Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование естественных механизмов регулирования роста популяции дрожжей Candida maltosa при периодическом культивировании

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование естественных механизмов регулирования роста популяции дрожжей Candida maltosa при периодическом культивировании"

На правах рукописи

РАБИНОВИЧ Юрий Самуилович

Исследование естественных механизмов регулирования роста популяции дрожжей Candida maltosa при периодическом культивировании

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1997

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном Технологическом институте (техническом университете).

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор Яковлев

Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Болотников

Игорь Алексеевич кандидат химических наук Петров

Леонид Николаевич Ведущая организация: Санкт-Петербургская государственная фармацевтическая академия.

Защита состоится 1998 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 063.25.09 в Санкт-Петербургском государственном Технологическом институте (техническом университете) по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр-т, 26, СП6ТИ(ТУ).

С дисссрт"цией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского .государственного Технологического института (технического университета). Замечания и отзывы по данной работе, заверенные печатью, в одном экземпляре, просим направлять по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр-т, 26, СПбТИ(ТУ), Ученый Совет.

Автореферат разослан /¿У 1997 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета Т.Б. Лисицкая

-31. Обща" характеристика работы

А [дуальность работы Исследование клеточного цикла эу-карнотическнх клеток микроорганизмов, в частности дрожжей, является необходимым для разработки технологий микробиологического синтеза. Клеточный цикл взаимосвязан с поиуляцноннымн процессами, что вклгочает в себя целый комплекс вопросов о наличии сложиог внутрипопуляционного регулирования, влияющего через сигнальное взаимодействие на процессы, происходящие внутри клетки. Сложность проблемы проявляется в том, что процессы внутрипопуляциоииого регулирования роста (пролиферации клеток и увеличения их размеров), а также способность популгции микроорганизмов к выживанию п неблагоприятных условиях складывается из независящих от. микроорганизмов и контролируемых ими факторов. К независящим от микроорганизмов фяк/орам можно отнести создаваемые извне или возникающие в процессе жизнедеятельности условия субстратного лимитирования, инп.бирования продуктами синтеза, высокими концентрациями субстратов или физическими условиями среды. К контролируемым микроорганизмами естественным факторам относятся изменения поверхностных сьойо'в и линейных размеров клеток, модификация и перенос генетического материала и шгкомолекулярных медиаторов. Изменение поверхностных свойств клеток включает изменение площади поверхности, изменение активности транспорта веществ, а также агрегацию клеток между собой и агрзгацшо с частицами малорастворимых су5-стратов.

Клеточный цикл разделяют на фазы Go, Gj, S, G2 и M. Протяженность этих фаз оказывается предсказуемой индивидуально цля каждого организма. Особое состояние мембран, возникающее на последних фазах клеточного цикла может быть важным для отключения клетки от регуляторных процессов, протекающих в этот помет в популяции (Rodney P.J. et.al, 1987). Как для животных клеток так и для микроорганизмов высказывается предположение о жест-

кой связи между достижением клеткой определенного размера и прохождением точки .старта клеточного цикла в фазе G[. Рецептор-но-каскаДное распространение полны сигнального возмущения по цнтоскелету для'клеток,жиротных и человека запускает внутриклеточные механизмы от такого первичного- регуляторного акта как изменение свойств поверхности (Ne.lscn, Lazarides,. 1984). В. какой степени изменение свойств поверхности клеток микроорганизмов может зависеть от Е".ода в клеточный цикл,, остается малоизученным. Изучение изменений в химическом, и компонентном составе поверхности не прояснило líx Значимость для формирования надмолекулярных структур поверхности, которые могут нести ответственность за первичные регуляторные акты, связанные с пролиферацией. Иллюстрацией этого является связь количества рубцов на поверхности материнских: клеток некоторых почкующихся дро-окей и их дальнейшей пролиферати'йной иктивности.

В лабор;1торни кафедры технологии микробиологического синтеза СПгТИ (ТУ) проводились многолетние исследования процессов управляемого биосинтеза дрожжевых организмов. Исследования включали в себя изучение кинетики переходных процессов в условиях субстратного лимитирования'!! апробировались в условиях промышленных предприятий (г. Кириши .(Ленинградская обл.), г.Новополоцк (Беларусь)).

Изучение взаимообязанности между собой параметров клеточного цикла, состояния поверхности н размеров клетки является продолжением этой темы II расширяет возможности модификации управления процессом культивирования микроорганизмов.

Цель и задачи исследования: В работе ставилась цель изучения взаимосвязи между средним линейным размером Клеток и качественным изменением клеточной стенки клеток растущей культуры дрожжей Candida maltosa в различных фазах клеточного цикла.

Для достижения поставленной цели ^необходимо было решить следующие конкретные задачи:

-51. Выбор методе анализа для характеристики гетерогенного распределения популяции по размерам.

2. Исследование параметров клеточного циклц и зависимости между средним линейным размером клеток почкующихся дрожжей и'скоростыо прохождения клеточного цикла.

3. Изучение возможности применения циклических температурных колебаний (ЦТК) для получения популяции шочкугащихся дрожжей Candida maltosa,, синхронизированной по фазам клеточного цикла. .- ■ . .

4. Изучение качественных изменении поверхности клеток в популяции при входе клеток в репродуктивный цикл.

5. Исследование р'оста популяции дрожжей при различных концентрациях иона MgIt в среде как дпвалентного катиона, модифицирующего наружнюго мембрану клеток. -

Научная новизна работы:'

С помощью модифицированного спектротурбидиметрнческого метода показана соотносимая с этапами клеточного-цикла закономерность гетерогенного распределения популяции дрожжей Candida maltosa по размерам и количеству клеток в каждой субпопуляцин. ;

Впервые , с помощью циклических температурных колебаний определена минимальная протяженность клеточного цикла для дрожжей Candida; maltosa. Показан искусственно индуцированный разрыв между минимальной протяженностью клеточного цикла и временем, необходимым для накоплением стартовой массы клетки для входа в клеточный цикл при выСраниом в ходе экспериментов режиме колебаний.

Впервые показано резкое изменение надмолекулярной структуры поверхности при входе клеток культуры Candida maltosa в клеточный никл. С гтомошыо им» унохнмннеского исследования показано наличие сдвигов в пространственной ориентации участкоп клеточной поверхности при неизменности качественного состава.. Эф-

фект согласуется с продемонстрированной кооперативной сорбцией ионов магния на поверхности в этот момент.

Научио-мрактпческая -значимость работы: Решение задачи определение параметров клеточного цикла для микроорганизмов данного вида и его минимальной протяженности прежде всего может иметь значение для стандартного ускоренного наращивания биомассы микроорганизмов, синхронизированной по фазам клеточного никла, что может быть связано с получением посевного материала высокого качества и с исследованиями в облает» понуляцноннои экологии смешанных культур.

Исследования взаимосвязанных изменений клеточной поверхности н стартовых событий клеточного цикла является предпосылкой для исследований реценторно-каскадного распространения волны сигнального возмущения по шгоскелсчу дроаглен p. Candid».

Публикации: По материалам диссертации опубликованы 3 работы.

Апробация работы: Результаты ."иссертацнонной работы были доложены па Всероссийской научной конференции' "Химия н технология лекарственных веществ" (С.-Петербург, 1994), па семинаре в Национальном Ппотехнологнческом центре Германии в рамках международной программы повышения квалификации по биотехнологии (Braunschwieg, Germany, 1995).

Структура я объем диссертации: Диссертация изложена на 131jCTpainmax и состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 126 источников, из них 63 на русском языке. Работа содержит 23 рисунка н 4 таблицы.

Положения, которые выносятся на защиту :

1. Для культуры Candida maltosa существует оптимальный режим циклических температурных колебаний, состоящий из 25-минутного интервала воздействия оптимальной ростовой темпера-

режим приводит к стимулированному • прохождению точки старта неточного цикла н к сокращению естественной для данных условий протяженности клеточного цикла.

2. Существование для каждого вида микроорганизмов Минимальной протяженности клеточного , цикла. Для дрожжей Candida maltosa она составила 50 ±5 минут. Она складывается ni'малоизменяемых нлн-неизменяемых, протяженностей S-, Oj-, М-фазы, послестартовок части Gi-фазы клеточного цикла п минимальной достартовой части Gj-фазы.

3. В раинелогар.нфмическон, фа?е: развития популяции дрожжей Candida maltosa и'в первой трети стационарной фазы выделяются, две фрак^нн компонентов, клеточной поверхности. Их количестйетгое соотношение практически не ме.жггся при абсолютном: росте, а иммуноген-иость определена их пространственной ориентацией, которая резко меняется при «ходе в клеточный цикл. ' " : : > • V-

2. Материалы н мп оды. • 2.1. Синхронизация фаз клеточного цикла и культнпчропапис в условиях циклических температурных колеиаПнй.

Для получения исходного, материала в стандартом активном физиологическом состоянии для иммунизации, изучения клеточного цикла и возможностей метода, циклических температурных колебаний проводились разноцелевое; периодическое культивирование на глюкозе, на границе трехфакторного субстратного лимитирования (Позмогова И.Н., Звягнльская Р.А., 1989). fi экспериментах, связанных с изучением шоковых воздействий низких концентраций иона MgJ> использовалась следующая методика его определения (Практикум по биохимии, по ред. Северина С.Е., Соловьевой Е.Г., 1989); К 1 мл пробы, содержащей до 0,3 мкмоль Mg2' добавляют 2 мл метчловога спирта, 2,5 мл 1 М аммиачного буфера н 0,4 мл 0,1% раствора эрчохрома черного Т в метиловом спирте. Объем доводят до 10 мл аммиачным буфером (рН 9,5), Измеряя длину волны максимального поглощения, определяют количество MgJf против

раствора, не, содержащего .магния. . Определение .неорганического фосфата проводилось по методу Бенцини. Общий состав среды культивирования, включая режимы циклических температурных колебаний, приведен в Табл. 1.

. , Таблица 1

Состав среды культивирования

Макроэлементы Концентрация г/л Микроэлементы Концентрация г/л

V : :/ 0,081 Са2' не менее 0,002

Р043" 0,32 : МоО/". 0,0002

'•. ■ к" 0,75 > . 2н2, .. 0,082

цнтрат натрия 0,11 (цитрат) ГейО^ х 71ЬО 1,39

глюкоза 10,0 МпБО., х 5Н20 0,609

МИ/ 0,25 СиЗОл х 5И:0 0,062 ;

сг 0,65 Со$04 х 7Н20 0,141

рН 5,3-5,4 Н.,ВО, 0,016

АЫБОЛ х 18Н20 0,1

ЬЙ х 2Н:0 од

Накопление клеточной массы для иммунохнмического исследования, проводилось на стенде лабораторного бяореактора при системе комроля и поддержания оборотов мещалки, парциального давления кислорода и рН. Для исследований температурных колебаний биореактор не годился из-за присутствия пеиы, большой инерционности тепло- и массообмена. Опыты вели в лабораторной установке, позволяющей осуществить культивирование в малых объемах со скачкообразной сменой температуры. Установка состояла из двух водяных термостатов и встряхивающего устройства; Культивирование осуществлялось в пробирках объемом 55 мл, которые были собраны в пакеты по 6 штук и помещались-в специально изготовленных блоках-штативах, снабженных внброгасящими прокладками. Культура дрожжей, выросшая в тсчьине 20 часов в кача-

лочной колбе при 25° С засевалась в них аликвотно и стерильио. Для снижения гидравлическогс сопротивления воздухообмену использовались облегченные ватно-марлевые пробки. Рабочий,объем среды культивирования составлял 10 мл. Начальное количество клеток калибровалось по оптической плотности и оставалось внутри порядка Ю4 кл/мл. Расположение пробирок под углом к горизонту при 2-3 колебаниях в секунду обеспечивало циклическое, движение жидкости п вертикальной плоскости. Проводилась михродозацид' убывающих компонентов среды. Контролировались следующие параметры: рН, концентрация глюкозы, концентрация фосфат-ионов, концентрация аммонийного азота, число клеток в 1 мл, визуально регистрировалась морфология'клеток. Закпслепне среды регулировали микродобавками ТРИС-буфера.

2.2. Расчет числа й средних размеряй дрожжевых клеток.

Для количественной и качественной характеристики распределения клеток дрожжей в популяции был применен спектротур-биднметрнческнй метод (СТМ-метод), основанный на определении спектра мутности суспензии микроорганизмов в широком диапазоне длин волн. Метод был разработан В 70-х годах коллективом "авторов и применялся для изучения дисперсных систем (Хлебцов Н.Г., Кле-11Ш1 В.И., Френкель С.Я., Щеголеа С.Ю. и др., 1977-1984). Метод был также опробован на суспензиях микроорганизмов н дал хорошие результаты (Дмитриева Т.О.. Клешш Б.И., Ефимов С.В. Кур-маева А.И. и др., 1984-1389).

В начале исследования было произведено уточнение "возможностей метода применительно к дрожжевой суспензии. По данным микроскопирова.шя было выбрано МО образцов растущей культуры с различной долей крупных клеток в популяции. Крупными клетками считались клетки " линейным размером, определенным морфометрнческим способом с помощью окулярного микрометра, соответствующим клетке с почкой в различных фазах почкования (Иванов В.Н., Седина С.А., 1985) (Рис. 1).

0,50 0,40 .0,30 .0.20 0.1 о

0,00

: .. .

- ;

0,00 0,10 0,20 С.30 0,40. 0.50 0,60

30,0 25,0 20,0 15.0 10.0 5.0 0.0

,0 10,0 15.0 20,0 25,0 3>.|()5

Рис.1.'Сравнительная калибровка по доле крупных клеток в популяция (А) и по количеству клеток в ¿азОавленных культурах (Н) для СТМ-метода (оси о£3"инат) и метода счетной камеры (оси абсцисс). На диаграмме А"по осям отложена доля крупных клеток к,общему количеству клеток популяции. Ка'диаграмме Б - натуральное число клеток в 1мл культу-оальной жидкости.

Образны подверглись спектрофотометрированшо и по спектру мутности также были определены доли крупных клеток в образцах. Доля крупных клеток, определенных СТМ-мстодой соответствовала определяемой микроскопированием суммарной доле всех крупных клеток и клеток в различных фазах почкования и отвечала расчетным значениям от 3 до 6 мкм.

Количество клеток в образцах также удовлетворяло условиям линейной калибровки по счетной камере Горяева и по методу высева на плотной среде, однако потребовалось введение дополнительного коэффициента пропорциональности. Также были уточнены границы работоспособности метода. В частности, выяснилось, что _ метод, не .работает вблизи нуля, при концентрациях клеток ниже 56105 в мл.

• 2.3. ГЬ'муцохимнческое определение.

Для определения качественного состава поверхности клеток ис-. пользовались иммунохимнческие методы, Дтя приготовления вакцин с целью получения антитслосодержащих сывороток и аитиге-ной, необходимых в иммуноферментном анализе (ИФА-аналше), были отобраны образцы культуры в двух точках кривой роста»

-Ii-

Число клеток ь 1 мл среды культивирования определялось с помощью камеры Горяева-Тома с почасовыми интервалами. Максимуму удельной скорости роста культуры около 0,7 ч*1 соответствует пролиферахивиьш пул клеток, содержащий свыше п0% всех клеток популяции, так как при этом происходило удвоение числа клеток популяции в течение олного часа. Для иммунизации'мышей, были взяты фракции в раннелоЬзрифмической и в первой трети стационарной фазы развития популяции.. Исследования проводились с помощью перекрестного по сэндвич-методу сконыогатом с пероксида-зой (кроличьц-антимышнные антитела). Обозначенные буквами разведения сывороток на оси Y приведены в Табл. 2. Для вакцинации приготовлялцельноклеточныи антиген (Chardes Т., Piechaczyk М., Cavalille S., 1986), Растворимый антиген для ингибированного ИФА-аиализа приготовлялся горячен солевой экстракцией (Brauner D., Culler J. 1984). Стандартизация концентрации антигенов проводилась фотометрирова'ннем при 235 и 280 пм. Сыворотки животных из каждой группы объединялись но близким титрам.

' г

Таблица 2

Расположение разведений сывороток п планшетах иммуноферментного анализа

Позиции А В С D Б • • F G Н

Разведения 1:10 • 1:50 1:150 1:450 1:1350 1:4050 1:12150 1:36450

3'. Результаты иммунохимического определения Как показывают результаты, исходные йакшшы отличались по иммуногенности, а следовательно, и по исходному фенотипу антигенного состава, так как ннтеиспйность реакции гомологичных антигенов и сывороток различается между собой в Зраза (Рнс.2).

Реакцнопноспособность одной л ¡той же сыворотки на разных ► антигенах отличается в трй раза. В частности, антйтеяа обнаруживают в рапиелогарифмическои фазе роста Культуры две ярко выраженные, сильнонммуиогеииие группы антигенных детерминант,

разлнчающпеся между со,бой отношением концентрации антител к их аффинности (сродства к И мм у 11 од етер м и нан та м). •

С 0 , Е рИ 1 Рамедення

Рис. 2. Титрование ецйоромк :Х грущда (в,аер?су) ,и XI второй группы сывороток ыа антййеце четадаоварной- .(1)..и "на. ранн&ло-гарифмической (2) фазраз.&йта.Я культуру. Разделение аффинности антител скворо^рк-. У^^уилы./ . л

Оба антигена представлены смесью бслко», с которых .выделяются две главных составляющих, так как в иммунодцффузионном тесте о агаре по Оухтерлонн антитела нерпой группы сывороток обнаруживают в обоих антигенах только две ярких линии преципитации.

Для определения лабильности структура антигена был применен так называемый ингнбпрованный.'анализ (Рнс.З). Перекрестная реакция в эгом анализе подавляется предварительным истощением

сыворотки добавлейпем одного из антигенов. Антиген для этой цели используется в растворенном' виде, а оставшиеся после этой реакции антитела сыворотки реагируют с сорбированным антигеном- на планшете.- , "

Рис. 3. Поверхность отклика, иитёнсшшостйг цйатиой реакции (на осп 7, нанесены минимальное и максимальное значения) перекрестной реакции с предварительным нкгибпрЪванйем. Сверху - реагирование атШЛей сывороток I группы, снизу - II. Слева - изометрические проекций рисунка поверхностей с наклонам 35". Справа - фронтальные проекции. • Разведения сшороток-отлажены иаосн V согласно буквенных обозначений (Табл.2). 1То оси X отложены разведения инщбпрующего антигена в прШумеровЗМом порядке: I; 1/3,1/9,1/27, 1/81,1/243,

По характеру реагирования антител первой группы можно сказать, что растворенная форма антигена стационарной фазы ими проигнорирована почти полностью. Это также указывает на то, что антиген является смссыо мембранных белков, сильно меняющих структуру в растворе и в значительной степени восстанавливающих ее при сорбции на гидрофобном полимере (активированный полистирол планшетов).

-144. Особенности динамики концентрации попов Wg"+ в среде при пролиферации клеток.

Изучали динамику ионов магния в среде после Сшкронизирующе-го воздействия цизкой температуры при периодическом культивировании С. maltosa (Рис. 4). При концентрации ионов, магния в среде ниже 50 ыг/д рост клеток практически отсутствует. С увеличением концентрации свыше . 6.0 ыг/я величина синхронного скачка численности клеток начинает пропорционально расти и при 80 мг/мд достигает своего максимума.

- 4

- 3

- 2 - 1

4

- 3

1,2

Рис. 4, Динамика концентрации'ионов, маг в среде в зависимости от роста культуры, Заштрихованный праноугольник -период низкой температуры, ■ /1,2, 3,4 по порядку исходные концентрации ионов." магния:20, .40, 60, -60 мг/л.

Индекс синхронизации; рассчитанный при максимальном скачке составил 0,8 (üacim ^n H.A., 1992). От начала и до конца скачка численности микрооргаш.нюв наблюдается пропорциональное снижение концентра-

90 . 80 ; -5 70,

S 60 ¡¡с——sr ~ 50

40 р-к-

& 3.0

20 Ö-r-röh

ю Г- i

13-*105

1 no

я fS 90

S 70

Í2

o 50

ÍJ

% 30

10

а-о-

—1-

ТГФ- . '"-й-

на-

-а--4-

-й-

J0 20 30 40 50 60 Время, MHiyrbi ;■'

70

7

zH

-b

-и-

-h

10 20 30 40 SO 60 70 Время, ммугы

Y.

-ü

90.

90

шш ионов мшшя и среде культивирования. Это отражало бы у,нет обыкновенного субстратного лимитирования, если бы не последующее освобождение ионов с возвратом к исходной концентрации сразу же после пролифсратпвнои вснмшкн. Эффект яегамстек в несинхронно растущей культуре, так как в этом случае наблюдается равномерное снижение содержания свободных понов магния. Отдельная клетка, вступая в клеточный цикл, потребляет магнии из среды в количестве, необходимом для определенной структуризации мембраны, а закончив почкование, "отдаст" магний обратно. Поскольку общая картина складывается из миллиардов таких единичных событии, то концентрация ионов магния просто разномерно и незначительно снижается в лепфнф5!н"ссквй фазе ртета, возвращаясь к исходной в стаппопарисй фазе.

"■>. ргепрезелгнпл дчяейнм* размеров клетогг

п лнела илгток мри росте на фане шкглпчгскнх тпик*рпт"|шых ¡колебаний.

Шуши распределение клеток культуры С. такова г» режимах циклических температурных колебании. С помощмо этого метода пока-заиалю «ложность искусственно стимулированного прохождения клеткой точки сгартя в фазе в), приводящего к несовпадению минимального времени, необходимого для накопления стартовой массы клетки для входа в клеточный цикл и минимальной протяженности клеточного цикла для дрожжей С. таИ'оБа (Рис.5). Из-за этого в холе последовательных сокращенных во времени генераций наблюдается надеине среднего размера клеток, так как пул пролифернрующих ¡слеток формируется на основе клеток с размерами, достаточными для прохождения точки старта и удельная скорость роста культуры пропорциональна его величине. Это ведет к "вымыванию" из популяции крупных клеток в ходе последовательных непрерывных генераций, стимулированных ЦТ1С. Максимальный расчетный размер,¡снеток быстро снижается до порога 3 мкм. Максимум удельной скорости роста популяции в опытах с таким режимом составил 1,2 ±0,2 ч'1.

мкм Средний линейный размер субпопулящш крупных клетик

Lg(N) Лремя, минуты Доля

крупных клеток

Рис.5 Оптимальный режим - циклических температурных колебаний. При сочетании 25 минут оптимальной ростовой температуры (32° С) и 23. минут низкой <16° С) температуры.. Вв.ерху: изменение среднего линейного размера пула крупных клеток. Внизу: соотношение логарифма общего количества клеток XI) и доля.-крупных клеток.а;гпопуляции-.по отношению к общему количеству (2). Заштрихованные, зоны внутри -пунктирных -линий отображают периоды оптимальной температуры.' .

Наблюдается.возрастающая синхронизация пула пролиферпруга-щих клеток в последовательных циклах. Величина пула крупных клеток и каждый момент времени жестко связана с последующим приростом клеток в популяции. На это указывает и тенденция изменения числа мелких клеток (Тис.б).

Уменьшение среднего радиуса субпопуляции крупных клеток при низкой температуре мдег одновременно с уменьшением числа крупных

клеток отноагтедьно предыдущего периода оптимальной температурь!, а это может быть связано с особенностью почкующихся дрожжей.

Рис. 6. Сравнительная характеристика параметров растущей популяции С. maltosa под воздействием циклических температурных колебаний: 40 минут холода и 15 минут оптимальной температуры. Зоны внутри пунктирных линий -:периоды оптимальной температуры. 1- логарифм натурального количества клеток/ 2,3-доли суОпоиулпций крупных м- мелких клеток соответственно, 4,5-средний линейный размер субпопуляций мелких и крупных клеток соответственно.

По данным ряда авторов (Иванов D.H., Пнндруе A.A., 1989) массовое отщепление почки (поздняя фаза М) невозможно при температуре ниже 23° С. по если отщепление уже произошло до периода холода, го клетка способна с низкой скоростью накапливать массу.

Примененная низкая температура ограничивает лишь процессы синтеза ДНК, но не препятствует завершению уже начатых остальных стадии клеточного цшла. На это указывает и дна1рамма отображающая динамику изменения числа наиболее мелких клеток (Рис.б). Во время периодов низкой температуры их число уменьшается за счет того, что часть из них становятся крупными. Видно также, что этот режим резко отличается от возможных циклических* периодов естественной при данных условиях культивирования протяженности клеточного цикла С. maltosa. В какой-то мере клетки компенсируют это изменением протяженности отдельных фаз, особенно фазы G|. Это приводит к инверсии периода пролиферации и нарастания массы клетки относительно периода оптимальной температуры в данном режиме. Между периодами инверсии имеет место пропуск полуволны размножения клеток культуры (Рис.б).

Общая диаграмма серии опытов по определению минимальной протяженности клеточного цикла С.maltosa приведена на Рис.7.

Рис.7. Поверхность отклика удельной скорости роста (иертнл-альная ось) в режимах циклических температурных колебании. Ось X - протяженность периода оптимальной температуры, сч.ь У - период холода.

Наблгодается ярко выраженный максимум при 25-минутном ле-риоде тепла и 25-минутном периоде холода. Средняя удельная скорость роста во всех режимах ЦТК, кроме отображенного на Рис.5, оказалась ниже, чем у контрольной, свободнорастущей культуры.

Выводы

1. Выбран и модифицирован спектротурбидиметрический метод для характеристики распределения клеток популяции дрожжей Candida maltosa по размерам. Уточнены границы применимости метода на культуре дрожжевых клеток. Показана однозначная связь между пулом крупных клеток и последующей удельной скоростью роста культуры.

2. Исследования циклических температурных колебаний, примененных при культивировании Candida maltosa позволили заключить, что при 25-минутном периоде воздействия оптимальной температуры (32° С) и 25-минутном периоде воздействия низкой температуры (16° С) популяция синхронизируется-по фазам клеточного цикла, протяженность Gj-фазы клеточного цикла минимальна и приводит к минимальной протяженности клеточного цикла составившей 50±5 минут при

№ max 1,2 ±0,2 ч-1.

3. Минимальная протяженность клеточного цикла для дрожжей Candida maltosa оказалась меньше времени, необходимого для накопления массы (размера) клетки, разрешающего вступление в клеточный цикл. Это приводит к переходу клеток культуры в латентную фазу. Прохождение стартовой точки обуславливается размером клетки 3 мкм. Размер наиболее крупных индивидуальных клеток дрожжей р. Candida составляет не более 6 мкм.

4. Иммунохимические исследования антигенного ландшафта поверхности клеток дрожжей С. maltosa показали, что свойства поверхности резко меняются при входе клеток в клеточный цикл, количество антигенных эпитопов в стационарной фаз,* пропорционально увеличивается в 3 раза по отношению к раннелогарифмической и часть антигенных

эпитопов, составляющая около 40% от общего определяемого количества топономически закрывается

5. Изучение роста популяцн" дрожжей при различных концентрациях иона M g2 .в среде показало, что при концентрации ниже бОмг/л роста нет и это не связано с субстратным лимитированием, но связано с модификацией клеточной поверхност" вследствие сорбции на ней ионов магния в логарифмической фазе роста. Сорбция обратима по отношению к латентной фазе клеточного цикла.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рабинович Ю.С., Самойлович М.П., Яковлев В.И. Йммунохи-мическое исследование клеточной популяции Candida maltosa на различных стадиях ее развития // Всероссийская науч. конф. "Химия и технология лекарственных веществ": Тез. докл. - С.-Петербург: СХФТИ, 1994. - С.28.-- ,

2. Transient process kinetics of microorganisms / P. Ganin, A. Push-karev, V. Kryvoshlyk, V. Galynkin, Y. Rabinovicti, 1. Mindukshev // International conference "Biotechnology St. Petersburg'94": Abstr. - St.Petersburg, 1994. - P. 148.,.;

3. High cell density cultivation of recombinant E. coli and the production of Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and Platelet-derived Growth Facior (PDGF) / U. Rinas, K. Hellmuth, R. Bannerjee, N. Goonesekere, Y. Rabinovich, J.R.Talou. II Internationa! Training Programme in Biotechnology: The Reports. - Braunschwieg: Germany, 1995. - P. 134-145.

8.I2.P7 Зпк 180-70 P".. Ил U.L/.jio-:,'лскс<гск:г: пр. ,26