Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка на основе полимерных микросфер диагностического набора для оценки фагоцитарной активности

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка на основе полимерных микросфер диагностического набора для оценки фагоцитарной активности"

Р Г 5 Ой

На правах рукописи

- 8 'МАЙ 1995

ЕФРЕМОВА НИНА БОРИСОВНА

РАЗРАБОТКА НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР ДИАГНОСТИЧЕСКОГО НАБОРА ДЛЯ ОЦЕНКИ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ.

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995 г.

Работа выполнена в Московской Медицинской Академии имени И.М.Сеченова на кафедре готовых лекарственных средств и биотехнологии, в лаборатории высокомолекулярных соединений и методов контроля научно-исследовательского сектора и на кафедре синтеза полимеров Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им.М.В.Ломоносова. -

Научные руководители:

доктор технических наук, профессор, член-корр. РАМН, Быков Валерий Алексеевич доктор медицинских наук, профессор, Козловская Лидия Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Молчанова Лидия Васильевна

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович

'Ведущая организация - Государственный Научный Центр по Антибиотикам

Защита состоится ¿3^?" ¿¿Л^/1995 г.

в 5шс на заседании диссертационного совета Д.053.34.13 в Российском Химико-Технологическом Университете имени Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл. 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Химико-Технологического Университета имени Д.М.Менделеева

Автореферат разослан . 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного соррха.,

к.б.н. И.И.Гусева

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Как известно, • фагоцитоз занимает важное место среди других факторов неспецифической резистентности организма. Обычно для изучения фагоцитоза в клинической практике используются бактериальные или дрожжевые клетки (Маянский Д.Н. ,1986; Пига-ревский В.Г.,198?; Haynes А.Р.,1990). Кроме них применялись также активированный уголь, крахмальные шарики (Fenn W.O.* 1921; липосомы (Batzri S.,1975) химически модифицированные эритроциты (Lehnert В.Е.,1983) коллоидное золото (Valberg P.A.,1988) парафиновое масло, покрытое альбумином (Ito У.,1981), полимерные микросферы (Корн М.Я.,1984; Ауста К.А.,1986; Greenspan B.J., 1984). Анализ данных литературы свидетельствует о целесообразности использования полимерных микросфер для оценки фагоцитоза ввиду целого ряда преимуществ, по-сравнению с другими частицами. Прежде всего необходимо отметить относительную стабильность полимерных микросфер в растворе, а также возможность химической модификации их поверхности. В настоящее время известны факторы, определяющие фагоцитоз полимерных микросфер, а именно: размер частиц, заряд их поверхности, гидрофобные свойства (Tabata Y.198?,1988,1989), а также присутствие в сыворотке иммуноглобулинов, белков, гормонов, фибриногена и других соединений опсонинов, способствующих значительному усилению фагоцитоза (Маянский Д.Н.,1986, Haynas А.Р.,1990).

В клинической практике основными методическими приемами изучения степени поглощения частиц являются методики подсчета фагоцитарного индекса (ФИ), т.е. процента клеток, захвативших частицы, и фагоцитарного числа (ФЧ), т.е. среднего количества частиц, поглощенных одним фагоцитом. Указанные методики являются в значительной мере интегративными показателями фагоцитоза, т.к. включают в себя оценку не только собственно поглощения, но и миграционной подвижности, хемотаксиса, опсонизации, и, в определенной мере, метаболической активности клеток полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ). Поэтому данные показатели наиболее часто используются в исследованиях фагоцитоза, учитывая к тому же простоту выполнения этих методических подходов

для практических лабораторий и высокую значимость результатов исследований.

В настоящей работе главное внимание было уделено оценке резервов неспецифического иммунитета при хроническом гломеру-лонефрите. ХГН рассматривают как иммунно-воспалительное заболевание с преимущественным поражением аппарата почек (Шульцев Г.П.,1988). Изучение фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови и тканевых макрофагов при заболеваниях почек началась с середины 70-х годов, но в настоящее время представлено лишь единичными работами (Мирошниченко Н.Г.,1980; Николаев В.И.,1983). Рядом авторов выявлено резкое снижение фагоцитарной активности клеток ПЯЛ периферической крови у детей, страдающих нефротическим и смешанным гломерулонефритом САшимо-ва Ф.М.1976, Стефани Д.В.1978, Капелько М.А.19791. В работе Мирошниченко Н.Г. (1980) показана связь фагоцитарной активности клеток ПЯЛ .с тяжестью ХГН у взрослых лиц. Автор обнаружила, что при неактивных, легких формах гломерулонефркта (ГН) показатели фагоцитоза (ФИ и ФЧ) практически не отличались от контрольных у здоровых доноров и равнялись через 2 часа соответственно 66,1% и 13,5 клеток стафилококка в одном фагоците. В то же время, при тяжелых формах ХГН эти показатели снижались до значений ФИ=52,4% и ФЧ=9,8.

В последние годы отечественными исследователями был предложен метод оценки резервной активности фагоцитов, заключавшийся в подсчете фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа в ответ на введение "стимулирующих фагоцитоз агентов (Маянский Д.Н.,1986; Виксман М.Е. с соавт.,1988). Такой подход позволяет дать более точную дифференциальную оценку степейи подавления фагоцитоза у больных, по-сравнению со здоровыми лицами. Поэтому принцип этого метода был использован в наших исследованиях.

В клинической практике особое значение имеет определение функциональных резервов человека, в том числе, фагоцитарной системы, особенно у больных тяжелыми формами заболевания, получающих иммуносупрессивную терапию цитостатиками и корти-костероидами, которая оказывает подавляющее влияние на состояние неспецифической резистентности организма. Знание указанных резервов' позволит своевременно корректировать курс лечения и поднять его эффективность.

Изложенное определяет актуальность проведения данного исследования. Цель исследования.

Разработка диагностического набора для оценки фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов на основе полимерных микросфер.

Основные задачи исследования.

1. Получение и морфометрическая характеристика различных ПМ.

2. Изучение влияния размеров, состояния поверхности ПМ и их модификации на фагоцитоз лейкоцитов.

3. Электронно-микроскопическая характеристика фагоцитарной реакции ПЯЛ, определяемой с использованием различных ПМ.

4. Сравнительный анализ фагоцитарной активности лейкоцитов крови здоровых доноров и больных хроническим гломерулонеф-ритом (ХГН) с различной степенью тяжести с помощью диагностического набора ПМ.

5. Разработка методики определения резервной фагоцитарной активности ПЯЛ при ХГН с помощью диагностического набора из ПМ. Личный вклад диссертанта.

Участие автора заключалось в приготовлении и модификации ПМ, их морфометрической характеристике, подборе больных ХГН. постановке экспериментов по определению фагоцитарной активности ПЯЛ, обраоотке полученных результатов и их обсуждении. Научная новизна.

1.Найден способ получения инертных и модифицированных ПМ..

2.Разработан набор функциональных полимерных микросфер, позволяющий оценивать фагоцитарную активность клеток ПЯЛ с высокой степенью достоверности.

3.Предложен и апробирован на больных ХГН новый метод определения резервной фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови, заключающийся во введении в лейко-концентраты одного и того же лица ПМ в виде двух оппозитных частиц, различающихся по способности стимулировать фагоцитоз.

По результатам исследований получено положительное решение на авторское свидетельство "Способ получения монодисперсного латекса". Авторская заявка N93037131/05026766 от 12.05.93 г.

Практическая значимость.

- б - •

Впервые создан набор ПМ и разработана методика для оценки фагоцитарной активности клеток ПЯЛ периферической крови, а также резервной фагоцитарной активности, что позволяет выявлять с высокой степенью достоверности дефекты неспецифической резистентности организма и на этой основе корректировать схемы лечения больных. Набор имеет коммерческую ценность и может применяться в клинических лабораториях. Внедрение результатов работы.

Материалы диссертации используются в качестве рекомендаций при наблюдении больных хроническим гломерулонефритом в клинике терапии профзаболеваний ММА им.И.М.Сеченова. По материалам настоящей работы подана заявка на изобретение "Способ определения резервной фагоцитарной активности лейкоцитов крови с использованием набора ПМ". Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции кафедры готовых лекарственных средств и биотехнологии совместно с кафедрой терапии и профзаболеваний ММА им.И.М.Сеченова (2 марта 1995 г.), на научных конференциях "Биомедицинские технологии" (Москва, февраль 1994 г., февраль 1995 г.), на 1-ом съезде нефрологов России (Казань, май 1994г.) Публикации.

По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы, получено положительное решение на авторскую заявку и подана заявка на изобретение, список приведен в конце автореферата. Структура и объем работы.

Диссертация изложена на листах мащинописного текста и включает 7 таблиц, 3 рисунка и 16 микрофотографий. Состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Библиографический указатель содержит отечественных и зарубежных источников. Материалы и методы исследования.

Полимерные микросферы готовили совместно с кафедрой синтеза полимеров Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им.М.В.Ломоносова.

Морфометрический контроль функциональных полимерных микросфер осуществляли методами световой и электронной микроскопии в лаборатории высокомолекулярных соединений и методов

- 7 -

контроля ММА им.И.М.Сеченова.

Лейкоконцентраты получали из свежей гепаринизированной крови 10-ти здоровых доноров и 30-ти больных хроническим гло-мерулонефритом. Цельная кровь отстаивалась в течение часа при комнатной температуре. Затем Еерхнюю светлую фракцию, содержащую лейкоциты, осторожно отсасывали и_центрифугировали 10 минут при 1000 оборотов в минуту. Полученный осадок смешивали с равным объемом надосадочной сыворотки. В лейкоконцентраты добавляли разведенные физиологическим раствором полимерные микросферы в соотношении 100 частиц на 1 лейкоцит. Смесь лейкоцитов и полимерных микросфер помещали в термостатированный шу-тель-аппарат при 37 С в условиях постоянного взбалтывания при 20-ти качаний в минуту. Пробы для световой и электронной микроскопии отбирали в различные сроки инкубации (от 20-ти мин. до 2 часов). Для световой микроскопии готовили мазки, фиксиро-' вали их в течение 20-30 мин. в парах метанола и затем окрашивали азур 11 - эозином 15-20 мин.' Фагоцитоз оценивали по двум показателям: фагоцитарному индексу, т.е. проценту клеток, захвативших частицы, и по фагоцитарному числу, т.е. среднему количеству частиц, приходящееся на один фагоцит. Пробы для электронной микроскопии последовательно фиксировали в 1Z растворе глютаральдегида и 2Z растворе осмиевой кислоты, обезвоживали в батарее этилового спирта возрастающей концентрации и пропиленоксиде. Затем постепенно заключали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме ULTRACUT-E фирмы Reichert (Австрия). Полученные срезы после двойного контрастирования 2Z уранилацетатом и 2% цитратом свинца просматривали в электронном микроскопе GEM-100 (Япония).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием критерия Стьюдента.

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

С помощью различных методов были синтезированы ПМ, разработана технология их изготовления и модификации поверхности частиц соединениями , влияющими на фагоцитоз.

Прежде чем использовать полученные полимерные микросферы для оценки фагоцитоза, необходимо было провести морфометри-ческую характеристику изучаемых частиц.

Анализ электронограмм различных микросфер показал, чт некоторые из них либо имели неправильную форму, либо'склеива лись между собой посредством "мостиков" из электроннопрозрач ного материала, либо слабо связывались с модифицирующим ве ществом, либо отличались неоднородностью размеров. 8 этом пла не оптимальными оказались полистироловые частицы, покрытые же латином, а также чистые полистироловые полимеры без покрытия Указанные ПМ отличались однородностью размеров и формы, ста бильностью суспензии (более 1 года) и были хорошо видны как вне, так и внутри фагоцитов.

Следующий этап исследований был посвящен изучению влияни размеров частиц на фагоцитоз. По данным световой микроскопи: частицы диаметром меньше 0,8 мкм были плохо видны в поле зре ния. В то же время, полимеры более 4,0 мкм имели размеры соизмеримые с нейтрофилами (8,0 - 10,0 мкм), поэтому для дальнейшего анализа были отобраны частицы диаметром от 0,8 до 4,( мкм.

В тайл.1 представлены данные зависимости показателей ФИ и ФЧ от размеров полимерных микросфер.-

Таблица 1

Влияние размеров ПМ на фагоцитоз в сравнении с бактериальным! клетками

1 Размеры Ш и | бактериальных | клеток (в мкм) | ФИ 1 1 1 1 1 ФЧ I 1 1 1 |

полистирольные (0,8-1,0) | 41 1 1 1 1,73 |

полистирольные (1,2-1,4) | 45 1 1,95 |

хлорметакрилатные (1,2-1,4) | 43 1 1,88 |

полистирольные (2,0-2,2) | 54 1 2,09 |

полистирольные (2,4-2,8) | 56 1 3,07 (

полистирольные (3,0-4,Ф) | 43 1 1,88 |

стафилококк шт.1 (0,8-1,0) | 42 1 2,52 |

стафилококк шт.2 (0,8-1,0) | | 56 1 2,86 | I 1

Результаты экспериментов показали, что все исследованные

шертные полимерные микросферы захватывались ПЯЛ, причем наиболее высокие показатели ФИ и ФЧ отмечались при использовании истиц размером 2,0-2,2 мкм и 2,4-2,8 мкм. При использовании толимерных микросфер меньшего (от 0,8 до 1,4 мкм) или большего эазмера (от 3,0 до 4,0 мкм) показатели ФИ и ФЧ были несколько зиже. В контрольных опытах, когда вместо ПМ в лейкоконцентра-гы добавляли клетки золотистого стафилококка, такие же показатели незначительно отличались от полученных при использовании инертных частиц (полистирольных) размером от 2,0 до 2,8 мкм.

Таким образом, для дальнейших экспериментов были отобраны -¡астицы диаметром 2,0-2,8 мкм,'которые наиболее активно захватывались клетками ПЯЛ.

Дальнейшее исследование было направлено на изучение влияния поверхностных свойств полимеров на фагоцитарную реакцию. В данной работе для оценки фагоцитарной активности клеток ПЯЛ были использованы, так называемые, модифицированные ПМ, поверхность которых была покрыта биологически активными соединениями, способными активировать фагоцитарную реакцию. Впервые были использованы отечественные полимерные микросферы, поверхность которых была покрыта различными веществами, в том числе желатиной, желатозой, глицедилметакрилатом, а также родамином С. При добавлении в лейкоконцентраты различных полимерных микросфер, по данным световой микроскопии, было установлено, что модифицированнные ПМ более активно захватывались лейкоцитами по-сравнению с инертными.

Для оценки фагоцитарной реакции в практических лабораториях обычно используется световая микроскопия. При этом весьма вероятно, что ядро фагоцитирующей клетки из-за плотного содержимого может экранировать часть захваченных ПМ. Поэтому был проведен электронномикроскопический анализ фагоцитарной реакции с целью выявления истинного количества захваченных частиц, а также определения возможных изменений на ультраструктурном уровне в ответ на введение оппозитных ПМ.

Анализ большого количества электрограмм, показал, что при использовании в фагоцитарной реакции таких различных ФПМ как инертные и стимулирующие наблюдались как сходные, так я отличительные признаки в ультраструктуре захватывающих, их фагоцитов . К сходным признакам можно отнести аггрегацию хроматина

ядра, скопление вокруг частиц специфических гранул и лизосом, образование одноконтурной мембраны вокруг ПМ, большое количество псевдоподий. В то же время, наблюдались и некоторые отличия, которые, в определенной мере, зависели от физико-химических свойств самих частиц. Однако, в целом, в ответ на введение стимулирующих микросфер, они сводились к резкому уменьшению числа специфических гранул и лизосом, которые, как известно, участвуют в процессе дезактивации и уничтожения инородных тел, а также к увеличению числа митохондрий, что свидетельствовало об усилении энергетических потребностей клеток.

Таким образом, данные экспериментов свидетельствовали о том, что модифицированные ПМ захватывались клетками ПЯЛ здоровых доноров значительно в большем количестве, чем инертные *ИМ. Вероятно, это связано с тем , что на поверхности модифицированных ФПМ были расположены белки, которые усиливали фагоцитоз. С целью доказательства такого предположения были проведены эксперименты, в которых лейкоконцентраты, полученные от 10 здоровых доноров делили на две равные части и затем в 1 часть добавляли модифицированные ПМ, а во вторую - инертные микросферы и инкубировали. В обеих пробирках было одинаковым соотношение частиц и клеток крови, которое составляло 100 микросфер на одну клетку. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 2.

Как видно из табл.2, показатели ФИ и ФЧ, полученные при использовании модифицированных ПМ, значительно превышают (р < 0,05) такие же. показатели при применении инертных ПМ, о чем свидетельствовала разность между модифицированными и инертными микросферами, которая у здоровых доноров во всех экспериментах имела положительное значение.

Таким образом, эспериментально было установлено, что все модифицированные ПМ, захватывались клетками ПЯЛ здоровых доно-рбв значительно активней, по сравнению с инертными ПМ. На это указывает тот факт, что разность показателей ФИ в ответ на добавление модифицированных ПМ в лейкоконцентраты по отношению к инертным ПМ составила + 15,7 + 2,94 и для ФЧ +1,38 + 0,33. Вероятно, чем большие значения имеет разность показателей ФИ и ФЧ в ответ на модифицированные и инертные ПМ, тем выше резервная функциональная активность ПЯЯ.

Таблица 2

Фагоцитарная реакция ШШ, выделенных от здоровых доноров, при использований модифицированных и инертных ФПМ.

т-1-г—~—!-1-г—-1

Лейко- |Модифици- IИнерт- Раз- Модифици- Инерт- I Раз- |

концент- |рованные | ные ность рованные ные |ность |

раты | ПМ ] ПМ ПМ ПМ

1

1

доноров 1 ФИ 1 I ФИ ФЧ ФЧ

1 1 149 (род.С) | 38 +11 2,88 1,95 !+0,93 |

2 1 160 (жел-за) 1 1 46 +14 4,90 2,86 1+2,04 1

3 ! |66 (род.С) 1 ! 4? +19 4,98 2,68 1+2,30 1

4 1 |56 (жел-ин) 1 1 42 +14 3,07 2,08 1 \ 1+0,99 1

5 1 163 (род.С) 1 I 48 + 15 2,93 2,01 1" .....1 1+0,92 |

6 1 162 (род.С) 1 1 48 + 14 3,58 2,57 |. 1+1,01 |

7 1 |53 (жел-ин) 1 I 40 + 13 2,98 1,79 1+1,19 |

8 1 158 (жел-ин) 1 31 +27 3,81 2,06 1.........1 1+1,75 |

9 153 (жел-за) 1 I ~38 +15 3,30 1,87 1 1+1ДЗ |

10 ! ¡64 (жел-за) 1 I 49 +15 2,96 1,68 г 1+1,28 | 1 |

Среднее 1 |58,4 + 3,65 |42,2 + 15,7+ 3,53+0,52 2,15+ 1 I 11,38+ 1

1 |+ 3,91 +2,94 +0,26 1+0,33 |

1_1__Ч........... 1___I_1_I

- 12 -

Следует отметить, что наиболее стабильными (по данным микроскопии) в отношении сохранения размеров и формы, наиболее устойчивыми при хранении и, главное, обеспечивающими повторяемость результатов, оказались частицы микросфер полистирола, а также ПМ, состоящие из полистирола, покрытого желатином. Поэтому данные микросферы были отобраны в качестве набора ПМ в качестве инертных (полистирольные) и модифицированных (полистирол + желатин) для оценки фагоцитоза.

Все приведенные выше экспериментальные, данные были получены с использованием лейкоконцентратов здоровых . доноров. В дальнейших исследованиях изучали разность показателей ФИ и ФЧ в лейкоконцентратах больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) с различной степенью тяжести заболевания.

На рис.1 представлены кривые зависимости, значений показателей ФИ и ФЧ от степени тяжести ХГН. Как видно из представленных данных, наиболее высокие значения ФИ и ФЧ наблюдались в лейкоконцентратах здоровых доноров в ответ на модифицированные ПМ 58,4 + 3,65% и 3,5 +0,5 соответственно, а в ответ на инертные частицы эти же значения были несколько ниже и составили для ФИ - 42,2 + 3,9%, а для ФЧ - 2,2 + 0,3.'По-сравнению со здоровыми донорами у больных легкой формой ХГН отмечается значительное снижение показателей ФИ и ФЧ, особенно при добавлении в лейкоконцентраты модифицированных ПМ. Так, значения ФИ и ФЧ соответственно для них составили 33,4 + 4,8% и2,3 + 0,2, а для инертных - 28,1 + 4,3 % и 1,7 + 0,3.

Следует отметить, что у больных ХГН по мере усиления тяжести заболевания, наблюдаются различные тенденции в изменении характера кривых показателей фагоцитоза. В частности, при добавлении модифицированных ПМ показатели ФИ и ФЧ постоянно снижались , достигая у больных тяжелой формой следующих значений (ФИ= 22,8 + 3,4% ; ФЧ= 1,7 + 0,2). В то же время, указанные показатели в ответ на добавление инертных ПМ имели общую тенденцию к росту, возрастая у больных тяжелой формой ХГН до значений для ФИ - 33,9 + 4,0% и для ФЧ - 2,1 + 0,2.

Таким образом, данные, представленные на рис.1, свидетельствуют о том, что у здоровых лиц и больных легкой формой ХГН наблюдалась положительная разность показателей ФИ и ФЧ в ответ на добавление оппозитных ПМ. В то же время, у больных

РисД

Зависимость значений фагоцитарного числа (ФЧ) и фагоцитарного

индекса (ФИ) от тяжести заболевания ХГВ. % ФЧ

3 -

здоровые легкая

доноры форма ХГН

Обозйачения:

О - ФИ инертных ПМ х - ФИ модифицированных ПЫ -

средняя тяжелая

тяжесть ХГН форма ХГН

Ш - ФЧ инертных ГШ А - ФЧ модифицированных Ш

б

2

средней степени тяжести ХГН эта разность была близка к нулю, о чем свидетельствует пересечение кривых показателей фагоцитоза, а у больных тяжелой формой она имела отрицательные значения.

Полученные результаты исследования свидетельствуют о том, что наиболее информативным показателем для оценки фагоцитарной активности является разность значений ФИ и ФЧ в ответ на добавление модифицированных и инертных ПМ. Поэтому, на рис. 2 и 3 представлены данные, в которых учитывалась только средняя разность показателей ФИ и ФЧ в ответ на модифицированные и инертные ПМ, в парных сравнениях, когда лейкоконцентрат одного и того же лица делили на две равные части, в одну из них добавляли модифицированные ПМ, в другую - инертные. Как видно из данных, представленных на рис.2 и 3, средняя разность показателей ФИ и ФЧ в ответ на модифицированные и инертные ПМ у здоровых доноров имела высокое положительное значение (ФИ= 15,7'+ 2,9%; ФЧ= 1,4 + 0,3). У больных легкой формой ХГН эта же разность была значительно ниже (ФИ= 5,3 + 1,7%; ФЧ= 0,5 + 0,1), но также имела положительное значение. В то же время, у больных средней тяжести заболевания разность приближалась к нулевому значению (ФИ= 0,6 + 2,8%; ФЧ= 0,03 + 0,42), ■ а у больных тяжелой формой она имела статистически достоверное отрицательное значение (ФИ= -10,5 + 2,0%; ФЧ= 0,4 + 0,1).

Рис.2

Средняя разность показателей ФИ в ответ на введение модифицированных и инертных ПМ (парные сравнения).

Средняя разность ФИ между модифицированные и инертными ПМ

20 18

16 14 12 10 8 6 4 2 О 2 4 6 О 10 12 14

15,7

т

Г-Н

X

5,3 т

ГхТ

Здоровые Начальная форма ХГН

• -0,6 ХГН

средней тяжести т

-Г-Н-

Тяжелая

форма

заболевания

Доноры

I т J

х

-10,5

Рис.3

Средняя .разность показателей ФЧ в ответ на введение модифицированных и инертных ПМ (парные сравнения). 1

Средняя разность ФЧ между модифицированными и инертными ПМ

4,0 3,6 3,2 2,8 2,4 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 О

- 0,4

- 0,8

- 1.2

3,5 т

I

5—! —)

0,5

т

г-ч

I I _1_

Здоровые Начальная доноры стадия ХГН

Средняя Тяжелая тяжесть форма т ХГН

I

А

-0,03

~1-г

I т I

I ->

-0,36

Доноры

_1

Таким образом, полученные данные по изучению фагоцитарной реакции больных тяжелой формой ХГН свиде-тел! стюеялгс с значительном подавлении неспецкфического иммунитета у бсл;-ных средней и, особенно, тяжелой формой заболевания.

Резюмируя данные настоящего тследжчт, следует отметить. что разработанный диагностический н;лср, :сотолщ:й иг модифицированных (полистирол + желатина) и инертных полимерных микросфер, позволил статистически достоверно оценивать ную фагоцитарную активность клеток ПЯЛ !тор;1ф«ри"«ской «ерсг.и как у здоровых доноров, та:-; и V лиц. гтродолщих хроническим гломерулоирфритом.

- 18 -ВЫВОДЫ.

1.Впервые разработан диагностический набор, состоящий из модифицированных и инертных ПМ, позволяющий дать оценку фагоцитарной реакции ПЯЛ периферической крови.

2.Получены ПМ, дана их морфометрическая характеристика методами световой и электронной микроскопии, определены оптимальные размеры частиц (2,0-2,8мкм), пригодных для использования в диагностических наборах.

3.Показано, что модификация поверхности частиц с помощью желатины, желатозы или родамина С в значительной степени усиливает их фагоцитоз, по-сравнению с инертными ПМ.

4.Установлено, что суспензия полистирольных частиц, покрытых желатином, полученных методом безэмул'ьгаторной полимеризации, обладают высокой стабильностью (более 1 года), прочной связью полимера с белком, хорошей сохранностью размеров и формы и обеспечивают наиболее достоверные результаты при оценке фагоцитарной реакции.

5.Экспериментально установлено, что одновременное применение модифицированных и инертных ПМ с лейкоконцентратом одного и того же донора позволяет определить по разности показателей ФИ и ФЧ резервную фагоцитарную активность ПЯЛ. 6.Предложен и апробирован в клинике на больных ХГН метод определения резервной фагоцитарной активности ПЯЛ периферической крови, при этом выявлена возможность оценивать у больных степень подавления неспецифического иммунитета с высокой точностью и достоверностью. Практические рекомендации.

1. Диагностические наборы, содержащие как инертные , так и модифицированные ПМ размером от 2,0 до 2,8 мкм могут быть широко использованы в клинической практике для оценки фагоцитарной реакции.

2.С целью достижения максимальной информативности целесообразно одновременно использовать инертные и модифицированные ПМ, покрытые желатином. Последние отличаются прочной связью полимера с белком, хорошей сохранностью размеров и формы.

3.Диагностический набор, состоящий из инертных и модифицированных ПМ, покрытых желатином, дает возможность определить резервную фагоцитарную активность клеток ПЯЛ как у здоровых лиц,

так и у больных, имеющих различные стадии патологического процесса. Положительная разность между ФИ и ФЧ, изученных в тестах с модифицированными и инертными ПМ, свидетельствует о наличии резерва фагоцитоза, отсутствие разности или ее отрицательное значение указывает на отсутствие резервов фагоцитарной функции лейкоцитов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований (соавт. Грицкова И.А., Прокопов Н.Я., Черкасов В.Р., Ишков А.А.А, Шина Н.В., Кравцов Э.Г., Гжива Э., Быков В.Л.). Биомедицинские технологии. Вып.1. ММА им.И.М.Сеченова, М. ,1994, стр.62-6?.

2. Разработка диагностического набора для оценки фагоцитарной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов на основе функциональных полимерных микросфер (латексов) (соавт. Быков В.А., Козловская Л.В., Мирошниченко Н.Г., Еремин В.й., Решилов Л.Н.Н, Логинова Т.М., Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Черкасов В.Р., Ишков A.A.). Биомедицинские технологии. Вып.1. ММА им.И.М.Сеченова, М.,1994, стр.76-84.

3. Методы оценки резервной фагоцитарной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) у больных хроническим гломеруло-нефритом (соавт. Быков В.А, Козловская Л.В., Мирошниченко Н.Г., Еремин В.И.). Тез. докл. 1-ый съезд нефрологов в России, Казань, 1994, стр.15-16.

4. Способ получения монодисперсного латекса (соавт. Прокопов Н.И., Грицкова И.А., Черкасов В.Р., Яшина Н.В., Быков В.А., Подсидков B.C., Коган В.И.). Положительное решение на ав-' торскую заявку N93037131/05026766 от 12.05.93 г.