Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новой препаративной формы биологических фунгицидов на основе клеток микроорганизмов Trichoderma viride и Pseudomonas fluorescens

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка новой препаративной формы биологических фунгицидов на основе клеток микроорганизмов Trichoderma viride и Pseudomonas fluorescens"



На правах рукописи

Чекалова Ксения Владимировна

РАЗРАБОТКА НОВОЙ ПРЕПАРАТИВНОЙ ФОРМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФУНГИЦИДОВ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ TRICHODERMA VIRIDE И PSEUDOMONAS

FLUORESCENS

03. 00. 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003054449

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Инженерного Экологического факультета Российского химико - технологического университета им. Д.И. Менделеева

Научный руководитель: кандидат технических наук,

доцент

Николай Семенович

Марквичёв

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Логинов Олег Николаевич

кандидат биологических наук Донова Марина Викторовна

Ведущая организация: МГУ имени

Ломоносова Биологический факультет кафедра микробиологии

Защита состоится « » февраля 2007 г в часов на заседании

диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом Университете имени Д.И. Менделеева (125047 Москва, Миусская пл-дь, д.9) в ауд.

Ж .

С диссертацией можно ознакомиться в информационно-научном центре РХТУ им. Д. И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан « Ж' » января 2007

г.

Ученый секретарь диссертационного совета Шакир И.В.

ДМ 212.204.13

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Интенсивное развитие технологий защищенного грунта подразумевает применение биологического метода защиты растений для улучшения экологической обстановки и снижения пестицидной нагрузки.

Большинство препаративных форм биологических препаратов на основе полезных микроорганизмов для борьбы с патогенными представляют собой споровые формы или вегетативные клетки. Также препаративные формы обладают рядом общих недостатков, а именно: коротким сроком хранения клеток, крайне низкой приживаемостью в реальных экосистемах, неустойчивостью к физико-химическим взаимодействиям. Эти недостатки ведут к снижению эффективности биологических препаратов на основе микроорганизмов. Разработка новых препаративных форм, которые лишены данных недостатков, является актуальной задачей современной биотехнологии. Цели и задачи исследования. Целью исследования явилась разработка новой препаративной формы биологических фунгицидов на основе клеток гриба Trichoderma viride и бактерии Pseudomonas fluorescens. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

в Разработать принципиально новый метод иммобилизации клеток исследуемых микроорганизмов в Са-альгинатном геле и специально подобранного для их метаболизма субстрата;

• Исследовать динамику роста клеток из разработанной иммобилизованной системы;

• Подобрать высокомолекулярный субстрат для его совместной иммобилизации с микроорганизмами и исследовать влияние концентрации этого субстрата на свойства иммобилизованной системы;

• Изучить влияние фазы развития микроорганизмов и их концентрации на кинетические характеристики роста клеток;

• Исследовать влияние концентрации альгината натрия на свойства иммобилизованной системы клеток с субстратом;

• Изучить сохранение клетками своих фунгицидных свойств при совместной иммобилизации с субстратом;

• Изучить фитотоксические свойства иммобилизованной системы в лабораторных условиях для возможности её применения в производственных условиях в качестве новой препаративной формы средств защиты растений.

Научная новизна. Впервые реализована одновременная иммобилизация клеток грибных, либо бактериальных культур со специально подобранными для них субстратами в Са-альгинатных гранулах. Показаны общие закономерности для роста грибных и бактериальных клеток из иммобилизованной системы. Показано, что рост клеток внутри гранулы и выход на её поверхность, а также колонизация объёма вокруг гранулы обеспечивается метаболизмом субстрата иммобилизованного в грануле. Показано, что на кинетику роста клеток вокруг гранулы оказывает влияние начальная концентрация субстрата и практически не влияют начальная концентрация клеток и их физиологическое состояние. Показано, что клетки, иммобилизованные вместе с субстратом, являются более стабильными при хранении, чем свободные вегетативные клетки. Иммобилизованная система обеспечивает устойчивость клеток к внешним воздействиям за счёт диффузионных ограничений, возникающих на границе раздела фаз, и в то же время минимальные остаточные концентрации клеток позволяют им как расти в объёме гранулы, так и колонизировать поверхность, а также продолжать рост вокруг гранулы, находясь в свободном состоянии. Практическая значимость. Показано, что клетки в иммобилизованной системе не теряют своих фунгицидных свойств по отношению к тест-объектам. Иммобилизованная система в качестве препаративной формы не вызывает фитотоксичности у растений. При исследовании в производственных условиях новых препаративных форм на основе ТМпс1е и Р. Аиогезсет было показано снижение уровня встречаемости патогенных микроорганизмов по сравнению с контролем, а также снижение количества выпадов. Испытания показали, что

новые препаративные формы встраиваются в систему защитных мероприятий, проводимых в условиях защищенного грунта за исключением тех случаев, когда используется система капельного полива. Высокая эффективность иммобилизованной препаративной формы по сравнению с ранее используемыми формами обусловлена более длительным сроком хранения, высоким уровнем адаптивности и конкурентоспособности клеток в почвенных экосистемах, а также большей устойчивостью к воздействиям внешних факторов. Разработанная препаративная форма находят всё более широкое применение в условиях защищенного грунта.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на международной научно-практической конференции «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов антагонистов и применения их в закрытом и открытом грунте» (20-22 сентября 2006г, ВНИИБЗР, г.Краснодар); на II специализированной выставке «Защищенный грунт России» (30 августа -02 сентября 2005г, Москва); на семинаре-выставке селекционно-семеноводческой фирмы «Гавриш» «Защита растений в теплицах» (22-25 мая 2006г, Москва); на семинаре-выставке селекционно-семеноводческой фирмы «Гавриш» «Агрохимическое обслуживание в защищенном грунте» (27-30 марта 2006, Москва); на выставке «Инновации-2005» (01-05 декабря 2005, Тель-Авив, Израиль).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ, в том числе 6 статей.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждений, заключения,

выводов и списка литературы, а также приложения. Работа изложена на_

страницах машинописного текста, включает_рисунков и_таблиц. Список

литературы включает_наименований, в том числе_иностранных работ.

Материалы и методы: В работе были использованы микроорганизмы Trichoderma viride штамм Pers ex S F Gray №501, выделен из почв Тепличного комбината ЗАО "Агрофирма НИВА" в 2004 году и предоставленный Борисовым Б.А. из коллекции ЗАО «Росагросервис» и Pseudomonas fluorescens Migula 1895 В 954 - ВКМ В-561, полученный из природных источников и предоставленный Всероссийском коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ). В качестве тест-объекта на антагонистическую активность использовали микроорганизм-возбудитель фузариоза Fusarium oxysporum, выделенный из огурцов, больных фузариозным увяданием, и предоставленный Борисовым Б.А.

Результаты работы и их обсуждения:

1. Разработка новой иммобилизованной системы «иолисахаридная матрица -клетки - субстрат». Сохранение свойств биологических форм препаратов является определяющим фактором при их использовании в технологиях защищенного грунта. Одним из способов повышения стабильности культуры при хранении является иммобилизация клеток, в частности, включением их в полисахаридные матрицы различной природы. Клетки исследуемых микроорганизмов были иммобилизованы в Са-альгинатных гранулах, и полученные гранулы были заложены на хранение в физиологическом растворе, а также в специально подобранных консервирующих растворах, содержащих разные концентрации глицерина. Эксперименты по определению срока хранения показали, что концентрация клеток внутри гранул снижается, однако, это падение концентрации было существенно ниже, чем для свободных вегетативных клеток, находящихся в аналогичных условиях. Гранулы с иммобилизованными клетками были исследованы на проявление антагонистической активности при использовании в качестве тест-объекта культуры F.oxysporum. При помещении иммобилизованных клеток на богатые агаризованные среды вокруг гранул начинался рост и образовывались колонии, характерные для данных микроорганизмов. Показано, что клетки, выходящие

из гранул и образующие вокруг них колонии, не теряли своих антагонистических свойств, как на агаризованных искусственных средах, так и на средах па основе торфа. Выдвинуто предположение, что рост клеток внутри гранул и их вь:ход из гранул обусловлен несколькими факторами: метаболизмом компонентов питания, находящихся вне гранулы, метаболизмом остатков питательной среды и/или продуктов частичного разрушения клеток в самой грануле, а также частичным разрушением самой гранулы. Для увеличения скорости выхода клеток из гранул и увеличения их концентрации вокруг гранул был разработан и исследован метод одновременной иммобилизации микроорганизмов и субстрата. В качестве субстратов были выбраны крахмал для грибной культуры Тлчпс/е и желатин для бактериальных клеток РАиогезсепз. Из литературных источников н наших исследований известно, что взятые микроорганизмы способны к метаболизму выбранных субстратов. Важным условием для проведения совместной иммобилизации являлось отсутствие диффузии выбранного субстрата из Гранулы в водные растворы. Са-альгинатные гранулы (средний диаметр 2мм) были получены путём добавления но каплям смеси 2% раствора альгината натрия с 0,5% желатином, либо крахмалом в 2% раствор хлорида кальция

время. часы

Рис.1. Изменение концентрации субстратов при диффузии из гранул и водных растворах: (А) - крахмал; (Б) - желатин.

Далее была изучена диффузия этих субстратов из гранул в водные растворы. При этом накопление субстратов в водных растворах определяли методом Лоури в случае желатина и эбулиостатическим методом в случае крахмала. На рисунке 1 показаны изменения концентраций субстратов в водных растворах при диффузии из гранул. Расчёты, произведённые на основе материального баланса, показали, что из гранул диффундирует не более 10 и 5% крахмала и желатина соответственно.

На основании результатов были получены два препарата иммобилизованных клеток с субстратами. Клетки смешивали с 2% раствором альгината натрия и 0,5% раствором крахмала, в случае Т.\nride, либо 0,5% желатина в случае Р./!иогезсеп$ и добавляли по каплям в 2% раствор СаС12 для получения гранул. Гранулы отмывали от раствора СаС12 И хранили в физиологическом растворе (далее физ.р-р).

Полученные гранулы были использованы для исследования роста колоний вокруг них на голодных и богатых агаризоВанных средах, на покровньдх стеклах во влажной камере и на торфах. В качестве контроля одновременно исследовали рост колоний вокруг гранул, не содержащих субстрата и рост из суспензии соответствующих микроорганизмов, В ходе экспериментов через определенные интервалы времени фиксировали размер образовавшихся колоний.

Рис.2. Изменение площадей колоний вокруг гранул с иммобилизованными клетками Т.\4ride с крахмалим и без него: (А)- на стекле; (Б) - на торфе.

Рнс.З. Изменение площадей колоний вокруг гранул с иммобилизованными клетками P.ßuorescem С желатином и без него: (Л) - на стекле; (Ь) - на Торфе.

На рисунках 2,3 показаны изменения площадей колоний вокруг гранул с субстратом, гранул без него, на торфе и покровном стекле. Как видно нз рисунков 2.3 вокруг гранул с субстратом увеличение площади колонии происходит интенсивнее, чем вокруг гранул не содержащих субстрата. Важно отметить, что увеличение площади колонии для гранул с субстратом описывается характерной S-образной кривой, в то время как в остальных вариантах оно подчиняется линейному закону. Следовательно, клетки способны к метаболизму субстрата, локализованного внутри гранулы. Наличие S-образной формы роста колоний вокруг гранул с субстратом позволило рассчитать удельную скорость роста колонии по изменению площади. Увеличение удельной скорое™ можно объяснить только наличием дополнительного субстрата внутри гранулы. Увеличение площади колоний в течение периода времени, описываемого S-образной кривой, происходило сначала за счёт субстратного мицелия, развивающегося радиалЬНо от точки роста - гранулы и быстро проникающего в предварительно увлажнённые комочки торфа. На начальном периоде роста субстратный ветвящийся мицелий на поверхность не поднимается. Далее на поверхность среды прорастает воздушный мицелии. Через некоторое время начинают формироваться конпдисносцы, образуя сплошной грибной газон.

Тест с использованием F.oxysporum показал, что клетки P.fluorescens и T.viride, выросшие вокруг гранул, не теряют характерных для них фунгицидных свойств.

Полученные образцы были заложены на хранение. В течение года с интервалом в два месяца отбирали пробы и анализировали антагонистическую активность. Снижения антагонистической активности в исследуемых образцах не наблюдалось.

Таким образом, был разработан новый способ включения клеток в Са-альгинатный гель с одновременной иммобилизацией с субстратом (иммобилизованная система), методологически отличающийся от прочих стандартных иммобилизованных систем тем, что основной задачей было обеспечение не удержания, а выхода клеток в свободное состояние с максимальной скоростью и максимальной степенью колонизации и образования колонии при сохранении стабильности культуры. 2. Изучение свойств иммобилизованной системы «полимерная матрица -клетки — субстрат». Дальнейшие эксперименты были направлены на изучение свойств новой иммобилизованной системы. Скорость роста клеток при глубинном культивировании (культивирование в объёме Са-альгинатной гранулы можно считать таковым) зависит от начальной или/и текущей концентрации субстрата. Исследования по влиянию начальных концентраций субстратов, иммобилизованных в Са-альгинатном геле, на кинетические и физиологические характеристики роста клеток из гранулы, проводили с гранулами, содержащими различные начальные концентрации субстрата, при постоянстве всех остальных параметров. Концентрация вносимого в альгинат натрия субстрата варьировалась от 0 до 2% (вес.). Максимальные концентрации субстрата ограничивались изменением реологических свойств системы -увеличением вязкости смеси субстрата и альгината натрия. Гранулы помещали на чашки Петри на фиксированное количество стерильного торфа и анализировали рост колоний вокруг гранул. При этом торф моделировал

реальную почвенную экосистему. Во всех случаях, за исключением роста колоний вокруг гранул, не содержащих субстрат, увеличение площадей колоний описывалось стандартной кривой 5-обратной формы, что позволило рассчитать удельную скорость роста (колонизации). На рисунке 4 представлены значения удельной скорости колонизации торфа в зависимости от начальной концентрации субстрата .тля клеток ТлчгШе и Р. /1иогезсеп$.

» (и й.6 1 Ц1 | с: и,4 е.о <|.я | и

КЛЧНЛЬНЫ КвПИСЩрЯШЕЯ кряХМЯЛЯ Н грЯНуЛЯК, % Я1ЧКШ1М копнет раним желЯГЛШЯ В I |)Л11У. %

Рисунок 4: Удельная скорость роста (колонизации) торфа нри различных начальных концентрациях субстратов и грануле: (А) — Т.\тш1е И крахмал; (Б) - Р.Пиогекееня н желатин.

Как видно из рисунка 4, увеличение концентрации субстратов от 0 до 0,1% (пес.) приводило к увеличению удельной скорости роста. Дальнейшее увеличение концентрации субстрата не влияло на скорость увеличения площадей колоний. Удельная скорость роста колонии (скорость колонизации торфа) составила 0,75-0,77 сутки"1 для Т.утек и 0,43-0,45 сутки"1 для Р.РиогШсеш. Максимальная площадь колонизации, безусловно, зависит от начальной концентрации субстрата в грануле. В варианте с ТМгШе максимальную площадь колонизации в зависимости от начальной концентрации субстрата достоверно определить в лабораторных условиях не удалось. В экспериментах с Р.Аиогезсепз была достигнута одинаковая максимальная площадь колонизации для всех исследуемых образцов и она составила 38-40смг при размере гранулы 2мм и высоте слоя торфа 2мм.

На свойства иммобилизованной системы может оказывать влияние начальная концентрация клеток, внесённых на стадии иммобилизации, и их физиологическое состояние. В раствор альгината натрия вместе с субстратом вносили разные концентрации клеток, взятых в середине экспоненциальной фазы роста, и проводили иммобилизацию. Все остальные параметры фиксировались на постоянном уровне: содержание альгината 1%, крахмала или желатина по 0,5%. Полученные гранулы помещали в центр чашек Петри с торфом и исследовали кинетику образования колоний. Анализ результатов экспериментов показал, что увеличение начальной концентрации клеток Т.утс1е приводит к сокращению времени выхода клеток на поверхность гранулы с 3,5 суток (при начальной концентрации 0,1% по абсолютно сухому весу) до 2 суток (при 2% по абсолютно сухому весу). Для Р./1иоге.чсепз скорость колонизации торфов и максимальная степень колонизации не зависели от начальной концентрации клеток и во всех экспериментах были приблизительно одинаковы. Таким образом, было показано, что начальная концентрация клеток, локализованных внутри гранул, определяла лишь время начала колонизации, то есть время начала выхода клеток с поверхности гранул.

Для клеток гриба Т.ушс1е исследовали влияние стадии развития мицелиальной культуры, взятой для иммобилизации на рост колонии вокруг гранулы. Мицелий выращивали в периодических условиях на среде Чапека с глюкозой. В начале, середине и конце экспоненциальной фазы развития отбирали аликвоты, доводили до одинаковых концентрации физ.р-ром и проводили иммобилизацию из расчёта 2% по абсолютно сухому весу. Полученный гранулы помещали на стерильный торф и измеряли площади образовавшихся колоний. Время начала колонизации, удельная скорость роста колонии во всех вариантах не отличалась. Это свидетельствовало об отсутствии влияния фазы развития гриба Т.утс1е на параметры роста колонии вокруг гранул.

Важным параметром, влияющим на эффективность применения иммобилизованной системы, является средний размер гранул. Размер гранул определяет соотношение поверхности гранул к её объёму, а это, в свою очередь, определяет поступление кислорода к иммобилизованным клеткам, и следовательно, эффективность применения гранул в качестве новой препаративной формы. Варьированием диаметра иглы, используемой при иммобилизации, были получены гранулы разного размера. Средний диаметр гранул в различных сериях образцов составлял 0,2-0,3 мм, 0,5-0,6мм, 3-4 мм. Все остальные параметры оставались неизменными. При культивировании клеток в гранулах с различным начальным диаметром на средах с торфами были исследованы время начала колонизации, рост колонии вокруг гранулы, максимальная площадь колонизации. Проведённые эксперименты показали, что время начала колонизации и удельная скорость колонизации не зависели от диаметра гранул. Максимальная степень колонизации коррелировала с диаметром гранул и возрастала по мере его увеличения.

Концентрация альгината натрия, применяемого для иммобилизации, однозначно влияла на механические свойства гранул и диффузионные ограничения, возникающие на границе раздела фаз и внутри гранул. Были исследованы кинетические характеристики роста клеток Т. \nride и Р.]\иогексет вокруг гранул, полученных из альгината натрия различных концентраций. Для этого гранулы с начальной концентрацией альгината натрия 1, 2 и 4% в исходной смеси помещали на чашки Петри с торфом и изучали кинетику образования колоний. На рисунке 5 показаны кривые изменения площадей колоний вокруг гранул, полученных с использованием растворов с различной концентрацией альгината натрия. Как видно из рисунка 5 для обоих исследуемых микроорганизмов увеличение концентрации раствора альгината натрия приводило к увеличению времени начала колонизации. Удельная скорость колонизации снижалась, а формы кривых роста колонии практически не отличались друг от друга. Можно предположить, что диффузионные

ограничения, возникающие внутри гранул, влияли на кинетические характеристики роста свободных клеток вне гранул.

(I 2

время,сутки

Рис. 5: Изменение площадей колоний вокруг [ранул, полученных с использованием растворов с различной концентрацией альгината натрия; (А) - Р./1иоге5сеш; (Б} - ТлчгЫе.

3. Предполагаемая модель роста колонии клеток в иммобилизованной системе «полимерная матрица - клетки — субстрат». Проведённые эксперименты позволили предложить последовательности, и механизм роста клеток внутри гранулы и вокруг гранулы. Первая фаза: после иммобилизации субстрат и клетки равномерно распределены внутри гранулы. Движение высокомолекулярного субстрата и клеток за счёт диффузии практически отсутствует. Клетки начинают декретировать индуциб&льные ферменты амилолитического ряда (для Т.\>1гИе) и протеолитичеекие ферменты (в случае Р.риогехсепк). При этом можно предположить, что диффузия ферментов из-за меньшей молекулярной массы, в отличие от диффузии субстрата в Са-альгинатных матрицах, несколько выше. Ферменты расщепляют соответствующие высокомолекулярные субстраты (крахмал или желатин) до пншомолскупярнык соединений: моно- и цисихаров и аминокислот, соответственно. Вторая фаза: клетки метабол из и ру ют НШкомолекуяярные субстраты, и начинается их рост. Третья фаза: концентрация клеток начинает возрастать, при этом максимальное возрастание концентрации клеток

происходит в приповерхностном слое гранулы, где наблюдается максимальная концентрация кислорода. Четвёртая фаза: клетки выходят на поверхность гранулы за счёт направленного роста, и далее происходит рост свободных клеток, начинает образовываться колония. Дальнейший рост колонии сопряжён с метаболизмом субстрата, локализованного как внутри гранулы, так и вне её. В случае отсутствия субстрата вне гранулы рост микроорганизмов в колонии происходит за счёт низкомолекулярных соединений, диффундирующих из гранулы в приповерхностный водный слой вокруг клеток. В случае клеток ТМпс1е одновременно с этим происходит движение субстрата или продуктов его метаболизма по мицелию. По мере удаления клеток от центра колонии концентрация низкомолекулярных компонентов начинает снижаться, и рост колонии из экспоненциальной фазы переходит в линейную. Рост колонии и достижение ей максимальной площади обусловлен исчерпанием субстрата у края колонии.

' Г- » \

1 о

Л

V "О:- 04 ЧГфО/0,/

Й'ЮГ".^«

° " " <Л<„ о с

V,' " А Л X» О

с >

'оШ п°' о о

О

ит I

о пл ..г V 'си

о°0

°ОО^оо

УУ о о о

°0О

о

л

субстрат

•О

фермент

□

продукт

расщепления

субстрата

1 ФАЗА

2 Ф А 3 А

3 Ф А 3 А

4Ф АЗА

Рис.6. Предполагаемая модель роста колонии вокруг гранул с иммобилизованными клетками и субстратом.

4. Применение иммобилизованных системы «полисахаридная матрица -клетки - субстрат», как новой препаративной формы. Фитотоксичность была исследована в серии экспериментов при прорастании семян огурца сорта «Победа». Для этого на увлажнённую фильтровальную бумагу в чашки Петри помещали семена огурца с разным количеством гранул. Гранулы были локализованы в различных местах чашки. Анализ, проведённый через 7 дней, показал наличие свободных клеток микроорганизмов на поверхности фильтровальной бумаги и рост корневой системы. Сравнительный анализ длины корешков в контрольном эксперименте и в экспериментах с различными концентрациями иммобилизованных систем убедительно доказал отсутствие отрицательных воздействий новых препаративной формы.

Для определения эффективности применения новой препаративной формы в период 2005-2006 г в реальных условиях защищённого грунта были поставлены производственные испытания на различных культурах, с использованием различных типов субстратов (земля, торф, минеральная вата и др.) при разных способах внесения.

Для этого были наработаны опытные партии препарата на основе иммобилизованных форм клеток Т. \nridc или Р./1иоге.чсст\ Выпуск продукции был осуществлён ООО «РостПромТорг» на основании научно-технической документации, разработанной совместно со специалистами фирмы. На обе препаративные формы были разработаны технологические условия, включающие в себя методы контроля качества готовой продукции. Опытное производство иммобилизованных форм осуществляли в соответствии со следующей технологией: последовательное культивирование клеток на соответствующих питательных средах, начиная с агаризованой среды и кончая суспензионным культивированием в ферментёре объёмом Юл в аэробных условиях; концентрирование клеточной суспензии; иммобилизацию полученной клеточной суспензии (2% по абсолютно сухому весу на 1л раствора альгината, содержащего субстрат). Иммобилизацию проводили распылением

под давлением через соответствующие устройства в 2% раствор СаС12 при постоянном перемешивании. Порция раствора, подаваемого на иммобилизацию, не превышала 6 л. Полученные гранулы выдерживали в растворе СаСЬ не более 30 мин, фильтровали, затем дважды ресуспензировали в физ.р-ре. Полученную суспензию иммобилизованных гранул консервировали раствором 15% раствором глицерина. Микробиологический контроль производства осуществляли на стадиях культивирования и перед консервацией. Препаративные формы хранили при комнатной температуре.

Во всех случаях норма расхода препарата, рассчитанная нами, исходя из лабораторных экспериментов, составляла 4л иммобилизованной препаративной формы на 1 га или 0,15 мл (105 гранул) под корневую систему растения. При этом средний размер гранул уменьшили до 0,2 мм. Препаративную форму иммобилизованных клеток вносили по технологиям, согласованным с главными агрономами тепличных комбинатов. Испытания провели на огурце Б1 сорта «Атлет» на торфоплитах; баклажане сорта «Орион» на минеральной вате; огурце сорта «Кураж» на торфосубстрате; зеленных культурах (салат, укроп, петрушка и т.д.). Препарат вносили с использованием бочки ОЗГ-400. В соответствии с принятыми в хозяйствах методиками осуществляли визуальное наблюдение состояния растений, подсчёт урожайности и количества выпадов. Осуществляли отбор проб из корня, корневой шейки и субстрата прикорневой зоны для микробиологического контроля. Во всех вариантах состояние растений было хорошим, снизился уровень выпадов, заболевших растений и встречаемость корневых гнилей. Наблюдали увеличение урожайности на 1-1,5 кг/м2. В опытах, где производили микробиологический контроль, было отмечено увеличение процента встречаемости грибов Т.уМс1е и бактерий Р.Аиогевсет на протяжении 2,5-3 месяцев после внесения.

Интегрированная система защиты растений включает в себя применение химических и биологических средств. Степень и характер воздействия различных химических препаратов на биоценоз почвы отличаются. Практика

показывает, что после применения химических фунгицидов и бактерицидов обычно следует внесение биологических препаратов для восстановления уровня полезной микрофлоры. Наличие диффузионного барьера между клетками, находящимися внутри гранулы, и средой должно частично снизить уровень воздействия химических пестицидов. При наличие роста колонии вокруг гранул, выдержанных определённое время в растворе пестицида, вариант эксперимента считали положительным. Данные эксперимента приведены в таблице 1. Препаративная форма клеток T.viride выдерживает инкубацию с Фитолавином-300 более 180 минут, с Фитоплазмином - в течение 30 минут, а с Квадрисом не - более 5 минут. Препаративная форма клеток P.fluorescens выдерживала 5 минутный контакт со всеми исследуемыми растворами, более длительная инкубация приводила к гибели клеток.

Таблица 1: Рост колоний из гранул после инкубации в растворах пестицидов.

Квадрис: Фитолавин-300: Фитоплазмин:

Препаративная форма/время инкубации (мин): 5 15 30 60 180 5 15 30 60 180 5 15 30 60 180

Т. viride + - - - - + + + + + + + + - -

P. fluorescens + - - - - + - - - - + - - - -

Выявленная устойчивость к фунгицидам и бактерицидам позволила произвести производственные испытания на огурце сорта «Кураж» продлённого оборота на лотках типа «Мапал». Испытания проводили при одновременном внесении иммобилизованной препаративной формы на основе T.viride в одной баковой смеси с Фундазолом. В течение месяца после внесения отбирали пробы субстрата, корневой шейки и корня, в которых анализировали наличие клеток T.viride, а также фитопатогенной микрофлоры. Результаты анализа проб показали увеличение встречаемости клеток T.viride в три раза и снижение уровня фитопатогенной микрофлоры в корневой шейке и корнях в два раза. Таким образом, совместное внесение препаративной формы клеток T.viride и

Фундазола не приводило к гибели клеток в иммобилизованной системе, что позволило клеткам занять освободившуюся экологическую нишу, образовавшуюся после химической обработки. Таким образом, были продемонстрированы преимущества применения иммобилизованной препаративной формы по сравнению со свободными клетками в интегрированной системе защиты растений. ВЫВОДЫ

1. Разработан метод совместной иммобилизации клеток гриба Т. \iride или бактерии Р./1иогезсет в Са-альгинатных гранулах с высокомолекулярными субстратами (крахмалом, либо желатином).

2. Показано, что исследуемые микроорганизмы способны к образованию колоний вокруг гранул за счёт метаболизма иммобилизованных в них субстратов.

3. Изучено влияние концентрации раствора альгината натрия, начальной концентрации клеток, их физиологического состояния на параметры выхода клеток из гранул после иммобилизации (время начала выхода, удельную скорость роста колонии, максимальную степень колонизации).

4. Показано, что клетки иммобилизованные в Са-альгинатных гранулах, одновременно с высокомолекулярными субстратами сохраняли свои присущие им фунгицидные свойства после выхода из гранул.

5. Показана возможность применения созданных иммобилизованных систем в качестве новых препаративных форм средств защиты растений. Разработанные формы по сравнению со свободными клетками имеют увеличенный срок хранения, повышенную адаптивность и конкурентоспособность, а также большую устойчивость к воздействию внешних факторов, включая кратковременные обработки химическими фунгицидами и бактерицидами.

6. Разработана техническая документация (ТУ и опытно-промышленный регламент) на выпуск препаративных форм на основе иммобилизованных

систем и осуществлён выпуск опытных партий. Проведены успешные

испытания препаративных форм в различных тепличных комбинатах в

условиях защищенного грунта.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Чекалова К.В., Подшивалова Е.В., Игнатьева Е.С., Марквичёв Н.С. Совмещение биопрепаратов с химическими средствами защиты растений // Картофель и овощи. - 2006. - №8.- С.20-21.

2. Чекалова К.В., Подшивалова Е.В., Игнатьева Е.С, Марквичёв Н.С. Исследование колонизации торфосубстратов грибом Trichoderma viride при внесении иммобилизованных форм // Известия ТСХА. -2006. - №4,- С. 123-127.

3. Чекалова К.В., Подшивалова Е.В., Игнатьева Е.С., Буянова A.B., Алексеева О.Б., Марквичёв Н.С. Схема применения иммобилизованных форм биопрепаратов // Гавриш. - 2006.- № 4 - С. 26-27.

4. Чекалова К.В., Марквичёв Н.С., Илушка И.В., Царьков Д.А. Совместимость биологических препаратов с химическими пестицидами // Гавриш. - 2006. - № 2. - С. 21- 22.

5. Марквичёв Н.С., Чекалова КВ., Алексеева О.Б. Биопрепараты нового поколения // Тепличные технологии. - 2006. - Т.6, №1. - С. 48 - 50.

6. Чекалова К.В., Подшивалова Е.В., Корнилова H.A., Буянова A.B., Марквичёв Н.С. Колонизация торфосубстратов различными формами на основе грибов p. Trichoderma // Гавриш. - 2006 - №6 - С. 22-23.

7. Чекалова К.В., Подшивалова Е.В., Игнатьева Е.С., Марквичёв Н.С Рост клеток Trichoderma viride из кальций - альгинатных гранул при их одновременной иммобилизации с крахмалом // Тез.докл. МАИП -2006.- Т.39-С.54-55.

8. Марквичёв Н.С., Чекалова К.В., Подшивалова Е.В. Иммобилизованные биопрепараты и их совместимость с химическими средствами защиты растений // Биологическая защита растений -основа стабилизации агроэкосистем: Тез.докл. III Междунар. конф. Выпуск 4. - Краснодар. - 2006. - С. 158-160.

Подписано в печать 25.01.2007 г. Формат 60x84 1/16, Усл. Печ. Лист1,5 Тираж 100 экз. Заказ № 138 Отпечатано в типографии «ДЦ «Каретный Двор»» 101000, Москва, ул. Покровка, д. 12, стр.1 Тел.: (495) 955-19-31 Факс: (495) 955-19-31 www.allaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чекалова, Ксения Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Суть и значение биологического метода защиты растений.

1.1.1. Механизмы действия полезных почвенных микроорганизмов.

1.1.2. Достоинства и недостатки препаративных форм биопестиц^дов.

1.1.3. Экосистема обитания биологических агентов.

1.2. Природная и искусственная иммобилизация клеток микроорганизмов.

1.2.1. Иммобилизация микроорганизмов в почве и её преимущества.

1.2.2. Поведение биообъектов, вносимых в почву.

1.2.3. Способы иммобилизации клеток.

1.2.4. Выход клеток из иммобилизованного состояния в свободное.

1.2.5. Применение иммобилизованных клеток для защиты окружающей среды.

1.2.6. Иммобилизация клеток совместно с субстратом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка новой препаративной формы биологических фунгицидов на основе клеток микроорганизмов Trichoderma viride и Pseudomonas fluorescens"

подразумевает

Интенсивное развитие технологий защищенного грунта применение биологического метода защиты растений дф улучшения экологической обстановки и снижения пестицидной нагрузки.

Большинство препаративных форм биологических препаратов на основе полезных микроорганизмов для борьбы с патогенными представляют собой споровые формы или вегетативные клетки. Также препаративные формы обладают рядом общих недостатков, а именно: коротким сроком хранения клеток, крайне низкои приживаемостью в реальных неустойчивостью к физико-химическим взаимодействиям. Э:и недостатки экосистемах, эв на основе ведут к снижению эффективности биологических препарат микроорганизмов. Разработка новых препаративных форм, ко-орые лишены данных недостатков, является актуальной задачей современной биотехнологии. Целью исследования явилась разработка новой препаративной формы I биологических фунгицидов на основе клеток гриба Trichodprma viride и бактерии Pseudomonas fluoresceins. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• Разработать принципиально новый метод иммобилизации клеток исследуемых микроорганизмов и специально подобранного для их метаболизма субстрата в Са-альгинатном геле;

• Исследовать динамику роста клеток из иммобилизованной системы;

• Подобрать высокомолекулярный субстрат для егс иммобилизации с микроорганизмами и исследоЕ концентрации этого субстрата на свойства иммобилизованной системы;

• Изучить влияние фазы развития микроорганизмов и их ко кинетические характеристики роста клеток;

• Исследовать влияние концентрации альгината натрия иммобилизованной системы клеток с субстратом; разработанной совместной ать влияние нцентрации на на свойства

• Изучить сохранение клетками своих фунгицидных свойств при совместной иммобилизации с субстратом;

• Изучить фитотоксические свойства иммобилизованной системы в I лабораторных условиях и возможность её применения в производственных условиях в качестве новой препаративной формы средств защиты растений. I

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Чекалова, Ксения Владимировна

выводы

1. Разработан метод совместной иммобилизации клеток гриба Tviride или бактерии P.fluorescens в Са-альгинатных гранулах с высокомолекулярными субстратами (крахмалом, либо желатином).

2. Показано, что исследуемые микроорганизмы способны к образованию колоний вокруг гранул за счёт метаболизма иммобилизованных в них субстратов.

3. Изучено влияние концентрации раствора альгината натрия, начальной концентрации клеток, их физиологического состояния на параметры выхода клеток из гранул после иммобилизации (время начала выхода, удельную скорость роста колонии, максимальную степень колонизации).

4. Показано, что клетки, иммобилизованные в Са-альгинатных гранулах одновременно с высокомолекулярными субстратами, сохраняли присущие им фунгицидные свойства после выхода из гранул.

5. Показана возможность применения созданных иммобилизованных систем в качестве новых препаративных форм средств защиты растений. Разработанные формы по сравнению со свободными клетками имеют увеличенный срок хранения, повышенную адаптивность и конкурентоспособность, а также большую устойчивость к воздействию внешних факторов, включая кратковременные обработки химическими фунгицидами и бактерицидами.

6. Разработана техническая документация (ТУ и опытно-промышленный регламент) на выпуск препаративных форм на основе иммобилизованных систем и осуществлён выпуск опытных партий. Проведены успешные испытания препаративных форм в различных тепличных комбинатах в условиях защищённого грунта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Биологические средства защиты растений нашли широкое применение в растениеводстве защищенного грунта. Однако большинство из них не обладают высокой эффективностью и чаще всего используются в качестве профилактических, нежели лечебных средств. Несмотря на то, что многие научные центры по всему миру производят постоянный поиск штаммов, обладающих высокой антагонистической активностью, и количество патентов в области биопестицидов из года в год только растёт, практические применении биопрепаратов не увеличивается. Связано это прежде всего с недостатками, касающимися препаративных форм.

В ходе лабораторных и производственных испытаний была разработана новая препаративная форма биологических фунгицидов на основе грибов Trichoderma viride и бактерий Pseudomonas fluores cens, которая обладает целым рядом преимуществ по сравнению с другими препаративными формами биофунгицидов, а именно: длительным сроком хранения; высоким уровнем приживаемости и стабильности клеток микроорганизмов в субстратах и почвенных экосистемах; удобством использования и обращения; безопасностью и биодеградируемостью всех компонентов.

Основой препаративной формы является принципиально новая иммобилизованная система «полисахаридная матрица-клетки-субстрат».

Другим отличительным моментом является то, что иммобилизация была использована не для удержания клеток в объёме гранулы, как это было принято раньше для использования в биореакторах и для препаратов в области защиты окружающей среды, а с целью обеспечения максимально возможного выхода клеток в объём вокруг гранулы.

В ходе лабораторных и производственных испытаний были определены оптимальные характеристики новой препаративной формы и ориентировочная норма расхода для использования в области защищённого грунта.

В связи с тем, что штаммы-антагонисты обладают определённым направленным спектром действия, перспективным является построение интегрированной защиты, в которой чередовались бы различные штаммы, или разработка и производство препаративных форм на основе не одного, а нескольких эффективных штаммов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чекалова, Ксения Владимировна, Москва

1. Abu-Ashour J., Joy D.M., Lee H., Transport of microorganisms through soil // Water Air Soil Poll. 1994 - Vol. 75- 141-158.

2. Acea M.J., Moore C.R., Alexander M. Survival and growth of bacterias introduced into soil 1988 - Vol. 20 - 509-515.

3. Andrews J.H., Harris R.F. The ecology and microbiology of microorganisms on plant surface // Annu. Rev. Phytopathol. 2000. -Vol. 38-p. 145-180.

4. Anselmo A.M., Novais J.N. Biological treatment of phenolic wastes: comparison between free and immobilized cells // Biothecnol. Lett. -1985 -Vol.14-p. 1-7.

5. Babu G.R.V., Wolfram J.N., Chapatwala K.D. Conversion of sodium cyanide to carbon dioxide and ammonia by immobilized cells J. Ind. Microbiol. - 1992 - Vol. 9 - p. 235-238.

6. Backman P.A., Wilson M., Murphy J.F. Bacteria for biological control of plant diseases. 1997 - In: Rechcigl NA, Rechcigl JE (eds) Environmentally safe approaches to crop disease control CRC/Lewis Press, Boca Raton, Fla., - 1997 - 95-109.

7. Bais H.P., Park S.W., Weir T.L. How plants communicate using the underground information superhighway // Trends Plant Sci. 2004 -Vol. 9, p.26-32.

8. Baker R. Trichoderma spp. as plant growth stimulants. // CPC Critical Reviews in biotechnology 1988 - Vol.7 - p. 240-244.

9. Barros M.R.A., Cabral J.M.S., Novais J.M. Production of ethanol by immobilized Saccharomyces bayanus in an extractive fermentation system // Boitechnol bioeng 1987 - Vol. 29 - p. 1097-1104.

10. Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J.J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria. // Curr.Opin. Plant Biol. -2001 -Vol.4-p. 139-149

11. Boby V.U., Bagyaraj D.J. Biological control of root-rot of Coleus forskohlii Briq. using microbial inoculants. // World J. of Microbiol, and Biotechnol. 2003.-Vol. 19 - p. 175-180.

12. H.Boland G.J., Kuykendall L.D. Plant-microbe interactions and biological control 1998 - Deker - New-York.

13. Brodhagen M., Henkels D., Loper J.E. Positive auto regulation and signaling properties oh pyoluteorin, an antibiotic produced by the biological control organism Pseudomonas fluorescens Pf-5. // Appl. Envierom. Microbiol. 2004 - Vol.70 - 1758-1766.

14. Buzas Z., Dallmann K., Szafanni Influence of pH on the growth and production of free and immobilized cells Sacchoromyces cerevisiae cells // Biotechnol. Bioeng. 1989 - Vol. 34 - p. 882-884.

15. Calistru C., McLean M., Berjak P. In vitro studies on the potential for biological control of Aspergillus flavus and Fusarium moniliforme by Trichoderma species. Mycopatologia in press.

16. Cassidy M.B., Lee H., Trevors J.T. Environmental application of immobilized microbial cells: a review. // J. Ind.Microbiol 1996 - Vol. 16-p. 79-101/

17. Caunt P. Immobilisation of the cells in the linear polyacrilamide matrix: degradation of a mixture of volatile fatty acids by Alcoligenes denitrificans II Biotechnol. Lett. 1987 - Vol. 9 - p. 47-48.

18. Chen K.S., Huang C.T. Effects of the growth of Trichosporon cytaneum in calcium alginate gel beads structure and oxygen transfer characteristics // Enzyme Microbiol. Biotechnol. 1988 - Vol. 10 - p. 284-292.

19. Chernin L., Chet I. Microbial enzymes in biocontrol of plant pathogens and pests // In R.G. Burns and R.P.Dick (ed), Enzymes in the environment: activity, ecology and application Marcel dekker, New-York - 2002 - p. 171-225.

20. Chet A., Baker R. Isolation and biological potential of Trichoderma hamatum from soil naturally suppressive of Rhizoctonia solani. II Phytopatology 1981 - Vol. 71 -p.268-290.

21. Chet I., Inbar J. Biological control of fungal pathogens. // Appl. Biochem. and biotechnol. 1994 - Vol. 48 - p. 37-42.

22. Compant S., Duffy В., Nowak J., Clement C. Minireview. Use of plant-growth promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects. // Appl. and environm. Microbial.-2005 -p.4951-4959.

23. Corbell N., Loper J.E. A global regulator of secondary metabolite production in Pseudomonas fluorescens Pf-5. // J. Bacteriology.- 1995-Vol.177-6230-6236.

24. Danso S.K.A., Keya S.O., Alexander M. Protozoa and the decline of Rhizobium populations added to soil // Can. J. Microbiol. 1975 - Vol. 21-p. 884-895.

25. De Weger L.A., A.J. van der Bij, Dekkers L.C., Simons M. Colonization of the rhizosphere of crop plants by plant-beneficial Pseudomonas. II FEMS Microbiol. Ecol. 1995.- Vol.17- p. 221-228.

26. Duffy B.K., Defago G. Environmental factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas fluorescens biocontrol strains. // Appl. Envierom. Microbiol. 1999. - Vol.65- p.2429-2438.

27. Duffy B.K., Schoten A., Raajmakers J.M. Pathogenic self defense: mechanisms to counteract microbial antagonism // Annu. Rev. Phytopathol. 2003. - Vol.641- p.501-538.

28. England L.S., Lee H., Trevors J.T. Bacterial survival in soil: effect of clay and protozoa // Soil Biol. Biochem. 1993 - Vol. 25 - p. 525-531.

29. Ferschl A., Loidl M., Ditzelmuller G. Continuous degradation of 3-choloroaniline by calcium-alginate entrapped of Pseudomonas acedovorans CA28: influence of additional substrates // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991 - Vol. 35 - p. 544-550.

30. Fravel D.R. Role of antibiosis in biocontrol of plant diseases. // Annual rev. Phytopathol. 1988 - Vol. 26 - p. 74-91.

31. Gerhardson Biological substitutes for pesticides.// Trends Biotechnol -2002 Vol.20 - p.338-343.

32. Ghisalberti E.L., Sivasithamparam Antibiotics produced by Trichoderma spp. // Soil Biol, and Biochem. 1991 - Vol. 23 - p. 10111020.

33. Gosmann В., Rehm H.J. Influence of growth behavior and physiology of alginate-entrapped microorganisms on the oxygen consumption // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988 - Vol. 29 - p. 554-559.

34. НаЫе M., Alexander M. Further evidence for the regulation of bacterial populations in the soil by protozoa // Arch. Microbiol. 1977 - Vol. 13 -p. 181-183.

35. Hallman J, Quadt-Hallman A, Mahafee W.F.and Kloepper J.W. Bacterial endophytes in agricultural crops. // Can.J.Microbiol 1997 -Vol.43 -p.895-914.

36. Harman G.E. Myths and dogma of biocontrol: changes in perception derived research of Trichoderma harzianum T-22 // Plant Dis.-2000 -Vol.84-p. 377-393.

37. Heijnen C.E., J.D. van Elsas, Kuikman P.J. Dynamics of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii introduced into soil; the effect of betonite clay on predation by protozoa // Soil Biol. Biochem. 1988 - Vol. 20 -p. 483-488.

38. Heijnen C.E., J.D. van Elsas, Kuikman P.J. Improvements to the use of betonyte clay as a prospective agent, increasing survival levels of bacteria, introduced into soil // Soil Biol. Biochem. 1992 - Vol. 24 -p. 533-538.

39. Jackson S.J., Leek R., Microencapsulation and the food industry // Lebensm Wiss. Technol. Vol. 25 - p. 289-297.

40. Jones D.G. Exploitation of microorganisms. // Chapman Hall London - 1993.

41. Barea J-M., Azcon R. Mycorhizospere interactions to improve plant fitness and soil quality // Antonie van Leeuwenhoek 2002 - Vol. 81 -p. 343-351.

42. Lancy E.D., Tuovinen O.H. Ferrous ion oxydation by Thiobacillus ferrooxydans immobilized in calcium alginate // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1984 - Vol. 20 - p.94-99.

43. Lefebvre .J, Vincent J-C. Diffusion-reaction-growth coupling in gel-immobilized cell systems: model and experiment // Enzyme Microb. Technol.- 1995-Vol. 17-p. 276-284.

44. Lodewyckx C., Vangronsveld J., Porteous F. Entophytic bacteria and their potential applications // Crit. Rev. Plant Sci. 2002 - Vol.21 -p.583-606.

45. Loper J.E., Henkels M.D. Availability of iron to Pseudomonas fluorescens in rhizosphere and bulk soil evaluates with an ice nucleation reporter gene // Appl. Environ. Microbiol 1997 - Vol. 63 - p.99-105.

46. Lorito M., Woo S.L., Ruocco M. The molecular cross-talk between Trichoderma, plants and pathogens provides new tools for disease control // 9-th international workshop on Trichoderma and Gliocladium, Vienna, Austria 2006.

47. McLoughlin A.J. Controlled release of immobilized cells as a strategy to regulate ecological competence of inocula // Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 1994 - Vol. 51 - p. 1-45.

48. Michrina J., Michalikova A., Konacik T. Antibiosis as a possible mechanism of antagonistic action of Trichoderma harziannum against Fusarium culmorum II Ochrana rostlin 1995 - Vol.31 - p. 177-184.

49. Milner J.L., Silo-Suh L., Lee J.C. Production of kanosamine by Bacillus cereus UW 85 // Appl. Environ. Microbiol. 1996 - Vol. 63 - p. 30613065.

50. Montesinos E., Bonatera A. Dose-response models in biological control of plant pathogens. An empirical verification.// Phytopathol. 1996 -Vol. 86-464-472.

51. Montesinos E. Development, registration and commercialization of microbial pesticides for plant protection // Int. Microbiol. 2003 -Vol.6-245-252.

52. Montesios E., Bonaterra A., Badosa E., Plant-microbe interactions and the new biotechnological methods of plant disease control // Int. Microbiol. 2002 - Vol.5 - p. 169-175.

53. Nakayama Т., Homma Y., Hashidoko J. Possible role of xanthobaccins produced be Stenotrophmonas sp. strain SB-K88 in suppression of sugarbeet damping-off disease // Appl. Environ. Microbiol. 1999 - Vol. 65 -p.4334-4339.

54. Papavizas G.C. Trichoderma and Gliocladium: biology, ecology and potential for biological control. // Annual Rev. Phytopathol. 1985 -Vol. 23-p. 23-54.

55. Paulitz T.C., Belanger R.B. Biological control in green-house systems. / Annu. Rev. Phytopatol. Vol. 39 - p. 103-133.

56. Pilar Pons M., Carmen Fuste M. Uranium uptake by immobilized cells of Pseudomonas strain EPS 5028 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993 -Vol. 39-p. 661-665.

57. Portier R.J., Fujisaki K. Continuous biodegradation and detoxification of chlorinated phenols using immobilized bacteria // Toxity assessment 1986-Vol. 1 - p. 501-513.

58. Powell K.A., Jutsum A.R. Technical and commercial aspects of biocontrol products//J. Pestic. Sci. Vol. 37-p. 315-321.

59. Pristchepa L.,Voitka D. Use of a new biofiingicide Lignorin {Trichoderma harzianum S-4) for plant protection against diseases. // Bulletin of the polish Academy of Sci., Biol. Sci. 2003. - vol.51 -nub.3.

60. Prusky D., Yakoby N. Pathogenis fungi: leading or led by ambient pH? // Mol. Plant Pathol. 2003 - Vol.4 - 509-516.

61. Rhodes D.J. Formulation of biological control agents. In: Exploitation of Microorganisms // Chapman and Hall London, UK - 1993 — p. 411439.

62. Schroth M., Hancock J. Selected topics in biological control // Annu. Rev. Microbiol. -1981 Vol. 35 - p. 453-476.

63. Shreve G.S., Vogel T.M. Comparison of substrate utilization and growth kinetics between immobilized and suspended Pseudomonas cells // Biotechnol. Bioeng. 1993. - Vol. 41 - p. 370-379.

64. Siahpush A.R., Lin J.E., Wang H.Y. Effects of adsorbents on degradation of toxic organic compounds by coimmobilized systems // Biotecnol. Bioeng. 1991. - Vol. 39 - p. 619-628.

65. Tanaka H., Matsumura M., Veliky I.A. Diffusion characteristics of substrates in Ca-alginate beads // Biothechnol. Bioeng. 1984. - Vol. 26-p. 53-58.

66. Toyoda H., Utsumi R. Method for the prevention of Fusarium diseases and microorganisms used for the same. // U.S. Patent 4,988,586 -January 1991.

67. Van Elsas J.D., Heijen C.E. Methods for the introduction of bacteria into soil: a review.//Biol. Fertil. Soil-1992.-Vol. 14-p. 14-22.

68. Van Loon L.C., Bakker P.A.H.M, Pieterse C.M.J. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria.// Annu. Rev. Phitopatol. 1998 -Vol.35-p. 453-483.

69. Vargas R., Hattori T. Protozoan predation of bacterial cells in soil aggregates // FEMS Microbiol. Ecol. 1986. - Vol. 38 - p. 467-472.

70. Weir S.C., Lee H., Trevors J.T. Survival of free and alginate-encapsulated Pseudomonas aeruginosa UG2Lr in soil treated with disinfectants // J. Appl. Bacteriol. 1995a.

71. Welbaum G., Sturz A.V., Dong Z., Nowak J. Fertilizing soil microorganisms to improve productivity of agroecosystems // Crit. Rev. Plant Sci. 2004 - Vol.23 - p.175-193.

72. Weller DM. Biological control of soil born plant pathogens in the rhizospere with bacteria // Annu. Rev. Phytopathol. 1988 - Vol.26 - p. 379-407.

73. Wheayley R.E. The consequences of volatile organic compounds mediated bacterial and fungal interactions // Antonie van Leeuwenhoek -2002-Vol. 81 -p. 357-364.

74. Whipps J.M., Lumsden R.D., Biological control of Pythium species. // Biocontrol sci. and technol. 1991 - Vol. 1 - p.75-90.

75. Wipps J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere // J. Exp. Bot. 2001 - Vol. 52 - p.487-511.

76. Wong P.K., Lam K.C., So C.M. Removal and recovery of Си (II) from industrial effluent by immobilized cells of Pseudomonas putida II-11 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - Vol. 39 - p. 127-131.

77. Zhang L., Brich R.G. The gene for akbicidin detoxification from Pantoae disrersa encodes an esterase and attenuates pathogenesity of Xanthomonas albilineans to sugarcane.// Proc.Natl. Acad. Sci. USA -1997- Vol.94 p.9984-9989.

78. Алимова Ф.К. Trichoderma/Hypocrea (Fungi, Ascomycetes, Hypocreals): таксономия и распространение. // Казанский государственный Университет. Казань. - 2005, стр.264.

79. Алимова Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma // Казанский государственный Университет. Казань -2006, стр.210.

80. Архипченко И.А., Гусарова Г.А., Паников Н.С. Биотрансформация азотсдержащих соединений в процессе непрерывной очистки стоков свинокомплексов иммобилизованными клетками // Москва "Микробиология" 1996, т.65, №5, с.621-626

81. Ассонов Н.Р. Практикум по микробиологии // Москва, Агропромиздат, 1998, с.155.

82. Ахатов А.К., Джалилов Ф.С., Белошапкина О.О. Защита овощных культур и картофеля от болезней // Москва. 2006, стр.352.

83. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв // Москва 1989, стр.238.

84. Биотехнология под.ред. Баева А.А. // Издательство «Наука». -Москва. 1984.

85. Бодей С.П., Броделиус П., Кабрал И.М. «Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Москва, Мир, 1988, стр. 215.

86. Веселова И.А. Использование хитозана и его производных для иммобилизации ферментов / Тез. докл. науч-практ. конф. "Новые перспективы в использовании хитина и хитозана», Москва, 1999, с.265-267.

87. ВНИИБЗР «Культивирование и применение грибов против вредителей», 1985, стр. 48-56.

88. Волкова Т.Г. Биотехнология // Изд-ва СО РАН, Новосибирск, 1999, стр. 253.

89. Воробьёв Л.И. Промышленная микробиология // Изд-во Московского Государственного Университета. 1989, стр.296.

90. Вредители тепличных и оранжерейных растений, под.ред. Ахатова А.К.и Ижевского С.С. //М.: Товарищество Научных Изданий КМК, 2004, стр.307.

91. Вудвард Д. Иммобилизация клеток и ферментов // Москва "МИР", 1988, стр.162.

92. Грицай В.И. Самоорганизация в макропористом геле с иммобилизованными клетками. Кинетическая модель биоселективной мембраны сенсора // Доп.нац. АН Украины, №2, с.175-179.

93. Давиденко Т.И., Бондаренко Г.И. Использование иммобилизованных в каррагинан клеток микроорганизмов дляполучения органических веществ // Москва, Успехи химии, 1990, т.59, №3, с.509-521.

94. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: Академкнига, 2002, 281 стр.

95. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика, Москва "Мир", 1991, стр.

96. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во МГУ, 1987, стр.256.

97. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: изд-во Московского Университета. 2005, стр. 358.

98. Китова А.Е., Кувичкина Т.Н., Аринбасарова А.Ю. Деградация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 // "Прикладная микробиология и биотехнология", 2004, т.40, №3, с.307-311.

99. Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов и их применение. В кн.: Иммобилизованные клетки. Пущино, 1978, с.5-36.

100. Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки. В кн.: Итоги науки и техники. Сер.микробиология.М.:ВИНИТИ, 1981, 11, с.55-157.

101. Красильников Н.А. Микроорганизмы почвы и высшие растения.М., 1958, стр.376.

102. Лабораторный практикум по общей биотехнологии // М.: ИЦ РХТУ имени Менделеева, 2001, стр. 68.

103. Логинов О.Н. Бактерии p. Pseudomonas и Azotobacter как объекты сельскохозяйственной технологии // М.: Наука. 2005 стр.165.

104. Макаренко А.А., Аринбасарова А.Ю., Кувичкина Т.Н., Балашов С.В., Решетилов А.Н. Деградация п-толуолсульфоната иммобилизованными клетками Comamomas testosteroni BS 1310 // "Прикладная биохимия и микробиология", 2005, т.41, №5, с.521-524.

105. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Козлов С.В., Максимов А.Ю. Влияние различных способов иммобилизации на нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp.gtl//B кн: Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. -Пермь, 2004.- с.93-101.

106. Минеев В.Г. Агрохимия. // М.: изд.МГУ, 2003г, стр.268.

107. Мирчинк Т.Г. Почвенная микология. М.:Из-во МГУ - 1976, стр. 321.

108. Общая биотехнология. Лабораторный практикум. //Москва, Министерство образования РФ. РХТУ имени Менделеева, 2001, стр.57

109. Павлюшин В.А., Новикова Н.Н., Бойкова И.В. и др «Новые препараты для комплексной защиты растений от болезней разной этиологии», Доклады Российской Академии сельскохозяйственных наук, 2004, №6, стр. 17-21

110. Паников Н.С. Кинетика роста микроорганизмов // Москва «Наука», 1991, стр.312.

111. Перт С., «Основы культивирования микроорганизмов и клеток» Москва, Мир, 1978, стр. 331.

112. Практикум по микробиологии под ред.А.И.Нетрусова // М.: Академия, 2005, стр.606.

113. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей p.Pseudomonas // Москва "Наука", 1986, с. 151-156.

114. Самошин Н.М., Мотина Л.Г., Ерещенко Л.И. Исследование свойств иммобилизованной протеазы // Прикладная биохимия и микробиология, 1978, №4, стр.554-557.

115. Свириденко Ю.Я., Абдуллаева Л.В., Ефременко Е.Н., Райнина Е.И. Иммобилизованные дрожжи в биотехнологии переработки сыворотки.// Тез. докл. науч.-практ.конф. "Вклад науки в развития маслоделия и сыроделия", Углич, 15-17.09.1994, Россия, с. 156.

116. Сейкетов Г.Ш. Грибы рода Триходерма и их использование на практике. Изд-во "Наука" Казахской ССР. Алма-Ата, 1982, стр. 248.

117. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов // Москва, Изд-ва МГУ, 1994, стр.228.

118. Министерство сельского хозяйстваи продовольствия РФ. ООО «РостПромТорГ»

119. Закрытое Акционерное Генеральному директору1. Общество «Калининское»170015, Тверь, ул, Димитрова,52 Тел. (4822) 31-63-39, 31-67-25

120. Факс (4822) 31-54-09 № от DLOfiSjftOfc. На№от

121. Акт о производственных испытаниях.

122. Хозяйство: ЗАО «Калининское» г. Тверь Теплица 4 га.

123. Дата начала эксперимента: 06.01.2006. Дня» окомпяиив чтесттеримвнта: 29.06,2006. I

124. Дата отбора проб: 9-10.02.,840.03., 12-14.04.,10-12.05.2006. | Методика отбора проб: отбор среднего образца по всему ' объему субстрата с высевом на питательные среды, |

125. Кем отобрана проба: Голубева В В. Заболевание: Корневые гаили, питиоз, фузариоз, верпициллез. Препарат: Иммобилизованный триходермив. Культура: Огурец пчелоопьшемый Fj Атлет. Субстрат: Экоторф торфоплита, Площадь, га: 1 га

126. SEP-06 11:12 ZflO KfiRELSKIY 201 Ml• fti^T1. M-q £

127. J ■ ^ ^ ~ сёшл^иг^) aji Soy-q-меч*,** 1Г.Щ

128. Qf > d-Ь.ОЪ ^0cplu4> ^jo^rvf KJ^Ci

129. JLUAJLJirt^im ьЛ* К С: .^iC^&O^^a^h fa № l2*-fi?C(1. Уфс&СОгч l&kAUt^o L? 3-V,la . 7

130. CIoclJ^JUlu^. fxClC^tXuA 1g V A a1. Те*, . , ©T^ .- б? cfw^TMл ^ 1. TOTAL P.01 145

131. Акт о производственных испытаниях препарата иммобилизованный'триходермин.

132. Цель исследования: исследование уровня встречаемости микроорганизма Trichodermaviride после внесения в субстрат для выращивания зеленных культур

133. Кем отобрана проба (Ф.И.О.): Будынков Н.И.

134. Хозяйство (Предприятие): ЗАО "Агрофирма Белая Дача"1. Теплица: №491. Площадь обработки: 600м2

135. Субстрат: торфосмесь на основе торфа «Росторфинвест» с добавлением удобрения «Кемира».

136. Методика внесения: внесение раствора препарата иммобилизованный триходермин через бочки ОЗГ-400 в 632 лотка по 900 л торфосмеси каждый.1. Результаты испытанийнаименование обнаруженных микроорганизмов Обнаруженная концентрация Метод исследования

137. Trichoderma viride 10 От£ конструк чашки Пег после юр проб с ций и рассев на 1ри через 7 дней обработки1. Agrobacterium 74 *1. Pseudomonas 48

138. Заключение: по сравнению с контролем отмечалось полное отсутствие Erwinia carotovora и Pythium debaryanum. Произошло увеличение уровня грибов Trichoderma viride в 3 раза.

139. Фамилия и подпись ответственного лица: Юваров В.!1. М.П.патогенных грибов вс гречаемости

140. Акт о производственных испытаниях препарата иммобилизованный '1. Триходермин.

141. Цель исследования: исследование уровня встречаемости микроорганизма Trichodermaviride после обработки конструкций

142. Кем отобрана проба (Ф.И.О.): Будынков Н.И.

143. Хозяйство (Предприятие): ЗАО "Агрофирма Белая Дача"1. Площадь обработки: 2га

144. Trichoderma viride 100% Отб|>р проб с конструкций и рассев на чашки Пет|ри через 7 дней после обработки

145. Заключение: после нанесения препарата на обледеневшие части констр) показал 100% встречаемость гриба Trichoderma viride и отсутствие постор микрофлоры.

146. Фамилия и подпись ответственного лица: Юваров В.Н.1. М.П.й отбор проб ей

147. Акт о производственных испытаниях препаратов иммобилизованныйпланриз.

148. Цель исследования: исследование уровня встречаемости микроорганизма Pseudomonas fluorescens.

149. Кем отобрана проба (Ф.И.О.): Будынков Н.И.

150. Хозяйство (Предприятие): ЗАО "Агрофирма Белая Дача"1. Теплица: №58.1. Субстрат: торфосмесь.1. Культура: огурец.1. Сорт: «Кураж».

151. Дата внесения: 10.07.2005.

152. Дата отбора проб: 20.07.05.

153. Методика отбора проб: из субстрата, корневой шейки и корневой системы. Методика внесения: пролив по горшочкам.

154. Результаты влияния препаратов серии «планриз» на развитие рассады огурца.

155. Вариант Длина стебля, см Длина корня, см Масса растения г1. Контроль 31 8.1 24.8

156. Планриз обыкн. 25 8.6 28.21. ПИМ 30 9.0 27.21. ПИМ Fe 30 9.8 23.81. HCPoos 6 1.4 4.9

157. Подлив под корень иммобилизованного планриза практически никак не повлиял на рост стебля в длину.

158. В то же время отмечалось значительное увеличении длины корня: добавлением железа значимое, в варианте с иммобилизованным планризом без добавления железа - в виде заметной тенденции.

159. Масса растений в варианте с иммобилизованным планризом была выше, чем в необработанном контроле. При добавлении железа в ПИМ масса растений в сравнении в необработанным контролем не увеличивалась.

160. Фамилия и подпись ответственного лица: Юваров В.1. М.П.

161. ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ «РостПромТорг»1. СОГЛАСОВАНО1. Председатель1. Госхимкомиссии2006г.

162. Биопрепарат на основе иммобилизованных в биоразлагаемом полимере микроорганизмов «Иммобилизованный Планриз»

163. Технические условия ТУ 9192-006-76399909-20061. Срок введения с «»2006.

164. СОГЛАСОВАНО Заместитель главного Государственного санитарного врача РФ2006г.

165. Главный государственный санитарный врач

166. Санитарно-эпидемиологическоезаключение1. Москва 2006г.

167. Препарат обладает способностью подавлять широкий спектр фитопатогенных грибов, возбудителей корневых и при корневых гнилей.

168. По органолептическим, физико-химическим и микробиологическим показателям продукт должен соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице 1.