Разработка энантиоселективных биокатализаторов кинетического разделения рацемических спиртов, кислот и эфиров

Хабибуллина, Ирина Ифировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка энантиоселективных биокатализаторов кинетического разделения рацемических спиртов, кислот и эфиров
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка энантиоселективных биокатализаторов кинетического разделения рацемических спиртов, кислот и эфиров"

003053219

На правах рукописи

Хабибуллина Ирипа Ифировна

РАЗРАБОТКА ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ КИНЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ РАЦЕМИЧЕСКИХ СПИРТОВ, КИСЛОТ И ЭФИРОВ

Специальность 03.00.23 - «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Казань - 2007

003053219

Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Зорин Владимир Викторович.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Гуревич Петр Аркадьевич; кандидат технических наук, доцент Кусова Ирина Валерьевна.

Ведущая организация

Институт биологии Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Защита состоится «28» февраля 2007 года в 14-00 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.080.02 при Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420015, Республика Татарстан, г. Казань, ул.К.Маркса, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан «28» января 2007 года

Ученый секретарь совета

Поникаров С. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Важнейшими синтонами при производстве лекарственных препаратов и биологических средств защиты растений являются оптически чистые энантиомеры спиртов, кислот и сложных эфиров. Наиболее эффективными способами получения таких соединений является кинетическое разделение их рацемических смесей парциальным ацилированием или энантиоселективным гидролизом с помощью гидролаз микроорганизмов (эстераз и липаз), отличающихся высокой селективностью, широкой субстратной специфичностью, активностью, стабильностью, способностью работать как в воде, так и в органических растворителях.

Клетки микроорганизмов с успехом применяются в качестве катализаторов во многих процессах регио- и энантиоселективной трансформации органических соединений. Использование их в качестве биокатализаторов кинетического разделения более перспективно по сравнению с ферментными препаратами, учитывая, с одной стороны, высокие затраты материалов и энергии на концентрирование и выделение внеклеточных и внутриклеточных ферментов, а с другой - значительный расход ферментов во время трансформации. Кроме того, важнейшим преимуществом интактных клеток перед ферментными препаратами явлется возможность их регенерации и многократного использования.

Принимая во внимание успехи, достигнутые в создании ©-функциональной боковой изопреноидной цепи а-токоферола с 2-мя хиральными центрами И-конфигурации на основе хлорофилла, разработка биокаталитического метода получения Б-хроманилэтанола - ключевого синтона полного аналога природного а-гокоферола - является важной задачей на пути создания альтернативной технологии получения витамина Е на основе доступного растительного и нефтехимического сырья.

Использование методов энантиоселективной биотрансформации с применением клеток микроорганизмов также является перспективным подходом к синтезу оптически активного 8-кетопрофена - ценного предшественника в синтезе нестероидных противовоспалительных препаратов.

В связи с этим создание доступных, технологичных и энантиоселективных катализаторов для синтеза оптически активных в-хроманилэтаггола (ключевого синтона в синтезе витамина Е) и 8-кетопрофена (синтона нестероидных противовоспалительных препаратов) является актуальной задачей.

Цель работы. Разработка энантиоселективных биокатализаторов для получения оптически активных 8-(-)-б-бензилокси-2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана и 5-(+)-2(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты на основе микроорганизмов, обладающих гидролазной активностью. Поиск методов интенсификации процессов кинетического разделения оптически активных спиртов, кислот и эфиров.

В связи с этим задачами работы являлись:

• осуществление скрининга микроорганизмов, обладающих липолитической и эстеразной активностью;

• исследование свойств перспективных штаммов с целью их идентификации;

• разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального разделения спиртов, кислот и эфиров в процессах этерификации и гидролиза на основе клеток мшфоорганизмов с целью получения оптически активных 8-хроманилэтанола, энантиомеров других спиртов и 8-кетопрофена;

• исследование условий эффективной работы и стабильности биокатализаторов;

• разработка методов получения оптически активных S-хроманилэтанола и S-кетопрофена с использованием созданных биокатализаторов;

• исследование подходов к интенсификации процессов кинетического разделения спиртов и эфиров.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракг № 02.438.11.7003), региональной программой РФФИ "Агидель" (2005г.), планами научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой "Развитие научного потенциала высшей школы" (проект «Научно-образовательная деятельность музея, созданного на базе кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета» 2005-2006 гг.).

Научная новизна. Выделены и идентифицированы новые микроорганизмы родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (КЗ-2), на основе которых созданы энантиоселективные биокатализаторы, проявляющие каталитическую активность при парциальном ацилировании R,S-хроманилэтанола, переэтерификации R,S-кетопрофена и энантиоселективном гидролизе их рацемических эфиров.

Научно обоснованы методы синтеза оптически активных 8-(-)-6-бензилокси-2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана и 8-(+)-2-(3-бензоил-фенил) пропионовой кислоты с использованием биокатализаторов на основе микроорганизмов родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (КЗ-2). Обнаружена инверсия К-(+)-хроманилэтанола в 8-(-)-хроманилэтанол в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма, относящегося к роду Rhodococcus (77-32). Найдены условия (температура, pH, растворитель), в которых биокатализаторы проявляют наивысшую активность. Разработаны методы увеличения активности биокатализаторов путем их обработки органическими растворителями. Показано, что в условиях кинетического разделения биокатализаторы проявляют высокую стабильность. Доказана возможность многократного использования разработанных биокатализаторов.

Практическая значимость. На основе найденных культур микроорганизмов родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (КЗ-2) созданы энантиоселективные биокатализаторы и эффективные методы получения S-(-)-хроманилэтанола - ключевого синтона витамина Е и 8-(+)-кетопрофена -предшественника нестероидных противовоспалительных препаратов высокой оптической чистоты.

Разработаны методы увеличения активности ранее описанных катализаторов энантиоселективного гидролиза рацемических эфиров вторичных спиртов не снижающие энантиоселективность.

Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 240901 - «Биотехнология».

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на 55,56 и 57-й научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (Уфа, 2004-2006), -V Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005), IV Всероссийской научной INTERJSIET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в

области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005), научно-практической республиканской конференции «Успехи интеграции академической и вузовской науки по химическим специальностям» (Уфа, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов, материалов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов (глава 3), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 10 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Разработка энантиоселекгивных биокатализаторов для кинетического разделения рацемических 6-бензилокси-2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметил-хромапа и 6-бензилокси-2(2-ацетоксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана

1.1 Скрининг микроорганизмов, обладающих гидролазной активностью

Для разработки эффективных биокаталигаческих методов получения оптически активных хроманов требовалось найти микроорганизмы, клетки которых могут быть использованы в процессах кинетического разделения рацемических смесей 6-бензилокси-2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана (хроманил-этанола 1*) или 6-бензилокси-2(2-ацетоксиэтил)-2,5,7,8-тетраметил-хромана (хроманилэтилацетата 2*).

Скрининг энантиоселективных биокатализаторов осуществляли в два этапа. На первом этапе были отобраны микроорганизмы, продуцирующие гидролазы и осуществляющие гидролиз ацетата хроманилэтанола. Объектами первичного скрининга служили более 100 музейных культур липолитических микроорганизмов из коллекции кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, в том числе энантиоселективные культуры микроорганизмов родов Pseudomonas (77-47), Pseudomonas (77-33, 59-3), Bacillus (77-1, 79-54), Rhodococcus (78-5), способные осуществлять парциальное ацилирование ряда вторичных спиртов и энантиоселекгивный гидролиз их сложных эфиров, а также почвенные микроорганизмы (56 культур), выделенные на средах с этилацетатом и изопропанолом. В результате скрининга, было отобрано 25 культур.

На втором этапе скрининга среди отобранных продуцентов искомых гидролаз выявляли энантиоселективные ' микроорганизмы, способные осуществлять кинетическое разделение рацемических смесей хроманов (50%-ную конверсию субстрата по одному из энантиомеров).

Для получения оптически активных хроманилэтанолов с помощью липаз микроорганизмов могут быть использованы два процесса: парциальное ацилирование рацемического хроманилэтанола 1 и энантиоселекгивный гидролиз рацемического хроманилэтилацетата 2:

*Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам ИНК РАН д-ру хим. наук, проф. Одинокову В.Н. и канд. хим. наук Спивак А.Ю. за предоставленные образцы рацемических соединений 1,2 и внимание к работе.

Хроманялэтанол нерастворим в неполярных растворителях, поэтому наряду с поиском Знантиоселективных биокатализаторов осуществляли подбор подходящего растворителя.

В более ранних работах с применением очищенных липаз микроорганизмов для парциального ацилирования хроманилэтанола в качестве реакционной среды использовался диэтиловый эфир и ацетон. В качестве ацилирующего агента в этих исследованиях использовали винилацетат.

Для суспендирования клеток в органическом растворителе промытую фосфатным буфером биомассу микроорганизмов предварительно обезвоживали ацетоном. Известно, что такая предобработка биомассы ацетоном не оказывает инактивирующего действия на клеточные липолитические биокатализаторы, а напротив - может увеличивать их активность и стабильность.

В результате тестирования 25 культур, обладающих гидролазной активностью в отношении хроманилэтилацетата, было найдено 16 культур микроорганизмов, способных синтезировать хроманилэтилацетат этерификацией хроманилэтанола винилацетатом в течение трех суток с ~50%-ной конверсией субстрата. Более активно трансформация хроманилэтанола протекала в смешанных растворителях При этом все найденные микроорганизмы конвертировали субстрат в изооктане, содержащем 5 % ацетона. Многие культуры, хотя и менее активно, но работали в 5 %-ном растворе ацетона в гексане.

Исследование оптических свойств остаточных субстратов и продуктов ацилирования хроманилэтанола показало, что в реакционных смесях этих клеток микроорганизмов (77-25, 77-32, И-10, Э-13, 77-5, 78-2, 77-34, 77-64, 79-2, 79-15, 57-3, 77-12 и 77-9) накапливаются правовращающие хроманы.

В качестве продукта трансформации преимущественно образуется S-(+)-2-(2-ацетоксиэтил)-6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман, для которого, по литературным данным, величина [a]D22 равна +18,5. Это позволяет отнести найденные микроорганизмы к биокатализатарам S-типа, катализирующим преимущественно трансформацию S-энантиомера рацемического субстрата:

Остаточный субстрат трансформации представляет собой преимущественно 2-[R-(+)-б-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил]этанол, для которого, по литературным данным, величина удельного вращения равна [a]D 22 +17,35.

Однако, судя по величинам удельного вращения [<x]D22, которые показали полученные препараты замещенных хроманов, большинство культур, за исключением клеток микроорганизмов 77-9 и 77-12, в исследуемых системах растворителей проявляют низкую энантиоселекгивность. Вероятно, в этих условиях

конверсия близкая к 50 %-ному уровню, в большей степени обусловлена низкой скоростью реакции или ингибированисм органическими растворителями.

Вместе с тем культуры микроорганизмов 77-9 и 77-12 проявили высокую энантиос елекгнвносгь, позволяющую получать в ацетоне высокочистый 5-хромаиилэтилацетат (97% ее). Низкая оптическая чистота остаточного хро манил этанол а (52 и 40% ее соответственно), вероятно, связана с неполной конверсией исходного рацемичеекот субстрата (37 и 33 %).

Таким образом, в результате скрининга были найдены две перспективные энан тиоеелективные культуры микроорганизмов 77-9 и 77-12.

С целью повышения эффективности найденных биокатализаторов при их практическом использовании а препаративных целях был осуществлен поиск новых условий, в которых они проявляют высокую селективность,

1.2 Исследование условий анилнровання хроманилэтанола вин ил ацетатом в присутствии клеточных катализаторов на основе культур м икр организмов 77-12 и 779 в системах ацетон-изооктан

Изменение липофильно-гидрофильного баланса, определяющего конформанию третичной струюуры фермента за счет изменения полярности бинарного растворителя, является одним из методов, позволяющих регулировать каталитическую активность и эпацтиоселективность фермента.

При исследовании влиянии концентрации ацетона на начальную скорость а цитирования хрома] шлэтацола винил ацетатам в присутствия катализаторов на основе клеток микроорганизмов 77-12 и 77-9 в системах ацетон-изооктан было установлено, что снижение содержания полярного растворителя приводи! к существенному ускорению реакции в обоих случаях (рисунок 1).

О 20 40 W «в IM

Концентрации ацетона, % (v/v) 77-12

¡1

s -

Ё ?1

<5 I

100 se 60 40 20

tfl

5 50 60 70 100 Концентариня ацетона.

% (v/v)

■ 77-9 □ 77-12

Рисунок 1-Зависимость скорости ацилирования хроманилэтанола вин ил ацетатом в присутствии биоказализиторов на основе культур микроорганизмов 77-12 и 77-9 в бинарной смеси йцетон-изоокган

Рисунок 2 - Зависимость оптической чистоты х роман ил этил ацетата от

концентрации ацетона при ацилировании хроманилэтанола вини л ацетатом в присутствии культур микроорганизмов 77-12 и 77-9 бинарной смсси ацетон-изооктан

Однако при этом было найдено, что высокая энантиоселекшвность проявляется лишь в системах, содержащих >70 % ацетона, в которых скорость

реакции мала и сопоставима со скоростью в чистом ацетоне. При этом наиболее активно и энантиоселективно осуществлялась трансформация культурой 77-9 (рисунок 2).

Таким образом, наилучшие результаты при ацегилировании получены при использовании микроорганизма 77-9. С помощью данного биокатализатора в течение трех суток удается получать 8-(+)-2-(2-ацетоксиэтил)-б-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман с [a]D22 +16 с оптической чистотой 92 % ее, последующий гидролиз которого дает необходимый 8-(-)-2-(2-шдроксиэтил)-6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман.

1.3 Исследование биокатализируемого гидролиза хроманилэтилацетата

Низкая скорость и энантиоселективность процессов ацетилирования, реализуемых в органических растворителях, побудила к исследованию альтернативного процесса получения оптически активных хроманов энантиоселективного гидролиза хроманилэтилацетата 2, в котором биокатализаторы находятся в водной среде. Растворенный в ацетоне субстрат вносили в буферный раствор (концентрация ацетона 20% (v/v)).

В качестве биокатализаторов использовались клетки микроорганизмов, проявивших на стадии экспресс-тестирования гидролазную активность в отношении хроманилэтилацетата (25 культур).

При исследовании кинетики гидролиза эфира 2, катализируемого различными культурами микроорганизмов, было установлено, что многие микроорганизмы за трое суток гидролизовали субстрат неселективно.

За этот период более высокая конверсия субстрата (25 - 50 %) была достигнута только в случае четырех культур (77-25,77-32,77-64 и 79-15).

100г

«о

Я SO"

5 ии и

О 20 40 «0 80 100 120 -«- 77-64 •►•77-25 -» 79-15 -*• 77-32

Рисунок 3 - Кинетика гидролиза хроманилэтилацетата биокатализаторами на основе культур микроорганизмов 77-64,77-25,79-15 и 77-32 в 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,0), содержащем 20% ацетона, начальной концентрации субстрата 3 г/л, скорости перемешивания 180 об/мин и температуре 30 °С

Однако кинетика типичная для стереоселекгивного процесса, была выявлена только для культуры 77-32, который конвертировал ~35% рацемического субстрата к 72 часам (рисунок 3).

В результате исследования оптических свойств «остаточного» эфира было обнаружено, что он представляет собой правовращающий 8-(+)-хроманилэтилацетат 54 %-ной оптической чистоты ([a]D22 +10).

Это позволяет отнести культуру 77-32 к энантиоселективным биокатализаторам R-типа, катализирующим превращение R-энантиомера субстрата в R-продукт:

Известно, что 2-[К-(+)-6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил]этанол является правовращающим соединением с [a]D22 +17,35. Однако в ходе исследуемой трансформации вместо ожидаемого правовращающего К-(+)-хроманилэтанола образуется левовращающий спирт с оптической чистотой 99 % ([a]D22 -17,16), то есть 2-[5-(-)-6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил]этанол.

Полученные результаты позволяют предположить, что в ходе гидролиза эфира 2 образующийся Я-(+)-хроманилэтанол подвергается инверсии в 8-(-)-хроманил-этанол:

В пользу этого предположения свидетельствуют результаты, полученные при инкубации биокатализатора на основе клеток микроорганизма 77-32 с рацемическим хроманилэтанолом в условиях, аналогичных гидролизу хроманилэтилацетата. Было найдено, что в этих условиях происходит обогащение смеси Б-изомером (уже через двое суток энантиомерный избыток 8-хроманилэтанола составил 74% ее).

Низкая чистота остаточного эфира (54% ее) в исследуемом процессе гидролиза хроманилэтилацетата при конверсии 35% (вместо теоретически возможной 50%-ной конверсии в энангиоселективном процессе) связана с неполным превращением Я-(+)-энантиомера субстрата. Таким образом, для получения более чистого остаточного в-эфира необходимо увеличить продолжительность трансформации или увеличить скорость ее протекания.

В связи с этим была предпринята попытка увеличения каталитической активности клеток микроорганизма 77-32 путем оптимизации температуры и кислотности среды. При этом было установлено, что оптимальные значения рН и температуры близки к используемым (рН 7,0 и 30 °С).

Более значительное увеличение гидролазной активности культуры 77-32 было достигнуто при изучении влияния концентрации ацетона на гидролиз хроманилэтилацетата. Было обнаружено, что при концентрации ацетона 30 % конверсия субстрата составляет 43 % уже после 72 ч трансформации. При дальнейшем увеличении концентрации ацетона (более 30 %) скорость реакции и соответственно конверсия субстрата снижаются.

5 10 20 30 40 Ковиентрация ацетона, % (v/v)

■ активность Е конверсия

Рисунок 4 - Зависимость относительной активности клеток культуры 77-32 от концентрации ацетона при гидролизе х романил эти л ацетата в 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,0), содержащем 5 - 40 % ацетона, при концентрации биомассы 30 мг(асв)/мл, начальной концентрации субстрата 3 г/л, скорости перемешивания 180 об/мин и температуре 30 UC

Исследование оптических свойств Хроманов после трансформации хроманил-этилацетата биомассой клеток 77-32 в системе с 30 % ацетона показало, что наряду с высокочистым 2-[S-(-)-6-6eH3nnoKcH-2^,7,8-тетраметилхроман-2-ил] этанол ом (99 % ее) образуется а более чистый, чем в системе с 20%-НЫМ содержанием ацетона, остаточный S - (+)-2-(2-ацето кс иэти л )-6-бензил о кс и -2,5,7,8-terpаметилхроман (76% ее). При увеличении времени трансформации до 96 ч знат ном ер ная чистота остаточного S - (+) -хроманилэтил ацетата увеличивается до 99% ее.

Таким образом, в результате скрининга были кайлены энангиоселективные культуры микроорганизмов 77-9 и 77-32, позволяющие получать оптически чистый S-хромани л этанол с выходом 80%.

2 Разработка энантиоселективных б но катализаторе в для кинетического разделения кетопрофена

2.1 Поиск потенциальных бно катал и зато ров для кинетического разделения рацемической 2-(3-бетоилфеннл)пропноновой кислоты

(кетопрофена)

Аналогично скрининг микроорганизмов был выполнен при поиске биокатализаторов, способных осуществлять кинетическое разделение рацемической смеси кегоггрофека - ценного предшественника ь синтезе нестероишнх противовоспалительных препаратов.

Помимо описанных выше культур микроорганизмов, объектами исследования служили также почвенные микроорганизмы, выделенные на среде с этанолом и бутиловым эфиром кетопрофена.

При первичном скрининге были отобраны 17 культур, способных гидролизовать бутиловый эфир кетопрофена.

Исследование конверсии субстрата и оптической чистоты образующегося продукта показало, что большинство выделенных микроорганизмов осуществляет гидролиз бутилового эфира кетопрофена неселективна.

Наиболее энантиоселективно гидролиз рацемического бутилового эфира кетопрофена протекает в присутствии клеток микроорганизмов КЗ-2, 77-1 и 79-54 с преимущественным образованием К-кетопрофена, что позволяет отнести его к биокатализаторам Ы-типа. Наилучший результат был получен при использовании культуры КЗ-2. При конверсии по субстрату 3 41% с практически количественным выходом 85 % был получен И-кетопрофен 78%-ной оптической чистоты.

Микроорганизмы К-типа перспективны для одновременного получения Я-кетопрофена и Б-эфиров в процессе гидролиза рацемической смеси эфира. Гидролиз ¿-эфира под действием кислотных катализаторов приводит к получению 8-кетопрофену:

СООВн

соон

^-бутиловый эфир кетопрофена 3

11-(-)-кетопрофен

СООВи

§-(+)-бутиловый эфир кетопрофена

СООН

Б-(+)-кетопрофен

Такой процесс имеет практическое значение, поскольку в последние годы появляется все больше сведений о расширении области применения 11-кетопрофена.

2.2 Исследование переэтерифпкации кетопрофена

Альтернативным энантиоселективным биокаталитическим процессом, лежащим в основе кинетического разделения кетопрофена, является переэтерификация. При переэтерификации кетопрофена в изооктане, содержащем 5% ацетона, различными акцепторами ацильных групп (этилацетат, винилацетат, бутилацетат) в присутствии биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов КЗ-2, 79-54, 77-1 было установлено, что наиболее активно кетопрофен конвертируется в присутствии культуры КЗ-2 под действием винилацетата:

соон

соо^

К-(+)-виниловый эфир кетопрофена

Было установлено, что в системе, содержащей 30% ацетона, образуется кетопрофен с оптической чистотой 75% ее.

3 Идентификация перспективных микроорганизмов

С целью идентификации полученных в результате скрининга наиболее активных и селективных микроорганизмов были изучены их основные морфологические, физиолого-биохимические и хемо-таксономические свойства. На основании полученных результатов культура 77-32 была отнесена к роду ЮюсЬсоссив, 77-9 - к МюгоЬасГегшт, а КЗ-2 - к ВасШиБ.

Испытания культур микрорганизмов на патогенность, выполненные в Институте экологии труда и гигиены человека (г. Уфа), показали, что они не обладают патогенными для человека и животных свойствами. Данные микроорганизмы хранятся в музее кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.

4 Поиск методов увеличения активности, найденных биокатализаторов кинетического разделения рацемических хроманов и кетопрофена

Для интенсификации различных методов кинетического разделения были изучены способы увеличения активности найденных биокатализаторов, как на стадии наращивания биомассы, так и в процессе биокатализируемой трансформации.

С этой целью был осуществлен поиск источников углерода (субстратов-индукторов), позволяющих наиболее эффективно осуществлять синтез целевых ферментов микроорганизмами, а также исследовано действие различных органических растворителей на активность биомассы.

4.1 Исследование липолитической и эстеразной активности клеток

При исследовании липолитической активности было обнаружено, что все три культуры микроорганизмов 77-32, 77-9, КЗ-2 осуществляют гидролиз оливкового масла. Это подтверждает предположение о возможном участии клеточных липаз в трансформациях хроманов и кетопрофена исследуемыми микроорганизмами (таблица 1).

Таблица 1- Липолитическая и эстеразная активность биокатализаторов на основе культур микроорганизмов 77-32, 77-9 и КЗ-2

Активность Субстрат трансформации Культуры микроорганизмов

77-32 77-9 КЗ-2

Липолитическая активность1, мкмоль/мгч Оливковое масло 188 42 270

Эстеразная активность2, мг/лч Этилацетат 700 458 540

Примечания 1 0,2 М фосфатный буфер (рН 8,0); 1 мл смеси оливкового масла с 1% раствором поливинилового спирта, при температуре 37 °С; 2 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0); этилацетат - 2 г/л; скорости перемешивания -180 об./мин и температуре 30 °С

Было обнаружено, что культуры 77-32 и КЗ-2 проявляют высокую липолитическую активность по сравнению с микроорганизмом 77-9. В то же время

клетки микроорганизма 77-9 проявили высокую эстервзную активность, сопоставимую с активностью клеток 77-32 и КЗ-2, обусловленной, скорее всего, работой липаз этих микроорганизмов.

Данный факт указывает на то, что за трансформацию сложных эфиров у микроорганизма 77-9 может отвечать клеточная эстерата.

При исследовании синтеза гидролитических ферментов микроорганизмами было обнаружено, что гидролазная активность клеток увеличивается параллельно приросту биомассы и д ости гае! максимума к началу стационарной фазы роста,

Культура 77-32 проявляла наибольшую липолитическую активность в возрасте трое - четверо суток. В случае культуры КЗ-2 наибольший уровень л и политической активности наблюдался у суточной биомассы. Наибольшая эстерашая активность клеток микроорганизмов 77-9 была достигнута у 2-суточной культуры.

Учитывая, что синтез ряда липаз и эсгераз микроорганизмов, как известно, может быть индуцирован в процессе роста субстратами этих ферментов (триацилглицеридами, твилом 80, оливковым маслом И др.), а также глицерином и изонропашлом, для повышения эффективности разрабатываемых биокатализаторов было исследовано влияние этих веществ на их гндродазную активность.

Установлено, что уровень гидролазной активности культур микроорганизмов существенно увеличивается при внесении в ростовую среду некоторых указанных соединений (рисунок 5.6).

При исследовании гидролиза оливкового масла суточной биомассой клеток КЗ-2 было выявлено увеличение липолитической активности биомассы, выращенной на среде с глицерином (1 %), в 2,4 раза по сравнению с контролем (рисунок 5).

В без добавок Штвин 80 П наело □ ыаиерви Ииюп рои» аол

Рисунок 5 - Влияние различных добавок к ростовой среде на ли политическую активность клеток

микроорганизмов 77-32 и КЗ-2 и эстераэную активность культуры 77-9

Рисунок 6 - Зависимость ли политической активности клеток микроорганизма 77-9 о Г возраста биомассы на среде без добавок и среде с оливковым маслом

Значительный стимулирующий эффект глицерина (более чем в 2 раза) был обнаружен также при исследовании липодитическоЙ активности трехсуточной биомассы клеток микроорганизма 77-32 (рисунок 5). Напротив, при исследовании гидролиза этилацетата, было отмечено, что эстеразная активность микроорганизма

з»

Ё Ж>

0 Е

£ 2Ы

5; "

3 £

5 | ш ¥ £ | 1 100

1 ?о

4 о

0 30 40 60 (

Возраст биомассы, ч о срел с маслом о сред» (5е1 добавок

77-9 не увеличивается при выращивании культуры на среде с глицерином (рисунок 5).

В случае культуры 77-9 при тестировании двухсуточной биомассы было обнаружено некоторое увеличение эстеразной активности на среде с оливковым маслом (рисунок 6). При исследовании липолитической активности биомассы клеток микроорганизма 77-9, полученной на среде с этой добавкой, также обнаружено повышение её активности у суточной биомассы.

При исследовании динамики изменения липолитической активности культур микроорганизмов 77-32 и КЗ-2 во времени на средах с глицерином было установлено, что наибольшая активность, как и на среде без добавок, проявляется у суточной биомассы клеток КЗ-2 и трехсуточной биомассы у культуры 77-32.

При исследовании целевых трансформаций хроманилэтанола, хроманилэтилацетата, кетопрофена с помощью биокатализаторов, полученных на основе биомассы исследуемых микроорганизмов с максимальной липолитической активностью, было обнаружено, что скорость реакции возрастает в 1,3 и 1,7 раза в трансформациях, катализируемых культурами микроорганизмов 77-32 и КЗ-2 (таблица 2), соответственно.

Таблица 2 - Относительная активность биокатализаторов, полученных на средах с добавками глицерина и оливкового масла в различных реакциях

Трансформация Культуры микроорган измов Добавка к ростовой среде Возраст биомассы Относительная активность*

Переэтерификация кетопрофена КЗ-2 Глицерин 1 сутки 1,7

Гидролиз хроманилэтилацетата 77-32 Глицерин 3 суток 1,3

Ацилирование хроманилэтанола 77-9 Оливковое масло 1 сутки 1,0

*Примечапие - рассчитана по отношению к контролю (биомасса, выращенная на среде без добавок, время трансформации двое суток)

В то же время в случае ацилировании хроманилэтанола микроорганизмом 77-9 скорость реакции оставалась на прежнем уровне (как на среде без добавок) (таблица 2).

4.2 Исследование влияния способа обработки биомассы на гидролазную активность клеточных катализаторов

В настоящем исследовании в процессах трансформации соединений 1, 2 и 4 использовалась биомасса микроорганизмов, предварительно отмытая от ростовой среды фосфатным буфером и затем обезвоженная ацетоном.

Обезвоживание клеток ацетоном было необходимо для трансформации исследуемых субстратов в органических растворителях. Однако известно, что обработка органическими растворителями препаратов липаз или клеток микроорганизмов может существенно ускорять катализируемые ими реакции не только в безводных растворителях, но и в водной среде.

С целью увеличения активности' биокатализаторов была осуществлена их обработка другими органическими растворителями, способными модифицировать

клеточные мембраны (увеличивать их проницаемость) или активирован, ли политические ферменты вследствие изменения липофильно-гидрофильного баланса внутримолекулярных взаимодействий, формирующих конформацию и связанную с ней активность фермента. В качестве растворителей наряду с анстоном использовали изопропанол, толуол и хлороформ.

В результате исследования было установлено, что обработка ацетоном была оптимальным вариантом для клеток микроорганизмов 77-9 и КЗ-2 (рисуггок 7).

1 2 3 4 5 6

1 - ацегон;

2 - изопропанол;

3 - ацетон-толуол;

4 - ацетон-хлороформ;

5 - изопропанол - хлороформ;

6 - изопропанол -толуол

а - гидролиз хром а пил этил ацетата в присутствии биокатализа гора на основе культуры микроорганизма рода Rhodococcus (77-32);

б - ацилирование хромание этанола в присутствий биокатализатора на основе культуры микроорганизма рода Microbacterium (77-9);

в - переэтерифншш кетоирофена а присутствии бшжвтализатора на основе культуры микроорганизма рода Bacillus (КЗ-2)

Рисунок 7 - Влияние природы растворителя, используемого при предобработке биомассы микроорганизмов, па их шдролазную активность

В случае культуры микроорганизма 77-32 был найден более эффективный способ увеличения гидролазной активности биомассы. Установлено, что дополнительная обработка клеток толуолом после их обезвоживания ацетоном позволяет увеличить скорость гидролиза хроманилэтил ацетата еще в 2 раза.

Таким образом, нами были подобраны условия увеличивающие активность биокатализаторов путем внесения ростовой добавки и обработки биомассы органическими растворителями на основе культур микроорганизмов: Rhodococcus (77-32), осуществляющий гидролиз хроманилэтилаиетата и Bacillus (КЗ-2), осуществляющий переэтерификацию кетопрофена. В случае би о катали затор а на основе культуры микроорганизма Microbacterium (77-9), осуществляющего ацилирование хроманилзтанола, активность оставалась па прежнем уровне.

Использование биокатализатора рода Rhodococcus (77-32), полученного в оптимизированных условиях, позволило увеличить конверсию R,S-хроманилэтилацетата до 48 % за трое суток, однако, при этом оптическая чистота образующегося S-хроманилэтанола оказалась ниже (66 % ее). В случае биокатализатора рода Bacillus (КЗ-2) оптическая чистота образующегося S-кетопрофена оставалась на прежнем уровне (75 % ее).

5 Разработка методов получения 8-(-)-хроманилэтанола и S-(+)-кетопрофена

5.1 Энантиоселективный гидролиз рацемического хроманилэтилацетата с помощью биокатализатора на основе микроорганизма рода Rhodococcus (77-32)

В результате проведенных исследований разработан метод получения 8-(-)-хроманилэтанола путем энантиоселективного гидролиза рацемического хроманилэтилацетата с помощью катализатора на основе микроорганизма рода Rhodococcus (77-32) и последующего щелочного гидролиза остаточного S- эфира, который позволяет получать целевой продукт практически со 100 %-ным выходом (от исходного субстрата), вследствие протекания катализируемой инверсии R-хроманилэтанола в S-энантиомер в условиях биотрансформации.

Время биотрансформации при соотношении субстрат - биокатализатор 3:20 (вес.) составляет 96 ч.

Показана возможность многократного использования биокатализатора, по крайней мере, в течение 5 циклов:

он +

ЛЗ-хроманилзтилацетат

К-(+)-хроманилэтанол 77-32

-•"Ч^ОАс

8-(+)-хроманилэтилацетат 99% ее

NaOH

8-{-)-хроманилэтанол 99% ее

Предложена принципиальная технологическая схема получения Б-хроманилэтанола (рисунок 8).

Процесс состоит из трех основных стадий: приготовление биокатализатора, био- и химические трансформации хроманилэтилацетата в 8-(-)-хроманилэтанол и выделение готового продукта.

Трансформацию осуществляют в реакторе 1, куда подается растворенный в ацетоне субстрат, фосфатный буфер и вводится биокатализатор. Реакция проводится при 30-32 °С и постоянном перемешивании в течение 96 ч. В центрифуге 2 происходит осветление реакционной смеси, которая затем перекачивается в экстрактор 3, куда подается экстрагент - хлороформ. После экстракции и разделения

органической и водной фаз органический слой осушается сульфатом магния в отстойнике 4 и через фильтр 5 подается в роторно-пленочный испаритель 6. Разделение спиртовой и эфирной фракций осуществляется методом ВЭЖХ (элюэнт гексан:этилацетат) 7. Фракции, содержащие спирт или эфир, упариваются под вакуумом в аппаратах 8 и 9. Затем эфир подвергается щелочному гидролизу в емкости 10.

1 - реактор; 2-центрифуга; 4,10- емкости; 3-экстрактор, 5- фильтр, 6,8,9 - вакуумный испаритель; 7 - колонка ВЭЖХ

Рисунок 8 - Принципиальная технологическая схема получения 8-(-)-хроманилэтанола

Обнаруженная в ходе кинетического разделения рацемического хроманилэтилацетата инверсия 11-(+)-хроманилэтанола в 8-(-)-энантиомер в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма рода Rhodococcus (77-32) открывает новые пути к перспективной технологии получения S-(-)-энантиомера непосредственно из рацемического хроманилэтанола. При этом технологическая схема процесса существенно упрощается и включает биореактор, экстрактор и испаритель.

5.2 Двухступенчатая переэтерификация кетопрофена в присутствии биокатализатора на основе микроорганизма рода Bacillus (КЗ-2)

Известно, что при этерификации кетопрофена с помощью ферментного препарата Novozym 435 (Candida antarctica) удается получить остаточный S-кетопрофен с энантиомерным избытком 77%, при двухступенчатой переэтерификации оптическая чистота S-кетопрофена достигает 96 % ее.

Энантиоселективная переэтерификация рацемического кетопрофена с винилацетатом в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма рода Bacillus (КЗ-2) позволяет получить остаточный S-кетопрофен с 75% ее. Таким образом, разработанный биокатализатор на основе культуры микроорганизма рода

Bacillus (КЗ-2) не уступает по эффективности известному ферментному препарату Novozym 435 (Candida antarctica), позволяющему получать при двухступенчатой переэтерификации S-кетопрофен высокой оптической чистоты.

теоретически 97 % ее

Рисунок 9 - Принципиальная технологическая схема двухступенчатой переэтерификации кетопрофена в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма рода Bacillus (КЗ-2)

6 Увеличение активности биокатализаторов, используемых в процессах кинетического разделения вторичных спиртов и их эфиров

Важнейшими синтонами при производстве лекарственных препаратов и биологических средств защиты растений являются оптически чистые энантиомеры спиртов, оксикислот и сложных эфиров. Перспективным методом получения этих соединений является кинетическое разделение рацемических смесей с помощью гидролаз микроорганизмов (эстераз и липаз), отличающихся высокой селективностью, широкой субстратной специфичностью, активностью, стабильностью, способностью работать как в воде, так и в органических растворителях.

Положительные результаты по увеличению гидролазной активности биокатализаторов кинетического разделения рацемических хроманилэтанола, хроманилэтилацетата и кетопрофена путем обработки биомассы различными растворителями показывают, что эта методология может оказаться перспективной и в отношении других энантиоселективных биокатализаторов.

С целью увеличения ферментативной активности и стабильности, ранее разработанных энантиселективных клеточных биокатализаторов на основе обработанных ацетоном биомасс культур микроорганизмов родов Rhodococcus (785), Bacillus (77-1) и Bacillus (79-54) - продуцентов энантиоселекгавных внутриклеточных гидролаз сложных эфиров (липаз, эстераз) - осуществлен поиск способов их обработки различными органическими растворителями.

В результате исследования каталитической активности клеток Rhodococcus (78-5) в процессе энантиоселективного гидролиза рацемического этил-3-оксибутирата (ЭОБ) было обнаружено, что наиболее эффективной для обработки биомассы является смесь ацетон-толуол ^(1:1), позволяющая увеличить её активность в 4,2 раза, что превышает в 1,8 раза активность биомассы, обработанной одним ацетоном:

СНз

(R,S)-30B

СНз

(RH-УЭОБ

(R)-{-)-30E (SK+УЗ-ошшасляная кислота

В случае клеток микроорганизма рода Bacillus (79-54) установлено, что для стереоселективного гидролиза рацемической смеси втор-бутилацетата наиболее эффективной является предварительная обработка биомассы смесью растворителей изопропанол-толуол (1:1), увеличивающая активность нативного катализатора в 4,5 раза. В случае культуры Bacillus (77-1) наибольший эффект роста активности (в 1,7 раза) достигается при обработке смесью ацетона и толуола (1:1). При энантиоселекгивном ацилировании октанола-2 обработка биомассы микроорганизма Bacillus (77-1) смесью изопропанол-толуол также позволила увеличить активность биокатализатора в 1,5 раза:

Показано, что предложенный способ интенсификации процесса гидролиза при кинетическом разделении рацемических смесей вторичных спиртов с помощью культур микроорганизмов родов Bacillus (77-1) и Bacillus (79-54), этил-3-оксибутирата с помощью клеток рода Rhodococcus (78-5) не снижает энантиоселективных свойств биокатализаторов и позволяет получить S-(+)-emop-бутанол, П-(-)-ето/>-бутилацетат, К-(-)-этил-3-оксибутират и 8-(+)-оксибутират с оптической чистотой 96 - 98 % ее. При этом также сохраняется возможность многократного использования биокатализаторов (по крайней мере, в течение трех циклов).

6.1 Разработка однореакторного хемо-биокаталитпческого синтеза оптически активных вторичных спиртов с помощью клеточных биокатализаторов

С целью упрощения технологии получения индивидуальных энантиомеров спиртов или эфиров высокой оптической чистоты была изучена возможность совмещения химического синтеза вторичного рацемического спирта из прохирального предшественника и его кинетического разделения в процессах энантиоселективного ацилирования винилацетатом в присутствии биокатализаторов на основе клеток рода Bacillus (77-1).

Рацемический октанол-2 был получен восстановлением октанона-2 боргидридом натрия в присутствии мелкодисперсного алюминия в гексане.

Для энантиоселективного ацетилирования рацемического октанола-2 использовались высокоселекгивные цельноклеточные биокатализаторы на основе культуры микроорганизма рода Bacillus (77-1), проявивших высокую активность в процессах ацетилирования ряда первичных и вторичных спиртов винилацетатом в гексане.

Показано, что предложенный однореакторный способ восстановления октанона-2 боргидридом натрия до рацемического октанола-2 и его кинетическое разделение с помощью клеток Bacillus (77-1) в гексане позволяет получить (S)-(+)-втор-октанол и (К)-(-)-втор-октилацетат с оптической чистотой 96 - 98 % ее.

(Я)-(-)-Втор-бутилацетат (5)-(+)-Втор-бутанол

выводы

1 В результате скрининга выделены и идентифицированы микроорганизмы Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (КЗ-2), обладающие высокой липолитической и эстеразной активностью.

2 На основе культур микроорганизмов созданы энантиоселективные биокатализаторы родов Rhodococcus (77-32) для энантиоселективного гидролиза эфиров: хроманилэтилацетата и бутилового эфира кетопрофена, Microbacterium (779) для парциального ацилирования R,S-хромапилэтанола и Bacillus (КЗ-2) для переэтерификации К.Б-кетопрофена. Определены условия роста биомассы и трансформации на активность биокатализаторов. Показана возможность многократного применения созданных биокатализаторов в течение длительного времени,

3 Разработаны методы кинетического разделения рацемического хроманилэтанола путем его парциального ацилирования винилацетатом в присутствии биокатализаторов на основе клеток микроорганизма Microbacterium (77-9) и энантиоселективного гидролиза рацемического хроманилэтилацетата на основе клеток микроорганизма Rhodococcus (77-32), позволяющие получать (S)-(-)-хроманилэтанол высокой оптической чистоты - 76 и 99 % ее соответственно.

4 Разработан метод кинетического разделения рацемического бутилового эфира 2-(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты путем энантиоселективного гидролиза с помощью катализаторов на основе культур микроорганизмов рода Bacillus (КЗ-2), позволяющих получать К-(-)-кетопрофен высокой оптической чистоты (78% ее).

5 Разработан метод кинетического разделения рацемической 2-(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты путем переэтерификации с винилацетатом в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма Bacillus (КЗ-2), позволяющий получать кетопрофен высокой оптической чистоты.

6 Предложен метод увеличения активности энантиоселективных биокатализаторов парциального ацилирования вторичных спиртов и гидролиза их эфиров, полученных на основе культур микроорганизмов Rhodococcus (78-5), Bacillus (77-1) и Bacillus (79-54), в 1,1-4,5 раза путем обработки их органическими растворителями без снижения их энантиоселективности.

7 Доказана возможность осуществления однореакторного хемо-биокаталитического синтеза оптически активных вторичных спиртов из кетонов (на примере окганола-2) с использованием биокатализатора на основе клеток микроорганизма Bacillus (77-1), катализирующего энантиоселективное ацилирование рацемического октанола-2.

8 Научно обоснованы принципиальные технологические схемы получения оптически активных синтонов предшественников витамина Е и нестероидных противовоспалительных препаратов: (8)-(-)-хроманилэтанола и (8)-(+)-кетопрофена.

Содержание работы опубликовано в 9 научных трудах, из которых № 1-4 включены в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, выпускаемых в Российской Федерации в соответствии с требованиями ВАК Минобразования и пауки РФ

1 Хабибуллина И.И., Петухова Н.И., Одиноков В.Н. и др. Скрининг микроорганизмов для энантиоселективного ацетилирования 6-бензилокси-2(3'-гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана - хирона для витамина Е //Башкирский химический журнал -2004,- Том 11, №1.- С.51.

2 Хабибуллина И.И., Петухова Н.И., Спивак А. Ю. и др. Создание биокатализаторов для энантиоселективного ацилирования хроманилэтанола // Башкирский химический журнал- 2005. -Том 12, №1, С.5-6.

3 Хабибуллина И.И., Лукьянова A.B., Петухова Н.И. и др. Поиск методов повышения активности биокатализаторов кинетического разделения рацемических смесей эфиров вторичных спиртов // Башкирский химический журнал - 2006.- Том 13, №1.- С. 92-95.

4 Вершинин С.С., Коныпин П.С., Хабибуллина И.И. и др. Синтез кетопрофена // Башкирский химический журнал- 2006,- Том 13, №1.- С. 74-78.

5 Башарова Р.В., Хабибуллина И.И, Петухова Н.И. и др. С1фининг микроорганизмов для ацетилирования 6 -бензилокси- 2(3' - гидроксиэтил) - 2,5,7,8 - тетрамегилхромана // Материалы 55-й научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых,- Уфа: УГНТУ, 2004,- С.390.

6 Абдульманов Д.А.,. Хабибуллина И.И, Петухова Н.И. и др. Скрининг внутриклеточных ацетилэстераз микроорганизмов-биокатализаторов процесса ацилирования 6 -бензилокси- 2(3' - гидроксиэтил) - 2,5,7,8 - тетраметилхромана // Материалы 56-й научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых,- Уфа: УГНТУ, 2005,- С.179.

7 Хабибуллина И.И., Сучкова Е.В., Пехухова Н.И. и др. Интенсификация биокаталитических методов получения оптически активных синтонов а-токоферола // Химия и медицина: материалы II Всерос. науч. конф,- Уфа, 2005.- С.166-167.

8 Хабибуллина И.И., Исмагилова Л.М., Петухова Н.И. и др. Интенсификация процессов кинетического разделения рацемических смесей сложных эфиров оксикислот с помощью клеток Rhodococcus sp. 78-5 II Успехи интеграции академической и вузовской науки по химическим специальностям: материалы респ. науч.-пракг. конф,- Уфа - 2006.- С. 145-149.

9 Хабибуллина И.И., Исмагилова Л.М., Вершинин С.С. и др. Скрининг липолитических микроорганизмов для кинетического разделения кетопрофена // Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии: материалы IV Всерос. науч. internet-конф.- Уфа: Реактив, 2006.-С. 104-106.

Подписано в печать 22 ОТО?. Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Тайме». Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1. Тираж 90. Заказ <26.

Типография Уфимского государственного нефтяного технического университета.

Адрес типографии: 450062, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. Космонавтов,!.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Хабибуллина, Ирина Ифировна

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Введение. Ферменты и клетки - биокатализаторы реакций

1.2 Липолитические ферменты

1.2.1 Биосинтез липаз

1.2.2 Скрининг микроорганизмов-продуцентов липаз

1.3 Структурно - функциональные взаимодействия, возникающие при катализе липазами

1.4 Влияние органических растворителей на активность ферментов

1.4.1 Активность ферментов в присутствии органических растворителей

1.4.2 Суспензия биокатализаторов в неполярных и полярных органических растворителях

1.4.3 Модификация ферментов

1.4.3.1 Физическая модификация

1.4.3.2 Химическая модификация

1.4.3.3 Модификация с помощью методов генной инженерии

1.4.3.4 Специфические методы - внешняя модификация

1.4.3.4.1 «Твердые ферменты»

1.4.3.4.2 Методы увеличения энантиоселективности липаз

1.5 Ферментативные реакции в органических растворителях

1.6 Методы получения оптически активных веществ

1.6.1 Стереоселективный синтез на основе прохиральных предшественников и мезо-соединений

1.6.2 Дерацемизация рацемических смесей с помощью ферментов

1.6.3 Физико-химические методы разделения

1.7 Практическое применение липаз в разделении рацемических смесей

1.7.1 Кинетическое разделение рацемических спиртов с помощью липаз

1.7.2 Кинетическое разделение рацемических спиртов с помощью цельноклеточных биокатализаторов

1.8 Получение оптически активных хроманов

1.9 Получение оптически активного 8-(+)-кетопрофена

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка энантиоселективных биокатализаторов кинетического разделения рацемических спиртов, кислот и эфиров"

Актуальность работы. Важнейшими синтонами при производстве лекарственных препаратов и биологических средств защиты растений являются оптически чистые энантиомеры спиртов, кислот и сложных эфиров. Наиболее эффективными способами получения таких соединений является кинетическое разделение их рацемических смесей парциальным ацилированием или энантио-селективным гидролизом с помощью гидролаз микроорганизмов (эстераз и липаз), отличающихся высокой селективностью, широкой субстратной специфичностью, активностью, стабильностью, способностью работать как в воде, так и в органических растворителях.

Принимая во внимание успехи, достигнутые в создании со-функциональной боковой изопреноидной цепи а-токоферола с 2-мя хиральны-ми центрами R-конфигурации на основе хлорофилла, разработка биокаталитического метода получения S-хроманилэтанола - ключевого синтона полного аналога природного а-токоферола - является важной задачей на пути создания альтернативной технологии получения витамина Е на основе доступного растительного и нефтехимического сырья.

Использование методов энантиоселективной биотрансформации с применением клеток микроорганизмов также является перспективным подходом к синтезу оптически активного S-кетопрофена - ценного предшественника в синтезе нестероидных противовоспалительных препаратов.

В связи с этим создание доступных, технологичных и энантиоселективных катализаторов для синтеза оптически активных S-хроманилэтанола (ключевого синтона в синтезе витамина Е) и S-кетопрофена (синтона нестероидных противовоспалительных препаратов) является актуальной задачей.

Цель работы. Разработка энантиоселективных биокатализаторов для получения оптически активных 8-(-)-6-бензилокси-2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана и 8-(+)-2(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты на основе микроорганизмов, обладающих гидролазной активностью. Поиск методов интенсификации процессов кинетического разделения оптически активных спиртов, кислот и эфиров.

В связи с этим задачами работы являлись:

• осуществление скрининга микроорганизмов, обладающих липолитиче-ской и эстеразной активностью;

• исследование свойств перспективных штаммов с целью их идентификации;

• разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального разделения спиртов, кислот и эфиров в процессах этерификации и гидролиза на основе клеток микроорганизмов с целью получения оптически активных S-хроманилэтанола, энантиомеров других спиртов и S-кетопрофена;

• исследование условий эффективной работы и стабильности биокатализаторов;

• исследование подходов к интенсификации процессов кинетического разделения спиртов и эфиров.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракт № 02.438.11.7003), региональной программой РФФИ "Агидель" (2005г.), планами научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой "Развитие научного потенциала высшей школы" (проект «Научно-образовательная деятельность музея, созданного на базе кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета» 2005-2006 гг.).

Научная новизна. Выделены и идентифицированы новые микроорганизмы родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (КЗ-2), на основе которых созданы энантиоселективные биокатализаторы, проявляющие каталитическую активность при парциальном ацилировании Ы^-хроманилэтанола, переэтерификации Я^-кетопрофена и энантиоселектив-ном гидролизе их рацемических эфиров.

Научно обоснованы методы синтеза оптически активных 8-(-)-6-бензи-локси-2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана и 8-(+)-2-(3-бензоилфе-нил)пропионовой кислоты с использованием биокатализаторов на основе микроорганизмов родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (КЗ-2). Обнаружена инверсия Я-(+)-хроманилэтанола в 8-(-)-хроманилэтанол в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма, относящегося к роду Rhodococcus (77-32). Найдены условия (температура, рН, растворитель), в которых биокатализаторы проявляют наивысшую активность. Разработаны методы увеличения активности биокатализаторов путем их обработки органическими растворителями. Показано, что в условиях кинетического разделения биокатализаторы проявляют высокую стабильность. Доказана возможность многократного использования разработанных биокатализаторов.

Практическая значимость. На основе найденных культур микроорганизмов родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (КЗ-2) созданы энантиоселективные биокатализаторы и эффективные методы получения 8-(-)-хроманилэтанола - ключевого синтона витамина Е и 8-(+)-кетопрофена -предшественника нестероидных противовоспалительных препаратов высокой оптической чистоты.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на 55,56 и 57-й научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (Уфа, 2004-2006), V Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005), IV Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа,

2005), научно-практической республиканской конференции «Успехи интеграции академической и вузовской науки по химическим специальностям» (Уфа,

2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 статьи.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Хабибуллина, Ирина Ифировна

114 ВЫВОДЫ

2 На основе культур микроорганизмов созданы энантиоселективные биокатализаторы родов Rhodococcus (77-32) для энантиоселективного гидролиза эфиров: хроманилэтилацетата и бутилового эфира кетопрофена, Microbacterium (77-9) для парциального ацилирования Я,8-хроманилэтанола и Bacillus (КЗ-2) для переэтерификации Я^-кетопрофена. Определены условия роста биомассы и трансформации на активность биокатализаторов. Показана возможность многократного применения созданных биокатализаторов в течение длительного времени.

3 Разработаны методы кинетического разделения рацемического хроманилэтанола путем его парциального ацилирования винилацетатом в присутствии биокатализаторов на основе клеток микроорганизма Microbacterium (77-9) и энантиоселективного гидролиза рацемического хроманилэтилацетата на основе клеток микроорганизма Rhodococcus (77-32), позволяющие получать 8-(-)-хроманилэтанол высокой оптической чистоты - 76 и 99% ее соответственно.

4 Разработан метод кинетического разделения рацемического бутилового эфира 2-(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты путем энантиоселективного гидролиза с помощью катализаторов на основе культур микроорганизмов рода Bacillus (КЗ-2), позволяющих получать Я-(-)-кетопрофен высокой оптической чистоты (78% ее).

7 Доказана возможность осуществления однореакторного хемо-биокаталитического синтеза оптически активных вторичных спиртов из кето-нов (на примере октанола-2) с использованием биокатализатора на основе клеток микроорганизма Bacillus (77-1), катализирующего энантиоселективное ацилирование рацемического октанола-2.

8 Научно обоснованы принципиальные технологические схемы получения оптически активных синтонов предшественников витамина Е и нестероидных противовоспалительных препаратов: 8-(-)-хроманилэтанола и 8-(+)-кетопрофена.

1.10 Заключение

Таким образом, приведенный литературный анализ показывает, что наиболее эффективным при создании оптически активных синтонов является энан-тиоселективный биокатализ. На сегодняшний день не существует универсальных ферментных препаратов и цельноклеточных биокатализаторов, способных эффективно разделять рацематы. В связи с этим поиск новых эффективных биокатализаторов на основе целых клеток микроорганизмов, содержащих сте-реоспецифичные гидролазы для получения оптически активных соединений, является важной задачей.

Поэтому особенно актуальной является задача поиска новых стабильных биокатализаторов кинетического разделения рацемических смесей спиртов, кислот и их эфиров, обладающих широкой субстратной специфичностью и осуществляющих биотрансформацию субстрата с высоким выходом и оптической чистотой.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

Объектом исследования служили штаммы микроорганизмов, выделенных из почвенных образцов нефтеперерабатывающих предприятий, лесопарковой зоны г. Уфы, а также образцов, отобранных в сельских районах и лесных массивах республики Башкортостан, содержащихся в музее кафедры биохимии и технологии микробиологических производств.

2.2 Материалы и реагенты

Материалами исследования были чистые реактивы, синтезированные в химических лабораториях Уфимского государственного нефтяного технического университета и институте нефтехимии и катализа Российской Академии наук (г. Уфа).

Рацемические втор-бутилацетат, октанол-2, этил-3-оксибутират, 2-(3-бензоилфенил)пропионовая кислота, бутиловый эфир

2-(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты) были синтезированы в лаборатории биоорганического синтеза кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.

Рацемические смеси 6-бензилокси-2(2-ацетоксиэтил)-2,5,7,8-тетраме-тилхромана и 6-бензилокси-2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана были синтезированы в лаборатории ИНК РАН (г. Уфа) и любезно предоставлены д-ром хим. наук, профессором Одиноковым В.Н. и канд. хим. наук Спивак A.IO.

Материалами исследования также были чистые реактивы, произведенные шосткинским заводом химреактивов: этил ацетат, бутилацетат, толуол, диэти-ловый эфир, изопропиловый спирт, уксусная кислота, олеиновая кислота. Ви-нилацетат приобретен в компании «Мерк» (Германия). Гексан, ацетон были приобретены в «Компонент-реактив» (г. Москва), ацетонитрил, изооктан - в «Криохром» (г. Санкт-Петербург).

Физические свойства исследуемых соединений:

Октанол-2: Формула С8Н180; М=130,228; ТКИП=177,9°С; плотность при 20°С р=0,821±0,06 г/см3; [a]D -15,89. Спектр ЯМР 'Н в (CDC13) 5, м.д.: 0,88 t (ЗН); 1,19 d (ЗН); 1,30-1,44 m (ЮН); 1,61 s (1Н); 3,80 m (1Н).

Втор-бутилацетат. СбИ^СЬ; М=116,16; плотность при 20°С р=0,872 г/см3; ТКИП=111°С; показатель преломления 1,3890. Спектр ЯМР 13С в (CDCI3) 8, м.д.: 9,67 (СН3); 19,1(СН3); 21,19 (СН3); 28,7 (СН2); 71,8 (СН); 170,1 (С).

Втор-бутанол. С4Н10О, М=74,12; ТКИП=100°С, Тпл=-114,7 °С, плотность при 20 °С р=0,808 г/см3, показатель преломления 1,3949 при 25°С. Спектр ЯМР ,3С в (CDCI3) 5, м.д.: 10 (СН3); 22,7 (СН3); 32,1 (СН2); 68,85 (СН).

Этил-З-оксибутират. М=132,1; массовая доля СбН^Оз не менее 98,5%; ТКИп=184°С; плотность при 20°С р=1,017 г/см3; показатель преломления 1,4195. Спектр ЯМР 13С в (CDCI3) (5, м.д.): 14,95 (СН3); 22,4 (СН3); 43,6 (СН2); 60,7 (СН2); 64,4 (СН); 172,4 (С).

З-Оксимаслянная кислота С6НюОз; М=130,15; плотность при 20°С р= 1,024-1,028 г/см3; показатель преломления 1,419-1,420. Спектр ЯМР 13С в (CDCI3) 5, м.д.: 22,9 (СН3); 43,72 (СН2); 64,22 (СН); 176,06 (С).

6 - бензилокси - 2(2 - гидроксиэтил) - 2,5,7,8 - тетраметилхроман (хроманилэтанол) С22Н2803; М=340,456; плотность при 20°С р=1,083±0,06 г/см3; ТКИП=485°С; показатель преломления 1,556±0,02. Спектр ЯМР !Н в (CDCI3) (5, м.д., J/Гц): 1,35 (с, 3 Н, 2-СН3); 1,78-2,50 (м, 4 Н, С (3)Н2 и С(1')Н2); 2,14 (с, 4 Н, Аг-СНз); 2,23 (с, 3 Н, Аг-СЩ; 2,27 (с, 3 Н, Аг-СНз); 2,67 (т, 2 Н, С(4)Н2, J=7,l); 3,86-4,02 (м, 2 Н, С(2')Н2); 4,74 (с, 2 Н, РЬСШО); 7,35-7,50 (м, 5 Н, Ar-Н). Спектр ЯМР ,3С в (CDC13) (5, м.д.): 11,89 (Аг-СН3); 11,95 (Аг-СН3); 12,79 (Аг-СНз); 20,36(С(4)), 23,24 (2-СН3); 31,62 (С(3)); 41,91 (С(1')); 58,98 (С(2')); 74,63 (С(2')); 75,41 (PhCH20); 117,38 (С(8а)); 122,61 (С(8)); 126,18 (С(7)); 127,63 (С(2")/С(6")); 127,72 (С(4")); 128,09 (С(5)); 128,35 (С(3")/С(5")); 137,74 (С(1")); 147,10 (С(4а)); 148,52 (С(6)).

6 - бензилокси - 2(2 - ацетоксиэтил) - 2,5,7,8 - тетраме-тилхроман (хроманилэтилацетат) С24Н30О4; М=382,493. Спектр ЯМР !Н в (CDCI3) (5, м.д., J/Гц): 1,35 (с, 3 Н, 2-СН3); 1,85-1,95 (м, 4 Н, С (3)Н2 и С(1')Н2); 2,08 (с, 3 Н, СОСНз); 2,13 (с, 3 Н, Аг-СНз); 2,18 (с, 3 Н, Аг-СНз); 2,24 (с, 3 Н, Аг-СНз); 2,65 (т, 2 Н, С(4)Н2, ./=6,5); 4,32 (м, 2 Н, СШОАс); 4,75 (с, 2 Н, PhQLO); 7,40-7,55 (м, 5 Н, Аг-Н). Спектр ЯМР 13С в (CDC13) (8, м.д.): 11,90 (Аг-СНз); 12,01 (Аг-СНз); 12,88 (СОСНз); 12,90(Аг-СН3); 20,42 (С(4)); 24,81 (2-СН3); 31,95(С(3)); 52,34 (С(1')); 73,59 (СН2ОАс); 74,73 (С(2)); 117,02 (С(8а)); 123,12 (С(8)); 126,21 (С(7)); 127,69 (С(2")/С(6")); 127,81 (С(4")); 128,44 (С(5), (С(3")/С(5")); 146,90 (С(4а)); 148,77 (С(6)); 201,75 (СОСН3).

2-(3-бензоилфенил)пропионовая кислота) (кетопрофен) С16Н14О3; М=254,28; плотность при 20°С р= 1,198+0,06 г/см3; Ткип=431,3 °С; Тпл=75-78 °С; показатель преломления 1,591±0,02. Спектр ЯМР 'Н (CDC13)(5, м.д., У/Гц): 1.55 д (ЗН, СНз), 3,82 к (Н, СН), 7,46-7,84 м (9Н, С6Н5СОС6Н4).

Бутиловый эфир 2-(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты) С20Н22О4; М=326,28; ТКИП=75-78°С. Спектр ЯМР *Н (CDCI3) (5, м.д., J/Гц): 0,9 (т, ЗН, СНз), 1,5-1,65 (м, 4Н,(СН2)2СН3), 3,7 (м, Н, СНСН3), 4,1 (т, 2Н, ОСН2), 7,4-7,9 (м, 9Н, С6Н5СОС6Н4).

Виниловый эфир 2-(3-бензоилфе11ил)пропионовой кислоты) Спектр ЯМР 'н (CDCI3) 8, м.д.: 1,28 (g, ЗН, СН3), 3,7 (к, Н, СН), 4,2-4,3 (м, 2Н, СН=СН2), 5,12-5,35 (м, 2Н, СН=СН2), 6,9 (с, Н, СН=СН2), 7,4-7,8 (м, 9Н, С6Н5СОС6Н4).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Хабибуллина, Ирина Ифировна, Уфа

1. Гладилин А.К., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями // Биохимия 1998. - Т.63, Вып.З. - С. 408-421.

2. Tejo В. A., Salleh А. В., Pleiss J. Structure and dynamics of Candida rugosa lipase: The role of organic solvent // Journal of Molecular Model. 2004. - V. 10. - P. 358-366.

3. Серебряков Э.П. Стереодивергентный синтез хиральных низкомолекулярных биорегуляторов с применением доступных липаз // Известия Академии наук. Серия химическая. 2001. - №11. - С. 1896.

4. Горохова И.В., Иванов А.Е., Зайцев С.Ю., Зубов В.П. Изучение взаимодействия и активации липазы из Pseudomonas jluorescens в монослоях и преципитатах ПАВ // Известия Академии наук. Серия химическая. 2003. - № 4. - С. 961-969.

5. Reetz М.Т. Lipases as practical biocatalysts // Current Opinion in Chemical Biology. 2002.- V. 6. - P. 145-50.

6. Faber K. Biotransformations in Organic Chemistry. Springer, Berlin, 1997.-229c.

7. Santaniello E., Ferraboschi P., Grisenti P., Manzocchi A. The biocatalytic approach to the preparation of enantiomerically pure chiral building blocks // Chem. Rev. 1992. - V. 92, № 5. - P. 1071-1140.

8. Roberts S. M. Preparative biotransformations // Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions. 2001. - V. 1 - P. 1475.

9. Зорин B.B., Петухова Н.И. Регио- и стереоселективная биотрансформация органических соединений // Панорама современной химии России. Современный органический синтез: Сб. обз. статей.- М.: Химия, 2003. С.439-462.

10. Nardini М., Dijkstra B.W. а/р Hydrolase fold enzymes: the family keeps growing // Current Opinion in Chemical Biology. 1999. - V. 9. - P. 732-737.

11. Брокерхоф X., Дженсен, пер. с анг. Липолитические ферменты.М:- 1978.

12. Brune А.К, Gotz F Degradation of lipids by bacterial lipases. In: Winkelman G (ed) Microbial degradation of natural products. VCH: Weinhein, 1992. - P. 243-266.

13. Aires-Barros M.R., Taipa M.A., Cabral J.M.S. Isolation and purification of lipases. In: Wooley P, Petersen SB (eds) Lipases-their structure, biochemistry and application. Cambridge University Press: Cambridge, 1994. - P. 243-270.

14. Kim S.S., Kim E.K., Rhee J.S. Effects of growth rate on the production of Pseudomonas Jluorescens lipase during the fedbatch cultivation of Escherichia coli II Biotechnology Progress. 1996. - V. 12. - P. 718-722.

15. Lotti M., Monticelli S., Montesinos J.L. , Brocca S., Valero F., Lafuente J. Physiological control on the expression and secretion of Candida rugosa lipase // Chemistry and Physics of Lipids. 1998. - V. 93. - P. 143-148.

16. Ghosh P.K., Saxena R.K., Gupta R, Yadav R.P., Davidson W.S. Microbial lipases: production and applications // Science Progress. 1996. -V. 79.-P.119-157.

17. Rathi P., Saxena R.K., Gupta R. A novel alkaline lipase from Burkholderia cepacia for detergent formulation // Process Biochemistry. 2001. - V. 37. - P. 187192.

18. Gilbert E.J., Drozd J.W., Jones C.W. Physiological regulation and optimization of lipase activity in Pseudomonas aeruginosa EF2 // Journal of General Microbiology. -1991. V. 137 - P. 2215-2221.

19. Dharmsthiti S., Kuhasuntisuk B. (1998) Lipase from Pseudomonas aeruginosa LP602: biochemical properties and application for wastewater treatment // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology.-V. 21-P. 75-80.

20. Rashid N, Shimada Y, Ezaki S, Atomi H, Imanaka T Lowtemperature lipase from psychrotrophic Pseudomonas sp. Strain KB700A // Applied and Environment Microbiology. 2001. V. 67. - P. 4064-4069.

21. Dongzhi Wei, Li-ying Zhang, Qingxum Song Studies on a novel carbon source and cosolvent for lipase production by Candida rugosa И Applied and Environment Microbiology. 2004. - V. 31. - P. 133-136.

22. Ghosh P.K., Saxena R.K., Gupta R., Yadav R.P., Davidson W.S. Microbial lipases: production and applications // Science Progress. 1996.-V. 79.-P. 119-157.

23. Волкова И.М., Лебедева Ж.Д. Влияние липидного компонента среды на биосинтез липазы грибами // Микробиология 1979. - Т. 58, Вып. 4. - С. 653657.

24. Mahler GF, Kok RG, Cordenons A, Hellingwerf KJ, Nudel ВС Effects of carbon sources on extracellular lipase production and lipA transcription in Acinetobacter calcoaceticus I/ Applied and Environment Microbiology. -2000. -V. 24. P. 25-30.

25. Табак М.Я., Щелокова C.C. Влияние твинов на липазную активность // Микробиология. 1979. - Т. 58, Вып. 4. - С. 658-662.

26. Ogino H., Ishikawa H. Enzymes which are stable in the presence of organic solvents // Journal of Bioscience and Bioengineering.-2001.-V. 91,№ 3.-P.109-116.

27. Kanwar L., Gogoi B.K., Goswami P. Production of a Pseudomonas lipase in n-alkane substrate and its isolation using an improved ammonium sulfate precipitation technique // Bioresource Technology. 2002. - V. 84. - P. 207-211.

28. Liu I.L., Tsai S.W. Improvements in lipase production and recovery form Acinetobacter radioresistens in presence of polypropylene powders filled with carbon sources //Applied Biochemistry and Biotechnology. -2003 .-V. 104.-P.129-140.

29. Wu H.-Y., Xu J.-H., Shen D., Xin Q. Improved production of (S)-ketoprofen ester hydrolase by a mutant of Trichosporon brassicae CGMCC 0574 // Journal Ind Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 30. - P. 357-361.

30. Gupta R., Gupta N., Rathi P. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties // Applied and Environment Microbiology. -2004.-V. 64.-P 763-781.

31. Bradoo S., Saxena R.K., Gupta R. Two acidothermotolerant lipases from new variants of Bacillus sp. II World Journal Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 15. - P. 87-91.

32. Dharmsthiti S., Luchai S. Production, purification and characterization of thermophilic lipase from Bacillus sp. THL027. FEMS // Microbiol. Letters. 1999. -V. 179.-P. 241-246.

33. Sharma R., Soni S.K., Vohra R.M., Jolly R.S., Gupta L.K., Gupta J.K. Production of extracellular alkaline lipase from a Bacillus sp. RSJ1 and its application in ester hydrolysis // Ind J Microbiol 2002.- V. 42.- P.49-54.

34. Sugihara A., Tani Т., Tominaga Y. Purification and characterization of a novel thermostable lipase from Bacillus sp. // Journal of Biochemistry.- 1991.- V. 109.-P.211-216.

35. Dong H., Gao S., Han S., Cao S. Purification and characterization of a Pseudomonas sp. lipase and its properties in non-aqueous media // Appl Microbiol Biotechnol. 1999. - V. 30. - P. 251-256.

36. Reetz M.T., Jaeger K.-E. Overexpression, immobilization and biotechnological application of Pseudomonas lipases // Chem Phys Lipids.- 1998.- V. 93.- P.3-14.

37. Oh B.-C., Kim H.-K., Lee J.-K., Kang S.-C., Oh T.-K. Staphylococcus haemolyticus lipase: biochemical properties, substrate specificity and gene cloning // FEMS Microbiology Letters. 1999. - V. 179.- P. 385-392.

38. Schmidt-Dannert С., Luisa R. M., Schmid R.D. Two novel lipases from the thermophile Bacillus thermocatenulatus: Screening, purification, cloning, overexpression and properties // Methods Enzymol. 1997. - V. 284. - P. 194-219.

39. Schuepp C., Kermasha S., Michalski M.-C., Morin A. Production, partial purification and characterization of lipases from Pseudomonas fragi CRDA 037 // Process Biochemistry. 1997.- V. 32.- P. 225-232.

40. Sierra G. A simple method for the detection of lipolytic activity of microorganisms and some observations on the influence of the contact between cells and fatty substrates // Antonie van Leeuwenhoek 1957. - V.23.- P.15-22.

41. Yeoh H.H., Wong F.M., Lin G. Screening for fungal lipases using chromogenic lipid substrates // Mycologia. 1986. - V. 78. - P. 298-300.

42. Wang Y., Srivastava K.C., Shen G.J., Wang H.Y. Thermostable alkaline lipase from a newly isolated thermophilic Bacillus strain, A30-1 (ATCC 53841) // Journal of Ferment Bioengineering 1995. - V. 79. - P. 433-438.

43. Ahmad R., Yahya M., William A. Anderson, Murray Moo-Young Ester synthesis in lipase-catalyzed reactions // Enzyme and Microbial. Technology 1998. -V.23.-P. 438-450.

44. Leonard V., Lamare S., Legoy M.-D., Graber M. Enantioselective acylation of R-2-pentanol in a solid/gas reactor catalysed by lipase В from Candida antarctica II Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2004. - V. 32. - P. 53-59.

45. Jernigan R., Rughunathan G., Bahar I. Characterization of interactions and metal ion binding sites in proteins // Current Opinion in Chemical Biology. -1994.-V. 4.-P.256-263.

46. Шульц Г., Ширмер P. Принципы структурной организации белков. -М.:Мир, 1982.-354 с.

47. Wangikar P.P., Michels P.C., Clark D.C., Dordick j.S. Structure and Function of Subtilisin BPN' Solubilized in Organic Solvents" // Journal of the American Chemical Society 1997. - V. 119, № 1. - P. 70-76.

48. Hailing P.J. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media: theory, tests and recommendations for experimental design and analysis // Enzyme and Microbial. Technology 1994. - V. 16. - P. 178-206.

49. Cowan D.A. Thermophilic proteins: stability and function in aqueous and organic solvents // Comparative Biochemistry and Physiology A: Physiology. 1997. -V.1I8A.-P. 429-438.

50. Schulze В., Klibanov A.M. Inactivation and stabilization of subtilisins in neat organic solvent // Biotechnology and Bioengineering. 1991. - V. 38. - P. 1001-1006.

51. Gorman L.A.S., Dordick J.S. Organic solvents strip water off enzymes // Biotechnology and Bioengineering 1992. - V. 39. - P. 392-397.

52. Ghatorae A.S., Bell., Hailing P.J. Inactivation of enzymes by organic solvents: new technique with well-defined interfacial area // Biotechnology and Bioengineering. 1994. - V. 43. - P. 331-336.

53. Yamamoto Y., Kise H. Catalysis of enzyme aggregates in organic solvents: An attempt at evaluation of intrinsic activity of proteases in ethanol // Biotechnology Letters.- 1993. V. 15, № 6. - P. 647-652.

54. Klibanov A.M. Asymmetric transformations catalyzed by enzymes in organic solvents // Accoounts Chem. Res. 1990. - V. 23. - P. 114-120.

55. Gupra M.N. Enzyme function in organic solvents // European Journal of Biochemistry. 1992. - V. 203. - P. 25-32.

56. Dordick J.S. Designing enzymes for use in organic-solvents // Biochem. Prog. -1992.-V. 8.-P. 259-267.

57. Белова А.Б., Можаев B.B., Левашов A.B., Сергеева М.В., Мартинек К., Хлельницкий Ю.Л. Взаимосвязь физико-химических органических растворителей с их денатурирующей способностью по отношению к белкам // Биохимия. -1991.-V. 56.-Р. 1923-1940.

58. Leon R., Fernandes P., Pinheiro H.M., Carbal J.M.S. Whole-cell biocatalysis in organic media // Enzyme Microbial. Technology 1998. - V. 23. - P. 483-500.

59. Ceen E.G., Dunnill P., Herrmann J.P.R. Two-liquid phase reactor studies of 11-a-hydroxylation of progesterone by Aspergillus ochraceus II Biotechnology and Bioengineering. 1988. - V. 31. - P. 743-746.

60. Fitzpatrick P.A., Klibanov A.M. How can the solvent affect enzyme enantioselectivity? //Journal of the American Chemical Society. 1991. - V. 113. - P. 3166-3171.

61. Sakurai J. H., Margolin A.L, Rassel A.J., Klibanov A.M. Control of enzyme enantioselectivity by the reaction medium // Journal of the American Chemical Society. 1988. - V. 110. - P. 7236-7237.

62. Parida S., Dordick J.S. Substrate structure and solvent hydrophobicity control lipase catalysis and enantioselectivity in organic media // Journal of the American Chemical Society. -1991. V. 113. - P. 2253-2259.

63. Villeneuve P., Muderhwa J. M., Graille J., Michael J. Haas Customizing lipases for biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches Review // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2000. - V. 9. - P. 113-148.

64. Клесов А. А. Биотехнология. Ферментативный катализ. M.: Изд-во МГУ, 1984 - с.203-216.

65. Inada Y., Nishimura H., Takahashi K., Yoshimoto Т., Saha A.R., Saito Y. Ester synthesis catalyzed by polyethylene glycol-modified lipase in benzene // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1984. - V. 122. - P. 845-850.

66. Takahashi K., Ajima A., Yoshimoto Т., Inada Y. Polyethylene glycol-modified catalase unexpectedly high activity in benzene // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1984. - V. 125. - P. 761-766.

67. Y. Kimura, A. Tanaka, K. Sonomoto, T. Nihira, S. Fukui Application of immobilized lipase to hydrolysis of triacylglyceride // European Journal Appl. Microbiol. Biotechnol. 1983. - V. 17. - P. 107

68. Inada Y., Takahashi K., Yoshimoto Т., Ajima A., Matsushima A., Saito Y., Application of polyethylene glycol-modified enzymes in biotechnological processes: organic solvent-soluble enzymes // Trends Biotechonol. 1986. - V. 4. - P. 190-194.

69. Delgado C., Francis G.E., Fisher D. The uses and properties of PEG-linked proteins // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1992. - V. 9. P. 249-304.

70. DeSantis G., Jones J.B. Chemical modification of enzymes for enhanced functionality // Current Opinion Biotechnol. 1999. - V. 10. - P. 324-330.

71. Mingarro I, Gonzales-Navarro H, Braco L. Trapping of different lipase conformers in water restricted environments // Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 9935-9944.

72. Jernigan R., Raghunathan G., Bahar I. Characterization of interactions and metal ion binding sites in proteins // Current Opinion In Structural Biology. 1994. - V. 4, №2,-P. 256.

73. Dai L., Klibanov A.M. Striking activation of oxidative enzymes suspended in nonaqueous media//Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. - V. 96. - P. 9475-9478.

74. Dabulis K., Klibanov A.M. Dramatic enhancement of enzymatic activity in organic solvents by lyoprotectants // Biotechnology and Bioengineering. 1993. - V. 41.-P. 566-571.

75. Secundo F., Carrea G., Varinelli D., Soregaroli C. Activity of different Candida antarctica lipase В formulations in organic solvents // Biotechnology and Bioengineering. 2001. - V. 73. - P. 157-163.

76. Klibanov A.M. Why are enzymes less active in organic solvents than in water? // Trends. Biotechnol. 1997. - V. 15. - P. 97-101.

77. Lee S. H., Choi J.H., Park S.H., Choi J.-I., Lee S.Y. Enantioselective resolution of racemic compounds by cell surface displayed lipase // Enzyme and Microbial Technology. 2004. - V. 35. - P. 429-436.

78. Klibanov A.M. Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents // Trends. Biotechnol. Sci. 1989. - V. 14. - P. 141-144.

79. Zaks A., Klibanov A.M. Enzyme-catalyzed processes in organic solvents // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985. - V. 82. - P. 3192-3196.

80. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Мубаракова А.И. «Разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального ацилирования спиртов» по спциальности 03.00.23 «Биотехнология».- Уфа: УГНТУ. 2002.- 125 с.

81. Fontanille P., Larroche С. Optimization of isonovalal production from a-pinene oxide using permeabilized cells of Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 I I Appl Microbiol. Biotechnol. 2003. -V. 60. - P. 534-540.

82. Helenius A., Simons K. Solubilization of membranes by detergents // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V. 415. - P. 29-79.

83. Liu Y.-Y., Fujita Y., Kondo A., Fukuda H. Preparation of High-Activity Whole Cell Biocatalysts by Permeabilization of Recombinant Yeasts with Alcohol // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2000. - V. 89. - P. 554.

84. Colton I. J., Ahmed S. N., Kazlauskas R. J. A 2-Propanol Treatment Increases the Enantioselectivity of Candida rugosa Lipase toward Esters of Chiral Carboxylic Acids // Journal of Organic Chemistry. 1995. - V. 60. - P. 212-217.

85. Kim M.G., Lee E.G., Chung B.H. Improved enantioselectivity of Candida rugosa lipase towards ketoprofen ethyl ester by a simple two-step treatment // Process Biochemistry. 2000. - V. 35. - P. 977-982.

86. Matsuda Т., Nakajima Y., Harada Т., Nakamura K. Asymmetric reduction of simple aliphatic ketones with dried cells of Geotrichum candidum // Tetrahedron: Asymmetry. 2002. - V.l 3. - P. 971-974.

87. Мубараков А.И., Хабибуллина И.И., Петухова Н.И., Зорин В.В. Синтез эфиров гераниола в присутствии клеток микроорганизмов // Башкирский химический журнал,- 2003. -Т 10, №1.- с.56.

88. Jackson R.W., DeMoss J.A. Effects of toluene on Escherichia coli // Journal of Bacterid. 1965. - V. 90. - P. 1420-1425.

89. Lin G., Liu H.-C. Ultrasound-promoted lipase-catalyzed reactions // Tetrahedron Letters. 1995. - V. 36, № 34. - P. 6067.

90. Boye E., Alver S., Skarstad K. Deoxyribonucleic Acid Replication in Permeable and Fully Viable Escherichia coli Cells // Journal of Bacteriol. 1981. -V. 145.-P. 1413-1416.

91. Mowshowitz D.B. Permeabilization of yeast for enzyme assays: an extremely simple method for small samples // Anal. Biochemistry. 1976. - V. 70. - P. 94.

92. Oliveira D.E., Santos Neto A.L., Panek A.D. Permeabilization of yeast for in situ determination of alpha-glucosidase // Anal Biochemistry. 1981. - V. 113, № 1. -P. 188-192.

93. Rao В., Rehman A., Krishnakumari H., Yadav B. Lipase catalysed kinetic resolution of racemic (n)2,2-dimethyl-3-(2-methyl-l-propenyl)-cyclopropane carboxyl esters // Tetrahedron Letters. 1994. - V. 35, № 16. - P. 2611.

94. Shen D., Xu J.-H., Wu H.-Y., Liu Y.-Y. Significantly improved esterase activity of Trichosporon brassicae cells for ketoprofen resolution by 2-propanol treatment // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2002. - V. 18. - P. 219224.

95. Wu S. H., Guo Z. W., Sih C. J. Enhancing the enantioselectivity of Candida lipase-catalyzed ester hydrolysis via noncovalent enzyme modification // Journal of the American Chemical Society. 1990. - V. 112, № 5. - P. 1990-1995.

96. Kometani Т., Isobe Т., Goto M., Takeuchi Y., Haufe G. Enzymatic resolution of 2-fluoro-2-arylacetic acid derivatives // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 1998.-V. 5.-P. 171-174.

97. Chamorro S., Sanchez-Montero J.M., Alcantara A.R., Sinisterra J.V. Treatment of Candida rugosa lipase with short-chain polar organic solvents enchants its hydrolytic and synthetic activities // Biotechnology Letters. 1998. - V. 20, № 5. - P. 499-505.

98. Tsai S.-W., Wu G.-H., Chiang C.-L. Kinetics of enzymatic hydrolysis of olive oil in biphasic organic-aqueous system // Biotechnology and Bioengineering. 1991. - V. 38. - P. 761-766.

99. Chae H.J., Yoo Y.J. Mathematical analysis of an enzymatic reaction in an aqueous/organic two-phase system: Tyrosinase-catalysed hydroxylation of phenol // Journal of Chem. Technol. Biotechnol. 1997. - V. 70. - P. 163-170.

100. Klibanov A.M. Improving enzymes by using them in organic solvents // Nature. 2001. - V. 409. - P. 241.

101. Davison B.H., Barton J.W., Peterson G.R. Nomenclature and methodology for classification of nontraditional biocatalysis // Biotechnol. Prog. 1997. - V. 13. - P. 512.

102. Eliel E.L., Wilken S.H., Mander L.N. Stereochemistry of Organic Compounds. John Wiley: New York, 1994. - P. 1267.

103. Collins A.N., Sheldrake G.N., Crosby J. Chirality in Industry. John Wiley: Chichester. UK, 1997. 127 p.

104. Strauss U. Т., Felfer U., Faber К. Biocatalytic transformation of racemates into chiral building blocks in 100% chemical yield and 100% enantiomeric excess // Tetrahedron: Asymmetry. 1999. - V. 10. - P. 107-117.

105. Reinhold D. F., Firestone R. A., Gaines W. A., Chemerda J. M., Sletzinger L Selective Amidase with Extremely Broad Substrate Specificity from Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321 M I I Journal of Organic Chemistry. 1968. - V. 33. - P. 1209-1213.

106. Ghanem A, Aboul-Enein H.Y. Lipase-mediated chiral resolution of racemates in organic solvents. Tetrahedron: Asymmetry Report Number 78 // Tetrahedron: Asymmetry. 2004. -V. 15. - P. 3331-3351.

107. Leffingwell J.C., Shakelford R.E. Laevo menthol synthesis and organoleptic properties //Journal of Cosmet Perfume. 1974. - V. 89. - P. 69-89.

108. Fadnavis N.W., Radhika K.R. Enantio- and regiospecific reduction of ethyl 4-phenyl-2,4-dioxo // Tetrahedron Asymmetry. 2004. - V. 15. - P. 3443.

109. Zymanczyk-Duda, E. Kafarski, P. Lejczak, B. Reductive biotransformation of diethyl b-, g- and d-oxoalkylphosphonates by cells of baker s yeast // Enzyme And Microbial Technology. 2000. - V. 26, № 2-4. - P. 265-270.

110. Grison C., Coutrot F., Coutrot P. New glycosyl a-hydroxyesters as key intermediates in a convenient route to glycosyl a-aminoester chirons // Tetrahedron. -2002. 58, № 14. - P. 2735-2741.

111. Haeffner F., Norm Т., Hult K. Molecular modeling of the enantioselectivity in lipase-catalyzed transesterification reactions // Biophys. Journal. 1998. - V. 74. - P. 1251-1262.

112. Orrenius C., Haeffner F., Rottici D., Ohrner N., Norin Т., Hult K. Chiral recognition of alcohol enantiomers in acyl transfer reactions catalysed by Candida antarctica lipase В // Biocatalysis and Biotransformation. 1998. - V. 16. - P. 1-15.

113. Patel R.N., Banerjee A., Nanduri V., Goswami A., Comezoglu F.T. Enzymatic resolution of racemic secondary alcohols by lipase В from Candida antarctica II Journal American Oil Chemists Society. 2000. - V. 77, № 10. - P. 1015-1020.

114. Kamal A., Sandbhor M., Venkata Ramana K. One-pot lipase-catalyzed synthesis of enantiopure secondary alcohols from carbonyl compounds: a new protocol for lipase-mediated resolution // Tetrahedron: Asymmetry Pergamon. 2002. -V. 13.-P. 815-820.

115. Brackenridge I., McCague, R. M.; Roberts, S. M.; Turner, N. J. Enzymatic resolution of oxalate esters of a tertiary alcohol using porcine pancreatic lipase // Journal of Chemical Society Perkin Transactions. 1993. - № 10. - P. 1093.

116. Chen, S.-T., Fang, J.-M. Preparation of Optically Active Tertiary Alcohols by Enzymatic Methods. Application to the Synthesis of Drugs and Natural Products // Journal of Organic Chemistry. 1997. - V. 62, № 13. - P. 4349-4357.

117. Matsumoto Т., Ito M., Fukuda H., Kondo A. Enantioselective transesterification using lipase-displaying yeast whole-cell biocatalyst // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. - V. 64. - P. 481.

118. Grochulski. P., Li, Y., Schrag. J. D., Bouthhillier. F., Smith. P., Harrison, D., Rubin, В., Cygler. M. Insights into interfacial activation from an open structure of Candida rugosa lipase // Journal of Biol. Chemistry. 1993. - V. 268 - P. 1284312847.

119. Grochulski, P., Li, Y., Schrag, J. D., and Cygler, M. Two conformational states of Candida rugosa lipase // Protein Sci. 1994. - V. 3. - P. 82-91.

120. Derewenda, Z. S., Derewenda, U., and Dodson, G. G. The crystal and molecular structure of the Rhizomucor miehei triglyceride lipase at 1.0 A resolution // Journal of Biol. Chemistry. 1993. - V. 227. - P. 818-839.

121. Schrag, J. D., Cygler M. 1.8 A Refined structure of the lipase from Geotrichum candidum II Journal of Molecular Biol. 1993. - V. 230. - P. 575-591.

122. Коновалов А.А., Петухова Н.И., Ишмуратов Г.Ю., Зорин B.B. Гидролазная активность для кинетического разделения рацемической смеси этил-3-оксибутирата // Башкирский химический журнал. 2000. - Т. 7, № 5 - С. 34-36.

123. Zorin V.V., Petukhova N.I. New microbial biocatalysts for kinetic resolutions racemic mixtures of some epoxides, alcohols and esters In Book of Abstracts of 9th Meeting on Stereochemystry. Prague. 2001. - P. 215.

124. Idogaki H., Kasai N., Takeuchi M., Hatada M., Suzuki T. Preparation of (R)-and (S)-4-chloro-3-acetoxybutyronitrile using microbial resolution // Tetrahedron: Asymmetry.-2001.- V. 12, № 3.- p. 369 373

125. Ко C-S., Chu I-M. Immobilized cells biocatalyst for the production of S-acetylthio-2-methyl propionic acid // Enzyme and Microbial Technology. 2004.- V. 35, №6-7.- p. 619-623

126. Коновалов A.A., Петухова Н.И., Зорин B.B. Разработка метода микробиологического разделения рацемических втор-бутанолов // Башкирский химический журнал. 2000. - Т. 7, № 5 - С. 49-50.

127. Molinari F., Cavenago K.S., Romano A., Romano D. Gandolfi R. Enantioselective hydrolysis of (RS)-isopropylideneglycerol acetate with Kluyveromyces marxianus // Tetrahedron: Asymmetry 2004.- V. 15.- p. 1945-1947

128. Kumar I., Manju K., Jolly R.S. A new biocatalyst for the preparation of enantiomerically pure 2-arylpropanoic acids // Tetrahedron: Asymmetry.- 2001,- V. 12, №3-p. 1431-1433

129. Duan Shen; Jian-He Xu; Peng-Fei Gong; Hui-Yuan Wu; You-Yan Liu Isolation of an esterase-producing Trichosporon brassicae and its catalytic performance in kinetic resolution of ketoprofen // Canadian Journal of Microbiology.- 2001. V. 47,№ 12.-P. 1101.

130. Мубараков А.И., Петухова Н.И., Гареев B.M., Зорин B.B. Поиск новых микробных биокатализаторов для энантиоселективного ацилирования гептано-ла-2 //Башкирский химический журнал. 2000. - Т. 7, № 5 - С. 37-39.

131. Molinari F., Mantegazza L., Villa R., Aragozzini F. Resolution of 2-alkanols by microbially-catalyzed esterification // Journal of Fermentation and Bioengineering.- 1998.- V.86, № 1.- P. 62-64.

132. Mizuguchi E., Suzuki Т., Achiwa K. Lipase-catalyzed synthesis of optically active N,N,N-trimethylethanaminium a-tocopherol analog MLD-73404 // School of Pharmaceutical Sciences University of Shizuoka, 52-lYada, Synlett. 1994. - №11. -P. 929-930.

133. Czompa A., Kovacs Т., Antus S. Lipase-catalysed kinetic resolution of hydroxymethylchromanes // Journal of Heterocyclic Chemistry. 2000. - V. 37. - P. 991-995.

134. Ramadas S., David G.L., Krupadanam Enantioselective acylation of chroman-4-ols catalysed by lipase from Pseudomonas cepecia (Amano PS) // Tetrahedron: Asymmetry. 1997. - V. 8, № 18. - P. 3059-3066.

135. Подчуфарова E.B. Болевые синдромы в неврологии лечение острых болевых синдромов пояснично-крестцовой локализации // Консилиум медикум Журнал доказательной медицины для практикующих врачей.

136. Gajraj N.M. Cyclooxygenase-2 Inhibitors // Anesthes Analges. 2003. - V. 96. -P. 1720-1738.

137. Leman P., Kapadia Y., Herington J. Randomised controlled trial of the onset of analgesic efficacy of dexketoprofen and diclofenac in lower limb injury // Emergency medicine journal.- 2003.- V. 20, № 6.- P. 511-513.

138. Hutt A.J., Caldwell J. The importance of stereochemistry in the clinical pharmacokinetics of the 2-arylpropionic acid nonsteroidal anti-inflammatory drugs // Clin Pharmacokin. 1984. - V. 9. - P. 371.

139. Heefner D.L., Zepp M. Enantioselective hydrolysis of ketoprofen esters by Beauveria bassiana and enzymes derived therefrom. PCT Int Appl WO 94. 1994. -P. 20635 Al

140. Liu J., Zhang Y., Qiu L. H., Yang F., Ye L., Xia Y. Kinetic resolution of ketoprofen ester catalyzed by lipase from a mutant of CBS 5791 // Journal Ind. Microbiol. Biotechnol. 2004. - V. 31. - P. 495-499.

141. Liu Y.-Y., Xu J.-H., Hu Y.Enhancing effect of Tween-80 on lipase performance in enantioselective hydrolysis of ketoprofen ester // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2000. - V. 10. - P. 523-529.

142. Gong P.-F., Wu H.-Y., Xu J.-H., Shen D„ Liu Y.-Y. Biocatalytic preparation of enantiopure (^-ketoprofen from its racemic ester by a new yeast isolate Citeromyces matriensis CGMCC 0573 // Appl Microbiol Biotechnol. 2002. - V. 58. - P. 728-734.

143. Lee K. W., Shin G.-S., Bae H.-A., Shin H.-D., Lee Y.-H. Isolation and characterization of Acinetobacter sp. ES-1 excreting a lipase with high enantioselectivity for (^-ketoprofen ethyl ester // Biotechnology Letters. 2004. - V. 26.-P. 1639-1642.

144. Liu Y.-Y., Xu J.-H., Xu Q.-G., Hu Y. Significant enhancement of lipase enantioselectivity toward (5)-ketoprofen ester at pH 2 // Biotechnology Letters. -1999.-V. 21.-P. 143-146.

145. Park H. J., Choi W. J., Huh E. C., Lee Z. Y., Choi C. Y. Production of Optically Active Ketoprofen by Direct Enzymatic Esterification // Journal Of Bioscience And Bioengineering. 1999. - V. 87, № 4. - P. 545-547.

146. Duan G., Ching C.B., Lim E., Ang C.H. Kinetic study of enantioselective esterification of ketoprofen with n-propanol catalysed by an lipase in an organic medium//Biotechnology Letters. 1997.-V. 19, № 11. - P. 1051-1055.

147. Antona N.D., Lombardi P., Nicolosi G., Salvo G. Large scale preparation of enantiopure S-ketoprofen by biocatalysed kinetic resolution // Process Biochemistry.-2002,- V. 38.- P. 373 -377.

148. Cui Y.-M., Wei D.-Z., Yu J.-T. Lipase-catalyzed esterification in organic solvent to resolve racemic naproxen // Biotechnology Letters. 1997. - V. 19, № 9. -P. 865-868.

149. Mustranta A. Use of lipases in the resolution of racemic ibuprofen // Appl Microbiol. Biotechnol. 1992. - V. 38. - P. 61-66.

150. Henke E., Schuster S., Yang H., Bornscheuer U.T. Lipase-Catalyzed Resolution of Ibuprofen // Monatshefie fuer Chemie. 2000. - V. 131. - P.633-638.

151. Duan G., Chen J.Y. Effects of polar additives on the enzyme enantioselectivity of an esterification reaction in organic solvents // Biotechnology Letters. 1994. - V. 16, №10. -P. 1065-1068.

152. Практикум по микробиологии. / Под ред. H.C. Егорова. М.: Изд-во МГУ, - 1976.-306 с.

153. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Сни-та, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.: Мир, 1997. - Т. 1. - 430 е., Т.2. - 800 с.

154. Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф. Герхардта-М.: Мир, 1984. -Т. 1.-С. 54-57, Т. 3. С. 263.

155. Практикум по биохимии. / Под ред. С. Е. Северина, Г.А. Соловьева. М.: Изд-во МГУ, - 1989. - 93-96 с.

156. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высш. Школа, - 1980.-271 с.

157. Методы общей микробиологии. / Под ред. Ф. Герхфрдта М.: Мир, -1984.-Т. 2.-С. 24-25

158. Башкатова Н.А., Северина JI.O. // Прикладная микробиология и химия. -1978.-Т. 14,№6.-С. 838-864.

159. ФГУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Аттестат аккредитации ГСЭН.1Ш.ЦОА.155

160. Зарегистрирован в Госреестре № РОСС RU.0001.510411 от 10.06.2003. Экспертное заключение № 49от 16 ноября 2006 года

161. Культура микроорганизма род Microbacterium (77-9)наименование образца продукции) кафедра биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУорганизация-производитель)

162. Микробиологическая характеристика культуры микроорганизма род Microbacterium (77-9).

163. Источник выделения культуры: образцы почв с территорий, прилегающих к нефтеперерабатывающим предприятиям.

164. В работе использовались белые мыши с исходной массой тела 16-18 г. Содержание животных соответствовало санитарным правилам.

165. Вирулентность культуры микроорганизма оценивалась в острых опытах на белых мышах и крысах при различных путях введения взвеси бактерий в физиологическом растворе (внутрибрюшинно, пероралыш и интраназально).

166. Вводимая доза выражалась величиной десятичного логарифма, соответствующей количеству микробных клеток, полученных животными; каждая доза испытывалась не менее, чем на 6 животных.

167. Результаты приведены в таблице.

Информация о работе

Хабибуллина, Ирина Ифировна
кандидата технических наук
Уфа, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка энантиоселективных биокатализаторов кинетического разделения рацемических спиртов, кислот и эфиров - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы