Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка нового пробиотика на основе бактерий видов Lactobacillus plantarum и bacillus subtilis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка нового пробиотика на основе бактерий видов Lactobacillus plantarum и bacillus subtilis"

На правах рукописи

ШЮХУШКО Елена Николаевна

РАЗРАБОТКА НОВОГО ПРОБИОТИКА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ ВИДОВ LACTOBACILLUS PLANTARUM И BACILLUS SUBTILIS

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2003

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (г. Казань) и в Центре военно-технических проблем биологической защиты научно-исследовательского института микробиологии МО РФ (г. Екатеринбург).

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук Садыков Н.С.

Научный консультант: кандидат медицинских наук Забокрицкий А.Н.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Низамов Р.Н.

кандидат биологических наук Махмуткин В. А.

Ведущая организация: Московская академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. Скрябина К.И.

Защита диссертации состоится «15» мая 2003 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (420075, Россия, Татарстан, Казань, Научный городок, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института.

Автореферат разослан «2?» 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета /р

кандидат ветеринарных наук^у^эе^»^7^^" В.И.Степанов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последние годы в Российской Федерации наблюдается нарастание неблагоприятных социальных, экологических и других факторов, что существенно влияет на ухудшение эпидемической ситуации. Одним из закономерных следствий такого положения является увеличение числа инфекционных заболеваний, в том числе кишечных инфекций и дисбактериозов / Ю.Л.Шевченко, А.В.Бойко, А.Д.Карцев, 2000/.

Острые кишечные инфекции в настоящее время остаются одной из актуальных и важных проблем инфекционной патологии. По данным Центра Госсанэпиднадзора Минздрава РФ, за период с 1998 года по декабрь 1999 года заболеваемость, в частности, сальмонеллезами увеличилась на 3 %, острыми кишечными инфекциями, вызванными неустановленными возбудителями - на 39,37%, шигеллезом - на 89,36%. В 2000г. и 2001г. отмечена тенденция к снижению заболеваемости кишечными инфекциями, в 2002г. их увеличение, в целом по стране за 2002г. было зарегистрировано 16 вспышек острых кишечных инфекций. Особое внимание на себя обращают так называемые инфекции с неустановленной этиологией, на долю которых приходится более 50% заболевших / Т.И.Фролочкйна, 2002/.

По данным Центрального научно-исследовательского института Эпидемиологии Минздрава Российской Федерации, увеличивается также и количество инфекционных заболеваний, отличающихся затяжным и хроническим течением, которые вызываются условно-патогенными возбудителями / А.В.Бойко, 2000; A.B. Т.И.Фролочкина, 2002/.

Необходимо также обратить внимание на то, что, по данным Российской Академии медицинских наук, почти 90 % населения России страдает кишечными дисбактериозами. Широкое распространение дисбактериозов, в свою очередь, способствует развитию ряда других рецидивирующих инфекционных заболеваний, а также иммунодефицитов и аллергопатий. Нелеченные дисбакте-риозы сопровождаются морфологическими и функциональными нарушениями не только в пищеварительной, но и в иммунной, урогенитальной и дыхательной системах организма. Анализ данных литературы показал, что проблема кишечных инфекций и дисбактериозов не менее актуальна и в ветеринарии. Патологии желудочно-кишечного тракта, клинически проявляющиеся диарейным синдромом, в общей структуре заболеваний молодняка животных составляют 75%, падеж поросят от желудочно-кишечных болезней достигает 40-50% от числа родившихся. В промышленном птицеводстве России желудочно-кишечные болезни занимают второе место в общей структуре заболеваемости птиц /В.А.Антипов, 1992; Ю.Н.Бригадиров', 1997; Н.Д.Придыбацло, 2000/.

Положительные результаты в борьбе с кишечными инфекциями и дисбактериозами могут быть достигнуты лишь при условии решения целого комплекса лечебно-профилактических, противоэпидемических и санитарно-гигиенических мероприятий. Особое внимание должно быть уделено совершенствованию существующих, разработке и внедрению новых эффективных лечебно-профилактических препаратов. В настоящее время в практике лечения и профилактики острых кишечных инфекций и дисбактериозов все более широкое применение находят медицинские бактериальные препараты: севакол, ко-лифлорал, колибактерин, бифидумбактерин, : -

i БИБЛИОТЕКА

¿"■гйг.**/!

рин, бактисубтил, биоспорин, флошдага и др. Из медицинской практики известно, что данные препараты обладают недостаточной эффективностью при определенных формах дисбактериозов, а также при тяжелых формах острых кишечных инфекций, вызванных стафилококками, кандидами и сальмонеллами. При применении пробиотиков на основе бацилл всегда следует помнить, что культуры некоторых штаммов в больших дозах способны вызывать у людей инфекционные процессы (до эндокардитов) и, что вопросы кинетики и длительной персистенции бацилл в организме человека до настоящего времени и в теоретическом, и в практическом плане окончательно не изучены. Изложенное должно вызывать настороженность при использовании больших доз данных препаратов, особенно у детей и молодняка сельскохозяйственных животных. Необходимо отметить, что существующие пробиотики не реализуют в своем составе всего комплекса механизма пробиотического действия, что снижает их эффективность.

Цель н задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка нового пробиотика на основе бактерий видов Lactobacillus plantarum и Bacillus subtilis. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи:

- провести теоретические исследования по выбору перспективных микроорганизмов для включения в состав нового пробиотика;

- определить критерии оценки свойств бактериальных культур, используемых для производства лечебно-профилактических препаратов;

- всесторонне изучить культурально-морфологические, тинкториальные, физиолого-биохимические и другие биологические свойства выбранных культур штаммов;

- определить терапевтическую эффективность экспериментального образца препарата при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах у лабораторных и сельскохозяйственных животных, а также его влияние на показатели неспецифической резистентности макроорганизма.

Научная новизна работы. Теоретически и экспериментально обоснованы и выбраны культуры штаммов для включения в состав нового пробиотика; определены оптимальные концентрации бактериальных культур компонентов в экспериментальном образце.

Отработана технология получения нового препарат, изучена его терапевтическая эффективность на лабораторных и сельскохозяйственных животных и представлены рекомендации по его дальнейшему использованию.

Практическая ценность работы. Разработана технология получения нового препарата из глубинных культур L. plantarum и В. subtilis. По результатам исследований разработаны:

инструкция по приготовлению и контролю качества препарата субтилакт, утвержденная директором ВНИВИ Минсельхоза РФ и начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ;

сборник лабораторных методик по выделению, изучению биологических свойств и поддержанию в жизнеспособном и активном состоянии культур лак-тобактерий, утвержденный начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ и директором ВНИВИ Минсельхоза РФ;

заявка на патент «Способ получения сухого препарата на основе бацилл и лактобацилл для лечения и профилактики диспепсии у крупного рогатого скота».

Основные положения и результаты, выносимые на защиту;

Композиционный состав биопрепарата, включающий бактерии видов L. plantarum и В. subtilis в соотношении 1:2, пригоден для создания нового высокоэффективного пробиотика.

Комплексный биопрепарат может быть использован для регуляции микробиоценоза и неспецифической иммуностимуляции при лечении кишечных инфекций и дисбактериозов кишечника, в том числе отличающихся затяжным и хроническим течением.

Апробация работы. Материалы работы представлены на 1 Конференции иммунологов Урала (Екатеринбург, 2001), на научной конференции ЦВТП БЗ (Екатеринбург, 2001), на 2 Конференции Уральского научного общества иммунологов, аллергологов и иммунореабилитологов (Пермь, 2002), на расширенном заседании лаборатории бакинфекций ВНИВИ (Казань, 2002).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста (с полуторным интервалом), иллюстрирована 9 рисунками, 30 таблицами, состоит из списка сокращений единиц и терминов, введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов практических рекомендаций, приложения. Список литературы содержит 117 источников, включая работы отечественных и зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования

В работе использовали музейные культуры штаммов Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, Lactobacillus fermentum 90T-C4, Lactobacillus acidophilus IK, Bacillus subtilis 3, Bacillus licheniformis 31, Bacillus subtilis 3(105), Bacillus species IP5832, а также культуры непатогенных спорообразующих бацилл и бактерий рода Lactobacillus sp., выделенные из различных природных и производственных источников, организма людей и животных.

Для определения антагонистической активности изучаемых бактерий использовали тест-культуры штаммов Staphilococcus aureus 209, Salmonella typhi-murium 11, Shigella sonnei 659, Candida albicans 690, Proteus mirabilis 237, Esher-ichia coli 157, Staphilococcus epidermidis 14990, Staphilococcus saprophiticus, Proteus vulgaris 177, Micrococcus luteusl09. Культуры данных штаммов получены из музея Государственного института стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.

Экспериментальная работа была проведена на 280 половозрелых белых мышах, 56 морских свинках, 80 кроликах, 20 телятах и 36 цыплятах.

В исследованиях использовали клинические, бактериологические, иммунологические, биохимические, физико-химические методы исследования.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с использованием стандартных программ: методом вариационной статистики с вычислением средних величин (М), ошибки средней (t), среднего квад-

ратичного отклонения (Q), показателя достоверности (р), определяемых по таблице Стьюдента-Фишера.

2.2 Результаты исследований

Анализируя последние публикации по проблеме пробиотиков, были выделены две основные группы бактерий, которые являются наиболее перспективными в качестве основы для создания новых пробиотиков - это бактерии рода Lactobacillus и вида В. subtilis. Совмещение данных бактерий в бактериальном препарате является эффективным, прежде всего потому, что они могут воздействовать на различные звенья патогенетического процесса.

На первом этапе экспериментальной работы проводили исследования по изучению и выбору активных культур штаммов бацилл и лактобацилл из музейной коллекции и выделенных самостоятельно. Выбор активных культур штаммов осуществляли с учетом следующих критериев: определение их антагонистической активности по отношению к условно-патогенным и патогенным бактериям in vitro, изучение характера бактериоцинопосредованных конкурентных взаимоотношений с другими штаммами, выраженности их иммуномо-дулирующей активности, цитадгезирующих свойств, технологичности.

В результате выполненной работы были отобраны 2 штамма культур бактерий для включения в состав нового биопрепарата - В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ. Культура штамма L. plantarum 8Р-АЗ обладает высокими адгезивными свойствами, а также высокой антимикробной активностью в отношении различных видов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. В наших исследованиях экспериментально было доказано, что в условиях смешанных микробных популяций под действием изучаемой культуры L. plantarum происходит резкое снижение адгезивных свойств условно-патогенных микроорганизмов. Было также установлено в опытах на лабораторных животных, что культура L. plantarum увеличивает фагоцитарную активность нейтрофилов и перитонеаль-ных макрофагов, усиливает общую бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови.

Культура штамма В. subtilis 3, в свою очередь, проявляет высокую антагонистическую активность в отношении многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов из родов Candida, Staphylococcus, Proteus, Campi-lobacter, Shigella, Salmonella. В то же время культура Bacillus subtilis не оказывает антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры, что создает условия для бесконкурентного восстановления аутофлоры. Бациллы характеризуются высокой ферментативной активностью, позволяющей им регулировать и стимулировать пищеварительные процессы и оказывать противоаллергическое и антитоксическое действие.

Для конструирования препарата оценивали антагонистическую активность при их совместном культивировании. При совместном выращивании культур штаммов В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ на плотных питательных средах было установлено, что эти культуры штаммов не оказывают друг на друга антагонистического воздействия и могут служить компонентами для создания комплексного препарата. Использование данных культур в составе комплексного препарата обеспечивает стабильность такого сочетания штаммов. Важно отметить, что штаммы В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ могут служить стабильным материалом для получения экспериментального препарата,

так как они сохраняют жизнеспособность и активность при лиофильном высушивании и в процессе длительного хранения (не менее двух лет).

Для оценки эффективности различных комбинаций изучаемых культур в препарате в качестве критерия использовали величину антагонистической активности, которую изучали методом совместного культивирования с тест-культурами. В качестве тест-культур использовали S. sorwei 659, S. typhi-murium 11, S. aureus 209 и С. albicans 690. Готовили ассоциации нативных микробных культур в различных количественных соотношениях для В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ соответственно (об.%): 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90. Кроме того, исследовали образцы вариантов, разведенные в 10,102,103,104раз.

При определении оптимальных комбинаций культур в препарате, кроме того, изучали их взаимное влияние на цитоадгезию в условиях смешанных популяций. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что бациллы не проявляют цитоадгезивных свойств и не подавляют цитоадге-зивных свойств культуры штамма L. plantarum 8Р-АЗ (СПА был равен 4,6).

Таблица 1 — Антагонистическая активность различных вариантов В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ в отношении тест-культур через 24часа выращивания

Соотношение вариантов В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ Наличие роста тест-культур

Б. вопля ЗЛурЫтигшт S. aureus С. albicans

90:10 5,З.Ю6кл.см"3/1,0»106кл.см'3 Наличие роста Наличие роста Наличие роста Наличие роста

80:20 4,6.106кл.см"3/2,0.10бкл.см'3 Наличие роста Наличие роста Наличие роста Наличие роста

70:30 4,Ы06кл.см"3/2,9«106кл.см"3 Наличие роста Наличие роста Наличие роста Наличие роста

60:40 3,6.10'kji.cm"3/4,6.10Vi.cm"3 Подавление роста Подавление роста Подавление роста Подавление роста

50:50 2,9404кл.см"3/5Д. Ю'кл.см3 Подавление роста Подавление роста Подавление роста Подавление роста

40:60 2, Ы0бкл.см"3/6,0. Ю'кл.см"3 Подавление роста Подавление роста Подавление роста Подавление роста

30:70 1,5.106кл.см"3/б,9.106кл.см"3 Подавление роста Наличие роста Подавление роста Подавление роста

20:80 1,2.106кл.см"3/8,3 «106кл.см"3 Наличие роста Наличие роста Наличие роста Наличие роста

10:90 0,5.1 0Vcmj/9,4.1 0<Wcm"3 Наличие роста Наличие роста Наличие роста Наличие роста

Согласно данным, представленным в таблице 1, установили, что оптимальным соотношением бактериальных культур В. виЫШз 3 и1. ркгиагит 8Р-АЗ для получения препарата является 1/2 при количестве живых микробных клеток не менее 2,1 • 106 кл »см"3 для В. зиЫШв 3 и 4,6 . 106 кл.см"3 для Ь. р1ап-1ягшп 8Р-АЗ.

В дальнейшем определяли оптимальные условия глубинного культивирования выбранных штаммов, критериев оценки готовности нативных культур,

порядка приготовления экспериментального образца препарата. Одновременно в ходе работы проводили сравнительное изучение биологических свойств глубинных и поверхностных кулыур исследуемых штаммов.

В сравнительных экспериментах изучали возможность использования питательных сред для производственного культивирования лактобактерий. Основным показателем эффективности культивирования является определение количества жизнеспособных клеток в культуральной жидкости. Помимо этого, косвенно о готовности культуры можно судить по изменению микроскопической картины и значений рН. Перечисленные показатели являются достаточными для оценки готовности нативных культур и их целесообразно использовать для определения продолжительности культивирования.

В экспериментальной работе были апробированы пять полужидких питательных сред: капустная среда, среда на основе панкреатического гидролизата крови крупного рогатого скота, среда на основе молочной сыворотки и казеи-ново-дрожжевая среда. К питательным средам добавляли 0,1% агар-агара или желатина. Прибавление этих веществ давало качественно равнозначные результаты в отношении роста и развития лактобактерий. Выращивание проводили в статических условиях при температуре (37+1 )°С. Посевная доза Ь. р1ап-1ашш 8Р-АЗ составляла не менее 1,2*107кл.см'3.

В ходе исследований наилучшие результаты были получены при использовании казеиново-дрожжевой среды и капустной среды. При выращивании изучаемой культуры в средах на основе панкреатического гидролизата крови крупного рогатого скота и на основе молочной сыворотки концентрация клеток была низкой. Высокие ростовые качества казеиново-дрожжевой среды и капустной среды объясняются рациональным подбором питательных веществ, поэтому данные среды могут быть использованы для глубинного культивирования лактобацилл. При выращивании культуры штамма Ь. р1аШагит 8Р-АЗ в жидких питательных средах наблюдалась последовательная смена отдельных фаз в развитии популяции, отражающая общую закономерность роста и размножения бактериальных клеток. Показано, что после 8, 12 и 24 часов выращивания культуры на капустной среде в статических условиях количество клеток соответственно составляло 1,2 млрд.кл..см'3, 2,1 млрд.кл.»см"3 и 7,8 млрд.кл.»см"3, через 30 часов культивирования концентрация бактерий увеличилась до 10,2 млрд.кл..см'3(таблица 2).

Таблица 2 - Характеристика культуры штамма Ь. ркшапяп 8Р-АЗ при выращивании в капустной среде в динамике_

Показатель Время выращивания, ч

8 12 24 30 36 48

рН.ед. рН 6,28+ 0,02 6,02+ 0,05 4,50+ 0,08 4,32+ 0,04 4,32+ 0,02 4,30+ 0,02

Концентрация клеток, млрд.кл.«см"3 1,2+0,4 2,1+0,6 7,8+1,1 10,2+3,2 9,3+0,1 8,4+0,1

Значения величины рН при выращивании культуры в капустной среде в течение 30 часов изменялись от 6,28 до 4,32.

Согласно данным, приведенным в таблице 3, при выращивании культуры на казеиново-дрожжевой среде в интервале времени от 8 до 12 часов концентрация клеток лактобактерий достигает 1,12*Ю10кл.см"3, значение рН при этом составляло 4,52. Дальнейшее выращивание нецелесообразно, так как происходило резкое снижение значений рН и концентрация клеток уменьшалась до 4,22 млрд .кл. .см"3.

Таблица 3 - Характеристика культуры штамма Ь. ркхйагшп 8Р-АЗ при выращивании в казеиново-дрожжевой среде в динамике_

Показатель Время выращивания, ч

8 12 24 30 36 48

рН.ед. рН 4,52+0, 02 4,52+0, 02 4,31+0, 01 4,22+0,11 4,22+ 0,02 4,22+ 0,02

Концентрация клеток, млрдлсл.»см"3 10,2+7, 4 11,2+6, 4 9,1+2,4 7,2+0,4 7,3+0,1 7,4+0,3

Было установлено, что при культивировании лактобацилл важное значение имеет регуляция окислительно-восстановительного потенциала среды, по-' этому уровень накопления биомассы может быть повышен коррекций величины рН. Морфологические, культуральные свойства и антагонистическая активность молочнокислых бактерий, выращенных в различных питательных средах, не изменились.

Для глубинного выращивания культуры штамма В. бцЫШб 3 использовали жидкую питательную среду на основе гидролизата соевой муки с добавлением солей кальция хлорида, сульфатов магния и марганца, хлорида натрия и сульфата железа. Глюкозу и раствор кальция хлорида вносили непосредственно при посеве. Культуру выращивали в колбах на установке для выращивания бактерий при температуре (37+1 )°С и 220 оборотах в минуту. Посевная доза В. зиЬйЦэ составляла не менее 2,3»106кл«см"3. Определяли в динамике основные характеристики глубинных культур: концентрацию клеток и значение водородного показателя. Характеристика культуры штамма В. зиЫШв 3, полученной при выращивании в жидкой питательной среде на основе гидролизата соевой муки, представлена в таблице 4.

Таблица 4 - Характеристика культуры штамма В. $иЬШ& 3 при выращи-

Показатель Время выращивания, ч

15 21 24 30 36 48

рН.ед. рН 5,91+ 0,02 6,24+ 0,04 6,80+ 0,02 6,65+ 0,03 6,01+ 0,04 4,96+ 0,07

Концентрация клеток, млрд.кл.»см*3 0,71+ 0,14 0,84+ 0,14 1,94+ 0,12 2,56+ 0,08 2,31+ 0,16 2,21+ 0,12

Анализ данных, приведенных в таблице 4, показывает, что максимальное значение концентрации биомассы регистрировалось на 24-30 часов роста культуры. Динамика роста бактерий В. виЫШз 3 характеризовалась закислением среды на 15 часов. В дальнейшем после 21 часа выращивания кулыуры происходило увеличение значения величины рН, что соответствовало увеличению биомассы бактерий В. зиЫШэ 3 до значения 2,56 млрд.кл..см~3. После ферментации и определения количества клеток каждой культуры их смешивали в установленном ранее соотношении. В полученную взвесь добавляли сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в соотношение 1:1. Затем стабилизированную микробную суспензию высушивали на установке лиофильного высушивания. Состав готового препарата приведен ниже:

количество живых клеток В .виЫШБ 3 (2,9+0,7). 106кл.см'3;

количество живых клеток Ь. р1атагшп 8Р-АЗ (5,2+0,8). 106кл*см'3;

концентрация сахарозы (0,020+0,002) г;

концентрация желатина (0,0060+0,0006) г

Были приготовлены 3 лабораторные серии экспериментального образца препарата с установленным количеством живых микробных клеток отобранных бактериальных культур для дальнейшего изучения специфической активности и безопасности. Полученному экспериментальному образцу дали рабочие наименование субтилакт. Для контроля качества экспериментального образца определяли количество жизнеспособных клеток, антагонистическую активность препарата методом отсроченного антагонизма (Н.С.Егоров, 1986) и отсутствие посторонней микрофлоры. Показатели качества полученных серий представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Показатели качества экспериментального образца пробиоти-ка субтилакт_

Наименование показателя Серии

1 2 3

Количество жизнеспособных клеток, млн.кл: В. виШНя 3 Ь. ркиЛагит 8Р-А 2,3+0,2 5,2+0,8 3,4+0,2 5,9+0,4 4,2+0,3 5,2+0,8

Контаминация посторонней микрофлорой Отсутствует

Антагонистическая активность Полное подавление роста тест-культур

Специфическая активность полученного экспериментального образца препарата была определена у белых мышей и кроликов на экспериментальных моделях дисбактериоза и кишечных инфекций. Дисбактериоз вызывали путем интрагастрального введения ампиокса в дозе 4 мг в сутки белым мышам (массой 18-20 грамм) в течение 5 дней. Лечебное действие субтилакта оценивали в

и

сравнении с двумя коммерческими препаратами биоспорин и лакгобактерин, которые использовали в течение 7 суток в дозе 2»106 клеток для белых мышей, 2,5»108 клеток - для кроликов. Субтилакт вводили в дозе 2«103 клеток для белых мьппей, 2,5»105 клеток - для кроликов также в течение 7 суток.

Данные по изучению влияния указанных препаратов на микробиоценоз лабораторных животных при экспериментальном дисбактериозе и при его лечении приведены в таблице 6. Для оценки состояния противомикробной зашиты на 10 сутки с начала лечения у подопытных животных определяли общую бактерицидную активность сыворотки крови (В.Н.Кашин, 1996) и количество лейкоцитов (таблица 7, рисунки 1 и 2).

На основании анализа полученных данных определили, что после приема ампиокса у лабораторных животных происходит снижение общего количества анаэробов, особенно лакто- и бифидобакгерий; повышение общего количества аэробов; появление в большом количестве неполноценных в ферментативном отношении кишечных палочек; протея, плазмокоагулирующего стафилококка, дрожжевых грибов. Кроме того, повышалась концентрация гемолширукмцей микрофлоры, лактозонегативных энтеробактерий.

Дисбактериоз кишечника лабораторных животных сопровождался высоким содержанием лейкоцитов в крови, значительным увеличением относительного количества зрелых и незрелых нейтрофилов, а также моноцитов. Относительное количество лимфоцитов было снижено. Кроме того, отмечали снижение общей иммунологической резистентности организма, так как общая бактерицидная активность сыворотки крови (ОБАСК) у лабораторных животных с экспериментальным дисбактериозом была меньше, чем у интактных животных.

При изучении влияния бактерий видов Ь. р1ап1агиш и В. зиЫШэ в составе препарата субтилакт на микробиоценоз кишечника белых мышей при экспериментальном дисбактериозе было установлено, что их воздействие протекает по типу синергизма, способствует более быстрому восстановлению нормомикро-биоценоза у животных, чем использование каждого из них в отдельности в составе препаратов биоспорин и лакгобактерин. Показано также, что применение для лечения дисбактериозов у белых мышей и кроликов препарата субтилакт было значительно эффективнее, чем лечение экспериментальных животных биоспорином или лактобакгерином. Как видно из приведенных в таблице 6 данных, после применения экспериментального образца препарата у подопытных животных происходило увеличение общего количества анаэробов, восстановление до показателей нормы количества бифидо- и лактобакгерий и в то же время снижение количества условно патогенных энтеробактерий, дрожжепо-добных грибов. При введении лабораторным животным субтилакта происходило не только восстановление микробиоценоза, но и нарушенных механизмов естественного иммунитета (рисунки 1 и 2). Важно отметить, что после лечения экспериментального дисбактериоза биоспорином и лактобакгерином у подопытных животных ОБАСК была снижена.

Таблица 6 - Качественный и количественный состав микрофлоры содержимого кишечника лабораторных животных при экспериментальном дисбактериозе и при его лечении

Группа лабораторных животных Общее количество аэробов Общее количество анаэробов Концешрация бактерий , lg КОЕ«г"1

Bifidobacterium Lactobacte-riimi Условно патогенных энтеро-бактерий Candida

С экспериментальным дисбактериозом 9,42+0,18 4,18+0,16 2,04+0,11 0,24+0,14 5,34+0,86 4,12+0,18

9,85+0,16 3,24+0,26 ls04+0,26 0,14+0,11 6,14+0,66 4,07+0,11

Леченные лактобакгерином 8,12+0,14 8,42+0,16 7,12+0,14 6,92+0,18 4,86+0,43 4,86+0,27

8,68+0,14 8,32+0,13 7,12+0,14 6,92+0,18 4,16+0,43 4,86+0,27

Леченные биоспорином 8,28+018 8,08+0,14 6,42+0,12 5,64+0,24 2,14+0,28 1,84+0,31

8,48+018 8,19+0,09 6,88+0,14 5,13+0,24 2,12+0,38 1,61+0,22

Леченные субтилактом 8,24+0,13 9,18+0,18 10,24+0,11 8,64+0,12 1.94+0,22 1,20+0,15

8,04+0,19 9,98+0,18 10,24+0,32 8,52+0,22 1,49+0,13 1,15+0,11

Интактные животные 8,41+0,12 9,12+0,18 10,12+0,11 8,42+0,24 2,12+0,14 1,41+0,18

8,11+0,23 9,62+0,11 10,85+0,13 8,16+0,11 2,45+0,16 1,34+0,08

Примечание:!} числителе представлен состав микрофлоры белых мышей, в знаменателе - состав микрофлоры кроликов.

Таблица 10 - Лейкоцитарная формула крови лабораторных животных при экспериментальном дисбактериозе и при его лечении

Группа лабораторных животных Лейкоцитарная формула крови

Лимфоциты, % Нейтрофилы Моноциты, % Эозино- филы, %

юные палоч-коя-дерные сегмен-тоядер-ные

С экспериментальным дисбакгерио-зом 70,1+1,8 1,4+0,1 7,0+0,5 18,2+0,9 3,1±0,3 0,2+0,1

41,9+1,8 0,2+0,1 8,1+0,5 40,2+0,9 3,4+0,3 3,2+0,2

Леченные экспериментальным образцом 85,1±0,3 0,9±0,1 1,1+0,5 10,9+1,1 1,7+0,3 0,3±0,1

6,2±0,2 0,6±0,1 6,210,5 28,9+1,1 2,6+0,3 0,8+0,1

Леченные лактобактерином 76,2+2,9 1,1±0,6 2,2+0,8 16,8+1,6 3,7+0,9 0,2+0,1

50,0+1,9 1,0+0,6 7,5+0,5 36,9+2,1 3,5+1,7 1,1+0,3

Леченные биоспорином 75,2+0,5 1,8+0,2 2,0+0,2 17,2+0,9 3,4+0,2 1,2+0,5

55,2+0,2 0,4+0,2 3,6+0,8 36,4+0,8 2,2+0,3 2,2+0,5

Интактные животные 80,4+1,7 1,2+0,1 1,6+0,1 14,2±0,4 2,4+0,3 0,2+0,1

59,511,2 0,4+0,1 5,6+0,1 30,3±0,6 2,9_К),2 1,3±0,1

Примечание. В числителе представлена лейкоцитарная формула белых мышей, в знаменателе -кроликов.

1,2 -1 4

0,6 [■

Рисунок 1 - Бактерицидная активность сыворотки крови белых мышей при экспериментальном дисбактериозе и при его лечении По оси абсцисс - ОБАСК.

1-при экспериментальном дисбактериозе, 2-при лечении биоспорином, 3-при лечении лактобактерином, 4-при лечении субтилактом, 5-интактные животные. По оси ординат - уровень ОБАСК.

Рисунок 2 - Бактерицидная активность сыворотки крови кроликов при экспериментальном дисбактериозе и при его лечении. По оси абсцисс - ОБАСК:

1-при экспериментальном дисбактериозе, 2-при лечении биоспорином, 3-при лечении лакгобактерином, 4-при лечении субтилактом, 5-интактные животные. По оси ординат - уровень ОБАСК.

В дальнейшем была определена эффективность экспериментального образца препарата у подопытных животных по отношению к сальмонеллам, ши-геллам, золотистому стафилококку, грибам рода Candida. Заражение животных осуществляли введением тест-культур в дозе ШД50. У животных с экспериментальными моделями кишечных инфекций развивался инфекционный процесс, сопровождавшийся высевом бактерий из паренхимы печени, селезенки, крови и приводящий к гибели на 10 сутки наблюдения 50% подопытных животных. Гибель животных начиналась с 7 суток после заражения. У подопытных животных отмечалось увеличение абсолютного количества лейкоцитов, концентрация зрелых нейгрофилов и моноцитов по сравнению с интактными животными. Помимо этого, следует отметить, что кишечные инфекции сопровождались прогрессирующим угнетением неспецифической резистентности, так как бактерицидная активность сыворотки крови была снижена.

Применение биоспорина и лактобактерина по указанной выше схеме способствовало элиминации золотистого стафилококка на 8 сутки; сальмонелл, шигелл Зонне и грибов рода Candida - на 10 сутки после лечения. Выживаемость подопытных животных, леченных биоспорином, составила 94%, леченных лакгобактерином - 75%. После лечения инфицированных животных данными препаратами отмечалось снижение численности лейкоцитов до нормального уровня, хотя количество сегментоядерньтх нейгрофилов оставалось выше нормальных значений. Показатели неспецифических факторов иммунитета в этих группах животных приближались к норме, но все еще сохранялось угнетение бактерицидной активности сыворотки крови.

Как показали результаты проведеннных исследований, экспериментальный образец препарата субтилакт является эффективным средством лечения кишечных инфекций бактериальной этиологии. Так, при его использовании выживаемость подопытных животных составляла 100%. На 4 сутки наблюдения у белых мышей и кроликов на фоне лечения экспериментальным образцом препарата происходила полная элиминация золотистого стафилококка, на 6 сутки - сальмонелл, а на 7 сутки - шигелл Зонне и грибов рода Candida. Важно

1,2 т

0,8 f 0,6 -j-0.4 j-0,2 f О —

l-_£=L__c=I.

1

5 !

отметить, что при применении экспериментального образца происходила нормализация микрофлоры кишечника подопытных животных. Лечение субтилак-том позволило нормализовать концентрацию лейкоцитов, показатели неспецифической резистентности, а также соотношение лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов. Результаты исследования свидетельствуют о высокой эффективности препарата, изготовленного по разработанной технологии.

I Ряд1 ■ Ряд 2 □ РядЗ О Ряд4

Рисунок 3 - Бактерицидная активность сыворотки крови белых мышей при экспериментальных кишечных инфекциях и при лечении. По оси абсцисс - ОБАСК животных 1-при экспериментальном сальмонеллезе; 2- при экспериментальном кандидозе; 3 - при экспериментальной стафилококковой инфекции, 4- при экспериментальном шигеллезе, 5 - интактные животные По оси ординат - уровень ОБАСК.

Ряд 1-модель инфекции, ряд 2- лечение инфекционного процесса лактобактерином, ряд 3- лечение инфекционного процесса биоспорином, 4- лечение инфекционного процесса субтилак-'

4

5

Ряд1 ■ Ряд2 □ РядЗ □ Ряд4

Рисунок 4 - Бактерицидная активность сыворотки крови кроликов при экспериментальных кишечных инфекциях и при лечении. По оси абсцисс - ОБАСК животных 1-при экспериментальном сальмонеллезе; 2- при экспериментальном кандидозе, 3 - при экспериментальной ста-

том.

филококковой инфекции; 4- при экспериментальном шигеллезе, 5 - интактные животные. По оси ординат-уровень ОБАСК.

Ряд 1-модель инфекции; ряд 2- лечение инфекционного процесса лактобакгерином, ряд 3-лечение инфекционного процесса биоспорином, 4- лечение инфекционного процесса субги-лактом

Сравнение результатов действия трех указанных пробиотиков на подопытных животных с экспериментальными моделями кишечных инфекций и дисбактериоза дает основание предположить, что более высокая эффективность комплексного пробиотика субтилакта объясняется тем, что данный препарат получен на основе бактерий микроорганизмов, дополняющих и усиливающих терапевтическую эффективность, присущую каждому из них. Важно отметить, что совместное применение бактерий Ъ. р1аШагит и В. эиЫШя позволяет снизить терапевтическую дозу в 1000 раз по сравнению с биоспорином и другими известными пробиотиками.

Отметим, чгго бактерии штамма Ь. р1ап1агиш 8Р-АЗ,входящие в состав нового препарата, оказывают заместительное действие на микрофлору слизистой кишечника, они обладают выраженной адгезивностыо к поверхностным структурам эпителиальных клеток кишечника и обеспечивают формирование полноценной защитной биопленки слизистой кишечника. Адгезивность бактерий, на наш взгляд, является важным фактором в колонизации слизистых оболочек макроорганизма. Заселяя слизистую оболочку кишечника, лакгобациллы создают на ее поверхности среду, благоприятную для роста и размножения бифидобактерий. Кроме того, молочнокислые бактерии проявляют высокую активность кислото-образования, что создает неблагоприятные условия для жизнедеятельности патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Механизм действия лакгобактерий штамма Ь. р1ап1агшп 8Р-АЗ обусловлен также продукцией антибиотиков, бактериоцинов, лизоцима, активацией лактопе-роксидазы. Важно отметить, что под влиянием данных бактерий происходит стимулирование фагоцитарной активности макрофагов и, особенно, нейтрофилов, их перекисных систем, что приводит к повышению неспецифической резистентности организма.

Антимикробная активность В. БйЫШв 3 связана с высокой антагонистической активностью в отношении многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Бациллы штамма В. ¡зчЫШб 3 продуцируют комплекс веществ полипептидной, амияогликозидной, полиеновой и другой природы, они обладают разносторонней ферментативной активностью, благодаря чему проявляется не только их антимикробное действие, но и компенсаторное участие в процессах кишечного пищеварения.

Перечисленные биологические свойства бактерий штаммов В. виЫШз 3 и Ь. р1ап1агшп 8Р-АЗ определяют механизм действия экспериментального образца нового пробиотика. Совместное применение данных бактерий обеспечивает одновременное воздействие препарата на различные факторы и звенья патогенетического процесса, в результате чего комплексная бактериотерапия является более эффективной.

При оценке безвредности экспериментального образца препарата определили, что бактериальные культуры В.зцЫШб 3 и Ь. р1агйагит 8Р-АЗ в составе

данного образца не оказывали какого либо токсического действия на внутренние органы белых мышей и морских свинок. Препарат не вызывал видимых признаков патологического воздействия на организм лабораторных животных при различных способах введения и в максимальных дозах.

Изучение лечебно-профилактической эффективности при диспепсии у цыплят и телят показало, что субтилакт, приготовленный по разработанной технологии, в опытных группах подопытных животных показал высокую эффективность Применение препарата субтилакт обеспечивало 100% лечебно-профилактическую эффективность у телят в дозе 3,2»107 клеток при двукратном использовании препарата в течение 7 дней.

Для профилактики и лечения цыплят использовали субтилакт в дозе 6,7»104клеток 2 раза в день в течение 7 суток. Эффективность препарата, при этом, составляла 90%. Полученные данные позволяют сделать заключение, что новый препарат эффективен при профилактике и лечении диспепсии молодняка сельскохозяйственных животных и птиц.

ВЫВОДЫ

1. На основании выполненных теоретических исследований обоснована возможность и целесообразность создания нового пробиотика на основе бацилл В. виЫШз и лактобакгерий.

2. Теоретически обоснованы критерии отбора культур для производства пробиотических препаратов. По результатам выполненных исследований, предложены для включения в состав нового пробиотика культуры штаммов В. зчЫШб 3 и Ь. р1аМагит 8Р-АЗ.

3. Изучены культурально-морфологические, физиолого-биохимические свойства выбранных культур, определены оптимальные концентрации бактериальных культур в экспериментальном образце препарата. Количество живых клеток в готовом образце препарата составляет (2,9+0,7)»106кл»см~3 В. зиЫШэ 3 и (5,2+0,8). 10бкл«см"3 Ь. р1аШагит 8Р-АЗ.

4. В лабораторных условиях отработана технология получения биомассы бактериальных клеток Ь. р1аШагиш 8Р-АЗ меюдом глубинного культивирования. Использование глубинного метода культивирования позволяет сократить в 3 раза продолжительность выращивания микроорганизмов и в 10 раз увеличить объем выпуска препарата, снизить себестоимость производства в 8 раз и трудозатраты на 30%.

5. Результаты исследований на лабораторных и сельскохозяйственных животных показали высокую терапевтическую эффективность экспериментального образца препарата при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах. Применение субтилакта на экспериментальных моделях кишечных инфекций и дисбакгериоза обеспечивает выздоровление подопытных животных, нолную санацию организма от возбудителя, быструю нормализацию микробиоценоза кишечника. Совместное применение бактерий В. БиЫШв 3 и Ь. р1ап1агит 8Р-АЗ позволяет снизить терапевтическую дозу в 1000 раз по сравнению с биоспори-ном и лактобакгерином.

6. Установлено, что экспериментальный образец нового пробиотика оказывает стимулирующее влияние на показатели нсспецифического иммунитета,

что приводит к повышению защитных функций организма экспериментальных животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При производстве препарата субтилакг рекомендуется использовать технологию глубинного выращивания культур В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ.

2. Комплексный бактерийный препарат рекомендуется использовать для регуляции микробиоценоза и неспецифической иммуностимуляции при лечении кишечных инфекций и дисбактериозов кишечника, в том числе отличающихся затяжным и хроническим течением.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Критерии оценки свойств музейных штаммов, используемых для производства лечебно-профилактических препаратов, экобиопрепаратов и препаратов военно-технического назначения. Отчет о НИР./ ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Научные уководители Васильев П.Г., Забокрицкий А.Н.- 2000.- Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-446.

2. Оценка возможности выделения Б AB при производстве "Биоспорина" и создания на их основе новых лекарственных средств для медицинского обеспечения войск в экстремальных ситуациях. Отчет о НИР./ ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Научные руководители Литусов Н.В., Забокрицкий А.Н.-2001,- Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д- Д-482.

3. ЗотоваН.В., Грачев А.Ю., Плохушко E.H. Влияние биоспорина и БАВ, продуцируемых бациллами, на показатели иммунитета при экспериментальном дисбактериозе кишечника./ Сборник материалов научной конференции ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ - Екатеринбург, 2002.

4. Ларионов Л.П., Литусов Н.В., Зотова Н.В., Плохушко E.H., Васильев П.Г. Влияние биологически активных веществ, продуцируемых бациллами, на некоторые показатели иммунитета.// Иммунология Урала (Материалы I Конференции иммунологов Урала, 4-6 декабря 2001 г. Изд-во «Здравоохранение Урала», г. Екатеринбург.).-2001.-№1.-С.132.

5. Плохушко E.H., Ларионов Л.П., Литусов Н.В., Забокрицкий А.Н., Васильев П.Г. Влияние лактобактерий, перспективных для создания новых про-биотиков, на неспецифическую резистентность организма.// Иммунология Урала (Материалы II Конференции иммунологов Урала, 9-12 сентября 2002 г. Изд-во «Здравоохранение Урала», г. Пермь.).-2002,- №2.-С.13-14.

6. Совершенствование методов изучения и сохранения промышленных штаммов музейной коллекции./ ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Научный руководитель Забокрицкий А.Н.- 2002,- Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-595.

7. Изучение возможностей получения новых пробиотиков и оценка их лечебно-профилактической эффективности при актуальных для ВС РФ инфекционных заболеваниях различной бактериальной и вирусной этиологии./ ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Научные руководители Васильев П.Г., Забокрицкий А.Н.- 2002,- Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-597.

8. Плохушко E.H., Литусов Н.В., Ларионов Л.П., Забокрицкий А.Н.,

Васильев П.Г. Экспериментальные исследования по обоснованию возможности использования бактерий видов Lactobacillus plantarum и Bacillus subtilis для создания нового лечебно-профилактического препарата.//Актуальные проблемы теоретической и прикладной медицины / Под ред. Черешнева В.А. - Екатеринбург, 2003. - С. 67-70.

9. Плохушко Е.Н., Литусов Н.В., Ларионов Л.П., Забокрицкий А.Н., Васильев П.Г. Изучение возможности длительного хранения лактобактерий методами контактно-сорбционного обезвоживания и лиофильного высушива-ния.//Актуальные проблемы теоретической и прикладной медицины / Под ред. Черешнева В.А. - Екатеринбург, 2003. - С.70-71.

10. Чупринина Р.П., Плохушко Е.Н., Литусов Н.В., Забокрицкий А.Н., Васильев П.Г., Грязнева Т.Н. Оценка эффективности экпериментального образца нового бактерийного препарата при лечении дисбактериозов // Биотехнология (в печати).

Заказ № 36. Подписано к печати 25.03.2003 г. 1,25 пл. Тираж 100 экз. Типография ВНИВИ Минсельхоза РФ, г. Казань, Научный городок, 2

2_ooj -fi ¡

~ёгИ \

- ,6794

\

M

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Плохушко, Елена Николаевна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Современное состояние проблемы пробиотиков.

2.1.1. Общая характеристика пробиотиков.

2.1.2. Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков.

2.1.3. Критерии оценки свойств бактериальных культур, используемых для производства лечебно-профилактических препаратов.

2.1.4. Композиционный состав пробиотиков.

2.2. Видовая характеристика бактерий родов Lactobacillus и Bacillus.

2.3. Краткая характеристика технологии получения пробиотиков.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Микроорганизмы.

3.2 Методы исследований.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Биологическая характеристика штаммов, входящих в состав экспериментального образца нового пробиотика.

4.1.1. Изучение биологических свойств культур штаммов микроорганизмов из музейной коллекции. Оценка возможности их использования для производства нового пробиотика.

4.1.2. Изучение биологических свойств культуры штамма

Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ.

4.1.3. Изучение биологических свойств культуры штамма Bacillus subtilis 3.

4.1.4. Оценка влияния бактерий видов В. subtilis 3 и L. Plantarum 8Р-АЗ на неспецифическую резистентность организма.

4.2. Сохранение культур штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и В. subtilis 3 в жизнеспособном и активном состоянии.

4.3. Конструирование экспериментального образца нового препарата

4.4. Испытания экспериментального образца бактерийного препарата субтилакт на основе культур штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и В. subtilis 3 ^

4.4.1. Определение специфической активности экспериментального образца препарата.

4.4.2. Изучение безопасности экспериментального образца бактерийного препарата на основе культур штаммов В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ.

4.4.3. Влияние субтилакта на микробиоценоз кишечника птиц и телят ^^ 5 .ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка нового пробиотика на основе бактерий видов Lactobacillus plantarum и bacillus subtilis"

В последние годы в Российской Федерации наблюдается нарастание неблагоприятных социальных, экологических и других факторов, что существенно влияет на ухудшение эпидемической ситуации. Одним из закономерных следствий такого положения является увеличение числа инфекционных заболеваний, в том числе кишечных инфекций и дисбактериозов /1,2,3,4/.

Острые кишечные инфекции в настоящее время остаются одной из актуальных и важных проблем инфекционной патологии. По данным Центра Госсанэпиднадзора Министерства здравоохранения РФ за период с 1998 года по декабрь 1999 года заболеваемость, в частности, сальмонеллезами увеличилась на 3 %, острыми кишечными инфекциями, вызванными неустановленными возбудителями -на 39,37%, шигеллезом - на 89,36% /5/. В 2000г. и 2001г. отмечена тенденция к снижению заболеваемости кишечными инфекциями, в 2002г. их увеличение. В целом по стране за 2002г. было зарегистрировано 16 вспышек острых кишечных инфекций. Особое внимание на себя обращают так называемые инфекции с неустановленной этиологией, на долю которых приходится более 50% заболевших /6/.

По данным Центрального научно-исследовательского института Эпидемиологии Минздрава Российской Федерации, увеличивается также и количество инфекционных заболеваний, отличающихся затяжным и хроническим течением, которые вызываются условно-патогенными возбудителями /6/.

Необходимо обратить внимание на то, что, по данным Российской Академии медицинских наук, почти 90 % населения России страдает кишечными дис-бактериозами. Широкое распространение дисбактериозов, в свою очередь, способствует развитию ряда других рецидивирующих инфекционных заболеваний, а также иммунодефицитов и аллергопатий. Нелеченные дисбактериозы сопровождаются морфологическими и функциональными нарушениями не только в пищеварительной, но и в иммунной, урогенитальной и дыхательной системах организма. Анализ данных литературы показал, что проблема кишечных инфекций и дисбактериозов не менее актуальна и в ветеринарии /7-12/. Патологии ЖКТ, клинически проявляющиеся диарейным синдромом, в общей структуре заболеваний молодняка животных составляют 75%, падеж поросят от желудочно-кишечных болезней достигает 40-50% от числа родившихся. В промышленном птицеводстве России желудочно-кишечные болезни занимают второе место в общей структуре заболеваемости птиц/10/.

Положительные результаты в борьбе с кишечными инфекциями и дисбак-териозами могут быть достигнуты лишь при условии решения целого комплекса лечебно-профилактических, противоэпидемических и санитарно -гигиенических мероприятий. Особое внимание должно быть уделено совершенствованию имеющихся, разработке и внедрению новых эффективных медицинских препаратов /13/.

В настоящее время в практике лечения и профилактики острых кишечных инфекций и дисбактериозов все более широкое применение находят медицинские бактериальные препараты (пробиотики), созданные на основе культур различных микроорганизмов: кишечных палочек, бифидобактерий, лактобактерий и аэробных спорообразующих бактерий. В терапии острых кишечных инфекций наиболее распространены такие препараты как севакол, колифлорал, колибактерин, би-фидумбактерин, бификол, ацилакт, лактобактерин, бактисубтил, биоспорин, фло-нивин и др. Из медицинской практики известно, что некоторые из таких преп аратов обладают недостаточной эффективностью при определенных формах дисбактериозов, а также при тяжелых формах острых кишечных инфекций, вызва н-ных стафилококками, кандидами и сальмонеллами /13,14/. При применении про-биотиков на основе бацилл всегда следует помнить, что культуры некоторых штаммов в больших дозах способны вызывать у людей инфекционные процессы различной тяжести (до эндокардитов) и, что вопросы кинетики и длительной пер-систенции бацилл в организме человека до настоящего времени не в теоретическом, не в практическом плане не изучены (Kiss Т., Gratwohl A., Frei R., Oggioni M.R., Pozzi G., Valensin P.E., Thomas M., Mhitter H., Velasco E., Wallet F., Crunelle V. et all). Необходимо отметить, что существующие пробиотики не реализуют в своем составе всего комплекса механизма пробиотического действия, что снижает их эффективность.

Целью настоящей работы является разработка нового пробиотика на основе бактерий видов Lactobacillus plantarum и Bacillus subtilis.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи:

- провести теоретические исследования по выбору перспективных микроорганизмов для включения в состав нового пробиотика;

- определить критерии оценки свойств бактериальных культур, использу е-мых для производства лечебно-профилактических препаратов; всесторонне изучить культурально -морфологические, тинкториальные, фи-зиолого-биохимические и другие биологические свойства выбранных культур штаммов; определить терапевтическую эффективность экспериментального образца препарата при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах у лабораторных и сельскохозяйственных животных, а также его влияние на показатели неспециф и-ческой резистентности макроорганизма.

Научная новизна работы. Теоретически и экспериментально обоснованы и выбраны культуры штаммов для включения в состав нового пробиотика; определены оптимальные концентрации бактериальных культур компонентов в экспериментальном образце.

Отработана технология получения нового препарата, изучена его терапе в-тическая эффективность на лабораторных и сельскохозяйственных животных и представлены рекомендации по его дальнейшему использованию.

Основные научные положения и результаты исследований, выносимые на защиту:

Композиционный состав биопрепарата, включающий бактерии видов L. plantarum и В. subtilis в соотношении 1:2, пригоден для создания нового высокоэффективного пробиотика.

Комплексный биопрепарат может быть использован для регуляции микробиоценоза и неспецифической иммуностимуляции при лечении кишечных инфекций и дисбактериозов кишечника, в том числе отличающихся затяжным и хроническим течением.

Практическая ценность работы. Разработана технология получения нового препарата из глубинных культур L. plantarum и В. subtilis. По результатам исследований разработаны: инструкция по приготовлению и контролю качества препарата субтилакт, утвержденная директором ВНИВИ Минсельхоза РФ и начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ; сборник лабораторных методик по выделению, изучению биологических свойств и поддержанию культур лактобактерий, утвержденный директором ВНИВИ Минсельхоза РФ и начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ ; заявка на патент «Способ получения сухого препарата на основе бацилл и лактобацилл для лечения и профилактики диспепсии у крупного рогатого скота».

Исследования проведены в рамках плановой тематики научно-исследовательских работ Центра ВТП БЗ НИИМ (темы №№ О -99-94У-С, 0-99-42У-С, 0-01-35У-С, 0-01-39У-С) в период с 1999 по 2002 г.г.

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста (с полуторным интервалом), иллюстрирована 8 рисунками, 21 таблицами, состоит из списка сокращений единиц и терминов, введения, обзора литературы, выбора направления исследований, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и заключения. Литературный указатель содержит 117 источников, включая работы отечественных и зарубежных авторов.

Автор глубоко признательна руководству ВНИВИ и Центра ВТП БЗ НИИМ МО РФ за предоставленную возможность обобщить результаты проведенных теоретических и экспериментальных исследований в виде кандидатской диссертации, научному руководителю доктору ветеринарных наук Садыкову Нариману Султановичу, научному консультанту кандидату медицинских наук Забокрицк ому Александру Николаевичу, а также доктору биологических наук Васильеву Петру Геннадьевичу, оказавшим консультативную и практическую помощь при оформлении настоящей работы. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ВНИВИ и Центра ВТП БЗ за ценные советы и замечания, высказанные в процессе подготовки диссертации.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Плохушко, Елена Николаевна

6. ВЫВОДЫ

1. На основании выполненных теоретических исследований обоснована возмо ясность и целесообразность создания нового пробиотика на основе бацилл В. subtilis и лактобактерий.

2. Теоретически обоснованы критерии отбора культур для производства проби о-тических препаратов. По результатам выполненных исследований, предложены для включения в состав нового пробиотика культуры штаммов В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ.

3. Изучены культурально-морфологические, физиолого-биохимические свойства выбранных культур, определены оптимальные концентрации бактериальных культур в экспериментальном образце препарата. Количество живых клеток в готовом обра з

6 3 6 3 це препарата составляет (2,9+0,7)» 10 кл»см" В. subtilis 3 и (5,2+0,8)»10 кл*см" L. plantarum 8Р-АЗ.

4. В лабораторных условиях отработана технология получения биомассы бакт е-риальных клеток L. plantarum 8Р-АЗ методом глубинного культивирования. Испол ь-зование глубинного метода культивирования позволяет сократить в 3 раза продолжительность выращивания микроорганизмов и в 10 раз увеличить объем выпуска препарата, снизить себестоимость производства в 8 раз и трудозатраты на 30%.

5. Результаты исследований на лабораторных и сельскохозяйственных животных показали высокую терапевтическую эффективность экспериментального образца препарата при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах. Применение субт и-лакта на экспериментальных моделях кишечных инфекций и дисбактериоза обесп е-чивает выздоровление подопытных животных, полную са нацию организма от возбудителя, быструю нормализацию микробиоценоза кишечника. Совместное примен е-ние бактерий В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ позволяет снизить терапевтическую дозу в 1000 раз по сравнению с биоспорином и другими известными^эобиотиками.

6. Установлено, что экспериментальный образец нового пробиотика оказывает стимулирующее влияние на показатели неспецифического иммунитета, что прив о дит к повышению защитных функций организма экспериментальных животных.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При производстве препарата субтилакт рекомендуется использовать техн о-логию глубинного выращивания культур В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ.

2. Рекомендуется использовать комплексный бактерийный препарат для per у-ляции микробиоценоза и неспецифической иммуности муляции при лечении кише ч-ных инфекций и дисбактериозов кишечника, в том числе отличающихся затяжным и хроническим течением.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Плохушко, Елена Николаевна, Казань

1. Шевченко Ю.Л. Роль современных факторов во взаимодействии человека и микроорганизмов. Значение национального здравоохранения в профилактике и лечении инфекционных болезней // Журн. микробиол. 2000. - № 6. - С.З.

2. Бойко А. В. Этиологическая структура острых кишечных инфекций, вызванных не холерными вибрионами, в дельте Волги //Журн. микробиол. 2000. - № 1. — С. 1517.

3. Карцев А.Д. Цикличность и прогнозирование заболеваемости шигеллезами в России // Журн. микробиол. 2000. - № 1. - С.57.

4. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь декабрь 1997 года // Эпидемиология и инфекционные бол езни. 1998. - № 3. - С. 63-64.

5. Инфекционная заболеваемость в РФ за январь декабрь 1999 года // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2000. - № 4. - С. 55.

6. Фролочкина Т.И. Вспыпки под надзором // Фармацевтический вестник. -2002.- №23. С.22.

7. Щербаков П.Н., Гусев А.Г. Профилактика и лечение при желудочно -кишечных и респираторных болезнях телят // Ветеринария 2002. - №3. - С. 15.

8. Субботин В.В. Влияние бифацидобактерина на кишечную микрофлору пор о-сят // Ветеринария 1998. - №5. - С.24.

9. Раицкая В.И. Новые препараты для лечения желудочно -кишечных болезней телят. // Ветеринария 2001. - №5. - С. 14.

10. Новые пробиотические препараты ветеринарного назначения: Автореф. дисс. докт. биол. наук / Малик Н.И. М.,2002.

11. Джупина С.И. Факторные инфекционные болезн и животных. // Ветеринария -2001. -№3.-С.6.

12. Тараканов Б.В., Николичева Т.А. Пробиотический потенциал Lactobacillus са-sei при выращивании телят// Ветеринария 2001 - №3. - С.46.

13. Литусов Н.В., Поберий И.А. и др. // Перспективы использования эубиотика "Биоспорин" в практике здравоохранения и военно -медицинской службы Екатеринбург. - 1997. - С.6-10.

14. Лобзин Ю.В., Позняк А.Л., Добрынин В.М., Захаренко С.М. Дисбактериозы при острых кишечных инфекциях. СПб, 1997.

15. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора кишечника и некоторые вопросы микроэкологической токсикологии // Антибиотики и медицинская биотехнология. -1987,- №3.- С. 164-170.

16. Гончарова Г. И., Дорофейчук В. Г., Смолянская А.З., Соколова К.Я. Микро б-ная экология кишечника в норме и при патологии // А нтибиотики и химиотерапия. -1989. 34, № 6.С. 462-466.

17. Tannock G. М. The Normal Microflora New Conctpts in Health Promotion // Micr-jbiologinal Scinees. 1988. - Vol.5.

18. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. Лактофлора и колониз а-ционная резистентность // Антибиотики и мед. биотехнол. 1987. - 32, № 3. - С. 173179.

19. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестник РАМН. 1997. -№ 3. - С. 7-10.

20. Тараканов Б. В. Механизм действия пробиотиков на микрофлору пищевар и-тельного тракта и организм животных // Ветеринария. 2000 - № 1. - С. 47-54.

21. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактери о-зы актуальная проблема медицины // Вестник РАМН - 1997. - № 3. - С. 4-7.

22. Ruchim M.A., Makino D. Volatile Fatty Acids degradation By Human Fecal Suspensions // Gastroenterol.- 1984. Vol.86.

23. Бароновский А.Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. -СПб.,2000.

24. Шендеров Б.А. Медицинская микробн ая экология и функциональное питание. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. М., 1998.

25. Коршунов В. М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника // Журн. ми к-робиол. 1995. - № 3 . - С. 48-55.

26. Микроэкологические нарушения при экспериментально м дисбактериозеи роль бактерицидных систем клеток организма хозяина: Автореф. дисс. канд. биол. наук / Патрушева Е.В. Волгоград.,2000

27. Петровская В. Г., Марко О. П. Микрофлора человека в норме и патологии. ■ М., Медицина, 1976.

28. Пинегин Б. В., Коршунов В. М., Мальцев В. Н. Дисбактериозы кишечника. ■ М., Наука, 1984.

29. Эпидемиология и инфекционные болезни. 1997. - №5. - С. 7.

30. Гончарова Г.И., Семенова Л.П., Лянная А.М. и др. Бифидофлора человека, ее нормализующеие и защитные функции // Антибиотики и мед ицинская биотехнол о-гия. 1987.-№3.-С. 179.

31. Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А., Осадчая А.И. и др. Влияние живых культур Bacillus subtilis на неспецифическую резистентность организма // Микробиол. журн. 1996. -№ 2.- С.46-55.

32. Шендеров Б.А. Значение колонизационной резистентности в патогенезе инфекционных заболеваний // Иммунология инфекционного процесса. М., 1994. - С. 112-121.

33. Николаева И.В., Бондаренко В.М., Анокин В.А. и др. Частота колонизации стафилококками кишечника у детей с явлениями дисбактер иоза // Журн. микробиол. -2000. -№ 1.-С.17.

34. Шендеров Б. А., Маквелова М.А., Степанчук Ю.Б., Скиба Н.Э. Пробиотики и функциональное питание // Антибиотики и химиотерапия. 1997. - №7.- С.30-34.

35. Аутофлора человека в норме и патологии / Под ред. Блохиной И.Н., Соколовой К.Я. Горький, 1988.

36. Банникова Л.А., Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические осн о-вы молочного производства. М., 1987.

37. Коршунов В.М., Ефимов Б.А., Пикина А.П. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функциолального питания и коррекции микр о-флоры кишечника / Журн. микробиол., -2000.-№3.-С.86-91.

38. Кругликов В.Д., Цураева Р.И., Рыжков И.В. и др. Возможность приживления Lactobacillus acidophilus в кишечнике белых мышей на фоне бактериальной терапии // Ж. микробиол. 1997. - № 1. - С. 67-69.

39. Коршунов В.М., Кафарская Л.И., Володин Н.Н. и др. Коррекция дисбиотич е-ских нарушений вагинальной микрофлоры с помощью препарата из высокоадгези в-ных лактобактерий // Журн. микробиол. -1990.- № 7. С. 17-19.

40. Воробьев А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологич е-ские свойства, защитные функции // Журн. микробиол. 1999.- №6. - С. 102-105.

41. Коваленко Н.К. Бактериоциногенная и лизоцимсинтезирующая активность молочнокислых бактерий // Микробиол. журн. 1999,- №6.- С.42.

42. Квасников Е.И., Нестеренко О. А. Молочнокислые бактерии и пути их испол ь-зования. М., 1975.

43. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев: Наукова думка, 1982.

44. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Сорокулова И. Б., Самгородская Н.В., Тофан А. В. Современные представления о механизмах лечебно -профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus // Микробиол. журн. 1993. - №4. - С. 92-112.

45. Егоров Н.С., Баранова И.П. Бактериоцины. Образование, свойства, примен е-ние // Антибиотики и химиотерапия. — 1999. №6. - С.33.

46. Филиппов В.А. Некоторые свойства бактериоцинов лактобацилл подрода Streptobacterium // Антибиотики. 1980. - №11. - С.837.

47. Шаталов Е.В. Сравнительная характеристика влияния некоторых иммуном о-дуляторов на показатели неспецифической защиты организма и структуру популяций возбудителей при смешенных инфекциях// Журн. микробиол. 1996. - №3. - С.• 54.

48. Бондренко В.М., Рубакова Э.И., Лаврова В.А. Иммуностимулирующее дейс т-вие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов робиотиков // Журн. микробиол.- 1998.-№5.-С. 107-112.

49. Лопатина Т.К., Бляхер М.С., Николаенко В. Н. Иммуномоделирующее дейс т-вие препаратов-эубиотиков. // Вестник РАМН. М., 1997. - № 3. - С. 30-34.

50. Резник С.Р., Смирнов В.В., Волынец А.К., Вьюницкая В.А. Влияние перорал ь-ного введения бактерий рода Bacillus на фагоцитарную активность лейкоцитов крови //Микробиол. журн. 1982. - 44, № 4. - С. 51-54.

51. Бляхер М. С., Лопатина Т. К., Фёдорова И. М. Характер влияния биоспорина на некоторые показатели иммунитета // Проблемы инфекционны х болезней. Сб. статей, посвящ. 100-летию со дня рождения Г.Н. Габрического. М., 2000. - С. 2327.

52. Карсонова М.И., Андронова Т.М., Пинегин Б.В., Хаитов P.M. Иммуностим у-лирующая активность мурамилдипептида // Журн. микробиол. -1999.-№3.-С.105.

53. Пикина А.П., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Первичный скрининг штамов биф и-добактерий и лактобактерий с целью разработки на их основе эффективных препар а-тов пробиотиков. //Журн. микробиол. - 1999. - №6. - С.34-36

54. Коршунов В.М., Уртаева З.А., Смеянов В.В. Изучение антагонистической активности бифидобактерий in vitro и in vivo с использованием гнотобиологической технологии // Журн. микробиол. 1999. - №5. - С.72-74.

55. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микрооргазмов. М., 1987.

56. Руководство по вакцинному и сыворо точному делу / Под ред. Бургасова П.Н. -М., 1978.

57. Штамм бактерий Bifidobacterium adolescentis 2Ф1 для приготовления бакпре-паратов, нормализующих микрофлору при нарушениях микробиоценоза: Пат.2148640 Россия, МПК7 С12 N1/20, А61К 35/74/ Коршунов В.М., Гудеева З.А., Ефимов Б.А. и др. Заявл. 09.07.98.

58. Серженко С.В., Филатов Н.Н. Опыт применения бифидумбактерина для пр о-филактики острых респираторных вирусных инфекций в детских дошкольных учр е-ждениях Москвы // Журн. микробиол. 1993. - №6. - С.61.

59. Коршунов В.М., Кисина Е.В., Иконникова Т.Б. Влияние препаратов из лакт о-бацилл и бифидобактерий на микрофлору кишечника мышей, облученных у квантами //Журн. микробиол. - 1980. - №6. - С. 47-54.

60. Бардых И.Д., Круглинов В.Д., Мазрупо Б.Л. Экспериментальная оцен ка эффективности лактобацилл для профилактики и лечения холеры // Журн. микробиол. 2001. - №2. - С.68.

61. Бляхер М. С., Поспелова В. В., Лопатина Т. К. Сравнение разных лекарстве н-ных форм ацилакта по их влиянию на иммунную систему // Проблемы инфекцио н-ных болезней. Сб. статей, посвящ. 100-летию со дня рождения Г.Н. Габрического. -М„ 2000.-С. 27-31.

62. Получение антибиотикоустойчивых штаммов бифидобактерий и лактобацилл и изучение их биологических свойств: Автореф. дисс. канд. мед.наук / Иванова И.П. -М„ 1981.

63. Воспяков В.Г и др. Гликопептиды лактобацилл регуляторы гемопоэза и иммунитета: Доклад на 8 Международной конференции, С -Пб // "ВИЧ/СПИД и родств. пробл." - 2000, - №1. С. 31,32, 156

64. А.С. 1710575 А1 СССР, МКИ5 С 12 N 1/29, А61 К 35/74. Штамм бактерий Bacillus sp. компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергии / Л.И.Никитенко, В.И.Никитенко (СССР). - Опубл. 07.02.92, Бюл. № 5.

65. Штамм бактерий В. breve Р2 для приготовления бакпрепаратов, нормализу ю-щих микрофлору: Пат. 2148639 Россия, МПК7 С12 N 1/20, А61К 35/74/Гудеева З.А. Заявл. 09.07.98.

66. Смирнов В. В., Резник С. Р., Вьюницкая И. А. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus // Микробиол. журн. 1993. - Т. 54, № 6. - С. 82-94.

67. Поберий И.А., Харечко А.Т., Садовой Н.В., Литусов Н.В. Новый комплексный эубиотик "Биоспорин" для детей и взрослых // Уральское медицинское обозрение "Здравоохранение Башкортостана". 1998. -№ 1. - С. 97-99.

68. Белявская В.А., Кашперова Т.А., Сорокулова И.Б. Экспериментальная оценка безопасности генно-инженерных бактерий на модели штамма В. subtilis, продуцирующего интерферон //Журн. микробиол. 2001. - №2. - С. 16-20.

69. Killen М. Klatnhammtr Т. Genetic modification of intestinol lactobacilli and bifi-dobfcteria // J. Mol.Biol. 2000. - № 2. - P. 41-50.

70. Вельков В.В. Интродукция генетически модифицированных микроорганизмов в окружающую среду. Перспективы и риск // Генетика 1994. - №5. - С.581-592.

71. Банникова Л. А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в моло ч-ной проышленности. -М., 1987.

72. Gopal P. In vitro adherence properties of L. rhamnosus DR20 and B. lactis DR10 strains and thtir antagonistic activity against an enterotoxigenic E. coli // Int J. Food Microbiol.- 2001. №5. - P. 207-216.

73. Лихачева А,Ю., Бондаренко B.M., Соколова К.Я. Современное состояние в о-просатаксономии бактерий рода LACTOBACILLUS //Журн. микробиол. № 9-10.

74. Блохина И.Н., Бондаренко В.М., Лихачева А.Ю. Традиционная классификация и геносистематика бактерий рода LACTOBACILLUS // Журн. микробиол. 1995,-№4. - С. 19-23.

75. Резник С.Р., Слабоспицкая А.Т., Смирнов В.В. Некоторые биологические свойства бактерий рода Bacillus, выделенных из организма людей // Микробиол. журн. 1985. - 47, № 3. - С. 53-59.

76. Бациллы. Генетика и биотехнология / Пер. с англ. под ред. Харвурда. М., 1992.

77. Егоров Н.С. Промышленная микробиология. М ., 1890. С.570.

78. Fleuring Н. P., Ordal Z. J. Responses of В. subtillis spores to ionic environments during sporulation and germination/ J. Bacterial.- 1964, v.88,'6.-p. 1529-1537.

79. Hanson R. S., Spinivasan V. R. and Halvorson H. O., 1963, Biochemistry of sporulation. I. Metabolism of acetate by vegetative and sporulating cells, T. Bacteriol. 1985.-P.451-460.

80. Harrison О. E. F. Physiological effest of dissolved oxygen tension and redox potential on growing populations of microorganisms T. Appl. Chem. Biotechnol. 1972.-V223.-P.-417-440.

81. Horkins T. R. Feed-on-demand control of fermentation by cyclic changes in dis-* solved oxygen tenson // Biotechol. and Bioeng., -1981.-V.23.-P.2137-2143.

82. Nakata H.M. and Halvorson H.O., 1960, Biochemical changers occurring during growth and sporulation of Bacillus cereus. T.Bacteriol.-1980.-P. 801-810.

83. Neilson N.E., Macgnillan M.F., Campbele L.L. Grout studies on B. stearothermi-phillus// Canad. J.Microbiol.-1959,- V.6.-P.293-298.

84. Емцева Т.В. Влияние источников углерода и азота, добавок витаминов группы В на биосинтез щелочной протеазы штаммами B.mesenthericus и В. subtilis // Прикладная биохимия и микробиология. 1975.- №3.- С.391.

85. Лабораторный регламент. Биоспорин сухой /ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. 1993. - Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Инв.№ 373/3 -ДСП.

86. Методические рекомендации по изучению биологических свойств бактерий рода Bacillus.- М., 1998.

87. Фармакопейная статья. Бифидумбактерин сухой. ФС 42 -132ВС-88.

88. Сборник методик /ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. 2002. - Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ.

89. Стандарты предприятия /ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. 1999. - Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Инв.№ 401 -ДСП.

90. Отчет о НИР (заключительный) / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководитель 3 а-бокрицкий АН. 2002. - Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ.

91. Price К. Inhibition of Pseudomon species by hydrogen peroxide producing lactoba-cilli.// Т/ Milk Food Technol. 1970. - №3. - P. 13.

92. Reiter B. Laktoperoxidase antibacterial system // T. Food Prof. 1984. - №4. -P.324.

93. Коваленко H.K., Касумова C.A. Лизоцимсинтезирующая активность энтер о* кокков и лактобацилл // Микробиол. журн. 19 96.- №6.-С. 12.

94. Харечко А.Т., Садовой Н.В., Поберий И.А., Литусов Н.В., Филин В.А. Ос о-бенности роста и развития бактерий на плотных и в жидких питательных средах. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Инв.№ 961В, 1996.

95. Войно-Ясенецкий М. В. Биология и патология инфекционны х процессов. Л., Медицина, 1981.

96. Павлович С. А. Основы иммунологии. Минск, 1997.

97. Кашин В.Н. Нетрадиционная иммунология инфекций. Пермь, 1996.

98. Аркадьева З.А. Методы хранения культур микроорганизмов.// Метаболизм микроорганизмов / Под ред. Егорова Н.С. М.,1986. - С.57-64.

99. Куплетская М.Б., Аркадьева З.А. Методы длительного хранения коллекцио н-ных микрорганизмов кафедры микробиология МГУ // Микробиол о-гия.1997.№2.С.283.

100. Опарин Ю.Г. Повреждение и защита биоматериалов при замораживании и лиофилизации // Биотехнология. 1996. №7. - С.З.

101. Аркадьева З.А. Факторы, влияющие на жизнеспособность и свойства микроо р-t ганизмов при различных методах хранения. // Биологические науки. №4. - С. 93105.

102. ГОСТ 9525-84. Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа. Дополнение ГК от 1992года.

103. Ушаков Р.В., Царев В.Н., Ушаков Т.В. Стандартный тампон для количестве н-ных исследований смешанной анаэробно -аэробной микрофлоры //Лабораторное д е-ло.-1991-№7.- С.69-71

104. Государственные испытания и регистрация новых медицински х иммунобиологических препаратов: Санитарные правила. М.: Информационно-издательский центр М инздрава России, 1998.

105. Разработка нового экспериментального препарата из молочнокислых бактерий L. plantarum 8Р-АЗ: Автореф. дисс. канд. мед. наук / Красик Пермь, 1974.it

106. ЦЕНТР ВОЕННО-ТЕХНИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИ™ CKcS?*™ ЗАЩИТЫ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ИНСТИТУТА МИКРОБИОЛОГИИ МО РФ1. Экз.№ ✓

107. УТВЕРЖДАЮ ЗАМЕСТИТЕЛЬ НАЧАЛЬНИКА ЦЕНТРА , ПО НАУЧНОЙ РАБОТЕ доктор технических наук старший научный1. V- V^ мая 2002г.

108. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО ПЕРСПЕКТИВАМ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НОВЫХ

109. НАЧАЛЬНИК НИУ-3 доктор биологических наук старший научный сотрудник

110. НАЧАЛЬНИК 17 ОТДЕЛА кандидат медицинских наук старший научный сотрудник1. W11. П.Васильев1. JfiM1. А.Забокрицкий1. Екатеринбург 2002137 Приложэниэ 21. УТВЕРЖДАЮ УТВЕРЖДАЮ

111. Начальник Центра военно-технических Директор Всероссийского научногроблем биологической защиты . исследовательского ветеринарного

112. НИИ микробиологии МО РФ института Минсельхоза РФп© ппрщиготозлкешишю шробэдшшчсскош Ервзшряпга субтшпяшет

113. НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ РАБОТЫ

114. Ведущий научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института Минсельхоза РФ доктор ветеринарных наук

115. Начальник научно-исследовательского управления Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ доктор биологических наук старший научный сотрудник ■ л/1. Начальник отдела

116. Центра ВТО ЕЗ НИИ микробиологии МО РФ кандидат медицинских наук старший научный сотрудникы1. Н.Садыков1. П.Васильев1. АЗабохрицкий1. Екатеринбург-Казань- 2CG21. УТВЕРЖДАЮ 138

117. Начальник Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФсхих наук1. ШВ.Ли

118. УТВЕРЖДАЮ • Прилсжэниэ 3 Директор Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института Минсельхоза РФ доктор ветеринарных наук •Абря 2002г.

119. СБОРНИК МЕТОДИК ПО ВЫДЕЛЕНИЮ, ИЗУЧЕНИЮ СВОЙСТВ И ПОДДЕРЖАНИЮ В ЖИЗНЕСПОСОБНОМ И АКТИВНОМ СОСТОЯНИИ КУЛЬТУР1. ЛАКТОБАКТЕРИЙ

120. НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ РАБОТЫ

121. Ведущий научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательсхого ветеринарного института Минсельхоза РФ доктор ветеринарных наукс

122. Начальник научно-исследовательского управления

123. Центра ВТП 53 НИИ микробиологии МО РФ доктор биологических наук стглзший научный сотрудник /2^1. Начальник отдела

124. Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ кандидат медицинских наук стгрп-ий научный сотрудник1. Н.Садыкоз1. П.Васильгз1. АЛабокзицкий

125. Екатерикбург-Хаза:-:ь- 2002