Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности окислительного обмена дрожжей Candida maltosa при росте на алифатических спиртах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности окислительного обмена дрожжей Candida maltosa при росте на алифатических спиртах"

Г' п

на правах рукописи

ПЕСКОВА ЕЛЕНА БОРИСОВНА

ОСОБЕННОСТИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ОБМЕНА ДРСШЕЙ

1 I II II/ ПППТГ 1Т Ц * ггтеж А •пгпт~г>\гчгу тт-п/пт Ау

иаш/Зиа Ик^г ^и^ла [±гА г^ 1 с. НА Рии^н - ^ -и^гчхЛ ^.¿инг^мЛ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1996 г.

Работа выполнена в Лаборатории окислительного обмена веществ Института биохимии и физиологии микроорганизмов

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Т.В. ©иногенова; кандидат биологических наук A.A. Еарышев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор ¡O.E. Евтодиенко; кандидат биологических наук А.Г. Медендев

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха

(г. Москва)

Защита диссертации состоится 23 февраля 1996г. в 1430 ч. на заседании специализированного совета Д 002.69.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, г. Пущино Московской обл., Институт биохимии и физиологии мик-,роорганизмов РАН.

С диссертацией ыохно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан января 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

В.М. Вагабов

Актуальность проблемы. Последние годы характеризуются возрастанием интереса к исследованию организации метаболизма эукариотических микроорганизмов, в частности грибов и дрожжей, что обусловлено, с одной стороны, широким применением их в биотехнологии и необходимостью повышения эффективности их использования для создания более экономичного производства. В биотехнологии решается проблема утилизации непищевых субстратов для получения веществ, применяемых в разнообразных отраслях народного хозяйства. Важную роль в этом вопросе играют дрожжи, как организмы, способные при росте на таких субстратах, как углеводороды, спирты с различной длиной цепи, продуцировать белки, органические кислоты и другие продукты.

С другой стороны, гибкость метаболизма дрожжей, возможность четкого контролирования их культивирования, позволяет широко применять данный объект для изучения эукариотических организмов в целом.

В связи с этим возникает необходимость детального изучения структурно-функциональной организации метаболических путей ассимиляции и диссимиляции различных субстратов в клетках дрожжей.

В лаборатории окислительного обмена веществ ИБФМ АН РАН в течение ряда лет проводятся исследования организации метаболизма дрожжевых организмов при росте на жидких парафинах и глюкозе,а также этаноле. Показано, что на втором этапе окисления н-алканов действует не дегид-рогеназный путь окисления спиртов (LebeauU et al., 1970), а оксидаз-ный (Ильченко, 1984; Ильченко с соавт, 1987; Ильченко, Цфасман, 1988; Краузова с соавт., 1984; Краузова с соавт., 1985). Для дрожжей Yarro-wia Upolytica - продуцентов лимонных кислот, исследованы возможные пути окисления этанола (Ильченко с соавт., 1994), однако известно, что у дрожжей, как представителей эукариотических организмов, обмен веществ и энергии строго компартментализован, отдельные этапы метаболизма сопряжены с различными органеллами, что обусловливает необходимость изучения обмена не только в бесклеточных гомогенатах, но и в зыделенных компартментах. Для создания более полной картины участия гслеточных структур в обмене веществ и энергии рассматривали пути тревращения азота при использовании этанола в качестве единственного юточника углерода и энергии.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение путей и внутриклеточной организации окисления спиртов различной длины углеводородной цепи, , а также локализации азотного обмена у дрожжей bandida maltosa.

В задачи экспериментального исследования входило: .) изучение природы окисления коротко- и длинноцепочечных спиртов у

дрожжей С. maltosa;

2) определение субклеточной локализации ряда ферментов, в том числе начальных этапов окисления спиртов;

3) изучение азотного обмена в клетках дрожжей С. maltosa и Y. tipoly-tica при использовании этанола в качестве источника углерода.

Научная новизна работы. Показано, что в клетках дрожжей С. maltosa, выращенных на этаноле, функционируют два пути окисления спиртов: первый осуществляется НАД-зависимой алкогольдегидрогеназой специфичной к спиртам с длиной углеродной цепи С2-С1г, локализованной в цитозоле; второй - алкогольоксицазой специфичной к спиртам с длиной углеродной цепи С6-С16, локализованной в пероксисомах. При росте же на длинноце-почечном спирте гексадеканоле функционирует только оксидазный путь.

При росте С.maltosa на этаноле обнаруживаются две альдегиддегидро-геназы, одна из которых локализована в пероксисомах и специфична к высшим альдегидам. Другая, локализованная в матриксе митохондрий и окисляющая ацетальдегид, нами выделена и охарактеризована.

Показана цитозольная' локализация ацетил-КоА-синтетазы и предложена схема метаболизма алифатических спиртов в дрожжевой клетке.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований разработан метод очистки ацетальдегиддегидрогеназы, которая может быть использована для получения НАДН в реакции окисления ацетальдеги-да, т.к. и субстрат (этанол), и продукт реакции (ацетат) легко удаляются из реакционной среды.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на сессиях научных работ ИБФМ РАН 1990 и 1994 гг., на первой международной конференции по метаболизму Yarrowia Upolytica в Тиверваль-Гриньоне, Франция (1995),

Публикации. По материалам работы опубликовано две печатные работы, одна статья принята к печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа содержит 133 страниц машинописного текста, включая 1 таблиц, 2? рисунков. Список литературы содержит 24Д, источника (из них - 21^ зарубежные).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Объекты исследований. Объектом исследований при изучении окисления

спиртов различной длины цепи явились дрсжжи Candida maltosa НП-4, хорошо растущие на изучаемых спиртах и не накапливающие в среде заметных количеств метаболитов.

Исследование азотного обмена проводили, помимо названных, у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica 704 (Y-2373) - активного продуцента лимонной кислоты при лимитировании роста источником азота.

Данные штаммы получены из Всесоюзной Коллекции микроорганизмов

ИБФМ РАН.

2. Культивирование микроорганизмов. Для культивирования микроорганизмов использовали минеральную среду Ридер с (NH4)2S04 (3,0 и 1, 6 г/л) в качестве источника азота. В качестве источника углерода использовали алифатические спирты (этанол 1%, додеканол 0,5%, гексадеканол 0,5%), ацетат натрия 1%. Культивирование дрожжей проводили в лабораторном ферментере АНКУМ-2М с автоматическим поддержанием рН (4,5), при температуре 29° С и концентрации кислорода 60-65%; объем среды 6 л. Рост дрожжей контролировали по массе сухих клеток (г/л) и по величине оптической плотности клеточной суспензии при 600 нм.

3. Получение бесклеточных гомогенатов. Дрожжевые клетки собирали в конце экспоненциальной фазы роста и осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, затем дважды отмывали 1% -ным NaCl.

После этого клетки ресуспендировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 1 мМ ЭДТА, 5мМ ДТТ и 0,3 мМ фенилметилсульфо-нилфторид (PMSF), в соотношении 1:3 (осадок: буфер) и разрушали экс-трузионным методом на ИБФМ - прессе (рабочее давление 3200 кг/сь?). Суспензию, полученную после разрушения, центрифугировали при 10000 g 10 мин при 0°С, в результате чего оболочки клеток и неразрушенные клетки выпадали в осадок, а супернатант, содержащий ферменты всех ор-ганелл, использовали для измерения ферментативных активностей.

При выделении ацетальдегиддегидрогеназы бесклеточный гомогенат получали разрушеним клеток с помощью стеклянных бус "баллотини" (100-150 мкм) на планетарной мельнице при 1000 об/мин в течение 3 минут при 4°С в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 1 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ И 0. 3 MM PMSF.

4. Субклеточное фракционирование. Для получения протопластов клетки, собранные в середине логарифмической фазы роста, суспендировали в среде с цистеином, затем с "улиточным ферментом". Проводили осмотический лизис протопластов, а полученный лизат подвергали дифференциальному центрифугированию, в результате которого получали фракцию частиц, состоящую из митохондрий и пероксисом, фракцию легких мембран

и растворимую фракцию. Качество разделения фракций проверяли измерением активности маркерных ферментов. Разделение считалось удовлетворительным, если не менее 95% активности фумаразы обнаруживалось в митохондриях и не менее 95% активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы обнаруживалось в цитозоле.

Дальнейшую очистку митохондрий и пероксисом проводили центрифугированием в растворах перколла с конечной концентрацией перколла в суспензии 30 %.

Профиль градиента, образовавшийся в результате , определяли двумя способами : 1) по распределению окрашенных маркерных гранул известной плотности; {"Pharmacia", Швеция); 2) по значению индекса рефрактер-ности фракций, используя экспериментально найденную зависимость между индексом рефрактерности и плотностью растворов перколла различной концентрации в среде.

5. Определение активности ферментов. Активности ферментов определяли спектрофотометрически в термостатируемой кювете при температуре 30°С.

При участии в реакции НАД(Ф) или НАД(Ф)Н в реакционную смесь добавляли 1 мМ KCN для ингибирования окисления НАД(Ф)Н в дыхательной цепи. С целью снятия барьера проницаемости мембран в реакционную смесь добавляли 0,02 % -ный тритон Х-100, который не оказывал ингиби-рующего влияния.

Методики определения цитратсинтазы, фумаразы, аконитазы, малатсин-тазы, изоцитратлиазы, НАД- и НАДФ- изоцитратдегидрогеназы, малатде-гидрогеназы, карнитинацетилтрансферазы, ацетил-КоА-синтетазы, катала-зы, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, альдегидредуктазы, алкогольоксидазы, ацил-КоА-оксидазы, НАД- и НАДФ- глутаматдегидроге-назы, аланин- и аспартат-оксоглутаратаминотрансферазы, аланин-глиок-силатаминотрансферазы, глутаминсинтетазы подробно изложены в диссертационной работе (см. Материалы и методы).

Белок определяли с биуретовым реактивом.

6. Определение интенсивности дыхания. Ингибиторный анализ. Определение потребления кислорода фракцией митохондрий проводили в полярографической ячейке объемом 2 мл со стационарным электродом типа электрода Кларка при 28 -29°С. В качестве среды дыхания использовали 1 М сорбитол, 10 мМ Трис, 10 мМ Hepes, 10 мМ MgCl2, 0,2% БСА, рН 7,4. Ингибиторами являлись 1 мМ KCN, 1 мМ БГК, 10 мМ антимицин, 0, 05 мМ ро-тенон. Определяли процент ингибирования на фоне эндогенного дыхания и на фоне внесенного субстрата.

Одновременное измерение интенсивности дыхания и восстановления НАД

проводили в ячейке, снабженной электродом Кларка и датчиком, регистрирующим изменение флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов. Среда инкубации содержала 20 мМ натрий-пирофосфатный буфер. рН 8,8. Для создания анаэробных условий использовали ловушку " глюкозооксида-за - каталаза ", включающую 25 ед / мл глюкозооксидазы, 150 ед / мл каталазы, 0,1 мМ / мл глюкозы.

7. Очистка ацетальдегидцегидрогеназы. Разработанная нами методика очистки ацетальдегидцегидрогеназы включала три стадии: прогревание при 60? высаливание сульфатом аммония (50% насыщения) и гидрофобная хроматография с октил-сефарозой. Белок во фракциях, полученных в результате элюции, определяли по оптической плотности при 280 нм и с реактивом Бредфорда.

Молекулярную массу нативного препарата фермента определяли методом гельфильтрации на колонке (1,6 х 100 см) с Sepharose CL-6B и методом электрофореза в 12,5 % - ном ПААГ. Электрофоретические исследования выполнены на приборе для горизонтального скоростного электрофореза Fast-System ("Pharmacia", Швеция) по инструкции к прибору. В качестве маркеров использовали набор маркерных ферментов ("Pharmacia"). включающий лактальбумин, карбоангидразу, овальбумин, бычий сывороточный альбумин и фосфорилазу Б. Структуру фермента определяли методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ РЯДА ФЕРМЕНТОВ ПРИ ОКИСЛЕНИИ ЭТАНОЛА И ГЕКСАДЕКАНОЛА

1.1. Рост дрожжей на различных спиртах и активность ферментов их окисления

Для исследования механизмов окисления различных спиртов были выо-раны дрожжи Candida raitosa и рассмотрены особенности их роста на таких субстратах, как метанол, этанол, октанол, додеканол, гексадека-нол, а также глюкоза, гексадекан и ацетат.

Дрожжи С. maltosa росли на этаноле и гексадеканоле. На додеканоле и гексадеканоле особенно хороший рост наблюдался при внесении 0,1% Tween -80 в качестве добавки, эмульгирующей субстрат. В то же время, дрожжи С.maltosa не росли на метаноле, равно как и на среднецепочеч-ном спирте октаноле. Более того, октанол, будучи добавлен в количест-

ве 0,3% по объему, полностью блокировал рост дрожжей на гексадекане и на этаноле, что, по-видимому, объясняется его токсичностью (рис.1).

Известно два основных пути окисления спиртов - дегидрогеназный (1) и оксидазный (2) (рис.2). Специфические особенности алкогольдегидро-геназного пути заключаются в следующем: данный процесс не сопровождается -поглощением кислорода, может протекать как в аэробных, так и в анаэробных условиях; восстановление НАД обусловлено последовательным функционированием алкоголь-и альдегиддегиддегидрогеназ и подавляется специфическим ингибитором алкогольдегидрогеназы - пиразолом, и не подавляется полностью

ir-r/n

BpeufSíjrniTHBii)

Candida maltosa

врздх куль ч "

Рис.1 Накопление биомассы дрожжами

при росте на различных субстратах

"ловушкой" альдегидов - семикарбазидом; кроме того, реакция превращения спирта в альдегид является обратимой, следовательно, можно наблюдать НАД(Ф)Н-зависимое восстановление альдегида в спирт.

1 НАД+ НАДН НАД+ НАДН

спирт

альдегид ингиби?ор пиразол

.кислота

НАД НАДН

альдегид

кислота

■^ловушка семикарбазид

Рис.2.Схема возможных путей окисления спиртов

Окисление спирта с помощью алкогольоксидазы сопровождается поглощением кислорода; наблюдаемое восстановление НАД вызвано действием ал ьдегиддегидрогеназы и не ингибируется пиразолом, но подавляется семикарбазидом; равновесие сильно сдвинуто в сторону образования аль-

дегида, реакция практически необратима.

Для "этанольных" гомогенатов характерна высокая активность дегид-рогеназных ферментов, причем как в случае окисления этанола, так и октанола (табл. 1), а также ферментов альдегидзависимого окисления НАДН - ацетальдегид-и октанальредуктазы, которые при окислении длин-ноцепочечных.спиртов проявляют активность примерно на порядок ниже. Активность этанолдегидрогеназы заметно снижается при использовании в качестве источника углерода жирных спиртов. Примечательно, что при окислении октанола наблюдается высокая и дегидрогеназная, и оксидаз-ная активность во всех исследованных гомогенатах.

Таблица 1. Ферментативные активности в субклеточных гомогенатах дрожжей С.maltosa, выращенных на различных спиртах

Ферментативная активность (микромоль в мин на 1 мг белка) Субстрат роста

этанол додеканол гексадеканол

Алкогольдегидрогеназа 0.181 0.023 0.005 |

(с этанолом) 1

Алкогольдегидрогеназа 0. 238 0.190 0.164

(с октанолом) j

Алкогольоксидаза 0. 240 0.210 0.183 1

(с октанолом) 1

Ацетальдегидредуктаза 0.234 0.054 0.011

Октанальредуктаза 0. 216 0. 032 0. 012

Ацеталъдегиддегидроге- 0. 150 0.010 0. 015

наза

Октанальдегидрогеназа 0.084 0. 190 0. 164

Ацил-КоА-оксидаза 0.007 0. 150 0.200

Для формирования более четких представлений о метаболических путях, реализуемых в клетке, необходимо рассматривать не только активности, определяемые в гомогенатах, но и их распределение в клеточных фракциях.

1.2. Внутриклеточная локализация ферментативных активностей

На первом этапе анализировалось распределение ферментативных активностей во фракциях, выделенных дифференциальным центрифугированием бесклеточных гомогенатов, полученных "мягким" осмотическим шоком протопластов дрожжей. На рис. ЗА представлены результаты фракционирования "этанольных" дрожжей. Маркерные ферменты митохондрий обнаруживались практически полностью во фракции Фго наряду с другими ферментами ЦТК - цитратсинтазой и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназой, где также обнаруживалось от 60-70 % активности изоцитратлиазы , каталазы, малатсинтазы. Остальная активность проявлялась в растворимой фракции, что обусловливалось, по-видимому, частичным разрушением пероксисом. Тут же обнаруживалось до 10% активности малатдегидрогеназы. В отличие от НАД-зависимой-, активность НАДФ-зависимой- ИЦДГ на 60-70 % выявлялась в цитозоле. Карнитинацетилтрансфераза обнаруживалась в основном в митохондриально-пероксисомальной фракции. Алкогольоксидаза была обнаружена в Ф20 и отсутствовала в цитозоле. Алкогользависимое (как этанол, так и октанол) восстановление НАД выявлено в цитозоле. Альде-гидредуктазная реакция наблюдалась лишь в цитозоле, а активность аце-тальдегиддегидрогеназы - в митохондриально-пероксисомальной фракции.

Ацегил-КоА-синтетаза обнаружена в цигозольной фракции, что ставит вопрос о переносе ацетильных остатков и проницаемости пероксисомаль-ной мембраны для них.

Для уточнения локализации ацетил-КоА-синтетазы проводили дифференциальное центрифугирование бесклеточного гомогената дрожжей, выращенных на ацетате, где данный фермент осуществляет первый этап метаболизма. Ацетил-КоА-синтетаза выявлена также в цитозоле, что отличается от данных для S. cerevisiae, выращенных на глюкозе, [Klein et al., 1968] и совпадает с данными для С. tropicalis, утилизирующих ацетат и пропионат [Veda et al.,1983], а также ряда мутантных штаммов S. cerevisiae, выращенных на ацетате [Small et al. ,1995].

При дифференциальном центрифугировании бесклеточных гомогенатов "гексадеканольных" дрожжей распределение маркерных ферментов, ферментов ЦТК и ГЦ, карнитинацетилтрансферазы аналогично распределению в "этанольных" дрожжах и не зависит от длины углеродной цепи используемого спирта (рис.ЗБ). Октанолоксидаза , альдегиддегидрогеназа, ацил-КоА-оксидаза локализованы во фракции крупных органелл, состоящей из пероксисом и митохондрий. В растворимой фракции обнаружена этанол-дегидрогеназная активность в следовом количестве.

В результате центрифугирования в самообразующемся градиенте пер-колла митохондриально-пероксисомальной фракции было осуществлено раз-

изоцитрат лиаза

фумараза

НАДФ ИЦЦГ

и

* -

3 -2 -

глюхозо— б—фосфат

ДГ

81

ацетил-КоА-синтетаэа

КАТ

этанолДГ

октанолДГ

з-21-

4_

3_ г 1

ацеталь ■ дегидДГ

- I

з 2 1 _

овсидаза э_

ацсгаль -цегидре-дуктаза

*

з _ г _

октаналь-редуктаэа

НАД-ГДГ

НАДФ-ГДГ i-з -г-

АспАТ

4 -

з 2 1 -

АлаАТ

глиоксилат АТ

глутаыин-синтетаэа

100

ф ф РФ

содержание белка %

ФвоФ|ов РФ

содержание белка,

Рис.3. Распределение ферментативных активностей между субклеточными фракциями, полученными дифференциальным центрифугированием бесклеточного гамогената дрожжей С.паНаза, выращенных на этаноле (А) и гекоадеканоле (Б), вго-митоховдриально-пероксисомальная фракция, со-Фракция легких мембран, РФ-растворимая фракция. Высота столбца-отнооительная удельная активность фермента во фракции, равная отношении X активности к X Селка во фракции; ширина-относительное содержание белка во фракции (I); площадь равна общей ферментативной активности во фракции. За 1002 принята активность в Оесклеточном гамогената.

1 ■

деление фракции частиц на две зоны - нижнюю, более плотную, митохонд-риальную и верхнюю, более легкую, пероксисомальную. Кривая распределения белков имела два выраженных пика, первый - во фракции 2-4, соответствует верхней зоне, второй -9-11, что соответствует нижней

зоне.

На рис.4 показаны результаты разделения митохондриально-пероксисо-мальной фракции "этанольных" дрожжей. Митохондриальные маркерные ферменты - аконитаза , фумараза, цитратсинтаза и НАД - зависимая изоцит-ратдегидрогеназа обнаруживались во втором пике, пероксисомальные-изоцитратлиаза и каталаза - в первом. НАДФ-зависимая ИЦДГ выявлялась во фракции митохондрий, а малатсинтаза - в пероксисомах. Т.о., полученные данные свидетельствуют о том, что в пероксисомах дрожжей С. maltosa содержатся только два фермента глиоксилатного цикла - изоцит-ратлиаза и малатсинтаза, тогда как остальные локализованы в матриксе митохондрий, за исключением малатдегидрогеназы, обнаруживаемой и в митохондриях, и в цитозоле, что характерно для большинства дрожжей [Cioní el al.,1981; Alomi el al.,1990], в отличие от растений [Земля-нухин с соавт.,1986]. Оксидаза высших спиртов "этанольных" клеток локализована в пероксисомах, а ацетальдегидегидрогеназа - в митохондриях. карнитинацетилтрансфераза распределена между пероксисомами и митохондриями.

^активности во фр&кции [от общей в пробирке

j оксидаза 30Г высших спиртов

ПЛОТНОСТ1 .1 ц

перко/ша.

АлиДГ

Hiátep фракции

.^активности во фр&хдин от общей в пробирке

10

.08

.07

.05

.04

ао

го

ю

Ас пАТ

каталаза

ноие$ фракций

Рнс.4. Распределение ферментативной активности при фракционировании (^этанольных дрожжей С.таИ03а в градиенте плотности перколла

Для "гексадеканольных" дрожжей распределение ферментов ЦТК, ГЦ, карнитинацетилтрансферазы аналогично рассмотренному (рис.5).Ферменты начальных этапов окисления гексадеканола - алкогольоксидаза и альде-гидцегидрогеназа выявляются в пероксисомах, наряду с ключевым ферментом пероксисомального ^-окисления ацил-КоА-оксидазой. Как видно из табл.1, в гомогенатах дрожжей, выращенных на длинноцепочечных спиртах

сГактивностн во фракции

от обшей в пробирке цптратоинтаза

¿активности во фракции от о вше Я в пробирке

20

10

0'

Рис.5. Распределение ферментативной активности при фракционировании (^гексадеканольных дрожжей С.maltosa в градиенте плотности перколла

обнаруживается достаточно высокая активность этого фермента. Активности ключевых ферментов митохондриальной системы ^-окисления -ацил-КоА-дегидрогеназы и карнитинпальмитоил-КоА-трансферазы обнаружено не было. Следовательно, образующиеся при окислении альдегидов жирные кислоты окисляются в системе^-окисления пероксисом. подобно тому как это происходит в клетках дрожжей, растущих на н -алканах.

Итак, в результате проведенных исследований выявлены сходство в локализации активностей ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла у дрожжей С. maltosa, утилизирующих этанол и гексадеканол и ряд различий в распределении активностей ферментов их окисления , а именно: цито-зольное алкогользависимое восстановление НАД в клетках "этанольных", обусловленное функционированием дегидрогеназы и пероксисомальное - в клетках "гексадеканольных" дрожжей, вызванное последовательным действием алкогольоксидазы и дегидрогеназы высших альдегидов; митохондри-альное окисление ацетальдегида у "этанольных" и пероксисомальное окисление высших альдегидов- у "гексадеканольных".

2. ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ ОКИСЛЕНИЯ КОРОТКО- И ДЛИННОЦЕПО-ЧЕЧНЫХ СПИРТОВ

После определения локализации ферментативных активностей во фракциях, мы проанализировали природу окислительных процессов, которые протекают в различных компартментах клетки дрожжей С. maltosa при окислении спиртов различной длины углеводородной цепи.

2.1. Природа окисления спиртов разной длины углеродной цепи

Катализируемое растворимой фракцией алкогользависимое восстановление НАД имело субстратную специфичность к спиртам с длиной углеродной цепи С2-С12 практически одинаковую для "этанольных" и "гексадеканоль-ных" дрожжей. В растворимой фракции были обнаружены альдегидредуктаз-ные активности (альдегидзависимое окисление НАДН) со сходной субстратной специфичностью. Ингибитор АДГ пиразол в низких концентрациях подавлял активность алкогользависимого восстановления НАД, а 200 мМ семикарбазид снижал активность не более чем на 10 % . Как видно из рис.6, этанол-и октанол -зависимое восстановление НАД не сопровождалось поглощением кислорода и наблюдалось в аэробных и анаэробных условиях. Исчерпание кислорода в среде с помощью кислородной ловушки не влияло на процесс восстановления НАД. Т.о., все полученные данные свидетельствуют о том, что окисление спиртов с длиной углеродной цепи С2-С1г в цитозоле дрожжей С. maltosa катализируется НАД-зависимой ал-когольдегидрогеназой.

Совершенно другая картина наблюдается при изучении процессов окисления спиртов очищенными пероксисомами. Пероксисомы катализируют как алкогользависимое поглощение кислорода, связанное с генерацией перекиси водорода, так и алкогользависимое восстановление НАД. При этом оба процесса имеют одинаковую субстратную специфичность к спиртам с длиной углеродной цепи С6-016. Как показано на рис.6, внесение окта-нола в реакционную смесь вызывает поглощение кислорода, независимое

ндд'Сг-он

rfr°H НУДушкаО, IjHyWcaOe

от присутствия в среде НАД и не подавляемое ингибиторами дыхательной цепи митохондрий. Если в среде присутствует НАД, то он восстанавливается наряду с поглощением кислорода. Октанолзависимое восстановление НАД наблюдалось лишь в аэробных условиях. Исчерпание кислорода в среде с помощью кислородной ловушки приводило к немедленной остановке процесса восстановления НАД. В отличие от цитозольной активности ал-когользависимое восстановление НАД не было чувствительно к пиразолу, но значительно подавлялось "ловушкой" альдегидов-семикарбазидом. Кроме того, в пероксисомах не обнаруживалась альдегидредуктазная активность. Т. о., полученные данные свидетельствуют о том, что в пероксисомах дрожжей С.maltosa, выращенных как на этаноле так и на гексаде-каноле, присутствует алкогольоксидаза, катализирующая окисление спиртов с длиной углеродной цепи С6-С16. Наблюдаемое же алкогользависимое восстановление НАД обусловлено функционированием алкогольоксидазы и присутствующей в пероксисомах дегидрогеназы высших альдегидов.

2.2. Митохондриальное дыхание

Альдегиддегидрогеназные активности, обнаруженные в очищенных фракциях митохондрий и пероксисом " этанольных" дрожжей, существенно различались по субстратной специфичности. Альдегиддегидрогеназа митохондрий имела широкую специфичность и окисляла как короткоцепочечные, так и длинноцепочечные альдегиды, в то время как альдегиддегидрогеназа пероксисом окисляла только длинноцепочечные и среднецепочечные альдегиды и практически не окисляла формальдегид и ацетальдегид. В связи с этим представляло интерес изучение возможности сопряжения окисления ацетальдегида с окислительным фосфорилированием. На рис. 7 представлены полярографические кривые поглощения кислорода митохонд-риальной фракцией "этанольных" дрожжей в присутствии различных субстратов. Митохондрии катализировали сопряженное с окислительным фосфорилированием окисление ацетальдегида. С другой стороны, митохондрии не окисляли ни ацетат, ни ацетил-КоА. Окисление ацетальдегида, как и окисление малата в присутствии пирувата на 95% ингибируется ротено-ном, ингибитором первого пункта сопряжения. Это свидетельствует о том, что НАДН, образованный в ацетальдегиддегидрогеназной реакции, окисляется на уровне НАДН-дегидрогеназы. Следовательно, окисление ацетальдегида происходит в матриксе митохондрий. Следует отметить, что окисление ацетальдегида полностью подавлялось KCN и бензгидрокса-мовой кислотой. Таким образом, можно заключить, что у дрожжей

М* 1кМ

МШГ 10« И

пчим

АДФБО^м

ЯДФ 1м И

1>И

РОТЕНОН -|ми

нядн

Рис.7. дыхаюге шюхопдрии этанальнш дрожжей. Цифры на кривых обозначают скорость дыхавдя; ншхкь Ог/шн на 1 иг белка. ЕГК-бензгвдроксаиовая киелоп; Мх-юггахондащ, а,6 иг Qejuca/ui.

С.maltosa при росте на этаноле функционирует сопряженное с окислительным фосфорилированием окисление ацетальдегида, катализируемое альдегиддегидрогеназой, локализованной в матриксе митохондрий. Аце-тальдегиддегидрогеназа была нами выделена, онищена и частично охарактеризована.

2.3. Очистка ацетальдегиддегидрогеназы

Результаты очистки фермента суммированы в табл.2. Получен препарат фермента с удельной активностью 14,5 мкмоль/мин на 1 мг белка, с выходом 55 % со степенью очистки в 240 раз.

Молекулярная масса нативного препарата альдегиддегидрогеназы из С. maltosa, определенная методом гель-фильтрации на колонке с Sepharo-se CL-6B, составляла 70 кДа. Такая же величина молекулярной массы определена и методом нативного электрофореза в 12,5 % - ном ПААГ. Фер-

Табл.2. Очистка ацетальдегиддегидрогеназы.

Стадия очистки Общий Активность Выход. Степень

белок. общая. удельная. %

мг Е Е на 1 мг белка очистки

Бесклеточный

экстракт 1360 81,6 0, 06 100 1

Прогрев 950 97,5 0.1 119 1.6

Высаливание 413 90,8 0.22 111 3.7

Октил-сефароза 3 45,0 14. 5 55 241. 6

мент состоит из одной субъединицы, что подтверждалось электрофорезом с Ds-Na.

Максимальную активность фермент проявлял при pH 9,6. При этом более стабильными являлись растворы альдегиддегидрогеназы с pH 7- 8. Альдегиддегидрогеназа являлась термостабильным ферментом и сохраняла более 90 % активности при нагревании в течение 30 мин до 60°. При этой же температуре фермент проявлял максимальную активность.

Константы Михаэлиса для NAD и ацетальдегида определены методом прямого линейного графика Эйзенталя и Корниш-Боудена. Km для NAD равна 60 мкМ, для ацетальдегида - 30 мкМ.

Ионы Mg2* и Mnz+ в концентрации 10 мМ не влияли на активность аль-. дегиддегидрогеназы, ионы некоторых других металлов (Ag+, Fez+, Zn2+, Cuz+) ингибировали фермент.

Альдегиддегидрогеназа, выделенная нами из С.maltosa, наиболее близка по свойствам к митохондриальной из дрожжей S.cerevisiae, [Jacobson et al., 1974]. но отличается более широкой субстратной специфичностью.

2.3. Схема окисления этанола и гексадеканола в клетках дрожжей Candida maltosa

Суммируя полученные данные, мы сочли возможным составить предполагаемую схему окисления алифатических спиртов в клетке исследуемых дрожжей (рис.8). Т.к. ферменты начальных этапов окисления гексадеканола - алкогольоксидаза. дегидрогеназа высших альдегидов и ацил-КоА-синтетаза являются пероксисомальными мембракносвязанными, то и эти этапы протекают в мембране пероксисом. Дальнейшие преобразова-

ния осуществляются в цикле ^-окисления жирных кислот, локализованном внутри пероксисом. Ацетил-КоА,образовавшийся в результате, включается в глиоксилатный цикл в результате малатсинтазной реакции или превращается в ацетилкарнитин под воздействием КАТ. локализованной в перокси-сомах, и поступает в митохондрии, где вновь превращается в ацетилКоА опосредовано митохондриальной КАТ и включается в ЦТК в цитратсинтаз -ной реакции.

Окисление этанола до ацетальдегида происходит в цитозоле под воздействием АДГ. Образовавшийся ацетальдегид поступает в матрикс митохондрий, где АльДГ катализирует сопряженное с окислительным фосфори-лированием его окисление до ацетата. Учитывая исключительно цигозоль-ную локализацию ацетил-КоА -синтетазы и отсутствие окисления ацетата митохондриями, остается предположить, что ацетат переносится через митохондриальную мембрану в цитозоль,где превращается в ацетил-КоА.

жирный спирт \ашде

(Щ

митохондрия

ОрЧГд "Т^ислота пероксисома У

адал-КоА*—^ й

^-скисгсение 0

ацетит/—Ко_ ,

алат

^Чгтмоксират^,

\ \изоцитра' карнити#» ацвтилуарнити:

Рис.8. Схема метаболизма этанола и гексадеканола в клетках дрожжей Стасова

Отсутствие в цитозоле КАТ предполагает, что пероксисомаль-

ная мембрана, в отличие от митохондриальной, проницаема для него и ацетил-КоА проникает внутрь пероксисом. где включается в глиоксилатный цикл или превращается в ацетилкарнитин и переносится в митохондрии, поступая в ЦТК.

3. МЕТАБОЛИЗМ АЗОТА

В целях создания более цельного представления о метаболизме дрожжей Candtda raltosa было проведено исследование утилизации источников азота, природы действующих ферментов и их локализации в зависимости от лимитирующего фактора - количества азота в клетках дрожжей С. mal-

tosa и Yarrowia lipolytica' 704.

В результате проведенных исследований показано, что в условиях не-лимитированного роста основным ферментом ассимиляции аммония являлась НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа; НАД-зависимая глутаматдегидро-геназа являлась ферментом диссимиляции, ее активность возрастала в условиях утилизации как эндогенных, так и экзогенных аминокислот. При лимитировании роста как дрожжей С.maltosa так и Y. lipolytica (рис.9) источником азота происходило переключение пути ассимиляции ионов аммония с глутаматдегидрогеназного на тлутаминсинтетазный, по-видимому, в связи с существенно более высоким сродством последнего к ионам аммония. Исследование локализации ферментов у дрожжей С.maltosa (рис.ЗА) и Y. lipolytica показало, что глутаматдегидрогеназы и глута-минсинтетаза локализованы в цитозоле; аспартатаминотрансфераза в

Рис.9. Изменение активности ферментов азотного метаболизма при росте дрожжей С, mal tosa (А) и Y.lipolytica (Б) на этаноле

при лимитировании источником азота

основном локализована в митохондриях, что совпадает с данными для Endomyces magnusii [Звягильская с соавт.,1986; Звягильская,1995], а глиоксилатаминотрансфераза локализована в цитозоле; аланинаминотранс-фераза у дрожжей С. maltosa локализована в цитозоле и митохондриях, а у У. lipolytica - в основном в цитозоле.

ВЫВОДЫ

1) В клетках дрожжей Candida maltosa, выращенных на этаноле, функционируют два пути окисления спиртов: первый осуществляется НАД -зависимой алкогольдегидрогеназой специфичной к спиртам с длиной углеродной цепи С2-С,g, локализованной в цитозоле, второй осуществляется

алкогольоксидазой специфичной к спиртам с длиной углеродной цепи С6-С16. локализованной в пероксисомах. При росте на гексадеканоле функционирует только оксидазный путь.

2) В клетках дрожжей С.maltosa, выращенных на этаноле, присутствуют две альдегидцегидрогеназы. Одна из них локализована в пероксисомах и специфична к высшим альдегидам. Другая, локализованная в матриксе митохондрий, осуществляет окисление ацетальдегида. Имеет широкую субстратную специфичность к альдегидам с длиной углеродной цепи C1-CÍZ. Ацетальдегиддегидрогеназа была нами выделена, очищена и частично охарактеризована. Получен препарат фермента со степенью очистки в 241 раз и удельной активностью 14, 5 мкмоль/ мин на 1 мг белка с выходом 55%. АльДГ, являясь мономером, имеет молекулярную массу 70 кДа. Фермент термостабилен, pH - оптимум сдвинут в щелочную сторону.

3) Ацетил-КоА-синтетаза локализована исключительно в цитозоле. Отсутствие карнитинацетилтрансферазы в цитозоле клеток позволяет предположить, что пероксисомальная мембрана проницаема для ацетил -КоА, в то время как перенос ацетильных остатков из пероксисом в митохондриии осуществляется в форме ацетилкарнитина.

4) При лимитировании роста дрожжей С.maltosa и Yarrowia lipo Ii¡tica источником азота происходит переключение пути ассимиляции ионов аммония с глутаматдегидрогеназного на глутаминсинтетазный, по-видимому, в связи с существенно более высоким сродством последнего к ионам аммония; аспартатаминотрансфераза в основном локализована в митохондриях, аланинаминотрансфераза у дрожжей С. maltosa локализована в цитозоле и митохондриях, а у Y. lipolytica - в основном в цитозоле.

Список работ, опубликованных по теме диссертации;

1. И.Г.Моргунов, A.A.Шарышев, Е.Б.Пескова, Т.В.Финогенова. Митохонд-риальная альдегиддегидрогеназа этанол-ассимилирующих дрожжей Candida maltosa. //Биохимия, 1996, Т. 61, N. 1, С. 135-145.

2. А.А.Шарышев,Е.Б.Пескова,Г.Н.Комарова, Т.В.Блинова. Субклеточная организация окисления алифатических спиртов у дрожжей Candida maltosa. //Прикл. биохимия и микробиол., 1996, Т.32, N. 1, С. 121-128.

3. Е. Б. Пескова, А.А.Шарышев, Т.В.Финогенова. Исследование внутриклеточной организации азотного метаболизма у дрожжей Yarrowia lipolytica и Candida maltosa. //Прикл. биохимия и микробиол., 1996, Т. 32, N.4, С. 405-412 /

/