установлено, что в первые часы культивирования исследуемых дрожжей на этаноле происходит активизация функционирования митохондриальных ЦПЭ. Об этом свиде-

тельствуют высокая интенсивность дыхания, максимальная активность ЦСО и максимальный уровень биосинтеза цитохромов в, с и а + аЗ в этот период роста.

8. Показано, что увеличение концентрации ионов железа относительно ионов цинка при выращивании дрожжей на этаноле позволяет поддерживать оптимальное функционирование мито-хондриальных ЦПЭ, в результате чего экскреция ацетата в среду отсутствует.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ильченко А.П., Василькова H.H., Матяшова Р.Н. (1991) Влияние условий выращивания на динамику активности Н9О9-утилизирующих ферментов. Микробиология, т.60, вып.1, с.55^64.

2. Ильченко А.П., Василькова H.H., Тихонова Е.Б. (1991) Влияние уровня растворенного в среде кислорода на динамику активностей алкогольоксидазы и НАД-зависимой альдегиддегид-рогеназы в процессе адаптации дрожжей Torulopsis candida к гексадекану. Микробиология, т.60, вып.З, с.454-460.

3. Ильченко А.П., Василькова H.H., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В. (1994) Влияние соотношения ионов цинка и железа на экскрецию ацетата, активность НАД-зависимых алкоголь- и альдепщдегидрогеназ при выращивании дрожжей Torulopsis candida на среде с этанолом. Микобиология, т.63, вып.4, с.615-623.

4. Ильченко А.П., Моргунов И.Г., Хонек Г., Мауэрсбергер С., Василькова H.H., Мюллер Г. (1994) Очистка и свойства алкогольоксидазы из дрожжей Yarrowia lipolyíica Н-222. Биохимия, т.59, N9, с.969- 974.

27.04.95 г. Заи.0Е71Р. Тир.130 экз. Усл.печ.л. 1,0 Отпечатано нч ротапринте в ОНГ>1 ГЕЩ РАН