Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка методов оценки семенного материала овощных культур на основке ЭПР-спектроскопии (на примере рода Brassica L.)

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов оценки семенного материала овощных культур на основке ЭПР-спектроскопии (на примере рода Brassica L.)"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

Р Г 8 О Л На правах рукописи

~ I) ЩЩ^А Мария Афанасьевна

УДК 635.342;581.1;53Г.53;632.35

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ СЕМЕННОГО МАТЕРИАЛА ОВОЩЫХ КУЛЬТУР НА ОСНОВЕ ЭЛР- СПЕКТРОСКОПИИ / на примере рода

/ 06.01.05 - селекция и семеноводство /

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 1993

Работа выполнена во ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур РАСН.

Научные руководители: Доктор сельскохозяйственных наук, профессор Кононков ПЛ., доктор сельскохозяйственных наук Самохвалов А.Н.

Официальные оппоненты: Доктор сельскохозяйственных наук, профессор Никитенко Г.Ф., кандидат биологических наук Головина S.A.

Ведущее учреждение - Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева.

Защита диссертации состоится п ....ßrffi'yfcf......1993

года в " часов на заседании специализированного совета К 053.22.22 в Российском университете дружбы народов по адресу:

I13093, Москва, ул. Павловская, 8/5. А?/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу:

II7I98, Москва, ул.Миклухо-Маклая, д.6

Автореферат

разослан .....IS93 г.

Ученый секретарь специализированного совета -кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

М.П.Харламов

- I -

ОоДАЯ ЛАРАКТЕРКСТЙКА. РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ:

Современное семеноводство разрабатывает научные основы и методические подходы, обеспечивающие воспроизведение, хранение и использование семян с сохранением хозяйственно-ценных признаков сорта в ряду поколений. Работы в этой направлении существенно осложнены наличием в семенах грибных и бактериальных инфекций. Одним из самых распространенных заболеваний, поражающих представителей рода ¿¿'является сосудистый бактериоз калусты. Используе-

мые в настоящее время методы сортового контроля, анализа и повышения посевных и урожайных качеств семян в селекции и первичном семеноводстве весьма трудоемки и требуют больших затрат времени. Так, например, для получения необходимой информации о наличие семенной инфекции необходимо проводить ряд сложных операций по микробиологическому культивированию патогенов.

В числе основных проблем, с решением которых связывают дальнейший прогресс в этой области, можно назвать следующие:

- экспресс-диагностика фитоинфекции, в особенности бактериального заражения семян;

- исследование сортовых различий морфологически неразличимых семян по биохимическим и биофизическим критериям.

Основой для решения указанных проблем может являться информация о состоянии структур семени на субмолекулярном и молекулярном уровне, которая может быть получена с помощью современных биофизических методов исследования биосистем, например, метода электронного парамагнитного резонанса - ЭПР.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ:

Целью нашей работы было разработать на основе ЭПР-спектро-скопии метод определения зараженности болезнями семян овощных культур и идентификации сортов на примере рода £>ШШС& ^ . 1ри выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследование патологических процессов в семенах, связанных с присутствием в них фитоинфекции методом Я1Р.

2. Поисковые исследования идентификации сортовых качеств семян методом ЗПР-епектроскопии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ:

Для диагностики фитоинфекции в семенах был использован метод электронного парамагнитного резонанса.

Обнаружена окислительная модификация меланина семенной обо-

лочки, индуцируемая возбудителем сосудистого бактериоза капусты и являющаяся, по видимому, составной частью иммунного ответа со стороны ткани семени.

Разработана методика исследования и кинетического описания процесса восстановления нитроксильного радикала в гомогенатах семян.

Установлены различия в кинетических характеристиках процесса восстановления нитроксила в семенах различных сортов капусты, которые предложено использовать для исследования сортовых различий семян.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ;

Предложена методика ранней диагностики сосудистого бактериоза капусты на основе обнаруженной в работе окислительной модификации меланина семенной оболочки, коррелирующей со степенью зараженности семян.

Полученные экспериментальные результаты могут быть использованы в селекционно-семеноведческой работе при создании новых и совершенствовании существующих методов и приемов получения высококачественных семян.

Установлены информативные ЭПР-параметры, позволяющие идентифицировать сортовые различия растений по семенам.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ:

Основные материалы работы были доложены на Международной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" в г.Звенигороде, 1989г.; 3-й Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант", Москва, 1989г.; научно-производственной конференции "Молодые ученые - сельскому хозяйству Нечерноземной зоны", Москва, 1990г.; ежегодных коференциях молодых ученых во ВНИИССОК, ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур, 1987-1989гг.

ПУБЛИКАЦИИ:

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ:

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц, 17 рисунков и состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, выводов, заключения, списка использованной литературы из 146 наименований, в том числе 89 отечественных и 57 зарубежных, рекомендацию для внедрения.

- 3 -

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Работа была выполнена в 1987-1990 гг. во ВНИИССОК /лаборатория семеноведения/. В исследованиях использовали отечественные и зарубежные сорта капусты белокочанной, представленные ВЙРоп и ВНИИССОК.

Выделение изолятов из инфекционного материала проводили з лаборатории иммунитета ВНИИССОК. Выделение штамма КУ-5 ХапХ^тгММ^ С&лцшЫь. (IV, сшг^аЫ^. проводили по общепринятым методам /Бельтю-кова, Матшпевская, 1988; Матвеева, 1589/. Приготовление бактериальной суспензии из изолятов проводили стандартными методами /Матвеева, Чумаевская, 1986/, оценку патогенности - в лабораторных условиях с предварительной проверкой по реакции сверхчувствительности на растениях-индикаторах и. ^/«¿¿¿/Оа.чохна-

лов и др., 1989/. Оценку развития сосудистого бактериоза проводили по пятибальной системе Студенцова с модификациями /Никитина, Студенцов, 1971/.

Заражение семян капусты сосудистым бактериозом проводили стандартными методами /Матвеева, 1982/. В качестве контроля использовали семена, обработанные в тех же условиях стерильной дистиллированной водой.

Регистрацию спектров Я7Р с в о бод но ради кал ь ньсс сигналов ШР целых и препарированных семян капусты проводили на спектрометре Е-104 фирмы уошии /США/. Спектры каждого образца регистрировали по 5-6 раз при неизменных условиях записи.

Регистрацию спектров ШР кинетики восстановления нитроксиль-ного радикала ТЕМПОЛ в гомогенатах семян проводили на основе разработанной нами методики приготовления гомогенатав из семян капусты. Интервал измерений составлял I минуту.

Математическую обработку результатов экспериментов проводили методами регрессионного, корреляционного и дисперсионного анализов в соответствии с рекомендациями В.Ю.Урбаха / Урбах, 1964/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ; I. Исследование свободнорадикального сигнала ШР в семенах капусты в покое и при прорастании.

Определены основные радиоспектроскопические характеристики свободнорадикального сигнала ШР семян капусты и отдельных структур семян: ^-фактор /^2,0058 Гс/, л Н /6,0 - 0,3 Гс/, насыщаемость сигнала при 0,5 мВт. Как видно из рисунка I, сигналы сПР

кожуры и целого семени имеют ряд сходных черт, а именно, одинаковые значения ширины линии, формы спектра, сравнимые значения фактора и интенсивности спектра /целое семя - 2,0058 Гс; 6,0 Гс; 0,5 мВт. Кожура семени - 2,0042 Гс; 6,5 Гс; 0,5 мВт. Ядро семени -2,0064 Гс; 10,5 Гс; 1,0 Мвт. (?-фактор, ширина линии и насыщаемость, соответственно/. Как видно, значения параметров спектра 31Р целого семени располагаются между значениями этих параметров для кожуры и ядра, а спектр 31Р целого семени является результирующим, суммарным спектром, возникающим от наложения всех компонент структур семени. Анализ полученных данных позволяет высказать предположение о том, что основной вклад в сигнал ШР семени дают парамагнитные центры кожуры.

Исследования сигналов 2ПР различных сортов семян капусты при относительно неизменных значениях §-фактора,дН и насыщаемости сигнала показывают высокое различие величины интенсивности сво-боднорадикального сигнала 31 Р.

При оценке уровня жизнедеятельности семян установлено, что происходящие в набухающем и прорастающем семени метаболические изменения коррелируют с изменением интенсивности сигнала ЭПР. А именно, с--активацией .метаболических, процессов в семени при прорастании происходит постепенное уменьшение величины интенсивности его свободнорадикального сигнала. Последнее обстоятельство объясняется разрушением парамагнитных центров под действием воды. Вполне вероятно, что уровень содержания свободных радикалов может свидетельствовать об интенсивности процессов поступления воды и расходования питательных веществ.

Данные проведенных экспериментов показывают также сильную зависимость интенсивности свободнорадикального сигнала ШР от условий внешней среды / рН среды, температуры, влажности и степени окрашенности семенной кожуры/.

Как следует из наших исследований, наиболее лабильной характеристикой, способной реагировать на самые различные изменения в семенах, является интенсивность свободнорадикального сигнала йПР. Данные многих исследований ряда авторов свидетельствуют о том, что разнообразные физиологические и патологические процессы в биологических объектах приводят к изменению величины интенсивности свободнорадикального сигнала Э1Р. Поскольку интенсивность характеризует общее ©держание парамагнитных центров в исследуемой системе, то ята характеристика может быть использована для исследо-

РисЛ. Свободнорадикальные сигналы ЭПР отдельных структур

семени капусты: а - целое семя,

б - кожура семени,

в - ядро семени.

вания патологических и динамических процессов, протекающих в семени.

В то же время столь высокая чувствительность этого параметра делает проблематичным идентификацию растения по семенам. Возникает необходимость расширения набора критериев, позволяющих характеризовать состояние семени на новом методическом уровне. Наиболее информативным в этом аспекте оказался метод восстановления нитроксильного радикала, впервые предложенный нами для исследования семян растений.

2. Использование метода восстановления нитроксильного радикала для характеристики состояния семян /методические аспекты и кинетическое описание/.

В качестве субстрата для восстановления нитроксила ТКМПОЛ использовали гомогенаты, приготовленные из семян капусты. Раствор ТЕШОЯ использовали в концентрации 2,5хЮ"^М/л. На рисунке 2 /а/ представлена кинетическая кривая восстановления ТЕМПОЛ. Как видно из рисунка, кривая восстановления выходит на плато, при этом восстанавливается примерно половина от исходного количества ТЕМПОЛ. Это означает, что в исследуемой системе нитроксил восстанавливается не полностью и, следовательно, концентрации ТЕМПОЛ и восстанавливающих его агентов сопоставимы между собой.

Исследования показали, что реакция восстановления имеет второй порядок и таким образом описывается кинетическим уравнением скорости второго порядка. Это позволяет для представления результатов эксперимента использовать уравнение скорости второго порядка и, соответственно, получить графическое представление результатов в к оординатах уравнения скорости второго порядка и вычислить константу скорости второго порядка . То есть:

- /I/

где: У и значения интенсивности сигнала 31Р ТЕШОЛ в

начальный, текущий и конечный моменты времени, соответственно;

- константа скорости второго порядка.

График уравнения I /рис.2, б/представляет собой прямую линию, проходящую через начало координат, тангенс угла наклона которой задается формулой:

1.10 ^

1.оо

0.90

0.80

0.70

0.60

0.50

5' (т^Х. илъ'иЬ,-)

Зиггиь (ггьшь)

0.40 [ | ) I | ) | I т)[ I | I I I I 1 I I ;> 1 I I I I т I I | 1 I I I I 1 I г I [ 0.00 4.00 8.00 12.00 16.00

Рис.2, а-кинетическая кривая восстановления ТЕМПОЛ в гомогенатах семян.

2.50 п &

2.00

1.50

1.00

0.50 -

0.00

(У о—Ус»©.

к =-/2 1 Уоо" •М^а-

м

ЗёЖ9(й£ ш, ггь I

(пъ!/>

иПГЬФ ( ГГЫЛЪ

, т—I --г■ < 1 Г1 ■ ¡2.00 16.00

0.00 4.00 8.00

б-линейная анаморфоза кинетической кривой.

- 8 -

сС = •

Для нахождения необходимо из экспериментальных данных определить величину ¿У и расчитать угол наклона графика. Тогда, как следует из формулы 2, :

/сг = 1к}сС ' /3/

Для выражения в М, необходимо учесть, что за одну относительную единицу принята начальная концентрация раствора ТЕМПОЛ, выраженная в М/л - М . То есть:

кг ~ • /4 /4/

При анализе кинетической кривой восстановления в качестве еще одной характеристики процесса предложено использовать величину общей концентрации восстановителей С^, равную:

где: Зо и ~ начальная, конечная величина интенсивности сигнала ТЕМПОЛ, соответственно;

с;

2,5x10 иМ/л

- концентрация раствора ТЕМПОЛ; - величина интенсивности ТЕМПОЛ при концентрации 2,5 х

Ю~5М/л;

0,2г - вес исследуемого образца семян.

Полученные кинетические характеристики и Сл по сути определяют количественный и качественный состав восстановителей ТЕМПОЛ в семени. В этой связи можно ожидать, что эти характеристики окажутся чувствительными с одной стороны к тонким биохимическим процессам, протекающим в семени, с другой стороны - к генетическим различиям в составе белков и низкомолекулярных восстанавливающих центров.

Логичным представляется поиск возможных различий основных радиоспектроскопических характеристик и кинетических параметров восстановления на семенах различных сортов капусты. Иными словами, с помощью полученных методом ЭПР физико-химических критериев идентифицировать сорт семян.

3, Поиск возможностей идентификации сортовых различий семян методом ШР.

Исследования свободнорадикальных сигналов 31Р 19 сортов капусты показали, что значения д -фактора колеблются в интервале от 2,0051 Гс,ДН - от 5,1 до 6,0 Гс. Все сигналы насыщались при 0,5 мВт. Звободнорадикальные сигналы ШР семян разных сортов сильно различались по величине интенсивности сигнала при относительно неизменных значениях ^-фактора, дН и насыщаемости /табл.1/.

При исследовании процесса восстановления ТЕМПОЛ в гомогенатах семян 9 сортов в соответствии с уравнениями 1,4 и 5 получены значения и для каждого сорта /таблица 2/.

Анализируя полученные экспериментальные данные, кинетические кривые и их соответствующие линейные анаморфозы в координатах уравнения скорости второго порядка можно видеть, что концентрация восстанавливающих нитроксил агентов отражает сортовую принадлежность семян. Для исчерпывающего ответа о достоверности наблюдаемых различий был проведен статистический анализ результатов.

Таким образом, проанализирована сортовая изменчивость ряда ШР-характеристик у различных сортов капусты. При этом оказалось, что три из исследуемых характеристик проявляют изменчивость при переходе от сорта к сорту. Наиболее четкие различия удается проводить при использовании параметра ^ . Это подтверждается и данными экспериментов, показывающими влияние эколого-географических условий выращивания на значения О и С^ на примере трех сортов разных лет репродукции и условий выращивания. Анализ данных этих исследований показал, что практически не связана с генетическими особенностями сорта и зависит от условий созревания семян. Вариабельным, хотя и в меньшей степени, оказывается параметр С^ . Здесь, несмотря на вариабельность и перекрывание доверительных интервалов значений удается проследить определенную связь между генотипом и критерием С ц .

Полученные различия физических параметров восстановления ТЕМПОЛ легко объяснить, исходя из представлений о биологической природе восстанавливающих нитроксил агентов семени. Известно, что нитрок-сильные радикалы легко восстанавливаются веществами, способными легко окисляться с потерей свободной валентности. Известно также, что основным источником электронов в метаболизирующих тканях, гле происходит восстановление нитроксилов, является дыхательная цепь митохондрий. Зто означает, что в таком случае кинетические коне-

- го -

Таблица I

Основные характеристики свободнорадикальных сигналов ШР семян капусты белокочанной.

Я? Исследуемый сорт Интенсив- ^-фактор Ширина

семян капусты ность, усл.ед Гс линии Гс

I. Амагер 611 10,4-0,3 2,0054 5,6-0,2

2. Ликуришка

498/15 4,8-0,2 2,0053 5,4-0,1

3. Московская

поздняя 9 8,6*0,6 2,0051 5,2*0,I

4. К. Юс^ШЛ^ 75 7,2-0,2 2,0053 5,5*0,1

5. Савинекая 378 7,2-0,I 2,0052 5,3*0,2

s. Zkuüd йтош ^ £0,7*0,4 2,0052 5,3*0,I

7. Xanftoiyte 8,6-0,5 2,0053 5,4*0,2

8. Ш- Wim. 7,9-0,I 2,0055 5,8*0,2

9. Подарок 2500 9,9*0,1 2,0053 5,5*0,2

ГО. OSinhucfU'ic г 8,2*0,5 2,0052 5,3*0,1

El.Краснодарская I 12. ГШ- wk 5,8*0,1 2,0053 5,4*0,2

5,3-0,I 2,0051 5,2*0,1

13. Бирючекутская 136 7,2-0,2 2,0052 5,3*0,1

14. (ihrikwfofc 2 9,1*0,3 2,0052 5,3*0,1

15. Завадовская

257/263 5,9-0,Г 2,0051 5,1*0,Г

16. Марнополко 1002 4,1-0,3 2,0055 5,7*0,2

17. hmiun ТЫ Юл. 6,1*0,1 2,0053 5,4*0,3

18. Капорка /Украина/ 8,3*0,4 2,0053 5,4*0,1

19. Зимовка 1474 8,6*0,3 2,0052 5,3*0,1

Таблица 2

Средние значения кинетических характеристик процесса восстановления ТЕМПОЛ в гомогенатах семян капусты.

р Исследуемый сорт kgioSr1- ю- -5М / г

семян > мин~^

г. Зимовка 1474 0,24 ± 0,03 6,45 ± 0,20

2. Амагер 611 2,32 ±0,05 9,47 ± 0,16

3. PumUm, mfaf-fl. [4,79 ± 0,13 5,53 ± 0,12

4. Савинская 378 3,60 ± 0,08 а 64 * 0,11

5. Марнополко 1002 0,64 i 0,04 7,70 i 0,21

б. Хсии^ЦЬь büfy. [7,57 ± 0,05 4,43 ± 0,10

7. Краснодарская I 3,11 i 0,03 4,12 ± 0,21

8. Шишиг äii i. 1,38 i 0,08 5, II ± 0,16

9. Бирючекутская 138 2,45 ± 0,07 6,08 ± 0,15

танты характеризуют функциональную активность митохондрий той или ткани. В случае покоящихся семян мы имеем дело с тканью, где не происходит активного метаболизма. В этом случае восстановителями нитроксила могут выступать различные сульфгидрильные группы белков и низкомолекулярные соединения /фенолы, аскорбиновая кислота/. Известно, что состав и свойства белков непосредственно детерминированы генотипом растения. В известной степени состав низкомолекулярных соединений также определяется генотипом. Поскольку генотип определяет качественный и количественный состав этих соединений, восстанавливающих нитроксил в гомогенате, то генотип определяет и константу скорости восстановления. Таким образом, генотип — качественный и количественный состав ¿восстановителей —*- константа скорости восстановления ТЕМЛОЛ в семенах.

4. Оценка на зараженность сосудистым бактериозом семян методом 31Р.

При сравнении свободнорадикальных сигналов инфицированных и-контрольных образцов семян установлено, что при идентичных радиоспектроскопических характеристиках сигналы 5ПР инфицированных семян характеризуются большей интенсивностью спектра ШР. Достоверность различий опытных и контрольных семян означает, что спектры ШР инфицированных семян обладают/дополнительным количеством парамагнитных центров.

При исследовании кинетики восстановления ТЕМПОЯ в гомогена-тах инфицированных семян, показано, что значения кинетических характеристик достоверно ниже таковых для контрольных семян / значения с7 и /^у контрольных семян: 15,2 - 0,3; 2,41 * 0,08. Значения о7 и л^ у инфицированных семян: 17,5 - 0,3; 1,75 - 0,1 для степени заражения Ю°кл/мл и 17,7 - 0,5; 1,42 - 0,1 для степени заражения 10®кл/мл./.

Представляло интерес сопоставить экспериментальные результаты, полученные в ходе двух независимых экспериментов. На рисунке 3 по оси абсцисс отложены значения восстановления ТЧМПОЛ в опыте и контроле, а по оси ординат - их соответствующие степеням зараженности значения У . Как видно из рисунка, полученные различными способами данные оказались связанными обратной линейной зависимостью Зто означает, что присутствие патогена в семени ведет с одной стороны к увеличению о сигнала ЗПР, с другой стороны снижает значение/1 в гомогенатах семян те< же образцов. По всей

1.00

0.98

З' (г-<г1. илггЖъ )

10 к л. мл

Ч©

5

0 кл.мл

^ПГПГГП! щ I 1Т1 П I 1 ГТТГПТГр I Т~П Г 1"П~

Ъ 4 -1 -1 к '10 л пит-2

тп IIII а Ч I'' ГТ1 м 11111IIIIIII

1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60

Рис.3. Взаимосвязь величин а/и /С", п норме и при патологии.

семян капусты

видимости наличие возбудителя оказывает влияние на конкретный биохимический субстрат или морфоструктуру, обладающую парамагнетизмом и способную восстанавливать нитроксильный радикал.

ШР-исследование отдельных структур инфицированных семян показало следующее:

I. При исследоЕШНии свободнорадикальных сигналов отдельно кожуры и ядер инфицированных и контрольных семян оказалась, что значения «7 ядер достоверно не отличаются, тогда как значения У кожуры инфицированных семян на 20Х выше значений. <7 для контрольных семян.

2. При исследовании кинетики восстановления ТЕМПОЛ отдельно в гомогенатах кожуры и ядер инфицированных и контрольных семян показано, что значения Да кожуры и ядер не отличаются от таковых для контрольных, в то время как значения С & инфицированных семян достоверно ниже значении 0 ^ контрольных образцов.

Поскольку обе характеристики и Сц являются количественными, то следует утверждать, что инфицированные семена характеризуются повышенным содержанием свободных радикалов и пониженным количеством восстановителей и чем выше степень зараженности семян, тем выше значение 3 и ниже значение С^ в гомогенатах этих семян.

Анализ литературных данных и полученных экспериментальных результатов показывает, что модифицируемым под действием патогена компонентом является пигмент кохуры семени - меланин / д -фактор от^>2-,0030 До 2,3044 Гс, д Н от 4 до Ь То/. Известно, что двумя типами мономерных звеньев этого полифенола являются 5,5-диоксиин-дол и индол-5,б-хинон. Наличие в структуре хинонных группировок обусловливает его способность реагировать как с окислителями, так и с восстановителями. Промежуточной структурой превращений 5,6 -диоксииндола в индол-5,о-хинон и обратно является свободный радикал семихинон, спектр которого и фиксируется при спектроскопии семян. Следовательно концентрация семихинонов обусловливает величину интенсивности спектра 31Р семян. При этом изменение концентрации семихинонов должно коррелировать с концентрацией нерадикальных компонентов. Поскольку гидрохиноновые группировки меланина являются донорами электронов в реакции с ТЗШОЛ /реакция окисления/, то согласно полученным данным уменьшение С^ определяется окислением части гидрохиноновых групп под действием патогена. В результате однозлектронного окисления гидрохиноновых групп долша увеличиваться концентрация семихинонов в кожуре семени, что и наблюдается в экс-

о,6-диоксииндол семихинон индол-о,6-хинон

Таким образом, два регистрируемых различными методами э+фекта /увеличение свободнорадикалыюго сигнала 3!Р кожуры семян и уменьшение концентрации восстановителей в гомогенате кожуры семени/ оказываются двумя проявлениями одного и того же процесса - окисления оксигрупп на меланине. Следствием этого является наблюдаемая в эксперименте взаимосвязь между результатами независимых исследованил.

Анализ полученных данных позволил нам с достаточной определенностью установить химическую природу наблюдаемого явления. Возникал вопрос о биологическом значении обнаруженной нами окислительной модификации меланина под действием патогена. О этой целью представляло интерес сопоставить экспериментальные данные, полученные при исследовании разных сортов капусты, зараженных сосудистым бактериозом. '6 экспериментах с двумя сортами было показано, что значения $ сигналов <?ЛР семян одного сорта /сорт Амагер 511/ нарастают постепенно в соответствии со степенью зараженности, в то время как значения $ сигналов ЗПР другого сорта /сорт Зимовка Т474/ начиная со степени заражения 10 кл/мл уке находятся в области плато. Сорта реагируют по-разному на внедрение возбудителя. Очевидно, что степень выраженности реакции в ответ на внедрение возбудителя, регистрируемое как увеличение величины $ сигнала ГОР зараженных семян, в этих сортах резко различается.

Следует отметить, что сорт Зимовка является более устойчивым сортом к штамму КУ-5, чем сорт Амагер 511, Поскольку степень выраженности реакции существенно вш.е в случае сорта устойчивого к возбудителю, то мо«но предположить, что мы наблюдаем проявление биологически значимо* реакции тьани семени в ответ на внедрение возбудителя, аналогичной по своей природе реакции сверхчувствительности.

Известно, что у чувствительных к патогенным микроорганизмам растений происходит активация перекисного окисления липидов, приводящая к необратимым нарушением клеточных структур. Известно также, что радикал кислорода токсичен для живых микроорганизмов и устойчивые к заболеваниям растения способны генерировать при ис-

кусзтвенном внесении суспензии патогенных бактерий. Добавление су-пероксидциссму.тазы приводило к появлению первичных признаков заболевания.

Вполне вероятно, что поли^енольные структуры, легко окисляющиеся до свобэднорадикального состояния, такие как меланин семенной кожурьг, способны генерировать 0?Г,. токсичны/ для патогенных микроорганизмов. Наше предположение основывается на анализе литературных данных последних лет ряда авторов, исследовавшик физико-химические свойства и биологисекую роль меланина. Существующая точка зрения относительно антиокислительной функции меланина как акцептора свободных радикалов дополняется и его донорными свойствами, то его способностью образовывать стабильные свободные радикалы, препятствуя таклм образом возникновению цепных окислительных реакций в системе. 'А котя смысл этого явления остается не выясненным, представляется, что окислительная модификация меланина является составной частью биологически значимой защитной реакции растения в ответ на внедрение возбудителя, реализуемая путем генерации супероксид радикалов кислорода.

ВЫВОДЫ:

1. Семена напусти, зараженные возбудителем сосудистого бактериоза, характеризуются повышенной интегральной интенсивностью свободнорадикального сигнала ,"?1Р и,одновременно, более низким значением константы скорости восстановления нмтро«сильного радикала

в гомогенатах тех же образцов семян./ Значения«У и для контрольных семян: 16,2 * 0,3 и 2,41 - 0,06. Значения ^ и ^ у инфицированных семян: 17,5 - 0,3 и Г,76 - 0,12 для степени зараяе-ни Ю°кл/мл у 17,7 - 0,50 и 1,42 * 0,10 для степени заражения Ю^' кл на мл/.

2. Возбудитель сосудистого бактериоза индуцирует в семенах окислительные реакции, приводящие к окислению части гидрохиноновых группировок меланина семенной оболочки. Окислительная модификация меланина, вероятно, является составной частью биологически значимой защитной реакции семени, реализуемой путем генерации свободных радикалов кислорода на меланине.

3. Установлено, что семена различных сортов капусты различается по кинетическим характеристикам процесса восстановления нитро-ксильного ради»ала, что мо-кет бить использовано для установления принадлежности семян к данному сорту. Полученные кинетические характеристики процесса восстановления'ТЗМПЭЛ могут быть использованы при разработке экспресс-метода для идентификации сортов.

- 17 -

Рекомендация для внедрения:

Разработанный метод ШР-спектроскопии может быть использован в научно-исследовательских учреждениях при оценке семенного материала капусты белокочанной.

Ло материалам диссертации опубликовано 5 работ:

Нешева М.А., Самохвалов А. П., Кононков ¡1.<Ь., Нешев И.V., Богданов Г.Н. Применение метода ШР-спектроскопии для исследования семян капусты, зараженных возбудителем сосудистого бактериоза// Семеноводство овощных культур. - Москва, 1969. - Вып.29 - С.67-71.

Пахомова М.а., Нешев Н.Л., Богданов Г.Н., Самохвалов А.К., Варфоломеев З.Н., Коненков П.*. Окисление меланина в семенах капусты, пораженных возбудителем сосудистого бактериоза// биоанти-оксидант. - Черноголовка, 1989. - 3.193.

Пахомова 15.А., Нешев Н.И., Ъогданов Г.Н., Самохвалов А.Н., Варфоломеев В.Н., -{ононков П.£. ШР-исследование семян капуста, зараженных возбудителем сосудистого бактериоза// Магнитный резонанс в биологии и медицине. - Черноголовка, 1969. - 3.157.

Нешева М.А. ЗПР-спектроскопия семян капусты, зараженных сосудистым бактериозом// Молодые ученые - сельскому хозяйству Нечерноземной зоны. - '/¡осква, 1990. - 3.56-57.

Нешева м.А. Возможности использования метода сПР в ранней диагностике сосудистого бактериоза в семенах капусты // ?(!олодые ученые - сельскому хозяйству Нечерноземной зоны. - Москва, 1990. - С.57-58.

2о11о.93г. Зак,, 641 Объем 1п.л. Тираж 100

Типография РУДН, Орджоникидзе 3