Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экология грибов рода Trichoderma (Pers.:Fr.) бассейна реки Енисей, их биологические свойства и практическое использование
ВАК РФ 03.02.12, Микология
Автореферат диссертации по теме "Экология грибов рода Trichoderma (Pers.:Fr.) бассейна реки Енисей, их биологические свойства и практическое использование"
На правах рукописи
САДЫКОВАВера Сергеевна „7.
ЭКОЛОГИЯ ГРИБОВ РОДА ТШСНООЕША (РЕЛвТрг.) БАССЕЙНА РЕКИ ЕНИСЕЙ, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
Специальности: 03.02.12 - Микология 03.01.06. - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук
1 9 ДПР ¿012
005019241
Москва - 2012
005019241
Работа выполнена на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии Сибирского государственного технологического университета (г. Красноярск) и кафедре микологии и альгологии Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научные консультанты: доктор биологических наук, ведущий научный
сотрудник кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова А.Н. Лихачев доктор биологических наук, зав. кафедрой микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова A.B. Кураков
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, зав.
кафедрой биохимии ФГБОУ «Казанский государственный университет» имени В.И. Ленина Ф.К.Алимова
доктор биологических наук, руководитель секции коллекции культур ГНЦА М.В. Бибикова
доктор биологический наук, профессор кафедры биотехнологии РХТУ имени Д.Г. Менделеева Н.Б. Градова
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный
аграрный университет»
Защита состоится 18 мая 2012 г в аудитории М-1 в ч. мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, ГСП - 2, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет Факс- (095)939-3970.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова
Автореферат разослан апреля 2012
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук М. В. Гусаковская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Активному изучению биологии, филогении, распространению микромицетов рода Trichoderma, а также ряду важных аспектов, связанных с механизмами биоконтроля, биосинтеза ферментов и антибиотиков, благодаря их широкому применению в практике, посвящено много внимания в России и за рубежом (Александрова, 2000; Алимова, 2006; Гринько, 2001; Сейкетов,1972; Druzhinina et al„ 2005, 2009; Harman, 2004; Samuels, 1996; 2006; Vinale, 2008). Однако, несмотря на множество исследований, потенциал грибов рода Trichoderma не только не исчерпан, но и не до конца раскрыт (Samuels, 2009). К настоящему времени практически отсутствуют данные, связанные с исследованием механизма аллелохимического действия на микробиоту, простейших, беспозвоночные и растения. Установлено, что виды этого рода синтезируют более 200 биологически активных веществ (Korolev et al., 2009; Rejno, 2008) и могут успешно применяться в медицине и сельском хозяйстве. Недостаточная изученность биохимического состава мицелия и метаболитов видов рода Trichoderma не дает возможности безопасного использования их биомассы в кормопроизводстве и других отраслях народного хозяйства и медицины.
Описание видов, распространенных на территории России, касается лишь европейской ее части (Александрова, 2006; Алимова, 2006; Кирцидели, 1999), сведения о видовом составе Trichoderma на территории азиатской части России, в частности, в Сибири, малочисленны (Громовых и др., 2005; Якименко, 1996; Kullnig, 2000). Изучению видов на территории бассейна реки Енисей, протяженность которого составляет более 3 тыс. километров, посвящено небольшое число работ (Прудникова, 2000; Громовых, 2002). Эти исследования имели направленный характер поиска штаммов-продуцентов биопрепаратов защиты растений. На территории бассейна реки Енисей, охватывающей три климатических пояса: арктический, субарктический и умеренный, в которых расположены восемь природных лесорастительных зон, полномасштабные исследования видов рода Trichoderma и оценка их экологической значимости не проводились, не изучена молекулярно-генетическая характеристика видов этого рода.
В последние десятилетия грибы рода Trichoderma заняли одно из ведущих мест в качестве ведущих объектов биотехнологии полезных продуктов и препаратов. Целенаправленный поиск видов, обладающих регуляторной активностью по отношению к организмам из разных таксонов, как и выявление среди них продуцентов для биотехнологических производств невозможен без четкого представления об их распространении в экосистемах и функциональных свойствах в этих условиях. Созданные коллекции, на основе новых активных штаммов, могут быть потенциалом для отбора штаммов грибов рода Trichoderma и использования их в различных сферах биотехнологии, сельского хозяйства и растениеводства.
Целью работы было определение разнообразия и гетерогенности видов рода Trichoderma в наземных экосистемах бассейна реки Енисей и оценка возможности их использования в биотехнологии и создании биопрепаратов для защиты растений.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- характеристика видового разнообразия и распространения грибов рода ТпсЬоёегта в различных компонентах наземных экосистем бассейна реки Енисей;
- создание коллекции культур микромицетов рода Тпс1юс1егта;
- изучение гетерогенности видов рода ТпсИос]ета (по культурально-морфологическим свойствам, потреблению субстратов, антибиотической активности, по температуре, аэрации);
- исследование роста штаммов при различных концентрациях тяжелых металлов;
- исследование вегетативной совместимости моноспоровых штаммов рода Тг1с1юс1егта;
Для установления возможности использования штаммов рода Тпс1ю(}егта в биотехнологии проводили:
- поиск штаммов рода Тгккос1егта с высокой антагонистической активностью к фитопатогенным грибам для создания биопрепарата защиты растений;
- скрининг штаммов, стимулирующих рост хвойных и злаковых растений и идентификация соединений, ответственных за этот эффект;
- твердофазное культивирование штаммов для разработки биотехнологии биофунгицидов и вермикомпостирования;
- оценка активности штаммов рода Тпс1юс1егта к патогенным и условно-патогенным бактериям для создания препаратов, ускоряющих элиминацию этих организмов из почв, органических отходов и сточных вод;
- испытание полученных опытных образцов биофунгицидов и вермикомпостов против возбудителей болезней хвойных и злаковых растений на естественных и искусственных инфекционных фонах;
- скрининг штаммов по биохимического составу (содержанию белка, аминокислот и липидов) мицелия и аккумуляции селена для разработки кормовых добавок;
- изучение противоопухолевой активности штаммов рода Тпс}юс1егта для отбора продуцентов противоопухолевых препаратов.
Научная новизна. В результате масштабных инвентаризационных исследований ненарушенных лесных почв и агроценозов бассейна реки Енисей составлен список видов ТпсИос1егта, среди которых Т. скппоутс1е, Т. ИатаШт и Т. а1го\чг1с1е отмечены впервые. Показано, что возникающие внутривидовые группировки у видов рода Тг1с1юс1егта выполняют роль краевых популяций, осуществляющих освоение новых субстратов и эколого-трофических ниш. Установлена высокая пластичность аэробного и анаэробного метаболизма, что обеспечивает специализацию к субстратам и поддержание численности видов рода Тгккос1егта в различных лесорастительных зонах бассейна реки Енисей. Показано, что неполная изоляция группировок снижает возможность образования гетерокарионов, что в конечном итоге, приводит к морфологическим, культуральным и биохимическим различиям клонов.
В области фундаментальной биотехнологии исследование дает исходный материал для инвентаризации рода Тпс/юс/егта и теоретического обоснования методов направленного поиска и скрининга промышленно важных штаммов микроорганизмов. Показано, что популяции грибов рода Тпскос/егта являются природным резервуаром для поиска штаммов-продуцентов биологически активных
соединений, эффективных для контроля широкой группы организмов: фитопатогенных грибов, условно-патогенных и патогенных бактерий, опухолевых клеток, а также стимулирующих рост высших растений. Стабильность культурально-морфологических признаков является критерием отбора штаммов-продуцентов для получения целевых продуктов в биотехнологии.
Впервые установлена ростстимулирующая активность у выделенных штаммов рода Trichoderma в отношении растений и каллусов злаковых и хвойных, связанная со способностью синтезировать вещества ауксиновой природы (индолилуксусную кислоту); отобраны перспективные штаммы для получения биопрепаратов, рекомендованные для стимулирования роста и защиты растений от корневых гнилей, вызываемых фитопатогенами из родов Alternaría, Bipolaris и Fusarium.
В результате исследований биологической активности метаболитов и экстрактов из спор и мицелия штаммов рода Trichoderma в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов и линий опухолевых клеток изучен механизм токсического действия и даны рекомендации для использования активных штаммов как продуцентов биологически активных противоопухолевых соединений.
Исследован биохимический состав биомассы и культуральной жидкости штаммов Т. asperellum, Т. harzianum, Т. koningii и Т. viride. Изучено влияние селена на накопление биомассы штаммов рода Trichoderma при поверхностном и глубинном культивировании, определена способность к накоплению селена мицелием штаммов и показана возможность их использования для получения кормовых добавок.
Основные защищаемые положения:
1. Лесные подстилки, верхние горизонты почв и корневые системы древесных растений - ведущие факторы в формировании видового состава и численного пула грибов Trichoderma. Представители этого рода предпочитают растительный опад, богатый лигноцеллюлозной органикой, их численность падает в ризосфере растений, особенно древесных, в сравнении с лесной подстилкой.
2. Абиотические факторы (температура, аэрация, влажность) и субстратная специфичность определяют доминирование определенных видов рода Trichoderma в разных лесорастительных зонах.
3. Популяционная структура видов характеризуется значительной физиологической пластичностью и представляет собой мозаику клонов, с различными типами совместимости, скорости роста, спороношения, антибиотической активности и конкурентоспособности. Виды представлены агрегатами гетерогенных популяций с разным соотношением культурально-морфологических типов.
4. Популяции грибов рода Trichoderma являются природным резервуаром для поиска штаммов-продуцентов биологически активных соединений, эффективных для контроля широкой группы организмов: фитопатогенных грибов, условно-патогенных и патогенных бактерий, опухолевых клеток, а также стимулирующих рост высших растений.
Практическая значимость работы. Создана коллекция штаммов рода Trichoderma, проведен скрининг штаммов, имеющих потенциальную ценность для производства биопрепаратов стимулирования роста и защиты растений: Т. asperellum МГ/6 (ВКПМ F-878 и Т. harzianum М99/5 (ВКПМ F-888); вермикомпостов: Т. asperellum МГ-97 (ВКПМ F-675); кормовых добавок:
Т. asperellum штамм ТН-5 и противоопухолевых соединений: Т. asperellum Т-30 (ВКМ F4340D), Т. harzianum TV4-1 (ВКМ F4341D) и Т. harzianum М99/51 (ВКПМ F- 1027).
Показана возможность использования штаммов Т. asperellum МГ/6 и Т. harzianum М99/5 для переработки отходов предприятий деревообрабатывающей и гидролизной промышленности. Подобран оптимальный растительный субстрат из отходов деревообрабатывающей промышленности для твердофазного культивирования продуцентов. Разработана в лабораторных условиях технология биопрепарата Триходермин-М. Наработана опытная партия биопрепаратов и проведены опытно-производственные испытания биопрепаратов на сеянцах хвойных в лесном питомнике и культурах злаковых растений. Показано положительное влияние биопрепаратов на увеличение урожайности злаков и выход здоровых сеянцев в питомнике.
На основании проведенных исследований даны рекомендации для использования штамма Т. asperellum МГ/6 в технологии вермикомпостирования и штамма Т. asperellum ТН-5 для разработки кормовой добавки для птиц.
Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на 1 — м конгрессе микологов России, Москва, 2002; XIV Congress of European Mycologists, Ялта, 2003; XI съезде Русского ботанического общества «Ботанические исследования в Азиатской России», Новосибирск-Барнаул, 2003; 75 th Anniversary Meeting Canadian Phytopathology Society, Ottawa, 13-16 June, 2004; 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium, April 6-8, Vienna, Austria, 2006; 2-й Российской конференции «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока», 2006; International Symposium «EU-Russia: Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framework Programme», June 5-9, 2006, St.-Petersburg; Di Всероссийском популяционныйом семинаре «Особь и популяция - Стратегия жизни», 2-7 октября, 2006, Уфа; Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна 28 ноября - 1 декабря, Пущино, 2006; 4 Съезда Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова 5-7 декабря, Пущино, 2006; International symposium «Best practice in disease, pest and weed management», 10-12 May, Berlin, 2007; Международной научной конференции «Современные средства, методы и технологии защиты растений». - Новосибирск, 2008; 5 Съезде Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, 2008; VII Международной конференции «Проблемы лесной фитопатологии и микологии», Пермь, 7-13 сентября 2009; Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов», проходившей в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 15-17 марта, Москва, 2010; Всероссийской конференции «Биологически активные вещества», посвященная 90-летию М.С. Егорова, 29-30 ноября, Москва, 2011.
Работа выполнена при финансовой поддержке следующих грантов: РФФИ-офи - №06-04-08040-офи «Создание высокопродуктивных, устойчивых к патогенам форм хвойных растений в культуре in vitro, на основе современных достижений в области половой репродукции голосеменных»; РНП.2.2.3.1.2466 Министерства образования и науки РФ «Развитие гербарной коллекции и музея культур грибов Средней Сибири как базы для научно-образовательного процесса»; РФФИ «Енисей» - №090498008 «Биологический контроль биотехнологии сокультивирования хвойных в культуре in vitro с биопрепаратами рода Trichoderma
и Streptomyces»; Ведущие научные школы НШ-5189.2008.4 "Биоразнообразие грибов - научная основа поиска новых генотипов для биотехнологии и других хозяйственно важных напралений"
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ, в том числе 18 статей в изданиях, входящих в «Перечень периодических научных изданий, рекомендуемых ВАК», 1 коллективная монография, получены 2 патента РФ и 2 положительных решения о выдаче. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с сотрудниками, работавшими совместно с автором при выполнении исследований.
Структура и объем работы. Диссертационная работа стоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации 388 страниц машинописного текста. Основная часть содержит 66 рисунков и 64 таблицы. Список литературы включает в себя 562 источников отечественных и зарубежных авторов.
Личный вклад автора. Автору принадлежит идея исследования видового состава микромицетов рода Trichoderma на территории бассейна реки Енисей, разработка методологии выполнения экспериментальных исследований и теоретическое обоснование задач. Основная работа по получению материала, обобщению результатов и формулированию выводов выполнена лично автором. Молекулярно-генетическую идентификацию видов Trichoderma проводили при активной помощи Дж. Биссетта, зав. лабораторией микологии (г. Оттава), сотрудника Института химической инженерии в Вене (Австрия), д.б.н. Дружининой И.А, зав. центра генетики Казанского федерального университета Тухбатовой Р.Э. Токсикологическую оценку и перевариваемость мицелиея грибов на установке «Искусственный желудок» проводили в МГУПБ под руководством доц., к.б.н. Черемных Е.Г., оценку противоопухолевой активности проводили в Международном научном центре СО РАН под руководством к.б.н., с.н.с. Е.В. Инжеваткина и в НИИ биоорганической химии имени академиков Шемякина М.М. и Овчинникова Ю.А. под руководством к.б.н., с.н.с. Е.В. Свирщевской. Ростстимулирующие свойства штаммов проводили на каллусах хвойных, изолированных в Институте Леса им. В.Н. Сукачева под руководством д.б.н. И.Н. Третьяковой Мультисубстратное тестирование проводили при содействии д.б.н., в.н.с. Б.А. Вызова и к.б.н., н.с. A.B. Якушева. Исследование химического состава биомассы, культуральной жидкости грибов, а также растительных субстратов проводили при содействии д.т.н., проф. Т.В. Рязановой, к.т.н., доц. В.М. Ушановой и к.х.н., доц. H.A. Чупровой. В организации полевых исследований на базе КрасНИИСХ принимали участие д.б.н. Н.В. Зобова, на базе ГУ «Мининский лесхоз» A.B. Гребинник. Автор выражает большую признательность и благодарность всем коллегам, оказавшим неоценимую поддержку при выполнении исследований.
Глубокую благодарность автор приносит своим научным консультантам -д.б.н., вед. н.с. А.Н. Лихачеву и д.б.н., зав. каф. A.B. Куракову, а также сотрудникам кафедры: д.б.н., проф. Ю.Т. Дьякову, д.б.н., проф. Л.В. Гарибовой, д.б.н., проф. И.И. Сидоровой, за важные советы и всестороннее содействие при выполнении работы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследований, показаны научная новизна и практическая ценность результатов работы.
1 Обзор исследований грибов рода Trichoderma: систематика, распространение, физиолого-биохимические свойства и практическое использование
Анализируются подходы к целенаправленному поиску видов рода Trichoderma, обладающих регуляторной активностью к другим организмам как в природных экосистемах, так при их интродукции в агроэкосистемы, выявление среди них продуцентов биологически активных веществ. Рассмотрены распространение грибов рода Trichoderma в экосистемах, особенности эколого-трофических ниш и проявления функциональных свойств. Представители этого рода влияют на почвообразовательные процессы, структуру почвы, участвуя в образовании гумуса и минерализации растительных остатков, регулируют комплекс микробиоты и ограничивают развитие фитопатогенных видов. Доминирование грибов Trichoderma в микробоценозах связано с реализацией в экосистемах гетеротрофного и биотрофного взаимодействий.
С момента первого описания представителей рода Trichoderma в 1794 г по 1969 г было дано морфологическое описание 8 агрегатов рода, а к 1991 г их число возросло до 27. В эру молекулярно-генетического анализа произошел критический пересмотр старой систематики Trichoderma, основанной на морфологических критериях. В результате количество видов Trichoderma к 2002 г увеличилось до 46, к 2005 г мультигенный филогенетический анализ позволили выявить 88 видов. С помощью компьютерной программы Barcode к началу 2006 г. определено 110 видов. Предполагается, что в ближайшие годы количество видов Trichoderma может превысить 130 и более.
В настоящее время исследования рода Trichoderma идут параллельно по трем направлениям: (а) биоразнообразие и распространение в различных регионах биосферы, (б) скрининг видов, перспективных для биотехнологии из новых выделенных и описанных изолятов Trichoderma и (в) разработка методологии быстрой и правильной идентификации и построения филогенетического древа рода Trichodema /Нуросгеа.
2 Объекты и методы исследований
Объекты исследований
В работе использовали коллекцию видов рода Trichoderma, состоящую из 620 штаммов, выделенных из образцов почв различных лесорастительных зон на территории бассейна реки Енисей, плодовых тел, растительных субстратов и семян растений. Штаммы поддерживаются в коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова и Центре биотехнологии и микологии СибГТУ.
Оценку антагонистической активности штаммов рода Trichoderma проводили на тест-культурах фитопатогенов злаков: Alternaría sp., В. bicolor, В. ellisii,
В. nodulosa, В. zeae, F. chlamydosporum, F. heterosporum, F. sambucinum, F. solani и F. sporotrichioides.
Для определения ростстимулирующей активности использовали семена и каллусы лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb), сосны сибирской (Pinus sibirica Du Tour), сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), пшеницы яровой линий «КС-1554» и «КС-1607», ячменя ярового сорта «Красноярский-80». Эксплантами для индукции каллуса злаковых служили незрелые зародыши семян ячменя и пшеницы, для хвойных растений использовали незрелые зиготические зародыши элитных деревьев-доноров.
Противоопухолевую активность штаммов оценивали, используя линии клеток: асцитной карциномы Эрлиха, НаСаТ - кератиноциты человека; НЕК 293Т-клетки эмбриональной почки человека и К562- линии клеток хронической миелоидной лейкемии. В опытах in vivo использовали линии белых мышей аутбредной популяции ICR. Для исследования антибактериальной активности использовали 9 штаммов резистентных госпитальных стафилококков из коллекции КрасГМ) и коллекции Института Проблем Севера СО РАН. Биотестирование на токсичность проводили на двух тест-объектах простейших: Paramecium caudaíum и Tetrahymena pyriformis.
Методы исследования
Образцы почвы отобраны в соответствии с правилами отбора проб для микробиологического анализа (Методы ..., 1991). Выделение изолятов грибов рода Trichoderma из образцов почв, ризосферы, ризопланы корней и филлопланы, растительных остатков, плодовых тел макромицетов проводили в период 1997 — 2008 гг методом посева на специализированные среды (Звягинцев, 1989). Идентификацию штаммов вели по культурально-морфологическим (Александрова с соавт., 2001; Chaverri et al., 2003; Samuels, 2003) и генетическим признакам (Druzhinina et al., 2005). Описание строения репродуктивных органов, очертания спор, размеров мицелия проводили методом сканирующей электронной микроскопии. Для подтверждения видовой принадлежности проводили генетическую идентификацию. Исследовали участки ядерной рДНК, содержащий ITS1 и 2 и ген tefl. Результаты секвенирования фрагмента гена tejí обрабатывали при помощи пакета программ Lasergene 5.03 (DNASTAR, Inc., США). Для анализа секвенсных хроматограмм использовали программу SeqMan и дальнейшим выравниванием последовательностей и экспорта их в формате GCG с использованием программы MegAlign. Молекулярную идентификацию нуклеотидных последовательностей - с программой TrichoMark — TrichoBLAST.
Моноспоровые культуры грибов получали методом разведения конидиальной суспензии на жидких питательных средах с добавлением глицерина (Лихачев, 1994). О стабильности моноспоровых и исходных штаммов судили по их разделению на кулмурально-морфологические типы (КМТ), появлению секторов при росте на чашках Петри. Цвет колоний определяли по шкале A.C. Бондарцева (1953). Вегетативную совместимость моноспоровых клонов изучали парным сращиванием колоний на среде Чапека, с последующ™ микроскопированием пограничной зоны между колониями. Характер проявления реакций при визуальной оценке и микроскопировании определяли по методу Ю.Т. Дьякова и A.B. Долговой (1995).
Способность к анаэробному росту изучали в анаэростатах («BioMerieux Со», Франция). Анаэробиоз создавали с помощью газовых анаэробных пакетов «GENbox anaer» и контролировали индикаторами на основе резазурина ("Oxoid Limited", Англия). Активность спиртового брожения определяли у штаммов, проявивших способность к росту в условиях анаэробиоза на жидкой минеральной среде. Содержание спирта в культуральной жидкости определяли методом газожидкостной хроматографии на хроматографе модели Chrom 3700 с пламенно-ионизационным детектором, колонка SOVPOL (1,5 м) и Parapac Q (0,5 м), газ носитель - аргон, температура колонки 160 °С и 130 °С, испарителя 240 °С, детектора 250 °С.
Интенсивность утилизации органических соединений определяли методом Biolog Phenotype MicroArray (РМ) system (Кожевин и др., 2008; Druzhinina, 2006; Tanzer et al., 2003). Оптимум роста при различных температурах определяли путем культивирования на сусло-агаре. Режим культивирования задавали в пределах 4-х градаций: 15-20, 20-25, 25-30 и 30-35 °С. Влияние тяжелых металлов на рост штаммов Trichoderma изучали путем культивирования штаммов на твердых и жидких средах, с добавлением различных концентраций от 0,01 до 10 ммоль/л меди, цинка, кадмия, свинца. Определение количества тяжелых металлов в растворах и мицелии проводили методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе Agilent 7500 Series ICP-MS.
Антагонистические свойства штаммов рода Trichoderma оценивали по показателям гиперпаразитической и антибиотической активности, в отношении фитопато генных микромицетов (Великанов, 1992; Егоров, 2005). Антибактериальную активность культуральных фильтратов и экстрактов мицелия штаммов в отношении условно-патогенных бакгериий и резистентных госпитальных стафилококков оценивали методом лунок (Бурмистрова, 2005). Противоопухолевую активность компонентов культуральной жидкости, и экстрактов спор штаммов изучали in vitro на 4-х линиях опухолевых клеток и in vivo на аудрбедной линии ICR лабораторных мышей. Фильтраты культуральной жидкости и экстракты из спор штаммов рода Trichoderma тестировали на линиях опухолевых клеток, предоставленных лабораторией клеточных взаимодействий ИБХ РАН и Международным научным центром СО РАН. Для выявления у исследуемых образцов противоопухолевой активности проводили оценку цитостатичности in vitro с помощью MIT теста и оценку проапоптотической активности. Фракционный состав активных компонентов культуральной жидкости изучали на жидкостном хроматографе «Shimadzu» (Япония) на колонке с обращенной фазой Perkin Elmer С18 (250x4,6 мм, 5мкм) в градиенте ацетонитрила 0-100% в 0,1% трифторуксусной кислоте при скорости потока 1,5 мл/мин. и длине волны 214 нм.
Оценку токсичности исследуемых штаммов в отношении простейших проводили по методу Е.Г. Черемных (2005), состоящему из трех последовательных этапов. На первом этапе оценивали выживаемость тест-объектов инфузорий Paramecium caudatum в водных экстрактах мицелия и спор и культур альных фильтратах. На втором этапе проводили оценку токсичности на тест-обьектах Tetrahymena pyriformis. На третьем этапе исследований подбирали нетоксичную концентрацию и увеличивали время экспозиции объекта с использованием обеих популяций простейших. Ростстимулирующее действие метаболитов штаммов рода Trichoderma изучали по показателям энергии прорастания и всхожести семян с
10
использованием метода влажных камер (ГОСТ 13056.5-76). Оценку стимуляции роста проводили на каллусов злаков и хвойных растений путем их культивирования с добавлением метаболитов штаммов. Пролиферацию каллусных культур проводили на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 1 % и 3 % концентрации фильтратов культуральной жидкости штаммов Trichoderma в питательную среду. Содержание индолилуксусной кислоты в культуральной жидкости штаммов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе KNAUER на колонке Zorbax с диаметром 4,6 мм, длиной 250 мм, заполненной обращенным фазовым сорбентом SB-C18 зернением 5 цкм. В качестве элюента использовали раствор ацетонитрила с 2 % уксусной кислотой в соотношении (1:4). Детектирование осуществляли при X. 280 нм. ИУК определяли в диапазоне от 0 до 5 мг/л (г=0,9998), со стандартным отклонением пика 3,5 % (п=6).
Биохимический состав биомассы и метаболитов грибов рода Trichoderma исследовали по следующим показателям: общее количество белка - по методу Кьельдаля (Емельянова, 1976); аминокислотный состав - на автоматическом аминокислотном анализаторе A0326V2 (Knauer, Германия), общее содержание триптофана - спектрофотометрическим методом, разработанным в Институте биохимии им. АН. Баха РАН, содержание липидов с их последующим разделением на нейтральные, глико - и фосфолипиды - по методу Блайя и Дайера (Кейтс, 1975).
Концентрацию селена в мицелии грибов рода Trichoderma измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии (атомно-абсорбционный спектрометр «Квант-гЭТА»), Процедуру минерализации проб в аналитических автоклавах проводили в соответствии с МУК 4.1.985-00. Перевариваемость мицелия проводили на установке «Искусственный желудок», разработанной в МГУ IIb.
Твердофазное культивирование грибов рода Trichoderma проводили на растительных субстратах: коре пихты исходной и после различных химических обработок, коре лиственницы; гидролизном лигнине, вегетативной части топинамбура исходного и после водной экстракции. Определение химического состава сырья после биодеструкции проводили по общепринятым в химии растительного сырья методикам (Химия древесины, 1994).
Полевые испытания биопрепаратов на основе штамма T. harzianum М99/5 проводили на посевах Pinns sibirica L. в Мининском лесном питомнике, расположенном на территории Мининского опытного лесного хозяйства (5б°10'с.ш., 92°42'в.д). Классификацию категорий сеянцев определяли по количеству всходов в опыте и контроле и степень проявления болезни сеянцев. Полевые испытания препарата на основе штамма T. asperellum МГ/6 проводили на посевах пшеницы линии «КС-1554» и ячменя сорта «Красноярский-80» в Мининском ОПХ (56°10' с.ш., 92°42; в.д.). Результаты действия биопрепаратов оценивали после сбора урожая по следующим параметрам: масса 1000 зерен, высота растений, продуктивная кустистость, количество зерен в колосе, количество растений к уборке, урожайность. Влияние внесения биопрепаратов на микробиоту почв оценивали традиционными методами (Звягинцев, 1991; Сэги, 1983).
Статистическую обработку результатов экспериментов и оценку достоверности различий проводили по критерию Стьюдента для уровня вероятности не менее 95 % с использованием Microsoft Excel 2007 и Statistica 8.0.
3 Характеристика видов рода Trichoderma наземных экосистем бассейна реки Енисей
3.1 Распространение видов рода Trichoderma
В настоящей работе исследовали почвы всех лесорастительных зон территории бассейна реки Енисей, имеющие аграрную значимость для сельскохозяйственных нужд и лесовосстановления. Из подстилки и различных горизонтов целинных и окультуренных почв ризосферы хвойных в трех климатических поясах (арктическом, субарктическом и умеренном) семян хвойных и злаков и плодовых тел макромицетов выделено 620 штаммов как материала для дальнейших исследований и оценки биоразнообразия и значимости видов рода Trichoderma.
Представители рода Trichoderma встречаются в почвах всех исследуемых климатических зонах, включая тундру. Самая высокая встречаемость изолятов Trichoderma отмечена в естественных биоценозах и почвах лесных питомников. Агроценозы злаков характеризовались снижением встречаемости и видового разнообразия Trichoderma.
При идентификации изолятов с помощью культурально-морфологических и молекулярно-генетических методов в почвах 3-х климатических зон выделено 8 видов. Среди видов, ранее не обнаруженных на исследуемой территории, были: Т. citrinoviride Bissett, T. hamatum (Bon) Boner и T. atroviride Koning. (таблица 1).
Таблица 1 - Список видов и количество изолятов грибов рода Trichoderma, выделенных на территории бассейна реки Енисей
Вид Количество изолятов
% от общего числа Число изолятов
Trichoderma sect. Trichoderma
T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg 37,9 235
Группа T. viride Pers, Fr. 10,5 65
T. hamatum (Bon) Boner 3,8 24
Группа T. koningi Oudemans et Koning 4,2 26
T. atroviride 3,7 23
Trichoderma sect. Pachybasium
T. harzianum Rifai 26,1 162
• Trichoderma sect. Longibrachiatum
T. citrinoviride Bissett 8,5 53
T. longibrachiatum Rifai 5,2 32
Общее число выделенных изолятов 620
Установлено, что наиболее распространенным и часто встречающимся является вид Т. азрегеПит (37,9 % от общего числа выделенных изолятов).
12
Представители этого вида были выделены практически из всех местообитаний, при этом большинство выделенных изолятов этого вида были почвенными. Вторым по распространенности был вид Т. Ъагх'шпит, доля изолятов которого составила 26,1 % от общего числа. Изоляты этого вида также преимущественно были выделены из целинных и антропогенных почв, подстилки, но не были обнаружены на семенах злаковых и хвойных растений, листьях и шишках.
Доля Т. у/пс/е составялет 10,5 % всех исследуемых изолятов, причем большинство выделялись из подстилки, лесного опада, образцов гниющей древесины и ризосферы корней. Следует отметить, что этот вид не встречался в антропогенных почвах и агроценозах. Часть изолятов этого вида были выделены из плодовых тел.
Виды из секции Longibrachiatllm находятся на четвертом месте по распространенности и численной характеристике, доля Т. с'иг'то\пг1с1е составила 8,5 %, а Т. longibrachiatum - 5,2 % от общего количества выделенных. Изоляты этих видов были выделены из богатых органикой субстратов: подстилки, верхних горизонтов целинных почв и плодовых тел. Далее по распространенности следуют группа видов Т. копт§И (4,2 %), изоляты которой были обнаружены в верхних горизонтах целинных почв, гниющей древесине, а также хвое, шишках и почвы ризосферы деревьев. Самыми малочисленными по количеству и распространению были изоляты видов Т. ЬатаШт (3,8 %) и Т. Мгол>тс1е (3,7 %), предпочитающие более глубокие почвенные горизонты.
Можно проследить некоторые закономерности по распределению некоторых видов в разных климатических зонах. Так, вид Т. ахрегеИит имел широкий диапазон распространения и присутствовал как в почвах северных, так и южных широт бассейна реки Енисей, однако редко выделялся из почв лесных биоценозов Тывы и Хакасии. Вид Т. а1ту1г1с1е встречался в основном в холодных климатических условиях Эвенкии, а в более южных областях встречаемость этого вида снижается. Виды Т. ИатаШт, Т. с'Иг!по\>1г'к1е, Т. Иаг2шпит имеют широкий диапазон распространения, однако их находки немногочисленны в северных почвах, а к южным широтам их численность увеличивается.
Наибольшее число видов обнаружено в целинных почвах, в сравнении с антропогенными ландшафтами. Уменьшение видового разнообразия в антропогенных ландшафтах и агроценозах отмечено ранее и для других микромицетов (Марфенина, 2004). Среди типичных видов агроценозов нами обнаружено только пять: Т. аьрегеНит, Т. Ьаггшпит, Т. ИатаШт, Т. коп^г и Т. уИс/е. В почвах агроценозов и лесных питомников не были найдены виды Т. а1п№г1с>е, Т. 1оп%ЛгасЫаШт и Т. сИгтоутс1е. Распределение по лесорастительным зонам видов рода Тпскос1егта оказалось неодинаковым. Все восемь идентифицированных нами видов обнаружены только в трех лесорастительных зонах: южная тайга, травяные леса с островами лесостепи и островные степи. Во всех лесорастительных зонах выделены представители вида Т. азрегеЦит, причем в зонах средняя и южная тайга, травяные леса с островами лесостепи и островные степи этот вид входит в ядро доминирующих видов. Второе место по распространению занимает вид Т. а!гоу!гНе, однако во всех обнаруженных лесорастительных зонах вид представлен как случайный. Эти два вида выявлены как в зонах субарктического, так и умеренного климатических поясов. Очевидна приуроченность видов Т. ИатаШт Т. Ьагггапит и Т. утс1е к зоне умеренного климатического пояса. Изоляты вида Т. longibrachiatum выделены как
в зонах субарктического, так и умеренного климатических поясов, в которых вид представлен как случайный.
3.2 Влияние абиотических факторов на рост грибов рода Trichoderma
Представители видов рода Trichoderma не очень требовательны к условиям окружающей среды, однако имеют оптимальные границы условий температуры и влажности для своего развития и нормальной жизнедеятельности (Thodore & Panda, 1995). Влажность, температурный, световой режим, доступность органических и минеральных питательных веществ могут ускорять или замедлить процессы роста Trichoderma, а также определять переход от стадии покоя к вегетативному росту и формированию репродуктивных структур (Лугаускас, 1988; Kubota, 1995).
Влияние температуры на рост и развитие штаммов рода Trichoderma.
Доминирование и развитие определенных видов грибов Trichoderma в различных экосистемах во многом определяются влиянием температуры. Для сибирских изолятов восьми исследуемых видов температурный диапазон, при котором они способны расти и осуществлять спороношение, находится в пределах от 10 до 35 °С. Большинство штаммов являются типичными мезофиллами, оптимум температуры колеблется от 20 до 25 °С. Для некоторых штаммов вида Т. hamatum отмечен лучший рост при температуре 10 °С (средний диаметр колоний штаммов достигал 40 мм). При температуре выше 25 °С ингибируется рост штаммов Т. koningii, а низкие температуры ингибируют рост штаммов Т. ciírinoviride. Психрофильные штаммы, способные расти при температуре 5-10 °С обнаружены среди представителей Т. asperellum, T.viride и Т. atroviride, в основном это были штаммы, выделенные из почв северных территорий Красноярского края и Эвенкии. Установлено, что виды рода Trichoderma, типичные для холодных географических районов, имеют более низкий температурный оптимум для роста, чем виды теплых климатических районов. Наиболее высокой скоростью роста при 10 °С обладали изоляты вида Т. atroviride, выделенные из тундровых почв Эвенкии, где среднегодовые температуры воздуха не превышают 0 - 5 °С.
Для изолятов Т. asperellum и Т. atroviride, выделенных из умеренных и относительно холодных районов, характерен оптимум роста при низких значениях температуры. В то время как утверждать такую закономерность для других видов этого рода неправомочно. Среди изолятов вида Т. ciírinoviride психотолерантных штаммов обнаружено не было, все исследуемые представители этого вида росли при температуре выше 15°С. Изоляты видов Т. longibrachiatum и T.citrinoviride являются мезофиллами с оптимумом роста 25 °С. Однако среди представителей этих видов, а также вида Т. hamatum встречались также термотолерантные изоляты, которые росли при температуре выше 35 °С. Таким образом, отмечается внутривидовая вариабельность штаммов внутри вида по оптимуму роста при высоких и низких значениях температуры - 30 - 35 °С и 10 °С.
Рост и бродильная активность штаммов рода Trichoderma в анаэробных условиях
Большую часть видов Trichoderma традиционно относят к облигатным аэробам. Вместе с тем, в природе эти грибы часто встречаются в местообитаниях с
ограниченной обеспеченностью кислородом, что может способствовать преобладанию определенной популяции или видов в условиях с пониженным содержанием кислорода, таких как в затопляемых и нижних горизонтах почв. Для поддержания жизнедеятельности в таких условиях, при наличии легкодоступных углеводов, микромицеты, по-видимому, переходят к брожению. Имеются единичные сообщения о росте в анаэробных условиях и сбраживанию органических субстратов для отдельных представителей рода Тпс/ю^егта (Кураков и др., 2003; Лаврентьев и др., 2008). Исследования по влиянию такого важного экологического фактора, как доступный кислород, на развитие микромицетов рода Тг1с!юс1егта может способствовать пониманию преобладания определенной популяции или видов в условиях с пониженным содержанием кислорода.
Исследованиями М.В. Горленко показано, что снижение аэрации тормозит как образование фиалид, так и сам процесс конидиогенеза, а также влияет на содержание липидов в покоящихся структурах (Горленко, 1982). Изучение роста в анаэробных условиях у штаммов ТпсИос1егта, выделенных из разных эколого-трофических ниш, показало, что представители рода Тпскос1егта росли в анаэробных условиях с образованием субстратного и воздушного мицелия, но не формировали репродуктивных органов и не спороносили. Штаммы, способные к росту в анаэробных условиях, выявлены среди представителей всех исследуемых видов. Однако для штаммов вида Т. 1ощ1ЬгасЫаШт характерна большая чувствительность к недостатку кислорода, чем для штаммов других видов. Только два из 20 изученных штаммов этого вида были способны к слабому росту при отсутствии кислорода. Обнаружена взаимосвязь приуроченности места обитания штаммов и способности роста в отсутствии кислорода. Изоляты, выделенные из плодовых тел макромицетов, пищеварительного тракта дождевого червя, гидроморфных почв и верховых болот, характеризовались активным ростом в анаэробных условиях. В то же время штаммы, изолированные из семян хвойных растений, в этих условиях не росли (таблица 2).
Таблица 2 - Рост штаммов рода ТпсИо(]егта в анаэробных условиях
Вид Число штаммов
Прове Радиальная скорость роста, мм/ч
рено 0.01-0.05 0.05-0.10 >0.10
Т. ачрегеПшп 55 10 8 7
Т. Ит~1апит 32 10 2 1
Т. \nride 35 8 4 2
Т. ЬатаШт 24 2 2 1
Т.копт^и 26 5 4 2
Т. ¡опкЛгасМаШт 20 2 - -
Т. citrinoviride 25 3 3 2
Т. Шг(Ы1г\йе 10 1 3 1
Таким образом, способность роста в анаэробных условиях определяется не систематической принадлежностью гриба и существенно варьирует среди штаммов одного вида. У штаммов, которые хорошо росли в условиях анаэробиоза, была в
дальнейшем исследована активность спиртового брожения. Все протестированные штаммы на среде с глюкозой способны к спиртовому брожению, что позволяет их отнести к группе факультативных анаэробов. Штаммы с относительно высокой и умеренной активностью спиртового брожения встречаются среди видов Т. ИаЫапит, Т. аярегеНит, Т. сиппоутс1е и Т. котп%и.
В большинстве случаев эффективность сбраживания глюкозы составляла у штаммов этих видов 25-50 %. Умеренная активность спиртового брожения (накопление 0,2-0,6 % этанола) обнаружена у большинства штаммов Т. азрегеПит, эффективность сбраживания глюкозы у них составляла порядка 15-20 % на среде с 3 % глюкозы. Низкая бродильная активность отмечена для штаммов Т. Иатшит, Т. \iride, Т. а/гоу1г:Ле. Среди представителей Т. сИгтоуИЫе и Т. коп'т£и обнаружены как активные штаммы, накапливающие около 1 % этанола и более, так и очень слабо сбраживающие глюкозу. Изоляты видов Т. Иатапит, Т. а.^регеЦит и Т. копищИ, обладают бродильной активностью, сопоставимой с таковой у мукоровых грибов-сахаролитиков. Максимальный уровень накопления этанола на более богатых по содержанию Сахаров средах составил 3 - 5 %, что сравнимо с продукцией этанола у диких штаммов дрожжей БассИаготусеэ сегеуЬгае КБП-3781 и Натетаэрога 1Я.
Влияние ионов тяжелых металлов на рост штаммов рода Trichodeтma
Исследовано влияние ионов пяти тяжелых металлов: цинк, свинец, медь, никель, кадмий на скорость роста и продуктивность 42 штаммов 1Уichoderma на среде Чапека с добавлением соли металла в концентрациях: 1 ммоль/л, 5 ммоль/л, 10 ммоль/л.
Добавление тяжелых металлов в концентрации 1 ммоль/л полностью ингибировало спороношение и формирование репродуктивных органов грибов (конидиеносцев и фиалид). Наиболее токсичной из всех исследованных металлов для штаммов всех видов оказалась медь. Рост штаммов Т. аярегеЦит и Т. с'Пг'то\1г'^е полностью прекращался при ее концентрации 5 и 10 мМоль/л, а при 1 ммоль/л скорость роста у разных штаммов этих видов снижалась на 65 % и более в сравнении с контролем. Штаммы Т. longibrachiatum, Т. а1гоу1^е и Т. ИатаШт не росли на среде с добавлением меди даже при самой низкой концентрации. Самым устойчивыми к высоким концентрациям меди были штаммы Т. Иаг:'юпит М 99/ 5 и 30, способные расти при содержании меди в среде 5 ммоль/л. На втором месте по токсическому действию в отношении исследуемых штаммов Trichoderma был никель. Рост всех штаммов полностью ингибировался при содержании в среде никеля в количестве 10 ммоль/л. В концентрации 1 ммоль/л скорость роста штаммов снижалась от 20 до 45 % у штаммов видов Т. а.ърегеИит, Т. а[го\>1Г1Ле, Т. viride, Т. коп^И и на 45-55 % у штаммов Т. ЬатаШт. Для дальнейшего исследования продуктивности были отобраны наиболее устойчивые штаммы рода Trichoderma ТСЛ - 06, М 99/ 5 и 30 к высоким концентрациям тяжелых металлов для жидкофазного глубинного культивирования.
Особенности спектра утилизации органических веществ изолятов вида ТпеИойегта
Исследование спектра потребления органических веществ разными штаммами Trichoderma может способствовать пониманию их преобладания в разных экологических нишах и обеспечить целенаправленный поиск
16
перспективных для различных целей в биотехнологии. Анализ спектра утилизации 23 субстратов показал, что штаммы разных видов имеют в большей степени сходные, чем отличные профили потребления субстратов. Дискриминантый анализ выявил определенные межвидовые различия в степени усвояемости соединений (рисунок 1).
Яоо11 уз. Коо! 2
о Натапит
с Мгйа
Котлды
л С|1ппо«ск1е
• |_опд1Ьгас*11аЬт
* А1гсм^9 о НатаЬлп
АврегеИит
а Нэгаапцт
о КоптдН
- О(ппо<л(к1е
• 1_опд|Ьгэс1щакП1
■ А1гомгкЗе
о Натаихп
Рисунок 1 - Дискриминантный анализ спектров потребления 23 субстратов грибами 5 видов рода Тг1сИос1егта (эллипсы ограничивают область с вероятностью р=0.95)
Наибольшая специфика в утилизации отмечена для штаммов видов Т. катаШт и Т. \ongiЪгасЫаШт, которые характеризовались более узким спектром в сравнении со штаммами других видов. Для них отмечена ограниченная способность усваивать спирты и аминокислоты. По спектру и активности потребления субстратов, на основе анализа методом кластеризации по Варду, штаммы разделяются на две группы независимо от их видовой принадлежности (рисунок 1). В первую группу преимущественно вошли штаммы, выделенные из почв, во второй кластер вошли штаммы, изолированные из плодовых тел макромицетов, образцов растительных остатков, семян хвойных и злаковых растений. Для штаммов, вошедших во второй кластер, характерно более интенсивное потребление Сахаров, что, вероятно, может быть связано с их обитанием в условиях более богатых углеводными соединениями, чем почва.
Таким образом, при исследовании выборки штаммов обнаружены как межвидовые различия в способности к утилизации определенных субстратов, так и различия, связанные с местообитанием.
3.4 Гетерогенность изолятов видов рода Trichoderma
Отражение широкой пластичности грибов проявляется и в нестабильности признаков, свойственной представителям разных систематических групп грибов. Один из самых широко используемых критериев для выявления внутривидовой дифференциации микромицетов является сравнительный анализ культурально-морфологических признаков при их росте в условиях in vivo и in vitro. На их основе у ряда фитопатогенных грибов удалось установить наличие культурально-морфологических типов (КМТ), коррелирующих с проявлением патогенности и токсинообразования. Это четко прослеживается у ржавчинных грибов, возбудителя ложной мучнистой росы хмеля, «томатной» и «картофельной» рас фитофторы и у многих других фитопатогенных грибов. Для сапротрофов и, в частности, для рода Trichoderma такие исследования практически не проводились. Эколого-географические особенности регионов также влияют на проявление частот культурально-морфологических типов в популяциях грибов (Дьяков, 1998).
Исследованы 124 изолята, выделенные из разных эколого-трофических ниш, и принадлежащие к восьми видам рода Trichoderma. Для каждого было выделено по 15 моноспоровых штаммов, отличающихся стабильными культурально-морфологическими признаками. В зависимости от видовой принадлежности было установлено от двух до четырех стабильных культурально-морфологических типов (КМТ) (таблица 3).
Таблица 3 - Культурально-морфологические типы колоний изолятов видов рода Trichoderma
Вид Количест во гетеро споровых изолятов Количество моноспоровых клонов Соотношение культурально-морфологических типов(%)
I II III IV
Т. asperellum 15 150 14,2 41,4 22,6 21,8
Т. hamatum 15 150 7,2 67,4 10,6 14,8
Т. harzianum 15 150 4,7 65,7 13,3 16,3
Т. citrinoviride 15 150 5,8 55,8 38,4 -
T.longibrachiat ит 15 150 11,5 55,2 33,3 -
T.viride 15 150 - 64,9 - 35,1
T.atroviride 10 100 - 42,3 - 57,7
Т. koningii 15 150 - 61,8 - 38,2
Примечание: «-» - вид не представлен
При исследовании коллекции моноспоровых изолятов видов Т. Ьатапит и Т. ахрегеПит было выявлено четыре стабильных культурально-морфологических типа, причем большинство штаммов (65 %) принадлежало ко второму культурально-морфологическому типу. Процентное соотношение между
18
остальными типами распределялось следующим образом: клоны, относящиеся к первому КМТ, составили 4,7 % для Т. harzianum и 14,2 % для Т. asperellum. Клоны третьего и четвертого типа составляли 13,3 и 16,3 % для Т. harzianum и 22,6 и 21,8 % для Т. asperellum соответственно.
Для моноспоровых культур видов Т. citrinoviride и Т. longibrachiatum установлено три КМТ: первый, второй и третий. Гетероспоровые популяции этих видов в большей степени также были представлены вторым КМТ.
Сравнительный анализ гетероспоровых популяций видов секции Rufa и видов T.viride, T.atroviride и Т. koningii, позволил выделить только два культурально-морфологических типа: второй и четвертый (таблица 3).
Важно, что ряде случаев удалось установить корреляцию между образованием антибиотиков и токсинов с принадлежностью изолятов к определенному КМТ. Установлено, что клоны второго культурально-морфологического типа вида Т. asperellum характеризовались высокой антибиотической активностью к фитопатогенным грибам, в сравнении с изолятами других КМТ (Садыкова, 2003).
3.5 Вегетативная совместимость моноспоровых штаммов рода Trichoderma
Популяции грибов представляют собой мозаику клонов, одним из механизмов изоляции которых является различная совместимость. Клоны, имеющие общие гены вегетативной совместимости, способны к генетическим обменам и образуют вегетативно-совместимые группы, эволюционирующие при бесполой фазе развития независимо друг от друга, что обеспечивает их внутривидовую и внутрипопуляционную дивергенцию.
Сравнение общих частот реакций совместимости и несовместимости у выделенных изолятов и их моноспоровых штаммов всех видов показало, что для разных видов Trichoderma характерны различные пропорции реакций совместимости и несовместимости. Для видов, представляющих собой полифилетические группы, характерен сдвиг в сторону реакций несовместимости: для Т. koningii (40,4 %), Т. viride (54,9 %) и Т. harzianum (45,8 %). Вегетативная несовместимость наиболее четко проявляется у контрастных по культуральным признакам штаммов. При парном сращивании исходных изолятов различного происхождения выявлен широкий спектр проявления реакции вегетативной несовместимости с преобладанием «бордюра» и «ограничения роста». Причем только для этих трех видов характерна реакция «барраж» при сращивании штаммов, выделенных из разных мест обитания. При сращивании гетероспоровых изолятов этих видов с моноспоровыми клонами преобладает реакция несовместимости типа бордюр - у 68 % изолятов, барраж отмечается у 3 % изолятов. Среди типов реакций вегетативной совместимости преобладают валик и проникновение.
Сравнение общих частот реакций совместимости и несовместимости для видов Т. asperellum, Т. atroviride, Т. hamatum указывает на наличие тенденции относительного сдвига в сторону реакций смешанного типа и вегетативной совместимости, что отражает однородность состава этих видов в сравнении с популяциями Т. koningii, Т. viride и Т. harzianum. Для видов Т. longibrachiatum и Т. citrinoviride характерно преобладание смешанных реакций и реакции типа валик.
Совместимость моноспоровых клонов одного происхождения (выделенных из одного географического региона) зависит от его принадлежности к культурально-морфологическому типу. Так, например, клоны второго КМТ с другими типами давали реакции бордюра или ограничения роста колонии, а при сращивании между собой наблюдали реакции вегетативной совместимости. Для клонов других культурально-морфологических типов такая корреляция выражена более слабо, однако отмечено, что при сращивании клонов третьего и второго типа с четвертым всегда наблюдали реакции «бордюр» или «ограничение роста» последних. Отсутствие анастомозов между субстратными гифами и ограничение роста колоний, по-видимому, можно объяснить продуцированием биологически активных веществ в питательную среду. Для штаммов, проявляющих данные типы реакций, характерны высокая антибиотическая активность. Различия в антибиотической активности грибов в природных условиях являются одним из признаков, обеспечивающих вегетативную совместимость; совместимые клоны образуют локальные популяции или субпопуляции (Дьяков, Долгова, 1995).
Анализ вегетативной совместимости исследуемых моноспоровых штаммов рода Trichoderma указывают на значительную гетерогенность природных изолятов. Вегетативная несовместимость прекращает образование гетерокарионов между адаптированными и, вероятнее всего, генетически разными штаммами. По мере снижения вариабельности, при исследовании моноспоровых культур установлен относительный сдвиг реакций в сторону смешанного типа. Возникающие внутривидовые группировки у грибов, вероятно, выполняют роль краевых популяций, осуществляющих освоение новых субстратов и эколого-трофических ниш. При этом даже неполная изоляция снижает возможность образования гетерокарионов и повышает специализацию к субстрату, что в конечном итоге приводит к морфологическим, культуральным и биохимическим различиям клонов.
4 Биологическая активность грибов рода Trichoderma
На основании анализа стабильности культурально-морфологических признаков для исследования биологической активности было отобрано 42 моноспоровых штамма рода Trichoderma, выделенных из разных эколого-трофических ниш и относящихся ко второму культурально-морфологическому типу.
Антагонистическая активность штаммов Trichoderma в отношении фитопатогенных грибов родов Fusarium, Bipolaris и Alternaría
Одним из главных ограничений для использования препаратов на основе грибов-антагонистов рода Trichoderma для защиты растений является их биологическая активность и устойчивость к экологическим факторам региона: гидротермическому режиму, почвенной микробиоте и др. В этом случае целесообразно использование местных штаммов грибов рода Trichoderma, как наиболее приспособленных к конкретным почвенно-климатическим условиям в отношении доминирующих видов возбудителей болезней растений из родов Fusarium, Bipolaris и Alternaría.
Оценка гиперпаразитической активности показала гетерогенность штаммов в пределах одного вида и различия по степени активности изолятов различных видов Trichoderma в отношении фитопатогенных микромицетов. Гиперпаразитическая активность в отношении фитопатогенов достоверно различалась у всех штаммов Т.
asperellum. Максимальную активность в отношении изолятов Bipolaris и Alternarla проявили штаммы Т. asperellum МГ/6 и 30; а другие штаммы этого вида ТН-5, ТН-7, ТН-11 и 119 проявляли минимальную активность в отношении тех же фитопатогенов. Самыми активными в отношении всех изолятов Fusarium оказались штаммы Т. asperellum 119, МГ/6, МГ-97 и Т. citrinoviride ТН-4.
Другой показатель - антибиотическая активность — максимально проявлялась у штаммов Т. koningii TCJI-06 и ТСГ в отношении Alternaría и Bipolaris в отношении Fusarium у штаммов Т. asperellum 31 и 119, МГ/6, Т. harziamim М99/5 и Т. koningii TCJI-06. Штаммы Т. asperellum МГ-97, ТН-5, ТН-7, ТН-11, Т. citrinoviride МК и ТН-4, антибиотического действия в отношении всех фитопатогенов Alternaría, Bipolaris и Fusarium не показали.
Кластерный анализ по активности штаммов рода Trichoderma в отношении комплекса видов Bipolaris и Alternaría показал, что по набору вышеуказанных признаков все штаммы, вне зависимости от видового происхождения, разделяются на два кластера (рисунок 2А).
Т. harzianum «Унив» Т. viride «Lg-2» Т. harzianum «М99/5» Т. asperellum «Mg-97» Т. citrinoviride «МК» Т. asperellum «К-12» Т. viride «Lg-1» Т. asperellum «Mg-6» Т. asperellum «30» Т. koningii «ТСГ» Т. viride «0-97» Т. asperellum «119» Т. asperellum «31» Т. koningii «ТСЛ-06»
Т. harzianum «Унив» ~ Т. citrinoviride «ТН-4» -Т. asperellum «31» Т. koningii «ТСГ» Т. citrinoviride «МК» _ Т. asperellum «Mg-97» _ Т. asperellum «119» -Т. viride «0-97» Т. asperellum «30» -Т. viride «Lg-l» -Т. viride «Lg-2» Т. asperellum «K-12» " Т. harzianum «М99/5» Т. koningii «ТСЛ-06» ^ Т. asperellum «Mg-6» .
Уровни сходства (Эвклидово расстояние)
Ул
Уровни сходства (Эвклидово расстояние)
Рисунок 2 — Кластерный анализ антагонистической активности в отношении фитопатогенов родов Bipolaris и Alternaría (А); рода Fusarium (Б)
К первому кластеру был отнесен штамм Т. koningii ТСЛ-06, который проявил высокую гиперпаразитическую и максимальную антибиотическую активность в отношении всех тест-объектов Bipolaris и Alternaría. Второй кластер разделился на два подкластера: в первый подкластер объединились три штамма: Т. asperellum 31 и 119 и Т. viride 0-97, характеризующиеся средней гиперпаразитической, но высокой антибиотической активностью в отношении большинства штаммов видов Bipolaris и Alternaría. Во второй подкластер объединены все остальные штаммы
рода Trichoderma.
Анализ активности штаммов рода Trichoderma в отношении комплекса видов Fusarium позволил условно разделить штаммы-антагонисты на три кластера (рисунок 2Б). В первый кластер вошли два штамма Т. asperellum МГ/6 и Т. koningii TCJI-06, характеризующиеся высокой гиперпаразитической и антибиотической активностью по сравнению с другими штаммами. Во второй кластер вошли четыре штамма Т. harzianum М99/5, Т. asperellum К-12, Т. viride Lg-2 и Lg-1, в третий кластер вошли все остальные штаммы, которые проявляли избирательную активность в отношении видов Fusarium. Полученные данные свидетельствуют о том, что природные изоляты состоят из клонов с разной антибиотической активностью, что обуславливает необходимость селекции активных штаммов по отношению к набору штаммов-возбудителей болезней растений.
4.2 Биологическая активность и токсичность штаммов рода Trichoderma в отношении простейших
Для того чтобы рекомендовать тот или иной штамм в качестве продуцента кормовых добавок, биосинтеза активных антимикробных или противоопухолевых веществ, а также дальнейшего регламентирования его в качестве биологического агента биотехнологий, необходима оценка его токсичности. Биотестирование, проведенное на тест-объектах Р. caudatum и Т. pyriformis, показало, что штаммы имеют различную токсичность в отношении простейших. Нетоксичными штаммами оказались ТВ-4-2, ТСЛ-06, МГ/6, М-99/51 и М-99/5. Самую высокую токсичность в отношении простейших имеют водные экстракты спор и культуральные жидкости штаммов Lg-1 и 310 (таблица 6).
Таблица 6 — Значение критерия токсичности штаммов рода Trichoderma в отношении Paramecium caudatum
Значение критерия токсичности экстрактов спор и мицелия
Штаммы рода штаммов рода Trichoderma
Trichoderma Холодный Горячий Холодный Горячий Культураль-
экстракт экстракт экстракт экстракт ный фильтрат
спор спор мицелия мицелия
Т. asperellum 30 0,99 0,99 0,55 0,55 0,99
Т. asperellum 310 0 0 0,55 0 0,50
Т. asperellum МГ/6 0,9 0,8 0,8 0,7 0,7
T.asperellum TH-5 1 0,6 1 1 0,8
Т. asperellum TH-7 0,8 0,6 0,9 1 0,7
Т. asperellum ТН-11 0,9 1 1 1 0,9
Т. asperellum Tv-4-2 1 1 0,8 0,7 1
Т. citrinoviride Tv-4-1 0 0,5 0,3 0,5 0
Т. viride Lg-1 0,5 0,3 0,8 0,5 0,5
Т. konigii Тсл-06 1 1 1 1 1
Т. harzianum М-99/5 1 1 1 1 1
Т. harzianum М-99/51 1 1 1 1 1
Примечание: 0-0,5 - сильная токсичность; 0,5 - 0,8 - средняя токсичность; 0,8 - 1 -
отсутствие токсичности
Среднюю токсичность также показали экстракты мицелия штаммов 30, горячий споровый экстракт Ту -4-1 и культуральные фильтраты и экстракты спор и
мицелия штамма МГ/6. Для всех исследуемых штаммов был проведен анализ влияния культуральных жидкостей и экстрактов на прирост популяции Tetrahymena pyriformis. Этот этап биотестирования позволил более точно оценить степень биологической активности и токсичности экстрактов. По результатам опыта выявлена высокая биологическая активность некоторых штаммов. Наибольшую биологическую активность проявляли экстракты спор, полученные путем горячей экстракции, трех штаммов ТН-5 и МГ/6 Т. asperellum, а также штамма Tv4-2 Т. citrinoviride. Споровые экстракты штамма ТН-5 имели максимальную биологическую активность по коэффициенту роста Tetrahymena pyriformis. Тестирование экстрактов мицелия на Tetrahymena pyriformis показало, что наибольшей активностью обладают экстракты штаммов Tv-4-2, ТВ-4-2 и ТН-5. Экстракты мицелия, полученные путем холодной экстракции, обладали высокой активностью у штаммов ТН-7 и 30 Т. asperellum. Такой экстракт штамма ТН-7 по коэффициенту прироста был выше, чем экстракт, полученный горячей экстракцией, в 3,2 раза, а у штамма 30, почти в 2 раза.
Таким образом, оценка биологической активности показала, что она определяется не столько видовой принадлежностью штаммов, а в большей степени его вариабельностью в пределах вида. В дальнейших исследованиях для получения кормовых добавок были отобраны штаммы Т. asperellum ТН-5, ТН-7 и ТН-11, обладающие слабой токсичностью и проявившие биологическую активностью в отношении простейших.
4.3 Противоопухолевая активность штаммов рода Tríchoderma
Первые упоминания о противоопухолевых свойствах этих грибов были сделаны A.M. Безбородовым, выделившим зарагозовую кислоту, которая является сильным ингибитором опухолевых клеток, и может выступать в качестве потенциальных противораковых лекарств (Безбородое, 1969). Впоследствии рядом авторов были установлены и другие группы активных веществ, таких как триходермамиды - модифицированные дипептиды, выделенные из морского штамма Т. virens. Виридиофунгины были изолированы из Т. viride и содержали как структурный элемент лимонную кислоту. Известны их формы А-С, Al—4, В2 и Z2, которые оказывают цитотоксический эффект на опухолевые клетки. Триходеноны и циклопептановые производные, изолированные из культуры Т. harzianum, паразитирующей на Halichondria okadai, обладают цитотоксическим эффектом на линии опухолевых клеток. В этой связи виды Tríchoderma могут представлять особый интерес, так как являются потенциальным дешевым биологическим ресурсом для получения препаратов-иммуномодулятов и новых противоопухолевых антибиотиков.
В результате первичной оценки активности in vitro 40 штаммов, принадлежащих к семи видам, в отношении асцитной карциномы Эрлиха было отобрано 6 активных, Т. asperellum 310 и 30, Т. harzianum М-99/51, Т. citrinoviride Tv4-1, Т. viride Lg-1 и Т. koningii ТСЛ-06.
В опытах in vivo проведена оценка противоопухолевой активности культуральных фильтратов на мышах аутбредной линии ICR. Установлен противоопухолевый эффект культуральных фильтратов четырех штаммов: Т. asperellum (30), Т. harzianum (М-99/51), Т. citrinoviride (Tv4-1) и Т. koningii (ТСЛ-06), сопоставимый с действием циклофосфана.
Штаммы, проявившие цитостатический эффект в отношении карциномы Эрлиха в опытах in vivo, затем оценивали на трех линиях клеток: НаСаТ-кератиноциты человека; НЕК 293Т-клетки эмбриональной почки человека и К562-линия клеток хронической миелоидной лейкемии. Исследования показали, что выраженной цитотоксической активностью обладают только культуральные жидкости штаммов TV4-1, М99/51 и 30 (рисунок 3).
Рисунок 3 - Зависимость индекса ингибирования от концентрации культуральных жидкостей штаммов Trichoderma на линии клеток НЕК 293Т (а), на линии клеток К562 (б), на линии клеток НаСаТ (в) при инкубации 72ч.
Особый интерес представляли исследования противоопухолевой активности экстрактов спор грибов рода Trichoderma. Для чего проводили анализ цитотоксической активности экстрактов из спор гриба Trchoderma, полученных методом холодной и горячей экстракции, на линии клеток НаСаТ. Небольшой активностью в отношении опухолевых клеток обладают экстракты спор штаммов М99/51 и 30, однако она несопоставима с активностью культуральных фильтратов.
В дальнейшем все отобранные штаммы оценивали на проапоптотическую активность. В результате проведенных экспериментов по анализу апоптоза установили, что значительную активность в отношении клеточных линий НЕК 293Т, НаСаТ и К562 проявляют штаммы TV4-1, М99/51 и 30. При этом одним из механизмов действия этих препаратов является индукция апоптоза поздней стадии. Таким образом, на наш взгляд, более целесообразно выделять соединения из культуральных фильтратов, а не из экстрактов спор грибов рода Trichoderma. По результатам проведенных исследований, представленных в данной работе, во Всероссийскую Коллекцию Микроорганизмов были депонированы штаммы Т. asperellum Т-30 (ВКМ F4340D и T.harzianum Rifai TV4-1 (ВКМ F4341D) как продуценты противоопухолевых соединений. Штамм T.harzianum М99/51 депонирован во Всероссийской коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ F-1027).
5 Ростстимулирующая активность штаммов рода Trichoderma
Положительное влияние биологически активных компонентов, продуцируемых видами Trichoderma, на ростовые показатели растений, отмечено на многих промышленно значимых зерновых культурах и древесных видах, однако это зависит от применяемого штамма (Harman и др., 2004; Romano, 2008). Оценка действия на рост растения может способствовать отбору продуцентов препаратов с комплексным воздействием - как стимуляторов роста и как антагонистов
фитопатогенных грибов. В связи с этим, использование биопрепаратов на основе этих грибов может быть расширено, если в качестве одного из главных факторов отбора для штамма определить их способность оказывать стимулирующее действие на рост растения. С этой целью 8 штаммов рода ТпсИос1егта, проявивших антибиотическую и гиперпаразитическую активность, были проверены на наличие ростстимулирующих свойств в отношении семян злаковых и хвойных растений.
Исследования показали, что штаммы рода ТпсИос)егта оказывают как стимулирующий, так и ингибирующий эффект на энергию прорастания и всхожесть семян и биометрические показатели проростков злаков. При исследовании действия культуральной жидкости штаммов Т. азрегеНит отмечено, что штаммы этого вида оказывали как стимулирующее, так и ингибирующее действие. Достоверное стимулирующее действие культуральной жидкости на прорастание семян установлено у штаммов Т. кот^Н ТСЛ-06 и ТСГ и Т. Ьатапит М99/5. Остальные штаммы не оказывали достоверного влияния на процессы прорастания семян и рост растений. Обработка семян хвойных культуральной жидкостью штаммов оказывала достоверный стимулирующий эффект на развитие корневой системы ячменя и хвойных при выращивании в светокультуре.
Для установления истинного ростстимулирующего эффекта используемого антагониста необходимо исключить присутствие фитопатогенов при выращивании растений. С этой целью удобно использование культуры каллусов. При внесении в культуру каллусов ячменя культуральной жидкости штаммов в концентрации 5 и 10 % все каллусы погибали, что свидетельствует о токсическом действии активных метаболитов грибов при их высокой концентрации. Внесение культуральной жидкости в количестве 1 и 3 % оказывало нейтральное или стимулирующее действие (рисунок 4).
5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50
ТпсИсккгтла тас110(1егашТпЛ1х1егта "°*П>мь Ьагаашт копвд1
«М99/5»
«ТСГ» «ТСЛ-06» д
I % концентрация
3% концентрация
ТпсЬо(]еш1а ТпсЬос1егта ТпсЬойегша Ъатапит коптгп кошт^н
«М99/5» «ТСГ» «ТСЛ-06»
Рисунок 4 - Объем каллусов ячменя «Красноярский-80» (А) и каллуса пшеницы сорт «КС-1607» (Б) при обработке метаболитами штаммов рода
Тггскос/егта
Максимальный стимулирующий эффект на каллусы ячменя сорта «Красноярский-80» оказали метаболиты штамма Т. Ъаг7,\апит М99/5: прирост каллуса при внесении культуральной жидкости с концентрацией 1 % был в 3,6 раза, а с концентрацией 3 % - в 3 раза выше, чем в контроле. Введение в культуру каллусов ячменя метаболитов штамма Т. копхщи ТСЛ-06 в концентрациях 1 и 3 % также способствовало увеличению их роста. Метаболиты культуральной жидкости
штамма Т. копищи ТСГ стимулировали рост каллусов ячменя только при 3 %-й концентрации.
Внесение в культуру каллусов пшеницы культуральной жидкости штаммов Т. котщи ТСЛ-06 и ТСГ оказывало ингибирующий эффект: прирост каллусов даже в количестве 1 и 3 % был ниже, чем в контрольном варианте, а при более высоких концентрациях каллусы погибали. При внесении метаболитов штамма Т. Иа^апит М99/5 в культуру каллусов в концентрации 1 и 3 % отмечено слабое стимулирующее действие, а в более высоких концентрациях приводило к гибели каллусов. По результатам проведенных исследований на семенах и каллусах злаковых растений установлено, что биологически активные компоненты разных штаммов-антагонистов могут избирательно влиять на разные виды растений, оказывая как стимулирующее, так и ингибирующее действие.
Исследования стимулирующего эффекта двух штаммов рода ТгкИос/егта на хвойных растениях показали, что обработка семян лиственницы сибирской и сосны обыкновенной метаболитами штаммов Т. аярегеЦит МГ/6 и Т. кагг1апит М99/5 стимулировала как всхожесть, так и энергию прорастания в сравнении с контролем.
Положительный эффект оказала также обработка семян культуральной жидкостью штаммов на рост растений в условиях выращивания их в светокультуре: штамм М99/5 Т. кагггапит достоверно ускоряет формирование и рост корневой системы, появление боковых побегов и увеличивает биомассу лиственницы сибирской, а Т. азрегеНит МГ/6 увеличивает вес сырой биомассы, но не оказывает влияния на рост надземной части и корневой системы растений.
В результате исследований установлено достоверное стимулирующее влияние метаболитов штамма Т. Иаг21апит М99/5 при внесении в культуру каллусов лиственницы сибирской и сосны сибирской (рисунок 5).
-ТисЫеша Ь | 700 .•врайш | я «%<» '£ 500 -ТисЫеша П % доо Ьашапиш ^ ^ 200 «Ш9Й» § 200 -ипрол 100
0
и
о
-•-ТшМим х «, ¡00 агрегеПтм т 2
й%-6» | а |5о
-¿-ТпсЫетш | Кашатш! * \ «Ы9Ш » * -в-контроль £ „
ьТшЫета аграеНшн Ш^-йг г-ТмМеша Зйшаиш |ЫМб» -кошрапь
Рисунок 5 - Динамика роста эмбриогенного каллуса лиственницы сибирской (А), сосны сибирской (Б) и сосны обыкновенной (В) при внесении культуральной жидкости Т. азрегеПит МГ/6 и Т. кагггапит М99/5
Внесение культуральной жидкости штамма Т. Иагг1апит М99/5 в питательную среду при выращивании каллусов лиственницы сибирской приводило к увеличению массы каллуса через 40 суток культивирования в 1,5 раза по сравнению с контролем. При внесении культуральной жидкости штамма Т. Ьагггапит М99/5 в культуру каллусов сосны сибирской объем их превышал контрольный в 1,3 раза. Однако на рост каллусов сосны обыкновенной метаболиты Т. Ьатапит М99/5 достоверного влияния не оказывали.
При введении культуру каллусов лиственницы сибирской и сосны сибирской метаболитов штамма Т. <35реге11ит МГ/6 на начальном этапе отмечен стимулирующий эффект на рост, но к концу культивирования объем опытных и контрольных вариантов обеих культур каллусов достоверно не различался, а рост каллусов сосны обыкновенной достоверно снижался в 1,5 раза в сравнении с контролем. Полученные данные свидетельствуют о непосредственном стимулирующем эффекте штаммов Т. котп^'й ТСЛ-06, Т. Иагггапит М99/5 и Т. аэрегеНит МГ/6 на рост растений, в связи с чем, представляло интерес определить наличие в культуральной жидкости ауксинов.
Анализ культуральной жидкости штаммов, оказывающих стимулирующее действие на ростовые процессы у растений, показал, что индолилуксусную кислоту синтезируют штаммы Т. Иагггапит М99/5 и Т. котп&х ТСЛ-06 (рисунок 6).
В Г
Рисунок 6 - Спектры индолилуксусной кислоты в культуральной жидкости штаммов: А-спектр стандартного образца, Б - культуральная жидкость штамма ТпсНосИегта koningii ТСЛ-06, В - культуральная жидкость штамма ТпсЬос/еппа котп^и ТСГ; Г - - культуральная жидкость штамма Тпскоёегта ИаЫапит М99/5
При культивировании штамма Т. кагг1апит М99/5 в течение 3-х суток ИУК обнаруживается в следовых количествах, а на 5 сутки и 7 сутки её количество составляет 0,68 и 0,76 мкг/мл соответственно. При дальнейшем культивировании штамма количество ИУК не увеличивается. В культуральной жидкости штамма Т. konmgu ТСЛ-06 ИУК на 3-й сутки культивирования не обнаружено, а на 5 и 7
штамм синтезирует в количестве 0,36 и 0,47 мкг/мл соответственно. Штамм Т. анрегеНит МГ/6 не синтезирует ИУК.
Таким образом, можно утверждать, что ростстимулирующее действие связано с биосинтезом ИУК штаммами рода Тг1с1юс!егта, что убедительно подтверждается в опытах на каллусных культурах. Различия в действии метаболитов культуральной жидкости штаммов связаны с концентрацией ИУК, что существенно влияет на прирост каллусной ткани. При добавлении культуральной жидкости штаммов рода Т. ИаЫапит М99/5 в концентрации 10 % в питательной среде для выращивания каллусной ткани приводили к ингибирующему эффекту, а концентрациях 1 и 3 %, оказывали стимулирующее действие на прирост каллусов ячменя, и не оказывали влияния на рост каллусов пшеницы. Стимулирующее действие метаболитов Т. азрегеНит МГ/6 на прорастание семян хвойных растения возможно достигается активацией иммунитета растения и подавления внутри семенной инфекции. В то время как метаболиты штамма Т. Ьагаапит М99/5 оказывают еще и непосредственный ростстимулирующий эффект за счет биосинтеза индолилуксусной кислоты.
6 Получение кормовых добавок на основе биомассы мицелия грибов рода ТпсИойегта
Способность видов рода ТпсЪос1егта утилизировать широкий набор субстратов, технологичность, сравнительно высокая скорость роста и низкая токсичность в отношении растений и животных предполагают возможность их использования для разработки кормовых добавок и БАД.
Для рекомендации микромицетов как продуцентов кормовых препаратов и БАД-ов обязательным условием является определение белков и липидов в биомассе, как наиболее ценных компонентов, принимающих участие в важнейших функциях организма.
Для определения общего содержания белка грибов рода Тпс1юс1егта исследовали биомассу 8 штаммов: Т. азрегеПит МГ/6, ТН-5, ТН-7 и ТН-11, Т. Иаг21апит М99/5, Т. коп'ищи ТСЛ-06 и ТСГ, Т. У1г1с1е 1^-1 и Lg-2. Установлено, что наибольшее количество белка содержится в биомассе и культуральной жидкости штаммов Т. азрегеИит ТН-11 и ТН-5, М99/5 Т. ИаЫапшп и ТСЛ-06 Т. копт^п и составляет в мицелии 22,43 и 21,88, 20,14 и 18,50 %, соответственно (таблица 7). В составе мицелия общее содержание аминокислот составляет от 14.91 до 21.77 % от сухого веса.
Среди незаменимых аминокислот в мицелии исследуемых штаммов содержатся лизин, аргинин и лейцин, лимитированные в растительных кормах для животных. Среди заменимых аминокислот преобладают аспарагиновая и глютаминовая кислоты. Количество незаменимых аминокислот от общей суммы аминокислот в биомассе мицелия штаммов МГ/6, ТН-5, ТН-7 и ТН-11 Т. а$реге11ит и М99/5 Т. Иагггапит составляет 54,12; 56,87; 60,13 и 57,58 %, соответственно.
Важным компонентом в биомассе мицелия исследуемых штаммов занимают липиды: их содержание в биомассе микромицетов рода Тг1сИос!егта составляет от 4,21 до 13,57 %. Установлено, что большее количество липидов содержат штаммы Т. аврегеИит — ТН-11, МГ/6, ТН-7 и ТН-5. В составе биомассы и культуральной жидкости микромицетов рода ТпсИос/егта преобладают гликолипиды, на втором
месте нейтральные, затем фосфолипиды (таблица 7).
Наибольшее содержание гликолипидов отмечено у штаммов вида Т. ахрегеПит - МГ/6, ТН-5 и ТН-11 (71,07, 72,79 и 68,06 % от общей фракции, соответственно).
Таблица 7 - Содержание белков и липидов в биомассе и метаболитах грибов рода Тг/скоЛегта, %
Штаммы Белки Липиды
Биомасса Биомасса
Trichoderma ахрегеПит МГ/6 16,43±0,65 13,13±0,48
ТпсИо^егта ахрегеПит ТН-5 21,88±0,71 10,99±0,17
Trichoderma ахрегеПит ТН-7 17,71±0,58 12,70±0,63
Trichoderma а.чрвгеИит ТН-11 22,43±0,79 13,57±0,42
Тг1сИо(к'гта /иггггапит М99/5 20,14±0,78 4,92±0,12
Тг/с/юс/егта коп'ищи ТСЛ-06 18,50±0,84 8,79±0,14
Trichoderma koningii ТСГ 15,17±0,55 4,21±0,48
Trichoderma \>1г\ёе Lg-1 16,33±0,67 6,91±0,23
Тг'1с!юЛегта 1^-2 15,67±0,50 4,38±0,56
Нейтральные липиды в значительном количестве были обнаружены в биомассе штаммов Т. котики ТСЛ-06 (35,53 %), Т. Иатапит М99/5 (33,83 %). Наибольшее содержание фосфолипидов выявлено у штаммов Т. ахрегеПит ТН-7 и Т. гШе 1^-1 (18,55 и 18,38 %).
По результатам исследования содержания белков и липидов в биомассе грибов ТпсИос1егта были отобраны 4 штамма, перспективные для получения кормовых препаратов: Т. ахрегеПит ТН-5, ТН-7 и ТН-11, Т. Иатстит М99/5, которые оценивали по способности накопления селена в биомассе. Обогащение микроэлементами биомассы может стать перспективным источником получения кормовых добавок, содержащих органические формы селена в мицелии.
Оценка продуктивности биомассы мицелия в условиях стационарного культивирования на селенсодержащей среде показала, что при 20 мг/л селена в питательной среде происходит полная задержка роста всех штаммов. При глубинном культивировании токсическое действие селена в концентрации 20 мг/л проявлялось слабее, и снижение урожая биомассы не было отмечено для трех исследуемых штаммов Т. ахрегеПит ТН-7, ТН-11 и Т. Пагггапит М99/5, а для штамма Т. ахрегеПит ТН-5 выход биомассы по сравнению с контролем увеличился в 1,2 раза (таблица 8).
Таблица 8 - Накопление биомассы штаммами ТпскосЗегта при глубинном культивировании на среде с солью селена на 10 сутки, г а.с.в._
Штаммы Биомасса (г/л) на среде без селена Биомасса (г/л) на среде с селеном, 20 мг/л
Trichoderma ахрегеПит ТН-5 4,38±0,10 5,28±0,12
Trichoderma ахрегеПит ТН-7 3,49±0,09 3,88±0,08
Тг1с1юЛегта ахрегеПит ТН-11 3,80±0,09 3.89±0,09
Trichoderma Иатапит М99/5 4.97±0,11 4.81±0,11
Проведенные исследования показали, что в условиях глубинного культивирования на среде с содержанием селена 20 мг/л в среде штаммы накапливают селен в количестве от 334,3 до 937,5 мкг/г (таблица 9).
Таблица 9 - Содержание селена в биомассе штаммов рода Тпс1юс1егта при глубинном культивировании, мкг/г
Штаммы Количество селена на среде без селената натрия Количество селена на среде с селенатом натрия
Тг!с1юс1егта аирегеЦит ТН-5 0,48 937,5
ТпсЪос1егта аярегеПит ТН-11 0,65 805,3
Тг№кос1егта Иатапит М99/5 0,06 334,3
Таким образом, мицелий штамма ТН-5 целесообразно было рекомендовать для разработки селенсодержащей кормовой добавки. С этой целью биомассу мицелия, полученную при культивировании на селенсодержащей среде и без селена, исследовали по показателю «переваримость» на установке «Искусственный желудок». В результате исследований установлено, что биомасса мицелия отобранного штамма ТН-5 Т. ахрегеНит с селеном и без селена может быть использована в качестве кормовой селенсодержащей добавки. Средняя активность пепсина при переваривании белка биомассы мицелия штамма без селена составила 0,204 ТЕ, с селеном - 0,213 ТЕ, в сравнении с активностью пепсина на эталонном яичном альбумине, равной 0,28 ТЕ.
В соответствии с проведенными исследованиями совместно с сотрудниками ВНИТИП был разработан рецепт рациона для цыплят-бройлеров с использованием кормовой добавки в составе которого использован функциональный мясной протеин и мицелий продуцентов Ьаейрогт вЫркигет штамм М2-22 (ВКМ Р-4276Б) и Т. аэрегеНит штамм ТН-5.
7 Твердофазное культивирование грибов рода Тпс1ю(1егта на растительных субстратах
Успех использования биологического метода защиты растений зависит не только от подбора высокоэффективного штамма рода ТггсИос1егта, но и в равной мере от качества полученного биопрепарата на его основе. Твердофазным способом биопрепараты получают на отходах агропромышленного комплекса.
Перспективным является расширение сырьевой базы для производства биопрепаратов наиболее распространенных отходов деревообрабатывающей промышленности, которые при внесении одновременно улучшают структуру почв. Скрининг штаммов для получения биологических препаратов на растительных субстратах должен определяться не только их антагонистической активностью, но и способностью усваивать при твердофазном культивировании используемый субстрат.
7.1 Получение биопрепаратов защиты растений от фитопатогенных микромицетов
Для подбора дешевых и экологически чистых субстратов была проведена оценка способности роста и биодеструкции отходов лесного хозяйства, деревообрабатывающей и гидролизной промышленности штаммами, обладающими высокой антагонистической и ростстимулирующей активностью: Т. ахрегеНит МГ/6, Т. кот^и ТСЛ-06 и Т. Иагггапит М99/5. Все используемые растительные субстраты являются труднодоступными для биоконверсии, с высоким содержанием лигноподобных соединений и клетчатки.
Исследования показали, что при росте на растительных субстратах штаммы формируют мицелий, колонизирующий субстраты, образуют конидиеносцы с конидиями, форма и размеры которых не отличаются от формирующихся при росте на стандартных питательных средах. Установлено, что наибольший выход КОЕ/г отмечен у штамма Т. а.чрегеНит МГ/6 на коре пихты исходной и после экстракции изопропанолом и составил 3,22-3,5-109, на биомассе топинамбура без обработки - 3,4-109 (таблица 10).
Таблица 10 - Титр (КОЕ/г) штаммов рода Тпс1юс1егта на растительных субстратах на 15 сутки культивирования
Субстрат Т. азрегеИит МГ/6 Т. Ьаг:'тпит М99/5 Т. коп^И ТСЛ-06
Гидролизный лигнин 1,60-10" 2,00-10' 2,90-10'
Кора лиственницы после С02-экстракции 3,30-10' 1,10-10' 2,60-10'
Кора пихты:
- исходная 3,50-10* 1,33-10" 1,24-10"
- после экстракции гексаном 4,00-108 0,90-108 0,50-108
- после экстракции горячей водой 3,00-108 7,80-10' 6,50-108
- после экстракции изопропанолом 3,22-10" 5,30-108 5,10-Ю8
- после экстракции холодной водой 2,86-109 3,00-10* 3,60-108
Топинамбур:
- исходный 3,40-10' 2,20-10" 2,70-10"
- после водной экстракции 1,90-10" 2,10-Ю8 3,70-108
Предварительная химическая обработка различными органическими растворителями либо не повышает степень доступности сырья для деструкции штаммов, либо оказывает ингибирующий эффект на рост грибов. Таким образом, для наработки препарата целесообразно использовать отходы без предварительной химической обработки.
В дальнейшем была исследована степень биодеструкции грибами рода ТпсИос/егта трех субстратов: гидролизный лигнине, коре пихты и вегетативной части топинамбура. О результатах эффективности воздействия ферментативного комплекса штаммов рода Тг:с1юс1егта на лигноуглеводные субстраты судили по изменению целлюлозных и лигниновых компонентов, а также накоплению гуминовых веществ (таблица 11).
Из всех исследуемых компонентов субстрата максимальное снижение
легкогидролизуемых и трудногидролизуемых полисахаридов отмечено при росте штамма Т. а$регеИит МГ/6 на коре пихты, при этом количество легкогидролизуемых полисахаридов по сравнению с исходным сырьем уменьшилось в 1,3 раза, трудногидролизуемых полисахаридов — в 1,7 раза.
Таблица 11 - Химический состав коры пихты исходной до и после биодеструкции %, а.с.с.
Показатели До биодеструкции После биодеструкции штаммами
Т. аврегеЫит МГ/6 Т. Иатапит М99/5 Т. кош^Н ТСЛ-06
Легкогидролизуемые полисахариды 16,70 13,22 12,70 14,27
Трудногидролизуемые полисахариды 20,80 12,20 14,54 11,16
Сумма полисахаридов 37,50 25,42 27,24 25,43
Лигниновые вещества 43,50 47,30 46,40 48,20
Гуминовые вещества 0 11,80 8,90 5,70
Белок 3,29 3,93 3,85 3,62
Зола 8,50 4,40 5,10 4,30
При культивировании штамма Т. Иатапит М99/5 содержание легкогидролизуемых и трудногидролизуемых полисахаридов снижалось на 16 % на гидролизном лигнине, на 24 % на вегетативной части топинамбура и на 27 % на коре пихты, тогда как при культивировании штамма Т. копили ТСЛ-06 содержание легкогидролизуемых и трудногидролизуемых полисахаридов на тех же субстратах снижалось на 19 %, 20 % и 32 %, соответственно.
Процесс деструкции лигноуглеводного комплекса сопровождается образованием гуминовых веществ. Наши исследования показали, что образование гуминовых кислот отмечено у всех штаммов на трех типах субстратов, однако их количество зависит от типа субстрата и продуцента. Накопление наибольшего количества гуминовых веществ отмечено при культивировании штамма МГ/6 Т. аэрегеНит на коре пихты и составило 11,8 %. При культивировании штаммов грибов рода Тпс1ю(1егта происходит накопление белка, количество которого максимально на коре пихты у штамма Т. азрегеПит МГ/6 и достигает 3,93 %. Белок при внесении в почву может служить источником дополнительного питания для почвенной микробиоты и растений.
Таким образом, по совокупности показателей для получения биопрепарата были рекомендованы кора пихты в качестве субстрата и штаммы Т. азрегеЦит МГ/6 и Т. Ьак'шпит М99/5 как продуценты биопрепаратов защиты растений. Предпосылками для использования коры пихты в качестве сырья для производства биопрепарата являются ее высокий гумусообразующий потенциал и максимальная доступность для ферментативной системы продуцентов.
Исследования, проведенные в лабораторных условиях, позволили разработать технологию получения биопрепарата Триходермин-М на основе штаммов Т. а.чрегеПит МГ/6 и Т. Иатапит М99/5.
7.2 Получение вермикомпостов с использованием активных штаммов Tríchoderma и биопрепарата триходермин - М
Биоконверсия с помощью вермикультуры - безотходная технология направленная на обеззараживание и уменьшение массы органические отходов, получение при этом высококачественного удобрения и дождевых червей, являющихся ценным белковым кормом и источником биологически активных веществ. (Ганжара, 1995; Мельник, 1991). Дождевые черви оптимизируют физико-химические и биологические свойства органического удобрения (агрегатное состояние, кислотность, доступность питательных элементов).
Повышение фунгицидных свойств готового компоста или вермикомпоста может также достигаться добавлением в него микробов-антагонистов. Использование грибов рода Tríchoderma совместно с различными растительными отходами может повысить супрессивность, улучшить качества компостов и сократить время его созревания, а также дает возможность получать на его основе экологически чистую продукцию.
Исследовано влияние штамма Т. asperellum МГ/6 и полученного на его основе биопрепарата при культивировании на растительных субстратах на процесс вермикомпостирования. В результате вермикомпостирования органических отходов с инокуляцией штамма Т. asperellum МГ/6 или препарата «Триходермин М» был получен биопрепарат следующего состава: массовая доля влаги - 50%; органических веществ (С орг.) - 26-27%; рН водной вытяжки — 6,5-7,5; общий азот составил 0,8%, в том числе нитраты (мг/100 г) - 8,75-9,00 и аммоний (мг/100 г) -0,60-0,65; общий фосфор (Р2О5)- 0,9 %, в том числе обменный фосфор (мг/100 г) -130,10-150,35; общий калий (К20)-0,9%;; подвижный калий (мг/100 г) - 750,22770,45; содержание тяжелый металлов составило (мг/1000 г) для Си- 80,49; Zn -170,81; Cd - 0,60; Pb - 15,60; Ni- 20,40; Со - 10,90; Cr- 17,30; Mn- 545,90; титр кишечной палочки был менее 0,01, яйца гельминтов не выявлены. Семян сорных растений - менее 20 на 1 тонну. Титр штамма Т. asperellum — 1 х 10 8 — 2х108 КОЕ/кг. В биопрепарате не выявлены патогенные бактерии и фитопатогенные грибы, яйца гельминтов и семена сорных растений (в 5 раз меньше, чем допустимо для биогумуса) (ТУ РСФСР №949-91). Полученный биопрепарат характеризуется высоким содержанием гумифицированного органического вещества и легкодоступных для растений минеральных форм азота, фосфора и калия.
Добавление штамма Т. asperellum МГ/6 и препарата Триходермин - М в исходный субстрат повышало численность колониеобразующих единиц грибов в субстрате и ускоряло минерализацию органических соединений. При компостировании происходило большее снижение органического углерода и, соответственно, это приводило к снижению его содержания в биопрепарате и накоплению в нем неорганических форм азота.
Общая численность грибов составляла в готовом продукте: в контроле -0,51±0,01 КОЕ х 106, в биопрепарате, полученном при вермикомпостировании с триходермином - 2,94±0,04 КОЕ х 106 и споровой суспензией - 2,12±0,01х106 КОЕ/г. При этом отмечено уменьшение популяционной плотности возбудителей заболеваний: численность фитопатогенных грибов в вариантах с внесением антагонистов (споровая суспензия/триходермин, соответственно) снижалась в 3,4 -5 раз на инфекционном фоне F. sporotrichioides и в 2-3 раза — Alternaría sp..
Установлено, что в ходе вермикомпостирования численность популяции Trichoderma снижается, но не столь значительно. Это вполне соответствует представлениям о том, что они являются одними из наиболее характерных для пищеварительного тракта червей и активно развиваются в экскрементах и свежих копролитах червей.
Добавление в исходные субстраты перед вермикомпостированием штамма-антагониста и препарата Триходермин-М положительно влияло на рост, накопление биомассы и скорости формирования половозрелых особей в популяции червей Е. fétida (таблица 12). Биомасса дождевых червей возрастала при вермикомпостировании в контрольном варианте с 40,0 до 51,2 г/кг (на 28 %) переработанного субстрата, а с инокуляцией микромицета Т. asperellum возрастала до 57,06 г/кг (на 43 %) и с 40,0 до 58,14 г/кг с Триходермином-М (на 45 %). Доля половозрелых особей дождевых червей также выше при вермикомпостировании субстратов с внесением препарата, чем в контрольном варианте.
Таблица 12 - Накопление биомассы червей Е. fétida при различных способах вермикомпостирования
Варианты вермикомпостирования Вес червей, г на 1 кг субстрата
0 сут 7 сут 14 сут 42 сут
Контроль без внесения грибов 40,0 51,44±3,6 50,06±3,5 51,2±3,6
Внесение спор Т. а$реге11ит 40,0 55,12±2,9 56,74±2,7 57,06±5,7
Внесение «Триходермина - М» 40,0 54,22±4,6 56,52±2,4 58,14±2,7
Уже через 17 суток вермикомпостирования их доля в популяции Е. fétida составляла 45-50 %, а в контроле 31-40 %. Количество коконов, отложенных дождевыми червями при вермикомпостировании, было выше на 15-25% при предлагаемом способе по сравнению с контролем.
О положительном стимулирующем влиянии микромицетов рода Trichoderma на развитие червей свидетельствует соотношение численности в разных возрастных группах в контроле и опытных вариантах. Численность половозрелых особей в варианте с внесением биопрепарата была максимальной на протяжении всего процесса вермикомпостирования, что свидетельствует об их хорошем развитии. В целом инокуляция грибов привела к повышению в популяции червей доли крупных, размером более 5 см червей и доли половозрелых особей.
8 Оценка эффективности использования биопрепаратов и вермиком постов на основе штаммов грибов рода Trichoderma
Испытание биопрепарата Триходермин - М в полевых условиях
Опытные партии биопрепаратов Триходермин-М в виде порошка были наработаны и испытаны на посевах пшеницы сорта «КС-1554» и ячменя сорта «Красноярский-80» на Мининском опытно-производственном поле КНИИСХ и на
территории Мининского лесного питомника на посевах Pinus sibirica L.
Результаты испытания биопрепарата на злаковых культурах показали достоверное увеличение продуктивности по трем показателям на посевах ячменя: количество зерен в колосе, растений к уборке, урожайность, а пшеницы по двум: количество зерен в колосе и масса 1000 зерен. Оценка внутренней инфекции семян полученного урожая злаковых, выращенных при использовании препарата «Триходермин-М», показала уменьшение внутренней инфекции у семян пшеницы в 1,3 раза и в 2 раза семян ячменя в сравнении с контрольными семенами.
Обработка посевов сосны сибирской биопрепаратом повысила число всходов на 25,6 % и выход сеянцев 1-го года на 35,7 % от контроля.
Главной мишенью действия антагонистически активных штаммов рода Trichoderma являются микромицеты. При исследовании видового разнообразия почвы ризосферы злаков было выделено и идентифицировано 48 видов почвенных микромицетов. В почве ризосферы злаков были обнаружены фитопатогены из родов Alternaría, Bipolaris, Helmintosporium, Fusarium. Внесенный с биопрепаратом антагонистически активный штамм T. harzianum М99/5 вытеснил не только на фитопатогенные микромицеты, но и на другие почвенные грибы. Так, при обработке посевов ячменя число видов снизилось до 22, а пшеницы - до 24. Оценка эффективности использования биологического контроля путем внесения биопрепарата на основе штамма Т. harzianum М99/5 показала, что наибольшее видовое разнообразие характерно для комплекса микромицетов прикорневой зоны пшеницы и ячменя в течение всего вегетационного периода без внесения, чем при внесении триходермина. Число выявляемых видов в почве ризосферы пшеницы и ячменя при использовании биопрепарата было уменьшено за счет подавления фитопатогенных видов Alternaria, Bipolaris, Fusarium и Helmintosporium, так и сапротрофных видов.
В почве ризосферы сеянцев идентифицирован 51 вид, среди которых, фитопатогены, принадлежащие к родам: Alternaria, Fusarium, Pestalotia Phoma, Pythium, Rhizoctonia, причем в сравнении с почвой ризосферы злаков было больше представителей рода Fusarium. При интродукции биопрепарата на основе антагонистически активного штамма Trichoderma asperellum МГ/6 в посевы Pinus sibirica L. отмечено вытеснение числа видов до 27, как фитопатогенных, так и сапротрофных из родов Alternaria, Fusarium, Pestalotia, Pénicillium, видов Absidia glauca, Chaetomium cochlioides, Ch. elatum, Ch. globosum, Myrothecium verrucaria. Однако, штамм МГ/6, внесенный в почву с биопрепаратом, не вытеснял представителей видов F.moniliforme, Phoma sp. и Rhizoctonia sp.
Одним из важных показателей биологической активности почв является численность и соотношение основных физиологических групп микроорганизмов, которая свидетельствует об определённой направленности биологических процессов, что имеет большое значение для роста и развития растений. Сравнительный анализ показал, что при внесении в посевы злаков штамма М99/5 Т. harzianum и посевы сеянцев Pinus sibirica L. штамма T. asperellum происходит увеличение численности микроорганизмов, использующих минеральные формы азота, азотфиксаторов и грибов. Численность этих групп микроорганизмов в вариантах с внесением биопрепарата была выше при внесении биопрепаратов как в период массовых всходов, так и в течение дальнейшего периода вегетации. Численность аммонификаторов увеличилась только в почве ризосферы злаков; в почве ризосферы сеянцев Pinus sibirica L. при внесении биопреперата: в период
после внесения штамма Т. asperellum МГ/6 достоверно не отличалась в сравнении с контролем во время всего периода вегетации.
Таким образом, использование биологических препаратов оказывает положительное действие и приводит к интенсификации процесса разложения органического вещества: увеличивается коэффициент олиготрофности в почве. На наш взгляд основными критериями применения биоконтрольных штаммов в агроценозах и питомниках следует считать: снижение численности фитопатогенов, увеличение урожайности и продуктивности растений злаков и высокое качество посадочного материала сеянцев.
8.2 Испытание вермикомпостов в условиях закрытого грунта
Проведенная оценка раздельного действия полученного вермикомпоста, а также с добавлением фитопатогенов и штамма МГ/6 Т. asperellum на развитие огуречной рассады при выращивании их в условиях теплицы, показала, что добавление биоконтрольного штамма оказывает достоверный стимулирующий эффект на рост и развитие растений. Количество нормально вегетирующих растений на 14 сутки вегетации было максимально при внесении Т. asperellum и составило 100 %, в вариантах совместного внесения с фитопатогенами - 90 %, а в контроле только 75 %. В вариантах выращивания огурцов с внесением фитопатогенных грибов гибель растений достигала 40 % и более.
Итак, добавление штаммов-антагонистов позволяет эффективнее осуществлять переработку органических отходов (сократить время), повысить продукцию дождевых червей и долю в ней половозрелых особей и получать биопрепарат, обладающий повышенным супрессивным действием к фитопатогенам и ростстимулирующим - на растения.
8.3 Оценка способности адсорбции тяжелых металлов биомассой штаммов Trichoderma
Во многих работах было показано что, грибы рода Trichoderma могут быть весьма устойчивы к промышленным загрязнениям окружающей среды. Так, например, при сравнении микобиоты загрязненных и экологически чистых местообитаний в Марокко выяснилось, что Т. konirtgii встречается только в наиболее неблагополучных местах. Грибы рода Trichoderma способствуют очищению воды и почв не только разлагая сложные органические загрязнители, но и адсорбируя и накапливая ионы металлов, в том числе и токсичных. Так, например, аккумуляция цинка, кадмия и ртути мицелием Т. harzianum происходит в широких пределах рН среды. Т. viride способна накапливать кобальт в мицелии и конидиях (Frank et al., 1993).
Штаммы, обладающие хорошим ростом и способностью расти на твердых средах с высоким, превышающим ПДК, содержанием тяжелых металлов, изучали на способность к адсорбции металлов в условиях глубинной культуры. Установлено, что штаммы обладают неодинаковой чувствительностью к различной концентрации металлов в жидкой среде. Медь и свинец в концентрации 5 ммоль/л полностью ингибировали рост всех трех штаммов (таблица 13).
Таблица 13 - Накопление биомассы штаммами Тпс1юс1егта при глубинном культивировании на средах с солями тяжелых металлов
Биомасса (г/л) при культивировании (7 сут) на средах с содержанием металлов
Штамм Ме контроль 0,1 ммоль/л 1 ммоль/л 3 ммоль/л 5 ммоль/л
Т.азрегеИ ит 310 Ъху 7,15±0,15 8,25±0,15 4,90±0,51 3,10±0,66 2,45±0,65
Сё 7,15±0,15 5,80±0,66 4,45±1,21 2,30±0,96 1,92±0,17
Си 7,15±0,15 1,90±0,30 0,60±0,60 0 0
РЬ 7,15±0,15 4,25±0,15 4,40±0,21 0 0
Т. Ъатапи т М 99/5 Ъ\ 8,05±0,15 6,35±0,23 7,75±0,46 8,80±0,69 2,0±0,24
Сс1 8,05±0,15 2,70±0,11 2,35±0,03 1,0±0,07 0
Си 8,05±0,15 1,95±0,76 0,40±0,01 0 0
РЬ 8,05±0,15 3,35±0,12 2,65±0,07 1,30±0,07 0
Т. кот^п ТСЛ-06 Тп 9,25±0,15 7,75±0,21 7,70±0,23 6,75±0,24 2,15±0,12
Сё 9,25±0,15 5,40±0,14 2,90±0,15 2,65±0,09 1,15±0,09
Си 9,25±0,15 3,70±0,08 1,40±0,03 0 0
РЬ 9,25±0,15 3,75±0,09 2,35±0,07 0,15±0,05 0
Увеличение концентрации металлов приводит к заметному подавлению роста штаммов при глубинном культивировании, причем ингибирующий эффект отмечен уже для концентрации 0,1 ммоль/л. При содержании в питательной среде 1 ммоль/л меди у всех штаммов наблюдали окрашивание пеллетов в голубой или синий цвета, что, очевидно, происходит в результате связывания ионов меди Си(П) клеточной стенкой грибов. Подобный эффект окрашивания мицелия в голубой цвет для N. сга.ка был отмечен А. Субраринян с соавторами (1989) и синий для Т. \iride И. Онанде с соавторами (2003). Согласно их предположениям, голубая окраска мицелия была обусловлена связыванием ионов меди белками клеточной стенки.
Наиболее устойчивым, способным расти при концентрациях свинца от 0,1 до 1 ммоль/л, оказался штамм М 99/5. Однако при содержании свинца 1 ммоль/л урожай биомассы снижался в 3,9 раза в сравнении с контролем. Токсическое действие кадмия и цинка проявилось значительно слабее, а для цинка отмечен незначительный стимулирующий эффект роста биомассы мицелия штамма 310 при концентрации 0,1 ммоль/ля.
В ранних исследованиях в области биосорбции ионов тяжелых металлов использовались живые клетки микроорганизмов. Однако, у мертвых и инактивированных клеток, как показали многочисленные исследования (Малик, 2004), была такая же или еще более высокая способность к адсорбции ионов металлов. Исследовали адсорбцию четырех металлов инактивированной биомассой трех штаммов в концентрациях: медь и свинец 0,1 и 1,0 мг/л раствора, а кадмий и цинк 1,0 и 10,0 мг/л раствора. Максимальной степенью сорбции всех изученных металлов обладал штамм ТСЛ-06 Т. котп^И (рисунки 6-9).
При экспозиции мицелия штамма в растворы содержание металлов снижается: для кадмия - 2,16 раз при концентрации 1 мг/л и 4,16 раз при концентрации 10 мг/л (рисунок 8); кроме того наблюдается значительное связывание меди мицелием, ее концентрация в растворе уменьшается в 3,15 раз при концентрации 1 мг/л до 10 раз при концентрации 0,1 мг/л (рисунок 9).
Рисунок 6 - Остаточное содержание свинца в растворе при концентрациях 0,1 (А) и 1 (Б) мг/ л раствора после адсорбции мицелием штаммов
Рисунок 7. Остаточное содержание цинка в растворе при концентрациях I (А) и 10 (Б) мг/ л раствора после адсорбции мицелием штаммов
Из литературных данных известно, что сорбция ионов Си(П) возрастает при увеличении времени нахождения сорбента и снижением концентрации меди в растворе (Singh et al., 2010). Максимальный уровень сорбирующей способности штаммов характерен для свинца. В первые 10 минут экспозиции всеми исследуемыми штаммами адсорбируется от 35 до 50 % металла при исходной концентрации 1мг/л, а к концу содержание ионов свинца в растворе снижается в 3 -4,5 раза, и его остаточное содержание не превышает 20 % от первоначальной концентрации (рисунок 6).
Это согласуется с данными индийских ученых (Singh et al., 2010), показавших, что при использовании инактивированной биомассы способность штамма Т. viride, выделенного из загрязненных почв, сорбировать ионы РЬ(П) возрастает при увеличении экспозиции. При насыщении раствора дальнейшая аккумулятивная способность снижается.
Рисунок 8. Остаточное содержание кадмия в растворе при концентрациях 1(А) и 10 (Б) мг/ л раствора после адсорбции мицелием штаммов
Рисунок 9. Остаточное содержание меди в растворе при концентрациях 0,1(A) и 1 (Б) мг/ л раствора после адсорбции мицелием штаммов
Аккумулятивная способность штамма TCJI-06 Т. koningii к адсорбции свинца сопоставима с рекомендованным штаммом Т. viride, используемым в биореакторе для очистки сточных вод в Индии (Singh et al., 2010). Таким образом, исходя из полученных результатов, штамм TCJI-06 Т. koningii можно рекомендовать в качестве адсорбента для сточных вод, загрязненных такими тяжелыми металлами как свинец, кадмий, медь.
ВЫВОДЫ
1. На основании многолетнего изучения микобиоты установлено, что грибы рода Trichoderma являются типичными представителями на территории бассейна реки Енисей. С использованием культурально-морфологических и молекулярно-генетических методов идентифицировано 8 видов: Т. asperellum, Т. harzianum, Т. viride, Т. citrinoviride, Т. hamatum, Т. atroviride. В ядро доминантных видов входят: Т. asperellum, Т. harzianum, Т. viride, Т. citrinoviride. Среди видов, ранее не описанных на исследуемой территории, обнаружены: Т. citrinoviride, Т. hamatum и Т. atroviride.
2. Природными резервуарами сохранения численности и видового
разнообразия видов рода ТпсИоёегта являются целинные лесные почвы, где частота встречаемости составляет более 60 %. Антропогенные ландшафты характеризуются резким снижением пространственной и временной частоты встречаемости (0-7 %) и видового разнообразия (менее 4- 5 видов).
3. Природные популяции Тпскойегта гетерогенны и характеризуются высокой степенью полиморфизма. Абиотические факторы (температура, аэрация, влажность) и субстратная специфичность определяют доминирование определенных видов и популяций рода ТпсИос1егта. Впервые установлена способность к анаэробному росту и брожению у видов Тг1скос1егта, способствующая отбору определенных клонов в местообитаниях с ограниченной обеспеченностью кислородом.
4. Качественная популяционная структура видов Тпскойегта представляет собой мозаику клонов с различным типом совместимости, скорости роста, интенсивности спороношения, отношения к субстрату и конкурентоспособности.
5. Популяции грибов рода ТгкИос/егта являются природным резервуаром для поиска штаммов-продуцентов биологически активных соединений, эффективных для контроля широкой группы организмов: фитопатогенных грибов, условно-патогенных и патогенных бактерий, опухолевых клеток, а также оказывающих влияние на рост высших растений. Стабильность кулыурально-морфологических признаков является критерием отбора штаммов - продуцентов для получения целевых продуктов в биотехнологии.
6. Исследование активных компонентов культуральной жидкости и экстрактов мицелия выявило наличие веществ непептидной природы, оказывающих цитотоксическое действие на опухолевые клетки (вызывающих индукцию позднего апоптоза и влияющих на клеточный цикл) и ингибирующих рост патогенных грамположительных бактерий. По результатам проведенных исследований отобраны штаммы: Т. аярегеИит Т-30 (ВКМ Р4340Б) и Т.Иа/^апит ТУ4-1 (ВКМ Р434Ш) как продуценты противоопухолевых соединений и штамм Т. каЫапит М99/51 - продуцент противоопухолевых и антимикробных веществ (ВКПМР- 1027).
7. Преобладающим типом взаимоотношения местных изолятов Тпскоёегта является положительное воздействие на растения, связанное с активацией иммунного ответа растения-хозяина в ответ на воздействие фитопатогенных грибов при интродукции микромицетов-антагонистов и прямого ростстимулирующего действия за счет синтеза специфических соединений.
8. Показаны механизмы ростстимулирующего действия антибиотически активных штаммов на различные виды растений и культуры тканей. Впервые установлено, что виды Т. аьрегеНит и Т. копт&г способны синтезировать вещества ауксиновой природы, стимулирующие рост растений. Отобраны перспективные штаммы Т. аярегеПит ТСЛ-06 и Т. Иап1апит М99/5, синтезирующие индолилуксусную кислоту в количестве 0,249 и 0,051 мг/л.
9. Составлены экологические обоснования скрининга и интродукции 1рибов-антагонистов в агроэкосистемы, способствующие повышению уровня экологической безопасности. Предложены штаммы - продуценты биопрепаратов -Т. аэрегеИит штамм МГ/6, Т. Иатапит М-99/5.
10. Изучение закономерностей роста, ферментативной активности, спорообразования на различных лигноцеллюлозных субстратах в условиях твердофазного культивирования позволило определить основные показатели продуктивности и разработать технологический регламент на получение биопрепарата Триходермин-М.
11. Испытание опытных партий биопрепарата показали его эффективность в защите от фитопатогенов злаков и хвойных, повышении продуктивности ячменя и пшеницы, снижения инфекции урожая новой репродукции, а также увеличение выхода здоровых сеянцев сосны сибирской. Основными критериями экологической эффективности следует считать снижение численности фитопатогенных микромицетов при сохранении ядра доминирующих сапротрофных видов и положительную направленность почвообразовательного процесса.
12. С целью регуляции жизнедеятельности популяций калифорнийских червей и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов разработана ускоренная технология вермикомпостирования с использованием штаммов Т. ахрегеНит МГ/6 и Т. Иагг'юпит М99/5, обладающих ростстимулирующими и антибиотическими свойствами.
13. На основе изучения биохимического состава мицелия показана возможность использования штаммов грибов рода Тпскос1егта в качестве продуцентов кормового препарата и отобраны культуры, перспективные для получения кормовой добавки для птиц. Качественный состав аминокислот белка мицелия штаммов характеризуется наличием незаменимых аминокислот: лизина, триптофана, аргинина и лейцина, лимитированного в растительных кормах, использующихся для птиц. Общее содержание липидов в биомассе микромицетов рода Тпс}юс!егта составляет от 4,21 до 13,57%. В составе липидов биомассы и культуральной жидкости микромицетов рода Тг1с!юс!егта преобладают гликолипиды.
14. Исследовано влияние селена на рост и продуктивность штаммов грибов рода Тпс1юс}егта, определены условия культивирования штаммов и оптимальная доза селена в питательной среде. На основании сравнительной оценки влияния селена на продуктивность биомассы грибов отобран штамм ТН-5 Т. а.чреге11ит, биомасса которого не является токсичной и может быть использована в качестве кормовой селенсодержащей добавки, при выращивании на жидкой среде с содержанием селена 20 мкг/л. Получена селенсодержащая кормовая добавка с содержанием белка не менее 22%, селена 93,75 мг/г и определена ее перевариваемость, обеспечивающая активность пепсина 0,213 ТЕ. Разработан рецепт рациона цыплят-бройлеров с использованием кормовой добавки в виде мицелия двух продуцентов Ь. ¡ифИигеиз штамм ЫЪ-22 (ВКМ Р-4276Б) и Т. азрегеИит штамм ТН-5.
15. Показана возможность использования мицелия штаммов грибов рода Тг1с!ю(1егта для адсорбции тяжелых металлов из растворов. Мицелий штамма ТСЛ-06, рекомендован в качестве адсорбента для сточных вод, загрязненных тяжелыми металлами свинец, кадмий, никель или для комплексной очистки загрязненных почв совместно с фиторемедиантами.
Основные публикации по теме работы Статьи в рецензируемых журналах
1. Рязанова Т.В., Громовых B.C.. Махова Е.Г., Громовых Т.И., Чупрова H.A. Пути поиска новых штаммов - продуцентов биопрепаратов для защиты сеянцев хвойных// Химия растительного сырья, Барнаул, 2001. С. 34 — 38
2. Громовых Т.И., Литовка Ю.А., Громовых B.C.. Махова Е.Г. Эффективность использования Trichoderma asperellum (штамм МГ-97) и влияние на развитие фузариоза на сеянцах Larix sibirica// Микология и фитопатология, 2002, том 36, вып. 4,- С. 70-76
3. Громовых Т.Н., Литовка Ю.А., Садыкова B.C., Габидулина И.Г.Биологические свойства нового штамма Streptomyces lateritius 19-97 М, перспективного для использования в растениеводстве // Биотехнология, №5. 2005,-С. 35-40
4. Кураков A.B., Прохоров И.С., Костина Н.В., Махова Е.Г., Садыкова B.C. Стимуляция грибами азотфиксации в дерново-подзолистых почвах// Почвоведение. Т.39, № 9, 2006. - С.1075 - 1081
5. Садыкова B.C., Ковалева Г.К., Чижмотря Н.М., Гаврилова А.Г., Новицкий И.А. Антимикробная активность грибов рода Trichoderma и Trametes в отношении условно-патогенных микроорганизмов рода Staphylococcus!7 Сибирский медицинский журнал. Т.66, № 8, 2006,- С. 17 - 20
6. Садыкова B.C., Громовых Т.Н., Кураков A.B., Лихачев А.Н. Перспективы создания новых форм биопрепаратов на основе сибирских биоконтрольных штаммов грибов рода Trichoderma // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова.Т.2. № 4, 2006 - С. 20-21
7. Kurakov A.V., Makhova E.G., Sadykova V.S., ProkhorovI.S., Kostina N.V. Stimulation of nitrogen fixation in soddy-podzolic soilwith fungi // Eurasian soil science. T.39 № 9, 2006. - C.968 - 974
8. Садыкова B.C., Громовых Т.Н., Лихачев A.H., Кураков A.B., Ушанова B.M. Биологическая активность сибирских штаммов Trichoderma как фактор отбора для создания биопрепаратов защиты растений нового поколения // Биотехнология, № 6. 2007 - С. 12-17
9. Садыкова B.C., Громовых Т.П., Гайдашева И.И., Ушанова В.М. Перспективы получения биопрепарата для защиты сеянцев хвойных путем твердофазного культивирования штамма 19/97 М STREPTOMYCES LATERITIUS SVESCHNIKOVA// Хвойные бореальной зоны XXXXIV, № 4-5, 2007. - С. 482 -486
10. Гайдашева И.И., Садыкова B.C., Бондарь П.Н., Зобова Н.В., Громовых Т.Н. Перспективы использования новых биопрепаратов для защиты злаков в Средней Сибири // Вестник КрасГАУ. - 2008. - №1(22). - с. 74-78
11. Третьякова И.Н., Садыкова B.C., Носкова Н.П., Бондарь П.Н., Гайдашева И.И., Громовых Т.И., Иваницкая A.C., Ижболдина М.В., Барсукова A.B. Ростстимулирующая активность штаммов рода Streptomyces и Trichoderma и перспективы их использования для микроклонального размножения хвойных // Биотехнология. - 2009. - №1. - С. 39-44
12. Садыкова B.C., Бондарь П.Н. Перспективы использования грибов рода Trichoderma в защите злаков от корневых гнилей в Сибири // Вестник КрасГАУ. -2010.-№2(41).-С. 34-39
13. Садыкова B.C., Лихачев А.Н., Бондарь П.Н. Ограничение развития комплекса возбудителей корневых гнилей ячменя антагонистами рода Trichoderma II Микология и фитопатология. - Т.44, Вып.б, 2010 - С. 556-562
14. Кураков А.В., Хидиров К.С., Садыкова B.C., Звягинцев Д.Г. Способность к анаэробному росту и активность спиртового брожения у микроскопических грибов// Прикладная биохимия и микробиология. Т.47 №2, 2011,- С. 1-7
15. Садыкова B.C., Громовых Т.Н. Устойчивость возбудителей корневых гнилей ячменя к химическим и биологическим фунгицидам //Доклады РАСХН № 2, 2011. - С.12-18
16. Sadykova V.S., Gromovykh T.I. Resistance of barley root rot pathogens to chemical and biological iiingicides// Russian Agricultural Sciences, Vol. 37, No. 2, 2011.- pp. 126-129
17. Садыкова B.C., Громовых Т.Н., Казеннова Д.В. , Черемных Е.Г. Перспективы получения кормовой добавки на основе селенсодержащего мицелия грибов рода Trichoderma //Доклады РАСХН № 3, 2012. - С.44 - 47
18. Садыкова B.C., Сидаков A.M., Громовых Т.Н., Бондарь П.Н. Оценка ростстимулирующей активности штаммов грибов рода Trichoderma на каллусах злаков // Вестник РАСХН № 2, 2012. - С. 32-37
Монографии
Biological Control: a global perspective (глава «Control of Root Diseases with Trichoderma spp. in Forest Nurseries of Central Siberia») / T.I. Gromovykh,V.A. Tyulpanova, V.S. Sadykova, A.L. Malinovsky: Ed. C. Vincent et al.- CABI.- 2007. - P. 177-203
Материалы, опубликованные в сборниках Всероссийских и Международных сборниках конференций, съездов, конгрессов
1. Tulpanova V., Shmarlovskaya S., GromowkhV .. Makhova H. Strains of Trichoderma Benefit for Biological Control Seedling Pathogen..// On Methyl Bromide Alternatives And Emmision Reductions: Ann. Int. Research Conf.- San-Diego, 1999. -P.38-1-38-5
2. Шилкина E.A., Гукасян B.M., Громовых B.C.. Коссинская И.С., Андреева О.Н.Оценка устойчивости сеянцев хвойных к фузариозному полеганию в лесопитомниках Средней Сибири// Методы оценки состояния и устойчивости лесных экосистем: Материалы докл. межд. сов.- Красноярск, 1999,- С.70-71
3. Садыкова B.C., Строй Л.А. Перспективы создания биопрепаратов на основе штаммов Trichoderma с использованием гидролизного лигнина// Всероссийская конференция «Биотехнология - сельскому хозяйству», С - Пб., 2001.-С. 54-57
4. Садыкова B.C., Лихачев А.Н., Махова Е.Г. Внутривидовая изменчивость гриба Trichoderma asperellum G.Samuels//l -й конгресс микологов России,- Москва, 2002. - С.220
5. Садыкова B.C., Лихачев А.Н., Махова Е.Г. Моноспоровый анализ видов рода Trichodcrma//BcepoccniicKaH конференция - Пенза, 2002. - С. 171-173
6. Zaika N. A.,Gromovykh T.I. Sadykova V.S. Ecological aspects of use of active strains Trichoderma asperellum and Trichoderma harzianum in biological monitoring of conifer seedlings// XIV Congress of European Mycologists,Yalta, 2003.-P. 42
7. Садыкова B.C., Кураков А.В., Махова Е.Г. Отбор штаммов для создания препарата по защите сеянцев хвойных от фузариозной инфекции корней// Научные труды МБЦ МГУ, 2003. - 69 - 76
8. Садыкова B.C., Лихачев А.Н., Рязанова Т.В. Изменчивость Trichoderma asperellum и отбор штаммов для использования в интегрированной системе защиты хвойных пород от фузариозаУ/ XI съезд Русского ботанического общества. Ботанические исследования в Азиатской России. Новосибирск-Барнаул, 2003. т.1. - С.58 -60
9. Sadykova V.S., Likhachev A.N., Gromovykh T.I. Biological control of Fusarium spp. In forest nurseries of Central Siberia// Shaping the Future Abstract 75 th Anniversary Meeting Canadian Phytopathology Society, Ottawa, 13-16 June, 2004.- P. 45
10. Sadykova V.S., Likhachev A.N., Ryazanova T.V. Control of Fusarium species with Trichoderma asperellum in combination with organic compounds to coniferous seedlings in Central Siberia// Abstract of 9 th Internetional Workshop on Trichoderma and Gliocladium, April 6-8, Vienna, Austria,2006.- P. 18
11. Садыкова B.C., Бондарь П.Н., Громовых Т.И. Внутривидовая изменчивость грибов рода Trichoderma в Средней Сибири // Всероссийская конференция «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока», Т.1, 2006.- С. 190- 193
12. Sadykova V.S. Development of biopreparations on the base of biocontrol Trichoderma strain on plant compounds of technogenic sphere// The Internetional Symposium «EU-Russia: Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framework Programme», June 5-9, 2006, St.-Petersburg
13. Садыкова B.C., Лихачев A.H. Вегетативная совместимость фитопатогенных видов Botritis michelli и сапротрофных Botrytis camea Schumach и Trichoderma asperellum Samuels// IX Всероссийский популяционный семинар «Особь и популяция - Стратегия жизни», 2-7 октября, 2006 , Уфа.- С. 225 - 230
14. Садыкова B.C., Лихачев А.Н., Кураков А.В. Биология и гетерогенность популяций грибов - фактор, определяющий отбор штаммов видов рода Trichoderma для биоконтроля // Труды Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна 28 ноября - 1 декабря, Пущино, 2006.- С.162 - 164
15. Садыкова B.C., Лихачев А.Н., Кураков А.В. Перспективы создания новых форм биопрепаратов на основе сибирских биоконтрольных штаммов Trichodermall 4 Съезд Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова 5 -7 декабря, Пущино, 2006. - С. 223 - 225
16. Садыкова B.C., Чижмотря Н.М., Ковалева Г.К. Антимикробная активность грибов рода Trichoderma в отношении условно-патогенных микроорганизмов //5 Всероссийский конгресс по медицинской микологии «Успехи медицинской микологии» Т. IX, 2007. - 187— 189
17. Садыкова B.C., Лихачев А.Н. Установление комплекса признаков-тестов по отбору антагонистов для биоконтроля фитопатогенов (на примере грибов рода Trichoderma) II Сборник научных трудов «Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты». РАЕН. Вып.16, М.2007. - С.ЗЗ-47
18. Sadykova V.S., Likhachev A.N., Gromovykh T.I., Kurakov A.V. Development of new forms of biopreparation on the basis of biocontrol Trichoderma
strains by using wooden residuals // International symposium «Best practice in disease, pest and weed management», 10-12 May, Berlin, 2007,- P. 42-44
19. Sadykova V.S. The use of active strains of Trichoderma and Streptomyces in biological monitoring of coniferous seedlings// International symposium "Best practice in disease, pest and weed management", 10-12 May, Berlin, 2007.- P. 71-74
20. Садыкова B.C., Бондарь П.Н., Рязанова T.B., Ушанова B.M. Оценка возможности использования сибирских штаммов Trichoderma для создания биопрепаратов защиты растений // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Лесной и химический комплексы - проблемы и решения». -Красноярск, 2007. - Т. 2 - с. 7-11
21. Садыкова B.C., Ковалева Г.К. Противоопухолевые свойства макро и микромицетов Средней Сибири// Современная микология России. Тезисы докладов II конгресса микологов России. М.: Изд-во «Национальная академия микологии». -2008. - С. 82
22. Садыкова B.C., Бондарь П.Н., Савицкая А.Г. Оценка возможности использования сибирских штаммов Trichoderma для создания биопрепаратов защиты растений // Тезисы докладов второго съезда микологов России. Современная микология в России. — Москва, 2008. — с. 122
23. Садыкова B.C., Громовых Т.Н., Третьякова И.Н., Бондарь П.Н., Носкова Н.Е. Антагонистическая и ростстимулирующая активность штаммов родов Trichoderma и Streptomyces и перспективы их использования в биоконтроле // Материалы 5 съезда биотехнологов России. - Москва, 2008. — С. 286-288
24. Бондарь П.Н., Садыкова B.C., Ушанова В.М., Савицкая А.Г. Биотехнологические аспекты отбора активных штаммов Trichoderma для создания препаратов защиты растений // Материалы международной научной конференции «Современные средства, методы и технологии защиты растений». - Новосибирск, 2008. - С. 30-34;
25. Садыкова B.C., Лихачев А.Н. Индикация функциональных групп микромицетов на опаде ряда травянистых и древесных пород// Сборник материалов VII Международной конференции «Проблемы лесной фитопатологии и микологии», Пермь, 7-13 сентября 2009. -С. 120-124
26. Кураков А.В., Садыкова B.C., Хидиров К.С., Супина О.А. Анаэробный рост и образование этанола грибами-деструкторами целлюлозных субстратов// Сборник материалов VII Международной конференции «Проблемы лесной фитопатологии и микологии», Пермь, 7-13 сентября 2009. -С.114-118
27. Садыкова B.C., Громовых Т.И., Третьякова И.Н. Создание биопрепаратов биологического контроля и стимуляции роста растений.// Материалы Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов», проходившей в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 15 - 17 марта, 2010 г.) - М.: ЗАО «Экспо - биохим - технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2010. - С. 163
28. Громовых Т.И., Кузнецова Л.С., Садыкова B.C. Коллекция культур макро и микромицетов как база для образовательного процесса и создания современных биотехнологий // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. -2010.-1 1.-С.246.
29. Бондарь П.Н., Громовых Т.И., Садыкова В.С. Ростстимулирующая активность сибирских штаммов рода Trichoderma в отношении злаковых растений //Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2010. - 1. - с. 89.
30. Садыкова В.С., Свирщевская Е.В., Громовых Т.И., Зубарева Е.С. Антимикробная и противоопухолевая активность штаммов рода Trichodemta//«buQSiQrmecK\i активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее», 27-29 января 2011,- С.47-49
31. Лихачев А.Н., Садыкова В.С. Эколого-трофические ниши и функциональные свойства грибов рода Trichoderma - основа для мониторинга и практического использования // Сборник статей 5-й Междунар. научно-практ. конф. «Мониторинг экологически опасных промышленных объектов и природных экосистем», Пенза, 2011 - С.142 - 152
32. Громовых Т.И., Садыкова В.С.А Свирщевская Е.В., Зубарева Е.С. Изучение ингибирующего действия метаболитов и экстрактов грибов рода Trichoderma на опухолевые клетки// Фармацевтические и медицинские биотехнологии: Матер. Международной науч.-практ. Конф. М. 2012,- С.186-187
33. Катруха Г.С., Федорова Г.Б., Садыкова В.С. Антимикробная активность грибов рода Trichoderma в отношении грамположительных бактерий // Фармацевтические и медицинские биотехнологии: Матер. Международной науч.-практ. Конф. М. 2012,- С. 74-75
Изобретения и патенты
1. Патент на изобретение №2171580. Штамм гриба Trichoderma sp. МГ-97, используемый для защиты сеянцев хвойных от фузариозов. / Громовых Т.И., Шмарловская С.В., Тюльпанова В.А., Садыкова В.С. Заявка №99126556/13 от 17.12.199г. Опубл. 10.08.2001 г. Бюлл. № 22.2001 г.
2. Патент на изобретение № 2261902. Громовых Т.И., Литовка Ю.А., Садыкова В.С. Штамм актиномицета Streptomyces lateritius 19-97 М, используемый для стимуляции роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium, Alternaría. Заявка №2003100579/13. 08.01.2003. Опубликовано: 10.10.2005, Бюл. №28.
3. Заявка № 2011107180/21. Способ переработки органических отходов // Кураков А.В., Садыкова В.С. Приоритет от 28.02.2011 г. Опубл. 27.07.2011, Бюлл. №21.
4. Заявка № 2011140094/10(059910). Штамм микромицета Trichoderma harzianum Rifai М 99/51 (ВКПМ F-1027), используемый в качестве продуцента для получения биологически активных противоопухолевых препаратов //Громовых Т.И., Садыкова В.С., Свирщевская Е.П., Зубарева Е.С. Приоритет от 04.10.2011 г.
Садыкова Вера Сергеевна
ЭКОЛОГИЯ ГРИБОВ РОДА ТШСНООЕЯМА (РЕЯ8: Рг.) БАССЕЙНА РЕКИ ЕНИСЕЙ, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук
Подписано в печать 04. 2012 Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать офсетная. Печ.л. 3.0. Тираж 100 экз. Заказ 4648 Типография «Бизнес-Стиль» Ленинградское шоссе, дом 94, корп. 3 Тел.:+7 (495) 988-40-02 www.tbstyle.ru
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Садыкова, Вера Сергеевна
ВВЕДЕНИЕ.
1 1 ОБЗОР ИССЛЕДОВАНИЙ ГРИБОВ РОДА ТШСНООЕЯМА:
СИСТЕМАТИКА, БИОЛОГИЯ ВИДОВ, ПРАКТИЧЕСКОЕ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ.
1.1 Общая характеристика и систематика рода Тпскойегта.
1.2 Распространение грибов рода ТпскосИегта и их роль в водных и наземных экосистемах.
I 1.3 Механизмы контроля фитопатогенов грибами рода
1 Тпскойегта.
1.4 Биологически активные соединения грибов рода
Тпскос1егта.
1.5 Влияние грибов рода Тпскойегта на рост и развитие растений.
1.5.1 Положительное влияние видов рода Тпскос}егта на растения.
1.5.2 Фитотоскичные свойства грибов рода Тпскос1егта и отрицательное действие на растения.
I 1.6 Использование грибов рода Тпскос1егта в практической деятельности.
I 1.6.1 Биофунгициды - триходермины, использующиеся в мировой у практике борьбы с фитопатогенами.
1.6.2 Использование грибов рода ТпсИос1егта для создания
Л' г-п компостов и вермикомпостов.
1.6.3 Использование грибов рода Тпс1гос1егта для адсорбции тяжелых металлов.
1.6.4 Применение штаммов рода ТпскснЗегта как кормовых добавок для животных.
2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1 Характеристика района исследования.
IV 2.2 Характеристика объектов исследований. \ 2.3 Методы выделения и идентификации грибов рода Тпскос1егта.
2.4 Методы изучения биологических свойств грибов рода
4' ТпсЪойегта.
2.4.1 Оценка нестабильности природных и моноспоровых р.* штаммов.
2.4.2 Определение способности роста в анаэробных условиях и бродильной активности штаммов.
2.4.3 Оценка влияния температуры на рост штаммов.
II 2.4.4 Оценка интенсивности спороношения штаммов. к\ 2.4.5 Оценка утилизации органических соединений штаммами.
2.4.6 Оценка влияния селена на прорастание спор и накопление у д биомассы мицелия штаммов. и, 2.4.7 Оценка влияния тяжелых металлов на рост штаммов.
2.5 Методы изучения биологической активности штаммов рода Trichoderma.
2.5.1 Определение антагонистической активности в отношении грибов и бактерий.
2.5.2 Оценка токсичности штаммов.
2.5.3 Оценка противоопухолевой активности.
2.5.4 Оценка ростстимулирующей активности.
2.6 Изучение биохимического состава биомассы мицелия штаммов Trichoderma.
2.7 Оценка перевариваемости биомассы мицелия штаммов рода Trichoderma.
2.8 Твердофазное культивирование штаммов грибов рода Trichoderma на растительных субстратах.
2.9 Оценка влияния биофунгицидов на продуктивность растений в полевых испытаниях.
2.10 Оценка влияния грибов рода Trichoderma на микробиоту ризосферы растений.
2.11 Оценка влияния препарата «Триходермин-М» и штамма гриба Trichoderma asperellum МГ/6 на процессы вермикомпостирования.
3 ХАРАКТЕРИСТИКА ВИДОВ РОДА TRICHODERMA НАЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМ БАССЕЙНА РЕКИ ЕНИСЕЙ.
3.1 Распространение видов рода Trichoderma.
3.2 Влияние абиотических факторов на рост грибов рода Trichoderma.
3.2.1 Влияние температуры.
3.2.2 Рост и развитие штаммов рода Trichoderma в анаэробных условиях.
3.2.3 Влияние ионов тяжелых металлов.
3.2.4 Особенности спектра утилизации органических веществ штаммами рода Trichoderma.
3.3 Гетерогенность изолятов грибов рода Trichoderma.
3.4 Вегетативная совместимость моноспоровых штаммов рода Trichoderma.
3.5 Молекулярно-генетическая характеристика моноспоровых клонов рода Trichoderma.
4 БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA.
4.1 Антагонистическая активность штаммов рода Trichoderma в ' отношении фитопатогенных грибов.
4.2 Антибиотическая активность штаммов рода Trichoderma в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий.
4.3 Противоопухолевая активность штаммов рода Trichoderma.
4.4 Биологическая активность и токсичность штаммов рода Trichoderma в отношении простейших.
5 РОСТСТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ГРИБОВ РОДА ТШСНОИЕЯМА.
5.1 Влияние метаболитов штаммов рода Тпскос1егта на рост растений и каллусов злаков.
5.2 Влияние метаболитов штаммов рода ТпсНос1егтс1 на рост растений и каллусов хвойных.
5.3 Изучение ростстимулирующих соединений штаммов рода Тпс1юс1егта.
6 РАЗРАБОТКА КОРМОВЫХ ДОБАВОК НА ОСНОВЕ БИОМАССЫ МИЦЕЛИЯ ШТАММОВ РОДА ТШСНОИЕЯМА.
6.1 Исследование биохимического состава биомассы и метаболитов культуральной жидкости.
6.2 Влияние соли селена на рост и накопление биомассы штаммами рода ТИскснЛегта.
6.3 Оценка перевариваемости биомассы штамма ТпсЬ.ос1егта аэрегеИит ТН-5.
6.4 Разработка белкового модуля кормовой добавки.
7 ТВЕРДОФАЗНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГРИБОВ РОДА ТШСНОИЕЯМА НА РАСТИТЕЛЬНЫХ СУБСТРАТАХ.
7.1 Биоконверсия растительных субстратов штаммами рода Тпскойегта, рзработка технологии биопрепаратов.
7.2 Получение вермикомпостов с использованием штаммов рода ТпскосИегта.
8 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ И ВЕРМИКОМПОСТОВ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА ТШСНОВЕКМА.
8.1 Эффективность использования биопрепаратов в полевых условиях.
8.2 Эффективность действия вермикомпостов и штамма Т.аярегеИит на рост растений в условиях закрытого грунта.
8.3 Адсорбция тяжелых металлов биомассой мицелия штаммов Тпс1юс1егта.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Экология грибов рода Trichoderma (Pers.:Fr.) бассейна реки Енисей, их биологические свойства и практическое использование"
Грибы являются обязательными компонентами гетеротрофного блока организмов наземных и водных экосистем и выполняют в них самые разнообразные функции (Великанов, 1997; Гарибова, Лекомцева, 2005; Мишустин, 1975; Красильников, 1958; Переведенцева, 1999; Сидорова, 1987; Christensen, 1989; Swift, 1976; 1987). Влияние грибов на биоценотические процессы, структуру и функции сообществ подтверждено целым рядом работ, хотя их роль менее исследована по сравнению с ролью растений (Великанов, 1997; Дьяков, 2008; Работнов, 1975; 1977). Наиболее подробно в отечественной и зарубежной литературе освящены вопросы распространения, видового состава и популяционной гетерогенности фитопатогенных микромицетов, особенно высоко патогенных видов, паразитирующих на экономически значимых возделываемых и диких видах растений (Веденяпина, 2000; Горленко, 1976; Дьяков, 1998; Лихачев, 2000; Громовых, 2002; Пидопличко, 1977; Nelson, 1983; Smith et al., 1993). Значительно меньшее внимание уделяется изучению биоразнообразия в естественных ценозах и агроэкосистемах сапротрофных видов микромицетов.
Представители сапротрофных микромицетов рода Trichoderma, входя гетеротрофный блок микроорганизмов, влияют на почвообразовательные процессы, способствуют улучшению структуры и образованию гумуса в почве за счет биоконверсии и минерализации растительных остатков, участвуют в регуляции комплекса микробиоты почв и ограничении развития фитопатогенных видов. Биология, филогения, распространение, а также ряд важных аспектов, связанных с механизмами биоконтроля, биосинтеза ферментов и антибиотиков микромицетами рода Trichoderma к настоящему времени исследованы достаточно подробно (Александрова, 2000; Алимова, 2006; Великанов, 1997; Гринько, 2001; Сидорова, 1980; Сейкетов,1972;
Bissett, 1991; Druzhinina et al., 2005, 2006, 2010; Harman, 2004; Samuels, 1996; 5
2006; Vinale, 2008). В последние десятилетия грибы рода Trichoderma заняли одно из ведущих мест в качестве ведущих объектов биотехнологии полезных продуктов и препаратов.
Однако, несмотря на множество исследований, потенциал грибов рода Trichoderma не только не исчерпан, но и не до конца раскрыт (Samuels, 2006). Данные о нахождении тех или иных видов рода Trichoderma наиболее часто встречаются в работах, посвященных изучению микобиоты почв тех или иных регионов, реже целенаправленному исследованию по распространению видов этого рода. Описание видов, распространенных на территории России, касается лишь европейской ее части (Александрова, 2006; Алимова, 2006; Кирцидели, 1999). Сведения о видовом составе Trichoderma на территории азиатской части России, в частности, в Сибири, малочисленны (Громовых и др., 2005; Якименко, 1996; Kullnig et all., 2000). Изучению видов на территории бассейна реки Енисей, протяженность которого составляет более 3 тыс. километров, посвящено небольшое число работ (Громовых, 2002; Прудникова, 2000). Эти исследования имели направленный характер поиска штаммов-продуцентов биопрепаратов для защиты растений.
На территории бассейна реки Енисей, охватывающей три климатических пояса: арктический, субарктический и умеренный, в которых расположены восемь природных лесорастительных зон, полномасштабные исследования видов рода Trichoderma и оценка их экологической значимости не проводились. Не исследована молекулярно-генетическая диагностика видов рода Trichoderma, распространенных на территории этого региона.
Важной проблемой является гетерогенность популяций грибов рода
Trichoderma по признаку антагонистической активности, скорости репродукции, составу ферментов и.т.д., что создает предпосылки для доминирования определенных форм в популяциях из разных регионов.
Высокая изменчивость популяций видов рода Trichoderma может являться 6 одной из причин низкой эффективности биологического контроля в сравнении с лабораторными испытаниями.
Слабо исследованной областью остается изучение места и функций рода Тпскос1егта в сукцесионных процессах биоценозов. К настоящему времени практически отсутствуют данные, связанные с исследованием механизма аллелохимического действия на микробиоту, простейших, беспозвоночные и растения. Установлено, что виды этого рода синтезируют более 200 биологически активных веществ (Кого1еу е1 а1., 2009; Яе^о, 2008) и мо1уг успешно применяться в медицине и сельском хозяйстве. Исследования взаимодействия ТпсИос!егта с микробиотой почвы, простейшими и растениями открывают возможности теоретического обоснования и практического использования их регуляторной роли по ограничению вредного воздействия фитопатогенов.
Недостаточная изученность биохимического состава мицелия и метаболитов видов рода ТпсИо£1егта не дает возможности использования их биомассы в кормопроизводстве и других отраслях народного хозяйства и медицины. Целенаправленный поиск и выявление продуцентов для биотехнологических производств невозможен без четкого представления об их распространении в экосистемах и проявлении функциональных свойств в этих условиях. Созданные коллекции, на основе новых активных штаммов, могут быть потенциалом для отбора штаммов грибов рода Тпско<Аегта и использования их в различных сферах биотехнологии, сельского хозяйства и растениеводства.
Основной целью работы является изучение видов рода ТпсЬойегта в наземных экосистемах бассейна реки Енисей, их разнообразия и гетерогенности, установление влияния экологических факторов на формирование и отбор клонов в популяции видов, сравнительное исследование их биологии, а также отбор штаммов для использования в растениеводстве, сельском и лесном хозяйстве и биотехнологии медицинских препаратов.
Научная новизна. В результате масштабных инвентаризационных исследований ненарушенных лесных почв и агроценозов бассейна реки Енисей составлен список видов Trichoderma, среди которых Т. citrinoviride, Т. hamatum и Т. atroviride отмечены впервые. Показано, что возникающие внутривидовые группировки у видов рода Trichoderma выполняют роль краевых популяций, осуществляющих освоение новых субстратов и эколого-трофических ниш. Установлена высокая пластичность аэробного и анаэробного метаболизма, что обеспечивает специализацию к субстратам и поддержание численности видов рода Trichoderma в различных лесорастительных зонах бассейна реки Енисей. Показано, что неполная изоляция группировок снижает возможность образования гетерокарионов, что в конечном итоге, приводит к морфологическим, культуральным и биохимическим различиям клонов.
В области фундаментальной биотехнологии исследование дает исходный материал для инвентаризации рода Trichoderma и теоретического обоснования методов направленного поиска и скрининга промышленно важных штаммов микроорганизмов. Показано, что популяции грибов рода Trichoderma являются природным резервуаром для поиска штаммов-продуцентов биологически активных соединений, эффективных для контроля широкой группы организмов: фитопатогенных грибов, условно-патогенных и патогенных бактерий, опухолевых клеток, а также оказывающих влияние на рост высших растений. Стабильность культурально-морфологических признаков является критерием отбора штаммов-продуцентов для получения целевых продуктов в биотехнологии.
Впервые установлена ростстимулирующая активность у выделенных штаммов рода Trichoderma в отношении растений и каллусов злаковых и хвойных, связанная со способностью синтезировать вещества ауксиновой природы (индолилуксусную кислоту), отобраны перспективные штаммы для получения биопрепаратов, рекомендованные для стимулирования роста и защиты растений от корневых гнилей, вызываемых фитопатогенами из родов Alternaria, В ¡polaris и Fusarium.
В результате исследований биологической активности метаболитов и экстрактов из спор и мицелия штаммов рода Trichoderma в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов и линий опухолевых клеток изучен механизм токсического действия и даны рекомендации для использования активных штаммов как продуцентов биологически активных противоопухолевых t соединений.
Исследован биохимический состав биомассы штаммов Т. asperellum, Т. harzianum, Т. koningii и Т. viride. Изучено влияние селена на накопление биомассы штаммов рода Trichoderma при поверхностном и глубинном культивировании, определено накопление селена в мицелии и показана возможность их использования для получения кормовых добавок.
Практическая значимость работы.
Создана коллекция штаммов рода Trichoderma, проведен скрининг штаммов, имеющих потенциальную ценность для производства биопрепаратов стимулирования роста и защиты растений: Т. asperellum МГ/6 (ВКПМ F-878 и » Т. harzianum М99/5 (ВКПМ F-888); вермикомпостов: Т. asperellum МГ-97 (ВКПМ F-675); кормовых добавок: Т. asperellum штамм ТН-5 и противоопухолевых соединений: Т. asperellum Т-30 (ВКМ F4340D), Т. harzianum TV4-1 (ВКМ F4341D) и Т. harzianum М99/51 (ВКПМ F- 1027).
Показана возможность использования штаммов Т. asperellum МГ/6 и Т. harzianum М99/5 для переработки отходов предприятий деревообрабатывающей и гидролизной промышленности. Подобран оптимальный растительный субстрат из отходов деревообрабатывающей промышленности для твердофазного культивирования продуцентов. Разработана в лабораторных условиях технология биопрепарата Триходермин-М. Наработана опытная партия биопрепаратов и проведены опытно-производственные испытания биопрепаратов на сеянцах хвойных в лесном питомнике и культурах злаковых растений. Показано положительное влияние биопрепаратов на увеличение урожайности злаков и выход здоровых сеянцев в питомнике.
На основании проведенных исследований даны рекомендации для использования штамма Т. asperellum МГ/6 в технологии вермикомпостирования и штамма Т. asperellum ТН-5 для разработки кормовой добавки для птиц.
Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на 1-м конгрессе микологов России, Москва, 2002; XIV Congress of European Mycologists,
Ялта, 2003; XI съезде Русского ботанического общества «Ботанические исследования в Азиатской России», Новосибирск-Барнаул, 2003; 75-th Anniversary
Meeting Canadian Phytopathology Society, Ottawa, 13-16 June, 2004; 9-th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium, April 6-8, Vienna, Austria, 2006; 2-й Российской конференции «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока», 2006; International Symposium "EU-Russia: Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framework Programme", June 5-9, 2006, St.-Petersburg; IX Всероссийском популяционном семинаре «Особь и популяция - Стратегия жизни», 2-7 октября, 2006, Уфа; Международной школы-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна 28 ноября - 1 декабря, Пущино, 2006; 4 Съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова 5-7 декабря, Пущино, 2006; International symposium "Best practice in disease, pest and weed management", 10-12 May, Berlin, 2007; Международной научной конференции «Современные средства, методы и технологии защиты растений» - Новосибирск, 2008; 5 Съезде Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, 2008; VII Международной конференции «Проблемы лесной фитопатологии и микологии», Пермь, 7-13 сентября 2009; Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов», проходившей в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 15-17 марта, Москва, 2010; Всероссийская конференция «Биологически активные вещества», посвященная 90-летию М.С. Егорова, 29-30 ноября, Москва, 2011.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ-офи - №06-04-08040-офи «Создание высокопродуктивных, устойчивых к патогенам форм хвойных растений в культуре in vitro, на основе современных достижений в области половой репродукции голосеменных»; РНП.2.2.3.1.2466 Министерства образования и науки РФ «Развитие гербарной коллекции и музея культур грибов Средней Сибири как базы для научно-образовательного процесса»; РФФИ "Енисей" - №090498008 «Биологический контроль биотехнологии сокульти-вирования хвойных в культуре in vitro с биопрепаратами рода Trichoderma и Streptomyces»; Ведущие научные школы НШ-5189.2008.4 "Биоразнообразие грибов - научная основа поиска новых генотипов для биотехнологии и других хозяйственно важных направлений".
1 ОБЗОР ИССЛЕДОВАНИЙ ГРИБОВ РОДА ТШСНООЕША: СИСТЕМАТИКА, БИОЛОГИЯ ВИДОВ, ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
Заключение Диссертация по теме "Микология", Садыкова, Вера Сергеевна
выводы
1. На основании многолетнего изучения микобиоты установлено, что грибы рода Тпскойегта являются типичными представителями на территории бассейна реки Енисей. С использованием культурально-морфологических и молекулярно-генетических методов идентифицировано 8 видов: Т. аэрегеНит, Т. Шготпс1е, Т. сИгтоутс1е, Т. катаЫт, Т. каЫапит, Т. кот^и, Т. 1оп&ЬгасЫаШт, Т. \iride. В ядро доминантных видов входят: Т. аБрегеНит, Т. кагг1апит, Т. утйе, Т. сНппотпйе. Среди видов, ранее не описанных на исследуемой территории, обнаружены: Т. йМпоуМйе, Т. катаШт и Т. а&оутс1е.
2. Природными резервуарами сохранения численности и видового разнообразия видов рода Тпскос1егта являются целинные лесные почвы, где частота встречаемости составляет более 60 %. Антропогенные ландшафты характеризуются резким снижением пространственной и временной частоты встречаемости (0-7%) и видового разнообразия (менее 4- 5 видов).
3. Природные популяции ТпскоЛегта гетерогенны и характеризуются высокой степенью полиморфизма. Абиотические факторы (температура, аэрация, влажность) и субстратная специфичность определяют доминирование определенных видов и популяций рода Тпскос1егта. Впервые установлена способность к анаэробному росту и брожению у видов Тпскойегта, способствующая отбору определенных клонов в местообитаниях с ограниченной обеспеченностью кислородом.
4. Качественная популяционная структура видов Гг/сЛой/гта представляет собой мозаику клонов с различным типом совместимости, скорости роста, интенсивности спороношения, отношения к субстрату и конкурентоспособности.
5. Популяции грибов рода ТпсИоЛегта являются природным резервуаром для поиска штаммов-продуцентов биологически активных
319 соединений, эффективных для контроля широкой группы организмов: фитопатогенных грибов, условно-патогенных и патогенных бактерий, опухолевых клеток, а также оказывающих влияние на рост высших растений. Стабильность культурально-морфологических признаков является критерием отбора штаммов-продуцентов для получения целевых продуктов в биотехнологии.
6. Исследование активных компонентов культуральной жидкости и экстрактов мицелия выявило наличие веществ непептидной природы, оказывающих цитотоксическое действие на опухолевые клетки (вызывающих индукцию позднего апоптоза и влияющих на клеточный цикл) и ингибирующих рост патогенных грамположительных бактерий. По результатам проведенных исследований отобраны штаммы: Т. азрегеНит Т-30 (ВКМ Р4340Б) и ТМаЫапит ТУ4-1 (ВКМ Р434Ю) как продуценты противоопухолевых соединений и штамм Т. Натапит М99/51 - продуцент противоопухолевых и антимикробных веществ (ВКПМ Р- 1027).
7. Преобладающим типом взаимоотношения местных изолятов Тпскойегта является положительное воздействие на растения, связанное с активацией иммунного ответа растения-хозяина в ответ на воздействие фитопатогенных грибов при интродукции микромицетов-антагонистов и прямого ростстимулирующего действия за счет синтеза специфических соединений.
8. Показаны механизмы ростстимулирующего действия антибиотически активных штаммов на различные виды растений и культуры тканей. Впервые установлено, что виды Т. аБрегеИит и Т. котщи способны синтезировать вещества ауксиновой природы, стимулирующие рост растений. Отобраны перспективные штаммы Т. кот^и ТСЛ-06 и
Т. Ьагг1апит М99/5, синтезирующие индолилуксусную кислоту в количестве 0,249 и 0, 051 мг/л.
9. Составлены экологические обоснования скрининга и интродукции
320 грибов-антагонистов в агроэкосистемы, способствующие повышению уровня экологической безопасности. Предложены штаммы-продуценты биопрепаратов - Т. аярегеПит штамм МГ/6 и Т. кагггапит М-99/5.
10. Изучение закономерностей роста, ферментативной активности, спорообразования на различных лигноцеллюлозных субстратах в условиях твердофазного культивирования позволило определить основные показатели продуктивности и разработать технологический регламент на получение биопрепарата Триходермин-М.
11. Испытание опытных партий биопрепарата показали его эффективность в защите от фитопатогенов злаков и хвойных, повышении продуктивности ячменя и пшеницы, снижения инфекции урожая новой репродукции, а также увеличение выхода здоровых сеянцев сосны сибирской. Основными критериями экологической эффективности следует считать снижение численности фитопатогенных микромицетов при сохранении ядра доминирующих сапротрофных видов и положительную направленность почвообразовательного процесса.
12. С целью регуляции жизнедеятельности популяций калифорнийских червей и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов разработана ускоренная технология вермикомпостирования с использованием штаммов Т. аБрегеНит МГ/6 и Т. каЫапит М99/5, обладающих ростстимулирующими и антибиотическими свойствами.
13. На основе изучения биохимического состава мицелия показана возможность использования штаммов грибов рода Тпскос1егта в качестве продуцентов кормового препарата и отобраны культуры, перспективные для получения кормовой добавки для птиц. Качественный состав аминокислот белка мицелия штаммов характеризуется наличием незаменимых аминокислот: лизина, триптофана, аргинина и лейцина, лимитированного в растительных кормах, использующихся для птиц. Общее содержание липидов в биомассе микромицетов рода Тпскойегта составляет от 4.21 до
321
13.57 %. В составе липидов биомассы и культуральной жидкости микромицетов рода ТпсНос1егта преобладают гликолипиды.
14. Исследовано влияние селена на рост и продуктивность штаммов грибов рода Тпскойегта, определены условия культивирования штаммов и оптимальная доза селена в питательной среде. На основании сравнительной оценки влияния селена на продуктивность биомассы грибов отобран штамм ТН-5 Т. азрегеНит, биомасса которого не является токсичной и может быть использована в качестве кормовой селенсодержащей добавки, при выращивании на жидкой среде с содержанием селена 20 мкг/л. Получена селенсодержащая кормовая добавка с содержанием белка не менее 22 %, селена 937,5 мкг/г и определена ее перевариваемость, обеспечивающая активность пепсина 0.213 ТЕ. Разработан рецепт рациона цыплят-бройлеров с использованием кормовой добавки в виде мицелия двух продуцентов Ь. ви1ркигеж штамм М£-22 (ВКМ Р-4276Б) и Т. аБрегеПит штамм ТН-5.
15. Показана возможность использования мицелия штаммов грибов рода Тпскос1егта для адсорбции тяжелых металлов из растворов. Мицелий штамма ТСЛ-06, рекомендован в качестве адсорбента для сточных вод, загрязненных тяжелыми металлами свинец, кадмий, никель или для комплексной очистки загрязненных почв совместно с фиторемедиантами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На современном этапе развития микологии род Trichoderma является одним из наиболее изучаемых. Причиной такого повышенного интереса является большая практическая и экологическая значимость рода. Виды рода Trichoderma являются продуцентами ферментов (целлюлаз, хитиназ, пектиназ, ксиланаз, серинзависимых протеиназ и др.), используемых в целлюлозно-бумажной и пищевой промышленности, в производстве моющих средств, в получении спирта, преобразовании отходов, содержащих целлюлозу, для биологической очистки почвы и для компостирования отходов (Franco et al., 2004; Harman et al., 2004; Kubicek et al., 1998;), получении кормовых препаратов. На основе антибиотиков, токсинов, ферментов грибов этого рода получают препараты для биологического контроля болезней и стимуляции роста растений, получения трансгенных растений (Алимова и др., 1990а, б; Гринько, 2004; Громовых, 2002; Сидорова, 1980; Alimova et al., 2002; Harman et al., 2004).
Следует также отметить, что в виду большой теоретической и практической значимости Trichoderma - это единственный род, для которого каждый вид представлен в Генетическом Банке, по крайней мере, одним геном, а многие виды Trichoderma представлены последовательностью двух или более генов (Алимова, 2005; Дружинина и др., 2005). Как показали многочисленные исследования генетики и таксономии этого рода, он является многокомпонентным и сложным, что затрудняет понимание биологии видов и указывает на необходимость более тщательного изучения распространения видов рода в уникальных по эколого-геграфическим и климатическим признакам регионах.
Наши многолетние исследования посвящены характеристике микромицетов рода Trichoderma, особенностей внутрипопуляционной гетерогенности видов, распространенных на уникальной территории бассейна реки Енисей, площадь которой составляет более 1 млн. км. Важной частью многолетних исследований был сбор коллекции культур, выделенных из почвы и других объектов с целью оценки морфологического и генетического разнообразия видов рода ТпсЬойегта, а также рассмотрению возможности использования представителей рода в различных сферах биотехнологии и экологии.
Оценка биоразнообразия рода ТпсИоЛегта, проведенная в восьми лесорастительных зонах (арктическая пустыня, тундра, лесотундра, северная тайга, средняя тайга, южная тайга, травяные леса с островами лесостепи, островные степи и лесостепи), показала, что среди представителей микромицетов виды рода Тпскойегта встречаются в почвах всех исследуемых климатических зон, включая самые северные широты (80 0 с.ш).
С использованием культурально-морфологических и молекулярно-генетических методов идентифицировано 5 видов: Т. аБрегеПит, Т. Натопит, Т. \iride, Т. 1ощ1ЬгасЫаШт, Т. котщп, которые были отмечены в ранних исследованиях, и три, ранее не описанных на исследуемой территории: Т. скгтоуг^е, Т. НатаШт и Т. ШгоугпЛе. Наиболее распространенным и часто встречающимся является вид Т. айрегеИит, на втором месте по численности и распространенности - вид Т. Натапит. Вид Т. уг^е по распространенности находится на третьем месте. Далее следуют виды: Т. сНгтоутйе, Т. longibrachiatum и Т. коп^и. Виды Т. Мгохг^е и Т. катаШт являются самыми малочисленными и редко встречающимися.
Лесные подстилки, верхние горизонты почв и корневые системы древесных растений - ведущие факторы в формировании видового состава и численного пула грибов Тпскойегта, так как здесь находится основная масса органического вещества, и происходят основные процессы минерализации лигно-целлюлозного комплекса растительных остатков, в котором грибы
312 рода Тпс}гос1егта принимают активное участие. В свою очередь, продуктами своего метаболизма виды Тпскойегта оказывает непосредственное влияние на рост растений и селективное влияние на формирование микробиоты почв.
Сравнение количественных показателей и процентного содержания видов Тпскос1егта в разных климатических и лесорастительных зонах позволило установить общую тенденцию развития популяций этого рода в составе микробиоты. Максимальное видовое разнообразие характерно для умеренного климатического пояса в зонах средней и южной тайги и зоне травяных лесов с островами лесостепи. Типичными видами верхних горизонтов почв и подстилки лесных биогеоценозов являются виды: Т. аэрегеНит, ТМатапит, Т. \iride, Т. копт&1, Т. сИппоуЫйе. Виды Т. 1о^1ЬгасЫаШт и Т. кот^и встречаются на коре и разлагающейся древесине хвойных и лиственных растений, а также часто являются микопаразитами плодовых тел макромицетов. Среди видов Т. Иагггапит, Т. 1ощ1ЬгасЫаШт и Т. сИттотпйе встречаются эндофиты, обитающие на хвое и листьях живых деревьев. Антропогенные ландшафты агроценозов злаков характеризовались снижением видового разнообразия Trichoderma. Среди типичных видов агроценозов нами обнаружено только пять: Г. аярегеНит, Т. каЫапит, Т. катаШт, Т. коп^и и Т. \iride. В почвах агроценозов и лесных питомников не были найдены виды Т. сйгот^е, Т. [ощгЬгасЫаЫт. и Т. ЫМпогг^е.
Неодинаковый видовой состав и численность грибов этого рода в почвах разных климатических зон свидетельствует об определенном влиянии комплекса эколого-трофических факторов на формирование сообщества микромицетов, что, несомненно, отражается на процессах почвообразования и питания растений. Абиотические факторы (температура, аэрация, влажность) и субстратная специфичность определяют доминирование определенных видов и популяций рода Trichoderma.
Анализируя полученные данные по численности и видовому составу, можно проследить некоторые закономерности по распределению обитающих на данной территории видов в разных климатических зонах. Так, вид Т. айрегеЦит имеет широкий диапазон распространения и присутствует как в почвах северных, так и южных областей, однако редко выделяется в южных районах, в лесных биоценозах Тывы и Хакасии практически не встречается в лесной подстилке хвойных пород деревьев, а также лиственных деревьях, пораженных макромицетами.
Вид Т. а&оутс1е встречается в основном в холодных климатических условиях Эвенкии, а в более южных областях встречаемость этого вида снижается. Виды Т. катаШт, Т. сиНпоутйе, Т. катапит имеют широкий диапазон распространения, однако их находки немногочисленны в северных почвах, а со снижением широты их численность увеличивается.
Температурный диапазон, при котором виды способны расти и осуществлять спороношение, находится в пределах от 10 до 35 °С. Большинство штаммов являются типичными мезофиллами, оптимум их роста от 20 до 25 °С. Для некоторых штаммов вида Т. катаШт отмечен лучший рост при температуре 10 °С. При повышении температуры свыше 25 °С ингибируется рост представителей вида Т. котп&ц а рост штаммов вида Т. сИппоуЫйе ингибируют низкие температуры. Психрофильные штаммы, способные расти при температуре 5-10 °С, обнаружены среди представителей видов ТмярегеИит, Т.утс1е и Т. а&оУ1пс1е, в основном это были штаммы, выделенные из почв северных территорий Красноярского края и Эвенкии. Установлено, что виды рода Тпскос1егта, типичные для холодных географических районов, имеют более низкий температурный оптимум роста, чем виды теплых климатических районов. Внутривидовая вариабельность по способности роста наиболее отчетливо проявляется при высоких и низких значениях температуры - 30-35 °С и 10 °С.
Штаммы, способные к росту в анаэробных условиях, выявлены среди представителей всех исследуемых видов. Обнаружена приуроченность места их обитания к способности роста в микроаэрофильных условиях. Так, штаммы, выделенные из плодовых тел макромицетов, пищеварительного тракта дождевого червя, гидроморфных почв и верховых болот, характеризовались активным ростом в анаэробных условиях.
Качественная популяционная структура видов характеризуется значительной физиологической пластичностью и представляет собой мозаику клонов, с различными типами совместимости, скорости роста, спороношения, антибиотической активности и конкурентоспособности. В большинстве случаев виды представлены агрегатами гетерогенных популяций с разным проявлением частот культурально-морфологических типов. Доминирующее положение в популяциях занимают быстрорастущие клоны второго культурально-морфологического типа, с высокой интенсивностью спороношения и антибиотической активностью, характеризующиеся r-стратегией развития. , В ряде случаев удается установить корреляцию групп КМТ с образованием антибиотиков и токсинов.
Сравнение общих частот реакций совместимости и несовместимости (%) для видов Т. asperellum, Т. atroviride, Т. hamatum указывает на наличие тенденции сдвига в сторону реакций смешанного типа и вегетативной совместимости, что отражает однородность их состава. Для видов Т. koningii, T.viride и T.harzianum, наоборот, характерно преобладание реакций несовместимости и дивергенции между популяциями по ряду физиолого-биохимических признаков. При этом вегетативная совместимость разделяет популяцию на отдельные самостоятельно эволюционирующие группы штаммов.
Помимо трофической конкуренции большую роль в природе играют аллелохимические взаимодействия грибов рода Trichoderma и других
315 организмов авто- и гетеротрофного блоков экосистем.
Благодаря способности образовывать широкий спектр биологически активных веществ, популяции грибов рода Тпскойегта являются природным резервуаром для поиска штаммов-продуцентов биологически активных соединений, эффективных для контроля широкой группы организмов: фитопатогенных грибов, условно-патогенных и патогенных бактерий, опухолевых клеток, а также оказывающих влияние на рост высших растений. Резюмируя результаты оценки биологической активности коллекции видов и штаммов рода ТпскснЗегта, можно сделать следующие заключения:
1. В пределах одного вида антагонистическая активность в отношении фитопатогенных грибов сильно варьирует среди моноспоровых изолятов, поэтому принадлежность к виду не может служить определяющим фактором для отбора продуцентов препаратов защиты растений. Скрининг видов и штаммов по микопаразитической активности, антибиотической активности позволил выделить изоляты видов, способные регулировать численность фитопатогенов, эндогенных представителей наземных экосистем бассейна реки Енисей;
2. В составе популяции грибов рода Тпскойегта имеются активные в отношении грамположительных бактерий и опухолевых клеток штаммы, которые могут быть объектом внимания для использования в медицинской биотехнологии. Штаммы вида Т. азрегеНит продуцируют вторичные метаболиты, обладающие антимикробной активностью в отношении грамположительных метициллинрезистентных бактерий.
3. Установлена способность ряда штаммов Т. азрегеНит и Г. катапит синтезировать вещества непептидной природы, обладающие цитотоксической активностью в отношении нескольких линий опухолевых клеток. При этом одним из механизмов действия этих веществ является индукция апоптоза поздней стадии.
4. Преобладающим типом взаимоотношений с растениями является стимулирующее влияние, которое, зависит от вида организма-эдификатора и инфицированности его возбудителями заболеваний. Виды рода ТНскойегта способны синтезировать вещества, стимулирующие рост растений. В серии экспериментов доказана стимуляция роста как нативных растений, так и каллусных культур разных видов злаковых и хвойных растений благодаря синтезу ауксинов (индолилуксусной кислоты).
Изучение закономерностей роста, ферментативной активности, спорообразования на различных лигно-целлюлозных субстратах в условиях твердофазного культивирования позволило определить основные показатели продуктивности и разработать технологический регламент на получение биопрепарата Триходермин-М на основе штаммов Т. азрегеИит МГ/6 и Т. Натапит М99/5. Для разработки препарата необходимо условие соблюдения стабильности культурально-морфологических признаков штаммов Тпскойегта. Методом твердофазного культивирования на коре пихты получен биопрепарат в виде воздушно-сухого порошка коричневого цвета с титром КОЕ 3.5x109 спор/г; препарат хорошо дозируется и длительный период сохраняет свою активность. Использование биологических препаратов в защите хвойных и злаковых растений целесообразно и может быть составной частью интегрированной защиты растений в Средней Сибири. Испытания опытных партий биопрепарата показали его эффективность в защите от фитопатогенов злаков и хвойных, повышении продуктивности ячменя и пшеницы, снижения инфекции урожая новой репродукции, а также увеличение выхода здоровых сеянцев.
Основными критериями экологической эффективности применения биопрепаратов на основе биоконтрольных штаммов Т. аэрегеНит МГ/6 и Т. кагггапит М99/5 следует считать снижение численности фитопатогенных микромицетов при сохранении ядра доминирующих сапротрофных видов и положительную направленность почвообразовательного процесса. Внесение
317 биопрепарата приводит к изменению структуры микобиоты почв, снижению численности фитопатогенов и увеличению доли сапротрофных групп организмов, использующих минеральные формы азота, и обеспечивает интенсивность деструкционных процессов в почве.
Способность видов рода Trichoderma утилизировать широкий набор субстратов, технологичность и низкая токсичность в отношении животных предполагает возможность их использования для разработки кормовых добавок. Известны первые попытки применения этих грибов как кормовых добавок в Республике Татарстан (Алимова, Тазетдинова, 2006), однако авторы рекомендовали их как продуцентов активных ферментных комплексов для обогащения растительной массы. В нашу задачу входило расширение спектра использования рода Trichoderma за счет оценки возможности применения биомассы грибов, обогащенной микроэлементами как добавку в корма для птиц.
Впервые проведена оценка биохимического состава биомассы (общее количество сырого протеина, аминокислотный состав и состав липидных фракций) штаммов разных видов. Отобраны штаммы, содержащие в значительных количествах незаменимые аминокислоты, лимитированные в растительных кормах и зерне. Последующий скрининг штаммов по способности к аккумуляции селена в мицелии позволил рекомендовать штамм T. asperellum ТН-5, обладающий хорошим аминокислотным и липидным составом и способным к накоплению селена в физиологически значимых количествах, для получения кормовых добавок. На установке «искусственный желудок» доказано, что перевариваемость мицелия, сопоставима с эталонным белком. На основании полученных результатов разработана кормовая добавка для кормления цыплят на основе мицелия штаммов Т. asperellum ТН-5, Laetiporus sulphur eus MZ-22 и функционального мясного протеина.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Садыкова, Вера Сергеевна, Москва
1. Абаимов, А.П. Леса Красноярского Заполярья / А.П. Абаимов, А.И. Бондарев, O.A. Зырянова, С.А. Шнтова.- Новосибирск: Наука, Сиб. Предприятие РАН, 1997. 208 с.
2. Александрова, A.B. Исторический обзор и современная система рода Trichoderma I A.B. Александрова, Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Микология и фитопатология. 2004. - Том 38, вып. 1. - С. 3-23.
3. Александрова, A.B. Влияние гриба Trichoderma harzianum на почвенные микромицеты / A.B. Александрова, Л.Л. Великанов // Микология и фитопатология. 2000.- Т.34.- Вып.З. - С. 68-77.
4. Александрова, A.B. Ключ для определения видов рода Trichoderma!
5. A.B. Александрова, Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Микология и фитопатология. 2006. - Т. 40, вып 6. - С. 437-468.
6. Алимова, Ф.К Trichoderma/Hypocrea {Fungi, Ascomycetes, Hypocreales): таксономи я и праспространение // Казань: Казанский гос. универ.- 2005. 264 с.
7. Безбородов, A.M. Биосинтез биологически активных веществ микроорганизмами / A.M. Безбородов. Спб.: Медицина, 1969. - 143 с.
8. Билай, В.И. Биологически активные вещества микроскопических грибов и их применение/ В.И. Билай. Киев: Наукова думка, 1965.- С. 33-69.
9. Билай, В.И. Микроскопические грибы продуценты антибиотиков /
10. B.И. Билай. Киев: Наукова думка, 1961. - 292 с.323
11. Билай, В.И. Микромицеты почв / В.И. Билай, И.А.Эллианская, Т.С. Кириченко. Киев: Наукова Думка.- 1984. - 264 с.
12. Блинохватов, А.Ф. Изучение влияния селенсодержащих препаратов на воспроизводительные функции животных и интенсивность роста молодняка /
13. A.Ф. Блинохватов, Г.В. Денисова, Д.Г. Ильин // Селен в биосфере: Пенза: РИО ПГСХА. 2001.- С. 186 189.
14. Бондарцев, A.C. Шкала цветов. (Пособие для биологов при научных и научно прикладных исследованиях) / A.C. Бондарцев. М.: Издательство АН СССР, 1954. 28с.
15. Бузун, Г.А. Определение белка в растениях с помощью амидо-черного / Г.А. Бузун, K.M. Джемухадзе, Л.Ф. Милешко // Физиология растений. 1982. - Вып. 1. - С. 198-204.
16. Буймистру, Л.Д. Использование триходермина в комплексной защите рассады овощных культур от вредителей, болезней и сорняков. В сб.: «Естественные враги насекомых фитофагов» / Л.Д. Буймистру, Н.И. Леонтян, П.И. Леонтян - Киев: Штиинца.- 1986.- С. 48-52.
17. Буряков, Н.П. Особенности кормления высокопродуктивных коров/ Н.П. Буряков, Е.В. Бурякова, Е.В. Караваева // DairyNews. 2010. - Вып. 6. -С.12-14.
18. Буханова, Ю.В. Особенности применения триходермина. / Ю.В. Буханова // Защ. и карантин растений. 2004. - №11- с.23.
19. Васильевская, В.Д. Почвообразование в тундрах Средней Сибири /
20. B.Д. Васильевская. М.: Наука, 1980. 234 с.
21. Васюкова, Н.И. Индуцированная устойчивость растений и салициловая кислота (обзор)/ Н.И. Васюкова, О.Л. Озерецковская // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. - том 43. - № 4. - С. 405-411.
22. Великанов, JI.JI. Роль грибов в формировании мико- и микробиоты почв естественных и нарушенных биоценозов и агроценозов/ Л.Л. Великанов: Дисс.доктора биол. н. М.: 1997. - 547 с.
23. Великанов, Л.Л. Пространственное распространение грибов рода Trichoderma в почвах биологической станции МГУ / Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова//Микология и фитопатология. 1999. - Т.ЗЗ.- Вып.2. - С.101-106.
24. Великанов, Л.Л. Экологические проблемы защиты растений от болезней / Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Итоги науки и техники. Сер. Защита растений.М.: ВИНИТИ. 1988. - Т. 6. - 143 с.
25. Вишнякова 3. В. Микрофлора кедровников Западного Саяна/ З.В. Вишнякова. Новосибирск: Наука. - 1974. - 142 с.
26. Войтка, Д.В.Повышение активности биопрепаратов на основе грибов-антагонистов Trichoderma sp. // Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии. 2008. - 548 с.
27. Ганжара, К.Ф. Легкоразлагаемое органическое вещество и эффективное плодородие/ К.Ф.Ганжара, Б.А. Борисов, М.А. Флоринский // Земледелие. 1995, № 1. - С. 10 - 13.
28. Гарибова, Л.В. Основы микологии: Морфология и систематика грибов и грибоподобных организмов /Л.В. Гарибова, С.Н. Лекомцева. Москва: Товарищество научных изданий КМК. -2005. - 220 с.
29. Гешеле, Э. Э. Болезни зерновых культур в Сибири / Э. Э. Гешеле:
30. М.: Изд-во Сельхозиздат.- 1956. 128 с.325
31. Головлева, Л.А. Разложение лигнина грибными культурами / Л.А. , Х.Г. Ганбаров, Г.К. Скрябин // Микробиология. 1982.- Т.51. - Вып.4. - С.543 -547.
32. Горбачев, В.Н. Почвенный покров южной тайги Средней Сибири /
33. B.Н. Горбачев, Э.П. Попова. Новосибирск: Наука. 1992. - 222 с.
34. Горбушина, A.A. Биологические особенности микромицетов, повреждающих мрамор/ A.A. Горбушина.: Автореф. дисс. к.б.н. СПб. -1997.17 с.
35. Горбушина, A.A. Повреждение скульптур и сооружений из мрамора в Херсонесе/ A.A. Горбушкина // Микол. и фитопатол. 1996. - Т.30. - вып. 4.1. C. 23-27.
36. Горленко, М.В. Все о грибах / М.В. Горленко, Л.В. Гарибова, И.М. Сидорова, Г.Л. Сизова, Г.Д. Успенская М.: Лесная промышленность. - 1985. -280 с.
37. Горленко, М.В. О некоторых направлениях эволюции фитопатогенных грибов /М.В. Горленко // Микол. и фитопатол. -1995. Т. 25 -вып. 1.-С. 87-94.
38. Горленко, М.В.Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ / М.В .Горленко, П. А. Кожевин // М.: Изд-во "МАКС Пресс". 2005. - 88 с.
39. Горьковенко, B.C. Фитопатогенный комплекс возбудителей корневых гнилей ярового ячменя /B.C. Горьковенко // Защита и карантин растений. 2005. - № 8. - С. 32-33.
40. Градова, Н.Б. Рост спирулины на селенсодержащих средах / Н.Б. Градова, Е.А. Сухинина, Е.С. Бабусенко, H.A. Гусарова, И.Ф. Баум // Биотехнология. 2001. - - 5. - С. 40 - 44.
41. Гринько, H.H. Битехнологические аспекты культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai ВКМ Б-2477Д / H.H. Гринько // Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук. 2004. - № 1. - С. 57-61.'
42. Гринько, H.H. Экологические аспекты регулирования популяций фитопатогенных микромицетов овощных культур в закрытом грунте/ H.H. Гринько: Автореф. дис.доктора биол. наук. -М.:МГУ. 2001. - 37 с.
43. Гришкан, И.Б. Почвенные микромицеты ольховников в бассейне верховий Колымы / И. Б. Гришкан // Микол. и фитопатол. 1995. - Т.29 - вып.2. -С. 1-6.
44. Громовых, Т.И. Фитопатогенные микромицеты сеянцев хвойных в Средней Сибири: видовой состав, эклогия, биологический контроль / Т.И. Громовых: Дисс. доктора биол. наук. Москва: МГУ. -2002. - 326 с. .
45. Громовых, Т.И. Биологический контроль болезней сеянцев хвойных в лесных питомниках Средней Сибири / Т.И. Громовых, Ю.А.Литовка, О.Н.Андреева: Монография. Красноярск: СибГТУ.- 2005. - 264 с.
46. Громовых, Т.И.Эффективность действия Trichoderma asperellum G. Samuels штамм МГ-97 на развитие фузариоза на сеянцах Larix sibirica L./Т.И. Громовых, Ю.А.Литовка, B.C. Громовых, Е.Г. Махова // Микол. и фитопатол. 2002. - Т.36. - вып.4. - С. 71-76.
47. Денисова, Г.В. Влияние неорганических соединений селена наразвитие базидиальных макромицетов/ Г.В. Денисова: Дисс.канд.биол. наук.:1. М.- 1999. -130 с.
48. Дондокова, В.Б. Влияние экологических условий на культивирование дождевого червя Eisenia fétida при получении и применении вермикомпоста / В.Б. Дондокова: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -Улан-Уде. -2006.- 23 С.
49. Дьяков, Ю. Т Системы размножения грибов и их эволюция / Ю.Т. Дьяков // Микол. и фитопатол. 1999. - Т. 33. - № 3. - С.137-146.
50. Дьяков, Ю. Т. Критерии биологического вида у грибов (с обзором таксономической структуры ризоктониеподобных грибов) / Ю.Т. Дьяков // Микол. и фитопатол. 1993. - Т. 27. - № 6. - С.68-82.
51. Дьяков, Ю.Т.Вегетативная несовместимость у фитопатогенных грибов / Ю.Т. Дьяков, A.B.Долгова. М.: Изд-во МГУ. - 1995. - 160 с.
52. Дьяков, Ю.Т. Новое в систематике и номенклатуре грибов/ Ю.Т. Дьяков, Ю.В. Сергеев. М.: Изд-во «Национальная академия микологии. Медицина для всех». - 2003. - С. 159 - 153.
53. Дьяков, Ю.Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов / Ю.Т. Дьяков. М.: Муравей. - 1998. -382 с.
54. Дьяков, Ю.Т. Гетерогенность популяций возбудителя ложной мучнистой росы хмеля по признаку вирулентности / Ю.Т. Дьяков, С.В.Ратушина, М.И. Крылова // Микол. и фитопатол. 1985. -Т. 19. - вып. 6. -С. 515-518.
55. Евграфова, С. Ю. Гетеротрофные микроорганизмы в почвах искусственных лесных биогеоценозов южнотаежной подзоны Красноярского края/ С.Ю. Евграфова: Дис. канд. биол. наук. Красноярск. - 2001.-215 с.
56. Егоров, Н. С. Основы учения об антибиотиках / Н. С. Егоров. М.: Изд-во МГУ. - 1994. - 512 с.
57. Егорова, JI.H. Структура сообществ микромицетов в естественных и антропогенных бурых лесных почвах полуострова Муравьева-Амурского (Южное приморье) / JI.H. Егорова, Г.В. Ковалева //Микол. и фитопат. 2011. -Т.45. вып. 2. - С. 125 - 132
58. Ермаков, В.В. Биологическое значение селена/ В.В. Ермаков,
59. B.В. Ковальский. М.: «Наука». - 1974. - 325 с.
60. Ершов, Ю.И. Почвенно-географическое районирование Красноярского края / Ю.И. Ершов // Геогр. и прир. ресурсы. 1998. №2.1. C. 110-118
61. Ершов, Ю.И. Почвы Среднесибирского плоскогорья / Ю.И. Ершов. -Красноярск: Институт леса им. В.Н.Сукачева Со РАН. 2004. - 86 с.
62. Жилин, О.В. Биосорбция и трансформация золота и сопутствующих тяжелых металлов микромицетами / О.В. Жилин: Дис. . канд. биол. наук. -Благовещенск. 2003. - 124 с.
63. Жуков, A.M. Грибные болезни лесов верхнего Приобья. / A.M. Жуков: Новосибирск: Наука.- 1978. 246 с.
64. Жуков, A.M. Патогенные грибы Алтая лесов южного Приобья: Дисс.докт.биол.наук. М. 1982.- 520 с.
65. Заика, Н. А. Эколого-биологическое обоснование скрининга штаммов рода Trichoderma для создания и использования биопестицидов в защите растений / H.A. Заика: Дис. . канд. биол. наук. Красноярск. - 2006159 с.
66. Зарипова, Л.П. Пути увеличения производства кормового белка в Республике Татарстан / Л.П. Зарипова, Ф.С. Гибадуллина // Достижения науки и техники АПК. 2008. - № 11. - С. 36 - 37.
67. Звягинцев, Д. Г. Почва и микроорганизмы / Д.Г. Звягинцев. М.: Высшая школа. - 1987 - С.55-64.
68. Звягинцев, Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии /f
69. Д.Г. Звягинцев. М.: Изд-во МГУ. - 1990.- 303 с.
70. Иванов, В.В. Экологическая геохимия элементов/ В.В. Иванов: В 6 кн./Под ред. Э.К. Буренкова. М.: Экология. 1997.-45 с.
71. Ильин, Д.Ю. Влияние селена на рост и развитие микромицетов -продуцентов биологически активных веществ/ Д.Ю. Ильин: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М.: МГУ, 2001. - 22 с.
72. Ильичев, В.Д. Биоповреждения: учебное пособие для биол. спец. вузов / В.Д. Ильичев, Б.Д.Бочаров, А.А.Анисимов. М.: Высш. Шк. - 1987. -352 с.
73. Илялетдинов, А.Н. Микробиологические превращения металлов / А.Н. Илялетдинов. Алма-Ата: Наука. - 1984.- 268 с.
74. Каравайко, Г.И. Селективное извлечение благородных металлов из растворов микроорганизмами / Г.И. Каравайко, В.И.Захарова, З.А.Авакян, Л.С. Стрижко // Прикл. биохим. и микробиол.- 1996.- Т. 32. -№5.- С. 562-566.
75. Карасевич, Ю.Н. Экспериментальная адаптация микроорганизмов / Ю.Н. Карасевич. М. Наук. 1975. - 179 с.
76. Картавцева, З.М. Микромицеты, поражающие смазочноохлаждающие жидкости, дизельное топливо и моторные обкаточные масла в330условиях Камаза / З.М. Картавцева: Автореф. дис. канд. биол. наук. М.:МГУ. -1992.-29 с.
77. Кейтс, М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов / М. Кейтс. М.: Мир, 1975. - 322 с.
78. Ким, Н.Ю. Безотходная переработка одубины коры хвойных пород / Н.Ю. Ким: Дисс . кандидата технических наук.- Красноярск. 2008.- 135 с.
79. Ким, Н.Ю. Биодеструкция коры хвойных пород/ Н.Ю. Ким, Е.Г.Махова, В.С.Громовых, H.A. Чупрова // Химия и технология растительных веществ: Сборник трудов. Сыктывкар. -2000. - С. 203.
80. Кирцидели, И.Ю. Почвенные микромицеты горных тундр Хибин (Кольский полуостров) / И.Ю. Кирцидели // Микология и фитопатология. -1999. Т. 33. - вып. 6. - с. 368-391.
81. Кирцидели, И.Ю. Сообщества микромицетов из почв подзоны типичных тундр в районе северного побережья Таймырского озера/ И.Ю. Кирцидели, Н.И.Воробьев, О.М. Терешенков // Микология и фитопатология. 1996.- Т. ЗО.-Вып. 2.- С. 9-13.
82. Кобзарь, А. И. Прикладная математическая статистика / А.И. Кобзарь. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2006. - 816 с.
83. Ковалева, Г.К. Биологические особенности и биохимический состав ксилотрофных базидиомицетов Fomitopsis officinalis (Vill.Fr.), Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. и Trameies versicolor (L.Fr.) Pillat: Дисс. канд. биол. наук Красноярск. - 2009. - 171 с.
84. Коваль, Э.З. Микродеструкторы промышленных материалов/ Э.З. Коваль, Л.П. Сидоренко. Киев: Наукова думка.- 1989. - 192 с.
85. Комышко, О.П. Внутривидовая изменчивость Trichoderma lignorum (Tode) Harz. / О.П. Комышко // Бот.ж. -1961. Т.46. -№.5. - С. 44-65.
86. Крапивина, И.Г. О диагностических признаках видов рода Trichoderma Fr./ И.Г. Крапивина, Т.П.Сизова, Л.А. Полякова // Микология и фитопатология. 1973. - Т.7. - №.3. -С.233-234.
87. Красильников, H.A. Микроорганизмы почв и высшие растения / H.A. Красильников М: Изд-во АНССР. 1958. - 463 с.
88. Краснощеков, Ю.Н. Генетические особенности почв северной тайги Приенисейской Сибири / Ю.Н. Краснощеков, Н.Д. Сорокин, И.Н. Безкоровайная, Г.И. Яшихин // Почвоведение. 2001. №1. - С. 18-27.
89. Кураков, A.B. Культурально-морфологические особенности роста мицелиальных микроскопических грибов в анаэробных условиях /A.B. Кураков,
90. Р.Б. Лаврентьев, B.C. Соина // Микология и фитопатология. 2007. - Т. 41.--№ 6. - С. 526-535.
91. Кураков, A.B. Способность к анаэробному росту и активность спиртового брожения у микроскопических грибов / A.B. Кураков, К.С.Хидиров, B.C. Садыкова, Д.Г. Звягинцев // Прикладная биохимия и микробиология. -Т.47.-№2.-2011.- С. 1-7.
92. Курини, С. Грибы рода Trichoderma Pers: Fr., их биотические связи и проблемы интродукции в почвы / С. Курини: Автореф. дисс.к.б.н. М.-1991.-26 с.
93. Курицина, Д.С. Новые виды грибов из рода Sporotrichum Fr. и Trichoderma Fr., изолированные с произведений изобразительного искусства / Д.С. Курицина, Т.П. Сизова//Микол. и фитопат. 1967. - Т.1. -№ 4. С.342-344.
94. Курсанов, Л.Н. Сравнительное изучение микофлоры московских и батумских почв / Л.Н. Курсанов, Т.Н. Шкляр // Бголл. МОИП. отд. биол. новая серия. 1938.- 47. - №.3. С. 44-47.
95. Лихачев, А.Н. Грибы рода Botrytis Micheli (Fungi, Deuteromycota). Биология, экология, микроэволюция / А.Н. Лихачев:Дисс. доктора биол. наук. -М.: МГУ-2000.-322 с.
96. Лунева, Т. А. Трансформация коры древесных пород грибом рода Trichoderma и получение биопрепарата / Т.А. Лунева: Дисс . канд. техн. наук.-Красноярск.- 2008.- 140 с.
97. Мазо, B.K. Перспективы биотехнологического получения новых пищевых источников органических соединений селена / В.К. Мазо, С.Н. Зорин // Успехи современного естествознания. 2008. - №11. - С. 1-2.
98. Марфенина, O.E. Антропогенная экология почвенных грибов / O.E. Марфенина.- М.: Медицина для всех. 2005. - 265 с.
99. Махова, Е.Г. Культивирование грибов рода Trichoderma на лигноуглеводных субстратах и получение биопрепарата / Е.Г. Махова: Автореф. дис. канд. техн. наук. / Е. Г. Махова. Красноярск. 2003. — 21 с.
100. Методические указания по изучению мировой коллекции ячменя и овса / Под.ред. В.Д. Кобылянского, А .Я. Трофимовской. 3-е изд., перераб. -JL: Всесоюзный НИИ растениеводства имени Н.И.Вавилова, 1981. - 32 с.
101. Мирчинк, Т.Г. Методические подходы к изучению грибов-микромицетов в почве / Т.Г. Мирчинк // В кн.: Методы выделения и идентификации почвенных микроорганизмов-биодеструкторов.- Вильнюс. -1982. С.96-98.
102. Мирчинк, Т.Г. Почвенная микология / Т.Г. Мирчинк. М.:Из-во МГУ.- 1976.-206 с.
103. Мирчинк, Т.Г. Характеристика комплексов грибов некоторых почвенных типов Советского Союза / Т.Г. Мирчинк, JI.H. Степанова, O.E. Марфенина, С.М. Озерская// Вест. МГУ. Почвоведение. 1981.- №1. С. 1941.
104. Мишустин, E.H. Эколого-географические закономерности в распространении почвенных микроскопических грибов / E.H. Мишустин, О.Н. Пушкинская // Изв. АНСССР. сер.биол. -1960. №5. - С.87-92.
105. Мишустин, E.H. Ассоциации почвенных микроорганизмов / E.H. Мишустин.-М.: Наука. 1975. - 164 с.
106. Нугаева, Н.Д. Численность и возможные функции деструкторовлигноцеллюлозы видов рода в субстрате и гифосфере шампиньонов334
107. Н.Д. Нугаева, Б.А.Томилин // Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии: Сб. статей. М: МГУ, 1998. - С.255 - 256.
108. Нюкша, Ю.П. Биологическое повреждение бумаги и книг / Ю.П. Нюкша. С.-П.: Изд-во отд. библиотеки РАН. - 1994. - С.25 - 26
109. Оболенская, A.B. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы: учебное пособие для вузов / A.B. Оболенская, З.П. Ельницкая, A.A. Леонович. М.: Экология.- 1991. - 320 с.
110. Омонди, О.С. Корневая гниль ячменя и эффективность ее подавления современными средствами в связи с особенностями сорта / О.С. Омонди: Дисс . канд. биол. наук.-М. 2002. - 128 с.
111. Онхонова, Л.О. Использование отходов животноводческих комплексов в производстве кормовых белков методом микробного синтеза / Л.О. Онхонова, A.B. Онхонова, И.Б. Баторова // В мире научных открытий. -2009.-№1.-с. 27-34.
112. Панников, Н.С. Кинетика роста микроорганизмов: общие закономерности и экологические приложения. М.: Наука.-1991. - 311 с.
113. Пантелеймонова, Т.И. Корреляционный анализ морфологических признаков гриба Botrytis cinerea Pers.ex Fr. / Т.И. Пантелеймонова // Микол. и фитопатол. 1984. - Т. 18. вып. 5 - С. 383 - 385.
114. Пантелеймонова, Т.И. Сравнительное изучение серой гнили земляники Botrytis cinerea pers. в Подмосковье / Т.И. Пантелеймонова, Ю.Т. Дьяков//Бюл. МОИП. Отд. биол. 1985. -Т.90. - вып. 3. - С. 93 - 103.
115. Пантелеймонова, Т.И. Фенетическое изучение внутривидовой дифференциации возбудителей серой гнили Botrytis cinerea Pers.: Fr. / Т.И. Пантелеймонова: Дисс. канд. биол. наук. М.: МГУ - 1986. - 208 с.
116. Патент №2122025 от 31.10.1997 г. / Е.Г.Черемных, Л.С.Покатаев, В.Н. Гридунов Прибор для биологических исследований. Дата опубл. заявки: 27.04.2008, Опубликовано 20.07.2009 г. Бюл. №20.
117. Переведенцева, Л.Г. Биота и экология агарикоидных микромицетов Пермской области // Л.Г. Переведенцева: Автореф. докт. дисс. биол. наук. М.-1999.-48 с.
118. Переведенцева, Л.Г. Грибы России / Л.Г. Переведенцева, В.М. Переведенцев. Пермь: Изд-во Пермского гос. универ. - 1995. - 189 с.
119. Петров, Л.П. Лигнин повышает плодородие солонцовых почв / Л.П. Петров, Е.И. Годунова // Вестник РАСХН. № 2. - 1996. - С. 60 - 61.
120. Пивкин, М. В. Вторичная адаптация грибов в море/ М.В. Пивкин, Ю.В.Бурцева Ю.В.Худякова, Журавлева Н.В. // В кн.: Современная микология в России, Первый съезд микробиологов. Тезисы докладов. М.: Национальная академия микологии. 2002.- С.77.
121. Пивкин, М.В. Вторичные морские грибы Японского и Охотского морей /М.В. Пивкин: Автореф. Дисс.докт. биол. наук,- М.:МГУ.- 2010.-40 с.
122. Пидопличко, Н.М. Грибы паразиты культурных растений / Н.М. Пидопличко // Определитель в 2-х т. - Киев.: Наукова думка. - 1977. - т.1 Грибы несовершенные. - 299 с.
123. Портенко, JI.Г. Методы изучения вегетативной несовместимости у мицелиальных грибов / Л.Г. Портенко // Микол. и фитопатол. 1992. - Т. 26. -вып. 1. - С.60-66.
124. Пронина, H.A. Влияние селенит ионов на рост и накопление селена у Spirulina plantensis /H.A. Пронина, Ю.И. Ковшова, В.В. Попова и др. // Физиология растений. 2002. - Т. 49. - № 2. - С. 264 - 271.
125. Прудникова, C.B. Эколого-биологическая роль грибов рода Trichoderma в различных биоценозах Средней Сибири / C.B. Прудникова: Дисс.канд.биол.наук. Красноярск. 2000.-197 с.
126. Работнов, Т.А. Изучение ценотических популяций растений в целях выяснения «стратегии жизни» видов растений / Т.А. Работнов // Бюл. МОИП. Отд. биол. 1975. - Т. 80. - № 2. - С. 5 - 11.
127. Работнов, Т.А. О состоянии изучения грибов как компонентов биогеоценозов / Т.А. Работнов // Микол. и фитопатол. 1977. - Т. 11.- вып. 6. -С. 521-526.
128. Ребрикова, Т.И. Биология в реставрации/ Т.И. Ребрикова. М.: РИО ГосНИИР. - 1999. - 184 с.
129. Редькина, В.В. Биологическая активность почв антропогенно-измененных ландшафтов / В.В. Редькина: Автореф. дисс. канд. биол. наук.-СПб.-2010.- 18 с.
130. Решетникова, И. А. Деструкция лигнина ксилотрофными макромицетами / И.А. Решетникова. -М.: Мир. 1997.-197.С.
131. Рудаков, И. Л. Проблемы и перспективы использования гиперпаразитов и антагонистов в защите растений от инфекционных заболеваний / Рудаков И.Л. // Микробиологические средства защиты растений. -Кишинев: Штиинца. 1986. - С. 29-33.
132. Рудаков, О. Л. Микофильные грибы, их биология и практическоезначение / Рудаков О. Л. // М.: Наука. 1981. - 158 с.337
133. Русакова, И.В. Агробиологическая оценка вермикомпоста и вермигумата / Русакова И.В., Касатиков В.А., Кравченко М.Е.// Плодородие. -2007. №1. - С.36-37.
134. Рязанова, Т.В. Химия древесины: учебное пособие для студентов / Т.В. Рязанова, Н. А. Чупрова, Е. В. Исаева. Красноярск: КГТА. - 1996. - 358 с.
135. Садыкова, B.C. Внутривидовая изменчивость гриба Trichoderma asperellum G. Samuels / B.C.Садыкова, А.Н.Лихачев, Е.Г. Махова //1 -й конгресс микологов России.- Москва, 2002. С.220.
136. Садыкова, B.C. Изменчивость вида Trichoderma asperellum и отбор штаммов для создания биопрепаратов на гидролизном лигнине/ B.C. Садыкова: Дис. канд. биол. наук. -М. 2003.-198 с.
137. Садыкова, B.C. Внутривидовая изменчивость грибов рода Trichoderma в Средней Сибири/ B.C. Садыкова, П.Н.Бондарь, Т.И. Громовых // Всероссийская конференция «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока».- 2006.-Т.1- С. 190 193.
138. Садыкова, B.C. Установление комплекса признаков-тестов поотбору антагонистов для биоконтроля фитопатогенов (на примере грибов рода
139. Trichoderma) / B.C. Садыкова, А.Н. Лихачев // Сборник научных трудов338
140. Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты». М.: РАЕН. 2007. - Вып.16. -С.33-47.
141. Садыкова, B.C. Ограничение развития комплекса возбудителей корневых гнилей ячменя антагонистами рода Trichoderma/B.C. Садыкова, А.Н. Лихачев, П.Н. Бондарь // Микол. и фитопат. 2010. - Т.44. - Вып.6.- С. 556-562.
142. Садыкова, B.C. Перспективы использования грибов рода Trichoderma в защите злаков от корневых гнилей в Сибири / B.C. Садыкова, Бондарь П.Н. // Вестник КрасГАУ. 2010. - №2 (41). - С. 34-39.
143. Садыкова, B.C. Антимикробная и противоопухолевая активность штаммов рода Trichoderma / Садыкова B.C., Свирщевская Е.В., Громовых Т.И., Зубарева Е.С. // Биологически активные вещества микроорганизмов: Матер. Всероссийского симп.- М.- 2011,- С. 105.
144. Садыкова, B.C. Оценка ростстимулирующей активности штаммов грибов рода Trichoderma на каллусах злаков/ B.C. Садыкова, A.M. Сидаков,
145. Т.И. Громовых, П.Н. Бондарь //Вестник РАСХН. -2012. № 2. - С. 32-37.339
146. Садыкова, B.C. Перспективы получения кормовой добавки на основе селенсодержащего мицелия грибов рода Trichoderma / B.C. Садыкова, Т.Н. Громовых, Д.В. Казеннова, Е.Г. Черемных //Доклады РАСХН. № 3.-2012. - С.44-47.
147. Садыкова, B.C. Устойчивость возбудителей корневых гнилей ячменя к химическим и биологическим фунгицидам / B.C. Садыкова,
148. Т.П. Громовых //Доклады РАСХН. 2011. -№ 2- С.12-18.
149. Салина, O.A. Грибы рода Trichoderma в окультуренных почвах Литовской ССР/ O.A. Салина: Автореф. канд. биол наук. М.:МГУ.- 1988.-17 с.
150. Свешникова, Е.В. Новые бактерии р. Pseudomonas антагонисты фитопатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной практике / Е.В. Свешникова: Дис. . канд. биол. наук. - Уфа.- 2003. - 189 с.
151. Сейкетов, Г.Ш. Грибы рода Trichoderma и их использование в практике/ Г.Ш. Сейкетов. Алма-Ата: Наука.- 1982. - 248 с.
152. Сидорова, И.И. Биологические методы борьбы с фитопатогенными грибами // Итоги науки и техники. Сер.защита раст. М. ВИНИТИ. - 1980. - Т. 2.-С. 116-157.
153. Сидорова, И.И. Микофильные грибы, экология и возможные пути происхождения / И.И. Сидорова: Автореф. дисс. докт. биол. наук. М. - 1987. -44 с.
154. Слинкина, H.H. Грибы аквапочв шельфовой зоны острова Сахалин/
155. H.H. Слинкина: Автореф. канд. биол наук. Владивосток. 2009.- 19 с.340
156. Соколов, М.С. Экологизация защиты растений / М.С. Соколов-Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН.1994.-С.15-19.
157. Соколова, Э. С. Указания по диагностике болезней хвойных пород в лесопитомниках молодняках / Э. С.Соколова, В. М. Ведерников: М.-1988.- 56 с.
158. Сорокин, Н.Д. Микрофлора таёжных почв Средней Сибири / Н.Д.Сорокин: «Наука» СО РАН. 1981.- 144 с.
159. Стаканов, В.Д. Характеристика лесного покрова / В.Д. Стаканов // Лесные экосистемы Енисейского меридиана. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2002. С. 19-24.
160. Сычугова, О.В. Возможности утилизации микромицетами модифицированного полиэтилена/ О.В. Сычугова, А.Н. Лихачев // Современная микология в России: Тез.докл. 1-го Съезда микологов России. М.- 2002. - С. 305.
161. Таланова, В.В Фитогормоны как регуляторы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды/ В.В. Таланова: Дис. . доктора биол. наук. -Петрозаводск.- 2009. -158 с.
162. Телышева, Г.М. Удобрение на основе лигнина / Г.М. Телышева, P.E. Панкова // Рига: Зинатне. 1978. - Вып. 64. - С. 158.
163. Тулемисова, К.А. Антагонизм и гиперпаразитизм Trichoderma lignorum к фитопатогенным грибам / К. А. Тулемисова, А.К. Успанов // Вестник АН Казах. ССР. 1986.- №12.- С 47-51.
164. Тюльпанова, В.А. Биотехнология новых форм грибных фунгицидовдля защиты растений / В.А. Тюльпанова, Т.И. Громовых, А.Л. Малиновский,341
165. T.JI. Козлова, И.А. Арефьева, И.А. Шипилова // Сибирский экологический журнал. 1997. - № 5. - С. 495-500.
166. Умаров, М.М. Микробиологическая трансформация азота в почве / М.М. Умаров, A.B. Кураков, A.JI. Степанов М: ГЕОС.-2007. 138 с.
167. Ушанова, В.М. Основы научных исследований. Часть 2. Контроль качества и экстрагирование растительного сырья / В.М. Ушанова, О.И. Лебедева, А.Н. Девятловская. Красноярск: СибГТУ.- 2004. - 168 с.
168. Феофилова, Е.П. Влияние консерванта сорбиновой кислоты - на состав липидов гриба аскомицетного аффинитета Penicillium roqueforti THOM /Е.П. Феофилова, Я.Э. Сергеева, Л.А. Галанина, Г.А. Кочкина // Микробиология.- 2009. - Т.78.- № 5. - С. 695-701.
169. Феофилова, Е.П. Ликопин грибов: биотехнология получения и перспективы использования в медицине / Е.П. Феофилова, В.М. Терешина, A.C. Меморская и др. // Микробиология.- 2006. Т.75.- № 6. - С. 725-730.
170. Феофилова, Е.П. Липиды мицелиальных грибов как основа для получения биодизельного топлива / Е.П. Феофилова, Я.Э. Сергеева, Л.А. Галанина, Д.А. Андрианова// Прикладная биохимия и микробиология.-2008. Т.44.- № 5. - С. 576-581.
171. Харин, С. А. Трасформация соединений азота и динамика микробной биомассы в свежих копролитах Aporrectodeaca liginosa / С.А. Харин, A.B. Кураков // Почвоведение. 2009. - № 1. - С. 86-92.
172. Хомяков, Н. В. Реакция микроорганизмов на воздействие пищеварительной жидкости дождевых червей / Н.В.Хомяков, С.А.Харин,
173. Т.Ю. Нечитайло, П.Н. Голышин, А.В.Кураков, Б.А. Вызов, Д.Г.Звягинцев // Микробиология. -2007. Т. 76. - № 1. - С. 55-65.
174. Шаховская, А.К. О применении органической формы селена лечении гастроэнтерологических больных / А.К. Шаховская, И.В. Гмошинский, В.В. Васильев // Экология моря: Сб. научных трудов.-2000.-Вып.54. С. 83- 86.
175. Штерншис, М.В. Грибные препараты / М.В. Штерншис, Ф.С. Джалилов, И.В. Андреева, О.Г. Томилова // Биологическая защита растений. М: Колос. - 2004. - С. 195-198.
176. Якименко, Е.Е. Микромицеты почв лесных питомников/ Е.Е. Якименко // Микология и фитопатология. 1992. - Т. 26. - Вып. 6. - С. 480-485.
177. Якушин, С.С. Влияние селенсодержащей добавки к пище на обеспеченность селеном больных ишемической болезнью сердца / С.С. Якушин, В.К. Мазо, Н.С. Сазонова и др. // Вестн. новых мед технологий. 2003. - Т. 10. -№ 3. - С. 84.
178. Abbott, E.V. Taxonomic studies on soil fungi / E.V. Abbott // Iowa St. Coll. J. Sci. 1926. - N.l.- P. 15 - 36.
179. Abdel-Azim, M. Novel sorbicillinoid derivatives from the marine fungus Trichoderma viride associated with the Caribbean sponge Agelas dispar/ M.Abdel-Azim, Bonn Abdel-LateffZ/J. Nat Prod. 2007. -63. -P. 225 - 232.
180. Abdel-Hafez, S. Mycoflora and mycotoxin-producing fungi of air-dust particles from Egypt/ S.Abdel-Hafez, A.Shoreit,I. Abdel-Hafez, O.Ec-Maghraby // Mycopathologia. 1986. - 93. -P. 25 - 32.
181. Abe, N. Bisorbibetanone, a novel oxidized sorbicillin dimer, with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity from a fungus / N. Abe, T. Murata, K. Yamamoto, A. Hirota // Tetrahedron Lett. -1999. -40. P. 5203-5206.
182. Abe, N. Novel DPPH radical scavengers, bisorbicillinol and demethyltrichodimerol, from a fungus / N. Abe, T. Murata, A. Hirota //Biosci Biotechnol Biochem. -1998a. 62. - P. 661-666.
183. Adams, P. Trichoderma harzianum Rifai 1295-22 Mediates Growth Promotion of Crack Willow (Salix fragilis) Saplings in Both Clean and Metal-Contaminated Soil / P.Adams, F. A. A. M.De-Leij, J. M. Lynch // Microby Ecology.-2007.-Vol. 54.-P. 306-313.
184. Akthar, M.N. Mechanism of metal-ion biosorption by fungal biomass/ M.N. Akthar, K.S. Sastry, P.M. Mohan //Biometals.- 1996.- V. 9. № 1. - p. 21-28.
185. Alguacil, F.J. Biotratamiento de contaminantes de origen inorganic/ F.J. Alguacil,Y. Merino // Rev. Metal. Madrid. 1998. - 34.-P. 428-436.
186. Amagata, T. Cytotoxic substances produced by a fungal strain from a sponge: physico-chemical properties and structures / T. Amagata, Y. Usami, K. Minoura, T. Ito, A. Numata // J Antibiot. 1998. - Vol. 51. - P. 33^10.
187. Andrade, R. The metabolites of Trichoderma longibrachiatum. III. Two new tetronic acids: 5-hydroxyvertinolide and bislongiquinolide / R. Andrade, W.A. Ayer, L.S. Trifonov //Aust J Chem. -1997. Vol. 50. - P. 255-257
188. Antal, Z. Colony growth, in vitro antagonism and secretion- of extracellular enzymes in cold-tolerant strains of Trichoderma species / Z. Antal, L. Manczinger, G. Szakas, R.P. Tengerdy, L. Ferencczy // Mycol. Res. 2000. - Vol. 104.-P. 545-549
189. Arnold, A.R. Understanding the diversity of foliar endophytic fungi: progress, challenges, and frontiers / A.R. Arnold // Fungal Biol Rev.-2007.- Vol. 21.-P. 51-66.
190. Atiyeh, R.M. Changes in biochemical properties of cow manure during processing by earthworms (Eisenia Andrei Bouche) and the effects on seedling growth/ R.M. Atiyeh, J. Dominguez, S. Subler, C.A. Edwards // Pedobiologia. -2000. -Vol. 44.-P. 709-724.
191. Aydogdu, H. Airborne fungi in child day care centers in Edirne City, Turkey / H. Aydogdu, A. Asan // Environ Monit Assess. 2008 -. Vol.-147.- P. 423444.
192. Babich, H. Synergism between nickel and copper and their toxicity to microbes: mediation by pH /H. Babich, G. Stotzky // Ecotoxicol. Environ.-1983.-Safety 7.- P. 576-587.
193. Baek, J.M. The role of an extracellular chitinase from Trichoderma virens Gv29-8 in the biocontrol of Rhizoctonia solani / J.M. Baek, C.R. Howell, C.M. Kenerley // Current genetics. 1999. - Vol. 35. - P. 41-50.
194. Baker, R. The controlled experiment in the scientific method with special emphasis on biological control. / R. Baker, Y. Elad, I. Chet // Phytopathology. 1984. -Vol. 74.-P. 1019-1021.
195. Bakker, P.A.H.M. Understanding the involvement of rhizobacteria mediated induction of systemic resistance in biocontrol of plaut diseases /
196. P.A.H.M. Bakker, L.X. Ran, C.M.J. Pieterse, L.C. van Loon // Can. J. Plant Pathol. -2003.-Vol.25.-P. 5-9.
197. Baldrian, P. Effect of cadmium on the ligninolytic activity of Stereum hirsutum and Phanerochaete chrysosporium/ P.Baldrian, J. Gabriel, F. Nerud // Folia Microbiol. 1996.-Vol.41. P. 363-367.
198. Balsalobre, L. Estudio de levaduras tolerantes a metals aisladas de lodos/ L. Balsalobre// Minor Thesis.: Universidad Complutense de Madrid. -2000. 125 p.
199. Becwar, M.R. Initiation of embryogenic cultures and somatic embryo development in loblolly pine {Pinus taeda) / M.R.Becwar, R. Nagmani, S. R. Wann // Can. J. For. Res. 1990. - V. 20. - P. 810-817.
200. Ben Omar, N. Comparative metal biosorption study of brewery yeast .and Mixococcus Xanthus biomass / N.Ben Omar, M. Larbi Merroun, J.M. Arias Penalver, M.T. Gonzalez Munoz // Chemosphere.-1997. Vol. 35. -P. 2277-2283.
201. Benhamou, N. Parasitism of sclerotia of Sclerotium rolfsii by Trichoderma harzianum ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction / N. Benhamou, I. Chet. // Phytopathology. 1996. - Vol. 86. - № 4. - P.405-416.
202. Benitez, T. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains / T. Benitez, A.M. Rincom, M.C. Limorn, A.C. Codorn // Int Microbiol. 2004. - V.7. - P. 249260.
203. Benitez, T. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains // T. Benitez,f
204. A.M. Rincon, M.C. Limon, A.C. Codon // International Microbiology. 2004. - Vol. 7.-P. 249-260.
205. Berestetskii, O.A. Phytotoxic properties of fungi of the Trichoderma Pers. / O.A. Berestetskii, V.F. Patyka, S.P. Nadkernichnyi // Genus. Vopr. Ekol. Fiziol. Mikroorg. Ispol'z. Sel'sk. Khoz. 1976. - P. 56-60.
206. Berg, G. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health: perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture/ G. Berg // Appl. Microbiol Biotechnol. 2009. - Vol. 84. - P. 11-18.
207. Bettuchi, L. Microfungi from a tropical rain forest litter and soil a preliminary study/ L.Bettuchi, M.F. Roqueberg // Nowa Hedwigia. - 1995.-Vol.61. -P. 111-118.
208. Bills, G.F. Saprobic soil fungi. In: Mueller GM, Bills GF, Foster MS (eds) Biodiversity of fungi: inventory and monitoring methods / G.F.Bills, M.Christensen, M.J. Powell, G. Thorn // Elsevier Academic Press. San Diego, CA. -2004.- P. 271-302.
209. Bisby, G.R. Trichoderma viride Pers. Ex Fries. And notes on Hypocrea. Transactions of the British Mycological Siciety / G.R. Bisby // 1939. 23. - P. 149-168
210. Bissett, J. A revision of the genus Trichoderma. (I) Sectionr1.ngibrachiatum sect, nov./ J.Bissett // Can. J. Bot. 1984. - Vol. 62. - P.924-931.
211. Bissett, J. A revision of the genus Trichoderma. (II). Infrageneric classification / J.Bissett // Can. J. Bot. 1991a. - Vol. 69. - P. 2357-2372.
212. Bissett, J. A revision of the genus Trichoderma. (Ill) Section Pachybasium / J.Bissett // Can. J. Bot. 1991b. - Vol. 69. - P. 2373-2417.
213. Bjorkman, T. Effect of Trichoderma Colonization on Auxin-Mediated Regulation of Root Elongation / T. Bjorkman // Plant Growth Regulation. 2004. -Vol. 43. -№1.- P. 89-92.
214. Blumenthal, C.Z. Production of toxic metabolites in Aspergillus niger,
215. Aspergillus oryzae, and Trichoderma reesei: justification of mycotoxin testing in foodgrade enzyme preparations derived from the three fungi/ C.Z. Blumenthal // Regul.
216. Toxicol. Pharmacol.-2004. Vol.39. -P. 214-228.347
217. Bostock, R.M. Signal interactions in induced resistance to pathogeus and insect herbivores / R.M. Bostock, R. Karban, J.S. Thaler, P.D. Weyman, D. Gilchrist // Eur. J. Plant Pathol. 2001. - Vol.107. - №1. - P. 103-111.
218. Breeze, E.M. Seasonal analysis of the fungal community on Acer platanoides leaves. / E.M.Breeze, N.J. Dix // Trans Br Mycol Soc. 1981. - Vol.77. -P. 321-328.
219. Brotman, Y. Role of swollenin, an expansin-like protein from Trichoderma fungi / Y. Brotman //Plant Physiol. -2008. Vol.147. - P. 779-789.
220. Calvo, A.M. Relationship between secondary metabolism and fungal development / A.M. Calvo, R.A. Wilson, J.W. Bok, P.N. Keller // Microbiol Mol Biol Rev. 2002. - Vol. 66. - P.447-459.
221. Carsolio, C. Characterization of ech42, a Trichoderma harzianum endochitinase gene expressed during mycoparasitism / C. Carsolio, A. Gutierrez,
222. B. Jimenez, M. van Montagu, A. Herrera- Estrella // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994. Vol. 91. - P. 10903-10907.
223. Carsolio, C. Role of the Trichoderma harzianum endochitinase gene, ech42, in mycoparasitism / C. Carsolio, N. Benhamou, S. Haran, C. Cortes, A. Gutierrez, I. Chet, A. Herrera-Estrella // Applied Environmental Microbiology. -1999. Vol. 65. - P.929-935.
224. Castro, F. Biomasa de Rhizopus oligosporus como adsorbente de iones metálicos / F.Castro, P. Viedma, D. Cotorra // Microbiología 1992. -SEM 8. - P.94-105.
225. Cervantes, C. Copper resistance mechanisms in bacteria and fungi /
226. C.Cervantes, F. Gutierrez-Corona//FEMS Microbiol. 1994. Rev.14. -P.121-138.
227. Chang, J.S. Selective adsorption/recovery of Pb, Cu, and Cd with multiple fixed beds containing immobilized bacterial biomass / J.S. Chang,J.C. Huang //Biotechnol. Prog. 1998. Vol.l4.-P.735-741.
228. Chapela, I. H. Structure and development of fungal communities in beech togs four and a half years after felling /1. H. Chapela, L. Boddy, A. D. Rayner // FEMS Microb. Ecol. 1988. -Vol. 53. P.59-70.
229. Chaverri, P. Trichoderma!Hypocrea species with conidiephore elongations and green conidia / P.Chaverri, B.E. Overton, G. J. Samuels // Mycologia. 2003. - № 95. - P. 1110 - 1140.
230. Chen, C. Role of salicylic acid in systemic resistance induced by Pseudomonas spp against Pyhium aphanidermaium in cucumber roots / C. Chen, R.R. Belanger, N. Benhamou, T.C. Paulitz // Europen J. of Plant Pathology. 1999. -Vol. 105. -P.477-486.
231. Chen, L.L. Characterization and gene cloning of a novel serine proteasewith nematicidal activity from Trichoderma pseudokoningii SMF2/349
232. L.Chen,L,J. Liu,M. Shi,X.Y. Song,C.Y. Zheng,X.L. Chen,Y.Z. Zhang // FEMS Microbiol Lett. -2009. Vol.299. -P.135-142.
233. Chet, I. Fungal antagonists and mycoparasites. The Mycota IV: environmental and microbial relationships / I. Chet, J. Inbar, I. Hadar. // Berlin: Springer-Verlag. 1997. - P.165-184.
234. Chet, I. The role of recognition in the induction of specific chitinases during mycoparasitism by Trichoderma harzianum /1. Chet, J. Inbar // Microbiology-UK. 1995.-Vol. 141.-P. 2823-2829.
235. Chet, I. Trichoderma hamatum: Its hyphal interactions with Rhizoctonia solani and Pythium spp. / I. Chet, G.E. Harman, R. Baker // Microbal Ecology. -1981.-Vol. 7.-P. 29-38.
236. Christensen, M. A view of fungal ecology / M.Christensen // Mycologia. -1989.-Vol. 81.-P. 1-19.
237. Clay don, N. Antifungal alkyl pyrones of Trichoderma harzianum / N. Claydon, M. Allan, J.R. Hanson, A.G. Avent // Transactions of the British Mycological Society. 1987. - Vol. 88. -P.503-513.
238. Coats, J.H. Antibiotic dermadin / J.H. Coats, C.E. Meyer, T.R. Pyke // US Patent 3627882. 14 Dec 1971. -14 p.
239. Collins, R.P. Characterization of the major aroma constituent of the fungus Trichoderma viride / R.P. Collins, A.F.Halim // J Agric Food Chem. 1972. -Vol.20.-P. 437-438.
240. Contreras-Cornejo, H.A. Trichoderma virens, a plant beneficial fungus,enhances biomass production and promotes lateral root growth through an auxindependent mechanism in Arabidopsis / H.A. Contreras-Cornejo,L. Macias-Rodriguez,350
241. C. Cortes-Penagos, J. Lopez-Bucio // Plant Physiol. 2009. - Vol.149. - P. 15791592.
242. Corbell, N. A global regulator of secondary metabolite production in Pseudomonas fluorescens Pf-5 / N. Corbell, J. E. Loper // J. Bacteriol. 1995. -Vol.177.-P. 6230-6236.
243. Daniel, J. Peptaibols of Trichoderma! Daniel J., Filho E. //Nat. Prod. Rep.-2007.-Vol.24.-P. 1128-1141.
244. Danielson, R.M. The abundance of Trichoderma propagules and the distribution of species in forest soils/ R.M.Danielson,C.B. Davey // Soil. Biol, and Biochemistry. 1973. - Vol. 5. - № 5. - P. 485-494.
245. De Meyer, G. Induced systemic resistance in Trichoderma harzianum T39 biocontrol of Botrytis cinerea / G. De Meyer, J. Bigirimana, Y. Elad, M. Hofte, // European Journal of Plant Pathology. 1998. - Vol.104. - P. 279-286.
246. Delgado-Jarana, J. Overproduction of /?-l,6-glucanase in T. harzianum is controlled by extracellular acidic proteases and pH / J. Delgado-Jarana, J.A. Pintor-Toro, T. Benitez // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1481. - P.289-296.
247. Demain, A.L. The natural functions of secondary metabolites / A.L. Demain, A. Fang // Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. -2000.-Vol. 69.-P. 1-39.
248. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma / C. Dennis, J. Webster // Transactions of the British Mycological Society. I. Production of non-volatile antibiotics. 1971a. - Vol. 57. - P.25-39.
249. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma / C. Dennis, J. Webster // Transactions of the British Mycological Society.' II. Production of non-volatile antibiotics. 1971b. - Vol. 57. - P. 41-48
250. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma. III. Hyphal interaction / C. Dennis, J. Webster // Transactions of the British Mycological Society. 1971c. - Vol. 57. - № 3. - P. 363-369.
251. Dickinson, J.M. Structure and biosynthesis of harzianopyridone, an antifungal metabolite of Trichoderma harzianum / J.M. Dickinson, J.R. Hanson, P.B. Hitchcock, N. Claydon // J Chem Soc Perkin Trans. 1989. - Vol. 1(11). - P. 1885-1887.
252. Doi, Y. Trichoderma sect Saturnisporum, sect. nov. and Trichoderma ghanense, sp. nov. / Y. Doi, Y. Abe, J. Sugiyama // Bull. Natl. Sci. Mus. Tokyo, Ser. B (Bot.). 1987. - Vol. 13.-P. 1-9.
253. Domsh, K.H. Compendium of soil fungi / K.H.Domsh,W. Gams // Microb. Ecol. 1980. -Vol. 1. - P. 794 - 809.
254. Donald, J. R Tandem oxime formation—epoxide ring opening sequences for the preparation of oxazines related to the trichodermamide / J. R Donald, M. Edwards, R.Taylor // Tetrahedron Letters . 2007. - Vol. 48. -P. 5201-5204.
255. Draborg, H. Molecular cloning and expression in S. cerevisiae of twoexochitinases from T. harzianum / H. Draborg, S. Kauppinen, H. Dalboge,
256. S. Christgau // Biochem. Molec. Biol. Int. 1995. - Vol.36. - P. 781- 791.352
257. Druzhinina, I.A DNA-barcode for strain identification in Trichoderma / I. Druzhinina, A. Koptchinskij, M. Komon, J. Bissett, C.P. Kubicek //J. Zhejiang Univ SCI.-2006. Vol. 6-P.100-118.
258. Druzhinina, I. Global carbon utilization profiles of wild type, mutant and transformant strains of Hypocrea jecorina / I. Druzhinina, M. Schmoll, B. Seiboth, C. P. Kubicek // Appl Environ Microbiol. -2006. Vol. 72. - P. 2126-2133.
259. Druzhinina, I. Species concepts and biodiversity in Trichoderma and Hypocrea: from aggregate species to species clusters / I. Druzhinina, C.P. Kubicek // J. Zhejiang Univ SCI. 2005. - P.401-407.
260. Du, L. Cytotoxic sorbicillinoids and bisorbicillinoids from a marine-derived fungus Trichoderma sp. /L. Du,T. Zhu, L. Li, S.Cai, B. Zhao, Q. Gu // Chem. Pharm. Bull. 2009. -Vol. 57(2). -P. 220—223.
261. Dunlop, R.W. An antibiotic from Trichoderma koningii active against soilborne plant pathogens / R.W. Dunlop, A. Simon, K.Sivasithamparam // Journal of Natural Product.- 1989.- Vol.52.- № 1.- P. 67-74.
262. Evidente, A. One, a new antifungal 6-substituted 2H-pyran-2-one produced by Trichoderma viride / A. Evidente, A. Cabras, L. Maddau, S. Serra, A. Andolfi, A. Motta // J Agrie Food Chem. 2003. - Vol. 51. - P. 6957-6960.
263. Evidente, A. Investigations of Fungal Secondary Metabolites with Potential Anticancer Activity / A.Evidente,S.Balde,A.Andolfi,A. Cimmino, S.Ganassi // J. Nat. Prod. 2010. - Vol. 73.-P.969-971.
264. Eziashi, E.I. Effect of metabolites produced by Trichoderma species against Ceratocystis paradoxa in culture medium / E.I. Eziashi, N.U. Uma, A.A. Adekunle, C.E. Airede //Afr J Biotechnol. -2006. Vol. 5. - P. 703-706.
265. Ezzi, M.I. Cyanide catabolizing enzymes in Trichoderma spp. / M.I. Ezzi, J.M. Lynch // Enzymol Microbial Technol. 2002. - Vol. 31. - P. 10421047.
266. Falcone, G. Reduction of selenite by intact yeast cells and cell-free preparation / G. Falcone, J. Nickerson.- 1963.- Vol. 85. P.754 - 762.
267. Farr, D.F. Fungi on Plant Products in United States / D.F. Farr, G.F. Bills, G.P. Chamuris, A.Y. Rossman // St. Paul. Minnesota: APS Press. 1989. -999 p.
268. Flores, A. Improved biocontrol activity of T. harzianum strains by overexpression of the proteinase encoding gene prbl / A. Flores, I. Chet, A. Herrera-Estrella // Curr. Genet. 1997. - Vol. 31. - P. 30-37.
269. Fourest, E. Heavy metal biosorption by fungal mycelial by products: mechanisms and influence of pH /E.Fourest, J.C. Roux // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. -Vol.37. - P.399-404.
270. Fuglsang, C.C. Antimicrobal enzymes: applications and future potential in the food industry / C.C. Fuglsang,C. Johansen,S. Christgau, J. Adler-Nissen // Trends Food Sci Technol 1995. - Vol. 6. - P. 390-396.
271. Gadd, G.M. Fungal responses towards heavy metals/ G.M. Gadd In: R.A.Herbert, G.A. Codd(Eds.) Microbes in Extreme Environments.: Academic Press, London.- 1990.-P. 83-110.
272. Gadd, G.M. Interactions of fungi with toxic metals / G.M.Gadd // New Phytol. 1993. - Vol. 124(25). - P. 25 -60.
273. Galante, Y.M. Application of Trichoderma enzymes in the textile industry. In: Harman G.E., Kubicek C.P. (eds) Trichoderma and Gliocladium / Y.M. Galante, A. De Conti, R. Monteverdi.:Taylor and Francis. London. -1998(a)-P. 311-326.
274. Galante, Y.M. Application of Trichoderma enzymes in the food and feed industries. In:Harman G.E., Kubicek C.P. (eds) Trichoderma and Gliocladiuml Y.M. Galante,A. De Conti, R.Monteverdi.: Taylor and Francis. London. - 1998(a)-P. 327-342.
275. Galstoff, P.S. Wasting disease causing mortality of sponges in the West Indies and Gulf of Mexico / P.S.Galstoff// Proc. 8th Am. Sci. Congr. 3. -1942. P. 411-421.
276. Galun, M. Removal of uranium (IV) from solution by fungal biomass and fungal wall-related biopolymers / M.Galun,P. Keller,D. Malki,H. Feldstein, E.Galun,S.M. Siegel, B.Z. Siegel // Science 219. 1983.-P. 285-286.
277. Gams, W. Biordiversity of soil- inhabitant fungi / W. Gams //Biodivers. Conserv. -2007. Vol. -P. 1669-1672.
278. Gams, W. What exactly is Trichoderma harzianum / W. Gams, W. Meyer // Mycologia. 1998. - Vol. 90. - № 5. - P. 904-915.
279. Garcia, I. Cloning and characterization of a chitinase (CHIT42) cDNA from the mycoparastic fungus T. harzianum / I. Garcia, J.M. Lora, J. De la Cruz, T. Benitez, A. Llobell, J.A. Pintor-Toro // Curr. Genet. 1994. - Vol. 27. - P. 83-89.
280. Garcia-Toledo, A. Training of Rhizopus stolonifer and Cunninghamella blakesleeana to copper: cotolerance to cadmium, cobalt, nickel and lead /A.Garcia-Toledo,H. Babich,G. Stotzky// Can. J. Microbiol.-1985. -Vol. 31. -P. 485^192.
281. Garo, E. Trichodermamides A and B, cytotoxic modified dipeptides from the marine-derived fungus Trichoderma virens / E. Garo, C.M. Starks, P.R. Jensen, W. Fenical, E. Lobkovsky, J. Clardy // J Nat Prod. 2003. - Vol. 66. - P. 423-426.
282. Gavrilesea, M. Removal of heavy metal from the environment by biosorption / M.Gavrilesea // Life Sci. 2004. Vol. 4. - P. 219-232.
283. Gelincik, A. A. The effect of indoor fungi on the symptoms of patients with allergic rhinitis in Istanbul / A. A.Gelincik,S. Buyukozturk,H. Gul,G. Gungor, H. Issever,A. Cagatay // Indoor Built Environment. 2005. - Vol.14. - P.427-432.
284. Ghisalberti, E.L. Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp. / E.L. Ghisalberti, K. Sivasithamparam // Soil Biology & Biochemistry. 1991. -Vol.23.-P. 1011-1020.
285. Golder, W.S. Lanosterol derivatives as precursors in the biosynthesis of viridian / W.S. Golder, T.R. Watson // Part 1. J Chem Soc Perkin Trans. 1980. -Vol. 1(2). - P. 422-425.
286. Gomes, N.C. Metal bioremediation by microorganisms / N.C. Gomes,
287. Mendonca-Hagler, I. Savvaidis //Rev. Microbiol. 1998. - Vol.29 -P.85-92.
288. Gomezalarcon, G. Microbial communites and alteration processes in monuments at Alcala de -Henares, Spain / G.Gomezalarcon, B. Cilleros, M. Flores, J.Lorenzo // Sci. of the Total Environment. - 1995. - Vol.167. - P. 231 - 239.
289. Grinyer, J. Proteomic response of the biological control fungus Trichoderma atroviride to growth on the cell walls of Rhizoctonia solani / J.Grinyer, S.Hunt, M. McKay, B.R. Herbert, H.Nevalainen // Curr Genet. 2005. - Vol. 47. - P. 381-388.
290. Gupta, R. Microbial biosorbents: meeting challenges of heavy metal pollution in aqueous solutions / R. Gupta,P. Ahuja, S. Khan, R.K. Saxena, H. Mohapatra // Curr. Sci. 2000. Vol.78. -P. 976-983.
291. Gutnick, D.L. Engineering bacterial biopolymeres for the biosorption of heavy metals; new products and novel formulations / D.L. Gutnick., H.Bach // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. Vol.54. - № 4. - P. 451-460.
292. Haggag, W.M. Characteristics of three Trichoderma species in peanut haulms compost involved in biocontrol of cumin wilt disease / W.M. Haggag, S.A. Abo-Sedera // Int J Agric Biol. -2005. Vol. 7. - P. 222-229.
293. Haleem Khan, A. Isolation, identification and testing for allergenicity of fungi from air-conditioned indoor environments/ A. Haleem Khan, S. Karuppayil, C. Manoharachary, K. Kunwar, S.Waghray //Aerobiologia.- 2009. -Vol.25. P. 119123.
294. Hameed, A. Prevalence and distribution of airborne and waterborne fungi and actinomycetes in the Nile river / A. Hameed, S. Hawarry, M. Kamel//
295. Aerobiologia. -2008. Vol. 24. - P. 231-240.357
296. Hammill, T.M. Paecilomyces clavisporis sp. nov., Trichoderma saturnisporum sp. nov., and other noteworthy soil fungi from Georgia // Micologia. -1970. Vol.62. - № l. - P. 107-123.
297. Hanada, R.E. Biocontrol potential of Trichoderma martiale against the black-pod disease (Phytophthora palmivora) of cacao / R.E. Hanada, W.V. Pomella, W. Soberanis, L. L. Loguercio, J. O. Pereira // Biological Control. 2009. - Vol. 50-P. 143-149.
298. Hanson, J. R. The viridin family of steroidal antibiotics / J. R. Hanson // Nat Prod Rep. 1995. - Vol.12. - P. 381-384.
299. Hanson, L.E.Elicitors of plant defense responses from biocontrol strains of Trichoderma virens / L.E. Hanson, C.R. Howell // Phytopathology. 2004. -Vol.94.-P. 171-176.
300. Haran, S. Differential expression of T. harzianum chitinases during mycoparasitism / S. Haran, H. Schickler, A.B. Oppenheim, I. Chet // Phytopathology. 1996. - Vol.86. - P. 980-985.
301. Haran, S. New components of the chitinolytic system of Trichoderma harzianum / S. Haran, H. Schickler, A.B. Oppenheim, I. Chet //Mycol. Res. 1995. -Vol. 99. -P. 441-446.
302. Harman, G.E. Chitinolytic enzymes of Trichoderma harzianum: purification of chitobiosidase and endochitinase / G.E. Harman, C.K. Hayes, M. Lorito, R.M. Broadway, A. Di Pietro, C. Peterbauer, A. Tronsmo // Phytopathology. -1993.-Vol. 83.-P. 313-318.
303. Harman, G.E. Trichoderma and Gliocladium / Harman G.E., Kubicek
304. C.P.: Taylor& Francis. London. - 1998. - 278 p.358
305. Harman, G.E. Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts / G.E. Harman, C.R. Howell, A. Viterbo, I. Chet, M. Lorito // Nature Review Microbiology. 2004. - Vol.2.-P. 43-56.
306. Hoitink, H.A.J. Biocontrol within the context of soil microbial communities: a substrate-dependent phenomenon / H.A.J. Hoitink, M.J. Boehm // Annual Review of Phytopathology. 1999. - Vol.37. - P. 427-446.
307. Howell, C.R. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts // C.R. Howell / Plant Disease. 2003. - Vol.87. - P. 4-10.
308. Howell, C.R. The role of antibiosis in biocontrol / C.R. Howell // Trichoderma and Gliocladium. Enzymes, Biological Control and Commercial Application. Vol. 2. Taylor and Francis Ltd., London. - 1998. -P. 173-183.
309. Howell, C.R. Understanding the mechanisms employed by Trichoderma virens to effect biological control of cotton diseases / C.R. Howell // Phytopathology. 2006. - Vol.96. - P. 178-180.
310. Hoyos-Carvajal, L. Genetic and metabolic biodiversity of Trichoderma from Colombia and adjacent neotropic regions / L. Hoyos-Carvajal, S. Orduz, J. Bissett Fungal Genet Biol.-2009. -Vol.46. P. 615-631.
311. Huang, Z. Metabolic biodiversity of Trichoderma / Z. Huang, W.J. Zheng, B.J. Guo // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2002. -Vol.18. - N 3.-P. 373-376.
312. Hyde, K.D. Marine mycology: a practical approach / K.D.Hyde, S. B. Pointing: Fungal Diversity Press. -2000. -Hong Kong. 185 p.
313. Holler, U. Fungi from marine sponges: diversity, biological activity and secondary metabolites / U. Holler, A.D. Wright, G.F. Matthee, G.M. Konig, S. Draeger, H.J. Aust, B. Schulz // Mycol Res. -2000. Vol.104. - P. 1354-1365.
314. Jaklitsch, W.M. European species of Hypocrea. Part I. The green-spored species / W.M. Jaklitsch // Stud Mycol. 2009. - Vol. 63. - P. 1-91.
315. Kaosol, M. Cellulolytic microbial activator influence on decomposition of rubber factory waste composting / M. Kaosol, A. Thaniya, T. Wandee, P. Srinthrar // World Acad. Sci., Eng. Technol. 2009. -Vol.58. P.74-79.
316. Kapoor, A. Removal of heavy metals using Aspergillus niger! A. Kapoor, T. Viraraghavan, D.R. Cullimore // Bioresour. Technol. 1999. -Vol.70. -P. 95-104.
317. Kapri, A. Phosphate solubilization potential and phosphatase activity of rhizospheric Trichoderma spp. / A. Kapri, L. Tewari // Braz. J. Microbiol. 2010. -Vol.23.-P. 1517-8382.
318. Kasai, K. Fungal succession in the early decomposition process of pine cones on the floor of Pinus densiflora forests /K. Kasai, T. Morinaga, T. Horlkoshl// Mycoscience 1995. T. 36. -P. 325-334.
319. Kenerley, C.M. Pathogen interactions with microbes on the phylloplane / C.M. Kenerley, J.H. Andrews // 197th ACS National Meeting, Dallas, Texas. 1989. -9-14 Apr.
320. Koga, K. Purification and characterization of beta-7V-acetylhexosaminidase from Trichoderma harzianum / K. Koga, Y. Iwamoto, H. Sakamoto, K. Hatano, M. Sano, I. Kato // Agric. Biol. Chem. -1991. Vol. 55. -P.2817-2824.
321. Korolev, N. The role of phytohormones in basal resistance and Trichoderma-induced systemic resistance to Botrytis cinerea in Arabidopsis thaliana / N. Korolev, D. Rav David, Y. Elad // BioControl. 2008. - Vol. - 53. P. - 667-683.
322. Kredics, L. Extracellular proteases of Trichoderma species. A review. / L. Kredics, Z. Antal, A. Szekeres, L. Hatvani, L. Manczinger, C. Vagvolgyi, E. Nagy // Acta Microbiol Immunol Hung. 2005. - Vol. 52. - P. 169-184.
323. Kredics, L. Trichoderma Strains with Biocontrol Potential / L. Kredics, Z. Anta, L. Manezinger, A. Szekeres, F. Kevei, E. Nagy // Food Technol. Biotechnol. 2003. - № 1. - Vol. 41. - P. 37-42.
324. Kredics, L.Breeding of mycoparasitic Trichoderma strains for heavy metal resistance / L.Kredics,L. Antal,L. Manczinger,E. Nagy// Lett. Appl. Microbiol. 2001a.-Vol. 33.-P. 112-116.
325. Kubicek, C.P. Facts and challenges in the understanding of the biosynthesis of peptaibols by Trichoderma / C.P.Kubicek, M. Komon-Zelazowska, E. Sa'ndor, I. Druzhinina // IS. Chem. Biodivers. 2007. - Vol.4. - P. 1068 - 1070.
326. Kubicek, C.P. Metabolic engineering strategies for the improvement of cellulose production by Hypocrea jecorina /C.P.Kubicek,M. Mikus,A. Schuster, M.Schmoll,B. Seiboth // Biotechnol. Biofuels 2009.-P. 2-19.
327. Kubicek, C.P. Trichoderma: from genes to biocontrol / C.P. Kubicek, R.L. Mach, C.K. Peterbauer, M. Lorito // Journal of Plant Pathology. 2001. - Vol. 83.-P. 11-23.
328. Kuc, J. Concepts and direction of induced systemic resistance in plants in plants and its application /J. Kuc // Eur. J. Plant Pathol. 2001. - Vol. 107. - P. 7-12.
329. Kuiper, I. Rhizoremediation: a beneficial plant-microbe interaction /1. Kuiper, E.I. Lagendijk, G.V. Bloemberg, B.J.J. Lugtenberg // Mol. Plant Microbe. -2004.-Vol.17.-P.6-15.
330. Kullnig, C.M. Molecular identification of Trichoderma species from Russia, Siberia and the Himalaya /C.M. Kullnig,G. Szakacs,C.P. Kubicek // Mycol Res. 2000. - Vol. 104. - P. 1117-1125.
331. Kullnig-Gradinger, C.M. Phylogeny and evolution of the genus Trichoderma: a multigene approach / C.M. Kullnig-Gradinger, G. Szakacsm,
332. C.P. Kubicek // Mycol Res Vol. -2002. Vol.106. - P. 757-767.
333. Kumar, R. Composting of sugarcane waste by-products through treatment with microorganisms and subsequent vermicomposting / R.Kumar,
334. D. Verma, B.L. Singh, U. Kumar, M. Shweta // Bioresour. Technol. 2010a. -Vol.101 (17).-P. 6707-6711.
335. Kumar, R. Enzyme activities and microflora of earthworm gut and vermireactors as indicators of the stabilization of wastes degradation process / R. Kumar, B.L. Singh, M.Shweta // Bioremed. J. 2010b. - Vol.14 (3). - P. 150-157.
336. Kumeda, Y. Effects of ergokonin A produced by Trichoderma viride on the growth and morphological development of fungi / Y. Kumeda, T. Asao, A. Iida, S. Wada, S. Futami, T. Fujita // Bokin Bobai. 1994. - Vol. 22. - P. 663-670. '
337. Kwasna, H. Determining species diversity of microfungal communities in forest tree roots by pure-culture isolation and DNA sequencing / H. Kwasna, G.L. Bateman, E. Ward // Applied soil ecology. 2008. - Vol.40. -P. 44-56.
338. Le Doan, T. Fluorescein studies on the interaction of trichorzianine A IIIc with model membranes / T. Le Doan, M. El-Hajii, S. Rebuffat, M.R. Rajeswari, B. Bodo // Biochimica et Biophysica Acta.- 1986. Vol.858. - P. 1-5.
339. Leandro, L.F.S. Population dynamics of Trichoderma in fumigated and compost amended soil and on strawberry roots / L.F.S. Leandro, T. Guzman, L.M. Ferguson, G.E. Fernandez, F.J. Louws // Applied Soil Ecology. 2007. -Vol.35. -P. 237-246.
340. Lelu, M.A. Somatic embryogenesis from immature and mature zygotic embryos and from cotyledons and needles of somatic plantlets of Larix. / M.A. Lelu, K. Klimaszewska, P.J. Charest // Can J For. Res. 1994. -Vol.24. P. 100-106.
341. Levine, A. Embryogenesis of somatic plantlets / A. Levine, R. Tenhaken, R. Dixon, C. Lamb // Cell. 1994. - Vol.79. - № 5. - P. 573-593.
342. Li, Z.Y. Perspective of Trichoderma genus / Z.Y. Li, S.Y. Guo, L.Li// Bioresurse. Technol. 2003. -Vol. 89. -N. 2. - P. 171 - 176.
343. Lieckfeldt, E. Endochitinase gene-based phylogenetic analysis of Trichoderma / E. Lieckfeldt, Y. Cavignac, C. Fekete, T. Borner // Microbiol. Res. -2000.--Vol.155.-P. 7-15.
344. Liu, R. Trichodermamide A and aspergillazine A, two cytotoxic modified dipeptides from a marine-derived fungus Spicaria elegans / R. Liu, Q.Q. Gu, W.M. Zhu, C.B. Cui, G.T. Fan // Arch Pharmacol Res. 2005a. - - Vol. 28. - P. 1042-1046.
345. Lopez Errasqu, E. Tolerance and uptake of heavy metals by Trichoderma atroviride isolated from sludge / E.Lopez Errasqu, C. Vazquez //Chemosphere. 2003. - Vol. 50. - P. 137-143.
346. Lorito, M. Cell wall synthesis is a major target of mycoparasiticantagonism by Trichoderma harzianum / M. Lorito, V. Farkas, S. Rebuffat, B. Bodo,
347. C.P. Kubicek // J Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 6382-6385.364
348. Lorito, M. Chitinolytic enzymes and their genes / Lorito, M. G.E. Harman, C.P. Kubicek // Trichoderma and Gliocladium. Taylor and Francis Ltd., London. - 1998. - Vol. 2. - P. 73-99.
349. Lorito, M. Microrganismi antagonist / M. Lorito, S.L. Woo, M. Iaccarino, F. Scala // Microrganismi Benefici per le Piante. Idelson-Gnocchi s.r.l., Napoli, Italia. 2006. - P. 146-175.
350. Lorito, M. Synergistic combination of cell wall-degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibition of spore germination / M. Lorito, C.K. Peterbauer, C.K. Hayes, G.E. Harman // Microbiology. 1994. - Vol. 140. -№3. - P. 623-629.
351. Lotan, T. Xylanase a novel elieitor of pathogenesis related proteins in tobacco, uses a nonethylene pathway for induction / T. Lotan, R. Fluhr // Plant Physiology. 1990. - Vol. 93. - P. 811-817.
352. Lynch, J.M. Bioremediation- prospects for the future application of innovative applied biological research / J.M.Lynch, A.J. Moffat // Ann. Appl. Biol. -2005.-Vol. 146. -P.217-221.
353. Malik, A. Metal bioremediation through growing cells / A. Malik // Environ Int. 2004. - Vol. 30. - P. 261-78.
354. Mapleston, R.A. The evolutionary role of secondary metabolites / R.A. Mapleston, M.J. Stone, D.H. Williams // Gene. 1992. - Vol. 115. - P. 151-157
355. Marra, R. Study of the three-way interaction between Trichoderma atroviride, plant and fungal pathogens by using a proteomic approach / R.Marra, P.Ambrosino, V. Carbone //Curr. Genet. 2006. - Vol.50. - P. 307-321.
356. Martin, P. Site and seasonal influences on the fungal community on leaves and stems of Pinus and Quercus seedlings in forest nurseries / P. Martin, J.A. Pajares, N. Nanos, J.J. Direz // Sydowia. 2004. - 450 p.
357. Biotechnol. -2008. -Vol.26. P. 553-560.366
358. Martnez-Medina, A. The interaction with arbuscular mycorrhizal fungi or Trichoderma harzianum alters the shoot hormonal profile in melon plants / A.Martnez-Medina, A.Roldyn, A.Albacete, J. A. Pascual // Phytochemistry. 2011. -72. -P.223-229.
359. Masciandaro, G. "In situ" vermicomposting of biological sludges and impacts on soil quality/ G.Masciandaro, B. Ceccanti, C. Garcia // Soil Biol Biochem. -2000.-Vol. 32.- P. 1015-1024.
360. Masuma, R. Effect of sea water concentration on hyphal growth and antimicrobial metabolite production in marine fungi / R.Masuma, Y.Yamaquch, M.Noum, S.Omura, M. Namikoshi // Mycoscience. 2001. - Vol. 42. -P. 455459.
361. Matsubara, M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land/M. Matsubara, J.M. Lynch, F. De Leij // Enzyme and Microbial Technology. 2006. - Vol. 39 . -P. 1365-1372.
362. Menzies, J.G. A strain of Trichoderma viride pathogenic to germinating seedlings of cucumber, pepper and tomato // Plant Pathology. 1993. - Vol. 42. - P. 784-791.
363. Metcalf, D.A. The process of antagonism of Sclerotium cepivorum in white rot affected onion roots by T. koningii / D.A. Metcalf, C.R. Wilson // Plant Pathol. 2001. - Vol. 50. - P. 249-257.
364. Mischke, S. Evaluation of chromogenic substrates for measurement of protease production by biocontrol strains of Trichoderma II Microbios. 1996. - Vol. 87.-P. 175-183.
365. Monaco, C. Survival and prolifiration in soil of Trichoderma koningii in algihnate prill / C.Monaco, M.Rollan // World J. Microb. Biotech. 1999.- Vol. 15.-Nol.- P. 123 125.
366. Moses, O.E. Fungi associated with herbal drug plants during storage / O.E. Moses// Mycopathologia. 1996. - Vol. 136. - P. 115-118.
367. Mouchacca, J. Mycobiota of the arid Middle East: check-list of novel fungal taxa introduced from 1940 to 2000 and major recent biodiversity titles / J.Mouchacca // J Arid Environ. 2005. - Vol. 60. - P. 359-387.
368. Mukherjee, P.K. Regulation of morphogenesis and biocontrol properties in Trichoderma virens by a VELVET protein / P.K. Mukherjee, C.M.Kenerley // Appl. Environ Microbiol. 2010. - Vol. 76. - P. 2345-2352.
369. Mukhopadhyay, A. N. Trichoderma harzianum a potential biocontrol agent for tobacco damping-off / A.N.Mukhopadhyay, A. Brahmbahtt, G.J. Patel // Tobacco Research. - 1986.- Vol. 12.-№ 1.- P. 26-35.
370. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. 1962. - Vol.15. -№4.-P. 473-497.
371. Nagai, K. Studies on the distribution of alkalophilic and alikali-tolerant soil fungi / K.Nagai, T.Sakai, R.M. Rantiatmodjo, K.Suzuki, W.Gams, G.Okada // Mycoscience. 1995. - Vol. 36. - P. 247-256.
372. Nakajima, A. Selective accumulation of heavy metals by microorganisms / A. Nakajima., T. Sakaguchi // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986. Vol.24. - P. 5964.
373. Naseem, I. Influence of autoclaved fungal matherials on spearmint (Mentha spicata L,) growth, morphogenesisand secondary methabolism fl. Naseem, I. Khan, T. Brent, M. Berhow, S. Vaughn // Journal Chemical Ecology. -2005. Vol. 31.-No.7.-P. 235-243.
374. Nelson, M.E. Biological control of gray mold of snap beans by Trichoderma hamatum / M.E. Nelson, M.L. Powelson // Plant Diseases. 1988.-Vol.72.- P. 727-729.
375. Nelson, M.E. Effrect of fungal antagonists and compost age on supprestion of Rizoctonia damping-off in container media amended with composted hardwood bark/ M.E. Nelson, H.A. Hoitink // Phytopathology. 1983. - Vol. 73. - P. 1457-1462.
376. Nevalainen, K.M.Heterologous protein expression in filamentous fungi / K.M.Nevalainen, V.S.Te'o, P.L. Bergquist // Trends Biotechnol. -2005. Vol. 23. -P. 468-474.
377. Nickerson, W. Differential reversal of inhibitory effects on folic acid analoges on growth, division and deoxyribonucleic acid synthesis of microorganisms / W. Nickerson, M. Webb // J Bacteriol. 1956. - Vol.71 (2). - P. 140 -148.
378. Nickerson, W. Enzymatic reduction of selenite / W. Nickerson, G. Falcone // J Bacteriol. 1963. - Vol.85 (4). - P. 763 -771.
379. Nielsen, K.F. Trichothecene production by Trichoderma brevicompactumj K.F. Nielsen, T. Grafenhan, D. Zafari, U. Thrane //J Agric Food Chem. 2005. - Vol. 53. - P. 8190-8196.
380. Oda, S. Production of 6-pentyl-alpha.- pyrone with Trichoderma atroviride and its mutant in a novel extractive liquid-surface immobilization (Ext-LSI) system/ S.Oda,K. Isshiki, S.Ohashi // Process Biochem.- 2009.- Vol. 44.- P. 625-630.
381. Ohira, S. Synthesis and structure of diastereomers of pentenocin B produced by Trichoderma hamatum F0-6903/ S. Ohira, H. Fujiwara, K. Maeda, M. Habara, N. Sakaedani, M. Akiyama, A. Kuboki //Tetrahedron Letters.- 2004. -Vol.45.-P. 1639-1641.
382. Olusola, M. Fungi associated with herbal drug plants during storage /M. Olusola // Mycopathologia. -1996.-Vol. 136. -P. 115-118.
383. Oostendort, M. Induce disease resistance in plants by chemical / M. Oostendort, W. Kunz, B. Dietrich, T. Stauo // Eur. J. Plant Pathol. 2001. - Vol. 107. -P. 19-28.
384. Osono, T. Fungal colonization as affected by litter depth and decomposition stage of needle litter/T. Osono, D. Hirose, R. Fujimaki// Soil Biology & Biochemistry. 2006. - Vol.38.-P.-2743-2752.
385. Osono, T. Limit values for decomposition and convergence process of lignocellulose fraction in decomposing leaf litter of 14 tree species in a cool temperate forest / T. Osono, H. Takeda // Ecological Research. 2005. - Vol.20. - P. 51-58 '
386. Park, K.S. Activation of PR1 a promoter by rhizobacteria that induce systemic in tobacco against Pseudomonas syringaepv. tabaci / K.S. Pare, J.W. Klopper // Biol. Control. 2000. - Vol. 18. - P. 2-9.
387. Perrakis, A. Phylogenetic relationships of chitinases / A. Perrakis, K.S. Wilson, I. Chet, A.B. Oppenheim, C.E. Vorgias // Chitin Enzymology, Atec, Italy. -1993.-P. 217-232.
388. Pinto, P. Fungi isolated from diseased nursery seedlings in Spain / P.Pinto, J. Alonso, V. Fernandes, J. Cazero //New Forests. -2006. -Vol. 31. P. 4156.
389. Pollex, A. Total synthesis of (3S,4S,20S)- and (3R,4R,20S)-viridiofungin A trimester/A. Pollex, L. Abraham, J. Muller, M.Hiersemann // Tetrahedron Letters.-2004. -Vol. 45. -P.6915-6918.
390. Pramanik , P. Changes in organic C, N, P and K and enzyme activities in vermicompost of biodegradable organic wastes under liming and microbial inoculants /P. Pramanik, G.K. Ghosh, P. Banik // Bioresource Technology.-2007. -Vol. 98.-P. 2485-2494.
391. Price, M. S. Aspergillus niger absorbs copper and zinc from swine /M. S. Price, J.J. Classen, G.A. Payne // J. Bioresour. Technol. 2001. Vol.77. - P. 41 - 49.
392. Punja, Z.K. Using fungi and yeasts to manage vegetable crop diseases / Z.K. Punja, RS. Utkhede // Trends Biotechnol. 2003. - Vol. 21. - P. 400-407.
393. Pyrri, I. A comparative study on the airborne fungi in Athens, Greece, by viable and non-viable sampling methods /1. Pyrri, E. Kapsanaki-Gotsi// Aerobiologia .-2007.-Vol.23.-P. 3-15.
394. Qaher, A. Fungal contamination of some imported spices /A. Qaher, L. Mandeel // Mycopathologia.- 2005.-Vol. 159. P. 291-298.
395. Rambelli, A.Comparative studies on microfungi in tropical ecosystems in Ivory Coast forest litter: behaviour on idfferent substrata/ A. Rambelli, B. Mulas, M. Pasqualetti //Mycol Res.-2004.-Vol. 108. P. 325-336.
396. Ramot, O. Regulation of /7-1,3- glucanase by carbon starvation in the mycoparasite T. harzianum / O. Ramot, R. Cohen-Kupiec, I. Chet // Mycol. Res. -2000.-V. 104.-P. 415-420.
397. Rebuffat, S. Isolation, sequence and conformation of seven trichorzianines B from Trichoderma harzianum / S. Rebuffat, M. El Hajji, P. Hennig, D. Davoust, B. Bodo // International Journal of Peptide and Protein Research. 1989. -Vol. 34. -P. 200-210.
398. Reino, J.L. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma / J.L. Reino, R.F. Guerriero, R. Herna'ndez-Gala', I.G. Collado // Phytochem Rev. 2008. - Vol. 7. - P. 89-123.
399. Rifai, M.A. A revision of the genus Trichoderma / M.A. Rifai // Mycol. Pap. 1969. - Vol. 116. - P. 1-56.
400. Rocha-Ramirez, V. Trichoderma atroviride G-protein alpha-subunit gene tgal is involved in mycoparasitic coiling and conidiation./ V. Rocha-Ramirez,C. Omero, I. Chet, B.A. Horwitz, A. Herrera-Estrella // Eukaryot Cell.- 2002. -Vol. 1.- P. 594-605.
401. Roiger, DJ. Occurrence of Trichoderma species in apple orchard and woodland soils/ D.J. Roiger, S.N. Jeffers, R.W. Cadwell // Soil Biol. Biochem. -1991.-Vol.23.-N.4. P. 353 - 359.
402. Roos, A. F. Systemic acquired resistance induced by localized virus infections in plants / A. F. Roos // Virology. 1961. - Vol. 14. - №3. - p. 340-358.
403. Ross, I.S. Membrane transport processes and response to exposure to heavy metals. In: Lemke, P.A. (Ed.), Stress Tolerance of Fungi / I.S. Ross// Marcel Dekker, New York. USA. - 1993. - P. 97-125.
404. Saccardo, P.A. Sylloge fungorum omnium hucusgue cogitorum. Patavii. -1885.
405. Saccardo, P.A. Sylloge fungorum omnium hucusgue cogitorum. Patavii. -1901.
406. Sadaba, R.B.Observations on vertical-distribution of fungi associated with standing senescent acanthus-ilicifolius steams at Mai-Po mangrove, Hong-Kong / R.B. Sadaba, E.D. Jones, N.I. Hodgk // Hydrobiologia. 1995. - Vol. 295, N. 3. - P. 119-121.
407. Sadykova, V.S. Biological control of Fusarium spp. in forest nurseries of Central Siberia /V.S. Sadykova, A.N. Likhachev, T.I. Gromovykh // Shaping the
408. Future Abstract 75 th Anniversary Meeting Canadian Phytopathology Society.: Ottawa- 2004.- P. 45.
409. Sahai, A.S. Chitinases of fungi and plants: their involvment in morphogenesis and host-parasite interaction / A.S. Sahai, M.S. Manocha // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - Vol. 11. - P. 317-338.
410. Sakaj, K. Two glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isozymesfrom the koningic acid (heptelidic acid) producer Trichoderma koningii / K. Sakaj, K. Hasumi, A.Endo // Eur. J. Biochem. 1990- Vol.193. - P. 195-202.
411. Samuels G.J. Trichoderma'. systematics, the sexual states, and ecology. Phytopathology. -2006. Vol.96. - P. 195-206.
412. Samuels, G.J. The Hypocrea schweinitzii complex and Trichoderma sect.1.ngibrachiatum. / G. J. Samuels, O. Petrini, K. Kuhls, E. Lieckfeldt, C.P. Kubicek //
413. Studies in Mycology. 1998. - № 41. - P. 1-54.
414. Samuels, GJ. Trichoderma asperellum: a new species with warred conidia, and redescription of T.viride / GJ. Samuels, E. Lieckfeldt, H.I. Nirenberg // Sydowia. -1999. Vol. 51. - № 1. - P. 71-.88.
415. Samuels, G.J. Trichoderma species associated with the green mold epidemic of commercially grown Agaricus bisporus / G.J. Samuels, S.L. Dodd, W. Games, L.A. Castlebury, O. Petrini // Mycologia. 2002. - № 94. p. 146-170.
416. Samuels, G.J. Trichoderma stromaticum sp. nov., a parasite of the cacao witches broom pathogen / G.J Samuels, R. Pardo-Schultheiss, K. P. Hebbar, R. D. Lumsden, C. N. Bastos, J. C. Costa, J. L. Bezerra // Mycol. Res. 2000. - Vol.104. -P.760-764.
417. Santiago, A. Effect of Trichoderma asperellum strain T34 on iron nutrition in white lupin / A. Santiago, J.M. Quintero, M. Aviler, A. Delgado // Soil Biology & Biochemistry. 2009. - Vol.41. - P. 2453-2459.
418. Schmoll, M. The information highways of a biotechnological workhorse—signal transduction in Hypocrea jecorina /M.Schmoll // BMC Genomics.- 2008.-Vol. 9. P. 430.
419. Schuster, A. Biology and biotechnology of Trichoderma /A. Schuster, M. SchmolWAppl Microbiol Biotechnol. 2010. -Vol. 87. - P. 787-799.
420. Seidl, V. A screening system for carbon sources enhancing b-Nfacetylglucosaminidase formation in Hypocrea.atroviridis (Trichoderma atroviridé) / V. Seidl, I. S. Druzhinina, C. P. Kubicek // Microbiology. 2006. - Vol. 152. - P. 2003-2012.
421. Seidl, V. Sexual development in the industrial workhorse Trichoderma reeseil V. Seidl, C. Seibel, C.P. Kubicek, M. Schmoll // Proc Natl Acad Sci U S A. -2009a. Vol.106. - P. 13909-13914.
422. Selvakumar, G. Inhibitory activity of pine needle tannin extracts on some agriculturally resourceful microbes /G. Selvakumar, S. Saha, S. Kundu// Indian J. Microbial.- 2007.- Vol. 47. P. 267-270.
423. Serrano-Carreon, L. Metabolism of linoleic acid and 6-pentyl-a-pyrone biosynthesis by Trichoderma species / L. Serrano-Carreon, Y. Hathout, M. Bensoussan, J.M. Belin // Applied and Environmental Microbiology. 1993. -Vol.59.-P. 2945-2950.
424. Shah, J. Biochemistry and Molecular Biolodgy of Plant Hormone / Eds. K. Libbenga, M. Hall, P. G. J. Hooykaas. London: Elsevier. 1999. - Vol. 33. - P. 513-554.
425. Shakeri, A.V. Molecular mechanisms of biocontrol of Trichoderma spp. / A.V. Shakery, N. Foster//Biocontrol. 2007. -P. 132 - 139.
426. Shirasu K., Nakajima H., V.K. Rajasekher, R.A. Dixon, C. Lamb // Plant Cell. 1997. - Vol. 9. - № 2. -P. 261-270.
427. Shirota, O. Structural elucidation of trichotetronines: polyketidespossessing a bicyclooctane skeleton with a tetronic acid moiety isolated from377
428. Trichoderma sp./O. Shirota, V. Pathak, C. Hossain, S. Sekita, K. Takatori, M. Satake // J Chem Soc Perkin Trans . 1997. - Vol.l(20). - P. 2961-2964.
429. Shoresh, M. Characterization of a mitogen-activated protein kinase gene from cucumber required for Trichoderma-conferred plant resistance / M. Shoresh, A. Gal-On, D. Leibman, I. Chet //Plant Physiol. 2006. - Vol. 142. - P. 1169-1179.
430. Shoresh, M. Induced systemic resistance and plant responses to fungal biocontrol agents. / M. Shoresh, G.E. Harman, F. Mastouri // Annu Rev Phytopathol. 2010. - Vol. 2 (34). - P. 235 - 246.
431. Shweta, L. Organic carbon transformation in different organic wastes by microbial vermicomposting / L. Shweta, D. Sharma, F. Sonal // J. Curr. Sci. 2005. -Vol. 7(1).-P. 157-160.
432. Singh, S. Production and antifungal activity of secondary metabolites of Trichoderma virens / S. Singh, P. Dureja, R.S. Tanwar, A. Singh // Pestic Res J. -2005.-Vol. 17.-P. 26-29.
433. Sivan, A. The possible role of competition between Trichoderma harzianum and Fusarium oxysporum on rhizosphere colonization / A. Sivan, I. Chet // Phytopathology. 1989.- Vol. 79.- № 2.- P. 198-203.
434. Sivapalan, A. Effect of inoculating fungi into compost on growth of tomato and compost microflora /A. Sivapalan, W. Morgan // Franz Pr Aust J Exp Agr . 1994. - Vol.34. - P. 541-548.
435. Sivasithamparam, K. Secondary metabolism in Trichoderma 'and Gliocladium / K. Sivasithamparam, E.L. Ghisalberti // Trichoderma and Gliocladium, London: Taylor and Francis. 1998. - Vol. 1. - P. 139-191.
436. Smith, V. L. Diseases of Pacific coast conifer / V.L. Smith, R.F. Scharpf// USDA Forest Service. 1993. - 133 p.
437. Song, F. Trichodermaketones A-D and 7-O-Methylkoninginin D from the Marine Fungus Trichoderma koningii / F.Song , H. Dai, Y. Tong, B. Ren, C.
438. Chen, N. Sun, X. Liu, J. Bian // J. Nat. Prod. -2010. Vol. 73. - P.806-810.378
439. Speriy, S. Vertinoid polyketides from the saltwater culture of the fungus Trichoderma longibrachiatum separated from a Haliclona marine sponge / S. Sperry, G.J. Samuels, P. Crews // J. Org Chem. 1998. - Vol. 63. - P. 10011-10014.
440. Stitcher, L. / L.Stitcher, B. Mauch-Mani , J. P. Metraux // Annu. Rev. Plant Pathol. 1997. - V. 35. - P.235-270.
441. Sun, Y. / Y.Sun,L. Tian,J. Huang,H. Y. Ma, Z.Zheng,A. L. Lv, K. Yasukawa, Y. H. Pei // Org. Lett. 2008. - Vol.10. - P. 393-396.
442. Swift, M. J. Organization of assambleges of decomposer fungi in space and time // In: Organization and Communities. Past and Present. The 27 th Sypos. Of British. Ecol. Soc. - 1986. - Oxford. - 1987. - P. 229 - 253.
443. Swift, M. J. Species diversity and structure of microbial communites in terrestrial habitants / M. J. Swift // In: The role of terrestrial and aquatic organisms in decomposition processes. (Eds. J. M. Anderson, A. MacFayed). London. 1976;- P. 185-222.
444. Tenkanen, T. M. Tricel 97. / T.M. Tenkanen, M. Siilka-aho // Programm and abstract. Belgium. -1997. P. 19.
445. Tezos, M.A. Batch reactor mass transfer kinetic model for immobilized biomass biosorption /M. Tezos, S.H. Nih, M.H. Baird // Biotechnol. Bioeng. 32, 1988. -P. 545-553.
446. Tokumasu, S. Fungal successions on pine needles fallen at different seasons: the succession of surface colonizers// Mycoscience. —1998. — Vol. 39. — P. 417-423.
447. Townsley, C.C. Biorecoveryof metallic residues from various industrial effluents using filamentous fungi. In: Lawrence, R.W. Branion, R.M.R.Ebner, H.G. (Eds.) Fundamental and Applied Biohydrometallurgy: Elsevier Amsterdam.- 1986.-P. 279-289.
448. Tronsmo, A. Biological and integrated controls of Botrytis cinerea on apple with Trichoderma harzianum / A. Tronsmo // Biological Control. 1991. -Vol.1.-P. 59-62.
449. Tseng, S.C. Proteomic study of biocontrol mechanisms of Trichoderma harzianum ETS 353 response to Rhizoctonia solani I S.C. Tseng, S.Y. Liu, H.H. Yang, C.T. Lo, K.C. Peng // J Agric Food Chem. 2008. - Vol. 56. - P. 69146922.
450. Tsezos, M. Biosorption of metal. The experience accumulated and the outlook for technology development // J. Hydrometallurgy. 2001. Vol. 59. -P. 241243.
451. Tsezos, M. Biosorption of metals. The experience accumulated and outlook for technology development // Hydrometallurgy. 2001. - Vol. 59.-P. 241-3.
452. Tulasne, L.R. Selecta fungorum carpología / L.R. Tulanse, C. Tulasne. Jussu. -1865.- Paris.
453. Turovzi, G. Y. More Trichoderma species from Hungary / G.Y. Turovzi, L. Yajna, Z. Bratek // Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 1994. - Vol. 29.-№3-4.-P. 259-271.
454. Ulhoa, C.J. Purification and characterization of an extracellular chitobiase from T. harzianum / C.J. Ulhoa, J.F. Peberdy // Curr. Microbiol. 1991. -Vol. 23.-P. 285-289.
455. Van Loon, L. C. Pathogenesis-related proteins // Plant Mol. Biol. 1985. -Vol. 4.-№2-3.-P. 111-116.
456. Van Loon, L. C. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins / L. C. Van Loon, E.A. Van Strien//Physiol. Mol. Plant Pathol. 1999. - Vol. 55. - P. 85-97.
457. Veerkamp, J.Los Hongos de Colombia. VIII. Some new species of soil fungi from Colombia/ W. Gams // J.Veerkamp, Caldasia / 1983. - Vol. 13. - P. 7091717.
458. Venkata, G. Stereoselective approach to pentenocins using RCM:synthesis of 6-epi-pentenocin B/ G.Venkata, B.Ramana, A. Rao //Tetrahedron1.tters.- 2006. Vol. 47. - P. 4441-4443.381
459. Verma, M. Antagonistic fungi, Trichoderma spp.: Panoply of biological control. / M. Verma, Satinder K. Brar, R.D. Tyagi, R.Y. Surampalli, J.R. Val'ero // Biochemical Engineering Journal. 2007. - Vol. 37. - P. 1-20.
460. Verma,V.The Endophytic Mycoflora of Bark, Leaf, and Stem Tissues of Azadirachta indica A. Juss (Neem) from Varanasi (India) /V. Verma, S.K. Gond, A. Kumar, R.N. Kharwar, G. Strobee // Microbial ecology. 2007. - P. 120 - 126.
461. Viera, R.H. Biosorption: A solution to pollution/ R.H. Viera, B. Volesky, // Int. Microbiol. 3. 2000. - P. 17-24.
462. Vinale, F. Major secondary metabolites produced by two commercial Trichoderma strains active against different phytopathogens / F. Vinale, R. Marra, F. Scala, E.L. Ghisalberti, M. Lorito, K. Sivasithamparam // Lett Appl Microbiol. -2006.-P.167- 185.
463. Vinale, F. rWc/zoderma-plant-pathogen interactions / F. Vinale, K. Sivasithamparamb, E. L. Ghisalberti, R. Marra, S.L. Woo, M. Lorito // Soil Biology & Biochemistry. 2008. - Vol. 40. - P. 1-10.
464. Virag, D. Microbial Toxicity of Pesticide Derivatives Produced with UV -photodegradation /D. Virag, Z. Naar, A. Kiss // Bull Environ Contam Toxicol . -2007. Vol. 79. - P. 356-359.
465. Viterbo, A. Significance of lytic enzymes from Trichoderma spp. in the biocontrol of fungal plant pathogens / A. Viterbo, O. Ramot, L. Chernin, I. Chet // Antonie van Leeuwenhoek. 2002. - Vol. 81. - P. 549-556.
466. Viterbo, A. Trichoderma mitogen-activated protein kinase signaling is involved in induction of plant systemic resistance /A. Viterbo, M. Harel, B.A. Horwitz, I. Chet, P.K. Mukherjee //Appl Environ Microbiol. 2005. - Vol. 71.- P. 6241-6246.
467. Volesky, B. Advances in biosorption of metals: selection of biomass types / B. Volesky // FEMS Microbiol. Rev.- 1994.- Vol 14. № 4.- P. 291-302.
468. Volesky, B. Biosorbents for metal recovery/ B. Volesky //Tibtech.-1987.-Vol. 5.- № 1.-P. 96-101.
469. Volesky, B. Detoxification of metal-bearing effluents: biosorption for the next century/ B. Volesky // J. Hydrometalallurgy. 2001. Vol. 59.- P. 203 - 216.
470. Wakelin, S.A. Saprophytic growth in soil of a strain of Trichoderma koningii / S.A. Wakelin, K. Sivasithamparam, A.L.J. Cole, R.A. Skipp // New Zealand Journal of Agricultural Research. 1999. - Vol. 42. - P. 337-345.
471. Wang, G. Phylogenetic diversity of eulturable fungi associated with' the Hawaiian Sponges Suberites zeteki and Gelliodes fibrosa/ G.Wang, Q. Li, P. Zhu // Antonie van Leeuwenhoek. 2008. - Vol. 93. - P. 163-174.
472. Wang, J. /J. Wang, C.Chen // Biotechnology Advances. 2006. - Vol. 24.-P. 427-451.
473. Washida, K. Novel secondary metabolites, spirosorbillinoles A, B and C from a fungus/ K. Washida, N. Abe, M. Siguyama, A. Hirota // Biosci. Biotech. Biochem. 2009. Vol. 73(6). - P. 1355 - 1361.
474. Watkinson, J.H. Analytical chemistry. -1964. NY. - 236 p.
475. White, R.F. Acetylsalicylic acid (aspirin) induces resistance to tobacco mosaic virus in tobacco // Virology. 1999. - Vol. 99. - №2. - P. 410-412.
476. Widden, P. Competitive interactions and ecological strategies of Trichoderma species colonizing spruce litter / P. Widden, V. Scattolin // Mycologia. -1988. Vol. 80. - P. 795-803.
477. Widden, P. Fungi from Canadian coniferous forest soils / P. Widden, D. Parkinson // Can. J. Bot. -1973. 51. - P. 2275-2290.
478. Widden, P. Seasonality of Trichoderma species in a spruce-forest soil / P. Widden, J.J. Abitbol // Mycologia. 1980. - Vol. 72. - P. 775-784.
479. Widden, P. The effects of temperature and litter types on competition between Trichoderma species /P. Widden, D. Hsu // Soil Biol. Biochem. 1987. -Vol. 19.-P. 89-93.
480. Widden, P. The effects of temperature on competition for spruce needles among sympatric species of Trichoderma/ P. Widden // Mycologia. -1984. Vol. 76. -P. 873-883.
481. Woo, S.L. The molecular biology of the interactions between Trichoderma spp., phytopathogenic fungi, and plants / S.L. Woo, F. Scala, M. Ruocco, M. Lorito, // Phytopathology. 2006. - Vol. 96. - P. 181-185.
482. Wu, C.H. Engineering plant-microbe symbiosis for rhizoremediation of heavy metals / C.H. Wu, T.K. Wood, A. Mulchandani, W. Chen // Appl. Environ. Microbiol.- 2006. Vol. 72. - P. 1129-1134.
483. Wu, P. Characteristics of indoor and outdoor airborne fungi at suburban and urban homes in two seasons / P.C. Wu, H.J. Su, C.Y. Lin // The Science of the Total Environment. 2000. - Vol. 253. - P. 111-118.
484. Wu, R.Y. Studies of microbial ecology of the Tansui Estuary/ T. Wu, Z. Kabir, // Bot. Bull. Acad. Sinica. 1993. - Vol. 34, 1. - P. 13 - 30.
485. Wu, T. A possible role for saprotrophic microfungi in the N nutrition of ectomycorrhizal Pinus resinosa / T. Wu, Z. Kabir, R.T. Koide // Soil Biology & Biochemistry. 2005. - Vol. 37. - P. 965-975.
486. Wuczkowski, M. Species pattern and genetic diversity of Trichoderma in a mid-European, primeval floodplain-forest / M. Wuczkowski, I. Druzhinina, Y. Gherbawy, K. Klug, H.J. Prillinger, C.P. Kubicek // Microbiol Res. -2003. -Vol.158.-P. 125-133.
487. Xia, X. Species diversity, distribution, and genetic structure of endophytic and epiphytic Trichoderma associated with Banana Roots / X. Xia, K. Lie, X. Qian, Z. Zheng, Y. Shen // Microb. Ecol. 2011/ s00248-010-9770-y.
488. Yedidia, I. Induction of defence responses in cucumber plants (Cucumis sativus L.) by the biocontrol agent Trichoderma harzianum / I. Yedidia, N. Benhamou, I. Chet // Applied Environmental Microbiology. 1999. - Vol. 65. - P. 1061-1070.
489. Yuan, Z. Diverse non-mycorhizal fungal endophytes inhabiting- an epiphytic, medicinal orchid (Dendrobium nobile): estimation and characterization / Z. Yuan, Y. Chen, Y. Yang // World J Microbiol Biotechnol. 2009. - Vol. 25. - P. 295-303.
490. Zachary, A. Earthworm assisted bioremediation of organic contaminants / A. Zachary, S.V. Huckman, T. Brain, J. Reid // Environ. Int. 2008. - Vol. 34 (7).-P. 1072-1081.
491. Zadworny, M. Conidia of Trichoderma virens as a phosphorus source for mycorrhizal Pinus sylvestris seedlings / M. Zadworny, Z. Gorski, E. Koczorowska, A. Werner // Mycorrhiza. 2008. - Vol. 19. - P. 61-66.
492. Zafar, S. Metal tolerance and biosorption potential of filamentous fungi isolated from metal contaminated agricultural soil / S. Zafar, F. Aqil, I. Ahmad // Bioresour. Technol. 2007. -Vol. 98.-P. 2557-256.
493. Zayed, G Bio-active composts from rice straw enriched with rockphosphate and their effect on the phosphorous nutrition and microbial communityin rhizosphere of cowpea / G. Zayed, H. Abdel-Motaal // Bioresource Technology. -2005.-Vol. 96.-929-935.
494. Zeilinger, S.Signal transduction by Tga3, a novel G protein alpha subunit of Trichoderma atroviride/S. Zeilinger, B. Reithner, V. Scala, I. Peissl, M. Lorito, R.L. Mach // Appl Environ Microbiol. -2005. Vol. 71. - P. 1591-1597.
495. Zeilinger, S. Trichoderma biocontrol: signal transduction pathways involved in host sensing and mycoparasitism/ S. Zeilinger, M. Omann // Gene Regul Syst Biol. 2007. Vol. 1. - P. 227-234.
496. Zhou, J.L. The uptake of copper from aqueous solutions by immobilized fungal biomass/ J.L. Zhou, R.J. Kiff// J. Chem. Technol. Biotechnol. 50, 1991.-345-355.
497. Zimand, G. Use of the RAPD procedure for the Identification of Trichoderma Strains / G. Zimand, L. Valinsky, Y. Elad, I. Chet, S. Manulis I I Mycol. Res. 1994. - Vol. 98. - p. 531-534.
-
Садыкова, Вера Сергеевна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2012
-
ВАК 03.02.12
- Эколого-биологическая роль грибов рода Тrichoderma в различных биоценозах Средней Сибири
- Биоэкологические особенности гиперпаразитных грибов и их значение в ограничении численности корневых гнилей зерновых культур
- Штаммы грибов рода Trichoderma (Pers.: Fr.) как основа для создания биопрепаратов защиты растений и кормовых добавок
- Эколого-биологическое обоснование скрининга грибов рода Trichoderma для получения и использования биопрепаратов на растительных субстратах
- Изменчивость Trichoderma asperellum и отбор штаммов для создания биопрепаратов на гидролизном лигнине
