Разработка биокаталитических методов получения (R)- и (S)-энантиомеров 1-фенилэтанола и эйкозапентаеновой кислоты

Калимуллина, Лилия Ягфарьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биокаталитических методов получения (R)- и (S)-энантиомеров 1-фенилэтанола и эйкозапентаеновой кислоты
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биокаталитических методов получения (R)- и (S)-энантиомеров 1-фенилэтанола и эйкозапентаеновой кислоты"

На правах рукописи

КАЛИМУЛЛИНА ЛИЛИЯ ЯГФАРЬЕВНА

РАЗРАБОТКА БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ (Я)- И (З)-ЭНАНТИОМЕРОВ 1-ФЕНИЛЭТАНОЛА И ЭЙКОЗАПЕНТАЕНОВОЙ КИСЛОТЫ

03 00 23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

ООЭ44Э473

Казань - 2008

003449473

Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Зорин Владимир Викторович

Официальные оппоненты-

доктор химических наук, профессор Гамаюрова Валентина Семеновна

кандидат технических наук, доцент Кусова Ирина Валерьевна

Ведущая организация

Институт биологии Уфимского научного центра Российской академии наук

Защита состоится «12» ноября 2008 года в 14 00 на заседании диссертационного совета Д 212 080 02 при Казанском государственном технологическом университете по адресу 420015, г Казань, ул К Маркса, 68, зал заседаний Ученого Совета (А-330)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного технологического университета

Электронный вариант автореферата размещен на сайте Казанского государственного технологического университета fwwwksturu)

Автореферат разослан «9 » октября 2008 года

Ученый секретарь совета

Сироткин А С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальпость работы. Процессы биотрансформации органических соединений, сущесгвляемые с помощью оксидоредуктаз микроорганизмов (карбонилредукгаз и деса-фаз), представляют значительный интерес для создания перспективных методов получе-ия практически важных веществ, таких как эйкозапентаеновая кислота (ЭПК), (Я)- и (Б)-шггиомеры 1-фенилэтанола (1-ФЭ) и др

ЭПК используется в качестве диетарных добавок при лечении и для профилактики наличных хронических и воспалительных заболеваний, включая сердечно-сосудистые 1болевания, ревматоидные артриты, астму, экзему, псориаз и рак

(Я)- и (Б)-энантиомеры 1 -фенилэтанола а также их производные являются сшггона-и лекарственных препаратов, обладающих антидиабетическим, антидепрессантным и ггирабическим действием Эти соединения используются также при получении жидких жсталлов и в синтезе оптически активных полимеров, применяемых для разделения ра-;мических смесей органических веществ

Получение этих соединений химическими методами представляется мало эффекгив-

лм

В связи с этим создание высокоэффективных биокаталитических систем и разработ-I на их основе регио- и стереонаправлешшх методов получения ЭПК и оптически чистых тнтиомеров 1-ФЭ, а также поиск методов их интенсификации являются актуальной за-ией

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой про->аммой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаменталь->й науки в 2002-2006 гг » (2004-2006 гг, госкошракт № 02 438.11 7003), планами научно-•следовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического универси-та (2003-2006 гг ), ведомственной научной программой «Развитие научного потенциала юшей школы» (2006-2008 гг, № РНП 2 2 3 1 5668)

Цель работы. Разработка регио- и стереоселекгавных биокаталитических методов »лучения эйкозапентаеновой кислоты и оптически чистых энангиомеров 1-фенилэтанола доступного сырья

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи проведение скрининга микроорганизмов, способных осуществлять энантиоселектив->е восстановление ацетофенона (АФ) при высоких концентрациях субстрата,

разработка энантиоселективных биокатализаторов на основе клеток микроорганиз->в для получения оптически чистых энантиомеров 1-фенилэтанола,

разработка методов получения (в)- и (Е1)-энантиомеров 1-фенилэтанола с помощью зработанных биокатализаторов,

разработка эффективного метода получения эйкозапентаеновой кислоты биотранс->рмацией доступных растительных масел

Научная новизна. Создан новый биокатализатор на основе гриб Geotrichiun sp 85-1 и найдены условия, в которых с его участием осуществляется энантио селективное восстановление ацетофенона в S-энантиомер 1-фенилэтанола при высоки: концентрациях субстрата

Обнаружена реакция изомеризации (Sj-изомера рацемической смеа 1-фенилэтанола в (Я)-изомер при инкубировании биомассами культур микроорганизме) Geotrickumsp 85-1, Candida sp 81-12, Metschnikowia sp 84-13 и Candida sake 111

Показана способность гриба Mortierella alpina 18-1 или его галорезистентного мутан та ХН1 трансформировать соевое, подсолнечное и оливковое масла в липиды, обогащении! эйкозапентаеновой кислотой

Практическая значимость. Разработаны методы получения эйкозапентаеновой ки слоты с помощью гриба Mortierella alpina 18-1 биотрансформацией растительных Macej (льняного, соевого, подсолпечного и оливкового) с выходом 5,2 - 7,9 г/кг среды

Созданы методы получения (S)-(-)-1 -фенилэтанола энантиосеяекгивным биовосста новлением ацетофенона с помощью культуры микроорганизма Geotrichum sp 85-1 с выхо дом 83,6% и оптической чистотой не менее 99%ее, а также (R)-(+)-1-фенилэтанола изомери зацией S-энантиомера рацемической смеси с помощью культуры микроорганизм; Candida sp 81-12 с выходом 95% и оптической чистотой 95,8%ее

Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных ра бот и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 24 09 01 - Биотехнология в Уфимском государственном нефтяном техническом университе те

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на IV, V Всероссийских научных MIERNET-конференциях «Интеграция науки и высшего образ вания в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005-2006), VI Всерос сийском научном семинаре с Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа,2007) Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 4 ста тьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, и тезисы 3 докладов

Структура и объем работы Диссертация включает введение, обзор литературы (1 глава), описание объектов и методов исследования (2 глава), обсуждение результатов (3 гла ва), выводы, список цитируемой литературы и приложения Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка, 19 таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Разработка биокаталитических методов получения оптически активных (S)- и (Л)-1-феинлэтанолов 1.1 Скрининг микроорганизмов

Основным недостатком известных биокатализаторов, энашиоселективно восстанавливающих ацетофенон (АФ), является необходимость проведения реакции при низ-

ких концентрациях токсичного субстрата, а также использование большого количества биомассы

Поиск микроорганизмов, обладающих карбонилредуктазной активностью в отношении АФ, осуществляли среди дрожжей из музея кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, у которых ранее была выявлена способность к энантиоселекгивному восстановлению этилацетоацетата в Э- и Я-этил-З-оксибутираты Кроме того, были выделены 3 изолята грибов рода Оео1псИит, так как согласно литературным данным представители этих грибов являются наиболее эффективными восстановителями АФ

В результате исследования были выявлены 4 культуры микроорганизмов, способные восстанавливать АФ в высокой концентрации (5 г/л) с выходом более 75 % 1-ФЭ за 24 ч трансформации (таблица 1) Дрожжевые культуры восстанавливали субстрат преимущественно в (Б)-1-ФЭ, тогда как гриб Оео1пскит Бр 85-1 в основном накапливал (Я)-1-ФЭ.

Таблица 1 — Удельная активность биомассы, оптические свойства продуктов и конвер-

сия субстрата при транс( гармации АФ клетками микроорганизмов

Микроорганизм Конверсия, % Удельная активность, ммоль/(г(асв)*ч) Выход 1-ФЭ, % Мо (конфигурация) Оптическая чистота, % ее

Geotrichumsp 85-1 98,6 0,18 76,8 + 17,5 (R) 29,8

Candida sake 111 89,6 0,07 80,4 - 42,4 (S) 74,4

Candida sp 81-12 98,6 0,09 85,6 -41,3 (S) 72,5

Metschnikowia sp 84-13 91,6 0,1 87,8 -38,0 (S) 66,7

Условия реакции 30 "С; 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0, биомасса - 80 г (асв)/л, АФ - 5 г/л, зремя реакции - 24 ч Стандартная величина удельного вращения (8)-(-)-1 -фецилзтанояа [я]" = -57 (с=5,12, СНС13), (К)-(+)-1-фенилэтапола [а]205 = +58,7 (с=1,03, СНС13)

Рисунок 1 - Изменение оптической чистоты 1-ФЭ при трансформации АФ с помощью биомассы гриба Сео1пскит ¡р 85-1

Условия реакции 30 °С, 0,1М фосфатный буфер рН 7,0, биомасса - 80 г (асв)/л, АФ - 5 г/л

Однако, исследование зависимости энантиоселективности трансформации АФ грибом Оеой-юЫт яр 85-1 от продолжительности реакции показало, что вначале реак-

Время, ч

ции также превалирует (3)-1-ФЭ (рисунок 1), но затем увеличивается содержание (^-энантиомера в реакционной среде

Изменение энантиомерного состава продуктов в процессе трансформации АФ в сторону обогащения (11)-энантиомером происходило также и в случае остальных культур микроорганизмов (таблица 1 и 2)

Таблица 2 - Оптические свойства 1-фенилэтанола, полученного при трансформации АФ дрожжевыми микроорганизмами

Микроорганизм К (конфигурация) Оптическая чистота, %ее

Сапёра зр 81-12 -22,0(8) 38,6

Ме1зсктко\У1а зр 84-13 -19,2(8) 33,7

СаЫШаяаке 111 + 12,4 (Я) 21,1

Условия реакции 30°С, 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0, биомасса - 80 г(асв)/л, АФ - 5 г/л, 48 ч.

Возможным объяснением этого явления может служить изомеризация (8)-энантиомера 1-ФЭ, образующегося первоначально в качестве основного оптического изомера при восстановлении АФ, в (Л)-энантиомер

>Н п он

(8)-1-фенилэтанол

ацеггофеноп

(И)-1-фенилэтанол

В основе такой изомеризации может лежать низкая энашиоселективность фер-мента(ов), восстанавливающего АФ, и низкая активность или отсутствие фермента(ов), окисляющего (Я)-1-ФЭ

1.2 Исследование восстановления ацетофенона в биоэмульсиях

Одним из подходов, позволяющих повысить энантиоселекгивпость клеточных катализаторов восстановления карбонилсодержащих соединений, является подавление нецелевых ферментов с помощью органического растворителя (гексана, гептана, изопро-панола, ацетона и др) При использовании гидрофобных растворителей перспективным представляется проведение данных трансформаций в биоэмульсиях, образованных клетками микроорганизмов

Исследование эмульгуриющих свойств биомассы микроорганизмов показало, что водные суспензии всех исследуемых культур образуют эмульсии типа «масло в воде» с органическими растворителями (н-гексадеканом, н-тетрадеканом, н-деканом, изоокга-ном, хлороформом, этилацетатом, метилэтилкетоном) Образованные эмульсии характеризуются высокими значениями индекса эмульгирующей активности (более 50%)

При микроскопировании препаратов эмульсий обнаружено, что клетки микроорганизмов иммобилизуются на поверхности капель органической фазы (рисунок 2)

Рисунок 2 - Микрофотография эмульсии декана в воде, образованная биомассой дрожжей Candida sp. 81-12 (х 250)

На основании результатов исследования распределения субстрата и продукта, жизнеспособности микроорганизмов и их карбонилредуктазной активности в органиче-I ских растворителях при проведении трансформации АФ в биоэмульсиях с органически: ми растворителями была выбрана система буфер-изооктан.

Сравнение выхода 1-ФЭ при трансформации АФ биомассой гриба Geotrichum sp. 85-1 в буферном растворе и биоэмульсии показало, что наибольший выход продукта может быть получен при проведении реакции в биоэмульсиях (рисунок 3).

Рисунок 3 - Сравнение выхода 1-ФЭ при трансформации АФ биомассой гриба ОеоМскит ¡р. 85-1 в буферном растворе и биоэмульсии Условия реакция: биомасса - 80 г (асв)/л; 30 "С; 24 ч.

И буфер ■ эмульсия

Таблица 3 - Выход и оптические свойства 1-фенилэтанола, полученного при трансформа! ции АФ исследуемыми культурами микроорганизмов в биоэмульсии

Микроорганизм Концентрация АФ, г/л Выход 1-ФЭ, % И? (конфигурация) Оптическая чистота, % ее

Geotrichum sp. 85-1 5 88,0 -4,5 (S) 7,9

10 87,0 -4,0 (S) 7,0

15 80,6 -4,3 (S) 7,5

Candida sp. 81-12 5 74,0 - 42,1 (S) 73,9

Metschnicowia sp. 84-13 5 75,0 - 40,6 (S) 71,2

Candida sake 777 5 71,1 - 41,4 (S) 72,6

Условия реакции: 30 °С; вода - изооктан в соотношении 1:1; биомасса - 80 г (асв)/л; АФ - 5 г/л; 24 ч.

5 10 15

Концентрация ацетофенона, г/л

Установлено, что в биоэмульсиях во всех вариантах преимущественно накапливается Б-энантиомер (таблица 3) Однако, оптическая чистота продукта при этом не превышала 74% ее

1.3 Трансформация ацетофенона в буфере с помощью пермеабшшзованных клеток

Другим из известных подходов увеличения селективности биокатализаторов, является использование пермеабилизоваиных органическими растворителями клеток, в присутствии экзогенного донора и кофермента (ЫАТЭРН)

Пермеабилизацию клеток микроорганизмов осуществляли обработкой биомассы с помощью ацетона или изопропанола В качестве экзогенного восстановителя был использован изопропанол

Таблица 4 - Трансформация АФ пермеабилизованными клетками микроорганизмов

Микроорганизм (растворитель) Удельная активность, ммоль/(г(асв)*ч) Конверсия АФ, % Выход 1-ФЭ, % (конфигурация) Оптическая чистота, % ее

Geotrichumsp 85-1 (ацетон) 0,078 79,4 49,4 - 56,9 (S) >99

Geotrichumsp 85-1 (изопропанол) 0,053 91,4 56,6 -57,0 (S) >99

Candida sake 777 (ацетон) 0,093 80,6 67,6 -51,8 (S) 90,9

Candida sp 81-12 (ацетон) 0,088 94,0 92,2 -42,8 (S) 75,1

Metschmkowia sp 84-13 (ацетон) 0,078 98,4 98,0 -42,1 (S) 73,9

Условия реакции 30-32 °С, 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0, АФ - 5 г/л, пермеабилизованные клетки - 80 г/л, NADPH - 0,26 г/л, изопропанол - 0,33%; аэробные условия, 24 ч

При трансформации АФ пермеабилизованными клетками микроорганизмов в присутствии изопропанола было показано, что в этом случае достигается более глубокая, чем в эмульсии конверсия субстрата (79 - 98%) с образованием преимущественно Б-энантномера 1-ФЭ (таблица 4)

При этом в случае гриба ОеотсИит яр 85-1 образуется целевой продукт с высокой оптической чистотой (не менее 99 % ее) Однако выход (в)-1-ФЭ в этом случае не превышает 49 - 57%

1.4 Исследование трансформации ацетофснона с помощью гриба Сео/г/сЛн/п 85-1 в системах буфер - изопропанол

С целью разработки более эффективного метода получения (8)-1-ФЭ с помощью гриба СеоШскит хр 85-1 была исследована трансформация АФ интактными клетками в буферном растворе, содержащем изопропанол в различных концентрациях

Было обнаружено, что в отличие от пермеабилизованных клеток, для активности которых необходимо было вводить ЫАБ(Р)Н, в случае использования необработанной органическим растворителем биомассы проявляется высокая карбонилредуктазная активность даже в отсутствие кофермента (таблица 5) Увеличение содержания изопропа-нола в реакционной смеси до 33,0 % приводит к возрастанию удельной активности клеток.

Таблица 5 - Удельная активность биомассы гриба Оео1псЫт зр 85-1

Биомасса Изопропанол, % КА1Э(Р)Н, г/л Удельная активность, ммоль/(г(асв)*ч)

Предварительно обработанная изопропанолом 0 ^ 0 0

0,33 0,26 0,053

Без предварительной обработки изопропанолом 0 0 0,183

0,33 0 0,187

3,30 0 0,347

33,0 0 0,369

Условия реакции 30 °С, 0,1М фосфатный буфер рН 7,0, АФ - 5 г/л, биомасса - 80 г (асв)/л

Установлено также, что добавление в реакционную смесь с необработанной биомассой даже небольшого количества изопропанола (0,33%) вызывает изменение стерео-направленности реакции, что, возможно, связано с ингабированием 11-редуктазы данным растворителем

Таблица 6 - Выход и оптические свойства 1-ФЭ, полученного при трансформации АФ биомассой гриба Сео^гсИит яр 85-1 в системе с изопропаяолом

Концентрация изопропанола, % Время, ч Конверсия, % Выход 1-ФЭ, % (конфигурация) Оптическая чистота, %ее

0 24 98,6 76,1 +17,5 (Л) 29,8

0,33 24 98,6 82,6 -4,8(8) 8,4

3,3 24 85,2 82,0 -21,5 (в) 37,8

33,0 3 83,6 72,1 - -

5 85,6 83,6 -56,7 (в) >99

7 90,8 83,2 - -

24 62,0 60,0 -56,9 (в) >99

Условия реакции 30 °С, 0,1М фосфатный буфер рН 7,0, АФ - 5 г/л, биомасса - 80 г (асв)/л

Было обнаружено, что увеличение содержания изопропанола в реакционной смеси до 33,0 % приводит к возрастанию карбонилредуктазной активности клеток, а также к существенному повышению оптической чистоты продукта до 99% ее (таблица 6)

Вместе с тем, было обнаружено, что при данной концентрации изопроианола выход 1-ФЭ через 24 ч составил лишь 60%, что сопоставимо с выходами, полученными при работе с пермеабшшзованными клетками микроорганизмов (таблица 4 и 6)

Изотюпанол

-«-0% —♦—0,33% -*-з,зо% -•—33%

Рисунок 4- Кинетика накопления 1-ФЭ при трансформации АФ биомассой гриба Оео&1с1тт вр 85-1 при различном содержании изопропанола в реакционной смеси

Однако исследование динамики выхода продукта в системе буфер-изопропанол (33,0%) показало, что при менее продолжительной трансформации (5-7 ч) можно получить продукт с выходом 83% (рисунок 4) При этом оптическая чистота (Б)-1-ФЭ остается очень высокой (таблица 6)

1.5 Исследование условий получепия (в)-(-)- 1-фенилэтанола с помощью гриба (¡¡еоЬюкит «р. 85-1 в системе буфер - изоиропапол (33%)

При изучении зависимости параметров восстановления АФ в подобранной системе буфер - изояропанол (33%) от возраста биомассы было установлено, что карбонил-редуктазная активность биокатализатора, а также выход продукта и биомассы достигают максимального значения на третьи сутки (рисунок 5, 6) Время выращивания биомассы практически не влияет на энантиоселективиость восстановления АФ (рисунок 5) Во всех исследуемых вариантах (в)-1-ФЭ получен с высокой оптической чистотой (не менее 99 %ее)

Влияние кисло гаости среды на выход продукта восстановления АФ в изучаемом диапазоне (рН 6-8) незначительно Наибольший выход наблюдали при рН в области 7,0 Оптимальная температура для осуществления реакции лежит в области от 28 до 32 °С, хотя реакция протекает с достаточно высокими выходами во всем исследуемом диапазоне температур от 20 до 50 °С

Энантиоселективиость реакции оставалась неизменно на высоком уровне при всех исследуемых значениях рН и температуры

100

в4 80

е 60

ш 20 -

0 -

Время выращивания биомассы, сут Ш9 выход 1 -ФЭ —А— оптическая чистота

Рисунок 5- Зависимость оптической чистоты и выхода 1-ФЭ от возраста биомассы Оео^скит ¡р. 85-1

0 1 2 3 4 5 Время выращивания биомассы, суг ШШ удельная активность —«— биомасса

Рисунок 6 - Динамика роста и карбонилредуктазной активности биокатализатора

В результате исследования зависимости выхода целевого продукта от начальной концентрации АФ было обнаружено, что трехсуточная биомасса ОеоКкИит ¡р. 85-1 в подобранных условиях проявляет высокую устойчивость к токсическому действию этого соединения и может восстанавливать 10 - 15 г/л субстрата в (8)-1-ФЭ высокой оптической чистоты (рисунок 7).

0 5 10 15

Начальная концентарция АФ, г/л

- выход

- оптическая чистота

Рисунок 7 - Зависимость выхода и оптической чистоты 1-ФЭ от начальной концентрации субстрата

Условия: 5 ч при 30 °С; 0,1М фосфатный буфер рН 7,0; изопропанол - 33%; биомасса - 80 г (асв)/я; 5 ч

При оптимальной концентрации 10 г/л АФ за 5 ч трансформации образуется - 7 г/л (8)-1-ФЭ с энангиомерным избытком не менее 99% ее.

1.6 Исследование етереоинверсии рацемического 1-фенилэтанола

С целью разработки метода полунения (Р.)-1-ФЭ была исследована трансформация рацемического 1-ФЭ с помощью микроорганизмов, для которых была выявлена изомеризация (в)-1-ФЭ в Я-энантиомер в ходе восстановления АФ.

Было обнаружено, что исследуемые микроорганизмы осуществляют дерацемиза-цию рацемического 1-ФЭ с накоплением (И.)-1-ФЭ в реакционной смеси (рисунок 8).

В качестве промежуточного продукта в реакционной смеси обнаруживается АФ (до 0,07 г/л). Выход 1-ФЭ в конце трансформации составляет 91-95% (рисунок 8а).

Л юо т-..........................| 100

0 12 3' Время, сут

а б

1 -Geotrichum sp. 85-1; 2-Candida sp. 81-12; 3- Metschnikowia sp. 84-13; 4- Candida sake 111

Рисунок 8 - Выход 1-ФЭ (а) и динамика изменения энангиомерного избытка R-энантиомера 1-ФЭ (б) во времени Условия реакции: 30 °С; 0,1М фосфатный буфер рН 7,0; биомасса - 80 г (асв)/л; 1-ФЭ - 5 г/л

В случае культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Metschnikowia sp. 84-13, Candida sake 111 оптическая чистота (Д)-1-ФЭ увеличивается до 45-70%ее за 5 суток трансформации (рисунок 86). При инкубировании рацемического субстрата с биомассой Candida sp. 81-12 в течение 6 суток энантиомерный избыток (11)-1-ФЭ существенно выше и достигает 95,8% ее.

1.7 Принципиальная схема получения оптических изомеров (S)- и (11)-1-фенилэтанола

На основе произведенных исследований разработана схема препаративного получения оптического изомера (S)-(-)-l-®3 путем энантиоселективного восстановления АФ биокатализатором на основе культуры микроорганизма Geotrichum sp. 85-1 и получения оптического изомера (R)-(+)-l-®3 путем стереоинверсии рацемического 1-ФЭ биокатализатором на основе культуры микроорганизма Candida sp. 81-12, состоящая из 3 стадий: получения биокатализатора, энантиоселективного восстановления/стереоинверсии и выделения полученного энантиомера из реакционной смеси (рисунок 9).

Биомассу микроорганизма Geotrichum sp. 85-1 выращивают в ферментере 1 в течение 72 ч при температуре 28 - 30 °С и рН 6,2. Биомассу микроорганизма Candida sp. 81-12 выращивают в ферментере 1 в течение 72 ч при температуре 28 - 30 °С и рН 6,5. Выращенная биомасса подается в центрифугу 2, Осажденная биомасса поступает в емкость 3, в которой она суспендируется в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,0).

Полученная суспензия поступает в реактор 4. Туда же подается изопропанол и субстрат трансформации. В случае восстановления АФ трансформация осуществляется

в течение 5 ч при температуре 30 "С и непрерывном перемешивании При трансформации рацемического 1-ФЭ процесс дерацемизации осуществляется в течение б сут при температуре 30 °С и непрерывном перемешивании

1 - ферментер, 2 - центрифуга, 3, 6, 8 - ёмкости с мешалкой, 4 - реактор, 5, 9 - фильтры, 7-экстракгор, 10-вакуумный испаритель, 11 - емкость ПС - питательная среда, Ин - инокулят; СВ - стерильный воздух

Рисунок 9 - Принципиальная технологическая схема получения (8)-(-)-1-фенилэтанола биокатализатором на основе культуры Geotrichum sp 85-1 и (R)-(+)- 1-фенилэтапола биокатализатором на основе культуры Candida sp 81-12

После трансформации биомасса удаляется из реакционной смеси на фильтре 5 Фильтрат собирается в емкость 6, куда также добавляется NaCl (до насыщения) для высаливания продуктов реакции Полученная смесь направляется в экстрактор 7 для экстракции продуктов хлороформом Хлороформная фракция обезвоживается с помощью MgS04 в емкости 8 Обезвоженный экстракт фильтруется на фильтре 9 и направляется в испаритель 10 для отгонки растворителя Готовые продукты собираются в емкости 11

2 Разработка методов биоконверсии растительных масел в грибные липиды, обогащенные эйкозапеитаеповой кислотой 2.1 Исследование трансформации льняного масла галорезистентным грибом Mortierella alpina ХН-1 па среде ОГ с 5% NaCI

Ранее было показано, что 1риб М alpina 18-1 может трансформировать а-линолевую кислоту, содержащейся в льняном масле, в ЭПК с выходом 1,48 г/кг среды за 13 сут трансформации 10-ти суточным мицелием Предполагается, что в этом процес-

се участвуют те же ферменты, что и в биосинтезе арахидоновой кислоты, продуцентом которой является данный гриб.

Олеиновая д? 2 .¿>ес amypaet

кислота --

i К : w9

£Р-десатураза^

Глюкоза Стеариновая (глицерин) кислота

18:0

Линолевая кислота 18:2

]^-десатураза

„ ^ соон

Гамма-линоленовая кислота 18:3 w6 эяонгаза

„ _ СРОН

Дигомо-гамма -линоленовая кислота 20:3 w6 Д^-десатураза

СООН 5% NaCI

Альфа-лнноленовая кислота 18:3 ic3

j ^-десатураза

(^^^СООН

Стеаридоновая кислота 18:4 »3

Арахидоновап кислота 20:4 т(,

Эйкозатетраеновая кислота 20:4 w3

Í /у*-десатураза

w^-десатураза Эйкозапентасноваякислота 20:5 w3

В связи с низким выходом ЭПК в данной работе решались 3 основные задачи, направленные на интенсификацию получения ЭПК: исследование возможности замены гриба М. alpina 18-1 его галорезистентным мутантом ХН1, который, как известно, может синтезировать эту кислоту de novo из глицерина; исследование трансформации льняного масла биомассой дикого и мутантного грибов, полученной на оптимизированной среде с сульфатом цинка; исследование возможности получения ЭПК трансформацией других доступных растительных масел.

При исследовании возможности использования для трансформации льняного масла галорезистентного мутанта ХН1 были получены грибные липиды, содержащее 21,9 % ЭПК (рисунок 10). При этом выход ЭПК через 10 суток трансформации составил 1,35 г/кг среды, что сопоставимо с выходом этого соединения, полученным ранее с помощью исходного грибаМ alpina 18-1, но за 13 суток.

N N fí

Рисунок 10 -- Жирнокислотный профиль 20-суточного мицелия гриба tí. alpina ХН1 при трансформации льняного масла на среде ОГ с NaCi (5%)

Вместе с тем, следует отметить, что в обоих игучаях выход целевого продукта недостаточно высок и требуется поиск способов интенсификации разрабатываемых биотрансформаций.

2.2 Исследование влияния сульфата цинка на синтез ЭПК de novo у галорезистентного мутанта

Одним из подходов к такой интенсификации является подбор условий культивирования гриба, обеспечивающий эффективный синтез высокоактивной биомассы микроорганизма. В этом аспекте заслуживает внимание факт стимулирования липидообра-зования у микроорганизмов ионами некоторых двухвалентных металлов. В частности известно, что ионы цинка и магния активируют ацетил-СоА-карбоксилазу - ключевой фермент синтеза жирных кислот. Активация этого фермента ионами металлов должна приводить к ускорению синтеза жирных кислот. Положительное влияние ионов цинка на синтез арахидоновой кислоты de novo грибом М. alpina 18-1 было выявлено ранее.

В результате исследования влияния сульфата цинка на рост и липидообразование галорезистентного мутанта XHI было обнаружено, что введение цинка в среду приводит к существенному увеличению выхода биомассы в конце культивирования (таблица 7).

Таблица 7 - Влияние ионов цинка на выход биомассы и липидов при росте гриба ХН1 на овсяной среде с глицерином и хлоридом натрия

Среда Время, сут Липиды, % от асв Биомасса, г/кг Нелипидные компоненты, г/кг Липиды, г/кг

Обозначение Содержание сульфата цинка, %

ОГ с NaCl 0 21 43,5 14,51 8,2 6JT

ОГЦ с NaCl 0,01 21 64 23,15 8,34 14,81

При этом содержание липидов в 21-суточной биомассе гриба, растущего на ОГЦ среде с 5 % NaCl, достигало 64 %, тогда как на среде без сульфата цинка лшшды составляли лишь около 43 % грибной массы. В тоже время выход нелипидных компонентов гриба остается на том же уровне.

При исследовании состава липидной фракции 18-суточного гриба М. alpina ХН1, выращенного на среде ОГЦ, содержащей 5% NaCl, было обнаружено, что в ней содержится свыше 22 % ЭПК (рисунок 11).

е-

2 Я 25

о н 20

¡J

в и s F 15

3 >• и 1«

5 S

12,8

54 5J

8J> 9Л

III

tí ?? ее % w

22,6

Рисунок 11 - Жирнокислотный профиль липидов 18-суточного мицелия М. alpina ХН1 на среде ОГЦ с NaCl (5%)

Выход этого соединения при выращивании гриба на среде ОГЦ в течение 18 суток составил 2,71 г/кг среды Ранее на аналогичной среде без цинка с помощью галоре-зистентного гриба удалось получить ЭПК только с выходом 0,95 г/кг за 23 суток культивирования

2.3 Исследование трансформации льняного масла грибами, выращенными на средах с сульфатом цинка

Были исследованы процессы трансформации льняного масла с помощью биомассы исходного и галорезистенгного 1рибов, полученной на овсяной среде с глицерином в присутствии 0,01 % сульфата цинка.

При трансформации льняного масла в течение 10 суток с помощью биомассы галорезистенгного гриба М alpina ХН1, выращенной на среде ОГЦ с хлоридом натрия (5%), были получены липиды с более высоким содержанием ЭПК (таблица 8), чем на среде без цинка При этом также существенно возрастает доля всех С20 ПНЖК (с 40,5 до 86,4 %) Выход ЭПК при трансформации льняного масла грибом М alpina ХН1 на среде с сульфатом цинка достигает 5,63 г/кг, что почти в 4 раза выше, чем на среде без ионов цинка (1,35 г/кг)

Таблица 8 - Содержание ПНЖК при трансформации льняного масла на средах с сульфатом цинка

Микроорганизм Среда Содержание ПНЖК, % Выход ЭПК, г/кг

Дигомо-у-линоленовая кислота Арахидо-новая кислота Эйкозапен-таеновая кислота

М alpina Xñl ОГ с NaCl 0 18,6 21,9 1,35

М alpina ХН1 ОГЦ с NaCl 22,2 27,3 36,9 5,63

М alpina 18-1 ощ 17,6 38,8 26,2 5,2

При трансформации льняного масла с помощью биомассы исходного гриба, полученной на овсяной среде с глицерином в присутствии сульфата цинка, обнаружено, что выход ЭПК в расчете на 1 кг среды также существенно увеличился (с 1,48 на среде ОГ до 5,2 г/кг на среде ОГЦ)

2.4 Исследование трансформации растительных масел, обедненных или несодержащих а-линоленовую кислоту

Была исследована возможность получения ЭПК, а также других ценных ПНЖК, с помощью исследуемых грибов М alpina путем трансформации других растительных масел, несодержащих или содержащих лишь небольшие количества а-линоленовой кислоты В качестве субстратов использовали соевое, подсолнечное и оливковое масла Преобладающей жирной кислотой в соевом и подсолнечном масле является линолевая кислота (54 и 67 %, соответственно), а в оливковом масле - олеиновая кислота (80 %)

Доля а-линоленовой кислоты в данных маслах колеблется от 0,2 до 8 %

a Mortier ella alpina 18-1

3,7

Ж 0 0

40 vo

Ci Ti ?!

« » т-1 о ГЧ

a Mortier ella alpina XH1

i Mortierella alpina 18-1

б Mortierella alpina XH1

Рисунок 12 - Жирнокислотный профиль липи-дов грибов при трансформации соевого (а), олнвкого (б) и подсолнечного (в) масел на средах с 0,01% сульфатом цинка в Mortierella alpina 18-1

Было обнаружено, что ЭПК может быть получена не только из льняного масла, содержащего а-линоленовую кислоту, но и из растительных масел, не содержащих это соединение. При трансформации соевого, подсолнечного и оливкового масел содержание ЭПК достигало 20-40%. Кроме того, в ряде случаев в липидах в значительных количествах обнаружена арахидоновая кислота (до 33% от суммы жирных кислот) (рисунок 12).

2.5 Анализ выхода липидов и ПНЖК при трансформации растительных масел

Анализ выхода липидов при трансформации растительных масел показал, что с помощью исследуемых грибов на среде ОГЦ можно получать от 15 до 22 г/кг среды грибного масла (рисунок 13 а). При этом более высокий выход липидов может быть достигнут при трансформации растительных масел с помощью исходного гриба 18-1.

Наиболее высокий выход ценных ПНЖК (17,3 г/кг среды) может быть получен при трансформации грибом М. alpina 18-1 льняного масла (рисунок 13 б).

JIM СМ пм ом

лм см пм ом

т-М. alpina 18-1 (среда ОГЦ); □ -М alpina ХН1 (среда ОГЦ с 5 % NaCl)

Масло: JIM - льняное, СМ - соевое, ПМ - подсолнечное, ОМ - оливковое

Рисунок 13 - Выход липидов (а), ПНЖК (б) и ЭПК (в) при трансформации растительных масел с помощью исследуемых грибов

Наибольший выход целевой ЭПК (7,2 - 7,9 г/кг среды) был достигнут при трансформации в течении 10 сут соевого и подсолнечного масел с помощью М alpina 18-1, что превышает ее выход при трансформации льняного масла, изначально прогнозируемого как наиболее перспективного источника богатого предшественником ЭПК -а-линоленовой кислотой (рисунок 13 в).

Согласно литературным данным, одним из наилучших достижений в получении ЭПК является процесс трансформации льняного масла с помощью мутактного гриба М. alpina, дефицитного по Д|2-десатуразе, накапливающего около 6,4 % ЭПК от веса

биомассы Нами при трансформации растительных масел на средах с сульфатом цинка с помощью исследуемых грибов удалось получить от 11,9 до 18,3 % ЭПК от веса сухой биомассы

Помимо ЭПК трансформацией исследуемых масел можно получать сопутствующую арахидоновую кислоту с выходом 4,3 - 7,6 г/кг среды, а также дигомо-у-линоленовую кислоту с выходом 3,5 - 3,6 г/кг среды при использовании в качестве субстрата льняного масла

ВЫВОДЫ

1 В результате скрининга найдены микроорганизмы Geotrichum sp 85-1, Candida sake 777, Candida sp 81-12, Metschnikowia sp 84-13, проявляющие карбонилредуктазнуго активность в отношении ацегофенона при высоких концентрациях субстрата (5-15 г/л)

2 Разработаны методы получения (8)-1-фснилэтанола с выходом 56-83% высокой оптической чистоты (не менее 99%ее) с помощью клеток Geotrichum sp 85-1, пермеабилизованных ацетоном или изопропанолом, а также с помощью интактных клеток в буфере, содержащем 33% изопропанола

3 Обнаружена реакция окислительно-восстановительной изомеризации (Бензомера 1-фенилэтанола в (Т1)-изомер при инкубировании их рацемической смеси с биомассами микроорганизмов Geotrichum sp 85-1, Candida sake 111, Candida sp 81-12, Metschnikowia sp 84-13

4 На основе культуры Candida sp 81-12 предложен метод получения (R)-1-фенилэтанола стереоизомеризацией S-энантиомера рацемического 1-фенилэтанола с выходом 95% и оптической чистотой 95,8%ее

5 Научно обоснована принципиальная технологическая схема получения (8)-(-)-1-фенилэтанола энантиоселективным восстановлением ацегофенона и (Д)-(+)-1-фенилэтанола дерацемизаций рацемической смеси 1-фенилэтанола с использованием разработанных биокатализаторов на основе культур микроорганизмов Geotrichum sp 85-1 и Candida sp 81-12

6 Показана возможность использования гриба Mortierella alpina 18-1 и его галоре-зистенгаого мутанта ХН1 для трансформации растительных масел (льняного, соевого, подсолнечного и оливкового) с высоким содержанием а-линоленовой, линолевой и олеиновой кислот в грибные липиды, обогащенные эйкозапентаеновой кислотой, образующейся с выходом 3,4 - 7,9 г/кг среды в составе других ценных полиненасыщенных жирных кислот (общий выход 7,9 -17,3 г/кг среды)

7 Выявлена способность гриба Mortierella alpina 18-1 и его галорезистентного мутанта ХН1 трансформировать льняное масло в дигомо-у-линоленовую кислоту с выходом 3,5 - 3,6 г/кг среды

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Калимуллина, Л.Я Скрининг дрожжевых штаммов, способных продуцировать биоэмульгаторы / ЛЛ Калимуллина, О В Семенова, Н И Петухова, В В Зорин // Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии Материалы IV Всероссийской научной INTERNET-конференции -Уфа Изд-во Реактив - 2006 - С 100-101

Калимуллина, Л Л Стереоинверсия 1-фенилэтанола грибом рода Geotrichum / Л Л Калимуллина, Н И Петухова, Д Г Ханнанова, В В Зорин // Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии Материалы V Всероссийской научной INTERNET-конференции - Уфа Изд-во Реактив - 2007 - С 63-64

Ханнанова, Д Г Скрининг биокатализаторов для энангиоселективпой трансформации ацетофенона / Д Г Ханнанова, ЛЛ Калимуллина, Н И Петухова, В В Зорин// Башкирский химический журнал - 2007 - Х°1 -С 148-150

Калимуллина, Л Л Восстановление карбонил содержащих соединений в биоэмульсиях с помощью клеток дрожжей / Л Л Калимуллина, Э Р Мухитдинов, Н И Пе-тухова,ВВ Зорин//Башкирский химический журнал-2007-№ 1 -С 151-153 Сюндюкова, Ю Р Разработка методов биоконверсии растительных масел в липиды, обогащенные арахидоновой и экозапентаеновой кислотами / Ю.Р Сюндюкова, Л Л Калимуллина, Н И. Петухова, В В Зорин II Химия и медицина- Материалы VI Всероссийского научного семинара с Молодежной научной школой - Уфа Гилем -2007 - С. 227.

Калимуллина, ЛЛ Восстановление ацетофенона с помощью клеток гриба Geotrichum sp 85-1 в биоэмульсиях / ЛЛ Калимуллина, Н И Петухова, В В Зорин //Башкирский химический журнал - 2008 -№1 -С 8-10.

Петухова, Н И Биотрансформация льняного масла в липиды, обогащенные эйкоза-пентаеновой кислотой /НИ Петухова, Л Л. Калимуллина, Ю Р Рахматуллина, В В Зорин//Башкирский химический журнал - 2008 - №1 -С 19-21

Соискатель

Калимуллина Л Л

КАЛИМУЛЛИНА ЛИЛИЯ ЯГФАРЬЕВИА

РАЗРАБОТКА БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ (R)- И (S)-3HAHTHOMEPOB 1-ФЕНИЛЭТАНОЛА И ЭЙКОЗАПЕНТАЕНОВОЙ КИСЛОТЫ

03 00 23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Подписано к печати 07.10.2008 г Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Печать плоская Гарнитура Times New Roman Уел печ л 1,0 Уел кр-отт 1,0 Уч-изд л 0,9 Тираж 100 экз Заказ № 440

ГОУ ВПО Уфимский государственный авиационный технический университет Центр оперативной полиграфии УГАТУ 450000, Уфа-центр, ул К. Маркса, 12

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Калимуллина, Лилия Ягфарьевна

Список сокращений

Введение

1 Литературный обзор

1.1 Микробиологические методы получения хиральных вторичных 10 спиртов

1.1.1 Кинетическое разделение

1.1.2 Восстановление

1.1.3 Стереоинверсия

1.2 Особенности трансформации липофильных соединений клетками 25 микроорганизмов

1.3 Трансформации органических соединений в эмульсиях

1.4 Биоэмульгаторы и адгезия клеток. Трансформация в биоэмульсиях

1.4.1 Биоэмульгаторы

1.4.2 Синтез биоэмульгаторов микроорганизмами

1.4.3 Биоэмульсии. Трансформация органических соединений в 39 биоэмульсиях

1.5 Полиненасыщенные жирные кислоты

1.5.1 Биосинтез и метаболизм ПНЖК в организме

1.5.2 Физиологическая роль

1.5.3 Природные источники ЭПК

1.5.4 Получение ЭПК с помощью грибов

1.5.4.1 Условия и способ культивирования

1.5.4.2 Влияние состава питательной среды

1.5.4.3 Влияние температуры культивирования грибов 50 1.5 А А Трансформация растительных масел 51 1.5.4.5 Генетическая модификация продуцентов ПНЖК

2 Объекты, материалы и методы исследования

3 Результаты и обсуждение

3.1 Разработка биокаталитических систем и методов получения оптически 67 активных (S)- и (К)-1-фенилэтанолов

3.1.4 Трансформация ацетофенона в буфере с помощью 88 пермеабилизованных клеток

3.1.5 Исследование трансформации ацетофенона с помощью гриба 91 Geotrichum sp. 85-1 в системах буфер -изопропанол

3.1.6 Исследование условий получения (S)-(-)-l-фенилэтанола с помощью 95 гриба Geotrichum sp. 85-1 в системе буфер - изопропанол (33%)

3.1.7 Исследование стереоинверсии рацемического 1 -фенилэтанола

3.1.8 Принципиальная технологическая схема получения 100 оптических изомеров (S)- и (R)-l-фенилэтанола

3.2 Разработка методов биоконверсии растительных масел в грибные 103 липиды, обогащенные ЭПК

3.2.1 Исследование трансформации льняного масла галорезистентным 104 грибом Mortier ella alpina ХН-1 на среде ОГ с 5% NaCl

3.2.2 Исследование влияния сульфата цинка на синтез ЭПК de novo у 107 галорезистентного мутанта

3.2.3 Исследование трансформации льняного масла грибами, 109 выращенными на средах с сульфатом цинка

3.2.4 Исследование влияния хлористого натрия на синтез ЭПК de novo у 111 галорезистентного мутанта

3.2.5 Исследование трансформации растительных масел, несодержащих 114 или содержащих небольшие количества а-линоленовую кислоту

3.2.6 Анализ выхода липидов и ПНЖК при трансформации растительных 117 масел

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биокаталитических методов получения (R)- и (S)-энантиомеров 1-фенилэтанола и эйкозапентаеновой кислоты"

Процессы биотрансформации органических соединений, осуществляемые с помощью оксидоредуктаз микроорганизмов (карбонилредуктаз и десатураз), представляют значительный интерес, поскольку позволяют получать ряд практически важных веществ, синтез которых химическими методами или их выделение из природного сырья нецелесообразны из-за их низкой эффективности.

Незаменимая эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) является важнейшим природным биологически активным соединением. Она используется в качестве диетарных добавок при лечении и профилактики различных хронических и воспалительных заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидные артриты, астму, экзему, псориаз и рак. Перспективным подходом к получению ЭПК является трансформация растительных масел, с высоким содержанием а-линоленовой кислотой, с помощью десатураз и элонгаз грибов Mortierella alpina - продуцентов арахидоновой кислоты.

Оптически чистые энантиомеры широко используются в современном стереонаправленном синтезе. (R)- и (8)-энантиомеры 1-фенилэтанола (1-ФЭ), а также их производные являются синтонами лекарственных препаратов, обладающих антидиабетическим, антидепрессантным и антирабическим действием. Эти соединения используются также при получении жидких кристаллов и в синтезе оптически активных полимеров, применяемых для разделения рацемических смесей органических веществ. Энантиоселективное микробиологическое восстановление широко доступного прохирального предшественника (R)- и (8)-1-фенилэтанолов, ацетофенона, является одним из наиболее перспективных путей их синтеза.

Вместе с тем описанные в настоящее время биокаталитические методы получения этих соединений имеют ряд недостатков, обусловливающих низкие выходы целевых продуктов.

Существенным недостатком методов трансформации льняного масла в ЭПК, накапливающуюся в липидной фракции грибов - известных продуцентов арахидоновой кислоты, является ее низкое содержание в биомассе.

Низкая эффективность известных микробиологических методов энантиоселективного восстановления ацетофенона в (Я)- и (З)-энантиомеры 1-фенилэтанола обусловлена неспособностью биокатализатора функционировать при высоких концентрациях субстрата, и как следствие необходимостью повышения его концентрации, а также введения экзогенных коферментов.

В связи с этим актуальной задачей является поиск более эффективных биокаталитических систем для создания на их основе практически перспективных методов получения эйкозапентаеновой кислоты и оптически чистых (Я)- и (8)-1-фенилэтанолов.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракт № 02.438.11.7003), планами научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой «Развитие научного потенциала высшей школы» (2006-2008 гг., № РНП.2.2.3.1.5668).

Целью настоящей работы являлась разработка биокаталитических методов получения эйкозапентаеновой кислоты и оптически чистых энантиомеров 1-фенилэтанола из доступного сырья.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: ® проведение скрининга микроорганизмов, способных осуществлять энантиоселективное восстановление ацетофенона (АФ) при высоких концентрациях субстрата;

• разработка энантиоселективных биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов для получения оптически чистых энантиомеров 1-фенилэтанола;

• разработка методов получения (S)- и (Я)-энантиомеров 1 -фенилэтанола с помощью разработанных биокатализаторов; разработка эффективного метода получения эйкозапентаеновой кислоты биотрансформацией доступных растительных масел.

Научная новизна. Создан новый биокатализатор на основе гриба Geotrichum sp. 85-1 и найдены условия, в которых с его участием осуществляется энантиоселективное восстановление ацетофенона в S-энантиомер 1-фенилэтанола при высоких концентрациях субстрата.

Обнаружена реакция изомеризации (З)-изомера рацемической смеси 1-фенилэтанола в (Я)-изомер при инкубировании биомассами культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13 и Candida sake 111.

Показана способность гриба Mortierella alpina 18-1 или его галорезистентного мутанта ХН1 трансформировать соевое, подсолнечное и оливковое масла в липиды, обогащенные эйкозапентаеновой кислотой.

Практическая значимость. Разработаны методы получения эйкозапентаеновой кислоты с помощью гриба Mortierella alpina 18-1 биотрансформацией растительных масел (льняного, соевого, подсолнечного и оливкового) с выходом 5,2 — 7,9 г/кг среды.

Созданы методы получения (S)-(-)-l-фенилэтанола энантиоселективным биовосстановлением ацетофенона с помощью культуры микроорганизма Geotrichum sp. 85-1 с выходом 83,6% и оптической чистотой не менее 99%ее, а также (R)-(+)-1-фенилэтанола изомеризацией S-энантиомера рацемической смеси с помощью культуры микроорганизма Candida sp. 81-12 с выходом 95% и оптической чистотой 95,8%ее.

Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 24.09.01 - Биотехнология в Уфимском государственном нефтяном техническом университете.

Структура и объем работы: Диссертация включает введение, обзор литературы (1 глава), описание объектов и методов исследования (2 глава), обсуждение результатов (3 глава), выводы, список цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка, 19 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Калимуллина, Лилия Ягфарьевна

выводы

1 В результате скрининга найдены микроорганизмы Geotrichum sp. 85-1, Candida sake 111, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13, проявляющие карбонилредуктазную активность в отношении ацетофенона при высоких концентрациях субстрата (5-15 г/л).

2 Разработаны методы получения (S)-l-фенилэтанола с выходом 56-83% высокой оптической чистоты (не менее 99%ее) с помощью клеток Geotrichum sp. 85-1, пермеабилизованных ацетоном или изопропанолом, а также с помощью интактных клеток в буфере, содержащем 33% изопропанола.

3 Обнаружена реакция окислительно-восстановительной изомеризации (8)-изомера 1 -фенилэтанола в (11)-изомер при инкубировании их рацемической смеси с биомассами микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Candida sake 111, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13.

4 На основе культуры микроорганизма Candida sp. 81-12 предложен метод получения (R)-l-фенилэтанола стереоизомеризацией S-энантиомера рацемического 1-фенилэтанола с выходом 95% и оптической чистотой 95,8%ее.

5 Научно обоснована принципиальная технологическая схема получения (S)-(-)-l-фенилэтанола энантиоселективным восстановлением ацетофенона и (R)-(+)-l -фенилэтанола дерацемизаций рацемической смеси 1-фенилэтанола с использованием разработанных биокатализаторов на основе культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1 и Candida sp. 81-12.

6 Показана возможность использования гриба Mortierella alpina 18-1 и его галорезистентного мутанта ХН1 для трансформации растительных масел (льняного, соевого, подсолнечного и оливкового) с высоким содержанием а-линоленовой, линолевой и олеиновой кислот в грибные липиды, обогащенные эйкозапентаеновой кислотой, образующейся с выходом 3,4 - 7,9 г/кг среды в составе других ценных полиненасыщенных жирных кислот (общий выход 7,9 - 17,3 г/кг среды).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Калимуллина, Лилия Ягфарьевна, Уфа

1. Oldham N.J.,Morgan E.D.,Holldobler B.,Konig W.A. Recruitment pheromones in the ants Aphaenogaster albisetosus and A. cockerelli (Hymenoptera: Formicidae) // J. Insect Physiol.- 1995.-V. 41.- P. 739-744.

2. Patent US 2005/0148801 Al.3 Patent US 5442118.

3. Hamada H., Miura Т., Kumobayashi H., Matsuda Т., Harada Т., Nakamura K. Asymmetric synthesis of (R)-2-chloro-l-(m-chlorophenyl)ethanol using acetone powder of geotrichum candidum // Biotechnol. Lett.- 2001.-V. 23.-P. 1603 -1606.

4. Raku Т., Tokiwa Yu. Chemoenzymatic synthesis of optically active, biodegradable polymers based on phenyl- and naphthyl-ethanols esterified with divinyladipate // Biotechnol. Lett.- 2004.- V. 26.- P. 665-670.

5. Krishnamurthy S., Chen S.H. New thermotropic chiral nematic copolymers. 2. A study of helical sense and twisting power based on copolymers containing (S)-(-)-l-phenylethanol and (R)-(-)-methyl mandelate // Macromolecules.- 1991.- V. 24.- P. 3481-3484.

6. Mastrangelo J.C., Chen S.H. New thermotropic chiral nematic polymers. 3. Copolymers containing a cyanobiphenyl group and (S)-(-)-l-phenylethanol or (S)-(-)-phenylethylamine // Macromolecules.- 1991.- V. 24.- P. 3481-3484.

7. Faber K. Biotransformations in Organic Chemistry. Springer, Berlin, 1997.-245 p.

8. Faber K. Biotransformation in Organic Chemistry. Springer, Berlin, 2000.- 218 p.

9. Saul S., Corr S., Micklefleld J. Biotransformations in low-boiling hydrofluorocarbon solvents // Angew.Chem.Int.Ed. 2004.-V. 43 .-P. 5519-5523.

10. Frings K., Koch M., Hartmeier W. Kinetic resolution of 1-phenylethanol with high enantioselectivity with native and immobilized lipase in organic solvents // Enzym. Microb. Technol.- 1999.- V. 25.- P. 303-309.

11. Kanerva L.T. Hydrolase-catalyzed asymmetric and other transformations of synthetic interest. In. Koskinen A.M.P., Klibanov A.M., editors. Enzymatic reactions in organic media. Glasgow: Blackie A&P, 1990.- P. 170-213.

12. Hult K., Norin T. Enantioselectivity of some lipases: control and prediction // Pure Appl. Chem.- 1992.- V. 64.- P. 1129 1134.

13. Oppermann U.C., Maser E. Molecular and structural aspects of xenobiotic carbonyl metabolizing enzymes: role of reductases and dehydrogenases in xenobiotic phase I reactions // Toxicology.- 2000.-V. 144.- P. 71-81.

14. Kataoka M., Sakai H., Morikawa T., ICatoh M., Miyoshi T., Shimizu S., Yamada H. Characterization of aldehyde reductase from Sporobolomyces salmonicolor II Biochim. Biophys. Acta.- 1992.- V. 1122.- P. 57-62.

15. Kuhn A., C. van Zyl, A. van Tonder, Prior B.A. Purification and partial characterization of an aldo-keto reductase from Saccharomyces cerevisiae II Appl. Environ. Microbiol.- 1995.- V. 61.- P. 1580-1585.

16. Kataoka M., Doi Y., Sim T.-S., Shimizu S., Yamada H. A novel NADPH-dependent carbonyl reductase of Candida macedoniensis: purification and characterization//Arch. Biochem. Biophys.- 1992.-V. 294.- P. 469-474.

17. Peters J., Minuth T., Kula M.-R. A novel NADH-dependent carbonyl reductase with an extremely broad substrate range from Candida parapsilosis: purification and characterization // Enzyme Microb. Technol.- 1993.- V. 15.- P. 950-958.

18. Bradshaw C.W., Fu H., Shen G.J., Wong C.H. A Pseudomonas sp. alcohol dehydrogenase with broad substrate specificity and unusual stereospecificity for organic synthesis I I J. Org. Chem. 1992.- V. 57.- P. 1526-1532.

19. Prelog V. Specification of the stereospecificity of some oxido-reductases by diamond lattice sections // Pure Appl. Chem.-1964. -V. 9.-P. 119-130.

20. Macau E., Aragozzini F. Stereoselective reduction of non-cyclic ketones with lactic acids bacteria// Appl. Microbial. Bionechnol. -1989.- V. 31 -P. 29-31.

21. Itoh N., Mizuguchi N., Mabuchi M. Production of chiral alcohols by enantioselective reduction with NADH-dependent phenylacetaldehyde reductase from Corynebacterium strain ST-10 // J. Mol. Catal. B: Enzymatic.- 1999.- V. 6.- P. 41-50.

22. Findrik Z., Vasic-Raclci D., Lutz S., Dausmann T., Wandrey C. Kinetic modeling of acetophenone reduction catalyzed by alcohol dehydrogenase from Thermoanaerobacter sp. //Biotechnol. Lett.- 2005.- V. 27.- P. 1087 1095.

23. Kataoka M., Kita K., Wada M., Yasohara Y., Hasegawa J., Shimizu S. Novel bioreduction system for the production of chiral alcohols // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2003.- V. 62.- P. 437.

24. Chartrain M., Greasham R., Moore J., Reider P., Robinson D., Buckland B. Asymmetric bioreductions: application to the synthesis of pharmaceuticals // J. Mol. Catal. B.- 2001.- V. 11.- P. 503.

25. Somers W.A.C., van Hartingsveldt W., Stigter E.C.A., van der Lugt J.P. // TIBTECH.- 1997.- V. 15.- P. 495.

26. Hummel W. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1990.- V. 34.- P. 15.

27. Haslegrave J.A., Jones J.B. // J. Am. Chem. Soc.- 1982.-V. 104.- P. 4668.

28. Nakamura K., Inoue Y., Ohno A. Improvement of enantioselectivity of microbial reduction by using organic solvent redox coupler system // Tetrahedron Lett.- 1995.- V. 36.- P. 265.

29. Nakamura K., Matsuda T. Asymmetric reduction of ketones by the acetone powder of Geotrichum candidum II J. Org. Chem.- 1998.- V. 63.- P. 8957 8964

30. Adlererette P. // Enzyme Microb. Technol.- 1991.- V. 13.- P. 9.

31. Nakamura K., Fujii M., Ida Y. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2001 .-V. 12.- P. 3147

32. Nakamura K., Matsuda T., Ohno A. Asymmetric synthesis of (S)-arylalkanols by microbial reduction // Tetrahedron: Asymmetry.- 1996.- V. 7.- P. 3021 3024.

33. Comasseto J.V., Omori A.T., Andrade L.H., Porto A.L.M. Bioreduction of fluoroacetophenones by the fungi Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae II Tetrahedron: Asymmetry.- 2003.- V. 14.- P. 711 715.

34. Mandal D., Ahmad A., Khan M.I., Kumar R. Enantioselective bioreduction of acetopthenone and its analogous by the fungus Trichothecium sp. // J. Mol. Catal. B.- 2004.- V. 27.-P. 61-63.

35. Salvi N., Chattopadhyay S. Studies on Rhizopus arrhizus mediated enantioselective reduction of arylalkanones // Tetrahedron.- 2001.- V. 57.- P. 2833 -2839.

36. Maconi E., Aragozzini F. Stereoselective reduction of noncyclic ketones with lactic acid bacteria // Microbiol. Biotechnol. 1989. - V. 31 - P. 29 - 31.

37. Hayakawa R., Nozawa K., Shimizu M., Fujisawa T. Control of enantioselectivity in the baker's yeast reduction of P-keto ester derivatives in the presence of a sulfur compound // Tetrahedron Lett.- 1998.- V. 39.- P. 67-70.

38. Nakamura K., Kawai Y., Nakajima N., Ohno A. J. Stereochemical control of microbial reduction. 17. A method for controlling the enantioselectivity of reduction with baker's yeast. // Org. Chem.- 1991.- V. 56.- P. 4778-^1783.

39. Nakamura K., Kawai Y., Oka S., Ohno A. A new method for stereochemical control of microbial reduction. Reduction of p-keto esters with bakers' yeast immobilized by magnesium alginate // Tetrahedron Lett.- 1989.- V. 30.- P. 2245-2246.

40. Mohamed A.H., Chirala S.S., Mody N.H., Huang W.Y., Garay-Arroyo A., Covarrubias A.A. Three genes whose expression is induced by stress in Saccharomyces cerevisiae // Yeast.- 1999.- V. 15.- P. 879-892.

41. Medson C., Smallridge A.J., Trewhella M.A. The stereoselective preparation of b-hydroxy esters using a yeast reduction in an organic solvent // Tetrahedron: Asymmetry.- 1997.- V. 8.-P. 1049.

42. Athanasiou N., Smallridge A.J., Trewhella M.A. Baker's yeast mediated reduction of p-keto esters and P-keto amides in an organic solvent system // J. Mol. Catal. B.- 2001.-V. 11.-P. 893.

43. Buque E. M., Chin-Joe I., Straathof A.J.J., Jongejan J.A., Heijnen JJ. Immobilization affects the rate and enantioselectivity of 3-oxo ester reduction by baker's yeast // Enzym. Microbial. Technol.- 2002.- V. 31P. 656.

44. Hasegawa Yu., Adachi S., Matsuno R. Asymmetric reduction of acetophenone by immobilized Hansenula capsulata cells // J. Ferment. Bioenigeer.- 1998.- V. 85,-P. 322 327.

45. Ogawa J., Xie S.-X., Shimizu S. Stereoinversion of optically active 3-pentyn-2-ol by nocardia species // Biotechnol. Lett.- 1999.- V. 21.- P. 331.

46. Barbieri C., Bossi L., D'Arrigo P., Fantoni G.P., Servi S. Bioreduction of aromatic ketones: preparation of chiral benzyl alcohols in both enantiomeric forms // J. Mol. Catal. B.- 2001.- V. 11.- P. 415.

47. Roy A., Bhattacharya M.S., Kumar L.R., Chawla H.P.S., Banerjee U.C. Microbial reduction of 1-acetonapthone: a highly efficient process for multigram synthesis of S-(-)-l-(l'-napthyl)ethanol // Enzym. Microbial Technol.- 2003.- V. 33.- P. 576 580.

48. Hamada H., Miura T., Kumobayashi H., Matsuda T., Harada T., Nakamura K. Asymmetric synthesis of (R)-2-chloro-l-(m-chlorophenyl)ethanol using acetone powder of Geotrichum candidumll Biotechnol. Lett.- 2001.- V. 23.- P. 1603.

49. Brzezinska-Rodak M., Zymanczyk-Duda E., Klimek-Ochab M., Kafarski P., Lejczak B. A simple and green procedure for the microbial effective synthesis of 1-phenylethyl alcohol in both enantiomeric forms // Biotechnol. Lett.- 2006.- V. 28.- P. 511 513.

50. Nakamura K., Matsuda T. Asymmetric reduction of ketones by the acetone powder of Geotrichum candidum II J. Org. Chem.- 1998.- V. 63.- P. 8957 8964.

51. Matsuda T., Harada T., Nakajima Y., Itoh T., Nakamura K. Two classes of enzymes of opposite stereochemistry in an organism: one for fluorinated and another for nonfluorinated substrates// J. Org. Chem.- 2000.- V. 65.- P. 157 -163.

52. Nakamura K., Matsuda T., Shimizu M., Fujisawa T. Asymmetric reduction of trifluoromethyl ketones containing a sulfur functionality by the alcohol dehydrogenase from Geotrichum II Tetrahedron.- 1998.- V. 54.- P. 8393 8402.

53. Yasohara Y., Kizaki N., Hasegawa J., Takahashi S., Wada M., Kataoka M., Shimizu S. Synthesis of optically active ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbial reduction // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1999.- V. 51.- P. 847 851.

54. Adiercreutz P. Novel biocatalyst for the asymmetric reduction of ketones: Permeabilized cells of Gluconobacter oxydans// Enzyme Microb. Technoh. -1991.-V. 13.-P.9-15.

55. Stewart J.D. // Curr. Opin. Chem. Biology.- 2001.- V. 5.- P. 120.

56. Rodrigues S., Kayser M., Stewart J.D. // Org. Lett.- 1999.- V. 1.- P. 1153.

57. Kita K., Kataoka M., Shimizu S. // J. Bioscien. Bioeng.- 1999.- V. 88.- P. 591.

58. Johanson T., Katz M., Gorwa-Grauslund M.F. Strain engineering for stereoselective bioreduction of dicarbonyl compounds by yeast reductases // FEMS Yeast Research.- 2005.- V. 5.- P. 513-525.

59. Hasegawa J., Ogura M., Tsuda S., Maemoto S., Kutsuki H. // Agric. Biol. Chem.- 1990.-V. 54.-P. 1819-1827.

60. Matsumura S., Kawai Y., Takahashi Y., Toshima K. // Biotechnol. Lett.- 1994.-V. 16.-P. 485-495.

61. Camell A.J., Iacazio G., Roberts S.M., Willets A.J. // Tetrahedron Lett.- 1994.-V. 35.- P. 331-334.

62. Goswami A., Mirfakhrae K.D.,Patel R.N. Deracemization of racemic 1,2-diol by biocatalytic stereoinversion//Tetrahedron Asymmetry.-1999.-V. 10.-P.4239-4244

63. Shimizu S., Hattori S., Hata H., Yamada H. One step microbial conversion of a racemic pantoyl lactone to optically active D-(-)-pantoyl lactone // Appl. Environ. Microbiol.- 1986.- V. 53.- P. 519-522.

64. Shimizu S., Hattori S., Hata H., Yamada H. Stereoselective enzymatic oxidation and reduction system for the production of D-(-)-pantoyl lactone from a racemic mixture of pantoyl lactone // Enzyme Microb.Technol.- 1987.-V. 9.- P. 411—416.

65. Tuchiya S., Miyamoto K„ Ohta H. // Biotechnol. Lett.-1992.-V.14.-P.l 137-1142

66. Buisson D., Azerad R., Sanner C., Lalcheveque M. // Biocatalysis.- 1992.- V. 5.-P. 249-265.

67. Takemoto M., Matsuoka Y., Achiwa K., Kutney J. P. Biocatalytic dediastereomerization of dibenzylbutanolides by plant cell cultures // Tetrahedron Lett.- 2000.- V. 41.- P. 499-502.

68. Takahashi E., Nakamichi K., Furui M.J. // Ferment. Bioeng.- 1995.- V. 80.- P. 247-250.

69. Xie S.X., Ogawa J., Shimizu S. Production of (R)-3-pentyn-2-ol through stereoinversion of racemic 3-pentyn-2-ol by Nocardia fusca AKU 2123 // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1999.- V. 52.- P. 327-331.

70. Ogawa J., Xie S. X., Shimizu S. Stereoinversion of optically active 3-pentyn-2-ol by Nocardia species // Biotechnol. Lett.- 1999.- V. 21.- P. 331-335.

71. Xie S. X., Ogawa J., Shimizu S. NAD+-dependent (S)-specific secondary alcohol dehydrogenase involved in stereoinversion of 3-pentyn-2-ol catalyzed by Nocardia fusca AKU 2123//Biosci.Biotech.Biochem.-1999.-V.63.-P.1721-1729.

72. Nakamura K., Inoue Y., Matsuda T., Ohno A. Microbial deracemization of 1-arylethanol // Tetrahedron Lett.- 1995.- V. 36.- P. 6263-6266.

73. Allan G.R., Carnell A.J.J. // Org. Chem.- 2001.- V. 66.- P. 6495-6497.

74. Takemoto M., Achiwa K. The synthesis of optically active pyridyl alcohols from the corresponding racemates by catharanthus roseus cell cultures // Tetrahedron : Asymmetry.- 1995.-V. 6,-P. 2925-2928.

75. Takemoto M., Achiwa K. Deracemization of racemic 4-pyridyl-l-ethanol by Catharanthus roseus cell cultures // Phytochemistiy.-1998.-V.49.- P. 1627-1629.

76. Nakamura K., Inoue Y., Matsuda T., Ohno, A. Microbial deracemization of 1-arylethanol // Tetrahedron Lett.- 1995.- V. 36.- P. 6263-6266.

77. Hasegawa Yu., Adachi S., Matsuno R. Production of homochiral 1-phenylethanol through enantioselective oxidation of its racemate with whole cells of yeast Hansenula capsulata IFO 0974 // J.Ferment.Bioenigeer.-1997.-V.83.-P. 346 -351.

78. Van der Meer В., Fluidity W., Shinitzky M. Biomembranes Physical Aspects // VCN Publisher. - P. 98-158.

79. Angelova В., Schmauder H.-P. Lipophilic compounds in biotechnology — interactions with cells and technological problems // J. Biotechnol. 1999. -V.67.-P. 13-32.

80. Борман E.A., Кощеенко К.А., Соколова JT.B. Микробиологическое 1,2-дегидрирование микрокристаллических субстратов эпигидрокортизона и его 21-ацетата // Изв. АН СССР. Серия биологическая. - 1978.- № 6 - С. 925-927.

81. Быков В. и др. Биотехнология. Кн. 6: Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов.- М.:- 1987.

82. Умнова Э.Ф., Рыжкова В.М., Воробьева Л.И. Гидроксилирование 16а-метил-17а,21-диоксипрегнан-4-ен-3-она // Хим.-фарм. журн. 1990.- т. 24.-№6.-С. 56-58.

83. Алехин Т.М., Рыжкова В.М., Гусарова Т.И. Микробиологическая трансформация водорастворимых стероидов // Хим.-фарм. журн. 1992.- т. 26.-№9-10.-С. 106-108.

84. Decleire M., De Cat W., Van Huynh N. Comparison of various permeabilization treatments on Kluyveromyces by deter-mining in situ P-galactosidase activity // Enzyme Microb. Technol.- 1987.- V. 9.- P. 300-302.

85. Flores M. V., Voget С. E., Ertola R. J. J. Permeabilization of yeast cells (Kluyveromyces lactis) with organic solvents // Enzyme Microb. Technol. -1994.-V. 16.-P. 340-346.

86. Holland L.H. Recent advances in applied and mechanistic aspects of the enzymatic hydroxylation of steroids by whole-cell biocatalysts // Steroids. -1999.-V. 64.- P. 178-186.

87. Seip J. E., Di Cosimo R. Optimization of accessible catalase activity in Polyacrylamide gel-immobilized Saccharomyces cerevisiae II Biotechnol. Bioeng. 1992. - V. 40. - P. 638-642.

88. Rao K. J., Panda T. Release of periplasmic penicillin amidase from Escherichia coli by chloroform shock // Bioproc. Eng.- 1996.- V.14.- P. 101-103.

89. Smolders A. J. J., Pinheiro H. M., Noronha P., Cabral J. M. S. Steroid bioconversion in a microemulsion system // Biotechnol. Bioeng.- 1991.- V. 38.-P. 1210-1217.

90. Mazumder Т., Sonomoto K., Tanaka A., Fukui S. Sequential conversion of cortexolone to prednisolone by immobilised mycelia of Curvularia lunata and immobilized cells of Arthrobacter simplex // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1985.-V. 21.- P. 154-161.

91. Laour L., Lowe К. C., Mulligan B. J. Yeast response to nonionic surfactants // Enzyme Microb. Technol.- 1996.- V. 18.- P. 433-^138.

92. Christova N., Tuleva В., Galabova D. Dependence of yeast permeabilization with Triton X-100 on the cell age // Biotechnol. Tech.- 1996.- V. 10.- P. 77-78.

93. Алехина T.M., Рыжкова B.M., Гусарова Т.И., Куракова В.В., Клубничкина Г.А. Микробиологическая трансформация соединений включения стероидов с ß-циклодекстрином // Хим.-фарм. журн. 1993.- т. 27,- № 4. -С. 59-62.

94. Егоров Н.С., Кестнер А.И., Вокк P.A. // Итоги науки и техники. Сер. Микробиология.- 1988.- т. 20, ч.1.- С. 4-52.

95. Паппель К.Э., Дихтярев С.И., Сугробова Н.П.// Итоги науки и техники. Сер. Микробиология.- 1988.- т. 21, ч. II.- С. 74-120.

96. Hesselink P.G.M., van Vliet S., de Vries H. I I Enzyme Microb. Technol.- 1989.-V. 11.-P. 398-404.

97. Кестнер А.И., Пальм Т.Б. // Итоги науки и техники. Сер. Микробиология.-1988.- т. 21,ч. И.-С. 128-152.

98. Дихтярев С.И., Штейнберг М.В., Чайка JI.A. // Итоги науки и техники. Сер. Микробиология.- 1988.- т. 20, ч.1.- С. 97-130.

99. Leon R., Fernandes P., Pinheiro H.M., Cabral J. M. S. Whole-cell biocatalysis in organic media // Enzyme Microb. Technol.- 1998.- V. 23.- P. 483-500

100. Cappaert L., Larroche C. Behaviour of dehydrated baker's yeast during reduction reactions in a biphasic medium // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2004.-V. 64.- P. 686-690.

101. Cameotra S.S., Makkar R.S. Synthesis of biosurfoctants in extreme conditions // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 50. - P. 520 - 529.

102. Chevalier J., Pommier M.-T., Cremieux A., Michel G. Influence of Tween 80 on the mycolic acid composition of three cutaneous corynebacteria // J. Gen. Microbiol. 1988. - V. 134. - P. 2457-2461.

103. Marchesi J.R., White G.F., House W.A., Russell N.J. Bacterial cell hydrophobicity is modified during the biodégradation of anionic surfactants // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - V. 124. - P. 387-392.

104. Garcia-Carmona F., Bru R., Sanchez-Ferrer R. In: Gomez-Puyou A, editor, Biomolecules in organic solvents. Boca Raton, FL: CRC Press.- 1992.- P. 163.

105. Haering G., Luisi P.L., Meussdoerffer F. Solubilization of bacterial cells in organic solvents via reverse micelles // Biochem. Biophys. Res. Comm.- 1985.-V.- 127.- P. 911-915.

106. Haering G., Pessina A., Meussdoerffer F., Hochkoeppler S., Luisi P.L. Solubilization of bacterial cells in organic solvents via reverse micelles and microemulsions //Ann NY Acad Sci.- 1987.- V. 506.- P. 337-344.

107. Prichanont S., Leak D.J., Stuckey D.C. The solubilisation of mycobacterium in a water in oil microemulsion for biotransformations: system selection and characterization // Physicochem. Eng. Aspects.- 2000.- V. 166.- P. 177-186.

108. Stamatis H., Xenakis A., Kolisis F.N. Bioorganic reactions in microemulsions: the case of lipases // Biotechnology Advances.- 1999.- V. 17.- P. 293-318.

109. Orlich В., Berger H., Lade M., Schomacker R. Stability and activity of alcohol dehydrogenases in W/O-microemulsions: Enantioselective reduction including cofactor regeneration // Biotechnol. Bioeng.- 2000.- V. 70,- № 6.- P. 638-646.

110. Chen S.-X., Wei D.-Z., Hu Z.-H. Synthesis of galacto-oligosaccharides in AOT/isooctane reverse micelles by P-galactosidase // J. Mol. Catal. B: Ensym.-2001.- V. 16.- P. 109-114.

111. Купцова O.C., Клячко H.JL, Левашов A.B. Синтез алкилгликозидов, катализируемый р-гликозидазами в системе обращенных мицелл // Биоорганическая химия.- 2001.- т.27.- №6.- С. 429-433.

112. Prichanont S., Leak D.J., Stuckey D.C. Chiral epoxide production using mycobacterium solubilized in a water-in-oil microemulsion // Enzyme Microbial. Technol.- 2000.- V. 27.- P. 134-142.

113. Fadnavis N.W., Reddy N.P., Bhalerao U.T. Reverse micelles, an alternative to aqueous medium for microbial reactions: yeast-mediated resolution of a-amino acids in reverse micelles // J. Org. Chem.- 1989.- V. 54.- P. 3218 3221.

114. Famiglietti M., Hochkoppler A., Wehrli E., Luisi P.L. Photosynthetic activity of Cyanobacteria in oil in water micoemulsions // Biotechnol. Bioeng.- 1992.- V. 40.-P. 173- 178.

115. Haering G., Pessina A., Meussdoerffer F., Hochlcoeppler S., Luisi P.L., Ann N.Y. // Acad. Sci.- 1987.- V. 506.- P. 337.

116. Smolders A.J.J., Pinheiro H.M., Noronha P., Cabral J.M.S. Steroid bioconversion in a microemulsion system // Biotechnol. Bioeng.- 1991.- V. 38.-P. 1210-1217.

117. Pfammatter N., Hochkoppler A., Luisi P.L. // Biotechnol. Bioeng.- 1992.- V. 40.-P. 167.

118. Елисеев C.A., Кучер P.B. Поверхностно-активные вещества и биотехнология.- Киев: Наукова думка, 1991,- 60 с.

119. Neu T.R. Significance of bacterial surface-active compounds in the interaction of bacteria with interfaces // Microbiol. Reviews.- 1996.- V. 60.- P. 151-166.

120. Desay J.D., Banat I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential // Microbiol. Mol. Biol. Reviews.- 1997.- V. 61.- P. 47-64.

121. Karanth N.G.K., Deo P.G., Veenanadig N.K. Microbial production of biosurfactants and their importance // Current Science.- 1999.-V. 77.-P.116-126.

122. Rosenberg E., Ron E.Z. High- and low-molecular-mass microbial surfactants // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1999.- V. 52.- P. 154-162.

123. Cooper D.G. Biosurfactants //Microbiol. Sci.- 1986.- V. 3.- P. 145-149.

124. Van Dyke M.I., Lee H., Trevors J.T. Applications of microbial surfactants // Biotech. Adv.- 1991.- V. 9.- P. 241-252.

125. Ганиткевич Я.В. Поверхностно-активные вещества микробного происхождения // Биотехнология.- 1988.- т. 4.- № 5.- С. 575-583.

126. Christofi N., Ivshina I.B. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation// J. Appl. Microbiol.- 2002.- V. 93.- P. 915-929.

127. Lang S., Philp J.C. Surface-active lipids in rhodococci // Antonie van Leeuwenhoek.- 1998.- V. 74.- P. 59-70.

128. Lin S.-C. Biosurfactants: recent advances // J. Chem. Tech. Biotechnol.- 1996.-V. 66.- P.109-120.

129. Ron E.Z., Rozenberg E. Natural role of biosurfactants // Environ. Microbiol.-2001.- V. 3940.- P.229-236.

130. Duvnjak Z., Kosaric N. Production and release of surfactant by Corynebacterium lepus in hydrocarbon and glucose media // Biotechnol. Lett. -1985.- V. 7.-P. 793-796.

131. Banat I.M. Biosurfactant production and possible uses in microbial enchanced oil recovery and pollution remediation: a review // Biorecource Technol.- 1995.-V.51.-P. 1-12.

132. Robert M., Mercade M.E., Bosch M.P., Parra J.L., Espuny M.J., Manresa M.A., Guinea J. Effect of the carbon source on biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa 44T // Biotechnol. Lett.-1989.-V. 11.-P.871-874.

133. Haba E., Espuny M.J., Busquets M., Manresa A. Screening and production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCIB 40044 from waste frying oils // J. Appl. Microbiol.- 2000.- V. 88.- P. 379-387.

134. Yu-Hong W., Li-Fen W., Jo-Shu C. Optimizing iron supplement strategies for enhanced surfactin production with Bacillus subtilis / Biotechnol.Progr. -2004.-V. 20.- №3.- P. 979-983.

135. Wei Yu.-H., Chu I.-M. Mn2+ improves surfactin production by Bacillus subtilis II Biotechnol. Lett.- 2002.- V. 24.- P. 479-482.

136. Suzuki T., Tanaka H., Itoh S. Sucrose lipids of Arthrobacter, Corynebacteria and Nocardia grown on sucrose // Agricultural and Biological Chemistry.- 1974.- V. 38.- P. 557-563.

137. Guerra-Santos L.H., Kappeli O., Fiechter A. Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon source // Appl. Environ. Microbiol- 1984.- V. 48.- P. 301-305.

138. Calder PC, Grimble RF. Polyunsaturated fatty acids, inflammation and immunity // European Journal of Clinical Nutrition.- 2002.- V. 56.- P. S14-S19

139. Ratledge C. Single cell oils—have they a biotechnological future?// Trends Biotechnol. 1993. - V. 11. - P. 278-284.

140. Van der Westhuizen J.P.J., Kock J.L.F., Botha A., Botes P.J. The distribution of the w3 and w6 series of cellular long - chain fatty acids in fungi// Systematic and Appl. Microbiol. - 1994. - V. 17. - P. 327-345.

141. Yongmanitchai W., Ward O.P. Omega-3 fatty acids:Alternative sources ofproduction // Proc. Biochem. 1989. - V. 9. - P. 117 - 125.

142. Calder P.C. Dietary modification of inflammation with lipids // Proc. Nutr. Soc.-2002.- V. 61.- P. 345-358.

143. Shimokawa H. Beneficial effects of eicosapentaenoic acid on endothelial vasodilator functions in animals and humans // World Rev. Nutr. Diet.- 2001.-V. 88.-P. 100-108.

144. Larsson S.C., Kumlin M., Ingelman-Sundberg M., Wolk A. Dietary long-chain n-3 fatty acids for the prevention of cancer:a review of potential mechanisms // Am. J. Clin. Nutr.- 2004.- V. 79.- P. 935- 945.

145. Cleland L.G., James M.J. Fish oil and rheumatoid arthritis: anti-inflammatory and collateral health benefits // J. Rheumatol.- 2000.- V. 27.- P. 2305-2307.

146. Mantzioris E., et al. Dietary substitution with alpha- linolenic acid-rich vegetable oil increases eicosapentaenoic acid concentrations in tissues // Am. J. Clin. Nutr.- 1994.- V. 59.- P. 1304-1309.

147. Hardman W. E. Omega-3 fatty acids to augment cancer therapy // J. Nutr.-2002.- V. 132.- P. 3508S-3512S.

148. Tinoco J. Dietary requirements and functions of -linolenic acid in animals // Prog. Lipid Res.- 1982.- V. 21.- P. 1-45.

149. Holman R.T. Nutritional and metabolic interrelationships between fatty acids // Fed. Proc.- 1964.- V. 23.- P. 1062-1067.

150. Sardesai V. M. The essential fatty acids// J. Nutr. Biochem. 1992. - №7:3. - P. 562-579.

151. Lands W.E.M. Eicosanoids and health// Ann. NY Acad. Sci.- 1993.- V.15.- P. 46-59.

152. Simopoulos A.P. Omega-3 fatty acids in health and disease and in growth and development // Am. J. Clin. Nutr 1991.- V. 54 - P.438-463.

153. Fernandes G., Venkatraman J. T. Role of omega-3 fatty acids in health and disease// Nutr. Res.- 1991.- V. 13.- P. 19-45.

154. Ward O.P., Singh A. Omega-3/6 fatty acids: Alternative sources of production // Process Biochemistry.- 2005.- V. 40.- P. 3627-3652.

155. Sijtsma L., de Swaaf M.E. Biotechnological production and applications of the w-3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2004.- V. 64.- P. 146-153.

156. Kendrick A., Ratledge C. Lipids of selected molds grown for production of n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids // Lipids.- 1992.- V. 27.- P. 15-20.

157. Dyal S.D., Narine S.S. Implications for the use of Mortierella fungi in the industrial production of essential fatty acids // Food Research International.-2005.- V. 38.- P. 445-467.

158. Wen Z.-Y., Chen F. Fleterotrophic production of eicosapentaenoic acid by microalgae // Biotechnol. Adv.- 2003.- V. 21.- P. 273-294.

159. Yazawa K. Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria // Lipids.-1996.- V. 31.-P. S297-S300.

160. Iqbal G., Valivety R. Polyunsaturated fatty acids, part 1: occurrence, biological activities and applications // Trends in Biotechnology.- 1997.-V. 15,- P.401-409.

161. Yongmanitchai W., Ward O.P. N-3 fatty acids: alternative sources of production // Proc. Biochem.- 1989.- P. 117-25.

162. Ahern T.J., Katoh S, Sada E. Arachidinic acid production by the red alga Porphyridium cruentum // Biotechnol. Bioeng.- 1983.- V. 25.- P. 1057-1070.

163. Bajpai P., Bajpai P.K. Eicosapentaenoic acid (EPA) production from microorganisms: a review//J. Biotechnol.- 1993.- V. 30.- P. 161-183.

164. Certik M., Shimizu S. Biosynthesis and regulation of microbial polyunsaturated fatty acid production // J. Biosci. Bioeng.- 1999.- V. 87.- P. 1-14.

165. Li Z.Y., Lu Y.Y., Yadwad V.B., Ward O.P. Process for production of arachidonic acid concentrate by a strain of Mortierella alpina // Canadian Journal of Chemical Engineering.- 1995.-V. 73.-P. 135-139.

166. Higashiyama K., Yaguchi T., Akimoto K., et al. Enhancement of arachidonic acid production by Mortierella alpina 1S-4 // J. Am. Oil Chem. Soc.- 1998.- V. 75.- P. 1501-1505.

167. Bajpai P., Bajpai P.K., Ward O.P. Eicosapentaenoic acid (EPA) formation: comparative studies with Mortierella strains and production by Mortierella elongate // Mycological Research.- 1991.- V. 95.- P. 1294-1298.

168. Stinson E.E., Kwoczak R. and Kurantz M. Effect of cultural conditions on production of eicosapentaenoic acid by Pythium irreguläre // J. Ind. Microbiol.-1991.-V. 8.-P. 171-178.

169. Obrien D.J., Kurantz M.J., Kwoczak R. Production of eicosapentaenoic acid by the filamentous fungus pythium irreguläre // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1993.- V. 40.- P. 211-214.

170. Gandhi S.R., Weete J.D. Production of the polyunsaturated fatty acids by fungus Pythium ultimum // J. General Microbiol.- 1991.- V. 137.- P. 1825-1830.

171. Stredansky M., Conti E., Salaris A. Production of polyunsaturated fatty acids by Pythium ultimum in solid-state cultivation // Enzyme Microb. Technol.- 2000.-V. 26.- P. 304-307.

172. Jang H.-D., Lin Y.-Y., Yang S.-S. Polyunsaturated fatty acid production with Mortierella alpina by solid substrate fermentation // Bot. Bull. Acad. Sin. 2000. - V. 41. - P.41-48.

173. Conti E., Stredansky M., Stredanska S., Zanetti F. Gamma-Linolenic acid production by solid-state fermentation of Mucorales strains on cereals // Bioresource Technol.- 2001.- V. 76.- P. 283-286.

174. Wynn J.P., Hamid A.A., Midgley M., Ratledge C. // Wold J. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 14. - P.145.

175. Krishnaiah M.M. Scale-up strategies for solid state fermentation systems. // Process Biochemistry. 1992. - V. 27. - P. 259-273.

176. Mitchell D.A., Grenfield P.F., Doelle H.W. A model substrate for solid state fermentation // Biotechnol. Lett. 1986. - V.6. - P. 827-832.

177. Costa J.A.V., Alegre R.M., Hasan S.D.M. Packing density and thermalconductivity determination for rice bran solid-state fermentation // Biotechnol. Technol.- 1998.- V. 12.- P. 747-750.

178. Feng K.C., Liu B.L., Tzeng Y.M. Veiticillium lecanii spore production in solidstate and liquid-state fermentations // Bioprocess Eng.- 2000.- V. 23.- P. 25-29.

179. Shinmen Y., Shimizu S., Akimoto D. Production of arachidonic acid by Mortierella fungi. Selection of a potent producer and optimization of culture conditions for large-scale production // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. — V.31.-P. 11-16.

180. Lindberg A.M., Molin G. Effect of temperature and glucose supply on the production of polyunsaturated fatty acids by fungus Mortierella alpina CBS343.66 in fermentor cultures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - V. 39. -P. 450-455.

181. Bajpai P.K., Bajpai P., Review: arachidonic acid production by microorganisms //Biotechnol. Appl. Biochem.- 1992.-V. 15.-P. 1-10.

182. Park E.Y., Koike Y., Higashiyama K., Fujikawa S., Okabe M. Effect of nitrogen source on mycelial morphology and arachidonic acid production in cultures of Mortierella alpine // J. Biosci. Bioeng. 1999. - V. 88. - P. 61-67.

183. Totani N., Hyodo K., Ueda T. A study on new nitrogen source for cultivation of genus Mortierella // J. Jpn. Oil Chem. Soc. 2000. - V. 49. - P. 479-485.

184. Koike Y., Cai H.J., Higashiyama, K, Fujikawa, S., Park, E.Y. Effect of consumed carbon to nitrogen ratio on mycelial morphology and arachidonic acid production in cultures of Mortieralla alpina // J. Biosci. Bioeng.- 2001.- V. 91.-P. 382-389.

185. Kyle D.J. Arachidonic acid and methods for the production and use thereof. PCT Patent W096/21037. 1996.

186. Bajpai P., Bajpai P.K., Ward O.P. Eicosapentaenoic acid (EPA) production by

187. Mortierella alpina ATCC 32222 // Appl. Biochem. Biotechnol.- 1991.- V. 31.- P. 267-272.

188. Shimizu S., Akimoto K., Kawashima H., Shinmen Y., Yamada, H. Production of dihomo-gamma-linlenic acid by Mortierella alpinalS-4 // J. Am. Chem. Soc.-1989a.- V. 66.- P. 237-241.

189. Shimizu S., Kawashima H., Akimoto K., Shinmen Y., Yamada H. Conversion of linseed oil to an eicosapentaenoic acid-containing oil by Mortierella alpina 1S-4 at low temperature // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1989.- V. 32.- P. 1-4.

190. Рахматуллина Ю.Р. Разработка метода получения полиненасыщенных жирных кислот: Автореф. дис. канд. техн. наук. Казань, 2007.- 20 с.

191. Shimizu S., Kawashima Н., Akimoto К., Shinmen Y., Yamada H. Microbial conversion of an oil containing alphalinolenic acid to an oil containing eicosapentaenoic acid // J. Am. Chem. Soc.- 1989b.- V. 66.- P. 342-347.

192. Kendrick A., Ratledge C. Cessation of polyunsaturated fatty acid formation in four selected filamentous fungi when grown on plant oils // J. Am. Oil Chem. Soc.- 1996.- V. 73.- P. 431-435.

193. Shimizu S., Akimoto K., Shinmen Y., Kawashima H., Sugano L. M., Yamada, H. Sesamin is a potent and specific inhibitor of delta5 desaturase in polyunsaturated fatty acid biosynthesis // Lipids.- 1991.- V 26.- P. 512-516.

194. Funtikova N. S., Mysyakina, I. S. Synthesis of gammalinolenic acid by mucaraceous fungi utilizing exogenous fatty acids // Microbiology.- 1997.- V. 66.- P. 76-79.

195. Kavadia A., Komaitis M., Chevalot I., Blanchard F., Marc I., Aggelis G. Lipid and gamma-linolenic acid accumulation in strains of Zygomycetes growing on glucose // J. Am. Oil Chem. Soc.- 2001.- V. 78.- P. 341-346.

196. Guo X., Ota Y. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids bya yeast (F0726A) // J. Appl. Microbiol.- 2000.- V. 89.- P. 107-115.

197. Guo X., Tomonaga Т., Yanagihara Y., Ota Y. Screening for yeasts incorporating the exogenous eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids from crude fish oil // J. Bioscien. Bioeng.- 1999.- V. 87.- P. 184-188.

198. Hottinger H.H., Richardson Т., Amundson C.H., Stuiber D.A. Utilization offish oil by Candida lipolytica and Geotrichum candidum // Journal of Milk and Food Technology.- 1974a.- V. 37.- P. 463-468.

199. Hottinger H.H., Richardson Т., Amundson C.H., Stuiber D.A. Utilization of fish oil by Candida lipolytica and Geotrichum candidum. II. Optimization of conditions // Journal of Milk and Food Technology.- 1974b.- V. 37.- P. 522-528

200. Kinoshita H., Ota Y. Concentration of Docosahexaenoic Acid from Fish Oils Using Geotrichum sp. F0347-2 // Bioscien. Biotechnol. Biochem.-2001.- V. 65.-P. 1022-1026.

201. Certik M., Sakuradani E., Shimizu S. Desaturase-defective fungal mutants: useful tools for the regulation and overproduction of polyunsaturated fatty acids // Tibtech December. 1998. - V. 16. - P. 500-505.

202. Shimizu S., Kawashima H., Shinmen Y., Akimoto K., Yamada H. Production of eicosapentaenoic acid by Mortierella fungi // J. Am. Oil Chem. Soc.- 1988.- V. 65.-P. 1455-1459.

203. Jareonkitmonkol S., Shimizu S., Yamada H. Production of an eicosapentaenoic acid-containing oil by a Al2desaturase-defective mutant of Mortierella alpina 1S-4 // J. Am. Oil Chem. Soc.- 1993.- V. 70.- P. 119-123.

204. MRS Lipid Analysis Unit Электронный ресурс.: Режим доступа: www.lipid.co.uk. — Загл. с экрана. Яз. англ.

205. Sigma-Aldrich Электронный ресурс.: Режим доступа: www.sigma-aldrich.com.

206. Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова / Учеб. пособие.- М.: Изд-во Моск. гос. ун-та, 1976.- 307 с.

207. Кутафьева Н.П. Морфология грибов: Учеб. пособие.- Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2003.- 215 с.

208. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов: Пер. с англ.- М.: Мир, 2001.-486 с.

209. Потапов В.М. Стереохимия.- М.: Химия, 1988 464 с.

210. А.С. 968072. СССР, МКИ С 12 Q 1/100. / Султанович Ю. А., Нечаев А. П., Барсукова И. А. Способ количественного определения жирно-кислотного состава липидов микроорганизмов. //Б.И. - 1982. — №39.- С. 223.

211. Henke Н., Schubert J. HPLC of fatty acid esters of mono- and polyhydric alcohols, part 1: Analytical separation// J. High Resol. Chromat. Chromat. Comm. 1980. - Vol. 3. - P. 69-78.

212. Давлетбаев И.М., Петухова Н.И., Зорин B.B. Скрининг низших грибов -потенциальных продуцентов незаменимых полиненасыщенных жирных кислот // Баш. хим. ж. 2000. - Т.7- №5.- С. 40-42.

213. Zhao Yu., DeLancey G.B. Transmembrane distribution of substrate and product during the bioreduction of acetophenone with resting cells of Saccharomyces cerevisiae II Biotechnol. Bioeng.- 1999.- V. 64.- P. 434-441.

214. Петухова Н.И., Давлетова A.P., Привалова И.В., Зорин В.В. Стереоселективное восстановление этилацетоацетата микроорганизмами // Баш. хим. ж.-1998.- т.5.- №3.-С. 42-45.

215. ФГУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Аттестат аккредитации ГСЭН.11и.ЦОА.155

216. Микроморфология. Гифы септированные, бесцветные ползучие, в большинстве погруженные. Нарастающие гифы дихотомически разветвленные. Конидиеносцы отсутствуют. Воздушные гифы вскоре фрагментируются на артроконидии. Форма артроконидий цилиндрическая.

217. Выделен из кисломолочных продуктов.

218. В работе использовались белые мыши с исходной массой тела 16-18 г. Содержание животных соответствовало санитарным правилам.

219. Вирулентность культуры микроорганизма оценивалась в острых опытах на белых мышах и крысах при различных путях введения взвеси бактерий в физиологическом растворе (внутрибрюшинно, перорально и интраназально).

220. Вводимая доза выражалась величиной десятичного логарифма, соответствующей количеству микробных клеток, полученных животными; каждая доза испытывалась не менее, чем на 6 животных.

221. Результаты приведены в таблице. Таблица. Оценка вирулентности

222. Путь введения Вид животных дл501. Внутрибрюшинно Мш > 61. Кс >71. Рег об Мш >91. Кс >91. Интраназально Мш >71. Кс >7

223. При анализе результатов посевов крови и внутренних органов животных ни в одном из исследований не был обнаружен рост культуры микроорганизма на питательной среде.

224. Таким образом, диссеминация культуры микроорганизма Оео^сЬиш М (ОеоМсЬиш 85-1) во внутренние органы при поступлении в организм отсутствует.

225. ЗАКЛЮЧЕНИЕ: Культура микроорганизма ОеойсЬиш М (ОеойсЬигп 85-1) не вирулентна и не обладает способностью к диссеминации во внутренние органы.

226. Хуснаризанова Р.Ф. Ткачева С.Г. Черняева Н.Ю.

227. В.н.с. канд. биол Научные со

Информация о работе

Калимуллина, Лилия Ягфарьевна
кандидата технических наук
Уфа, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка биокаталитических методов получения (R)- и (S)-энантиомеров 1-фенилэтанола и эйкозапентаеновой кислоты - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы