Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального ацилирования спиртов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Мубараков, Артур Ильфатович

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Потенциал микроорганизмов - продуцентов липаз и карбоксил эстераз в энантиоселективном биокатализе.

1.1.1 Скрининг липолитических микроорганизмов.

1.1.2 Биосинтез липолитических ферментов.

1.2 Ферменты в органических растворителях.

1.2.1 Влияние рН.

1.2.2 Состояние фермента.

1.2.3 Выбор растворителя.

1.3 Биокатализ целыми клетками микроорганизмов в органической среде.

1.3.1 Токсичность растворителя.

1.3.2 Адаптация клеток в органическом растворителе.

1.4 Синтез сложных эфиров.

1.5. Синтез карбоксильных амидов.

1.5.1. Сложные карбокиэфиры как ацильные доноры.

1.5.2. Карбоксикислоты как ацильные доноры.

1.5.3. Энантиоселективный аминолиз.

1.5.3.1 Разделение доноров ацильной группы.

1.5.3.2. Разделение хиральных аминов.

2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования.

2.2 Материалы исследования.

2.2.1 Синтез модельных соединений.

2.2.1.2 Синтез оксима бутанона-2.

2.2.1.3 Синтез 2-аминобутана.

2.2.1.4 Синтез оптически активных соединений.

2.2.1.5 Синтез гераниолацетата путем этерификации.

2.3 Методы исследования.

2.3.1 Культивирование микроорганизмов.

2.3.2 Получение накопительных культур.

2.3.3 Выделение чистых культур микроорганизмов.

2.3.4 Хранение микроорганизмов.

2.3.5 Идентификация микроорганизмов.

2.3.6 Обработка биомассы ацетоном.

2.3.7 Трансформация соединений покоящимися клетками микроорганизмов.

2.3.8 Трансформация соединений обработанной ацетоном биомассой.

2.3.9 Определение концентрации белка и биомассы.

2.3.10 Определение эстеразной активности.

2.3.11 Определение концентрации субстратов и продуктов трансформации.

2.3.12 Идентификация продуктов трансформации кетосодержащих соединений.

2.3.13 Определение оптической чистоты продуктов биотрансформации.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Скрининг микроорганизмов с эстеразной активностью.

3.1.1 Выделение и экспресс-тестирование микроорганизмов обладающих эстеразной активностью.

3.1.2 Количественная оценка гидролазной активности выделенных микроорганизмов.

3.1.3 Поиск биокатализаторов среди музейных липолитических микроорганизмов.

3.2 Скрининг ацилирующей активности у микроорганизмов.

3.2.1 Разработка экспресс-метода для тестирования микроорганизмов на наличие ацилирукнцей активности.

3.2.2 Экспресс-тестирование ацилирующей активности у микроорганизмов.

3.3 Поиск микроорганизмов - потенциальных продуцентов энантиоселективных ацилирующих ферментов.

3.3.1 Исследование кинетики ацилирования гептанола-2 винилацетатом в условиях экспресс-метода.

3.3.2 Исследование зависимости степени конверсии субстрата от его начальной концентрации.

3.4 Исследование условий роста микроорганизмов и синтеза ферментов, ответственных за трансформацию вторичных спиртов.

3.5 Разработка биокатализаторов ацилирования на основе клеток микроорганизмов.

3.5.1 Исследование влияния обезвоженной ацетоном биомассы на гидролазную и ацилирующую активность клеток.

3.5.2 Принципиальная схема получения биокатализаторов парциального ацилирования спиртов.

3.6 Исследование стабильности биокатализатора при длительном хранении.

3.7 Исследование условий ацилирования гептанола-2 обезвоженными клетками.

3.7.1 Исследование влияния температуры на ацилирование гептанола-2.

3.7.2 Влияние природы органического растворителя на ацилирование гептанола-2.

3.8 Исследование этерификации гептанолаорганическими кислотами.

3.9 Исследование стабильности биокатализаторов в процессе ацилирования.

3.10 Идентификация перспективных штаммов и исследование патогенных свойств.

3.11 Разработка метода кинетического разделения гептанола-2.

3.12 Разработка метода разделения рацемического пентанола-2.

3.13 Разработка метода кинетического разделения 2,3-Дихлорпропанола.

3.14 Трансформация азотсодержащих органических соединений.

3.14.1 Трансформация 2-аминобутана.

3.14.2 Ацилирование оксима бутанона-2 винилацетатом, катализируемое обезвоженными ацетоном клетками микроорганизмов.

3.14.3 Трансформация М-ЗЕ-пентен-2-ил-орто-толуидина.

3.15 Разработка методов синтеза эфиров гераниола.

3.16 Ферментативный синтез эфиров глицерина.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального ацилирования спиртов"

Одной из основных проблем, стоящих перед химиками в области направленного синтеза сложных органических молекул, с целью получения веществ с избирательным действием на живые организмы (лекарственные препараты, феромоны насекомых и др.), является энантиоселективный синтез физиологически активных энантиомеров. В последние годы интенсивно развивается подход, использующий для создания хирального центра в молекуле оптически активные строительные блоки, полученные методами биотрансформации. Синтонами многих низкомолекулярных биорегуляторов являются различные оптически активные спирты и сложные эфиры. Наиболее эффективными способами получения таких соединений в современном органическом синтезе считается кинетическое разделение их рацемических смесей с помощью препаратов липаз и карбоксилэстераз. Такие ферменты не требуют кофактора и могут быть использованы для катализа парциального ацилирования спиртов, проявляя при этом в ряде случаев высокую стереоселективность. В настоящее время применение в органическом синтезе нашли лишь некоторые коммерческие препараты липаз и карбоксилэстераз, которые не всегда удовлетворяют требованиям, предъявляемым к промышленным биокатализаторам.

В литературе имеется большое число работ, убедительно доказывающих перспективность использования для синтеза многих важнейших синтонов низкомолекулярных биорегуляторов препаратов внеклеточных и внутриклеточных эстераз микроорганизмов. В то же время остается малоизученным и неоправданно забытым вопрос применения в парциальном ацилировании спиртов интактных клеток липолитических микроорганизмов. Вместе с тем клетки микроорганизмов с успехом применяются во многих других процессах трансформации органических соединений и в данном случае использование их в качестве биокатализаторов может оказаться экономически целесообразным по сравнению с препаратами ферментов, учитывая, с одной стороны, высокие затраты материалов и энергии на концентрирование и выделение внеклеточных и внутриклеточных ферментов /1,2/, а с другой стороны, значительный расход ферментов во время трансформации /3/.

Важнейшим преимуществом интактных клеток как биокатализаторов в реакциях гидролиза перед ферментными препаратами может являться возможность их регенерации и многократного использования. Особенно эффективным может оказаться использование клеток липолитических микроорганизмов в парциальном ацилировании рацемических спиртов. Известно, что проведение эффективного ацилирования в водной среде невозможно, поскольку присутствие воды в системе смещает равновесие ли-политической реакции в сторону гидролиза /3/. Поэтому приходится проводить реакцию в органическом растворителе, оказывающем дестабилизирующее действие на ферменты /4/. Для сохранения активности липазы в органическом растворителе требуется ее химическая модификация, иммобилизация на инертном носителе или включение в гидратированные обращенные мицеллы поверхностно-активного вещества. Одним из вариантов защиты фермента от инактивирующего действия органического растворителя может служить естественная локализация фермента внутри клеток или переплазматическом пространстве.

В связи с этим особенно актуальной является задача поиска новых эффективных и стабильных биокатализаторов для ферментативного асимметрического синтеза вторичных спиртов, а также их эфиров, обладающих широкой субстратной специфичностью и осуществляющих биотрансформацию со 100% химическим и энантиоселективным выходом.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с заданием Министерства образования РФ по тематическому плану НИР Уфимского государственного нефтяного технического университета (1998-2002 гг.): Федеральной целевой программой "Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки" (1997-2001 гг.); научно-технической программой «Научные исследования Высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» 1998-2002 гг.

Цель работы. Разработка биокатализаторов энантиоселективного ацилирования рацемических спиртов на основе микроорганизмов, обладающих карбоксилэстеразной активностью, и создание методов получения оптически активных спиртов и эфиров.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

• скрининг микроорганизмов, обладающих высокой эстеразной активностью;

• разработка экспресс-метода скрининга микроорганизмов, синтезирующих ферменты, способные ацилировать спирты в органических растворителях;

• разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального ацилирования спиртов на основе клеток микроорганизмов;

• исследование стабильности и условий эффективной работы биокатализаторов;

• разработка методов получения оптически активных спиртов и эфиров с использованием созданных биокатализаторов ацилирования;

• исследование синтетических возможностей полученных биокатализаторов.

Научная новизна. Найдены и идентифицированы новые штаммы Pseudomonas sp. 77-33, Pseudomonas sp. 77-47 и Pseudomonas sp. 59-3, на основе которых созданы стереоселективные биокатализаторы, эффективно катализирующие парциальное ацилирование рацемических спиртов. Разработаны научно обоснованные методы синтеза оптически активных спиртов и эфиров с использованием созданных биокатализаторов. Определены оптимальные параметры выращивания биомассы, найдены условия, в которых биокатализаторы проявляют наивысшую активность. Впервые предложен метод использования внутриклеточных ферментов для осуществления эффективного катализа реакций парциального ацилирования спиртов в неводных средах путем обезвоживания клеток ацетоном. Доказана повышенная стабильность и возможность многократного использования разработанных биокатализаторов.

Практическая значимость. Разработаны высокостереоселективные биокатализаторы на основе штаммов Bacillus sp. 77-1, Pseudomonas sp. 7733, Pseudomonas sp. 77-47 и Pseudomonas sp. 59-3, эффективно катализирующие ацилирование спиртов. Созданы препаративные методы получения (8)-(+)-гептанола-2, (Я)-(-)-гептанола-2, (8)-(+)-пентанола-2, (R)-(-)-пентанола-2, (11)-(-)-2,3-дихлорпропанола высокой оптической чистоты (97 -100 %ее), которые являются оптически активными синтонами при получении различных низкомолекулярных биорегуляторов (феромонов насекомых, Р-адренергетиков, цереброзидов, гормонов).

Методика разделения рацемических спиртов гептанола-2 и пентано-ла-2 используется в учебном процессе УГНТУ при подготовке специалистов по специальности 07.01.00- «Биотехнология».

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на второй Международной конференции «Актуальные тенденции в органическом синтезе на пороге новой эры» (Санкт-Петербург, июнь 1999г.); V Международной конференции по интенсификации нефтехимических процессов «Нефтехимия-99» (Нижнекамск, сентябрь 1999г.); XXXVII Международной научной студенческой конференции (Новосибирск, апрель 1999 г.); конференции молодых ученых (Уфа, апрель 1999); Международной научно-практической конференции «Сервис большого города» (Уфа, май 1999 г.); XII Международной конференции по производству и примене

10 нию химических реактивов и реагентов «Реактив-99», (Уфа-Москва, сентябрь 1999 г.); республиканской научной конференции «И.П. Павлов и современные проблемы биологии и медицины» {Уфа, октябрь 1999 г.); заочной научно-практической конференции "Биотехнология ФЦП "Интеграция" (Санкт - Петербург, июнь 1999 г.); XXXVIII Международной научной студенческой конференции (Новосибирск, 2000 г.); XIII Международной конференции по производству и применению химических реактивов и реагентов «Реактив-2000» (Уфа-Москва, 2000); XXXXIX Международной научной студенческой конференции (Новосибирск, 2001 г.); XIX Международной конференции по производству и применению химических реактивов и реагентов «Реактив-2001» (Уфа-Москва, 2001 г.); Всероссийской заочной конференции «Катализ в биотехнологии, химии и химических технологиях» (Тверь, 2002 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 16 докладов. и

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мубараков, Артур Ильфатович

выводы

1. В результате скрининга из природных источников выделены и идентифицированы микроорганизмы Pseudomonas sp. 77-33, 77-47 и 59-3, обладающие высокой эстеразной активностью.

2. Разработан экспресс-метод скрининга микроорганизмов, синтезирующих ферменты, катализирующие ацилирование спиртов в органическом растворителе, который основан на использовании агаровых блоков с выросшими на них культурами микроорганизмов.

3. На основе штаммов Bacillus sp. 77-1, Pseudomonas sp. 77-33, Pseudomonas sp. 77-47 и Pseudomonas sp. 59-3 разработаны энантиоселективные биокатализаторы парциального ацилирования спиртов. Установлено влияние параметров роста биомассы и трансформации на активность биокатализаторов, влияние условий хранения на их стабильность. Показана возможность многократного применения созданных биокатализаторов в течение длительного времени.

4. Предложена принципиальная технологическая схема получения энантиоселективных биокатализаторов парциального ацилирования спиртов.

5. Разработаны методы разделения рацемических гептанола-2 и пен-танола-2 путем их парциального ацилирования винилацетатом, позволяющие получать с высокими (70 - 80 %) выходами (8)-(+)-гептанол-2, (R)-(-)-гептанол-2 и (8)-(+)-пентанол-2, (11)-(-)-пентанол-2 высокой оптической чистоты (97-100 % ее).

6. Разработан метод парциального ацилирования рацемического 2,3-дихлорпропанола, позволяющий получать (Я)-(-)-2,3-дихлорпропанол высокой оптической чистоты (97 % ее).

7. Разработан биокаталитический метод ацилирования гераниола в мягких условиях, позволяющий получать гераниолацетат с высоким выходом (95 %).

Заключение

В литературе имеется много примеров использования препаратов липаз для получения оптически активных соединений путем ацилирова-ния рацемических субстратов. В последние годы появляются сведения о новых биокаталитических возможностях липаз и эстераз, связанные с получением оптически активных аминов и карбаматов, которые также являются ценными полупродуктами в синтезе лекарственных препаратов.

В настоящее время в энантиоселективном синтезе нашли применение только некоторые коммерческие препараты липаз и карбоксилэстераз, которые не всегда удовлетворяют требованиям, предъявляемым к промышленным биокатализаторам (высокой стереоселективностью, активностью, способностью катализировать реакцию с максимальным выходом, доступностью, стабильностью, возможностью многократного использования, широкой субстратной специфичностью и др.).

Альтернативным подходом в решении вопросов активности и сте-реоселективности биокатализатора может служить поиск новых эффективных микробных ферментов, а вопросы его стабильности и длительного использования могут быть значительно упрощены заменой ферментных препаратов целыми клетками, внешний слой которых защищает ферменты, локализованные внутри клетки или в переплазматическом пространстве, от неблагоприятного действия реакционной смеси.

2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

Объектами исследования служили накопительные культуры микроорганизмов, синтезирующих внеклеточные или внутриклеточные липазы и эстеразы, проявляющие высокую энантиоселективность в процессах разделения рацемических смесей спиртов, отселекционированные в результате многократных пассажей на минеральной среде с внесением этилацета-та, бутилацетата и винилацетата в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации 3 %, и выделенные из них 53 штамма бактериальных культур микроорганизмов.

2.2 Материалы исследования

Материалами исследования были чистые реактивы, синтезированные в химических лабораториях УГНТУ, НИИ «Реактив» и ИОХ УНЦ РАН (г.Уфа).

Вторгептанол, вторгептилацетат, оксим бутанона-2 и 2-аминобутан были синтезированы в лаборатории кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.

Синтезы рацемического вторпентанола и гераниола были осуществлены в лабораториях ИОХ УНЦ РАН (г.Уфа).

Материалами исследования также были чистые реактивы, производимые шосткинским заводом химреактивов: винилацетат, этилацетат, бу-тилацетат, ацетоуксусный эфир, гексан, изооктан, пентан, тлулол, изоок-тан, бензол, тетрагидрофуран, ацетонитрил, диэтиловый эфир, ацетон, изо-пропиловый спирт, уксусная кислота, олеиновая и валериановая кислоты.

Физические свойства некоторых исследуемых соединений:

Гептанол-2: Формула С7Н16О; М=116,20; ТКИП=160°С; показатель преломления 1,4210; плотность при 20°С р=0,817 г/см3. Масс-спектр, m/z:

98(3), 83(8), 57(3), 56(4), 55(13), 46(2), 45(100), 44(9), 43(11), 42(4), 39(5). Спектр ЯМР 13С в (CDC13) 5, м.д.: 67.2(СН), 39.5(СН2), 25,8(СН2), 32.23(СН2), 22.9(СН2), 13.9(СН3).

Гептил-2-ацетат: Формула C9Hi802; М=158,23; ТКИП=176,5°С; показатель преломления 1,416; плотность при 20°С р=0,874 г/см3. Масс-спектр, m/z: 143(1), 115(3), 102(6), 99(4), 98(24), 97(1), 88(4), 87(36), 83(4), 71(3), 70(16), 69(21), 61(12), 59(6), 58(14), 57(24), 56(46), 55(36), 54(4), 53(3), 45(8), 43(100), 42(18), 41(48), 39(15), 31(1), 29(30), 27(27), 26(1). Спектр ЯМР 13С в (CDCI3) 5, м.д.: 70.42(СН), 35.8(СН2), 26(СН2), 30,81(СН2), 22,54(СН2), 13,95(СН3), 170.38(C), 19.33(СН3), 21.29(СН3).

Пентанол-2: Формула C5Hi20; М=88,15; ТКИП=118°С; показатель преломления 1,4060; плотность при 20°С р=0,812 г/см3. Масс-спектр, m/z: 73(7), 70(1), 59(3), 57(2), 56(1), 55 (18), 46(2), 45(100), 44(8), 43(20), 42(4), 41(9), 40(1), 39(8), 31(9), 29(11), 28(3), 27(17), 26(3), 19(3), 15(9), 14(2). Спектр ЯМР 13С в (CDCI3) 8, м.д.: 67.2(СН), 41.77(СН2), 19.23(СН2), 14.13(СН3), 23.5(СН3).

Пентил-2-ацетат: Формула С7Н1402; М=130,85; ТКИП=130,5°С; показатель преломления 1,4040; плотность при 20°С р=0,879 г/см3. Масс-спектр, m/z: 115(1), 102(1), 88(1), 87(14), 86(1), 71(2), 70(12), 69(1), 61(3), 58(1), 56(1), 55(14), 53(1), 45(4), 43(100), 42(11), 41(9), 40(1), 39(6), 38(1), 31(1), 29(7), 27(8), 26(1). Спектр ЯМР 13С в (CDC13) 5, м.д.: 74.38(СН), 37.9(СН2), 18.39(СН2), 15.17(СН3), 169.67(C), 19.1(СН3), 20.72(СН3).

2-аминобутан: Формула C4HnN; М=73; ТКИП=63°С; показатель

О Я преломления 1,403; плотность при 20 С р=0,741 г/см . Масс-спектр, m/z: 72(2), 58(11), 57(1), 56(3), 55(2), 45(3), 44(100), 43(4), 42(9), 41(11), 40(1), 39(3), 30(10), 29(5), 28(11), 29(9), 26(2), 18(15), 15(7), 14(1). Спектр ЯМР 13С в (CDCI3) 5, м.д.: 48.79(СН), 33.42(СН2), 10.81(СН3), 23.95 (СН3).

2,3-дихлорпропанол: Формула С3Н6С120; М=129; ТКИП=184°С; показатель преломления 1,4620; плотность при 20°С р=1,306 г/см3. Масс-спектр, m/z: 94(1), 92(4), 79(1), 75(2), 66(6), 65(3), 64(50), 63(8), 62(100), 61(5), 57(7), 55(2), 51(1), 49(5), 43(5), 42(1), 41(1), 39(5), 38(3), 37(2), 36(5), 35(1), 32(5), 31(43), 30(1), 29(19), 28(21), 27(21), 26(6), 25(2), 18(29), 17(7), 15(5). Спектр ЯМР 13С в (CDC13) 5, м.д.: 64.71(СН2), 60.55(СН), 45.46(СН2).

2,3-ДИХлопропилацетат: Формула C5H8Cl202; М=171; ТКИП=199,3°С; показатель преломления 1,4440; плотность при 20°С р=1,242 г/см3. Масс-спектр, m/z: 162(1), 123(4), 121(12), 116(1), 112(1), 110(2), 103(4), 99(1), 86(4), 81(28), 80(3), 79(86), 78(2), 77(2), 75(5), 74(4), 73(7), 64(2), 63(1), 62(3), 61(8), 60(7), 57(1), 51(3), 50(1), 49(8), 45(8), 44(5), 43(100), 42(4), 41(1), 39(3), 38(1), 36(2), 31(3), 29(5), 28(2), 27(4), 18(5), 17(1), 15(12), 14(1). Спектр ЯМР 13С в (CDC13) 5, м.д.: 71.6(СН2), 60.03 (СН), 169.49(C), 45.55(СН2), 20.87(СН3).

Бутанон-2 оксим: Формула C4H9NO; М=87; ТКИП=152,5°С; показатель преломления 1,4210; плотность при 20°С р=0,900 г/см3. Масс-спектр, m/z: 83(2), 73(1), 72(3), 71(3), 70(11), 68(6), 60(1), 58(5), 56(3), 55(5), 53(4), 52(3), 51(3), 50(2), 45(1), 44(7), 43(20), 42(100), 41(26), 40(10), 38(4), 37(7), 32(7), 31(12), 30(5), 29(7), 28(6), 27(7), 26(5), 15(5). Спектр ЯМР 13С в (CDC13) 5, м.д.: 159.1(C), 28.9(СН2), 10.1(СН3), 13(СН3).

Гераниол: Формула СюН^О; М=154; ТКИП=230°С; показатель преломления 1,4760; плотность при 20°С р=0,889 г/см3. Спектр ЯМР 13С в (CDCI3) 5, м.д.: 58.64(СН2), 125.2(СН), 137.37(C), 38.43(СН2), 26.77(СН2), 124.48(СН), 131.34(C), 25.37(СН3), 16.88(СН3), 17.44(СН3).

Геранилацетат: Формула Ci2H20O2; М=196; ТКИП=247°С; показатель преломления 1,4610; плотность при 20°С р=0,916 г/см3. Спектр ЯМР 13С в (CDCI3) 5, м.д.: 61.3(СН2), 118.9(СН), 140.6(C), 39.62(СН2), 26.59(СН2), 123,93(СН), 132.1(C), 25.5(СН3), 170.7(C), 16.4(СН3), 17.45(СН3). 20.2(СН3).

-ЗЕ-пентен-2-ил-орто-толуидин: Формула C13H19N; М=189; ТКип=1500С при 15 мм рт. ст.; показатель преломления 1,5170; плотность при 20°С р=0,912 г/см3. Спектр ЯМР 13С в (CDC13) 8, м.д.: 142.55(C), 123.98(C), 130.01(СН), 120.06(СН), 128.24(СН), 115.09(СН), 50.22(СН), 23.45(СН3), 17.95(СН3), 116.84(СН), 123,67(СН), 18.64(СН3).

У-ЗЕ-пентен-2-ил-орто-толуидинацетамид: Формула C15H21NO; М=231; ТКИП=215°С при 15 мм рт. ст.; показатель преломления 1,5240; плотность при 20°С р=0,980 г/см3. Спектр ЯМР 13С в (CDC13) 5, м.д.: 132.64(C), 141.04(C), 121.07(СН), 126.75(СН), 126.63(СН), 129.26(СН), 17.83(СН3), 52.27(СН), 22.01(СН3), 168.69(C), 136.38(СН), 128.98(СН), 19.15(СН3), 22.86(СН3).

2.2.1 Синтез модельных соединений

Для выполнения поставленных задач и проведения исследований осуществлен синтез ряда соединений.

2.2.1.1 Синтез Гептанола-2

Для синтеза использовали хорошо высушенный прибор для перегонки с 60 см. колонкой Вигре. В перегонной колбе нагревали 0,2 моля карбонильного соединения с 1М раствором изопропилата алюминия, в абсолютном изопропиловом спирте, содержащем 0,2 моля изопропилата алюминия. Температуру нагревательной бани регулировали таким образом, чтобы скорость отгонки смеси изопропанола с ацетоном составляла 5 капель в минуту. Через несколько часов после начала отгонки дистиллят время от времени проверяли на присутствие ацетона (что является признаком еще продолжающейся реакции): образование мути и осадка при встряхивании нескольких капель дистиллята с 5 мл. солянокислого водного раствора 2,4-динитрофенилгидрозина (0,1 г в 2Н НС1). После того как проба дала отрицательный результат, нагревали еще 15 минут с полным возвратом дистиллята и повторяли пробу. После повторной проверки на ацетон основную массу изопропанола отгоняли в слабом вакууме. К остатку прибавляли 500 г. льда на каждый моль взятого для реакции изопропилата, гидролизовали 550 мл. охлажденной на льду 6Н H2S04 или НС1. Экстрагировали эфиром, эфирный слой промывали 1 раз водой, сушили сульфатом натрия, отгоняли растворитель, а остаток перекристаллизовывали или перегоняли.

Ненасыщенные карбонильные соединения не смешивали перед началом реакции с изопропилатом натрия, а готовили из них раствор, добавляя на каждые 0,1 моля карбонильного соединения 100 мл. абсолютного изо-пропилового спирта и уже этот раствор постепенно в течении 6 часов прибавляли к кипящему раствору изопропилата, отгоняя одновременно смесь ацетона с изопропанолом. Через 1 час после окончания добавления карбонильного соединения проба на ацетон в дистилляте бывает обычно отрицательной. Не растворяется в воде Хроматомасс-спектрометрический анализ показал чистоту 99%.

2.2.1.2 Синтез оксима бутанона-2

В 0,5 л 3-х горлую колбу с мешалкой и ртутным затвором, обратным холодильником и капельной воронкой помещают 34,8 г. (0,5М) раствор солянокислого гидроксиламина в 60 мл воды и 0,4М бутанона-2. При перемешивании в течении 2-х часов приливают 0,25М (26,5 г) раствор Na2C03 в 100 мл воды. Нагревают на водяной бане 5 часов, охлаждают и экстрагируют эфиром 3-мя порциями по 100 мл. Экстракты промывают водой, сушат и пенрегоняют под вакуумом 96-97°С/5 мм. Выход 93-95%.

2.2.1.3 Синтез 2-аминобутана

В двухгорлой колбе 1 л с широким холодильником нагревают до кипения 1 моль оксима бутанона-2 и 400 мл н-бутилового спирта. К кипящему раствору прибавляют 30 гр. натрия (порциями по 4-5 гр. через каждые

10-20 мин). После замедления реакции продолжают нагревать с обратным холодильником до прктически полного растворения всего натрия. К охладившейся реакционной массе прибавляют 300 мл воды и отгоняют бутиловый спирт и амин, проверяя дистиллят на содержание амина; при необходимости прибавляют еще некоторое количество воды и продолжают отгонку до полного удаления амина. Дистиллят подкисляют до слабокислой реакции и упаривают до объема 60 мл. К концентрату добавляют еще 100 мл воды и перегоняют до полного упаривания бутилового спир-та.Концентрированный раствор гидрохлорида амина, свободный от бутилового спирта, пересыщают щелочью, амин отделяют (при необходимости извлекают эфиром) и сушат едким натрием. Перегонкой получают амин в чистом виде.

2.2.1.4 Синтез оптически активных соединений.

Синтез (8)-(+)-гептанола-2 и (8)-(+)-пентанола-2 осуществляли путем микробиологической трансформации из рацемических гептанола-2 и пентанола-2 соответственно, выделенными высокостереоселективными штаммом Pseudomonas sp. 77-47 и Pseudomonas sp. 77-33. Синтез (R)-(-)-гептанола-2 и (Я)-(-)-пентанола-2 осуществлялся из рацемических гептанола-2 и пентанола-2 при трансформации штаммами Pseudomonas sp. 59-3 и Bacillus sp. 77-1.

Для проведения реакции в стандартных условиях клетки выращивали на агаризованном сусле с содержанием Сахаров 3°б на чашках Петри (среда СР-3) в течение 60 часов. Культуры собирали и отмывали от среды центрифугированием, промывая трижды 0,05М фосфатным буфером рН 7,0. Концентрация биомассы клеток в буфере составляла 8,5 мг(асв)/мл. Затем клетки подвергали предобработке ацетоном.

Реакцию проводили в н-гексане при перемешивании и температуре 30 °С покоящимися клетками микроорганизмов, обработанными ацетоном.

Оба субстрата вводили в концентрации 10 г/л, контролируя уровень конверсии и накопления продукта методом ГЖХ. Продолжительность реакции составляла 24 часа. После того, как реакция прошла, клетки отделяли от реакционной среды центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин.

Образовавшиеся энантиомеры спиртов и эфиров разделяли методом колоночной жидкостной хроматографии на селикагеле, используя в качестве элюента этилацетат/гексан.

Идентификацию полученных соединений осуществляли методами хромато-масс-спектрометрии.

2.2.1.5 Синтез гераниолацетата путем этерификации

Синтез гераниолацетата осуществляли путем этерификации гераниола винилацетатом в присутствии биокатализатров на основе штаммов Bacillus sp. 77-1, Pseudomonas sp.77-47, Pseudomonas sp.77-33 и Pseudomonas sp. 59-3.

Для проведения реакции в стандартных условиях клетки выращивали на агаризованном сусле с содержанием Сахаров 3°б на чашках Петри (среда СР-3) в течение 60 часов. Культуры собирали и отмывали от среды центрифугированием, промывая трижды 0,05М фосфатным буфером рН 7,5. Концентрация биомассы клеток в буфере составляла 8,5 мг(асв)/мл. Затем клетки подвергали предобработке ацетоном.

Реакцию проводили в н-гексане при перемешивании и температуре 30 °С ацетоновым порошком микроорганизмов. Субстраты вводили в эк-вимолярных количествах в концентрации 10 г/л, контролируя уровень его конверсии и накопления продукта методом ГЖХ. Продолжительность реакции составляла 48 часов. После того, как реакция прошла, клетки отделяли от реакционной среды центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин.

Количество и идентификацию продуктов реакции проводили методом хроматомасс-спектрометрии.

2.3 Методы исследования

2.3.1 Культивирование микроорганизмов

Микроорганизмы выращивали на агаризованной сусле с содержанием Сахаров 3°б (СР-3) следующего состава (%):

Сусло 3°б 98,2 агар-агар 1,8 или агаризованном гидролизате кильки следующего состава (г/л): агар-агар 18 гидролизат кильки 35

Питательную среду стерилизовали в автоклаве в течение 45 минут при температуре 120 °С. В стандартных условиях выращивание микроорганизмов проводили на чашках Петри в термостатированных условиях при температуре 30 °С в течение 24-80 ч.

Выращенную культуру собирали центрифугированием, трижды промывали 0,05 М фосфатным буфером (рН=7,0) и использовали для трансформации эфиров.

2.3.2 Получение накопительных культур

Для получения накопительных культур, способных гидролизовать винилацетат, этилацетат и бутилацетат в аэробных условиях использовали питательную среду следующего состава (СР-1).

NaHP042H20 1,0 г/л

КН2Р04 0,6 г/л

NH4)2S04 1,0 Г/Л

MgS04 7H20 0,2 г/л

FeS04 7H20 0,01 г/л

Na2Mo04 2H20 0,002 г/л

MnS04 0,01 г/л Дистиллированная вода 1 л

В качестве источника углерода и энергии в синтетическую среду вводили этилацетат, винилацетат и бутилацетат в концентрации 0,5 %. Отобранные пробы почв вносили по 10 г в колбы, содержащие минеральные среды СР-1. Образцы инкубировали на качалке (150 об/мин) и температуре 28-3 0°С в течение суток. Затем заменяли 80 % культуры свежей питательной средой и инкубировали далее для обогащения накопительных культур.

2.3.3 Выделение чистых культур микроорганизмов

Выделение чистых культур производили высевом культуры накопления микроорганизмов на агаризованное сусло. Для определения культур синтезирующих липолитические ферменты в агаризованное сусло добавлялся фенофтолеин. Из колоний отдельного вида делали отсевы в пробирки со скошенным питательным агаризованным суслом 3°Б.

После соответствующей инкубации все посевы на косой агар контролировали на чистоту сначала визуальным контролем на отсутствие посторонних видов по штриху на агаре, затем идентичность клеток контролировали под микроскопом.

2.3.4 Хранение микроорганизмов

Выделенные микроорганизмы хранили: в пробирках со скошенной агаризованной средой СР-3 при температуре 4+6 °С. Для поддержания культуры периодически, каждые пять месяцев, производили пересев на свежие среды. При каждом пересеве проверяли чистоту культуры, под микроскопом;

2.3.5 Идентификация микроорганизмов

Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили на основании 9 издания "Определителя бактерий Берги"/149/, а также ключами и диагностическими таблицами /150,152, 153/ . Морфологию клеток и цикл развития исследовали на препаратах 6,24,48,72 и 96-часовых культур, выращенных на скошенной питательной среде, методами световой микроскопии с использованием фазового контраста. Рутинные тесты (окраска по Граму, определение кислотоустойчивости и др.), описание колоний и изучение физиолого-биохимических и цитологических признаков проводили по /150,152,153/. Наличие изомеров диаминопимелиновой кислоты (ДАПК), моносахаридный состав клеток определяли по принятым методикам/154,155,156/.

2.3.6 Обработка биомассы ацетоном

Исследуемую биомассу заливали ацетоном (1:3), перемешивали, выдерживали 15 минут. Затем отфуговывали при 6000G в течении 15 минут. Полученный порошок высушивали при комнатной температуре.

2.3.7 Трансформация соединений покоящимися клетками микроорганизмов

Трансформацию покоящимися клетками микроорганизмов, отмытыми от среды, осуществляли в двухфазной системе 0,05 М фосфатном буфере рН=7 и гексан при температуре 30 °С, при перемешивании (стандартных условиях). Концентрация биомассы исследуемых штаммов находилась на уровне 10-13 мг(АСВ)/мл. Исходная концентрация субстратов составляла-5,0 г/л.

2.3.8 Трансформация соединений обработанной ацетоном биомассой

Трансформацию клетками обработанными ацетоном осуществляли в гексане при температуре 30 °С при перемешивании (стандартных условиях). Концентрация биомассы исследуемых штаммов находилась на уровне 10-30 мг(АСВ)/мл. Исходная концентрация субстратов составляла - Юг/л.

2.3.9 Определение концентрации белка и биомассы

Концентрацию белка в культуральной жидкости и биомассы микроорганизмов оценивали измерением мутности клеточных суспензий на спектрофотометре "Specol-221" с нефелометрической приставкой при X = 520 нм (длина оптического шага кюветы - 10 мм). Измерения проводили против дистиллированной воды. Данные нефелометрирования пересчитывали на сухой вес, используя стандартную кривую для белка и данного вида микроорганизма, соответственно.

2.3.10 Определение эстеразной активности

Эстеразную активность клеток и ацетоновых порошков оценивали по начальной скорости образования продукта. Концентрация биомассы находилась на уровне 10-13 мг (асв)/мл. Определение проводили в 0,05М фосфатном буфере (рН=7,0) или гексане при температуре 30 °С. Концентрация субстрата составляла 5,0 г/л или 0,1 м/л, соответственно.

2.3.11 Определение концентрации субстратов и продуктов трансформации

Изменение концентрации субстратов и продуктов трансформации контролировали в пробах, предварительно осветленных центрифугированием при 5000 об/мин, используя метод ГЖХ.

Определение концентраций выполняли на хроматографе JTXM 8МД, снабженном пламенно-ионизационным детектором, на трехметровой колонке (d = 3 мм) с неподвижной фазой SE - 30 (5%) на хроматоне AW. В качестве газа-носителя служил азот. Анализ проводят при следующих параметрах:

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Мубараков, Артур Ильфатович, Уфа

1. Hernaiz M.D., Sanchez-Montero J.M., Sinisnterra J.V. Improved stability of the lipase from Candida rugosa in different purification degrees by chemical modification. Biotechnol. Techn. -1996. -10, N12-p.917-922.

2. Braun В., Klein E., Lopez J. Immobilization of Candida rugosa lipase to nylon fibers using its carbohydrate groups as the chemical link. Biotechnol. and Bioeng. 1996.- 51. - № 3. - p. 327 - 341.

3. Гладилин A.K., Левашов A.B. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями. Биохимия. 1998. - т.63., с. 408 - 421.

4. Давранов К.Д., Халанейзер В.Б., Вагина О.Н. Синтетазная активность липазы из Penicillium sp. в водной среде и в системе обращенных мицелл. Прикл. биохим. и микробиол. 1996. - т.32, № 4. - с. 386 - 388.

5. Jaeger К.Е., Ransac S., Dijkstra B.W., Colson С., van Heuvel M and Misset O. Bacterial lipases. FEMS Microbial. Rev. 1994. 15, p. 29-63.

6. Brune K.A. and Gotz F. Degradation of lipids by bacterial lipases. In: Microbial degradation of natural products (Ed. G. Winkelmann). VCH, Wein-heim, New York. 1992, p. 243-266.

7. Soberon-Chavez G. and Palmeros B. Pseudomonas lipases: molecular genetics and potential industrial application. Crit. Rev. Microbiol. 1994. - 20, p. 95-105.

8. Аренде И.М., Дорохов B.B., Турочкина T.M. Препараты липазы из глубинной культуры Aspergillus Awamori 259 и их характеристика. Прикл. Биохим. И микробиол. 1974. -т. 10. - № 1. - с. 92-98.

9. Samad M.Y.A., Razak C.N.A., Salleh А.В., Yunus W.M.Z.W, Ampon K. and Basri M. A plate assay for primary screening of lipase activity. 1989. - J. Microbiol. Methods. - № 9. - p. 51-56.

10. Kouker G., Jaeger K.E. Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases. 1987.-Appl. Environ. Microbiol. -№53. -p. 211-213.

11. Dupuis C., Corre C., Boyaval P. Lipase and esterase activities of Propioni-bacterium freudenreichii subsp. freudenreichii. Appl. Environ. Microbiol. -1993.-№59.-p. 4004-4009.

12. Sierra G. A simple method for the detection of lipolytic activity of microorganisms and some observations on the influence of the contact between cells and fatty substrates. 1957. - Antonie Leeuwenhoek. - 23. - p. 15-22.

13. Jarvis G.N. The microbiology of anaerobic digestion tallow hydrolysis. -1995. Phd Thesis, University of Otago, Dunedin.

14. Mackie R.I., White B.A. and Bryant M.P. Lipid metabolism in aerobic ecosystems. 1991. - Crit. Rev. Microbiol. - № 17. - p. 449-478.

15. Jensen R.G. detection and determination of lipase (acylglicerol hydrolase) activity from various sources. 1983. - Lipids. - № 18. - p. 650-657.

16. Hobson P.N. and Mann S.O. The isolation of glycerol fermenting and lipolytic bacteria from the rumen of the sheep. 1961. - J. Gen. Microbiol. -№25.-p. 227-240.

17. Vorderwulbecke Т., Kieslich K. and Erdmann H. Comparison of lipases by different assays. 1992. Enzyme Microb. Technol. - № 14. - p. 631-639.

18. Shelley A.W., Deeth H.C. and MacRae I.C. Review of methods of enumeration, detection and isolation of lipolytic microorganisms with special reference to dairy applications. J. Microbiol. Methods. 1987. - № 6. - p. 123137

19. Hofelmann M., Hartmann J., Zink A., Schreier P. Isolation and characterization of lipase isoenzymes from technical Aspergillus niger enzyme. 1985. -J. Food Sci. 50: p. 1721- 1725.

20. Commenil P., Belingheri L., Sancholle M. and Dehorter B. Purifications and properties of an extracellular lipase from the fungus Botrytis cinerea. -1995. Lipids. -30: p. 351-356.

21. Rivera G., Tinoco J.R., Sanchez S., Farres A. Production of microbial lipases in a solid state fermentation system. 1991. - Biotechnol. Lett. - № 4. -p. 277-280.

22. Nahas E. Control of lipase production by Rhizopus oligosporus under various growth conditions. 1988. - J. Gen. Microbiol. - № 134. - p. 227-233.

23. Hou C.T. Screening of microbial esterases for asymmetric hydrolysis of 2-ethylhexyl butyrate. 1993. - J. Indust. Microbiol. - № 11. - p. 73-81.

24. Graem N.J. and Jurgen H.T. Qualitative Rhodamine В assay which uses tallow as a substrate for lipolytic obligately anaerobic bacteria. J. of Microbiol. Methods. 1997. - № 29. - p. 41-47.

25. Toshiyuki F., Ronghui Su, Hiroshi O. and Jyoji K. Simple screening method for lipase for transesterification in organic solvent. Enzyme and Microb. Technol. 1995. -№ 17.-p. 1067-1072.

26. Аренде И.М., Дорохов B.B., Сверчкова T.M. Биосинтез ферментов микроорганизмами: Тез. докл. III Всесоюз. Конф. Кобулети, 1986. с. 21.

27. Maliszewska I. and Mastalerz P. Production and some properties of lipase from Penicillium citrinum. Enzyme Microb. Technol. 1992.- № 14. - p. 190-193.

28. Nahas E. Control of lipase production by Rhizopus oligosporus under various growth conditions. J. gen. Microbiol. 1988. № 134. - p. 227-233.

29. McNeill GP, Sonnet PE. Low-calorie triglyceride synthesis by lipase-catalyzed esterification of monoglycerides. J Am Oil Chem Soc 1995;72:1301-7.

30. Kawakami К. Enhancement of thermostability of lipase by the sol-gel entrapment into methyl-substituted organic silicates formed on diatomaceous earth. Biotech. Technic. 1996. v. 10. - № 7. p. 491-494.

31. Даврвнов К.Д., Табак М.Я. Влияние источников углерода на синтез липазы микромицетом Oospora lactis. Прикл. Биохим. и Микробиол. 1990. т. 26.-№3.-с. 403-408.

32. Гулямова К.А., Давранов К.Д. Влияние условий культивирования на образование вне- и внутриклеточной липазы грибом Mucor miehei. Прикл. Биохим. и Микробиол. 1993. т. 29. - № 1, - с. 706-711.

33. Dordick, JS Enzymatic catalysis in monophasic organic solvents. Enzyme and Microbial Technology. 11, 1989, 194-211

34. Brink, LES and Tramper, J. Optimization of organic solvent in multiphase biocatalysis. Biotechnol. Bioeng. 1985. 27: 1258- 1269

35. Klibanov, AM Asymmetric transformations catalyzed by enzymes in organic solvents. Accounts of Chemical Research. 1990. 23:114-120

36. Klibanov, AM Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. Chemtech. 1986, 16, 354-359.

37. Klibanov AM. Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. Trends Biol Sci. 1989. 14:141-144

38. Khmelnitsky, Y.L., Levashov, A.V., Klyachko, N.L., and Martinek, K. (1988) Engineering biocatalytic systems in organic media with low water content. Enzyme Microb. Technol. 10, 710-724

39. Gerben M Zijlstra , Cornells D de Gooijer and Johannes Tramper Extractive bioconversions in aqueous two-phase systems // Current Opinion in Biotechnology 1998, 9:171-176

40. R. Leo'n, P. Fernandes, H. M. Pinheiro, and J. M. S. Whole-cell biocatalysis in organic media Cabral Enzyme Microb. Technol., 1998, vol. 23,

41. Gerard A. Sellek, Julian B. Biocatalysis in organic media using enzymes from extremophiles // Chaudhuri Enzyme and Microbial Technology 25 (1999) 471-482

42. Wong, С. H.; Whitesides, G. M. Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, Pergamon, Oxford, 1994, pp. 41-49.

43. Woudenberg-van Oosterom M, van Rantwijk F, Sheldon RA. Regi-oselective acylation of disaccharides in tert-butyl alcohol catalyzed by Candida antarctica lipase. Biotechnol Bioeng 1996;49, pp. 328 -333.

44. Sugihara A, Shimada Y, Nakamura M, Nagoa T, Tominaga Y. Positional and fatty acid specificities of Geotricum candidum lipases. Protein Eng 1994; 7: pp. 85-88.

45. Klein RR, King G, Moreau RA, McNeill GP, Villeneuve P, Haas MJ. Additive effects of acyl-binding site mutations on the fatty acid selectivity of Rhizopus delemar lipase. J. Am. Oil. Chem. Soc. 1997. p. 74.

46. Villeneuve P, Pina M, Skarbek A, Graille J, Foglia ТА. Specificity of Carica papaya latex in lipase-catalyzed interesterification reactions. Biotechnol. Tech. 1997.-11.-p. 91-94.

47. Zaks A, Klibanov AM. Enzymatic catalysis in organic media at 100°C. Science 1984; 224:1249-51.

48. Chulalakananukul W, Condoret JS, Delorme P, Willemot RM. Kinetic study of esterification by immobilized lipase in n-hexane. FEBS Lett 1990; 276: 181-4.

49. Ramamurthi S, McCurdy AR. Lipase-catalyzed esterification of oleic acid and methanol in hexane a kinetic study. J Am Oil Chem Soc 1994; 71: 927-30.

50. From M, Adlercreutz P, Mattias.son B. Lipase catalyzed esterification of lactic acid. Biotechnol Lett 1997; 19: 315-17.

51. Charton M, Ziffer H. Contributions of steric, electrical, and polarizability effects in enantioselective hydrolyses with Rhizopus nigricans: a quantitative analysis. J Org Chem 1987; 52:2400 -3.

52. Gandhi NN, Sawant SB, Joshi JB. Specificity of a lipase in ester synthesis: effect of alcohol. Biotechnol Prog 1995; 11: 282-7.

53. Kim H-K, Park S-Y, Lee J-K, Oh T-K. Gene cloning and characterization of thermostable lipase from Bacillus stearothermophilus LI. Biosci Biotechnol Biochem 1998; 62: 66-71.

54. Egloff M-P, Marguet F, Buono G, Verger R, Cambillau C, van Tilbeurgh H. The resolution structure of the pancreatic lipase-colipase complex inhibited by a CI 1 alkyl phosphonate. Biochemistry 1995; 34: 2751- 62.

55. Drablos F, Petersen SB. Identification of conserved residues in family of esterase and lipase sequences. Methods Enzymol 1997; 284:28-61.

56. Burgess K, Jennings LD. Enantioselective esterifications of unsaturated alcohols mediated by a lipase prepared from Pseudomonas sp. J Am Chem Soc 1991; 113:6129-39.

57. From M, Adlercreutz P, Mattiasson B. Lipase catalyzed esterification of lactic acid. Biotechnol Lett 1997;19:315-17.

58. Charton M, Ziffer H. Contributions of steric, electrical, and polarizability effects in enantioselective hydrolyses with Rhizopus nigricans: a quantitative analysis. J Org Chem 1987;52:2400 -3.

59. Bevinakatti HS, Banerji AA. Lipase catalysis: factors governing transesteri-fication. Biotechnol Lett 1988;10:397- 8.

60. Sonnet PE, Foglia ТА, Feairheller SH. Fatty acid selectivity of lipases: eru-cic acid from rapeseed oil. J Am Oil Chem Soc 1993;70: 387-91.

61. Aldercreutz P. and Mattiasson B. (1987) Aspects of biocatalyst stability in organic solvents. BIOCATALYSIS., 1, 99-108.

62. Zaks A, Klibanov AM. 1986. Substrate specificity of enzymes in organic solvents vs. water is reversed. J Am Chem Soc 108:2767-2768.

63. Russell, A. J., and Klibanov, A. M. (1988). Inhibitor-induced Enzyme Activation in Organic Solvents. J. Biol. Chem. 263,11624-11626.

64. Tawaki S and Klibanov A M (1992) Inversion of enzyme enantioselectivity mediated by the solvent. Journal of the American Chemical Society, 114, 1882-1884.

65. Fitzpatrick, P.A. & Klibanov, A.M. 1991. How can the solvent affect enzyme enantioselectivity? J. Amer. Chem. Soc. 113: 3166-3171.

66. A.L. Gutman and T. Bravdo, Enzyme Catalysed Enantioconvergent Polymerisation of beta-Hydroxy-glutarate in Organic Solvents, J. Org. Chem., 54, 5645 (1989).

67. Facile enzymatic preparation of monoacylated sugars in pyridine. M. Therisod and A.M. Klibanov, J. Amer. Chem. Soc. 1986, 108, 5638.

68. Anderson, E. & Hahn-Hagerdahl, B. 1990. Bioconversions in aqueous 2-phase systems. Enz. Micr. Technol. 12: 242-254.

69. Lilly, M. D. 1982. Two-liquid-phase biocatalytic reactions. J. Chem. Tech. Biotechnol. 32: 162-169.

70. Kim KH, Kwon DY and Rhee JS (1984) Effects of Organic Solvents on Lipase for Fat Splitting. Lipids 19:975-977

71. Brink, L.E.S. and Tramper, J. 1985. Optimization of organic solvent in multiphase biocatalysis. Biotechnol. Bioeng. 27: 1258- 1269.

72. Zaks, A. & Klibanov, A.M. 1988. Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. J. Biol. Chem. 263: 3194-3201.

73. Zaks, A. & Klibanov, A.M. 1985. Enzyme-catalyzed processes in organic solvents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3192-3196.

74. Rekker, R.F. & de Kort, H.M. (1979). The hydrophobic fragmental constant; an extension to a 1000 data point set. European Journal of Medicinal Chemistry , 14, 479-488.

75. Laane, C., Boeren, S., Vos, K., and Veeger, C. Rules for the optimization of biocatalysis in organic sovents. Biotechnol. Bio-eng., 30, 81-87, 1987.

76. Inoue, A. and Horikoshi, K. A Pseudomonas putida thrives in high concentration of toluene. Nature, 338,264-266,1989.

77. Lee, J. Y., Choi, Y. В ., and Kim, H. S. Simultaneous biodegradation of toluene and p-xylene in a novel bioreactor: Experimental results and mathematical analysis. Biotechnol. Prog., 9,46-53, 1993.

78. Wubbolts, M. G., Reuvekamp, P., and Witholt, B. TOL plasmid specified xylene oxygenase is a wide substrate range monooxygenase capable of olefin epoxidation. Enzyme Microb. Technol., 16, 608-614, 1994.

79. Carrea. G. Biocatalysis in water-organic solvent two-phase systems. Trends Biotechnol., 2, 102-106, 1984.

80. Brink, L. E. S. and Tramper, J. Optimization of organic solvent in multiphase biocatalysis. Biotechnol. Bioeng., 27, 1258-1269, 1985.

81. Bruce, L. J. and Daugulis, A. J. Solvent selection strategies for extractive biocatalysis. Biotechnol. Prog., 7,116-124,1991.

82. Cabral, J. M. S. Extractive removal of product by biocatalysis. In: Extractive Bioconversions (Mattiasson, O. and Hoist, O., Eds.). Marcel Dekker Inc., New York, 207-235, 1991.

83. Van Sonsbeek, H. M., Beeftink, H. H., and Tramper, J. Two-liquid phase bioreactors. Enzyme Microb. Technol., 15, 722-728,1993.

84. Salter, G. J. and Kell, D. B. Solvent selection for whole cell biotransformation in organic media. Crit. Rev. Biotechnol., 15, 139-177, 1995.

85. Brink, L. E. S., Tramper, J., Luyben, A. M., and Van't Riet, K. Biocatalysis in organic media. Enzyme Microb. Technol., 10, 736-743, 1988.

86. Rekker, R. F. and Mannhold, R. Calculation of Drug Lipophilicity. The Hydrophobic Fragmental Constant Approach (Rekker, R. F. and Mannhold, R., Eds.). VCH, Mannheim, 1-113,1992.

87. Inoue, A. and Horikoshi, K. Estimation of solvent tolerance of bacteria by solvent parameter log P. J. Ferm. Bioeng., 3, 194-196, 1991.

88. Bassetti, L. and Tramper, J. Organic solvent toxicity in Morinda citrifolia cell suspensions. Enzyme Microb. Technol., 16, 642-648, 1994.

89. Rajagopal, A. N. Growth of Gram-negative bacteria in the presence of organic solvents. Enzyme Microb. Technol., 19, 606-613, 1996.

90. Janssen, A. E. M., van der Padt, A., van Sonsbeek, H. M., and van't Riet, K. The effect of organic solvents on the equilibrium position of enzymatic cyl-glycerol synthesis. Biotechnol. Bioeng., 41, 95-103, 1993.

91. Schneider, L. V. A three-dimensional solubility parameter approach to nonaqueous enzymology. Biotechnol. Bioeng., 37, 627-638,1991.

92. Sikkema, J., Weber, F. J., Heipieper, H. J., and de Bont, J. A. M. Cellular toxicity of lipophilic compounds: Mechanisms, implications and adaptations. Biocatalysis, 10,113-122, 1994.

93. Heipieper, H. J. and de Bont, J. A. M. Adaptation of Pseudomonas putida S12 to ethanol and toluene at the level of fatty acid composition of membranes. Appl. Environ. Microb., 60, 4440-4444,1994.

94. Weber, F. J., Ooijkaas, L. P., Schemen, R. M. W., Hartmans, S., and de Bont, J. A. M. Adaptation of Pseudomonas putida S12 to high concentrations of styrene and other organic solvents. Appl. Environ. Microb., 59, 3502-3504, 1993.

95. Ingram, L. O. Changes in lipid composition of Escherichia coli resulting from growth with organic solvents and with food additives. Appl. Environ. Microbiol., 33, 1233-1236, 1977.

96. Weber, F. J., Isken, S., and de Bont, J. A. M. Cis/trans isomerization of fatty acids as a defense mechanism of Pseudomonas putida strains to toxic concentrations of toluene. Microbiology, 140, 2013-2017,1994.

97. Keweloh, H., Weyracuch, G., and Rehm, H. J. Phenol-induced membrane changes in free and immobilized Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 33, 66-71, 1990.

98. Heipieper, H. J., Weber, F. J., Sikkema, J., Keweloh, H., and de Bont, J. A. M. Mechanisms of resistance of whole cells to toxic organic solvents. Trends Biotechnol., 12, 409-415,1994.

99. Isken, S. and de Bont, J. A. M. Active efflux of toluene in a solvent-resistant bacterium. Appl. Environ. Microbiol., 178, 6056-6058,1996.

100. S. Riva, M. Nonini, G. Ottolina, В Danieli. Subtilisin-catalyzed esterifica-tion of di- and oligosaccharides containing a D-fructose moiety. Carbohydrate Research, 314 (1998) 259-266.

101. R. T, Otto, U. T. Bornscheuer, C. Syldatk, R. D. Schmid. Lipase-catalyzed synthesis of arylaliphatic esters of p-D(+)-glucose, n-alkyl- and arylglucosides and characterization of their surfactant properties. J. of Biotechnology, 64 (1998), 231-237.

102. K. Nakamura, K. Takenaka and A. Ohno. Lipase-catalyzed kinetic resolution of 3-butyn-2-olLipase-catalyzed kinetic resolution of 3-butyn-2-ol. Tetrahedron: Asymmetry 9 (1998), 4429-4439.

103. K. Shishido, T. Bando. Lipase-mediated asymmetric acetylation of prochiral diols directed towards total syntheses of biologically active molecules. J. of Mol. Catal. B: Enzymatic, 5 1998,183-186.

104. D. Coulon, A. Ismail, M. Girardin, M. Ghoul. Enzymatic synthesis of alkyl-glycoside fatty acid esters catalyzed by an immobilized lipase. J. of Mol. Catal. B: Enzymatic, 5 1998, 45-48.

105. F. Zocher, N. Krebsfanger, O.J. Yoo, U.T. Bornscheuer. Enantioselectivity of a recombinant esterase from Pseudomonas fluorescens. J. of Mol. Catal. B: Enzymatic, 5 1998, 199-202.

106. P. Allevi, P. Ciufreda, A. Longo, M. Anastsia. Lipase-catalyzed chemoselective monoacetylation of hydroxyalkylphenols and chemoselective removal of single acetyl group from their diacetates. Tetrahedron: Assymetry 9 (1998), 2915-2924.

107. B. H. Hoff, L. Ljones, A. Ronstad, T. Anthonsen. Influence of substituents on enantiomeric ratio in transesterification of racemic C-3 synthons using lipase В from Candida Antarctica. J. of Mol. Catal. B: Enzymatic 8 2000, 51-60.

108. T. Maugard, M. D. Legoy. Enzymatic synthesis of derivatives of vitamin A in organic media. J. of Mol. Catal. B: Enzymatic 8 2000,275-280.

109. Yu-Yen Linko, M. Lamsa, X. Wu, E. Uosukainen, J. Seppala, P. Linko. Biodegradable products by lipase biocatalysis. J. of Biotechnology 66 (1998), 41-50.

110. E. Forro, L. T. Kanerva, F. Ftilop. Lipase-catalysed resolution of 2-dialkylaminomethylcyclohexanols. Tetrahedron: Asymmetry 9 (1998), 513520.

111. H. Stamatis, P. Christakopoulos, D. Kekos, B.J. Macris, F.N. Kolisis. Studies on the synthesis of short-chain geranyl esters catalysed by Fusarium ox-ysporum esterase in organic solvents. J. of Mol. Catal. B: Enzymatic 4 1998, 229-236.

112. Casimir C. Akoh, Lisa N. Yee. Lipase-catalyzed transesterification of primary terpene alcohols with vinyl esters in organic media. J. of Mol. Catal. B: Enzymatic 4 1998, 149-153.

113. N. Hayashi, К. Yanagihara, S. Tsuboi. Lipase-catalyzed kinetic resolution of Baylis-Hillman products. Tetrahedron: Asymmetry 9 (1998), 3825-3830.

114. C. Virto, I. Svensson, P. Adlercreutz. Enzymatic synthesis of lysophos-phatidic acid and phosphatidic acid. Enzyme and Microbial Technology 24 1999, 651-658.

115. В. H. Hoff, T. Anthonsen. Lipase-catalyzed resolution of esters of 4-chloro-3-hydroxy-butanoic acid: effects of the alkoxy group and solvent on the enantiomeric ratio. Tetrahedron: Asymmetry 10 (1999), 1401-1412.

116. M. Medio-Simon, J. Gil, P. Aleman, T. Varea, G. Asensio. Selective lipase-catalyzed acylation of epimeric -sulfinyl alcohols: an efficient method of separation. Tetrahedron: Asymmetry 10 (1999), 561-566.

117. J. Roos, U. Stelzer, F. Effenberger. Synthesis of (7R,cz"s, aS)-cypermethrine via lipase catalyzed kinetic resolution of racemic m-phenoxybenzaldehyde cyanohydrin acetate. Tetrahedron: Asymmetry 9 (1998), 1043-1049.

118. C. Humeau, M. Girardin, B. Rovel, A. Miclo. Enzymatic synthesis of fatty acid ascorbyl esters. J. of Mol. Catalysis B: Enzymatic 5 1998,19-23.

119. M. Bousquet, R. Willemot, P. Monsan, E. Boures. Lipase-catalyzed a-butylglucoside lactate synthesis in organic solvent for dermo-cosmetic application. J. of Biotechnology 68 (1999), 61-69.

120. S. Y. Huang,H. L. Chang, M. Goto. Preparation of surfactant-coated lipas for the esterification of geraniol and acetic acid in organic solvents. Enzyme and Microbial Technology 22 1998, 552-557.

121. R. Chenevert,G. M. Ziarani, M. P. Morin, M. Dasser. Enzymatic desymmetrization of meso cis-2,6- and cis,cis-2,4,6-substituted piperidines. Chemoenzymatic synthesis of (5S,9S)-(-i-)-indolizidine 209D. Tetrahedron: Asymmetry 10 (1999), 3117-3122.

122. Jean-Pierre Barnier, V. Morisson, I. Voile, L. Blanco. Chemo-enzymatic preparation of optically active endo-bicyclo/4.1.0/heptan-2-ols. Tetrahedron: Asymmetry 10(1999), 1107-1117.

123. K. Frings, M. Koch, W. Hartmeier. Kinetic resolution of 1-phenyl ethanol with high enantioselectivity with native and immobilized lipase in organic solvents. Enzyme and Microbial Technology 25 (1999), 303-309.

124. Puertas S., Brieva R., Rebolledo F. and Gotor V. Lipase catalyzed Aminoly-sis of Ethyl Propiolate and Acrylic Esters. Synthesis of Chiral Acrylamides. Tetrahedron, 49: 4007-4014, 1993.

125. Quiros, M., Rebolledo F., Gotor V. Bioreduction of 2-oxocyclopentanecarboxamides: syntheses of optically active 2-aminomethyl-and 2-aminocyclopentanols. Tetrahedron: Asymmetry (1999) 10:473-482.

126. Maugard Т., Remaud-Simeon M., Petre D. et Monsan P. (1997) Enzymatic synthesis of glycamide surfactants by amidification reaction. Tetrahedron, 1997, Vol. 53, No. 14, pp. 5185-5194.

127. Zoete M.C., A.C. Kock-van Dalen, F. van Rantwijk and R.A. Sheldon, Ester Ammoniolysis: a New Enzymatic Reaction, J. Chem. Soc., Chem. Com-mun., 1831 (1993).

128. Zoete, M.C., F. van Rantwijk and R.A. Sheldon, Lipase-catalyzed transformations with unnatural acyl acceptors, Catalysis Today, 22, 563-590 (1994).

129. Maugard Т., Remaud-Simeon M., Petre D. et Monsan P. Lipase-catalyzed chemoselective N-acylation of amino-sugar derivatives in hydrophobic solvent : acid-amine ion-pair effects. Tetrahedron, 1997, Vol. 53, No. 22, pp. 7587-7594.

130. Maugard Т., Remaud-Simeon M., Petre D. et Monsan P. Lipase-catalyzed synthesis of biosurfactants by transacylation of N-methyl-glucamine and fatty-acid methyl esters. Tetrahedron, 1997, Vol. 53, No. 22, pp. 7629-7634.

131. Maugard Т., Remaud-Simeon M., Petre D. et Monsan P. Lipase-catalyzed production of N-oleoyl-taurine sodium salt in non aqueous medium. Biotechnol. Lett, 1997, Vol. 19, No. 8, pp. 751-753.

132. Maugard Т., Remaud-Simeon M. et Monsan P. Kinetic study of chemoselective acylation of amino-alditol by immobilized lipase in organic solvent: effect of substrate ionization. BBA, Protein Structure And Molecular Enzymology 1998 (1387), 177-183.

133. Garcia, E.; Rebolledo, F.; Gotor, V. Enzymatic ammonolysis of ethyl-4-chloro-3-hydroxybutanoate. Chemoenzymatic syntheses of both enanti-omers of pyrrolidin-3-ol and 5-(chloromethyl)-l,3-oxazolidin-2-one. Tetrahedron: Asymmetry (1999) 10: 721-726.125

134. Определитель бактерий Берджи./ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крита, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.: Мир - 1997. - Т1 - 430 с.,Т2 -800

135. Методы общей бактериологии / под ред. Ф.Герхардта М.: Мир. -1984.-T.l-c. 54-57, Т.З-с.263.

136. Практикум по микробиологии. / под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во МГУ.-1976.-306 с.

137. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. М.: Наука. - 1989. - с. 287.

138. Смирнова В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наукова думка. - 1990. - 263 с.

139. Практикум по биохимии / под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьева. -М.: изд-во МГУ. 1989. - с.93-96.

140. Кочетов Г.А. Практическое руководство по этимологии М:Высш. школа.-1980.-с. 271.

141. Методы общей бактериологии / под ред. Ф.Герхардта М.: Мир. -1984.-Т.2-с. 24-25.

142. Рубан E.JI. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. -М.: Наука 1984.-200 с.

143. Давранов К.Д., Халанейзер В.Б., Вагина О.Н. Синтетазная активность липазы из Penicillium sp. в водной среде и в системе обращенных мицелл // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. - т.32, № 4. - с. 386 - 388.

144. Гладилин А.К., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями // Биохимия. 1998. - т.63., с. 408 - 421.