Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов разделения рацемических эфиров с помощью гидролаз микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Коновалов, Андрей Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:.

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 .ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 .Характеристика и условия функционирования липаз.

1.1.1 .Отличие липаз от других ферментов катализирующих аналогичные реакции.

1.1.2. Молекулярный механизм воздействия липазы.

1.1.3. Условия функционирования липолитических ферментов.

1.2. Субстратная специфичность липаз.

1.2.1. Классификация реакций катализируемых липазами.

1.2.2.Основные классы субстратов используемых при трансформациях липазами.

1.3 .Скрининг липолитических микроорганизмов.

1.3.1 .Классификация селективности липолитических ферментов.

1.3.2. Основные стадии скрининга.

1.3.3. Методы скрининга.1В

1 ^.Использование липолитических микроорганизмов в региоселективном разделении эфиров.

1.5.раз деление рацемических соединений путем энантиоселективного гидролиза или алкоголиза, ацидолиза наиболее известными коммерческими гидролазами.

1.5.1. Липазы Rhizopus delemar.

1.5.2. Липазы Candida antarctica.

1.5.3. Коммерческие препараты липаз Amano Pharmaceutical Со.

1.5.4. Липазы Candida rugosa ( Candida cylindracea).

1.6. Факторы влияющие на энантиоселективность и активность гидролаз.

1.6.1. Влияние состава ростовой среды и условий роста.

1.6.2.Влияние сокатализаторов и условий реакции на селективность разделения.

1.7.Разделение рацемических соединений путем энантиоселективного гидролиза или алкоголиза, ацидолиза эстеразами.

1.8. Разделение рацематов липазами путем amмонолиза сложных эфиров.

1.9.Использование интактных клеток липолитических микроорганизмов при разделении сложных эфиров.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов разделения рацемических эфиров с помощью гидролаз микроорганизмов"

В настоящее время поиск новых высокоэффективных лекарственных средств, обладающих направленным действием и пониженной токсичностью, а также биологически активных веществ, используемых для создания экологически чистых методов защиты растений осуществляется среди природных соединений и их модифицированных или синтетических аналогов. Многие из них имеют специфическую стереохимию, обусловленную наличием двойных связей или хиральных центров. Для создания методов получения синтетических аналогов природных соединений необходимы оптически активные блоки. Значительный интерес в качестве таких блоков представляют оптически активные спирты, оксикарбоновые кислоты и их эфиры.

Стереонаправленный синтез или разделение оптических изомеров химическими методами представляет собой сложную и дорогостоящую задачу, вследствие чего особенно перспективным является микробиологический подход, основанный на стереонаправленной биотрансформации органических соединений. В ряду ферментативно катализируемых реакций особый интерес представляет энантиоселек-тивный гидролиз рацемических эфиров, катализируемый липолити-ческими микроорганизмами, так как липазы являются коферментне-зависимыми, проявляют широкую субстратную специфичность, высокую стереоселективность и стабильность. Кроме того, особенностью липаз, является их способность катализировать реакции этери-фикации и трансэтерификации в органических растворителях, которые широко используются при получении оптически активных соединений. В связи с этим поиск новых эффективных микроорганизмов, содержащих стереоспецифичные гидролазы с целью создания на их основе биокатализаторов для энантиоселективного синтеза оптически активных спиртов, оксикислот и их эфиров является актуальной задачей.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с заданием Министерства образования РФ по тематическому плану НИР Уфимского государственного нефтяного технического университета (УГНТУ): Федеральной целевой программой "Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки" (1997-2001 гг.); научно-технической программой «Научные исследования Высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» 1998-2002 гг.

Целью работы являлась разработка новых высокоэффективных биокатализаторов гидролиза рацемических эфиров на основе микроорганизмов, обладающих гидролазной активностью, и создание методов получения оптически активных спиртов, эфиров и оксикислот.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

• скрининг микроорганизмов и внеклеточных ферментов, обладающих высокой гидролазной активностью и способных осуществлять энантиоселективный гидролиз рацемических эфиров вторичных спиртов и оксикислот;

• исследование морфологических, физиолого-биохимических и патогенных свойств найденных микроорганизмов;

• разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального гидролиза эфиров на основе клеток микроорганизмов;

• модификация биокатализаторов с целью увеличения их стабильности, активности и срока хранения;

• поиск оптимальных условий роста биомассы и работы биокатализаторов при гидролизе эфиров;

• исследование возможности использования найденных биокатализаторов для энантиоселективного ацидолиза, алкоголиза и аммо-нолиза в органическом растворителе;

• разработка методов разделения рацемических эфиров в водной и органической средах с помощью созданных биокатализаторов.

Найдены и идентифицированы 3 новых непатогенных штамма: Bacillus sp. 77-1, Bacillus sp. 79-54 и Rhodococcus sp. 78-5, на основе которых созданы стереоселективные биокатализаторы, эффективно катализирующие как гидролиз эфиров рацемических спиртов и окси-кислот в водной среде, так и алкоголиз, ацидолиз и аммонолиз этих соединений в органической фазе. Разработаны научно обоснованные методы синтеза оптически активных спиртов, оксикислот и их эфиров с использованием созданных биокатализаторов. Найдены условия, в которых биокатализаторы проявляют наивысшую активность. Доказана высокая стабильность и возможность многократного использования разработанных биокатализаторов.

Разработаны новые высокоэффективные биокатализаторы на основе штаммов Bacillus sp. 77-1, Bacillus sp. 79-54, Rhodococcus sp. 78-5 энантиоселективно катализирующие как гидролиз эфиров рацемических спиртов и оксикислот в водной среде, так и алкоголиз, аци

11 долиз и аммонолиз этих соединений в органической фазе. Созданы препаративные методы получения (8)-(+)-втор-бутанола, (К)-(-)-втор-бутилацетата, (8)-(+)-этил-3-оксибутирата, (11)-(-)-этил-3оксибутирата, (8)-(+)-3-оксимасляной кислоты, (11)-(-)-3-оксимасляной кислоты, (8)-(+)- глицидола и (11)-(-)-глицидола высокой оптической чистоты (96-100 %ее), которые являются ценными синтонами при получении различных низкомолекулярных биорегуляторов (феромонов насекомых, /?-адренергетиков, цереброзидов, гормонов, простагландинов, нуклеозидов,) и биоразлагаемых полимеров. Методика разделения рацемических втор-бутилацетата, этил-3-оксибутирата и глицидилового эфира метакриловой кислоты используется в учебном процессе УГНТУ при подготовке инженеров по специальности 07.01.00 - «Биотехнология».

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Характеристика, методы поиска и использование гидролаз в биотехнологии

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Коновалов, Андрей Александрович

Выводы

1. В результате скрининга микроорганизмов найдены и идентифицированы 3 новых непатогенных штамма: Bacillus sp. 77-1, Bacillus sp. 7954 и Rhodococcus sp. 78-5, способные катализировать энантиоселективный гидролиз рацемических втор-бутилацетата и/или этил-3-оксибутирата.

2. Установлено, что использование агаризованного сусла (3 °Б) приводит наибольшему выходу биомассы микроорганизмов, при этом наиболее высокая активность у штаммов Bacillus sp. 79-54 и Rhodococcus sp. 78-5 достигается через 72 часа выращивания, а у штамма Bacillus sp. 77-1 - через 24 часа.

3. Установлено, что обработка ацетоном биомассы микроорганизмов повышает её каталитическую активность в процессах гидролиза втор-бутилацетата (в 1,1 и 1,6 раза для штаммов Bacillus sp. 77-1 и Bacillus sp. 79-54, соответственно) и этил-3-оксибутирата (в 2,2 и 2,3 раза для штаммов Bacillus sp. 77-1 и Rhodococcus sp. 78-5, соответственно), а также увеличивает стабильность и время хранения биокатализаторов на основе этих штаммов до 9 месяцев без значительного снижения активности. Доказана возможность многократного использования полученных биокатализаторов.

4. Найдены оптимальные параметры энантиоселективного гидролиза (температура 30-35 °С; рН=7,5-8,0; начальная концентрация субстрата 57 г/л; концентрация сорастворителя 30-35% об. в зависимости от типа штамма) втор-бутилацетата и этил-3-оксибутирата для полученных биокатализаторов.

5. Научно обоснована принципиальная технологическая схема получения энантиоселективных биокатализаторов парциального гидролиза рацемических эфиров и их кинетического разделения с выделением индивидуальных R- или S-энантиомеров: (R)- (-)-втор-бутилацетата (96-99 % ее), (8)-(+)-втор-бутанола (96-98 % ее), (R)-(-)- или (S)-(+)- этил-3-оксибутирата (99 и 100 % ее, соответственно) и (R)-(-)- или (S)-(+)

3-оксимасляной кислоты (96 и 95 % ее, соответственно) с высокими выходами (80-90 %).

6. Разработаны методы получения R- или S- этил-3-оксибутирата (97 и 100 % ее, соответственно) путем парциального алкоголиза рацемического этил-3-оксибутирата бутанолом-1, катализируемого в гексане обезвоженными ацетоном клетками штаммов Bacillus sp. 77-1, Rhodococcus sp. 78-5.

7. Разработан метод получения R-втор-бутилацетата с оптической чистотой 99% ее путем энантиоселективного ацидолиза рацемического втор-бутилацетата валериановой кислотой, катализируемого в гексане обезвоженными ацетоном клетками штамма Bacillus sp. 79-54.

8. Разработаны методы получения R- или S- глицидола высокой оптической чистоты (97-98%о ее) путем парциального аммонолиза рацемического глицидилового эфира метакриловой кислоты аммиаком (бикарбонатом аммония), катализируемого в метилизобутилкетоне обезвоженными ацетоном клетками штаммов Bacillus sp. 77-1 и Rhodococcus sp. 78-5.

9. Научно обоснована принципиальная технологическая схема получения энантиоселективных биокатализаторов парциального алкоголиза этил-3-оксибутирата бутанолом-1, ацидолиза втор-бутилацетата валериановой кислотой и аммонолиза глицидилового эфира метакриловой кислоты карбонатом аммония в органическом растворителе и их кинетического разделения с выделением индивидуальных R- и S-энантиомеров: (Я)-(-)-втор-бутилацетата (99 % ее), (R)-(-)- или (S)-(+)-этил-3-оксибутирата (97 и 100 % ее, соответственно) и (R)-(-)- или (S)-(+)-глицидола (97 и 98%о ее, соответственно) с высоким выходом (80-90 %).

1.10. Заключение

В результате анализа литературных источников установлено, что стереонаправленная биотрансформация органических соединений гидролазами является перспективным подходом для получения оптически активных соединений. На сегодняшний день не существует универсальных ферментных препаратов и биокатализаторов на основе интактных клеток микроорганизмов, способных эффективно разделять рацематы В связи с этим поиск новых эффективных микроорганизмов, содержащих стерео-специфичные гидролазы с целью создания на их основе биокатализаторов для энантиоселективного синтеза является актуальной задачей.

2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач использовались следующие объекты, материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования

Объектом исследования служили накопительные культуры липоли-тических микроорганизмов синтезирующих внеклеточные или внутриклеточные липазы, отселекционированных в результате многократных пассажей на минеральной среде с внесением оливкового масла в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации 3 %, и выделенные из них 145 штаммов бактериальных культур липолитических микроорганизмов.

2.2. Материалы исследования

Материалами исследования были чистые реактивы, синтезированные в химических лабораториях УГНТУ и ИОХ УНЦ РАН (г. Уфа).

Рацемический втор-бутилацетат (ВБА) и (8)-(-)-этил-3-оксибутират были синтезированы в лаборатории кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.

Рацемический этил-3-оксибутират (ЭОБ), ]\[-ЗЕ-пентен-2-ил-орто-толуидинацетамид (М-ПТА), ]М-ЗЕ-пентен-2-ил-орто-толуидин, глицидило-вый эфир метакриловой кислоты (ГЭМК) предоставлен ИОХ УНЦ РАН (г. Уфа).

Материалами исследования также были чистые реактивы, производимые шосткинским заводом химреактивов: бутанол-1, валериановая кислота и бикарбонат аммония.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Коновалов, Андрей Александрович, Уфа

1. Balcao V.M., Paiva A.L., Malcata F.X. Bioreactors with immobilized lipases: State of the art // Enzyme and Microbial Technology.- 1996-V.18,-P.392-416.

2. Desnuelle P. The Lipases. In: The Enzymes. // Boyer PO (ed.).Academic Press, New York.-1994-Vol. 7.-P. 575.

3. Sarda L., Desnuelle P. Action de la lipase pancreatique sur les esters en emulsion. // Biochim. Biophys. Acta,-1958,- №30, -P.513-521.

4. Faber К /Biotransformation in organic synthesis (3rd edn). // SpringerVerlag. Berlin.-1992.

5. Rubin В., Dennis E. A., eds. Methods in Enzymology: Lipases, Part A: Biotechnology. //Academic Press.-1997,- Vol. 284.

6. Rubin В., Dennis E. A., eds. Methods in Enzymology: Lipases, Part B: Enzyme Characterization and Utilization. // Academic Press. -1997,- Vol. 286.

7. Kazlauskas R. J., Bornscheuer U.T. In Biotechnology: Biotransformations with Lipases. // VCH-1998,- Vol. 8,-P. 37-191.

8. Rozzell. D. Commercial Scale Biocatalysis: Myths and Realities. // Bioorganic & Medicinal Chemistry, -1999, -7,-P. 2253-2261.

9. Michal G., Molering H., Siedel J. Methods of Enzymatic Analysis. // Bergmeyer, H.U. Ed., Verlag Chemie:Weinheim, -1983, -Vol. 1,-P. 197.

10. Janes L.E., Kazlauskas R.J. Quick E. A Fast Spectrophotometric Method to Measure the Enantioselectivity of Hydrolases. // J.Org. Chem.,-1997,-№62, -P.4560-4561.

11. Janes L.E., Lowendahl C., Kazlauskas R.J. Quantitative screening of hydrolase libraries using pH indicators: identifying active and enantioselective hydrolases. // Chem. Eur. J.,-1998,- №4, P.2317-2324.

12. Zaks A., Klibanov A.M. Enzyme-catalyzed processes in organic solvents.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, -1985, -№82, P.3192.

13. Croteau R. Fragrance and Flavor Substances, // D&PS Verlag, Germany,-1980, -P. 13-14.

14. Armstrong D.W., Gillies B., Yamazaki H. in: G. Charalambous (Ed.), Flavor Chemistry, Trends and Development, // Elsevier Science Publishers, New York,-1989, -P. 104-120.

15. Klibanov A.M. Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. // Trends Biochem. Sci., -1989,-№ 14, -P.141-144.

16. John V.T, Abraham G., in: J.S. Dodrick Ed., Biocatalysis for Industry, // Plenum Press, New York, -1991, -P. 193-217.

17. Ballesteros A., Bornscheuer U., Capewell A., Combes D., Condoret J.-S., Koening K., Kolisis F.N., Marty A., Menge U., Scheper T., Stamatis H.,

18. Xenakis A. Review article: Enzymes in non-conventional phases. // Biocatal. Biotransform. -1995, -№13, -P. 1-42.

19. Stamatis H., Kolisis F.N., Xenakis A. Enantiomeric specificity of a lipase from Penicillium simplicissimum in the esterification of menthol in mi-croemulsions. //Biotechnol. Lett. -1993, -№15, -P.471-476.

20. Claon P.A., Akoh C.C. Effect of reaction parameters on SP435 lipase-catalyzed synthesis of citronellyl acetate in organic solvent. // Enzyme Microb. Technol., -1994, -№16,-P. 835-838.

21. Karra-Chaabouni M., Pulvin S., Touraud D., Thomas D. Enzymatic synthesis of geraniol esters in a solvent-free system by lipases. // Biotechnol. Lett. -1996,- №19,-P.1083-1088.

22. Claon P.A., Akoh C.C. Lipase-catalyzed synthesis of terpene esters by transesterification in n-hexane. // Biotechnol. Lett., -1994, -№16, -P. 235-240.

23. Chulalaksananukul W., Condoret J.-S., Combes D. Kinetics of geranyl acetate synthesis by lipase-catalyzed transesterification in n-hexane. // Enzyme Microb. Technol., -1992, -№14, -P. 293-298.

24. H. Stamatis, P. Christakopoulos, D. Kekos, et al. Studies on the synthesis of short-chain geranyl esters catalysed by Fusarium oxysporum esterase in organic solvents.// J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. -1998, -№4, -P. 229-236.

25. Boivin T.L.B. Synthetic routes to tetrahydrofuran, tetrahydropyran, and spiroketal units of polyether antibiotics and a survey of spiroketals of other natural products. // Tetrahedron -1987, -V.43, -P. 3309-3363.

26. Searle P.A., Molinski T.F., Brzezinski L.J., et al. Absolute Configuration of Phorboxazoles A and B from the Marine Sponge Phorbas sp. 1. Mac-rolide and Hemiketal Rings. // J. Am. Chem. Soc., -1996, -№118, -P.9422-9423.

27. Chenevert R., Goupil D., Rose Y.S., Bedard E. Enzymatic desymmet-risation of meso cis,cis-2,4,6-substituted tetrahydropyrans. // Tetrahedron: Asymmetry -1998, -V. 9, -P. 4285-4288.

28. Adam W.; Diaz M. T.; Saha-Moller C. R. Lipase-catalyzed kinetic resolution of threo-configured 1,2-diols: A comparative study of transesterifica-tion versus hydrolysis. // Tetrahedron: Asymmetry, -1998, -V. 9, -P. 589-598.

29. W. Adam, M. T. Diaz, C. R. Saha-Moller. Lipase-catalyzed kinetic resolution of a, /^-unsaturated «'-acetoxy ketones. // Tetrahedron: Asymmetry -1998, -V.9, -P.791-796.

30. Rao, A. V. R.; Bose, D. S.; Gurjar, M. K.; Ravindranathan T. 3-butene-l,2-diol: an attractive precursor for the synthesis of enantiomerically pure organic compounds. // Tetrahedron -1989, -V.45, -P.7031-7040.

31. Lohray, B. B.; Gao, Y.; Sharpless, K. B. One pot synthesis of homo-chiral aziridines and aminoalcohols from homohiral 1,2-cyclic sulfates. // Tetrahedron Lett. -1989, -V.30, -P.2623-2626.

32. Anilkumar A.T., Goto K., Takahashi T., Ishizaki K., Kaga H. Li-pase-mediated resolution of czs-l-amino-2-indanol, the key component of the HIV protease inhibitor indinavir. // Tetrahedron: Asymmetry, -1999, -V.10, -P.2501-2503.

33. Conde S., FieiTos M., Rodriguez-Franco M.I., Puig C. Resolution of 1-(4-amino-3-chloro-5-cyanophenyl)-2~bromo-l-ethanol by lipase mediated enan-tioselective alcoholysis, hydrolysis and acylation. // Tetrahedron: Asymmetry,-1998, -V. 9, -P. 2229-2232.

34. Baylis A.B., Hillman M.E.D. German Patent 2,155,113. // Chem. Abstr.-1974,- 77,34,-P.174q.

35. Hayashi N., Yanagihara K., Tsuboi. S. Lipase-catalyzed kinetic resolution of Baylis-Hillman products. // Tetrahedron: asymmetry, -1998, -V. 9,-P. 3825-3830.

36. Akeboshi T., Ohtsuka Y, Sugai T., Ohta H. A chemo-enzymatic elaboration of a quarternary chiral center: an alternative approach to the side chain of Furaquinocin D. // Tetrahedron, -1998, -V. 54, -P. 7387-7394.

37. Nagata H., Taniguchi T., Kawamura M., Ogasawara K. A lipase-mediated route to (+)-juvabione and (+)-epijuvabione from racemic norcamphor. // Tetrahedron Lett. -1999, -V. 40, -P. 4207-4210.

38. Heathcock C.H., Graham S.L., Pirrung M.C., et al. Total Synthesis of Natural Products. // ApSimon, J. Edn. Wiley, -1983, Vol. 5,-P.l.

39. Wong C.H., Whitesides G.M. Enzymes in Synthetic Organic Chemistry. // Pergamon, -1994.

40. Horiguchi A., Kuge Y., Mochida K.-I. Chemoenzymatic synthesis of four diastereomers of (6-fluoro-2-chromanyl)oxirane: An intermediate of a potent /^-blocker. // J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic -1997, -V.3, -P. 285-292.

41. Eugene G.R., Leopold M.F., Josephine M.F. Jap. P. 132977/1985, // Chem. Abstr., -1980, -V.93, P. 45990.

42. Eugene G.R., Leopold M.F., Josephine M.F., et al. EP 145067/1985. // Chem. Abstr., -1986, -V.104, -P. 5773e.

43. Santaniello E., Ferraboschi P., Grisenti P., et al. The biocatalytic approach to the preparation of enantiomerically pure chemical building blocks. // Chem. Rev., -1992, -V. 92, -P. 1071-1140.

44. Hanessian S., Bennani Y.L. The asymmetric synthesis of a-chloro a-alkyl and a-methyl a-alkyl phosphonic acids of high enantiomeric purity. // Tetrahedron Lett. -1990, -V. 31, -P. 6465-6468.

45. Coppola G.M., Schuster H.F. a-Hydroxy Acids in Enantioselective syntheses, // Weinheim: VCH, -1997, -P. 137-165.

46. Chenevert R., Letoumeau M. Enantioselectivity of carbonic anhydrase catalyzed hydrolysis of mandelic methyl esters. // Can. J. Chem. -1990, -V. 68, -P. 314-316.

47. Berglund P., Holmquist M., Hult K. Reversed enantiopreference of Candida rugosa lipase supports different modes of binding enantiomers of a chiral acyl donor. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, -1998, -V. 5, -P.283-287.

48. Wu S.-H., Guo Z.-W., Sih C.J. Enhancing the enantioselectivity of Candida lipase catalyzed ester hydrolysis via noncovalent enzyme modification. // J. Am. Chem. Soc. -1990, -V.l 12, -P. 1990-1995.

49. Chen C.-S., Fujimoto Y., Girdaukas G., Sih C.J. Quantitative analyses of biochemical kinetic resolutions of enantiomers. // J. Am. Chem. Soc. -1982, -V. 104, -P. 7294-7299.

50. Kometani T., Isobe T., Goto M. at al. Enzymatic resolution of 2-fluoro-2-arylacetic acid derivatives // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic-1998, -V.5, -P. 171-174.

51. Colton I.J., Ahmed S.N., Kazlauskas R.J. Isopropanol Treatment Increases Enantioselectivity of Candida rugosa Lipase toward Carboxylic Acid Esters. // J. Org. Chem., -1995, -V.60, -P. 212-217.

52. Konigsberger K., Prasad K., Repic O. The synthesis of (R)- and (S)-a-trifluoromethyl-a-hydroxycarboxylic acids via enzymatic resolutions. // Tetrahedron: Asymmetry, -1999, -V. 10, -P. 679-687.

53. Dinh P.M., Williams J.M.J., Harris W. Selective racemisation of esters: relevance to enzymatic hydrolysis reactions. // Tetrahedron Lett. -1999, -V. 40, -P. 749-752.

54. Pamperin D., Hopf H., Syldatk C., Pietzsch M. Synthesis of planar chiral 2.2.paracyclophanes by biotransformations: kinetic resolution of 4-formyl-[2.2]paracyclophane by asymmetric reduction. // Tetrahedron Asymmetry-1997,-V. 8, -P. 319-325.

55. Lambusta D., Nicolosi G., Patti A., Piatelli M. Lipase-Mediated Resolution of Racemic 2-Hydroxymethyl-l-methylthioferrocene. // Tetrahedron Lett. -1996, -V. 37, -P. 127-130.

56. Frykman H., Ohrner N., Norin T., Hult K. S-ethyl thiooctanoate as acyl donor in lipase catalysed resolution of secondary alcohols. // Tetrahedron Lett. -1993, -V. 34, -P. 1367-1370.

57. Chang C.-S., Tsai S.-W., Lin C.-N. Enzymatic resolution of (RS)-arylpropionic thioesters by Candida rugosa lipase-catalyzed thiotransesterifica-tion or hydrolysis in organic solvents. // Tetrahedron: Asymmetry, -1998, -V. 9, -P. 2799-2807.

58. Mustranta A. Use of lipases in the resolution of racemic ibuprofen. // Appl. Microbiol. Biotechnol., -1992, -V. 38, -P. 61-66.

59. Arroyo A., Sinisterra J.V. High enantioselective esterification of 2-arylpropionic acids catalyzed by immobilized lipase B from C. antarctica: A mechanistic approach. //J. Org. Chem., -1994, -V. 59, -P. 4410-4417.

60. Tsai S.W., Wei H.J. Kinetics of enantioselective esterification of naproxen by lipase in organic solvents. // Biocatalysis. -1994, -V. 11, -P. 33-45.

61. Morrone R., Nicoloci G., Patti A., Piattelli M. Resolution of Racemic Flurbiprofen by Lipase-Mediated Esterification in Organic Solvent. // Tetrahedron: Asymmetry, -1995, -V. 6, -P. 1773-1778.

62. Chang C.-S., Tsai S.-W. A facile enzymatic process for the preparation of (S)-naproxen ester prodrug in the organic solvents. // Enzyme Microb. Technol., -1997, -V. 20, -P. 635-639.

63. Brocca S., Garndori R., Breviario D., Lotti M. Localization of lipase genes on Candida rugosa chromosomes.// Curr. Genet. -1995, -V. 28, -P. 454-457.

64. Lotti M., Alberghina L. Candida rugosa lipase isoenzymes. Cloning, sequencing, analysis of the substrate binding pocket. In: Malcata, F.X. (Ed.), Engineering of:with Lipases. // Kluwer, Dordrecht, -1996, -P. 115-124.

65. Longhi S., Fusetti F., Grandori R., Lotti M., Vanoni M., Alberghina L., Cloning and nucleotide sequences of two lipase genes from Candida cyl-indracea. II Biochim. Biophys. Acta -1992, -V. 1131, -P. 227-232.

66. Shaw J.F., Chang C.H., Wang Y.J. Characterization of three distinct forms of lipolytic enzyme in a commercial Candida lipase preparation. // Biotechnol. Lett. -1989, -V. 11, -P. 779-784.

67. Veeraragavan K., Gibbs B. Detection and partial purification of two lipases from Candida rugose. II Biotechnol. Lett. -1989, -V. 5, -P. 345-348.

68. Rua M.L., et al. Purification and characterization of two distinct lipases from Candida cylindraceo. II Biochim. Biophys. Acta -1993, -V. 1078, -P. 181-189.

69. Linko Y.Y., Wu X.Y. Biocatalytic production of useful esters by two forms of lipase from Candida rugosa. II J. Chem. Technol. Biotechnol. -1996.-V. 65,-P. 163-170.

70. Diczfalusy M.A., Hellman U., Alexson E.H.S. Isolation of carboxy-lester lipase (CEL) isoenzymes from Candida rugosa and identification of the corresponding genes. // Arch. Biochem. Biophys. -1997. -V. 348, -P. 1-8.

71. Gordillo M.A., Sanz A., Sanchez A., et al. Enhancement of Candida rugosa lipase production by using different control fed-batch operational strategies. // Biotechnol. Bioeng. -1998. V.60 (2), -P. 156-168.

72. Sanchez A., Ferrer P., Serrano A., et al. A controlled fed-batch cultivation for the production of new crude lipases from Candida rugosa with improved properties in fine chemistry. // Journal of Biotechnology, 1999, -V.69, -P. 169-182.

73. Anthonsen T., Hoff B.H. Resolution of Derivatives of 1,2-Propanediol with Lipase B from Candida antarctica. Effect of Substrate Structure, Medium,

74. Water Activity and Acyl on Enantiomeric Ratio. // Chem. Phys. Lipids. -1998. -V. 93. -P. 199-207.

75. Gialih L., Hsiao-Chien L. Ultrasound-Promoted Lipase-Catalyzed Reactions. // Tetrahedron Lett. -1995, -V. 36, -P. 6067-6068.

76. Takagi Y., Teramoto J., Kihara H., Itoh T., Tsukube H. Thiacrown Ether as Regulator of Lipase-Catalyzed Trans-Esterification in Organic Media: Practical Optical Resolution of Allyl Alcohols. // Tetrahedron Lett. 1996, - V. 37,-P. 4991-4992.

77. Lin G., Lin W-Y., Shieh C.T. The enhancement of enantioselectivities for lipase-catalyzed reactions by using carbamates. // Tetrahedron Lett. -1998, -V. 39, -P. 8881-8884.

78. C.R. Ed. The Pesticide Manual, 6th ed. // BCPC Publication, London, -1979,-P. 329.

79. A. Cipiciani, M. Cittadini, F. Fringuelli.// Improving the enantioselec-tivity of Candida rugosa lipase in the kinetic resolution of rasemic metil 2-(2,4-dichlorophenoxypropionate. Tetrahedron, 54, 1998, 7883-7890.

80. Juaristi E. Enantioselective Synthesis of f5-Amino Acids. Ed. // Wiley-VCH: New York, -1996.

81. Ng J.S., Topgi R.S. Current Opinion in Drug. // Discovery and Development. 1998, - V. 1, - P. 314.

82. Faulconbridge S.J., Holt K.E., Sevillano L.G., et al. Preparation of en-antiomerically enriched aromatic /3-amino acids via enzymatic resolution. // Tetrahedron Lett. -2000, -V. 41, -P. 2679-2681.

83. Soloshonok V.A., Fokina N.A., Rybakova A.V., et al. Biocatalytic Approach to Enantiomerically Pure -Amino Acids. // Tetrahedron: Asymmetry, -1995,-V. 6, -P. 1601-1610.

84. Lai'b T., Ouazzani J., Zhu J. Horse liver esterase catalyzed enantioselective hydrolysis of N,0-diacetyl-2-amino-l-arylethanol. // Tetrahedron: Asymmetry, -1998. -V. 9, -P. 169-178.

85. Krebsfanger N., Schierholz K., Bornscheuer U. T. Enantioselectivity of a recombinant esterase from Pseudornonas fluorescens towards alcohols and carboxylic acids. // Journal of Biotechnology, 1998, -V. 60, -P. 105-111.

86. Hacking M.A.P.J., Wegman M.A., Rops J., van Rantwijk F., Sheldon R.A. Enantioselective synthesis of amino acid amides via enzymatic ammonio-lysis of amino acid esters. // J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic, -1998, -V. 5,-P. 155-157.

87. Stermans W.A.J., Doppen R.G., Thijs L., Zwanenburg B. Enzymatic resolution of methyl N-alkyl-azetidine-2-carboxylates by Candida antarctica lipase-mediated ammoniolysis. // Tetrahedron: Asymmetry, -1998, -V. 9,-P. 429-435.

88. Gotor V. Non-Conventional Hydrolase Chemistry: Amide and Carbamate Bond Formation Catalyzed By Lipases. // Bioorg. Med. Chem., -1999, -V. 7, -P. 2189-2197.

89. Puertas S., Rebolledo F., Gotor V. Enantioselective Enzymatic Ami-nolysis and Ammonolysis of Dimethyl 3-Hydroxyglutarate. Synthesis of (R)-4-Amino-3-hydroxybutanoic Acid. // J. Org. Chem., -1996, -V. 61, -P. 6024-6027.

90. Grogan G. J., Holland H. L. The biocatalytic reactions of Beauveria spp. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, -2000, -V. 9, -P. 1-32.

91. Bradford, М. М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem.- 1976-V 72.-P 248-254.

92. Башкатова H.A., Северина Jl.O. Прикладная микробиология и химия,- 1978, т. 14, -№ 6, -с. 838-864.

93. Определитель бактерий Берджи./ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крита, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.: Мир. - 1997. - Т1- 430 е., Т2 800 с.

94. Практикум по микробиологии./под ред. Н.С. Егорова. М.: изд-во МГУ. - 1976.-306 с.

95. Lechevalier М.Р. Identification of aerobic actinomycetes of clinical importace//J. Lab. Clin. Med.- 1968.-v/74.-p.934-944.

96. Mordaska H., Mordaski M. ,Goodfellow M // J. Gen. Microbiol.-1972.-v.71-p.77

97. Bergeys Manual of Determination Bacteriology. 97h ed.Baltimore.-1984 p.1278-1354, 1567-1572,965-974.

98. Методы общей бактериологии /под ред. Ф.Герхардта М.: Мир.- 1984,- Т.1 с. 54-57, Т.З - с. 263.

99. Нестеренко О. А., Ногина Т.М, Квасников Е.Н.Хемотаксонометрические признаки некоторых коринеподобных бактерий и групп "Rhodochrous" //Микробиол.-1978.-т. 47,№6ю- 1055-1062.

100. Becker В.М.Р., Lechevalier R.N/, Gordon H.A., Lechevalier М.Р. Rapid differentation betven Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolisates // Appl. Microbiol.-1964.-v.12,5.-p.421-423.

101. Lechevalier M.R., LechevalierH.A. In: Actinomycts Taxonomy.Soc. Ind. Microbial. Arlington,VA-1980.- p.227-291.

102. Кузнецов M.A., Кузнецова JI.M., Плечко P.JI. и др. Свойства органических соединений.//М.:Химия, 1984,с. 518.

103. Kieslich К. Biatransformations. Verlag Chemie, Weinheim// Biotechnology,- 1984.

104. Аренде И.М., Дорохов В.В. Гончаров Ю.И., Сверчкова Т.М. Биосинтез липазы плесневым грибом Rhizopus species, штамм 3-3. // Прикладная биохимия и микробиология. -1979, -Т. 15, -С. 676-681.

105. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир. -1989, -С.521.

106. Аренде И.М., Дорохов В.В., Турочкина Т.М. Препараты липазы из глубинной культуры Aspergillus awamori 259 и их характеристика. // Прикладная биохимия и микробиология. -1974, -Т. 10, -№1, -С. 92-98.

107. Braun В., Klein Е., Lopez J. Immobilization of Candida rugosa lipase to nylon fibers using its carbohydrate groups as the chemical link. // Biotechnol. and Bioeng. 1996.- V.51. - № 3. - P. 327 - 341.

108. Hernaiz M.D., Sánchez-Montero J.M., Sinisnterra J.V. Improved stability of the lipase from Candida rugosa in different purification degrees by chemical modification. //Biotechnol. Techn. -1996. -V.10, -№12,-P.917-922.

109. Зубенко Т.Ф., Закиров M.3., Давранов К.Д. Влияние температуры культивирования на термостабильность липолитических ферментов Rhizopus microsporus, штамм УзЛТ-1 // Прикладная биохимия и микробиология. -1979, -Т. 15, -С. 832-838.

110. Шумилина Е.В., Зонова Н.Ю., Щипунов Ю.А. Влияние поверхностно-активных веществ на активность фосфолипазы D.// Биол. мембраны ; 1998; 0233-4755.

111. Давранов К.Д., Халамейзер В.Б., Вагина О.Н. Синтетазная активность липазы из Penicillium sp. в водной среде и в системе обращенных мицелл. // Прикладная биохимия и микробиология. -1996, -Т. 32, -№4, -С. 386-388.

112. Ulrich A., Klein P. Enzymatic ester hydrolysis and syntesis two approaches to cycloalane derivatives of high enantiomeric purity. // Tetrahedron Letters., -1989., -Vol.30. -№14,- P.193.

113. Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека Лаборатория микробиологии