Штаммы грибов рода Trichoderma (Pers.: Fr.) как основа для создания биопрепаратов защиты растений и кормовых добавок

Бондарь, Полина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Штаммы грибов рода Trichoderma (Pers.: Fr.) как основа для создания биопрепаратов защиты растений и кормовых добавок
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Штаммы грибов рода Trichoderma (Pers.: Fr.) как основа для создания биопрепаратов защиты растений и кормовых добавок"

На правах рукописи

4841 оои ^^Ч^

Бондарь Полина Николаевна

Штаммы грибов рода Тпскойегта (Регэ.: Рг.) как основа для создания биопрепаратов защиты растений и получения кормовых добавок

Специальность 03.01.06. — Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2011

4841850

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии

Научный руководитель

кандидат биологических наук, доцент Садыкова Вера Сергеевна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева

Градова Нина Борисовна

доктор технических наук, старший научный сотрудник МГУПБ Кузнецова Людмила Станиславовна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет»

Защита состоится «15» февраля 2011 г. в 10 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д. И. Менделеева (125047 г. Москва, Миусская пл., д. 9) в ауд. 443 (конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ДМ 212.204.13

Шакир И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Грибы рода Trichoderma широко используются как биологические агенты для контроля возбудителей заболеваний растений (Harman, Bjorkman, 1998; Steward и др., 2006; Vinale и др., 2006). При рекомендации штамма-продуцента для создания биопрепаратов учитывается, как правило, его способность подавлять ряд фитопатогенных грибов и технологичность штамма. В последнее время появились сведения, что разные виды рода Trichoderma способны также вырабатывать фитогормоны (ауксины, этилен, цитокинины) и оказывать, помимо защитных свойств, прямое стимулирующее действие на рост растения (Ousley и др., 1993; Berg, 2009; Vinale и др., 2009). Такие воздействия грибов рода Trichoderma на развитие растений очень важны для применения их в сельском и лесном хозяйстве, а также для понимания роли этих грибов в природных и искусственных экосистемах.

Накоплен огромный фактический материал по использованию грибов рода Trichoderma как продуцентов ферментных препаратов, используемых в сельском хозяйстве для приготовления кормов. Однако недостаточная изученность биохимического состава биомассы видов рода Trichoderma не дает возможности гарантированного и безопасного их использования в кормопроизводстве. Использование грибов рода Trichoderma может быть существенно расширено при решении проблемы переработки сельскохозяйственного сырья и производства кормов животных, содержащих обогащенный селеном мицелий грибов этого рода. Созданные коллекции, на основе новых активных пггаммов из различных экосистем, могут быть потенциалом для отбора штаммов грибов рода Trichoderma и использования их в различных сферах биотехнологии, сельского хозяйства и растениеводства.

Цель работы - отобрать перспективные штаммы рода Trichoderma из коллекции Центра биотехнологии и микологии Сибирского государственного технологического университета для создания биопрепаратов защиты и стимулирования роста растений и для получения кормовых добавок.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- исследовать антагонистическую активность пггаммов рода Trichoderma в отношении фитопатогенных микроорганизмов родов Alternaría, Bipolaris и Fusarium и провести скрининг с целью выбора штаммов для защиты растений;

- изучить активность метаболитов сибирских штаммов рода Trichoderma как стимуляторов роста хвойных и злаковых растений;

- определить биохимический состав биомассы и компонентов культуральной жидкости штаммов рода Trichoderma;

- исследовать влияние селенсодержащих сред на рост и накопление биомассы штаммов рода Trichoderma',

- изучить степень биодеструкции растительных субстратов отобранными штаммами и их выход КОЕ при твердофазном культивировании для обоснования технологии производства;

- провести испытания полученных опытных образцов препаратов против болезней хвойных и злаковых растений на естественных инфекционных фонах.

Научная новизна. Методом многоступенчатого скрининга отобраны перспективные штаммы грибов рода Trichoderma для защиты злаковых культур от корневых гнилей, вызываемых фитопатогенами из родов Alternaría, Bipolaris и

Fusarium.

Впервые установлена ростстимулирующая активность грибов рода Trichoderma в отношении каллусов злаковых и хвойных растений и отобраны перспективные штаммы Г. asperellum «Mg-6» и Т. harzianum «М99/5» для разработки технологии микроклонального размножения ценных видов хвойных растений.

Определены параметры и субстраты для твердофазного культивирования ростстимулирующих штаммов Т. asperellum «Mg-6», Т. harzianum «М99/5» и Т. koningii «TCJI-06».

Определен биохимический состав биомассы и культуральной жидкости штаммов Т. asperellum, Т. harzianum, Т. koningii и Т. viride. Изучено влияние селена на накопление биомассы штаммов рода Trichoderma при поверхностном и глубинном культивировании и показана возможность их использования для получения кормовых добавок.

Практическая значимость работы. Выделены штаммы рода Trichoderma, имеющие потенциальную ценность для производства биопрепаратов защиты растений. Подобран рациональный растительный субстрат для твердофазного культивирования продуцентов. Показана возможность использования штаммов Г. asperellum «Mg-6» и Т. harzianum «М99/5» для переработки отходов предприятий деревообрабатывающей и гидролизной промышленности. Разработана в лабораторных условиях технология получения биопрепарата Триходермин-М.

Наработана опытная партия биопрепаратов, с титром 3.5-109 КОЕ/г, антагонистически активных штаммов. Проведены опытно-производственные испытания биопрепаратов на основе штаммов на сеянцах хвойных в лесном питомнике и культурах злаковых растений. Показано положительное влияние биопрепаратов на увеличение урожайности злаков и выход здоровых сеянцев в питомнике.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 1 и 2 региональной конференции по биологии (Красноярск, 2007, 2008); всероссийской научно-практической конференции «Лесной и химический комплексы: - проблемы и решения» (Красноярск, 2007); международной школе-конференции «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2007); II съезде микологов России (Москва, 2008); всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Красноярск, 2008, 2009); международной научной конференции «Современные средства, методы и технологии защиты растений» (Новосибирск, 2008); 12 международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); VII международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008); 5 съезде биотехнологов России (Москва, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Непрерывное экологическое образование» (Красноярск, 2009).

«Биологический контроль биотехнологии сокультивирования хвойных в культуре in vitro с биопрепаратами рода Trichoderma и Streptomyces»; 10-04-90745 (моб_ст) на прохождение научной стажировки в Московском государственном университете прикладной биотехнологии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителем и сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе выполнения исследований.

Структура и объем работы. Диссертационная работа стоит из введения, 8 глав, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации 220 страниц (основной текст 211 страниц, приложение 8 страниц). Диссертация содержит 36 рисунков и 34 таблицы. Список литературы включает в себя 277 источников, из них 178 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследований, показаны научная новизна и практическая ценность результатов работы.

Глава 1. Обзор литературы содержит анализ и обобщение литературы по использованию грибов рода Trichoderma в биометоде и механизмам биоконтроля фитопатогенов. Проанализированы данные о подходах, используемых в современной систематике этого рода. Показана возможность использования грибов рода Trichoderma для производства кормовых препаратов, обогащенных селеном. Приводится историческая справка о применении биопрепаратов на их основе для защиты растений. Особое внимание уделено поиску и путям отбора активных штаммов и видов как агентов биологического контроля фитопатогенных грибов и стимуляторов роста растений, приведена характеристика антибиотических и ростстимулирующих веществ рода Trichoderma. Показана целесообразность применения биопрепаратов на растительных остатках для улучшения структуры почв и роста растений.

Глава 2. Объекты и методы исследований.

Объекты исследований. В работе использовали 18 моноспоровых штаммов грибов рода Trichoderma, выделенных из почв различных лесорастительных зон Средней Сибири и республики Тыва и обладающих стабильными культурально-морфологическими признаками. Штаммы поддерживаются в коллекции Центра биотехнологии и микологии Сибирского государственного технологического университета.

Оценку антагонистической активности штаммов рода Trichoderma проводили с использованием тест-культур фитопатогенов злаков: Alternaria sp., В. bicolor, В. ellisii, В. nodulosa, В. zeae, F. chlamydosporum, Fi heterosporum, F. sambucinum, F. solani и F. sporotrichioides из коллекции Центра биотехнологии и микологии СибГТУ.

В качестве тест-объектов для определения ростстимулирующей активности были использованы семена и каллусы: лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb), сосны сибирской (Pinus sibirica Du Tour), сосны обыкновенной [Pinus sylvestris L.), пшеницы линии «KC-1554», пшеницы яровой линии «КС-1607», ячменя сорта «Красноярский-80». Эксплантами для индукции каллуса злаковых служили незрелые зародыши семян

ячменя и пшеницы, для хвойных растений использовали незрелые зиготические зародыши элитных деревьев-доноров.

Методы исследования: Идентификацию штаммов рода Trichoderma проводили по кулыурально-морфологическим (Александрова с соавт., 2001; Chaverri и др., 2003; Samuels, 2003) и генетическим признакам (Druzhinina и др., 2005). Морфологическую идентификацию проводили по следующим признакам: строение репродуктивных органов, очертание спор, размеры мицелия (методом сканирующей электронной микроскопии). Для подтверждения видовой принадлежности проводили генетическую идентификацию под руководством д.б.н., проф. Алимовой Ф.К., за что автор выражает ей благодарность. Исследовались участки ядерной рДНК, содержащий ITS1 и 2 и ген tefl. Результаты секвенирования фрагмента гена tef\ обрабатывали при помощи пакета программ Lasergene 5.03 (DNASTAR, Inc., США). Для анализа секвенсных хроматограмм использовали программу SeqMan, для выравнивания последовательностей и экспорта их в формате GCG использовали программу MegAlign. Молекулярную идентификацию нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программы TrichoMark -TrichoBLAST.

Антагонистические свойства штаммов рода Trichoderma, в отношении фигопатогенных микромицетов, оценивали по показателям гиперпаразитической и антибиотической активности. Изучение антибиотической активности проводили методом лунок и перпендикулярных штрихов (Егоров, 1994; Алимова, 2006).

Ростстимулирующее действие метаболитов штаммов рода Trichoderma изучали по показателям энергии прорастания и всхожести семян с использованием метода влажных камер (ГОСТ 13056.5-76). Оценку стимуляции роста каллусов злаков и хвойных растений проводили путем их культивирования с добавлением метаболитов грибов при постоянном освещении и температуре 20-24°С, длительность каждого пассажа составляла 40 суток. Пролиферацию каллусных культур проводили на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 1% и 3% концентрации метаболита в питательную среду. Культуральную жидкость добавляли после автоклавирования питательных сред. Для контрольного варианта использовали среду Мурасиге-Скуга без добавления метаболитов.

Изучение биохимического состава биомассы и метаболитов грибов рода Trichoderma проводили по классическим методам. Общее количество белка определяли по методу Кьельдаля (Емельянова, 1976); аминокислотный состав - на автоматическом аминокислотном анализаторе A0326V2 (Knauer, Германия), общее содержание триптофана изучали спектрофотометрическим методом, разработанным в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, содержание липидов с их последующим разделением на нейтральные, глико - и фосфолипиды - по методу Блайя и Дайера (Кейгс, 1975).

Концентрацию селена в мицелии грибов рода Trichoderma измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии (атомно-абсорбционный спектрометр «Кванг-Z3TA»), Процедуру минерализации проб в аналитических автоклавах проводили в соответствии с МУК 4.1.985-00. Токсикологическую оценку мицелия проводили на установке «Искусственный желудок», разработанной в МГУПБ.

Твердофазное культивирование грибов рода Trichoderma проводили на растительных субстратах: коре пихты исходной и после различных химических

обработок, коре лиственницы; гидролизном лигнине, вегетативной части топинамбура исходного и после водной экстракции. Определение химического состава сырья после биодеструкции проводили по общепринятым в химии растительного сырья методикам (Химия древесины, 1994).

Полевые испытания биопрепаратов на основе активных штаммов проводили на посевах Pinus sibirica в Мининском лесном питомнике, расположенном на территории Мининского опытного лесного хозяйства (56°10'с.ш., 92°42'в.д). Эффективность действия препарата в агроценозе проводили на пшенице линии «КС-1554» и ячмене сорта «Красноярский-80» оценивали после сбора урожая по следующим параметрам: масса 1000 зерен, высота растений, продуктивная кустистость, количество зерен в колосе, количество растений к уборке, урожайность. Для оценки влияния внесения биопрепаратов на микробиоту почв использовали методы, разработанные Д.Г. Звягинцевым (1991) и Й. Сэги (1983).

Эксперимент проводили в трех-пяти повторностях. Статистическую обработку результатов экспериментов и оценку достоверности различий проводили по критерию Стьюдента для уровня вероятности не менее 95% с использованием пакета программ Microsoft Excel 2007 и Statistica 8.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Антагонистическая активность сибирских штаммов грибов рода Trichoderma.

Одним из главных ограничений для широкого использования препаратов на основе грибов-антагонистов рода Trichoderma для защиты растений является зависимость их эффективности от типа почвы, гидротермичеких факторов, состава микробиоты, сортовых особенностей культур, а также экологической ниши, где будет функционировать продуцент. В этом случае целесообразно использование местных штаммов 1рибов рода Trichoderma, как наиболее приспособленных к конкретным почвенно-климатическим условиям. В связи с этим представляют интерес исследования антибиотической и гиперпаразитической активностей штаммов грибов рода Trichoderma в отношении доминирующих в Сибири видов возбудителей болезней растений из родов Fusarium, Bipolaris и Alternaría.

Оценка гиперпаразитической активности показала как гетерогенность штаммов в пределах одного вида, так и межвидовые различия по степени активности изолятов Trichoderma в отношении фитопатогенных микромицетов. Все виды Bipolaris и Alternaría чувствительны к микромицетам рода Trichoderma, тогда как виды рода Fusarium оказались более устойчивыми к антагонистам.

Гиперпаразитическая активность в отношении штаммов фигопатогенов достоверно различалась у всех штаммов Т. asperellum. Максимальную активность в отношении изолятов Bipolaris и Alternaría проявили штаммы «Mg-б» и «30»; другие штаммы этого вида «ТН-5», «ТН-7», «ТН-11» и «119» проявляли минимальную активность в отношении тех же фигопатогенов. Самыми активными штаммами в отношении всех изолятов Fusarium оказались штаммы Т. asperellum «119», «Mg-6» и «Mg-97» и Т. citrinoviride «ТН-4».

Максимальную антибиотическую активность в отношении Alternaría и Bipolaris проявили штаммы Т. koningii «ТСЛ-06» и «ТСГ», Т. asperellum «31» и «119», в отношении Fusarium - Т. asperellum «Mg-6» и Т. koningii «ТСЛ-06». Штаммы Т. asperellum «Mg-97», «ТН-5», «ТН-7», «ТН-11», Г. citrinoviride «МК» и «ТН-4», Т.

harzianum «M99/5» антибиотического действия в отношении всех фитопатогенов Alternaría, Bipolaris и Fusarium не показали.

Анализ активности штаммов рода Trichoderma в отношении комплекса видов Bipolaris и Alternaría методами кластерного анализа показал, что по набору вышеуказанных признаков все штаммы, вне зависимости от видового происхождения, разделяются на два кластера (рисунок 1 А). К первому кластеру был отнесен штамм Т. koningii «TCJI-06», который проявил высокую гиперпаразитическую и максимальную антибиотическую активность в отношении всех видов Bipolaris и Alternaría. Второй кластер разделился на два подкластера: в первый подкластер объединились три штамма: Т. asperellum «31» и «119» и Т. viride «0-97», характеризующиеся средней гиперпаразитической, но высокой антибиотической активностью в отношении большинства штаммов видов Bipolaris и Alternaría. Во второй подкластер объединены все остальные штаммы рода Trichoderma.

Анализ активности штаммов рода Trichoderma в отношении комплекса видов Fusarium позволил условно разделить штаммы-антагонисты на три кластера (рисунок 1Б). В первый кластер вошли два штамма Т. asperellum «Mg-6» и Т. koningii «TCJI-06», характеризующиеся высокой гиперпаразитической и антибиотической активностью по сравнению с другими штаммами. Второй кластер объединил четыре штамма Т. harzianum «М99/5», Т. asperellum «К-12», Т. viride «Lg-2» и «Lg-1», в третий кластер вошли все остальные штаммы, которые проявляли выборочную активность в отношении

Т. harzianum «Унив» Т. viride «Lg-2» Т. harzianum «М99/5» Т. asperellum «Mg-97» Т. citrinoviride «МК» Г. asperellum «К-12» Т. viride «Lg-1» Т. asperellum «Mg-6» Т. asperellum «30» Т. koningii «ТСГ» Т. viride «0-97» Т. asperellum «119» Т. asperellum «31» Т. koningii «ТСЛ-Об»

Уровни сходства (Эвклидово расстояние)

Т. harzianum «У нив» Т. citrinoviride «ТН-4» Т. asperellum «.31» Т. koningii «ТСГ» Т. citrinoviride «МК» Г. asperellum «Mg-97» Т. asperellum «119» Т. viride «0-97» Г. asperellum «30» Г. viride «Lg-I» Т. viride «Lg-2» Т. asperellum «К-12» Т. harzianum «М99/5» Т. koningii «ТСЛ-06» Т. asperellum «Mg-6»

Уровни сходства (Эвклидово расстояние)

Рисунок 1 - Кластерный анализ антагонистической активности в отношении фитопатогенов родов Bipolaris и Alternaría (А); рода Fusarium (Б)

некоторых видов Fusarium.

2.1

Полученные данные свидетельствуют о том, что штаммы состоят из клонов с разной антибиотической активностью, что обуславливает необходимость селекции активных штаммов по отношению к набору штаммов-возбудителей болезней растений.

2. Ростстимулирующая активность штаммов рода Trickoderma

Положительное влияние биологически активных компонентов, продуцируемых видами Trichoderma, на ростовые показатели растений, отмечено на многих промышленно значимых зерновых культурах и древесных видах, однако это зависит от применяемого штамма (Harman и др., 2004; Romano, 2008). Оценка действия на рост растения может способствовать отбору продуцентов препаратов с комплексным воздействием - как стимуляторов роста и как антагонистов фитопатогенных грибов. Штаммы Trichoderma исследованы на способность оказывать ростстимулирующее действие на широком диапазоне растений. В связи с этим, использование биопрепаратов на основе этих грибов может быть расширено, если в качестве одного из главных факторов отбора для штамма определить их способность оказывать стимулирующее действие на рост растения.

На основе кластерного анализа по антагонистической активности были отобраны 8 штаммов рода Trichoderma и проведены исследования их ростстимулирующих свойств в отношении семян злаковых и хвойных растений.

Исследования показали, что штаммы рода Trichoderma, в зависимости от видовой принадлежности, оказывают как стимулирующий, так и ингибирующий эффект на энергию прорастания и всхожесть и биометрические показатели проростков семян злаков. Так, штаммы Т. koningii «ТСЛ-06», Т. koningii «ТСГ» и Т. harzianum «М99/5» проявляют достоверную стимулирующую активность по сравнению с контролем. Все штаммы вида Т. asperellum в различной степени оказывают ингибирующее действие. Остальные исследуемые штаммы не оказывали достоверного действия на энергию прорастания и всхожесть семян. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о различном действии штаммов рода Trichoderma на показатели всхожести и энергии прорастания семян злаков, что необходимо учитывать при их отборе для использования в биоконтроле.

Для установления истинного ростстимулирующего эффекта используемого антагониста необходимо исключить присутствие фитопатогенов при выращивании растений. С этой целью удобно использование культуры каллусов. В результате исследования ростстимулирующего действия метаболитов штаммов на каллусы было установлено, что обработка каллусов ячменя сорта «Красноярский-80» метаболитами штаммов Т. harzianum «М99/5» и Т. koningii «ТСЛ-06» с концентрациями 1% и 3% способствовала значительному увеличению их роста. Максимальный стимулирующий эффект на каллусы злаков оказали метаболиты пггамма Т. harzianum «М99/5»: прирост каллуса при внесении 1% концентрации был в 3.6 раза, а при внесении 3% концентрации - в 3 раза выше контроля. Метаболиты штамма Т. koningii «ТСГ» стимулировали рост каллусов только при добавлении 3%-й концентрации.

Обработка каллусов пшеницы сорта «КС-1607» метаболитами штаммов Т. koningii «ТСЛ-06». и «ТСГ» оказала ингибирующий эффект: прирост каллусов при внесении метаболитов был ниже контрольного варианта. При внесении метаболитов пггамма Т. harzianum «М99/5» в обеих концентрациях различия роста в опытном и контрольном варианте были недостоверны (рисунок 2).

4,00

концентрация

метаболита

концентрация метаболита

■ 1% концентрация метаболита а 3% концентрация метаболита

Рисунок 2 - Влияние метаболитов штаммов рода Тпскойегта на рост каллуса ячменя «Красноярский-80» (А) и каллуса пшеницы сорт «КС-1607» (Б)

По результатам проведенных исследований на семенах и каллусах злаковых растений установлено, что биологически активные компоненты отобранных разных штаммов-антагонистов могут избирательно влиять на развитие растений, оказывая как стимулирующее, так и ингибирующее действие.

Исследования стимулирующего эффекта штаммов рода Тгк1го<1егта на хвойных видах показали, что обработка семян лиственницы сибирской и сосны обыкновенной метаболитами штамма Т. азрегеИит «М§-6» стимулировала как всхожесть, так и энергию прорастания в сравнении с контролем. Обработка метаболитами культуральной жидкости штамма Т. Иатапит «М99/5» увеличивала энергию прорастания и всхожесть семян всех исследуемых видов хвойных растений.

Достоверное стимулирующее влияние метаболитов штамма Т. Иатапит «М99/5» установлено при обработке каллусов всех трех испытуемых хвойных видов (рисунок 3). Наибольший стимулирующий эффект был достигнут при обработке каллусов лиственницы сибирской. Средняя масса каллуса через 40 суток культивирования, оказалась в 1.5 раза больше по сравнению с контролем. При обработке каллусов сосны сибирской объем превышал контрольный в 1.3 раза. Исследования показали, что в течение всего периода культивирования каллусов метаболиты штамма Т. ¡гатапит «М99/5» оказывали ростстимулирующее действие и на каллусы сосны обыкновенной, однако к концу культивирования прирост опытного каллуса достоверно не отличался от контрольного.

2 14000 -

в п 12000 1 / —Тпс1юс1егта

I 110000 - /

в я" | / » «Мв-6»

8000 1 // -*— ТпсЪойегта

" | 6000 1 // Ьагаапит

§2 ! X «М99/5»

А 4000 Н контроль

^ 2000

0 -!--г------,--------т-------

0 10 20 30 40 50 д

900 800

| 3 зоо £ 200 ° 100

к ^ 700 V £

ё *еоо

а 3 500

400

-*— Тпсподегша

—Тгк:Ь<х1егта

Ьагаапит

«М99/5»

контроль

а5реге1Ьт «Ме-6»

1егта

0 10 20 30 40 50

Рисунок 3 - Динамика роста эмбриогенного каллуса лиственницы сибирской (А), сосны сибирской (Б) и сосны обыкновенной (В) при обработке метаболитами Т. аьрегеИит «М§-6» и Т. Иатапит «М99/5»

При введении в питательную среду метаболитов штамма Г. айрегеИит «N^-6» на определенном этапе роста была отмечена стимуляция роста каллуса лиственницы сибирской и сосны сибирской, тогда как к концу культивирования объем опытных и контрольных вариантов каллусов достоверно не различался. При обработке каллусов сосны обыкновенной штамм Т. айрегеПит «1^-6» достоверно снижал их прирост в 1.5 раза в сравнении с контролем. Из этого следует, что при использовании этого штамма в биоконтроле можно ожидать только эффект подавления фитопатогенных микромицетов, но не ростостимулирующее действие на сеянцы.

В результате проведенных испытаний на семенах и каллусных культурах хвойных растений было установлено, что действие метаболитов штаммов Т. катапит «М99/5» и Т. аврегеИит «1^-6» на растительный организм не видоспецифично. Объекты каждого вида избирательно реагировали на виды грибов рода ТгккоеЗегта. Результаты очевидно показывают ростстимулирующий эффект штамма Т. Иатапит «М99/5» на каллусы хвойных, тогда как оба штамма стимулируют прорастание семян. Можно предположить, что такое стимулирующее действие метаболитов Т. аярегеИит «М£-6» на семена достигается активацией иммунитета растения и подавления внутрисемейной инфекции. Тогда как метаболиты штамма Т. каЫапит «М99/5» оказывают еще и непосредственный ростстимулирующий эффект за счет биосинтеза специфических соединений.

3. Возможности использования грибов рода Тпскойегта для получения кормовых добавок

Способность видов рода Тг1сИос!егта утилизировать широкий набор субстратов, технологичность, сравнительно высокая скорость роста и низкая токсичность в отношении растений и животных предполагают возможность их использования, наряду с традиционными для этого рода отраслями биотехнологии, для разработки кормовых добавок и Б АД. Для рекомендации микромицетов как продуцентов кормовых препаратов и БАДов обязательным условием является определение белков и липидов в биомассе, как наиболее ценных компонентов, принимающих участие в важнейших функциях организма.

Для определения общего содержания белка грибов рода Тпскойегта использовали биомассу и культуральную жидкость штаммов Т. азрегеИит «М£-6»,

«ТН-5», «ТН-7» и «ТН-11», Т. каЫапит «М99/5», Т. котп%и «ТСЛ-06» и «ТСГ», Т. У1пс!е «Ь§-1» и «1^-2».

Исследования показали, что наибольшее количество белка содержится в биомассе штаммов Т. азрегеПит «ТН-11» и «ТН-5», Т. катапит «М99/5» и Т. котщи «ТСЛ-06», которое составило 22.43 и 21.88%, 20.14% и 18.50%, соответственно. Эти же штаммы грибов рода Тпс}юс1егта накапливали белок и в культуральной жидкости от 1.26 до 1.54% (таблица 1). Сравнительная оценка аминокислотного состава мицелия штаммов показала, что в исследуемых образцах общее содержание аминокислот составляет от 14.91 до 21.77% от сухого веса. Общее количество незаменимых для сельскохозяйственных животных и птицы аминокислот от общей суммы аминокислот в чистой культуре мицелия штаммов «1у^-6», «ТН-5», «ТН-7» и «ТН-11» вида Т. азрегеИит и Т. катапит «М99/5» составляет 54.12; 56.87; 60.13 и 57.58% соответственно. Причем среди незаменимых аминокислот в мицелии исследуемых штаммов преобладают такие как лизин, аргинин и лейцин, лимитированные в растительных кормах для животных.

Липиды, наряду с белками, занимают важное место среди биологически активных веществ, причем их ценность тем выше, чем больше в их составе важных в биологическом отношении фосфолипидов (Феофилова, 2008,2009).

Исследования липидной фракции штаммов показали, что общее содержание липидов в биомассе микромицетов рода Тгккойегта составляет от 4.21 до 13.57%. Сравнительный анализ определения доли общих липидов в биомассе изучаемых микромицетов показал, что наибольшее их количество содержат штаммы вида Т. аврегеНит - «ТН-11», «1^-6», «ТН-7» и «ТН-5» от 10.99 до 13.57% (таблица 1).

Таблица 1

Содержание белков и липидов в биомассе и метаболитах грибов рода Тпскойегта, %__

Штаммы Белки Липиды

Биомасса Культур альная жидкость Биомасса Культуральная жидкость

Тпс1гос1егта аярегеИит «1^-6» 16.43±0.65 0.57±0.05 13.13±0,48 1.36±0,01

ТпсЪойегта азрегеЦит «ТН-5» 21.88±0.71 1.38±0.03 10.99±0,17 0.88±0,15

Тг1с1гос1егта аярегеПит «ТН-7» 17.71±0.58 0.71±0.03 12.70±0,63 0.50±0,01

ТпсИойегта аярегеИит «ТН-11» 22.43±0.79 ' 1,26±0.03 13.57±0,42 0.57±0,05

Тпскойегта Иатапит «М99/5» 20.14±0.78 1.41±0.12 4.92±0,12 0.40±0,11

Тпс1го<1егта котп^П «ТСЛ-06» 18.50±0.84 1.54±0.25 8.79±0,14 0.21±0,01

ТгкИос1егта копт^и «ТСГ» 15.17±0.55 0.22±0.03 4.21±0,48 1.82±0,07

ТпсЪобегта \iride «Ьд-1». 16.33±0.67 0.44±0.11 6.91±0,23 1.83±0,02

Тпс1гос1егта \iride «Ьй-2» 15.67±0.50 0.37±0.03 4.38±0,56 1.63±0,02

В составе липидов биомассы и культуральной жидкости микромицетов рода ТгкУюйегта преобладают гликолипиды, на втором месте нейтральные, затем фосфолипиды. Наибольшее содержание гликолипидов отмечено у штаммов вида Т. азрегеИит - «N^-6», «ТН-5» и «ТН-11» (71.07, 72.79 и 68.06% от общей фракции соответственно). Нейтральные липиды в значительном количестве были обнаружены в биомассе штаммов Т. копщи «ТСЛ-06» (35.53%), Т. Иатапит «М99/5» (33.83%).

Наибольшее содержание фосфолипидов выявлено у штаммов Т. аярегеИит «ТН-7» и Т. \iride «Ья-1» (18.55 и 18.38%).

По результатам исследования количества белков и липидов в биомассе грибов ТпсИос1егта были отобраны 4 штамма, перспективных для получения кормовых препаратов: Т. аярегеИит «ТН-5» «ТН-7» и «ТН-11», Т. ИаЫапит «М99/5» которые были оценены на взаимодействие с селеном в дальнейших исследованиях.

Обогащение микроэлементами сред при культивировании грибов может стать перспективным источником получения кормовых добавок, содержащих органические формы селена в мицелии. Проведенные исследования по влиянию селена на прорастание спор штаммов Trichoderma показали, что они обладают различной чувствительностью к изменению концентрации селена в среде. При концентрациях элемента в среде 15 мг/л прорастаемость спор достоверно не отличалась от контроля, при концентрации 20 мг/л имело место стимулирование роста грибов, а доза 25 мг/л достоверно ингибировала прорастание спор. Добавление селена в количестве 20 мг/л приводило к подавлению или задержке роста штаммов в условиях стационарного культивирования без перемешивания. При глубинном культивировании токсическое действие селена в концентрации проявлялось слабее и снижение урожая биомассы не было отмечено для всех исследуемых штаммов. Для штамма Т. а$регеИит «ТН-5» установлено увеличение выхода биомассы по сравнению с контролем на 1.2% (таблица 3).

Таблица 3

Накопление биомассы штаммами Trichoderma при глубинном культивировании на 10 сутки, г а.с.в.___

Штаммы Контроль Концентрация селена, 20 мг/л

Trichoderma а$реге\\ит «ТН-5» 4.38±0,10 5.28±0,12

Trichoderma айрегеИит «ТН-7» 3.49±0,09 3.88±0,08

Trichoderma аврегеИит «ТН-11» 3.80±0,09 3.89±0,09

Trichoderma кап'шпит «М99/5» 4.97±0,11 4.81±0,11

Проведенные исследования показали, что при содержании селена 20 мг/л в среде в условиях стационарного культивирования без перемешивания штаммы накапливали от 10.76 до 27.43 мкг/г сухой биомассы. В условиях глубинного культивирования наибольшее количество селена накапливалось в мицелии штамма Т. аярегеНит «ТН-5» и составляло 937.5 мкг/г (таблица 4).

Таблица 4

Содержание селена в биомассе штаммов рода ^¡^(»¿егта при глубинном культивировании, мкг/г__

Штаммы Контроль Концентрация селена, 20 мг/л

Trichoderma азрегеНит «ТН-5» 0,48 937,5

Trichoderma аврегеИит «ТН-11» 0,65 805,3

Trichoderma катапит «М99/5» 0,06 334,3

С помощью установки искусственный желудок было установлено, что биомасса мицелия отобранного штамма Т. айрегеИит «ТН-5» с селеном и без селена не

является токсичной и может быть использована в качестве кормовой селенсодержащей добавки.

4. Твердофазное культивирование грибов рода ТпсЬоЛетта на растительных субстратах

Успех использования биологического метода защиты растений зависит не только от подбора высокоэффективного штамма рода ТпсУюйегта, но и в равной мере от качества полученного биопрепарата на его основе. Твердофазным способом биопрепараты получают на отходах агропромышленного комплекса. Перспективным является расширение сырьевой базы для производства биопрепаратов наиболее распространенных отходов деревообрабатывающей промышленности, которые при внесении одновременно улучшают структуру почв. Для подбора дешевых и экологически чистых субстратов была проведена оценка способности биодеструкции отходов сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности штаммами грибов рода Гпс1гос1егта (Т. азрегеИит «М§-6», Т. коп^И «ТСЛ-06» и Т. Иатапит «М99/5») отобранными по антагонистической и ростстимулирующей активности для производства биопрепаратов.

При росте на исследуемых растительных субстратах образуются конидиеносцы с конидиями, форма и размеры которых не отличаются от органов бесполого спороношения, формирующихся при росте на стандартных питательных средах. Однако титр данных штаммов различается. Так, наибольший выход КОЕ штамма Т. сирегеПит «1^-6» отмечен на коре пихты исходной, выход спор составил 3.5-109, топинамбуре исходном - 3,4-109 и коре пихты после экстракции изопропанолом -3.22-109 (таблица 5). Предварительная химическая обработка различными органическими растворителями либо не повышает степень доступности сырья для деструкции штаммов, либо оказывает ингибирующий эффект на рост грибов. Таким образом, для наработки препарата можно использовать отходы без предварительной химической обработки.

Таблица 5

Титр (КОЕ/г) штаммов рода Тпскойегта на растительных субстратах на 15 сутки культивирования_._ ___

Субстрат Т. азрегеЦит «Мё-6» Т. каЫапит «М99/5» Т. копщи «ТСЛ-06»

Гидролизный лигнин 1.60-10" 2.00-10' 2.90-107

Кора лиственницы после СОг-экстракции 3.30-10' 1.10-10' 2.60-10'

Кора пихты:

- исходная 3.50-Ю9 1.33-109 1.24-109

- после экстракции гексаном 4.00-10" 0.90-10" 0.50-10"

- после экстракции горячей водой 3.00-10" 7.80-10' 6.50-10"

- после экстракции изопропанолом 3.22-10" 5.30-10" 5.10-10"

- после экстракции холодной водой 2.86-10" 3.00-10" 3.60-10"

Топинамбур:

- исходный 3.40-10У 2.20-109 2.70-10У

- после водной экстракции 1.90-10" 2.10-108 3.70-10"

Скрининг штаммов для получения биологических препаратов на растительных субстратах должен определяться не только их антагонистической активностью, но и способностью усваивать при твердофазном культивировании используемый субстрат. В дальнейшем была исследована степень биодеструкции грибами рода Тпскос1егта трех субстратов: гидролизный лигнине, коре пихты и вегетативной части топинамбура. О результатах эффективности воздействия ферментативного комплекса штаммов рода Тгккоёегта на лигноуглеводные субстраты судили по изменению целлюлозных и лигниновых компонентов, а также накоплению гуминовых веществ (таблицы 6 и 7).

Наибольшей степени деструкции подвергались компоненты коры пихты. Из всех исследуемых субстратов максимальное снижение легкогидролизуемых и трудногидролизуемых полисахаридов отмечено при росте штамма Т. азрегеПит «М§-6» на коре пихты, при этом количество легкогидролизуемых полисахаридов по сравнению с исходным сырьем уменьшилось в 1.3 раза, трудногидролизуемых полисахаридов - в 1.7 раза.

При росте штамма Т. Иагг1апит «М99/5» содержание легкогидролизуемых и трудногидролизуемых полисахаридов снижалось на 16% на гидролизном лигнине, на 24% на топинамбуре и на 27% на коре пихты. При росте штамма Т. коп^и «ТСЛ-06» содержание легкогидролизуемых и трудногидролизуемых полисахаридов на тех же субстратах снижалось на 19%, 20% и 32%, соответственно.

Процесс деструкции лигноуглеводного комплекса сопровождается образованием гуминовых веществ. Наши исследования показали, что образование гуминовых кислот отмечено у всех штаммов на трех типах субстратов, однако их количество зависит от типа субстрата и самого продуцента. Наибольшее количество гуминовых веществ отмечено в результате культивирования штамма Т. азрегеИит «М§-6» на коре пихты и составило 11.8%.

Таблица 6

Химический состав коры пихты исходной до и после биодеструкции %, а.с.с.

Показатели До биодеструкции После биодеструкции штаммами

Т. азрегеИит Т. катапит «М99/5» Т. коп^Н «ТСЛ-06»

Легкогидролизуемые полисахариды 16.70 13.22 12.70 14.27

Трудногидролизуемые полисахариды 20.80 12.20 14.54 11.16

Сумма полисахаридов 37.50 25.42 27.24 25.43

Лигниновые вещества 43.50 47.30 46.40 48.20

Гуминовые вещества - 11.80 8.90 5.70

Белок 3.29 3.93 3.85 3.62

Зола 8.50 4.40 5.10 4.30

При культивировании штамма Т. азрегеИит «\lg-6» на гидролизном лигнине снижение содержания лигниновых веществ было более значительно по сравнению с другими штаммами, что можно объяснить его более высокой фенолоксидазной активностью (Махова, 2003).

Таблица 7

Химический состав гидролизного лигнина до и после биодеструкции %, а.с.с. с учетом убыли массы __

Показатели До биодеструкции После биодеструкции штаммами

Т. сярегеИит «Мя-6» Т. Иагггапит «М99/5» Т. котщи «ТСЛ-06»

Легкогидролизуемые полисахариды 2.98 1.58 1.21 1.42

Трудногидролизуемые полисахариды 9.52 9.08 9.22 8.76

Сумма полисахаридов 12.50 10.66 10.43 10.18

Лигниновые вещества 71.05 63.09 68.54 69.23

Гуминовые вещества - 11.32 10.90 1.80

Белок 2.79 3.31 3.53 3.26

Зола 7.40 4.40 5.10 5.62

Таким образом, по совокупности показателей для получения биопрепарата были рекомендованы кора пихты в качестве субстрата и штаммы Т. сирегейит «1^-6» и Т. каЫапит «М99/5» как продуценты. Предпосылками для использования коры пихты в качестве сырья для производства биопрепарата являются ее высокий гумусообразующий потенциал и максимальная доступность для ферментативной системы продуцентов.

Исследования, проведенные в лабораторных условиях, позволили разработать технологию получения биопрепарата Триходермин-М на основе штаммов Т. аврегеИит «М§-6» и Т. Иагггапит «М99/5».

5. Оценка эффективности использования биопрепаратов на основе штаммов грибов рода ТпсНойегта в полевых условиях.

Опытные партии биопрепаратов Триходермин-М в виде порошка были наработаны и испытаны на посевах пшеницы сорта «КС-1554» и ячменя сорта «Красноярский-80» на Мининском опытно-производственном поле КНИИСХ и на территории Мининского лесного питомника на посевах Рта вШпса Ь.

Исследование влияния биопрепарата на урожай злаковых культур показало, что для ячменя достоверное увеличение в сравнении с контролем наблюдается по трем показателям из шести (количество зерен в колосе, растений к уборке, урожайность), а для пшеницы по двум (количество зерен в колосе и масса 1000 зерен).

Обработка посевов сосны сибирской биопрепаратом повысила число всходов на 25.6% и выход сеянцев 1-го года на 35.7% от контроля.

Оценка внутренней инфекции семян полученного урожая злаковых, выращенных при использовании препарата Триходермин-М, показала уменьшение внутренней инфекции фигопатогенами в 1.3 раза в опыте с пшеницей и в 2 раза в опыте с ячменем по сравнению с контрольными семенами.

Исследование состава микрофлоры почвы при посеве злаковых показало, что при использовании биопрепарата Триходермин-М происходят изменения количественного отношения состава микроорганизмов. При посевах пшеницы и ячменя по сравнению с исходной почвой, как в контроле, так и в случае применения биопрепарата, наблюдается значительное увеличение количества аммонификаторов в

почве, при этом их количество в присутствии препарата Триходермин-М на 25% выше, чем в контроле. Численность азотфиксаторов к концу сезона уменьшается, при внесении биопрепарата наблюдается уменьшение на 10% по сравнению с контролем.

Исследование состава микрофлоры почвы при посеве сосны сибирской показало, что, как в контрольном варианте, так и в присутствии триходермина, по сравнению с исходной почвой происходит уменьшение аммонификаторов на 18 и 39%, соответственно. При использовании препарата численность азотфиксаторов тоже уменьшается, а актиномицетов увеличивается на 42%.

Сравнение комплексов микромицетов, заселяющих почвы, до и после обработки триходермином, позволило установить, что они различаются как по богатству видов, так и по частоте встречаемости. Наибольшее видовое разнообразие характерно для комплекса микромицетов прикорневой зоны пшеницы и ячменя, выращенной в контроле. Доминирующее положение среди сапротрофов занимали грибы, относящиеся к родам Pénicillium и Aspergillus. Наиболее существенные изменения в структуре комплекса микромицетов прикорневой зоны пшеницы и ячменя были обнаружены при обработке триходермином. Отмечено уменьшение видового разнообразия грибов, что свидетельствует о глубине сдвигов в микоценозе. Резко снизилась популяционная плотность возбудителей корневых гнилей родов Alternaria и Bipolaris. После обработки триходермином посевов сосны сибирской отмечено уменьшение популяционной плотности возбудителей заболеваний растений рода Fusarium, снизилась не только частота встречаемости в структуре сообщества, но и их жизнеспособность. Таким образом, интродуцированные штаммы изменяют структуру микобиоты, подавляя фитопатогены и увеличивая долю сапротрофных групп организмов.

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

6. Технологическая схема получения биопрепарата Триходермин-М

Блок-схема получения биопрепарата Триходермин-М на основе штаммов Т. asperellum «Mg-6» и T. harzianum «М99/5» приведена на рисунке 6. Кора пихты, измельченная до 3-5 мм, стерилизуется и направляется в растильную установку. Посевной материал получают выращиванием на качалке на среде Чапека. Суспензия вносится в субстрат из расчета 1x106 КОЕ/г а.с.с. Вытяжной вентилятор обеспечивает подачу и удаление воздуха. На подающей и вытяжной линиях воздуха устанавливают фильтры для бактериальной очистки воздуха.

Рисунок 6 - Блок-схема получения биопрепарата

Процесс культивирования грибов рода Trichoderma в растильной камере протекает в следующих условиях: влажность субстрата - 70-75%, температура - 25-27°С. Через 15 суток культивирования гриба ферментационная масса высушивается при температуре до влажности 5-8% и стерильно расфасовывается.

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований 18 штаммов рода Trichoderma показано, что в пределах одного вида штаммы имеют неодинаковую гиперпаразитическую и антибиотическую активность, поэтому принадлежность к виду не может служить определяющим фактором для отбора продуцентов препаратов защиты растений. Высокой антагонистической, активностью в отношении фитопатогенов злаков родов Bipolaris, Alternaría, Fusarium обладают штаммы Т. asperellum «Mg-6», Т. harzianum «М99/5» и Т. koningii «TCJI-06».

2. В экспериментах in vitro и in vivo на каллусах и семенах показано, что положительное действие на рост злаковых и древесных растений обусловлено не только подавлением фитопатогенов, но и биосинтезом ростстимулирующих метаболитов штаммами Т. asperellum «Mg-6» и Т. harzianum «М99/5». Это дает возможность использования этого свойства как фактора отбора штаммов для создания новых высокоэффективных биопрепаратов для защиты от болезней и повышения продуктивности растений.

Для получения высокопродуктивных и устойчивых к патогенам растений при микроклональном размножении из каллусов перспективно использование биологически активных метаболитов штаммов Т. asperellum «Mg-6» и Т. harzianum «М99/5».

3. На основе изучения биохимического состава мицелия показана возможность использования штаммов грибов рода Trichoderma в качестве продуцентов кормового препарата и отобраны культуры, перспективные для получения БАД.

- Количество бежа, содержащееся в биомассе штаммов Т. asperellum «ТН-11» и «ТН-5», Т. harzianum «М99/5» и Т. koningii «TCJI-06», составляет от 18.50% до 22.43%. Качественный состав аминокислот белка мицелия штаммов характеризуется наличием незаменимых аминокислот: лизина, триптофана, аргинина и лейцина, лимитированного в растительных кормах, использующихся для животных.

- Общее содержание липидов в биомассе микромицетов рода Trichoderma составляет от 4.21 до 13.57%. В составе липидов биомассы и культуральной жидкости микромицетов рода Trichoderma преобладают гликолипиды, на втором месте нейтральные, затем фосфолипиды

4. Исследовано влияние селена на рост и продуктивность штаммов грибов рода Trichoderma.

- Определены условия культивирования штаммов и оптимальная доза 20 мг/л селена в питательной среде. Показано, что наибольшее количество селена накапливается в мицелии грибов в условиях глубинного культивирования и составляет от 334.3 до 937.5 мкг/г в зависимости от штамма.

- На основании сравнительной оценки влияния селена на продуктивность биомассы грибов был отобран штамм Т. asperellum «ТН-5», биомасса которого не является токсичной и может быть использована в качестве кормовой селенсодержащей добавки.

- получена селенсодержащая кормовая добавка с содержанием белка не менее

22%, селена 93.75 мг/г и определена ее переварнваемость, обеспечивающая активность пепсина 0.213 ТЕ.

5. Исследован процесс биодеструкции растительных отходов: коры пихты, гидролизного лигнина и твердого остатка топинамбура сибирскими штаммами рода Trichoderma;

- Показано, что все исследуемые штаммы рода Trichoderma способны использовать в качестве субстратов древесные отходы техногенной сферы и твердый остаток топинамбура.

- На основании сравнительной оценки ростовых показателей исследуемых штаммов определены условия культивирования на коре пихты, обеспечивающие титр КОЕ у штаммов Т. asperellum «Mg-6» 3.50-109и Т. harzianum «М99/5» 1.33-109.

Изучена биодеструкция растительных отходов при твердофазном культивировании антагонистически активных штаммов Т. asperellum «Mg-6», Т. harzianum «М99/5» и Т. koningii «TCJI-06», обеспечивающая снижение в биомассе легко- и трудногидролизуемых полисахаридов и относительное накопление гуминовых соединений. При культавировании штамма Т. asperellum «Mg-6» на коре пихты и лигнине количество гуминовых веществ составляло 11.80% и 11.32% на а.с.с., при культивировании штамма Т. harzianum «М99/5» 8.90% и 10.90% на а.с.с., соответственно.

6. В лабораторных условиях разработана технологическая схема получения биопрепарата Триходермин-М твердофазным культивированием штаммов Т. asperellum «Mg-6» и Т. harzianum «М99/5» на коре пихты.

- Биопрепарат получен в виде воздушно-сухого порошка коричневого цвета с титром КОЕ 3.5х109 спор/г. Испытания опытных партий биопрепарата показали его эффективность в защите от фитопатогенов злаков и хвойных, повышении продуктивности ячменя и пшеницы, снижения инфекции урожая новой репродукции, а также увеличение выхода здоровых сеянцев сосны сибирской.

- Внесение биопрепарата приводит к изменению структуры микобиоты почв, снижению численности фитопатогенов и увеличению доли сапротрофных групп организмов, использующих минеральные формы азота, и обеспечивает интенсивность деструкционных процессов в почве.

Список публикаций по теме диссертации: Статьи в рецензируемых журналах

1. Гайдашева И.И., Садыкова B.C., Бондарь П.Н., Зобова Н.В., Громовых Т.И. Перспективы использования новых биопрепаратов для защиты злаков в Средней Сибири // Вестник КрасГАУ. - 2008. - №1(22). - с. 74-78;

2. Третьякова И.Н., Садыкова B.C., Носкова Н.П., Бондарь П.Н., Гайдашева И.И., Громовых Т.И., Иваницкая A.C., Ижболдина М.В., Барсукова A.B. Ростстимулирующая активность штаммов рода Streptomyces и Trichoderma и перспективы их использования для микроклонального размножения хвойных // Биотехнология. - 2009. - №1. - с. 39-44;

3. Садыкова B.C., Третьякова И.Н., Носкова Н.Е., Бондарь П.Н. Антагонистическая и ростстимулирующая активность штаммов родов Trichoderma и перспективы их использования в биоконтроле // Иммунопатология, аллергология, инфекгология. - 2009. - №2. - с. 71-72;

4. Бондарь П.Н., Громовых Т.И., Садыкова B.C. Ростстимулирующая активность сибирских штаммов рода Trichoderma в отношении злаковых растений // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2010. - №1. - с. 89;

5. Садыкова B.C., Бондарь П.Н. Перспективы использования грибов рода Trichoderma в защите злаков от корневых гнилей в Сибири // Вестник КрасГАУ. -2010. -№2(41).- с. 34-39;

6. Садыкова B.C., Лихачев А.Н., Бондарь П.Н. Ограничение развития комплекса возбудителей корневых гнилей ячменя антагонистами рода Trichoderma // Микология и фитопатология. - 2010. - Т.44, Вып.6 - с. 556-562.

Тезисы докладов и публикации в материалах конференций

1. Садыкова B.C., Бондарь П.Н., Рязанова Т.В., Ушанова В.М. Оценка возможности использования сибирских штаммов Trichoderma для создания биопрепаратов защиты растений // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Лесной и химический комплексы - проблемы и решения». -Красноярск, 2007. - Т. 2 - с. 7-11;

2. Бондарь П.Н, Савицкая А.Г.. Разработка биопрепаратов на основе биоконтрольных штаммов Trichoderma с использованием растительных отходов техногенной сферы // Материалы 1-ой региональной студенческой научной конференции по биологии. Сибирский федеральный университет, Красноярск, 2007;

3. Бондарь П.Н., Савицкая А.Г. Перспективы получения препаратов защиты растений с использованием растительных отходов техногенной сферы // Материалы международной школы-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий». - Абакан, 2007. - с. 50-51;

4. Садыкова B.C., Бондарь П.Н., Савицкая А.Г. Оценка возможности использования сибирских штаммов Trichoderma для создания биопрепаратов защиты растений // Тезисы докладов второго съезда микологов России. Современная микология в России. - Москва, 2008. - с. 122;

5. Бондарь П.Н., Садыкова B.C., Медведева М.Г. Скрининг штаммов рода Trichoderma - продуцентов биопрепаратов защиты растений от корневых гнилей злаковых // Материалы всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Непрерывное экологическое образование и экологические проблемы». - Красноярск, 2008. - с. 233;

6. Бондарь П.Н., Садыкова B.C., Ушанова В.М., Савицкая А.Г, Биотехнологические аспекты отбора активных штаммов Trichoderma для создания препаратов защиты растений // Материалы международной научной конференции «Современные средства, методы и технологии защиты растений». - Новосибирск, 2008.-с. 30-34;

7. Бондарь П.Н., Барсукова A.B., Ижболдина М.В. Оценка возможности использования сибирских штаммов Trichoderma для создания биопрепаратов нового поколения // Материалы 12-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». - Пущино, 2008. - с. 197-198;

8. Бондарь П.Н., Гайдашева И.И. Влияние биопрепаратов защиты растений на продуктивность злаков в Средней Сибири // Материалы VII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - Москва, 2008. - с. 5-7;

9. Садыкова B.C., Громовых Т.И., Третьякова И.Н., Бондарь П.Н., Носкова Н.Е. Антагонистическая и ростстимулирующая активность штаммов родов Trichoderma и Streptomyces и перспективы их использования в биоконтроле // Материалы 5 съезда биотехнологов России. - Москва, 2008. - с. 286-288;

10. Савицкая А.Г., Бондарь П.Н. Перспективы получения препаратов защиты растений с использованием растительных отходов техногенной // Материалы всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки». - Красноярск, 2009. - Т. 2. - с. 151-

11. Бондарь П.Н., Ижболдина М.В., Барсукова A.B. Оценка возможности использования сибирских штаммов Trichoderma для создания биопрепаратов защиты растений нового поколения // Материалы всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Непрерывное экологическое образование и экологические проблемы». - Красноярск, 2009. - с. 216-217;

12. Бондарь П.Н., Барсукова A.B., Сиренко A.C. Оценка биологической активности сибирских штаммов Trichoderma и перспективы их использования для микроклонального размножения хвойных растений // Материалы всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки». - Красноярск, 2009. - Т. 1.-е. 109-114;

13. Куляшина Т.А., Бондарь П.Н. Использование коры пихты для получения биопрепарата // Материалы всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки». -Красноярск, 2009,- Т. 1. - с. 245-249.

156;

Подписано в печать 22.12.2010. Формат 60x841/8. Усл. печ. 1,0. Изд. № 6/15(2010). Заказ ЛЬ 1018. Тираж 130 экз.

Редакционно-издательский центр СибГТУ 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 82 факс (391) 211-97-25, тел. (391) 227-69-90

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бондарь, Полина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общая характеристика и распространение грибов рода ТпсИ ос1егта.

1.2 Биологические свойства и механизмы действия грибов рода Тпскос1егта.

1.2.1 Микопаразитические свойства и литические ферменты грибов.

1.2.2 Антибиотические свойства и летучие соединения грибов рода Тпскос1егта.

1.3 Влияние грибов на рост и развитие растений.

1.3.1 Положительное влияние видов рода ТИскоЛ.егта на растения.

1.3.2 Фитотоскичные свойства и отрицательное действие на растения.

1.4 Биологически активные кормовые препараты с дополнительным внесением селена в сельском хозяйстве.

1.5 Биотехнологические аспекты создания препаратов на основе грйбов рода ТпскоЛегта.

1.5.1 Препараты - триходермины, использующиеся в мировой практике борьбы с болезнями.

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Объекты исследований.

2.2 Методы исследований.

2.2.1 Определение антагонистической активности штаммов грибов рода Тпскос1егта.

2.2.2 Исследование ростстимулирующей и фитотоксической активностей грибов рода Тпскос1егта.

2.2.3 Изучение возможности использования штаммов ТпсИос^егта для получения кормовых добавок.

2.2.4 Твердофазное культивирование штаммов грибов, рода Тпскос1егта на растительных субстратах.

2.2.5 Определение показателей продуктивности зерновых культур.

2.2.6 Оценка влияния грибов рода Trichoderma на микрофлору ризосферы растений в питомнике.

2.2.7 Статистическая обработка полученных результатов.

ГЛАВА 3 АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СИБИРСКИХ

ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA.

3.1 Гиперпаразитическая активность грибов рода Trichoderma в отношении грибов родов Alternaría, Bipolaris, Fusarium,.

3.2 Антибиотическая активность штаммов грибов рода Trichoderma в отношении фитопатогенных микромицетов.

ГЛАВА 4 РОСТСТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA.

4.1 Влияние метаболитов штаммов рода Trichoderma на прорастание семян и рост каллусов злаковых растений.

4.2 Влияние метаболитов штаммов рода Trichoderma на прорастание семян и рост каллусов хвойных растений.

ГЛАВА 5 ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ШТАММОВ TRICHODERMA ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВЫХ ДОБАВОК.

5.1 Биохимический состав биомассы и метаболитов штаммов рода Trichoderma.

5.2 Оценка влияния селена на рост и накопление биомассы штаммами рода Trichoderma.

5.3 Содержание селена в биомассе штаммов Trichoderma.

ГЛАВА 6 ТВЕРДОФАЗНАЯ ФЕРМЕНТАЦИЯ ГРИБОВ РОДА

TRICHODERMA НА РАСТИТЕЛЬНЫХ СУБСТРАТАХ.

ГЛАВА 7 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА

TRICHODERMA В ПОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ.

7.1 Эффективность использования биопрепарата-триходермина.

7.2 Оценка влияния биопрепарата-триходермина на биологические процессы почв в полевых условиях.

ГЛАВА 8 ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ.

8.1 Область применения.

8.2 Технические требования.

8.3 Требования безопасности.

8.4 Приемка.

8.5 Методы контроля.

8.6 Хранение.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Штаммы грибов рода Trichoderma (Pers.: Fr.) как основа для создания биопрепаратов защиты растений и кормовых добавок"

Грибы рода Trichoderma широко используются как биологические агенты для контроля возбудителей заболеваний растений (Harman, Bjorkman, 1998; Steward и др., 2006; Vinale и др., 2006). При рекомендации штамма-продуцента для создания биопрепаратов учитывается, как правило, его способность подавлять ряд фитопатогенных грибов и технологичность штамма. В последнее время появились сведения, что разные виды рода Trichoderma способны также вырабатывать фитогормоны (ауксины, этилен, цитокинины) и оказывать, помимо защитных свойств, прямое стимулирующее действие на рост растения (Ousley и др., 1993; Berg, 2009; Vinale и др., 2009). Такие воздействия грибов рода Trichoderma на развитие растений очень важны для применения их в сельском и лесном хозяйстве, а также для понимания роли этих грибов в природных и искусственных экосистемах.

Накоплен огромный фактический материал по использованию грибов рода Trichoderma как продуцентов ферментных препаратов, используемых в сельском хозяйстве для приготовления кормов. Однако недостаточная изученность биохимического состава биомассы видов рода Trichoderma не дает возможности гарантированного и безопасного их использования в кормопроизводстве. Использование грибов рода Trichoderma может быть существенно расширено при решении проблемы переработки сельскохозяйственного сырья и производства кормов животных, содержащих обогащенный селеном мицелий грибов этого рода. Созданные коллекции, на основе новых активных штаммов из различных экосистем, могут быть потенциалом для отбора штаммов грибов рода Trichoderma и использования их в различных сферах биотехнологии, сельского хозяйства и растениеводства.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: ■ - исследовать антагонистическую активность штаммов рода Trichoderma в отношении фитопатогенных микроорганизмов родов Alternaría, Bipolaris и Fusarium и провести скрининг с целью выбора штаммов для защиты растений;

- определить биохимический состав биомассы и компонентов культуральной жидкости штаммов рода Trichoderma;

- исследовать влияние селенсодержащих сред на рост и накопление биомассы штаммов рода Trichoderma;

Впервые установлена ростстимулирующая активность грибов рода Trichoderma в отношении каллусов злаковых и хвойных растений и отобраны перспективные штаммы Т. asperellum «Mg-6» и Т. harzianum «М99/5» для разработки технологии микроклонального размножения ценных видов хвойных растений.

Определены параметры и субстраты для твердофазного культивирования ростстимулирующих штаммов Т. asperellum «Mg-6», Т. harzianum «М99/5» и

Т. koningii «ТСЛ-06».

Практическая значимость работы. Выделены штаммы рода Trichoderma, имеющие потенциальную ценность для производства „ биопрепаратов защиты растений. Подобран рациональный растительный субстрат для твердофазного культивирования продуцентов. Показана возможность использования штаммов Т. asperellum «Mg-б» и Т. harzianum «М99/5» для переработки отходов предприятий деревообрабатывающей и гидролизной промышленности. Разработана в лабораторных условиях технология получения биопрепарата Триходермин-М.

Наработана опытная партия биопрепаратов, с титром 3.5 ■109 КОЕ/г, антагонистически активных штаммов. Проведены опытно-производственные испытания биопрепаратов на основе штаммов на сеянцах хвойных в лесном питомнике и культурах злаковых растений. Показано положительное влияние биопрепаратов на увеличение урожайности злаков и выход здоровых сеянцев в питомнике.

Работа выполнена при финансовой поддержке следующих грантов: РФФИ-офи - №06-04-08040-офи «Создание высокопродуктивных, устойчивых к патогенам форм хвойных растений в культуре in vitro, на основе современных достижений в области половой репродукции голосеменных»; РНП.2.2.3.1.2466 Министерства образования и науки РФ «Развитие гербарной коллекции и музея культур грибов Средней Сибири как базы для научно-образовательного процесса»; РФФИ "Енисей" — №090498008 «Биологический контроль биотехнологии сокулътивирования хвойных в. культуре in vitro с биопрепаратами рода Trichoderma и Streptomyces»; 10-04-90745 (мобст) на прохождение научной стаэ/сировки в Московском государственном университете прикладной биотехнологии.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Бондарь, Полина Николаевна

выводы

1. В результате проведенных исследований 18 штаммов рода Trichoderma показано, что в пределах одного вида штаммы имеют неодинаковую гиперпаразитическую и антибиотическую активность, поэтому принадлежность к виду не может служить определяющим фактором для отбора продуцентов препаратов защиты растений. Высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенов злаков родов Bipolaris, Alternaría, Fusarium обладают штаммы Trichoderma asperellum «Mg-6», Trichoderma harzianum «M99/5» и Trichoderma koningii «TCJI-06».

2. В экспериментах in vitro и in vivo на каллусах и семенах показано, что положительное действие на рост злаковых и древесных растений обусловлено не только подавлением фитопатогенов, но и биосинтезом ростстимулирующих метаболитов штаммами Trichoderma asperellum «Mg-6» и Trichoderma harzianum «M99/5». Это дает возможность использования этого свойства как фактора отбора штаммов для создания новых высокоэффективных биопрепаратов для защиты от болезней и повышения продуктивности растений.

Для получения высокопродуктивных и устойчивых к патогенам растений при микроклональном размножении из каллусов перспективно использование биологически активных метаболитов штаммов Trichoderma asperellum «Mg-6» и Trichoderma harzianum «M99/5».

- Количество белка, содержащееся в биомассе штаммов Trichoderma asperellum «ТН-11» и «ТН-5», Trichoderma harzianum «М99/5» и Trichoderma koningii «TCJI-06», составляет от 18.50% до 22.43%. Качественный состав аминокислот белка мицелия штаммов характеризуется наличием незаменимых аминокислот: лизина, триптофана, аргинина и лейцина, лимитированного в растительных кормах, использующихся для животных.

- Общее содержание липидов в биомассе микромицетов рода Тпскойегта составляет от 4.21 до 13.57%. В составе липидов биомассы и культуральной жидкости микромицетов рода ТНскойегта преобладают гликолипиды, на втором месте нейтральные, затем фосфолипиды

4. Исследовано влияние селена на рост и продуктивность штаммов грибов рода ТпскосЗегта.

На основании сравнительной оценки влияния селена на продуктивность биомассы грибов был отобран штамм Ттскойегта аярегеНит «ТН-5», биомасса которого не является токсичной и может быть использована в качестве кормовой селенсодержащей добавки.

- получена селенсодержащая кормовая добавка с содержанием белка не менее 22%, селена 93.75 мг/г и определена ее перевариваемость, обеспечивающая активность пепсина 0.213 ТЕ.

5. Исследован процесс биодеструкции растительных отходов: коры пихты, гидролизного лигнина и твердого остатка топинамбура сибирскими штаммами рода Тпскос1егта;

- Показано, что все исследуемые штаммы рода Тпскос1егта способны использовать в качестве субстратов древесные отходы техногенной сферы и твердый остаток топинамбура.

- На основании сравнительной оценки ростовых показателей исследуемых штаммов определены условия культивирования на коре пихты, обеспечивающие титр КОЕ у штаммов ТпскосЗегта азрегеПит

3.50-109 и Тпскос1егта катапит «М99/5» 1.33-109.

- Изучена биодеструкция растительных отходов при твердофазном культивировании антагонистически активных штаммов ТНско(1егта аБрегеИит «1у^-6», Тпскойегта кагггапит, «М99/5» и Тпс1гос1егта котщи «ТСЛ-06», обеспечивающая снижение в биомассе легко- и трудногидролизуемых полисахаридов и относительное накопление гуминовых соединений. При культивировании штамма Тпскос1егта аБрегеНит «М£-6» на коре пихты и лигнине количество гуминовых веществ составляло 11.80% и 11.32% на а.с.с., при культивировании штамма Тпс!юс1егта кагггапит «М99/5» 8.90% и 10.90% на а.с.с., соответственно.

6. В лабораторных условиях разработана технологическая схема получения биопрепарата Триходермин-М твердофазным культивированием штаммов ТНскойегта азрегеНит «М§-6» и ТНскойегта кагг1апит «М99/5» на коре пихты.

- Биопрепарат получен в виде воздушно-сухого порошка коричневого цвета с титром КОЕ 3.5x109 спор/г. Испытания опытных партий биопрепарата показали его эффективность в защите от фитопатогенов злаков и хвойных, повышении продуктивности ячменя и пшеницы, снижения инфекции урожая новой репродукции, а также увеличение выхода здоровых сеянцев сосны сибирской.

1 (

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бондарь, Полина Николаевна, Красноярск

1. Александрова, A.A. Исторический обзор и современная система рода Trichoderma / A.A. Александрова, Л.Л. Великанов, И.И. Сидоров // Микология и фитопатология. — 2004. Т. 38, Вып. 1.-е. 3-23;

2. Александрова, A.B. Влияние гриба Trichoderma harzianum на почвенные микромицеты /Александрова A.B., Великанов Л.Л. // Микология и фитопатология. 2000.- Т.34, Вып.З. — с. 68-77;

3. Александрова, A.B. Ключ для определения видов рода Trichoderma / A.B. Александрова, Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Микология и фитопатология. 2006. - Т. 40, Вып 6. - с. 437-468;

4. Алешко, С.Ф. Влияние селена на некоторые биохимические процессы в организме животных : автореф. дис. канд. биол. наук Витебск, 1967.- 19 с;

5. Атлавин, А.Б. Ассимиляция селена в организме животных / A.B. Атлавин, М.Р. Апсите, Б.В. Питран // Усвоение органических и неорганических соединений в организме животных. Рига : Зинатне, 1990. -с. 30-61;

6. Безбородов, A.M. Биосинтез биологически активных веществ микроорганизмами / А. М. Безбородов. Спб.: Медицина, 1969. - 143 с;

7. Билай В.И., Эллианская И.А., Кириченко Т.С. и др. Микромицеты почв. Киев: Наукова Думка, 1984. - 264 с;

8. Буряков, Н.П. Особенности кормления высокопродуктивных коров / Н.П. Буряков, М.А. Бурякова, Е.В. Караваева // DairyNews. 2010;

9. Буханова, Ю.В. Особенности применения триходермина //

10. Защита и карантин растений. 2004. - № 11. — с.23;

11. Васюкова, Н.И. Индуцированная устойчивость растений и салициловая кислота (обзор) / Н.И. Васюкова, O.J1. Озерецковская // Прикладная биохимия и микробиология. — 2007. — Т. 43, № 4. — с. 405-411;

12. Великанов, Л.Л. Пространственное распространение грибов рода Trichoderma в почвах биологической станции МГУ / Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Микология и фитопатология. 1999. - Т.ЗЗ, Вып.2. - с.101-106;

13. Визнер, Э. Кормление и плодовитость сельскохозяйственных животных. М. : Колос, 1976. - 234 с;

14. Вишнякова, 3. В. Микрофлора кедровников Западного Саяна. Новосибирск: Наука, 1974. 142 с;

15. Войтка, Д.В. Повышение активности биопрепаратов на основе грибов-антагонистов Trichoderma sp. // Современная микология в России. Т. 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии. 2008. - 548 с;

16. Георгиевский, В.И. Минеральное питание животных / В.И. Георгиевский, Б.Н. Анненков, В.Т. Самохин. -М.: Колос, 1979. -471 с;

17. Гешеле, Э.Э. Болезни зерновых культур в Сибири Текст. / Э. Э. Гешеле. -М. : Изд-во Сельхозиздат, 1956. 128с;

18. Головлева, Л.А. Разложение лигнина грибными культурами / Л.А. Головлева, Х.Г. Ганбаров, Г.К. Скрябин // Микробиология. 1982. - Т. 51, Вып. 4. с. 543-547;

19. Голубкина, H.A. Селен в медицине и экологии / H.A. Голубкина, A.B.Скальный, Я.А. Соколов и др. -М.: «КМК», 2002. 134 с;

20. Горленко, М.В. Все о грибах / Л.В. Гарибова, И.М. Сидорова, Г.Л. Сизова, Г.Д. Успенская-М.: Лесная промышленность. 1985. - с. 280;

21. Горьковенко, B.C. Фитопатогенный комплекс возбудителей корневых гнилей ярового ячменя // Защита и карантин растений. 2005. - № 8.-с. 32-33;

22. Градова, Н.Б. Рост спирулины на селеносодержащих средах /

23. Н.Б. Градова, Е.А. Сухинина, Е.С. Бабусенко, Н.А. Гусарова, И.Ф. Баум // Биотехнология. 2001. - № 5. — с. 40-44;

24. Гринько, Н.Н. Битехнологические аспекты культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai ВКМ F—2477Д // Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук. — 2004. — № 1. — с. 57-61;

25. Громовых Т.И., Литовка Ю.А., Андреева О.Н. Биологический контроль болезней сеянцев хвойных в лесных питомниках Средней Сибири: Монография. Красноярск: СибГТУ, 2005. - 264 с;

26. Громовых, Т.И. Фитопатогенные микромицеты сеянцев хвойных в Средней Сибири: видовой состав, эклогия, биологический контроль // Автореф. диссертация. доктора биологических наук. Москва, 2002;

27. Дегтярев, Д.В. Влияние органических и не органических соединений селена на привесы и показатели антиоксидантной защиты у телят / Д.В. Дегтярев, Ю.Н. Алехин, С.В. Куркин, А.И. Фаустов // Ветеринарная патология. 2003. - № 3. - с. 70-71;

28. Денисова, Г.В. Влияние неорганических соединений селена на рост и развитие базидиальных макромицетов : Дис. . канд. биол. наук. -Москва, 1999.- 130 с;

29. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н. С. Егоров. -М.: Изд-во МГУ, 1994. 512 с;

30. Емельянова, И.З. Химико-технический контроль гидролизных производств / И.З. Емельянова. М.: «Лесная промышленность», 1976. - 328 с;

31. Ермаков, В.В. Биологическое значение селена / В.В. Ермаков, В.В. Ковальский. М. : Наука, 1974. - 325 с;

32. Ермаков, В.В. Биогеохимия селена и его значение в профилактике эндемических заболеваний человека // Электронный научно-информационный журнал Scientific publication. 2004. - № 1(22);

33. Жильцова, Т.С. Исследование резистентности дрожжей рода Candida к соединениям селена / Т.С. Жильцова, М.В. Шагова, Н.Б. Градова,

34. H.A. Голубкина // Прикладная биохимия и микробиология 1996. - Т. 32, №5.-с. 567-570;

35. Жильцова, Т.С. Накопление и распределение селена в клетках, обогащенных селеном дрожжей рода Candida /Т.С. Жильцова, А.П. Белов, Н.Б. Градова // Прикл. биохимия и микробиол. 1998. - Т. 34, № 2. - с. 186— 188;

36. Заика, H.A. Эколого-биологическое обоснование скрининга штаммов рода Trichoderma для создания и использования биопестицидов в защите растений : Дис. . канд. биол. наук. — Красноярск, 2006. 159 с;

37. Зарипова, Л.П. Пути увеличения производства кормового белка в республике Татарстан / Л. П. Зарипова, Ф.С. Гибадуллина // Достижения науки и техники АПК. 2008. - №11. - с. 36-37;

38. Касумов, С.Н. Основы применения селена в кормлении сельскохозяйственной птицы. М. : ВНИИТЭИСХ, 1981. — 61 с;

39. Кейтс, М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов / М. Кейтс. -М.: Мир, 1975. 322 с;

40. Кидин, В.В. Практикум по агрохимии / В.В. Кидин, И.П. Дерюгин, В.И. Кобзаренко и др.; Под ред. В.В. Кидина. М.: КолосС, 2008. -599 с;

41. Ким, Н.Ю. Безотходная переработка о дубины коры хвойных пород : Дис . кандидата технических наук-Красноярск, 2008. 135 с;

42. Ким, Н.Ю. Биодеструкция коры коры хвойных пород / Н.Ю. Ким, Е.Г. Махова, B.C. Громовых, H.A. Чупрова и др. // Химия и технология растительных веществ: Сборник трудов. Сыктывкар, 2000. с. 203;

43. Кирцидели, И.Ю. Почвенные микромицеты горных тундр Хибин (Кольский полуостров) // Микология и фитопатология. 1999. - Т. 33, Вып.6.-с. 368-391;

44. Кобзарь, А.И. Прикладная математическая статистика / А.И. Кобзарь. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2006. - 816 с;

45. Коломбет, JI.B. Микофунгицид — препарат на основе T. viride для борьбы с болезнями растений / JI.B. Коломбет, С.К. Жиглецова, В.В. Дербышев, Д.В. Ежов, H.H. Косарева, Е.В. Быстрова // Прикладная биохимия и микробиология.-2001.-Т.37, № 1.-е. 110-114;

46. Лебедев, H.H. Использование микродобавок для повышения продуктивности жвачных животных. Л. : Агропромиздат, 1990. - 96 с;

47. Лемешева, М. Аминокислотное питание птицы // Птицеводство. — 2006.-№11.-с. 25-27;

48. Летунова, C.B. Геохимическая экология почвенной микрофлоры в условиях различного содержания селена в естественной среде обитания / С. В. Летунова, В.В. Ковальский, В.В. Ермаков // Тр. Биогеохим. лаб. 1968. -Т. 12. с. 238-258;

49. Лунева, Т.А. Трансформация коры древесных пород грибом рода Trichoderma и получение биопрепарата : Дис . кандидата технических наук1. Красноярск, 2008 140 с;

50. Мазо, В.К. Перспективы биотехнологического получения новых пищевых источников органических соединений селена / В.К. Мазо, С.Н. Зорин // Успехи современного естествознания. 2008. — №11. - с. 1—2;

51. Махова, Е.Г. Культивирование грибов рода Trichoderma на лигноуглеводных субстратах и получение биопрепарата: автореф. дис. канд. техн. наук. / Е. Г. Махова. Красноярск, 2003 .-21 с;

52. Методические указания по изучению мировой коллекции ячменя и овса / Под. ред. В.Д. Кобылянского, А .Я. Трофимовской. — 3-е изд., перераб. JL: Всесоюзный НИИ растениеводства имени Н.И.Вавилова, 1981.-32 с;

53. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д.Г. Звягинцева. -М.: Изд-во МГУ, 1991. 304 с;

54. Мишанин, Ю.Ф. Влияние различных доз селенита натрия на морфологические и биохимические показатели крови кур / Ю.Ф. Мишанин, М.Ю. Мишанин, A.A. Лысенко // Тр. Кубан. аграр. ун-та. 1999. - № 375. -с. 107-109;

55. Мозгов, И.Е. Стабилизация нормофлором физиологической функции пищеварительного тракта / И.Е. Мозгов и др. // Актуальные вопросы гастроэнтерологической и метаболической патологии. — 1986. — с. 17-22;

56. Надаринская, М.А. Селен в кормлении высокопродуктивных коров // Зоотехния. 2004. - № 12. - с. 10-11 ;

57. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. Справочное пособие. 3-е изд., перераб. и доп. / под ред. А.I

58. П. Калашникова, В. И.Фисинина, В. В.Щеглова, Н. И.Клейменова. М.,2003; I

59. Нугманова, Т.А. Биотехнологические аспекты производстваi

60. М.Г. Осипова, М.В. Кабаргина // Инновационные технологии и природные

61. Оболенская, A.B. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы Текст. : учеб. пособие для вузов / А. В. Оболенская, 3. П. Ельницкая, А. А. Леонович. М. : Экология, 1991. - 320 с;

62. Омонди, О.С. Корневая гниль ячменя и эффективность ее подавления современными средствами в связи с особенностями сорта : Дис . кандидата биологических наук : 06.01.11 Москва, 2002. 128 с;

63. Онхонова, Л.О. Использование отходов животноводческих комплексов в производстве кормовых белков методом микробного синтеза / Л.О. Онхонова, A.B. Онхонова, И.Б. Баторова // В мире научных открытий. -2009. -№1.~ с. 27-34;

64. Орджоникидзе, З.Г. Значение микроэлементов для достижения высоких спортивных результатов и сохранения здоровья спортсменов / З.Г. Орджоникидзе, O.A. Громова, A.B. Скальный // Микроэлементы в медицине. 2001. -№ 2. - с. 40-45;

65. Панников, Н.С. Кинетика роста микроорганизмов: общие закономерности и экологические приложения. — М.: Наука, 1991. — 311 с;

66. Петров, Л.П. Лигнин повышает плодородие солонцовых почв / Л.П. Петров, Е.И. Годунова // Вестник РАСХИ. №2. - 1996. - с. 60-61;

67. Попова В.В., Ковшова Ю.И., Цоглин Л.Н., Пронина H.A. // Биотехнология народному хозяйству: Тез. Докл. I Межд.симп.- М 2000-с.41;

68. Пробиотики и микронутриенты при интенсивном выращивании цыплят кросса Смена / Г.А. Ноздрин, А.Б. Иванова, А.И. Шевченко, С.А.

69. Шевченко. Новосибирск: НГАУ, 2009. - 207 с;

70. Пронина, H.A. Влияние селенит ионов на рост и накопление селена у Spirulina platensis / Пронина H.A., Ковшова Ю.И., Попова В.В. и др. // Физиология растений. 2002. - Т.49, № 2. - с.264-271;

71. Решетникова, И.А. Деструкция лигнина ксилотрофными макромицетами. Накопление селена и фракционирование его изотопов микроорганизмами. — М.: СП Новинтех-Пресс, 1997 — 202 с.

72. Рудаков, И.Л. Проблемы и перспективы использования гиперпаразитов и антагонистов в защите растений от инфекционных заболеваний // Микробиологические средства защиты растений. — Кишинев: Штиинца, 1986. с. 29-33;

73. Рудаков, О. Л. Микофильные грибы, их биология и практическое значение //М.: Наука, 1981. 158 с;

74. Рязанова, Т.В. Химия древесины: учебное пособие для студентов / Т.В. Рязанова, Н. А. Чупрова, Е. В. Исаева. Красноярск: КГТА, 1996. - 358 с;

75. Садыкова, B.C. Изменчивость вида Trichoderma asperellum и отбор штаммов для создания биопрепаратов на гидролизном лигнине : Дис. . канд. биол. наук. Москва, 2003. - 198 с;

76. Свешникова, Е.В. Новые бактерии р. Pseudomonas антагонисты фитопатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной практике : Дис. . канд. биол. наук. - Уфа, 2003. - 189 с;

77. Сейкетов, Г.Ш. Грибы рода Trichoderma и их использование в практике. Алма-Ата: Наука, 1982. - 248 с;

78. Сэги, Й. Методы почвенной микробиологии / Й. Сэги. М.:1. Колос, 1983.-с. 167-173;

79. Таланова, В.В Фитогормоны как регуляторы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды : Дис. . доктора биол. наук. — Петрозаводск, 2009;

80. Телышева, Г.М. Удобрение на основе лигнина / Г.М. Телышева, Р.Е. Панкова // Рига: Зинатне, 1978. Вып.64 - с. 158;

81. Томмэ, М.Ф. Потребность свиней в макро- и микроэлементах / М.Ф. Томмэ, Э.Г. Филипович // Животноводство. — 1975. — № 12.-е. 36-38;

82. Третьяк, JI.H. Специфика влияния селена на организм человека и животных (применительно к проблеме создания селенсодержащих продуктов питания) / J1.H. Третьяк, Е.М. Герасимов // Вестник ОГУ. 2007. — №12. — с.136-145;

83. Тулемисова, К.А. Антагонизм и гиперпаразитизм Trichoderma lignorum к фитопатогенным грибам / К. А. Тулемисова, А.К. Успанов // Вестник АН Казах. ССР. 1986,-№12.- с. 47-51;

84. Тучемский, Л.И. Технология выращивания высокопродуктивных цыплят-бройлеров. Сергиев Посад : ВНИТИП, 1999. - 147 с;

85. Тюльпанова, В.А. Биотехнология новых форм грибных фунгицидов для защиты растений / В.А. Тюльпаниова, Т.И. Громовых, А.Л. Малиновский, Т.Л. Козлова, И.А. Арефьева, И.А. Шипилова // Сибирский экологический журнал. 1997. - № 5. - с. 495-500;

86. Ушанова, В.М. Основы научных исследований. Часть 2. Контроль качества и экстрагирование растительного сырья / В.М. Ушанова, О.И. Лебедева, А.Н. Девятловская. Красноярск: СибГТУ, 2004. - 168 с;

87. Феофилова, Е.П. Влияние консерванта — сорбиновой кислоты — на состав липидов гриба аскомицетного аффинитета Pénicillium roqueforti ТНОМ / Е.П. Феофилова, ЯЗ. Сергеева, Л.А. Галанина, Г.А. Кочкина // Микробиология, 2009. Т.78, № 5. - с. 695-701;

88. Феофилова, Е.П. Ликопин грибов: биотехнология получения и перспективы использования в медицине / Е.П. Феофилова, В.М. Терешина,

89. А.С. Меморская и др. // Микробиология, 2006. Т.75, № 6. - с. 725-730;

90. Феофилова, Е.П. Липиды мицелиальных грибов как основа для получения биодизельного топлива / Е.П. Феофилова, Я.Э. Сергеева, Л.А. Галанина, Д.А. Андрианова // Прикладная биохимия и микробиология, 2008.- Т.44, № 5. с. 576-581;

91. Шаховская, А.К. О применении органической формы селена в питании гастроэнтерологических больных / А.К. Шаховская, И.В. Гмошинский, А.В. Васильев и др. // Экология моря: Сб. научных трудов. -2000. Вып. 54. - с. 83-86;

92. Штерншис, М.В. Грибные препараты / М.В. Штерншис, Ф.С. Джалилов, И.В. Андреева, О.Г. Т.илова // Биологическая защита растений. -М: Колос. 2004. - с. 195-198;

93. Якименко, Е.Е. Микромицеты почв лесных питомников // Микология и фитопатология. 1992. - Т. 26, Вып. 6. - с. 480-485;

94. Якушин, С.С. Влияние селеносодержащей биологически активной добавки к пище на обеспеченность селеном больных ишемической болезнью сердца / С.С. Якушин, В.К. Мазо, Н.С. Сазонова и др. // Вестн. новых мед. технологий. — 2003. Т. 10, №3. — с. 84;

95. Abbott, E.V. Taxonomic studies on soil fungi // Iowa St. Coll. J. Sci.- 1926. -№.l.-p. 15-36;

96. Amagata, T. Cytotoxic substances produced by a fungal strain from a sponge: physico-chemical properties and structures / T. Amagata, Y. Usami, K. Minoura, T. Ito, A. Numata // J Antibiot. 1998. - V. 51. - p. 33-40;

97. Antal, Z. Colony growth, in vitro antagonism and secretion of extracellular enzymes in cold-tolerant strains of Trichoderma species / Z. Antal, L. Manczinger, G. Szakas, R.P. Tengerdy, L. Ferencczy // Mycol. Res. 2000. - V. 104. p. 545-549;

98. Astudillo, L. Acetophenone derivatives from Chilean isolated of Trichoderma pseudokoningii Rifai / L. Astudillo, G. Schmeda-Hirschmann, R. Soto, C. Sandoval, C. Sfonso, M.J. Gonzalez, A. Kijjoa // World J Microbiol

99. Biotechnol. 2000. - V. 16. p. 585-587;

100. Baek, J.M. The role of an extracellular chitinase from Trichoderma virens Gv29—8 in the biocontrol of Rhizoctonia solani / J.M. Baek, C.R. Howell, C.M. Kenerley // Current genetics. 1999. - V. 35. - p. 41-50;

101. Baker, R. The controlled experiment in the scientific method with special emphasis on biological control. / R. Baker, Y. Elad, I. Chet // Phytopathology. 1984. - V. 74. - p. 1019 - 1021;

102. Bakker, P.A.H.M. Understanding the involvement of rhizobacteria mediated induction of systemic resistance in biocontrol of plaut diseases / P.A.H.M. Bakker, L.X. Ran, C.M.J. Pieterse, L.C. van Loon // Can. J. Plant Pathol. 2003. - V.25. - p. 5-9;

103. Becwar, M.R. Initiation of embryogenic cultures and somatic embryo development in loblolly pine (Pinus taeda) / M. R. Becwar, R. Nagmani, S. R. Wann// Can. J. For. Res. 1990. -V. 20. - p. 810-817;

104. Benhamou, N. Parasitism of sclerotia of Sclerotium rolfsii by Trichoderma harzianum ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction / N. Benhamou, I. Chet. // Phytopathology. 1996. - V. 86. - № 4. - p. 405-416;

105. Benitez, T. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains / T. Benitez, A.M. Rincorn, M.C. Limorn, A.C. Codotn // Int Microbiol. 2004. - V.7. -p. 249-260;

106. Berestetskii, O.A. Phytotoxic properties of fungi of the Trichoderma Pers. / O.A. Berestetskii, V.F. Patyka, S.P. Nadkernichnyi // Genus. Vopr. Ekol. Fiziol. Mikroorg., Ispol'z. Sel'sk. Khoz. 1976. - p. 56-60 (Chem. Abstr. 1978, 88:148647)

107. Bisby, G.R. Trichoderma viride Pers. Ex Fries. And notes on Hypocrea. Transactions of the British Mycological Siciety // 1939. 23. - p. 149168;

108. Bissett, J. A revision of the genus Trichoderma. (I) Section Longibrachiatum sect, nov // Can. J. Bot. 1984. - V.62. - p. 924-931;

109. Bissett, J. A revision of the genus Trichoderma. (II). Infragenericclassification // Can. J. Bot. 1991a. - V.69. - p. 2357-2372;

110. Bissett, J. A revision of the genus Trichoderma. (Ill) Section Pachybasium//Can. J. Bot. 1991b. - V.69. - p. 2373-2417;

111. Bjorkman, T. Effect of Trichoderma Colonization on Auxin-Mediated Regulation of Root Elongation'// Plant Growth Regulation. 2004. — V.43, № l.-p. 89-92;

112. Bostock, R.M. Signal interactions in induced resistance to pathogeus and insect herbivores / R.M. Bostock, R. Karban, J.S. Thaler, P.D. Weyman, D. Gilchrist//Eur. J. Plant Pathol. 2001.-V.l 07, №1,-p. 103-111;

113. Calvo, A.M. Relationship between secondary metabolism and fungal development / A.M. Calvo, R.A. Wilson, J.W. Bok, P.N. Keller // Microbiol Mol Biol Rev. 2002. - V.66. - p. 447-459;

114. Carsolio, C. Role of the Trichoderma harzianum endochitinase gene, ech42, in mycoparasitism / C. Carsolio, N. Benhamou, S. Haran, C. Cortes, A. Gutierrez, I. Chet, A. Herrera-Estrella // Applied Environmental Microbiology. -1999.-V.65.-p. 929-935;

115. Chauvaux, G. Appreciation du nivaau du selenium sanguine parle dosage de la glutathion peroxydase. / G. Chauvaux, F. Lomba, J. Fumiere, V. Bienfet // Ann. med. vet. 1977. - V.121, № 2. - P. 111-115;

116. Chaverri, P. Trichoderma / Hypocrea species with conidiephore elongations and green conidia / P.Chaverri, B.E. Overton, G. J. Samuels // Mycologia. 2003. - № 95.-p. 1110- 1140;

117. Chen, C. Role of salicylic acid in systemic resistance induced by Pseudomonas spp against Pyhium aphanidermaium in cucumber roots / C. Chen, R.R. Belanger, N. Benhamou, T.C. Paulitz // Europen J. of Plant Pathology. -1999.-V.105.-p. 477-486;

118. Chet, I. Fungal antagonists and mycoparasites. The Mycota IV: environmental and microbial relationships / I. Chet, J. Inbar, I. Hadar. // Berlin: Springer-Verlag. 1997. - p. 165-184;

119. Chet, I. The role of recognition in the induction of specific chitinases during mycoparasitism by Trichoderma harzianum / I. Chet, J. Inbar // Microbiology-UK. 1995. -V. 141. - p. 2823-2829;

120. Chet, I. Trichoderma hamatum: Its hyphal interactions with Rhizoctonia solani and Pythium spp. / I. Chet, G.E. Harman, R. Baker // Microbal Ecology. 1981. - V.7. - p. 29-38;

121. Clay don, N. Antifungal alkyl pyrones of Trichoderma harzianum / N. Claydon, M. Allan, J.R. Hanson, A.G. Avent // Transactions of the British Mycological Society. 1987. - V.88. - p. 503-513;.

122. Coats, J.H. Antibiotic dermadin / J.H. Coats, C.E. Meyer, T.R. Pyke // US Patent 3627882, 14 Dec 1971;

123. Cogne G., Lehmann B., Dussap C.G., Gros J.B. // Biotechnol.Bioeng.- 2003. V.81, № 5. - p.588-593;

124. Combs, G.F. Selenium in nutrition // Encyclopedia of human biology- Sekond ed., New-York: Acad. Press. 1997. - V.7. - p. 743-754;i

125. Connick jr., W.J. Formulation of biocontrol agents for use in plant pathology / W.J. Connick jr., J.A. Lewis, P.C. Quimby jr. // In: New direction in biological control. Alternatives for suppressing agricultural pest and diseases. R.R

126. Baker and P.F. Funn (ed). Alan R. Liss, Inc. New York. - 1990. - p. 345-372;f

127. Corbell, N. A global regulator of secondary metabolite production ini 1 Pseudomonas fluorescens Pf-5 / N. Corbell, J. E. Loper // J. Bacteriol. 19951 —1. V.177. p. 6230-6236;

128. Danielson, R.M. The abundance of Trichoderma propagules and the distribution of species in forest soils / R.M. Danielson, C.B. Davey // Soil. Biol, and Biochemistry. 1973. -V.5, № 5. - p. 485^-94;

129. De Meyer, G. Induced systemic resistance in Trichoderma harzianum T39 biocontrol of Botrytis cinerea / G. De Meyer, J. Bigirimana, Y. Elad, M. Hofte // European Journal of Plant Pathology. 1998. - V.104. - p. 279-286;

130. Delgado-Jarana, J. Overproduction of p-l,6-glucanase in T. harzianum is controlled by extracellular acidic proteases and pH / J. Delgado-Jarana, J.A. Pintor-Toro, T. Benitez // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V.1481. - p. 289-296;

131. Demain, A.L. The natural functions of secondary metabolites / A.L. Demain, A. Fang // Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. 2000. -V.69.-p. 1-39;

132. Denisova, G.V. Effect of Inorganic Selenium Compounds on the Growth and Development of Basidial Macromycetes, Cand. Sci. (Biol.) Dissertation, Moscow, 1999;

133. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma / C. Dennis, J. Webster // Transactions of the British Mycological Society. I. Production of non-volatile antibiotics. 1971a. - V.57. - p. 25-39;

134. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma / C. Dennis, J. Webster // Transactions of the British Mycological Society. II. Production of non-volatile antibiotics. 1971b. - V.57. - p. 41-48;

135. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma. III. Hyphal interaction / C. Dennis, J. Webster // Transactions of the British Mycological Society. 1971c. - V.57. -№ 3. - p. 363-369;

136. Dickinson, J.M. Structure and biosynthesis of harzianopyridone, an antifungal metabolite of Trichoderma harzianum / J.M. Dickinson, J.R. Hanson, P.B. Hitchcock, N. Claydon // J Chem Soc Perkin Trans. 1989. - V.l(ll). - p. 1885-1887;

137. Doi, Y. Trichoderma sect Satumisporum, sect. nov. and Trichoderma ghanense, sp. nov. / Y. Doi, Y. Abe, J. Sugiyama // Bull. Natl. Sci. Mus. Tokyo, Ser. B (Bot.). — 1987. — V. 13.-p. 1-9;

138. Draborg, H. Molecular cloning and expression in S. cerevisiae of two exochitinases from T. harzianum / H. Draborg, S. Kauppinen, H. Dalboge, S. Christgau // Biochem. Molec. Biol. Int. 1995. - V.36. - p. 781- 791;

139. Druzhinina, I. A DNA-barcode for strain identification in Trichoderma /1. Druzhinina, A. Koptchinskij, M. Komon, J. Bissett, C.P. Kubicek // J. Zhejiang Univ SCI. 2006. V.6 - p. 100-118;

140. Druzhinina, I.mSpecies concepts and biodiversity in Trichoderma and Hypocrea: from aggregate species to species clusters / I. Druzhinina, C.P. Kubicek // J. Zhejiang Univ SCI. 2005. - p. 401-407;

141. Druzhinina, I. Global carbon utilization profiles of wild type, mutant and transformant strains of Hypocrea jecorina / I. Druzhinina, M. Schmoll, B. Seiboth, C. P. Kubicek // Appl Environ Microbiol. 2006. - V.72. - p. 21262133;

142. Engelberth, J., Koch, T., Ku'hnemann, F., and Boland, W. // Agnew Chem.Int. Ed. Engl. 2000. - V.39. - p. 1860-1862;

143. Evidente, A. Viridepyronone, a new antifungal 6-substituted 2H-pyran-2-one produced by Trichoderma viride / A. Evidente, A. Cabras, L. Maddau, S. Serra, A. Andolfi, A. Motta // J Agric Food Chem. 2003. - V.51. - p. 6957-6960;

144. Ezzi, M.I. Cyanide catabolizing enzymes in Trichoderma spp. / M.I. Ezzi, J.M. Lynch // Enzymol Microbial Technol. 2002. - V.31. - p. 1042-1047;

145. Falcone, G. Reduction of selenite by intact yeast cells and cell-free preparations / G. Falcone, W. Nickerson // J Bacteriol. 1963. - V.85(4). - p. 754-762;

146. Farr, D.F. Fungi on Plant Products in United States / D.F. Farr, G.F.

147. Bills, G.P. Chamuris, A.Y. Rossman // St. Paul. Minnesota: APS Press. 1989. -p. 999;

148. Flores, A. Improved biocontrol activity of T. harzianum strains by overexpression of the proteinase encoding gene prbl / A. Flores, I. Chet, A. Herrera-Estre 11 a // Curr. Genet. 1997. - V.31. - p. 30-37;

149. Frost, D. V. Selenium as a feed additive: a critique. With Canada adding selenium to feed, can the U. S. do better? // Feedstuffs. 1973. - V.45, № 50.-p. 26-28;

150. Gams, W. What exactly is Trichoderma harzianum / W. Gams, W. Meyer // Mycologia. 1998. - V.90. - № 5. - p. 904-915;

151. Garcia, I. Cloning and characterization of a chitinase (CHIT42) cDNA from the mycoparastic fungus T. harzianum /1. Garcia, J.M. Lora, J. De la Cruz, T. Benitez, A. Llobell, J.A. Pintor-Toro // Curr. Genet. 1994. - V.27. - p. 83-89;

152. Garo, E. Trichodermamides A and B, cytotoxic modified dipeptides from the marine-derived fungus Trichoderma virens / E. Garo, C.M. Starks, P.R. Jensen, W. Fenical, E. Lobkovsky, J. Clardy // J Nat Prod. 2003. - V.66. - p. 423-426;

153. Ghisalberti, E.L. Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp. / E.L. Ghisalberti, K. Sivasithamparam // Soil Biology & Biochemistry. — 1991. — Y.23. -p. 1011-1020;

154. Gladyshev, V.N. Selenocysteine-containing proteins in mammals / V.N. Gladyshev, D.L. Hatfield // J. Biomed. Sci. 1999. - V.6, № 3. - p. 151 -160;

155. Golder, W.S. Lanosterol derivatives as precursors in the biosynthesis of viridian / W.S. Golder, T.R. Watson // Part 1. J Chem Soc Perkin Trans. 1980. -V.l(2). - p. 422-425;

156. Haggag, W.M. Characteristics of three Trichoderma species in peanut haulms compost involved in biocontrol of cumin wilt disease / W.M. Haggag, S.A. Abo-Sedera // Int J Agric Biol. 2005. - V.7. - p. 222-229;

157. Hammill, T.M. Paecilomyces clavisporis sp. nov., Trichoderma saturnisporum sp. nov., and other noteworthy soil fungi from Georgia // Micologia.- 1970.-V.62, № l.-p. 107-123;

158. Hanson, JR. The viridin family of steroidal antibiotics // Nat Prod Rep. 1995. - V. 12. - p. 381-384;

159. Hanson, L.E. Elicitors of plant defense responses from biocontrol strains of Trichoderma virens / L.E. Hanson, C.R. Howell // Phytopathology. — 2004.-V.94.-p. 171-176;

160. Haran, S. Differential expression of T. harzianum chitinases during mycoparasitism / S. Flaran, H. Schickler, A.B. Oppenheim, I. Chet // Phytopathology. 1996. - V.86. - p. 980-985;

161. Haran, S. New components of the chitinolytic system of Trichoderma harzianum / S. Haran, H. Schickler, A.B. Oppenheim, I. Chet // Mycol. Res. -1995.-V.99.-p. 441—446;

162. Harman, G.E. Chitinolytic enzymes of Trichoderma harzianum: purification of chitobiosidase and endochitinase / G.E. Harman, C.K. Hayes, M. Lorito, R.M. Broadway, A. Di Pietro, C. Peterbauer, A. Tronsmo // Phytopathology. 1993. - V.83. - p. 313-318;

163. Harman, G.E. Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts / G.E. Harman, C.R. Howell, A. Viterbo, I. Chet, M. Lorito // Nature Review Microbiology. 2004. - V.2. - p. 43-56;

164. Harman, G.E., Kubicek, C.P. Trichoderma and Gliocladium. — Taylor & Francis, London. 1998. - 278 p.;

165. Hoitink, H.A.J. Biocontrol within the context of soil microbial communities: a substrate-dependent phenomenon / H.A.J. Hoitink, M.J. Boehm 11 Annual Review of Phytopathology. 1999. - V.37. - p. 427-446;

166. Howell, C.R. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts //' Plant Disease. 2003. - V.87. - p. 4-10;

167. Howell, C.R. The role of antibiosis in biocontrol // Trichoderma and Gliocladium. Enzymes, Biological Control and Commercial Application. 1998. -V.2. - p. 173-183;

168. Howell, C.R. Understanding the mechanisms employed by Trichoderma virens to effect biological control of cotton diseases // Phytopathology. 2006. - V.96.-p. 178-180;

169. Huang Z., Zheng W.J., Guo B.J. // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2002. - V. 18. - № 3. - p.373-376;

170. Hui, J.P.M. Characterization of cellobiohydrolase I (Cel7A) glycoforms from extracts of Trichoderma reesei using capillary isoelectric focusing and electrospray mass spectrometry / J.P.M. Hui, P. Lanthier, T.C. White,

171. S.G. McHugh, M. Yaguchi, R. Roy, P. Thibault // J. Chromatogr. 2001. - V.75. - p. 349-368;

172. Il'in, D.Yu. Effect of Selenium on the Growth and Development of Micromycetes Producers of Biologically Active Compounds, Extended Abstract of Cand. Sci. Dissertation, Moscow, 2001;

173. Kenerley, C.M. Pathogen interactions with microbes on the phylloplane / C.M. Kenerley, J.H. Andrews // 197th ACS National Meeting, Dallas, Texas. 1989;

174. Koga, K. Purification and characterization of beta-iV-acetylhexosaminidase from Trichoderma harzianum / K. Koga, Y. Iwamoto, H. Sakamoto, K. Hatano, M. Sano, I. Kato // Agric. Biol. Chem. 1991. - V.55. - p. 2817-2824;

175. Korolev, N. The role of phytohormones in basal resistance and Trichoderma-'mduced systemic resistance to Botrytis cinerea in Arabidopsis thaliana / N. Korolev, D. Rav David, Y. Elad // BioControl. 2008. - V.53. - p. 667-683;

176. Kubicek, C.P. Trichoderma: from genes to biocontrol / C.P. Kubicek, R.L. Mach, C.K. Peterbauer, M. Lorito // Journal of Plant Pathology. 2001. -V.83. - p. 11-23;

177. Kuc, J. Concepts and direction of induced systemic resistance in plants in plants and its application // Eur. J. Plant Pathol. 2001. - V.107. - p. 7

178. Kullnig, C.M. Molecular identification of Trichoderma species from Russia, Siberiaand the Himalaya / Kullnig, C.M., Szakacs, G., Kubicek, C.P. // Mycol Res. — 2000. — V. 104. p. 1117-1125;

179. Kumeda, Y. Effects of ergokonin A produced by Trichoderma viride on the growth and morphological development of fungi / Y. Kumeda, T. Asao, A. Iida, S. Wada, S. Futami, T. Fujita // Bokin Bobai. 1994. - V.22. - p. 663-670;

180. Le Doan, T. Fluorescein studies on the interaction of trichorzianine A IIIc with model membranes / T. Le Doan, M. El-Hajii, S. Rebuffat, M.R. Rajeswari, B. Bodo // Biochimica et Biophysica Acta. 1986. - V.858. - p. 1-5;

181. Leandro, L.F.S. Population dynamics of Trichoderma in fumigated and compost amended soil and on strawberry roots / L.F.S. Leandro, T. Guzman, L.M. Ferguson, G.E. Fernandez, F.J. Louws // Applied Soil Ecology. 2007. -V.35. - p. 237-246;

182. Lelu, M.A. Somatic embryogenesis from immature and mature zygotic embryos and from cotyledons and needles of somatic plantlets of Larix. / M.A. Lelu, K. Klimaszewska, P.J. Charest // Can J For Res. 1994. - V.24. -p.100-106;

183. Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C. // Cell. 1994. - V. 79, №5.-p. 573-593;

184. Li Z.Y., Guo S.Y., Li L.M Bioresour.Technol. 2003. - V.89, № 2. -p.171-176;

185. Lieckfeldt, E. Endochitinase gene-based phylogenetic analysis of Trichoderma / E. Lieckfeldt, Y. Cavignac, C. Fekete, T. Borner // Microbiol. Res. -2000.-V.155.-p. 7-15;

186. Liu, R. Trichodermamide A and aspergillazine A, two cytotoxic modified dipeptides from a marine-derived fungus Spicaria elegans / R. Liu, Q.Q. Gu, W.M. Zhu, C.B. Cui, G.T. Fan // Arch Pharmacol Res. 2005a. - V.28. - p. 1042-1046;

187. Lorito, M. Cell wall synthesis is a major target of mycoparasitic antagonism by Trichoderma harzianum / M. Lorito, V. Farkas, S. Rebuffat, B. Bodo,C.P. Kubicek//J Bacteriol. 1996. - V.178. - p. 6382-6385;

188. Lorito, M. Chitinolytic enzymes and their genes / Lorito, M. G.E. Harman, C.P. Kubicek // Trichoderma and Gliocladium. Taylor and Francis Ltd., London. - 1998. - V.2. - p. 73-99;

189. Lorito, M. Microrganismi antagonisti / M. Lorito, S.L. Woo, M. Iaccarino, F. Scala // Microrganismi Benefici per le Piante. Idelson-Gnocchi s.r.l., Napoli, Italia. 2006. - p. 146-175;

190. Lorito, M. Mycoparasitic interaction relieves binding of Crel carbon catabolite repressor protein to promoter sequence of ech—42 (endochitinase-encoding) gene of Trichoderma harzianum / M. Lorito, R.L. Mach, P. Sposato, J.

191. Strauss, C.K. Peterbauer, C.P. Kubicek // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. -V.93, №25. - p. 14868-14872;

192. Lorito, M. Synergistic combination of cell wall-degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibition of spore germination / M. Lorito, C.K. Peterbauer, C.K. Hayes, G.E. Harman // Microbiology. 1994. -V.140, №3. - p. 623-629;

193. Lotan, T. Xylanase a novel elicitor of pathogenesis related proteins in tobacco, uses a nonethylene pathway for induction / T. Lotan, R. Fluhr // Plant Physiology. 1990. - V.93. - p. 811-817;

194. Mapleston, RA. The evolutionary role of secondary metabolites / R.A. Mapleston, MJ. Stone, D.H. Williams // Gene. 1992. - V.115. - p. 151-157;

195. Menzies, J.G. A strain of Trichoderma viride pathogenic to germinating seedlings of cucumber, pepper and tomato // Plant Pathology. 1993. -V.42.-p. 784-791;

196. Metealf, D.A. The process of antagonism of Sclerotium cepivorum in white rot affected onion roots by T. koningii / D.A. Metealf, C.R. Wilson // Plant Pathol. -2001.- V.50. p. 249-2574; :

197. Mischke, S. Evaluation of chromogenic substrates for measurement 'ofprotease production by biocontrol strains of Trichoderma II Microbios. 1996. -V.87. - p. 175-183;

198. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. 1962. - V. 15. -№4.-P. 473—497;

199. Nickerson, W. Differential reversal of inhibitory effects of folic acid analogues on growth, division, and deoxyribonucleic acid synthesis of microorganisms / W. Nickerson, M. Webb // J Bacteriol. 1956. - V.71(2). - p. 140-148;

200. Nickerson, W. Enzymatic reduction of selenite / W. Nickerson, G. Falcone // J Bacteriol. 1963. - V.85(4). - p. 763-771;

201. Oostendort, M. Induce disease resistance in plants by chemical / M. Oostendort, W. Kunz, B. Dietrich, T. Stauo // Eur. J. Plant Pathol. 2001. - Y.107. -p. 19-28;

202. Park, K.S. Activation of PR1 a promoter by rhizobacteria that induce systemic in tobacco against Pseudomonas syringae pv. tabaci /K.S. Park, J.W. Klopper // Biol. Control. 2000. - V. 18. - p. 2-9;

203. Perrakis, A. Phylogenetic relationships of chitinases / A. Perrakis, K.S. Wilson, I. Chet, A.B. Oppenheim, C.E. Vorgias // Chitin Enzymology, Atec, Italy. 1993.-p. 217-232;

204. Pronina, N.A. The Effect of Selenite Ions on Growth and Selenium Accumulation in Spirulina platensis / N.A. Pronina, Yu.I. Kovshova, V.V. Popova et al., // Fiziol. Rast. 2002. - V.49. - №2. - p. 264-271;

205. Punja, Z.K. Using fungi and yeasts to manage vegetable crop diseases / Z.K. Punja, R.S. Utkhede // Trends Biotechnol. 2003. - V.21. - p. 400-407;

206. Ramot, O. Regulation of /7-1,3- glucanase by carbon starvation in the mycoparasite T. harzianum / O. Ramot, R. Cohen-Kupiec, I. Chet // Mycol. Res. -2000.-V.104.-p. 415-420;

207. Rebuffat, S. Isolation, sequence and conformation of seven trichorzianines B from Trichoderma harzianum / S. Rebuffat, M. El Hajji, P. Hennig, D. Davoust, B. Bodo // International Journal of Peptide and Protein Research. 1989. - V.34. - p. 200-210;

208. Reino, J.L. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma / J.L. Reino, R.F. Guerriero, R. Herna"ndez-Gala', I.G. Collado // Phytochem Rev. 2008. - V.7. - p. 89-123;

209. Rifai, M.A. A revision of the genus Trichoderma // Mycol. Pap. -1969.-V.116.-p. 1-56;

210. Roos, A.F. Systemic acquired resistance induced by localized virus infections in plants // Virology. 1961. - V. 14, №3. - p. 340-358;

211. Saccardo P.A. Sylloge fungorum omnium hucusgue cogitorum. Patavii.- 1885;

212. Saccardo P.A. Sylloge fungorum omnium hucusgue cogitorum.1. Patavii. 1901;

213. Sahai, A.S. Chitinases of fungi and plants: their involvment in morphogenesis and host-parasite interaction /A.S. Sahai, M.S. Manocha // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - V. 11. - p. 317-338;

214. Samuels, G.J. The Hypocrea schweinitzii complex and Trichoderma sect. Longibrachiatum. / G.J. Samuels, O. Petrini, K. Kuhls, E. Lieckfeldt, C.P. Kubicek // Studies in Mycology. 1998. - № 41. - p. 1-54;

215. Samuels, G.J. Trichoderma asperellum: a new species with warred conidia, and redescription of T.viride / G.J. Samuels, E. Lieckfeldt, H.I. Nirenberg // Sydowia. 1999. -V. 51, № 1. - p. 71-88;

216. Samuels, G.J. Trichoderma species associated with the green mold epidemic of commercially grown Agaricus bisporus / G.J. Samuels, S.L. Dodd, W. Games, L.A. Castlebury, O. Petrini // Micologia. 2002. - № 94. - p. 146-170;

217. Samuels, G.J. Trichoderma stromaticum sp. nov., a parasite of the cacao witches broom pathogen / G.J Samuels, R. Pardo-Schultheiss, K. P. Hebbar, R. D. Lumsden, C. N. Bastos, J. C. Costa, J. L. Bezerra // Mycol. Res. 2000. -V.104.-P. 760-764;

218. Schwarz, K. Selenium as an integral part of Factor 3 against dietary necrotic liver generation / K. Schwarz, C.M. Folltz // J. Am. Chem. Soc. 1958. -V.79. - p. 3292;

219. Serrano-Carreon, L. Metabolism of linoleic acid and 6-pentyl-a-pyrone biosynthesis by Trichoderma species / L. Serrano-Carreon, Y. Hathout, M. Bensoussan, J.M. Belin // Applied and Environmental Microbiology. 1993. — V.59. - p. 2945-2950;

220. Shah, J. Biochemistry and Molecular Biolodgy of Plant Hormone / J. Shah, D.F. Klessig, Eds. K Libbenga, M. Hall, P. G. J. Hooykaas // Elsevier. -1999.-V.33.-p. 513-554;

221. Shirasu K., Nakajima H., Rajasekher V. K., Dixon R. A., Lamb C. // Plant Cell. 1997. -V.9, №2. - p. 261-270;

222. Singh, S. Production and antifungal activity of secondary metabolites of Trichoderma virens / S. Singh, P. Dureja, R.S. Tanwar, A. Singh // Pestic Res J. -2005.-V.17.-p. 26-29;

223. Sivan, A. The possible role of competition between Trichoderma harzianum and Fusarium oxysporum on rhizosphere colonization / A. Sivan, I. Chet // Phytopathology. 1989. - V.79, №2. - p. 198-203;

224. Sivasithamparam, K. Secondary metabolism in Trichoderma and Gliocladium / K. Sivasithamparam, E.L. Ghisalberti // Trichoderma and Gliocladium, London: Taylor and Francis. 1998. - V. 1. - p. 139-191;

225. Stitcher, L., Mauch-Mani B., Metraux J.P. // Annu. Rev. Plant Pathol.- 1997. V.35. - p.235-270;

226. Sunde, R.A. Molecular biology of selenoproteins // Annu. Rev. Nutr.- 1990.-V.10.-p. 451-474;

227. Tenkanen T.M., Siika-aho M. // Tricel 97. Program and Abstracts. Ghent. Belgium. 1997. - p. 19;

228. Tronsmo, A. Biological and integrated controls of Botrytis cinerea on apple with Trichoderma harzianum II Biological Control. 1991. - V.l. - p. 59

229. Turovzi, G.Y. More Trichoderma species from Hungary / G.Y. Turovzi, L. Yajna, Z. Bratek // Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica.- 1994. V.29, № 3-4. - p. 259-271;

230. Ulhoa, C.J. Purification and characterization of an extracellular chitobiase from T. harzianum / C.J. Ulhoa, J.F. Peberdy // Curr. Microbiol. 1991.- V.23. p. 285-289;

231. Van Loon, L.C. Pathogenesis-related proteins // Plant Mol. Biol. -1985.-V.4, №2-3.-p. 111-116;

232. Van Loon, L.C. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins / L. C. Van Loon, E.A. Van Strien // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1999. - V.55. - p. 85-97;

233. Veerkamp J, Gams W. Los Hongos de Colombia. VIII. Some new species of soil fungi from Colombia // Caldasia. 1983. - V. 13. - p. 709-1717;

234. Verma, M. Antagonistic fungi, Trichoderma spp.: Panoply of biological control. / M. Verma, Satinder K. Brar, R.D. Tyagi, R.Y. Surampalli, J.R. Val'ero // Biochemical Engineering Journal. 2007. — V.37. - p. 1-20;

235. Vinale, F. Major secondary metabolites produced by two commercial Trichoderma strains active against different phytopathogens / F. Vinale, R. Marra, F. Scala, E.L. Ghisalberti, M. Lorito, K. Sivasithamparam // Lett Appl Microbiol. -2006

236. Vinale, F. 7>/c/zocfema-plant-pathogen interactions // F. Vinale, K. Sivasithamparamb, E. L. Ghisalberti, R. Marra, S.L. Woo, M. Lorito / Soil Biology & Biochemistry. 2008. - V.40. - p. 1-10;

237. Viterbo, A. Significance of lytic enzymes from Trichoderma spp. in the biocontrol of fungal plant pathogens / A. Viterbo, O. Ramot, L. Chernin, I. Chet // Antonie van Leeuwenhoek. 2002. - V.81. - p. 549-556;

238. Wakelin, S.A. Saprophytic growth in soil of a strain of Trichoderma koningii / S.A. Wakelin, K. Sivasithamparam, A.L.J. Cole, R.A. Skipp 11 New Zealand Journal of Agricultural Research. 1999. - V.42. - p. 337-345;

239. Watkinson, J.H. Analytical Chemistry, New York, 1966;

240. White, R.F. Acetyl salicylic acid (aspirin) induces resistance to tobacco mosaic vims in tobacco // Virology. 1999. - V.99, №2. - p. 410-412;

241. Wittwer A.J. Selenium-containing tPNA and tRNA Lys, from Escherichia coli: purification codon specificity, and translational activity / A.J. Wittwer, W.M. Cbing // Biofactors. 1989. - V.2. - p. 27-34;

242. Woo, S.L. The molecular biology of the interactions between Trichoderma spp., phytopathogenic fungi, and plants / S.L. Woo, F. Scala, M. Ruocco, M. Lorito, // Phytopathology. 2006. - V.96. - p. 181-185;

243. Yedidia, I. Induction of defence responses in cucumber plants (Cucumis sativus L.) by the biocontrol agent Trichoderma harzianum / I. Yedidia, N. Benhamou, I. Chet // Applied Environmental Microbiology. 1999. - V.65. -p. 1061-1070;

244. Zimand, G. Use of the RAPD procedure for the Identification of Trichoderma Strains / G. Zimand, L. Valinsky, Y Elad, I. Chet, S. Manulis // My col. Res. 1994. - V.98. - p. 531-534;

Информация о работе

Бондарь, Полина Николаевна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Штаммы грибов рода Trichoderma (Pers.: Fr.) как основа для создания биопрепаратов защиты растений и кормовых добавок - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы