Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разрушение эфиров о-фталевой кислоты бактериями рода Rhodococcus

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разрушение эфиров о-фталевой кислоты бактериями рода Rhodococcus"

РГБ ОД

I V* ^

ИНСТИТУТ микробиологии

^ академия наук беларуси

УДК №2222М7№

ВАЙКОВА Светлана Валентиновна

РАЗРУШЕНИЕ ЭФИРОВ О-ФТАЛЕВОЙ КИСЛОТЫ БАКТЕР' ^ *ОДА

Rhodococcuз

03.00.07 - микробиоло!

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степьим кандидата биологических наук

Минск -1996

Работа выполнена 8 Институте микробиологии Академии наук Беларуси

Научный руководитель: доктор биологических наук Самсолова А. С.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Гвоэдяк П. И.

доктор биологических наук, профессор, Лауреат Государственной премии Эстонии, Заслуженный деятель науки Республики Беларусь Залавко >1 В.

Оппонирующая организация - Белорусский государственный университет

Зацита состоится "Л." 1806 Г. в час. на

заседании Совета по эаг;ита диссертаций Д 01. 34. 01 в Институте микробиологии АН Беларуси по адресу: 220141, Минск, Яодинская,2.

С диссертацией могно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН Беларуси.

¿д , , п , Автореферат разослан -» 1966г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций

- к. б. н. Л, И. Стефанович

ОБ!АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность темы. Охрана окружающей среды - одна из глобальных проблем современной цивилизации. Насущная необходимость экономии металла и древесины стимулирует многотоннажное производство заменяющих их пластических масс во всем мире. Для улучшения свойств пластмасс применяются пластификаторы преимуце-ственно на основе фталевой кислоты. Однако, несовершенство используемых технологических процессов, особенности строения пластических изделий, в которых пластификатор не закреплен химическими связями с полимером, приводят к загрязнению окружающей среды. Во многих странах в объектах окружающей среды регистрируется Значительное количество токсикантов техногенного происхождения, Ы том числе и эфиров о-фталевой кислоты С M&yer et al. , 1972; dledhill et al. ,1980; Hans, 1987; Turin, Larsson, 1990 ; Клюев, уродский, 1993). Экспериментальные доказательства мутагенных, тератогенных свойств и канцерогенной активности о-фталатов при зтоль широком распространении их в окружающей среде свидетельствуют об их угрозе здоровью человека ( Гончарова, Кухир, 18Я4: Kluwe et al. , 1982, 198S; Dostal et al. , 1988; Воронин, 1093).

Раэрувение токсикантов в биогеоценозах осуществляется при взаимодействии биотических и абиотических факторов. Микроорганизмам, благодаря их уникальной способности адаптироваться к условиям окружающей среды, принадлежит ведущая роль в деструкции загрязняющих веществ. В последние десятилетия появились сообщения об исследованиях по деградации эфиров о-фталевой кислоты < Квувег et el, 1076; Kurftrte et »1. t 1877, 1982, 1904.; Eaton, Ribbons, 1982; Willians,. Dale, 1983; Hirarido-Romei-o, Gutierrez Castrejon, 1984; АлещенКова И др, 1993, 1994! ГофароВ, Наумов, 1894), которые демонстрируют возможность деградации их представителями родов PeeudononM, Bacillus, Cor^nebtct et-lujn. Micrococcus, Nocerctia, Aspergillus, fthodotorula. В доступной нам литературе отсутствуют сведения о деструкции иирокого ряда эфирив о-фталевой кислоты бактериями рода Rhodococeus. Однако^ расширение круга исследований в этой области представляется чрезвычайно перспективным благодаря возможности практического использования микроорганизмов для детоксикации ксенобиотиков ( Гвоэляк и лр 3988; Ной, i990; Головлева Л. А. , 1992; PingKon. Самсоиова, 399Ь).

Физико-химические методы и традиционная биологическая очистка малоэффективны в деконтаминации сточных вод и почвы от !"Гиров о-фталевой кислоты. В связи с этим разработка надежных микробиологически* методов очистки от них сточных вод и почвы приобретает важное народнохозяйственное значение.

Получение наиголее активных втамное-деструкторов, исследование утилизации и особенностей ферментативной атаки, а также чпализ разрушения о-фталатов в связи с проблемой соотношения мехд^ химической структурой и особенностями деструкции представляют теоретический интерес. Полученные в этой области данные послужат основой для решения практических задач охраны обьектов окружающей среды от загрязнения эфирами о-фталевой кислоты.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнена в лаборатории экологии микроорганизмов Института микробиологии АН Беларуси в течение 19901996гг. в рамках научно-исследовательских тем: "Разработать м внедрить микробиологические методы, предотвращающие загрязнение окружающей среды и сельскохозяйственной продукции выбросами предприятий химической промышленности", н Гос. регистрации 01.9. 10022751 (РНТП 75. 02р, "Охрана природы", 1991-1993гг. ) и "Изучение метаболических путей микробной деградации эфиров фталевых кислот штаммами микроорганизмов-деструкторов", К Гос. регистрации 1993242 ( РПФИ "Биотехнология", 1993-1995 гг. ).

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в выявлении особенностей процесса разложейия эфиров о-фталевой кислоты различного строения бактериями рода ЙЬо<1оооасия. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- выделение, получение, идентификация и скрининг активных итаммов микроорганизмов с повышенной способность» деградировать эфиры о-фталевой кислоты;

- исследование зависимости процесса деградации эфиров о-Фталеэой кислоты от их химического строения;

- установление оптинальных параметров разрушения эфиров о-фталевой кислоты родококками;

- определение метаболических путей деградации эфиров о-фта-лерой кислоты;

- выявление активности и природы Ферментных систем, осуще -сгэляюиих деградации эфиров о-фталевой кислоты;

- исследование разложения эфиров о-фталевои кислоты в почве интродуцированными бактериями-деструкторами.

научная цови^на полученных результатов. Впервые исследиьан процесс разложения эфиров о-фталевой кислоты нормального, разветвленного алкильного и фенильного типа различными видами бак терий рода ЙЬоёососсив. Предложена схема пути деградации эфщоь о-фталевой кислоты у родококков, отличная от таковой у лсеедо-монад и микрококков. Впервые получены данные о субстратной специфичности фермента, гидролиэуючего эфиры о-фталевой кислоти и активности диоксигенаэ, участвуюцих в разрыве ароматического кольца у различных видов рода £Шо<1осоосив. Впервые показана во-.» мощность применения микроорганизмов-деструкторов эфиров о-фтал« вой кислоты, иммобилизованных на торфяном носителе, для локо льной очистки почвы от орто-фталатов. Полученные в работа результаты значительно расяиряют и дополняют существующие представления о микробной деструкции широко распространенных и»п лютантов - эфиров о-фталевой кислоты родококкани.

Працтичвг.кая значимость полученных результатов. Выделении«! и полученные путем адаптивной селекции «таммы микроорганизма -деструкторов могут быть использованы для очистки сточных вод н почвы от -эфиров о-фталевой кислоты. Экспериментальные данные о пут** метаболизма эфиров о-фталевой кислоты будут полезными при разработке практических приемов получения новых втаммов микроор ганиэмов, способных деградировать более стойкие эфиры фталешм кислот. Р&зработан и изучен в условиях лабораторной модели еио-технологический прием интенсификации процесса разрушении в почт; эфиров о-фталевой кислоты с помошью интродуцированных микрооц-а низмов-деструкторов.

Эдонаннивдкая значимость получвнлы» вазульхатень Испольли вани а втаммов микроорганизмов-деструкторов эфиров о-фталепои кислоты в биотехнологии очистки почвы имеет суцественный социальный эффект, выражающийся в охране окрухакщей среды от чагн'!-нения. Втаммы и разработанные на их основе биотехнологии яелиюг--ся коммерческими продуктами, которые могут быть реализованы за интересованным организациям по договорным ценам.

Основные положения диссертации, выносимыд на защиту 1. Бактерии рода 1?Ьос1оеосси8 способна исрольэовать эфнри о-фталевой кислоты в качестве единственного, источника углевода Представители вида И. егуЬЬгороПа обладают широкой субстратном

специфичность» в отноаении эфиров о-фталевой кислоты раз-яичного строения (н-алкил-, иэо-алкил-, фенилфталаты).

2. Деградации эфиров о-фталевой кислоты осуществляется посредством гидролиза нх во фталеву» кислоту. Фермент обладает янрокой субстратной специфичностью и является индуцибельным.

3. Предложен путь утилизации эфиров о-фталевой кислоты: дпэфир*г Фталевая кислота-» бензойная кислота** п-0Б1-» ПИ- У исследованных родококков разрыв ароматического кольца идет по орто-пути, что подтверждает выявленная в активном состоянии протокатехат-3,4-диоксигеназа.

4. Экспериментальное обоснование принципиальной возможности использования полученных штаммов родококков дла ускорения процессов естественного самоочищения почвы от наиболее распространенных загрязнителей окружающей среды - эфиров о-фталевой кислоты ДИФ, ДБФ, ДЭГФ.

стевмное участие в получении экспериментальных данных, составляющих основу диссертации, их анализе, обобщении и изложении материала настоящей работы.

нссл£дований, включенных в диссертационную работу, докладывались на: ©Международной конференции "Загрязнении "окружающей среды. Проблемы токсикологии и эпидемиологии" Москва-Пермь, 3993 г. ; XV Нендёлеевскон съезде по общей и прикладной химии, Минск, 1993 г. ; VI Конференции Российской Федерации " Новые направления биотехнологии", Пущино, 1994г. ; Международной конференции "Новые направления биотехнологии", Пущине, 1996г.

Опубликовянность результатов. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 4 тезиса международных конференций.

Структура и объьм диссертации. Работа состоит из введения, обИс&й характеристики работы, обзора литературы, четырех глав экспериментальной! части, анализа и обобщения результатов исследований, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 173 источников Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, включаюаих 26 рисунков и 19 таблиц.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1 диссертационной работы является обзором литературы .и состоит из двух разделов, в которых описываются Физико-химические свойства и процессы миграции эфиров о-фталееой кислоты г> окружающую сроду, приводятся сведения о загрязненности ими различных объектов; рассматривается метаболизм эфиров о-фталевон кислоты в организме животных и человека, а также разрушение их микроорганизмами почвы, активного ила и речной воды; характеризуются фнзиолого-бнохимические особенности родококков, как перспективных деструкторов ксенобиотиков различной природы.

Глава 2. Общая характеристика объектов и методов исследования

Объектами исследований служили:

- штаммы различных видов рода Rhodoooocue, полученные из региональной коллекции Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Академии наук Российской Федерации (Пермь), коллекций непатогенных микроорганизмов Института микробиологии и лаборатории экологии микроорганизмов Института микробиологии Академии наук Беларуси ;

- эфиры о-Фталевой кислоты;

- образцы дерново'подэолистой почвы Биологической опытной станции Института генетики и цитологии АНБ;

- торф осоковый со степенью разложения 20-25* в качестве носителя для ниХроорганиэмоВ-деструкторов.

Для культивирования микроорганизмов использовали мясо-пеп-тонный агар, мясо-пептонный с^сло-агар, Синтетическую среду Е-6.

0 качестве единственного источника углерода и энергии использовали эфиры о-фталевой кислоты.

Способность бактерий расти на эфирах о-фталевой кислоты различного строения исследовали ауксанографическим методом на агаризовакной синтетической среде В-8 с 0,1* каждого эфира.

Рост .бактериальных культур контролировали путем измерения оптической плотности <0П) И на ФЭК-56Н (светофильтр N6). определение живых клетох проводили на агаризоваиной минеральной среде, содержащей 0.1Х соответствующего эфира.

Биомассу отделяли фильтрованием, ' высушивали -.при.' 106 "С до постоянного peca, взвешивали »« выражали о г/я.

в

Количество эфиров о-фталевой кислоты определяли методом ГЛХ на Chrom-5. Условия хроматографирования согласно методике (Слизень, Самсонова, 1990);

Анализ метаболитов выполняли в отделенной от клеток U.

"3-кетоадипиновую лислоту в гомогенате клеток определяли реакцией Rothera ( Stanier et al. ,1906).

Метаболиты анализировали методом ТСХ в системе растворителей (А) бензол: Хлороформ : этанол ( 30:63:7) и (Б) хлороформ: этмлацетаг : муравьиная, кислота (40.10:2,5). Визуализацию разделенных пятен проводили с использованием UV-лампи с максимумом излучения 254 нм. Пос^е разделения пятна элюировали этанолом, олюат фильтровали и спецтрофотометрировали в УФ-области спектра на Specord Н-40 (220-320 нм). Образцы для ИК-спектрофотометрии готовились по стандартной методике запрессовки в КВг (г.онцентра-ция 0,125 %) в области 4000-400 си-1. Регистрзция и последующая обработка спектров производилась с помощью спектрофотометрмчес-кого комплекса, созданного на основа спектрофотометра Specord Н-80 и персонального компьютера IBM/AT 48G. Идентификация ИХ-спектров производилась в соответствии с рекомендациями КазицыноЛ (1971).

Концентрацию метаболитов определяли в спиртовых экстрактах, полученных после анализа ТСХ, снятых с пластинок Silufol UV-254.

Природу ферментов, обеспечивающих деструкцию эфиров о-фта-девой кислоты у исследуемых итанмов рода Rhodococcus, устанавливали при изучении метаболизма ДМФ, ДБФ, ДЭГФ в 0,02М фосфатном буфере (pH 7,5 ) клеточными суспензиями бактерий, предварительно выращенными на зфирах и цитрате натрия.

Белок определяли по методу Bradford (197G),

Предварительный скрининг липолитической активности проводили по методу Kouker et al. (1987) на агаризованном.0,2 М фосфатном буфере.

Визуализацию эфиргидролизующей активности проводили модифицированный методом Shamad (1989) на агарнэованной среде Е-0 с 0,5Й ДЭФ и ДСФ и 0,01% родамина Б. .■ ■

Активность неспецифической эстеразы выявляли в клеточных .экстракта* и культуралыюй жидкости в присутствии субстрата индофенилацетата.

Активность липазы и гидролазы эфира фталевой кислоты определяли тлтрометрическим методом в соответствии с рекомендациями

Рубан (1977)..

Активность ключевых диоксигеназ, катализирующих разрыв ароматического кольца, определяли спектрофотометрически в соответствии с рекомендациями Fujieawa, Hayaishi (19В8); Crawford (1975).

Влияние pH и температуры на активность Ферментов выявляли, используя 0,05 М фосфатный буфер со значениями pH От 5 до 9, а также прогреванием среды инкубирования до 15, 25, 35 и 50° С 30 мин в присутствии клеточного экстракта, в которую затем вносили субстрат.

Динамику процесса деструкции эфиров изучали в Лабораторных исследованиях в дерново-подэолистой почве, Помещенной в чашки Петри по 50 г, в условиях постоянной температуры (22° С) и влажности (60* ПВ) в течение 28 суток. Бактерии в фаза экспоненциального роста вносили в почву из расчета 2,2-8,4- 10е кл/г почвы.

"Светомикроскопические наблюдения и фотосъемку осуществляли в фазовом контрасте с помощью микроскопа NU-2E ("Karl Zeiss", ГДР>. Образцы фиксировали в глутаровом диальдегиде (ГДА), затем в растворе OsO«, обезвоживали в этаноле и ацетоне, заливали в CnyppC'Serva" ,<№Г), Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме ЬКВ-XII (Ввецня), контрастировали уранилАцетатом и цитратом свинца.

Просмотр и фотосъемку срезов проводили с' помощью электронного микроскопа YEM^IOOB (" ieol", Япония).

Статистическую обработку полученных результатов проводили в соответствии с рекомендациями Рокицкого (1973), используя ком-Пъютерную программу Stadia, версия 4,10/9. 91г. , копия Н 1037, автор Кулаичев. Для учета случайной ошибки использовали распределение Сгыодента при доверительной вероятности 0,95.

Среди 107 исследованных ятаммов коллекционных микроорганизмов были выявлены 42 культуры p. Rhodococcus, способные разлагать аирокий спектр эфиров о-фталевой кислоты, а также узкоспециализированные, деградирующие трудноутилиэируомые ■ opto-Фталаты.

* Работ» проводнлвок Лоаиастно а . сотр* ои-иом ' .k^qyti гу ЙИохипии И фшимогии микрооргжниЬНон »AM я. П. kt, к. л

(Пуяина).

Наиболее вирокий спектр эфиров утилизируется микроорганизмами вида R. erythropolis.

Системное ауксанографическое тестирование выявило коровий рост представителей различных видов родококков - erythropolis, ruber, caris, luteus, rhodochroua на эфирах н-алкильного типа -ДПФ, ДБФ, ДАмФ, и их иэо-формах - ДИБФ, ДНАмф, Все исследованные микроорганизмы вида R. erythropolis хорово растут на эфирах фенильного типа - ББФ и ДФФ. Неудовлетворительными субстратами для роста родококков являются ДМФ, ДДФ (н-алкильный тип), а такка ДЭГФ (разветвленный алкильный тип). Наибольшее количестьо штаммов-деструкторов ДМФ и ДЭГФ, практически неутилизйруеных микроорганизмами других родов, обнаружено среди родококков вида erythropolis.

Исследование процесса деструкции эфиров о-фталевой кислоты провели с использованием наиболее активно растущих на них штаммов различных видов рода Rhodococcus.

Наиболее активный деструктор ДНФ втамм R. erythropolis 12Ф эфир в концентрации 0,1 X утилизирует полностью за 46 часов, а в концентрации 0,2 X - на сутки позднее. 0,5* эфира разрушается за 168ч, 1 и 2 Х(об./об. ) утилизируется культурой за это же время на 82 и 08 X соответственно. Втамм утилизирует ДМФ без лаг>-периода. Изучение деструкции эфиров о-фталевой кислоты в различных конченграциях выявило прямую зависимость времени деструкции от уровня активности использованных штаммов (рис. 1).

Рис. 1. Рост R. erythropolis 12Ф1 (а) и R. ruber 345-30 (Ь> в жидкой среде Е-8, содержащей ДМФ. Н - число хизнеспособных клеток при концентрации эфира □ - 0.1Х, X - 0,2Х, ф 0,5Х; t - время культивирования, ч * .

g

Сопоставление сроков деструкции эфиров н-алкильного типа с различным молекулярным весом показало, что скорость утилизации ДЭФ, ДПФ, ДНФ снижается по мере увеличения числа атомов углерода в их молекуле. Наиболее активные атаммы*-деструкторы эфиров о фталевой кислоты н-алкильного типа R. erythropolis 5Д, 7Ф, 23Ф, R. maris 100Ф используют их в концентрации 0,1 и 0,2* за 24 и 40 часов соответственно. ДЭФ и ДПФ в концентрации 0,5* используются ими за 72, а ДНФ втамиом R. erythropolis 23Ф - за 168 часов. Удельные скорости роста культур на исследованных эфирах практически не различаются и увеличиваются лишь при повышении концентрации субстрата (0,14 - 0,16 ч-1).

Высокая деструктивная активность в отноаении эфиров разветвленного алкильного типа выявлена у втамма R. erythropolis 29Ф, который ДИБФ в концентрации 0,1 * утилизирует за 72 ч, а 0,2 X и 0,5% за 120 и 169 часов соответственно. Представители других видов - R. rhodochrous, R. n&ris И R, luteus 0,1Х-ю концентрацию эфира полностью потребляют за 120 ч. , а 0,5*-ю к 192 часам на 85, 76 и 98 Я соответственно.

Структурными и физико-химическими различиями между широко распространенными в окружающей среде ДЭГФ и ДБФ, заключающимися в болы ем размере алкильной цепи и большей гидрофобностм ДЭГФ, объясняется более активное использование ДБФ по сравнению с ДЭГФ всеми тестируемыми представителями рода Rhodoooocua.

Активный ятамк R. erythropolis 40Ф полиостью потребляет ДВФ • концентрации 0.5Х за 168 ч, а ДЭГФ за это хе время только на 68*. Удельная скорость роста культуры составляет 0,137 и 0,157 ч-1 соответственно. Наиболее активный деструктор R. neria юоф, отличающийся от других «таммов преимущественным разрушением нерастворимых, обладающих большей молекулярной массой эфиров, различно утилизирует ДЭГФ в возрастающих концентрациях: 0,1% за 24ч, 0,2* - за 48ч, 1* - за 144ч, а максимальную из исследуемых концентраций -2* - за 188ч на 88*.

Эфиры о-фталевой кислоты фенильного типа активно потребляются всеми изученными «гаммами: ББ* в концентрации 0,1 X полностью утилизируется R. rhodoohrou», . R. ryber S45-30, R. maris за 72ч, Средняя' удельная скорость роста : (Ь rhadoohfоие составляет 0,2 ч-*, а для представителей рмдов R, ruber 345-30 ii P:waris -0,067 и 0,08 ч-i соответственно.

Эфир в концентрации 0,2 X утилизируется этими атаммами за 12ич со средней удельной споростью - 0,147, 0,072 и 0,11ч-* соответственно. Концентрацию 0,5 X ББФ - максимальную из использовании*. в опыте R. rhodcehrous потребляет за 144 ч, а R. rubel 345-30, R. aarie, R. luteus B-18 - за 166 ч.

Наиболее перспективным деструктором ББФ является R. егу-thropollg 29Ф, который деградирует эфир в концентрации 0,1 X за 48ч с удельной скоростью роста - 0,13ч-*; 0,2Х-я концентрация, потребляется им за 36ч с >1-0,17ч"1, а 0,5t -за 168ч с j*-p,124"+.

Глава 4.. Детабодиан. аФивов.о-Фталевой лислоты у „родркоккрв.

Исследование природы ферментов, участвующих в деградации эфиров о-фталевой кислоты у родококков, было проведено с использованием активных штаммов-деструкторов, утилизирующих ЛИФ, ДБФ и ДЭГФ. Для исследований отобрали культуры, предварительно выращенные на соответствующем эфире, а также цитрате натрия в концентрации 0,1 X. >

R.erythropolie 12Ф, выращенный на цитрате натрия, начинает деструкцию ДМ4> в концентрации 0,25* после лаг-периода, равного 20-ти часам. Через 144 часа инкубирования содержание эфира в среде составляет 57 X. Та же культура, предварительно выращенная на ДНФ, к этому Времени деградирует эфир полностью. Аналогичная тенденция сохраняется при деструкции ДБФ и ДЭГФ итаммами R. erythropolis 5Д, 7Ф, 58 Ф й 40Ф и R. »aria 100Ф. Культуры, выращенные иа цитрате натрия, с лаг-периодом от 20 ( итаммы 58Ф и 100Ф > до 48 часов < «танк 40Ф ) к 168 часам культивирования утилизировали эфир на 68, Ö? и 88 X соответственно. Микроорганизмы, предварительно адаптированные к соответствующим эфира«, к 168 (итанм 58Ф, 40Ф) И к 72 часам (втамм 100Ф) полностью утилизируют их из среды культивирования Это свидетельствует об ин-дуцибельнон характере ферментов, вовлеченных в деградацию эфиров о-фталевой кислоты.

Исследования процесса деградации, позволившие установить схему пути утилизации эфиров о-фталевой кислоты, вызваны как теоретическим интересом, та» и необходимостью знания природы промежуточных продуктов, степени их токсичности и деградабель-ности, условий накопления 6 среде и др. , что диктуется стремлением экологически безопасного использования микробиологических методов локальной очистки почвы « воды от фталатов.

и

Установлено, что процесс утилизации эфиров сопровождается накоплением в культуральной жидкости кислот и снижением значений рН с 7,3 до в, а к окончанию культивирования до 5,5. Анализ продуктов метаболизма эфиров о-фталевой кислоты исследуемыми втам-мами родокохков, проведенный методом ТСХ, позволил выявить в культуральной среде неизвестные соединения с равными 0,19, 0,33 и 0,09. Эти величины соответствуют хроматографической подвижности молекул таких соединений как фталевая, бензойная н протокатеховая кислоты. Качественный анализ этих соединений в УФ и XI области спектра подтвердил их сходство.

Исходя из полученных результатов, можно предложить следующую схему деструкции эфиров о-фталевой кислоты : гидролазы превращают эфир во фталевую кислоту, которая под действием дакарбо-ксилирующей дегидрогеназы превращается в бенэоат. Монооксигена-эы гидроксилируют бенэоат с образованием протокатеховой кислоты. Некоторые этапы перечисленных превращений протекают, по-видимому, настолько быстро, что довольно редко удается выявить в среде моноэфир, п-оксибензойную и протокатеховую кислоты, а пирокатехин и возможные другие интермедиаты вообще не представилось возмохным зафиксировать. Тем не менее, выявленные последовательности превращения эфиров, идентификация промежуточных метаболитов позволяют точно установить, что деструкция эфира протекает без накопления токсичных пр^мехуточных продуктов, а идет до углекислого газа и воды.

Результаты первичного скрининга липолитической, а также фталатгидролизующей активности подтверждают их наличие у исследуемых ятаммов, о чем свидетельствуют различные по'диаметру зоны гидролиза, образуемые вокруг колоний культур-деструкторов с участием экзоферментов. ДБФ-гидролизующая активность выявлена как в культуральной жидкости, так и в бесклеточных экстрактах.

Активность липазы у родококков, растущих на эфирах о-фта-левой кислоты, представлена в основной в культуральной жидкости в пределах 0,09-0,69 ед/мг. Липолитическая активность клеточного экстракта - в пределах 0,04-0,17 ед/мг белка.

Оптимальными параметрами режима образования и действия фермента являются температура 30°С н рН 8. Добавление в инкубационную среду 0.01М р-ра СаС1а увеличивает его активность на 20 X.

В бесклеточных экстрактах исследуемых культур, выращенных на минеральной среде Е-0 с эфирами о-фталевой кислоты в качестве

единственного источника углерода и энергии, обнаружена в активном состоянии протокатехат-3,4-диоксиг9наза, а у некоторых культур активность пирокатехин-1,2-диоксигеназы. Диоксигеназы, обеспечивающие мета-раэрыв ароматического кольца, не выявлены.

Активный синтез фермента протокатехат-3,4-диоксигеназы происходит в постэкспоненциальной фазе развития культуры, утилизирующей эфир. Сравнительный анализ параметров роста и синтеза фермента у культуры R. erythropolis 29Ф, активно растущей и утилизирующей ДКБФ в О, IX концентрации, . показал разобщенность процессов роста культуры и синтеза е» фермента во времени: фазе синтеза предаествует фаза роста. Время достижения максимальной удельной скорости роста опережает максимальную скорость образования фермента на 72 часа. Наибольшая активность фермента выявлена у активных деструкторов эфиров о-фталевой кислоты R. erythropolis 29 Ф (0,12 ед/мг белка), В. erythropolis 12Ф (0,16 ед/мг белка), R. ruber 2В (0,125 ед/мг белка). Ахтивность прото-катежат-Э,4-диоксигеназы у штаммов R. erythropolis 7Ф, 5Д, 58Ф; 404> составляла в среднем 0,03-0,08 ед/мг белка.

Наиболее оптимальные условия для проявления активности протокатехат-3,4-диоксигенаэы у R. erythropolis 7ф и пирокатехин-1,2-диоксигеназы у R. earlя 100Ф складываются при температуре 30°С и рН 8. 0 (рис. 2).

Рис. 2. Активность протокатехат-3,4 -диоксигемазы у R. erythropolis 7Ф в аависимости от рН (а) и температуры (Ь). Е-активност1> фчрмзнта (X), t- "С

Наличие активности лротокатехат-3,4-диоксигеназы свидетельствует о функционировании 3-кетоадипииового пути у родококков при утилизации зфиров о-фталевой кислоты. Э-кетоадипинат а результате хорово изученных метаболических последовательностей минерализуется до СО» и НаО.

Глава 5. Деградаций зфивов.о-аталввой кислоты а почва Исследование динамики разрушения ДМФ в различных концентрациях и его влияние на почвенную микрофлору показало, что эфир, внесенный в почву, оказывает стимулирующее воздействие на развитие аборигенных микроорганизмов, способных использовать его в качестве источника питания и энергии. Через 7 суток после внесения О,IX ДМФ содержание аборигенных микроорганизмов-деструкторов а загрязненной почве увеличивается в 5,8 раза, к окончанию культивирования (28 дней) количество их возрастает в 10,6 раза в сравнении с контролем и составляет 3,"26У107 кл/г абс. сух.почвы. I этому времени ДМФ разрушается на 15* (рис.3). Интродукция культуры-деструктора й. «гуЪЬгороНв 14Ф способствует достоверному (рг0,95) сокращению сроков деградации эфира в данной концентрации до 14 суток. Численность внесенного в загрязненную почву родококка ухена 7 сутки значительно (в 19 раз) снихается, а в последующие 14, 21 й 26|. сутки опита стабилизируется и остается на постоянной уровней Это объясняется полной утилизацией субстрата к 14 суткам.

Рис. 3. Разрукение ДМФ в почве. Концентрация ДМФ : а - О, IX, Ь - 1,0 X. Остаточное содержание эфира,X : • - почва, + -почва культура-деструктор, * - почва + культура-деструктор, иммобилизованная на торфяной носителе

В варианте с использованием интродуцнрованной культуры, иммобилизованной на торфе, численность клеток родококка, внесенных в количестве 2,85'10вкл/г абс. сух. почвы, снижается не столь резко и к моменту полного исчезновения субстрата - к 14 суткам инкубирования., составляет еще 1,07-10е кл/г абс. сух. почвы. К концу опыта (28 суток) количество клеток интродуцнрованной культуры снихается до 3,4*10' кл в г абс. сух. почвы. Аналогичная тенденция наблюдается при разрушении в почве IX ДМ^.

Использование культуры микроорганизма-деструктора ДБФ Н. егу1Ьгоро11в 7Ф способствует эффективному снижению 0,1* -ного загрязнения почвы днбутйлфталатом за 28 дней на 92 X. Иммобилизация культуры на торфяном носителе повывает эффективность процесса до 96 X. Максимальное из исследуемых загрязнений почвы -IX ДБФ, деградируется за 28 дней с использованием культуры -деструктора на 99 X, с использованием торфяного носителя -на 99.4Х. Количество клеток родококка, внесенного в загрязненную почву, после значительного увеличения к 14 суткам снижается к концу исследования в 8 раз по мере уменьпения концентрации субстрата. Численность аборигенных микроорганизмов в отличие от родококка в варианте с использованием культуры-деструктора, иммобилизованного на торфяном носителе в почве, загрязненной высокой концентрацией эфира ( IX), при незначительных колебаниях остается выше исходной до конца опыта. По всей вероятности именно аборигенные микроорганизмы используют остатки субстрата.

Деструкция ДЭГФ в почве протекает' аналогично разрушению ДМФ и ДБФ со скоростью больвей в вариантах с использованием культуры-деструктора эфира, иммобилизованной на торфе.

Представленный в главе материал демонстрирует принципиальную возможность практического использования микробиологического метода очистки почвы от эфиров о-фталевйй кислоты. Метод основан на использовании полученных нами высокоактивных игаммов микроорганизмов-деструкторов рода ЙНодососсиэ, интродуцированных в загрязненную почву, Иммобилизация их на природном материале -торфе, способствует интенсификации процесса очистки, не вызывающей сопутствующего' загрязнения почвы искусственными носителями.

Экологическая безопасность испытанного метода обеспечивается полной деструкцией эфиров, не приводящей к накоплению в почве токсичных промежуточных продуктов метаболизма при использовании

ятаммов-деструкторов, адаптированных к высоким концентрациям загрязняющих веществ без применения генетических модификаций.

ВЫВОДЫ

1. Изучена способность 107 культур микроорганизмов рода Rhodococcus использовать зфиры о-фталевой кислоты различного строения. Отобрано и изучено 42 »тамма-деструктора, утилизирующих эфиры о-фталевой кислоты в качестве единственного источника углерода. 11 культур активных деструкторов эфиров о-фталевой кислоты депонированы в Э1ПМ и коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии.

2. Исследованные культуры родококков утилизируют эфиры о-фталевой кислоты различного строения в концентрации 0,1-0,5* за 24-168 часов. При увеличении длины алкильиой цепи от Сг до Се скорость деструкции эфиров уменьшается.

3. Впервые изучена липаэная активность у родококков, утилизирующих эфиры о-фталевой кислоты. В культуральной жидкости больяинства исследованных культур активность фермента выяе, чем в бесклеточном экстракте.

4. Деструкция ' эфиров о-фталевой кислоты родококками происходит путем последовательного превращения их в моноэфир, а затем во фталевую кислоту, которая в результате декарбоксили-рования и гидроксилирования превращается в протокатеховую кислоту.

5. Разрыв ароматического кольца ПЕ1 родококками в процессе деградации эфиров о-фталевой кислоты идет по З-кетоадипиновому путч- Наличие у культур-деструкторов протокатехат-3,4-диоксиге-назы подтверждает орто-путь расщепления ароматического кольца протокатежовой кислоты родококками, отличный от пути утилизации эфиров у псевдомонад и микрококков.

6. Экспериментально обоснована принципиальная возможность использования полученных штаммов родококков для ускорения процессов естественного самоочищения почвы, загрязненной эфирами о-фталевой кислоты. Эффект очистки почвы от наиболее токсичного из эфиров о-фталевой кислоты -ДМФ в концентрации IX интродуцирован-ным втаммом-деструктороМ R, erythropolis 14Ф составляет 50Х за 28 суток. . Иммобилизация втамма-деструктора на торфяном носителе способствует увеличению эффекта очистки до 75 X.

СПИСОК ТРУДОО, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алещенкоыа 3. М. , Самсонова А. С. , Сайг.оса С. D. Использо ванне родог.<жп.ов для деструкции пластифиыторос. // XV Кендел. Съезд по общей и приклад, хинин. Тез. докл. С 4-х т. - Мм. , 1933. -Т. 4. -С. 3.

2. Алещенкова 3. И. , Самсонова А. С. , Сайкога С. D. Микробное превращение эфиров фталевой кислоты. // Загрязнение окружающей среды. Проблемы токсикологии и эпидемиологии. Те?, докл. между-нар. конф. -Москва-Пермь, 1993. -С. 149.

3. Алещенкова 3. Н. , Байкова С. С. , Самсонова A.C. Деструкция дибутилфталата и дк-(2-этилгексил)фталата F.hodococcua crythropc■ На. // Доклады Акад. наук Беларуси.-1904. -Т. 30, Н 6.-С. 04-06.

4. Алещенкова 3. И. , Байкова С. Р. , Самсоном А. С. -Кспользо вание микроорганизмов-деструкторов для очистки почвы, загрязненной выбросами производства лавсана. // Новые направления биотехнологии. Тез. докл. VI Конф. Российск. Федерации. - Пущино, 1094. -С. 12. •

5. Алещенкова 3. И. , Самсонова A.C. , Райкова С. В. , Семочкина И. Ф. Утилизация эфиров о-фталевой кислоты Rhodococcus erytliropo-lis. //Микробиология. -1995. -Т. 64, Hl. - С. 23-20.

8. Алещенкова. 3. И.., Самсонова A. C. , Байкова С. D. , Кукулям екая Т. А. . Деградация пластификаторов Rhodococcus erythi-ороПз 4ОФ. // М1кроб1олог1чний журнал. -199С. - Т. 58, К4. -С. 34 -3?.

7. Алещенкова 3. Н. , Самсонова А. С. , Байкова С. D. , Толстолуцкая Л. И. Никробная очистка сточных вод от эфнгов и- и м-фталевых кислот. // Тез. докл. междунар. конф. , лосвящ. памяти акад. А. А. Баева. Новые направления биотехнологии. - Пущино, 1990. -С. 148.

Гэзк-нэ

AU.:éf>ramiilnai) працы БАЙКОВАЯ Святиани Баллы) Ьиуни

" Разсурэнне зф!ра>г офталевай к!слаты сактэриям) р^ду

Ehodococcus"

Ключавыя слови. втам, палютант, д:-стр"кция, ííjPí-j;¡jii,jn, утилизация, матаСал1зм, эф!ры о фталевай кК'латы. фермамы, антрздукция. 1маб1л1зация, такс^чнасць, г1дрол1з, 1ндукция.

Упвряиию даследзвэн працэс раэбурзння эф!раУ íi Uiet-...ч клслати рознай будоеи (н-алк!льнага, разгалinaeaHaiа алкхль нагэ, ф^нхльнага ) DMaTfliKÍMi вхдам! роду tíhudocj^cus. Наказана, што ripu iiaEefliMDH'.ii даухын1 н-алг. хльпага ланцугу хутиаг.щ дэсгрукцы! змянцаоцца. МаОболт ampoKi спектр утилхзати зф^иу

0 фталсраЛ кхслати ат^ипани у нрадсгаунакиу 1йда R. е j y t Ьг 1 i Уиераыню атриманы дздзения аб '.уСстратн ай .. псцифхчн j.-ц i t-st-Ktíiiry, якЛ забяспочвае гхдролгз эфирау о-фталевай к1слэтн i прогакатэхат-3,4-дыокс1генаэи, якая удэельнÍ4a¿ ¡г раекладпши араматичнага кола протакатэхавай иЛслати Í працзсе дэградэщЦ 3$jpají. Прапзнавана схема яляху дэградацш эф1рау о-фталевай к1слатк 'í рэдакокау, якая ад£>оон1ваецца ад гэткай у псеудаманад

1 lúnpaKOKaJ: днзфiр ^ Moiia-j<Jip * фталовая к!слата > бензойная кДслата п•окехбензойная *1слата •> протакатэхавия гЛелатэ.

Ч/ к

Наяунаець актыунасц! протакатэхат-3,4-диокс ireiiaau i п!ракагэ-х0.н-1,2--ды.}кс1геназы сведчиць аб функциянаванн i 3-котаадып iiu ■ вага шллху у рздакокау при спахиваны! эф1рау о-фталеваЛ кК-латы. 3-к.б1аадип1нэт у вынгку добра дасладзваных метабалímhux пасля-дзунасця? мхнералгзуецца да СОг и HzO.

Упераыню наказана магчымасць Быварыстання иН:раац'а-Н1ама?-дэструктарау эфхрау о-фталевай к1елаты, 1маб1л1заваных на тарфянин носьгНце,. дзеля лакальнай ачистк! глебы ад найбольв таксгчнага эф1ру ДМ5> i шыроха раслаугюджаньи у наваколшыи асл-роддэ! ДБФ i ДЭГФ, эфектиунасць спахывання як!х активным! втамак1-дзструктарам1 у глебе складае 75, 99,4 i Э-1,41 адпа ведна. 1дэнтыф1кацыя метабал!тзу, nuin утвараюцца у лрацэсе дэс трукщП эфЦ>ау у глебе, микуляванай MÍK))4apraiii'3riaril дэструк тарам!, пацвярддае выключило экалаг1чкую блспеку внкзристання радакокау при штг>адукщй у природная i цтучннд асяроддг»}.

Резюме

диссертационной работы СЛЙСОВОЙ Светланы Валентиновны

"Раэрувенив эфиров о-фталевой кислоты бактериями рода Шюйоооссиз"

Ключевые слова: втамн, поллютант, деструкция, деградация, утилизация, метаболизм, эфиры о-фталевой кислоты, Ферменты, интродукция, иммобилизация, токсичность; гидролиз, индукция.

Впервые исследован процесс разрувения эфиров о-фталевой кислоты различного строения (н -алкилыюго, разветвленного алкильного, фенильного ) различными видами рода В1юс1осооси8. Показано, что при увеличении длины и-алкильной цепи скорость деструкции эфира уменьвается. Наиболее анрокнй споктр утилизации эфиров о-фталеной кислоты выявлен у представителей вид! 1?. егуЬЬгороНв. Впервые получены данные о субстратной специфичности фермента, обеспечивающего гидролиз эфиров о-фталевой кислоты н протокатехат-3,4-дноксигенаэы, участвующей в разрыве ароматического кольца протокатеХовой кислоты в процессе деградации эфиров. Предложена схема пути деградации эфиров о-фталевой кислоты у родококков, отличная от таковой у псеедомонад и микрококков: дм эфир* ионоэфир •» фталевая кислота бензойная к.ислота п-оксибенэойна* кислота -> протокатеховая кислота, наличие активности протокатехат-3,4-диоксигенэзи и пирокатехин 1,2-диоисигенаэы свидетельствует о функционировании Э-кетоадалипового пути у родококков при утилизации эфиров о фталевой кислоты, 3-кетоадипинат в результате хорошо изученных метаболических последовательностей минерализуется до СОа и НиО.

Впервые показана возмохность применения микроорганизмов-деструкторов ' эфиров о-фталевой кислоты, иммобилизованных на торфяном носителе, для локальной очистки почвы от наиболее токсичного ДМФ и широко распространенных в окрухающей среде ДЕФ н ДЭГФ, эффективность потребления которых активными атаммамн-деструкторами в почве составляет 75 , 93,4 н 94,1 * соответственно. Идентификация метаболитов, образующихся \в процессе деструкции эфиров в почве, инокулированной микроорганизмами-деструкторами, подтверхдает абсолютную экологнчесхую безопасность использования родококков при интродукции в природные и искусственные с роди.

SWHAPY

of the thesis by DAIKOVA !v?Ujrn Vilerit inovnn

" Degradation of ophthnlate esters by g"nus Rhodoec". c us

bacteria"

Key words: <fnfn, polln t m* . 'Ipc-mp^; It I "n , degindatimi , utilization, nptabolhii, o phthalate esters. ensyines, lntr?'1tio tion, immobilisation, toxicity, hydrolysis, induction.

Degradation of o-Fhthalnte inters different rtrunturo

(n-alkyl, branched alky], phenyl) by various specie? of Rhodococcus gen. wa3 originally in vest igated. Ester de<-omposl-tion rate was found to decrease at lung?» n-r\lkyl c-liainr. The broadest range of utilized o yhUinlate pit'rr vis r--veil<-d in R. arythropolis sp. Original findings on substrate specificity of enzyme responsible for hydrolysis of o-phthalate esters and protocatechuate-3,4-dioxygenase involved in disruption of aromatic ring in protoeatechuie acid during ester break-down uer< demonstrated. The novel scheme of o-phthalate ester degradation pathway in rhodococci different from pseudomonades and micrococci «as proposed: di^ster-» monoester > phthallc acid* benzoic acid* p-hydroxybenzpic acid-1» protocatechuic acid. Protocatechuate-3,4- d ioxygenasd and -cateehol-1,2-dio;iygenase activities testify to 3-ketoadipate route in rhodococci utilising o-phthalati- esters. 3-ketoadipate via woll-knuwn metabolic sequences is mineralized to CO a and l!aO.

The potential of microorganisms capable of o-phthalate cc tor dico»ipt'3itio]> immobilized on peat support Tor soil deconta-tiinaticn fro«, highly toxic DHF and widely distributed DCP and PfWr was disclosed, with utilization efficiency rates equalling 75, 99.4 and 04.4 X, respectively.

Identification of metabolites forned in the course of ester degradation in soil inoculated with microbial degraders evidence absolute env iron mental safety of rhodor-occi introduced into natural and artificial neois.-