Разработка методов диагностики микоплазмозов кур и изучение изолятов Mycoplasma gallisepticum, выявленных на территории Российской Федерации

Спрыгин, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методов диагностики микоплазмозов кур и изучение изолятов Mycoplasma gallisepticum, выявленных на территории Российской Федерации
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов диагностики микоплазмозов кур и изучение изолятов Mycoplasma gallisepticum, выявленных на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

0034080ЭУ

СПРЫГИН АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ МИКОПЛАЗМОЗОВ КУР И ИЗУЧЕНИЕ УПОЛЯТОЪ MYCOPLASMA GALLISEPTICUM, ВЫЯВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Щелково - 2009

t о ДЕК 2009

003488099

На правах рукописи

СПРЫГИН АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ МИКОПЛАЗМОЗОВ КУР И ИЗУЧЕНИЕ ИЗОЛЯТОВ MYCOPLASMA GALLISEPT1CUM, ВЫЯВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Щелково - 2009

Работа выполнена в лаборатории диагностики вирусных болезней птиц ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Дрыгин Владимир Викторович Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных паук, профессор Белоусов Василий Иванович доктор ветеринарных наук, профессор Белоусова Раиса Васильевна

Ведущая организации - ГНУ «Всероссийский паучио-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадсмии

Защита состоится 25 декабря 2009 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, ВНИТИБП, E-mail: vnitibp@ mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП

Автореферат разослан 24 ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного с< кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальност ь темы. Микоплазмы являются уникальными

микроорганизмами, занимающими особое положение среди бактерий (Razin, 1998). Для птицеводства наибольший интерес среди рода Mycoplasma представляют Mycoplasma gallisepticum (MG) и Mycoplasma synoviae (MS), которые наряду с метапневмовирусом птиц (МПВП), вирусом инфекционного бронхита кур (ИБК), ларинготрахсита (ИЛТ) и реовирусом вызывают респираторный синдром и теносиновит (Klevcn, 1997; Bagust et al., 1997; Cavanagh et al, 1997; Ley et al., 1997, Sahu et al., 1975). MG и MS наносят значительный экономический ущерб промышленному птицеводству, снижая яйценоскость у птиц и осложняя течение ассоциированных вирусных и бактериальных заболеваний (Cliu et al., 1987; Ley et al., 1997, Bradbury et al, 1978, 1984; AI-Afaleqe/a/., 1989).

Эффективность мероприятий по борьбе с инфекционными заболеваниями во многом зависит от своевременного выявления возбудителя. Диагноз основывается на данных клинического наблюдения и на результатах лабораторных исследований, которые должны быть получены в максимально короткие сроки. Дифференциация микоплазмозов от смешанных вирусных инфекций на ранних стадиях заболевания позволяет вовремя принять необходимые меры и сократить экономические потери.

В настоящее время для выявления MG и MS используют несколько методик. Выделение культуры микроорганизма является надежным, но весьма трудоемким методом, так как это требует значительного времени и специальных селективных сред. К тому же процесс культивирования может осложняться ростом вторичной микрофлоры (Klevcn, 1975).

Серологические методы являются быстрыми и

высокопроизводительными, но для выработки достаточного количества антител в крови, которые могут быть выявлены серологическими методами, требуется от 1-й до 3-х недель с момента начала инфекции (Kempf, 1998), что затрудняет выявление инфекции на ранней стадии.

отбора проб. В последнее время появились методы Г1ЦР для выявления MG (Slavi et al., 1993; Torna et al., 1999) и MS (Ramirez et al., 2006), а также запатентованные диагностикумы для MG (IDEXX, США; ИнтерЛабСервис, г. Москва). Сейчас также применяют методы ПЦР, с помощью которых можно идентифицировать MG и MS одновременно (Mardassi et al., 2005; Wang et al., 1997). Сравнительно недавно для выявления MG развитие получил такой метод, как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) (Carli et al., 2003; Callison et al., 2006). Однако выявление MS с помощью ГЩР-РВ еще не описано. Метод ПЦР-РВ более чувствителен и позволяет проводить количественный анализ! Одним из общих недостатков метода ПЦР является возможность ингибирования реакции при исследовании суспензий тканей и органов, таких, как мозг, печень и т.п., содержащих большое количество липидов и ферментов. Для исключения ингибирования и контроля процесса выделения используется внутренний контрольный образец (ВКО), т.е гетерологичная ДНК, которая добавляется в пробу перед выделением. К тому же существует риск перекрёстной контаминации, ввиду необходимости проведения электрофореза для анализа продуктов реакции.

Существующие штаммы MG, включая референтные, могут значительно отличаться по антигенным и биологическим свойствам (Rosengarten et al., 1996; Akhtar et al., 1991), поэтому необходимо не только выявлять изоляты, но также изучать их свойства. Сравнительный анализ иуклеотидных последовательностей вариабельных генов даст возможность устанавливать пути распространения инфекции (Ley et al., 2003). Более того, использование живых вакцин против MG делает актуальной задачу дифференциации полевых изолятов. К тому же генетическое разнообразие изолятов MG, встречающееся на территории РФ, остаётся в настоящее время неизученным.

Исходя из вышеизложенного, разработка надежных методов выявления MG и MS в пробах патологического материала, а также изучения выявленных изолятов MG является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью исследований являлась разработка методов выявления MG и MS на основе дуплекс ПЦР (дПЦР) и дуплекс ПЦР-РВ (дПЦР-РВ), а также изучение патогенности выявленных изолятов MG.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

1. Разработать методы ПЦР для выявления MG и MS в пробах патологического материала от птиц с ассоциированными инфекциями.

2. Провести анализ частоты встречаемости MG и MS в ассоциации с вирусами ИБК, МПВП, ИЛТ и рсовируса кур, соответственно, при исследовании проб патологического материала.

3. Изучить патогснность некоторых выявленных изолятов MG.

4. Провести анализ иуклеотидных последовательностей участков вариабельных генов выявленных изолятов MG.

Научная шшизна:

- разработаны методы выявления MG и MS на основе дПЦР и д ПЦР-РВ с внутренним контрольным образцом;

- показана возможность дифференциации MG и MS от вирусов ИБК, МГ1ВП, ИЛТ и реовируса кур в пробах патологического материала от птиц;

- изучена патогенность 5 выявленных изолятов MG; ,

- впервые проведен анализ иуклеотидных последовательностей генов gapA, mgc2 и pvpA 26 российских изолятов MG;

- получены последовательности фрагментов генов gapA, mgc2 и pvp/i 26 изолятов MG, депонированные в международной базе данных Genbank под номерами FJ965750-FJ965767, FJ965769-FJ965783, FJ965785-FJ965815, FJ965817-FJ965827 и FJ972630-FJ972632.

Практическая значимость. Разработанные молекулярно-биологические методы, прошедшие испытания в «ФГУ ВНИИЗЖ», изложены в следующих документах:

- ((Методика выявления генома Mycoplasma galUsepticum и Mycoplasma synoviae с использованием полимеразной цепной реакции в формате мультиплекс» (2006 г.);

- «Методика выявления и количественного анализа Mycoplasma gaUisepticum и Mycoplasma synoviae с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с внутренним контрольным образцом» (2008 г.).

животных и птиц с использованием ПЦР» (2008 г.), который допущен Россельхознадзором РФ в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Методы ПЦР для выявления МО и М8: одновременная детекция геномов Мб и МЯ методом дуплекс ПЦР и дуплекс ПЦР-РВ с внутренним контрольным образцом.

- Результаты выявления Мб и МБ в пробах от птиц с респираторным комплексом, полученных из птицеводческих хозяйств различных регионов РФ и СНГ в период е 2005 по 2008 гг.

- Результаты изучения биологических свойств изолятов МО.

- Результаты анализа первичных нуклеотидных последовательностей фрагментов генов gapA, mgc2 и рурА изолятов МО, выявленных на территории РФ в 2005-2008 гг.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены, обсуждены и одобрены на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2006-2008 гг., опубликованы в материалах Всемирного ветеринарного конгресса по птицеводству (Китай, 2007), международных ветеринарных конференциях по птицеводству (Украина, 2008), Международной конференции, посвященной генетике микроорганизмов и эволюции инфекционных заболеваний (США, 2008).

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 3 работы - в материалах международных конференций, 4 работы - в материалах конгрессов за рубежом.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 149 страницах и включает следующие разделы; введение, обзор литературы, заключение по обзору литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и приложения. Работа иллюстрирована, 25 таблицами и 18 рисунками, Список использованной литературы включает 210 источников. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.

Благодарность. Автор пыражаст глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., профессору Дрыгину В.В. за консультативную помощь в процессе выполнения дайной работы. Автор также признателен к.б.н. Колосову С.Н., к.б.н. Рунипой И.А. вет. врачу Колотнлову А.Н., а также Овчинниковой Е.В, Хлебовец З.Б. Зинякову Н.Г. и Брошиной Т.И. за методическую помощь в выполнении отдельных этапов работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы

Вирусы и бактерии. В работе были использованы следующие вирусы и бактерии: MG Rlow, MG S6, MS WVU1853, полученные из американской коллекции штаммов «АТСС» (США); Mycoplasma meleagridis 17529, реовирус птиц SU33, полученные из ФГУ «ВГНКИ» (Москва, Россия); Mycoplasma pneumoniae FH, Mycoplasma agalactiae v.bovis. Mycoplasma ar/hritidis Pg6-clone VII (3), штамм Mycoplasma fermentans PgI8, Ureaplasma urealyticum серотип VIII, Mycoplasma hominis H-34, Acholeplasma laidhnvii var.inocum, полученные из ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (Москва, Россия); Mycoplasma gaUinarum К.3390 и К.5446А, Mycoplasma iowae M95i33 и M9412, предоставленные доктором S. Branton (USDA ARS, США); аденовирус птиц ссротипы 1-12 (Spafas, США); Esherichia coli JM-109 (Promcga, USA), вакцинный штамм вируса болезни Ньюкасла (шт. Ла-сота, ФГУ «ВНИИЗЖ», Россия), вакцинный штамм вируса ИБК (H-I20, ФГУ «ВНИИЗЖ», Россия), вакцинный штамм вируса ИЛТ (шт. «О», ФГУ «ВНИИЗЖ», Россия), Staphylococcus aureus (шт. 6538, АТСС); В работе также использовали полевые изоляты вируса гриппа птиц, МПВП изолятов MG MG250I06, MG200705, MG140905, MG070306, MG030506 и изолят MS MS-V05, выделенные из проб биоматериала ог кур (ФГУ «ВНИИЗЖ», Россия).

Праймсры. Выбор праймеров для дПЦР и дПЦР-РВ осуществляли, анализируя данные литературы и нуклеотидные последовательности генома

v * I

MG и MS из базы данных GenBank. Праймеры синтезировали в научпо-пройзаодствешгой фирме «Синтол» (Москва, Россия).

Куриные эмбрионы. В работе использовали SPF-куриные эмбрионы (КЭ) 9-14 суток инкубации (Lohmann Tierzucht, Германия).

Лабораторные животные. В лабораторных экспериментах использовали не иммунных к MG и MS кур породы белый леггорн в возрасте 10-28 суток, выведенных из SPF-КЭ (Lohmami Tierzucht, Германия).

Патологический материал. Живые и павшие птицы, доставленные на тестирование из 164 птицефабрик РФ и СНГ в течение периода исследования (2005-2008 гг.) в количестве 620 голов.

Материал для исследования. Материалом для исследования в ПЦР служили трахеальные смывы и суспензии паренхиматозных органов птиц.

Реактивы. В работе были использованы реактивы фирм «Promega», «Fermcntans», «Fluka», «Sigma» и отечественные реактивы марки «о.с.ч.»

Иммуноферментный анализ. Образцы сывороток крови or экспериментально зараженных птиц тестировали на наличие антител к МО и MS наборами для ИФА ProFlock (Synbiotics, Франция). Результаты ИФА интерпретировали согласно инструкции производителя.

2.2. Методы

Выделение нуклеиновой кислоты. ДНК выделяли с помощью коммерческого набора БиоКом (Москва, Россия).

Конструирование внутреннего контроля для дПЦР. В качестве внутреннего контроля использовали продукт амплификации фрагмента гена S1 реовируса кур длиной 300 п.н.

Конструирование внутреннего контроля для дПЦР-РВ. Для создания положительного контроля продукт амплификации фрагмента гена S3 реовируса кур кДНК длиной 600 п.н. клонировали в плазмидный вектор pUC18 (Promega, США), следуя прилагаемым инструкциям изготовителя. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса с помощью набора GeneJet (Promega, США). Наличие вставки в клонах подтверждали ссквенированием.

ПЦР. ПЦР проводили в программируемых амплификаторах «Тсрцик» (ДНК-Технология, Москва) и 7500 Real-time PCR (Applied Biosystems, США). Анализ продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.

Определение аналитической чувствительности и специфичности дПЦР и дПЦР-РВ. Аналитическую чувствительность оценивали при использовании 10-кратных разведений геномной ДНК (Ю'-Ю6) MG (Rlow) и

М$ (WVU 1853) с концентрациями Ю5"6 КОЕ/мл и 105 КОЕ/мл, соответственно. Полученные результаты выражали в КОЕ-эквивалснтах/мл.

Для определения аналитической специфичности дПЦР и дПЦР-РВ разработанные методы были протестированы с другими микоплазмами, бактериями и вирусами, которые использовали в исследовании.

Определение диагностической чувствительности и специфичности дПЦР и дПЦР-РВ. Диагностическую специфичность (ДС) оценивали при тестировании образцов от птиц категории БРР (80 голов). ДС оценивали по отношению числа заведомо отрицательных проб, давших отрицательный результат при исследовании тестируемым методом (030) к числу заведомо отрицательных проб при тестировании референтным методом- [30]). В качестве референтного метода использовали ПЦР ОарА и ПЦР 163 для МО и М8. Диагностическую чувствительность (ДЧ) разработанных методов оценивали при тестировании образцов от птиц, присланных на исследование (патологический материал). ДЧ оценивали по отношению числа заведомо положительных проб при исследовании тестируемым методом (ПЗП) к числу заведомо положительных проб при тестировании референтным методом [311]). В качестве референтного метода использовали выделение чистой культуры МО и М8. Диагностическую чувствительность методов ПЦР ОарА для МО и ПЦР 168 для М8 также оценивали при использовании выделения в качестве стандарта для той же группы образцов.

Сравнение результатов дПЦР и дПЦР-РВ с результатами референтных методов выявления МС в ПЦР по гену царЛ (ПЦР СарА) н МЯ по гену 16Э рРНК (ПЦР 168). Два метода ПЦР С.арА для МС. и ПЦР 168 для МБ (Оагаа е( а!., 2005; Ьаиегтап е! а!., 1998) были выбраны как референтные вследствие их специфичности и чувствительности.

Выделение культур МС и Мв. Трахеальные смывы ресуспендировали в среде Фрея и инкубировали при 37° С до изменения окраски. Затем высевали на чашки Петри с агаром. Колонии МО и М5 идентифицировали с помощью методов ПЦР ОарА и ПЦР 168 для МО и МБ.

Методика заражения куриных эмбрионов. Заражение,КЭ проводили по 0,2 мл культуральной суспензии изолята МО на каждый" эмбрион в желточный мешок или аллантоисную полость.

5'*:

Мдс2 (М.даШ$ерЬ*сит)

■3' 5-

Ш(М,$упоиае)

1-3' 5'-: Внутретдай контрольный образец |

А, /

и I

/ Ген БЗ рссвирусэ «уо X

Ген реовируса гур

Рис. 1. Схема расположения праймеров, предназначенных для выявления МБ и М5 в дПЦР и дПЦР-РВ с ВКО Примечания: нумерация показана по последовательности гена mgc2 штамма Мв Шо\у [номер доступа ОепЬапк АУ556228] и МБ у!ИА Тамма \VVIJ 1853 [номер доступа ОепЬапк АМ998371]; для ВКО нумерация показана по последовательности гена БЗ и 81 штамма реовируса птиц 1733 [номер доступа ОепЬапк АР004857], соответственно; для предполагаемых продуктов амплификации указана длина; А - праймеры для дПЦР-РВ; Б - праймеры для дПЦР.

Титрование MG в трахсальной органной культуре (TOIC). Проводили титроваиис культур MG в ТОК по методике Чупиной О.Н. (Чупина и др., 2006).

Определение патогенное! и изолятов MG для восприимчивых животных. Не иммунных к MG и MS цыплят в возрасте 10 суток заражали культуральной суспензией изолятов в дозе 0,5 мл в концентрации 5x10? КОЕ/мл. Из общего объема заражающего материала 2 капли вносили на конъюнктиву, 2 капли - иитраназально, а оставшуюся часть выпаивали. Через 7 и 14 суток у птиц регистрировали патологоанатомичсские изменения и определяли цилиарную активность клеток эпителия трахеи.

Ссквснирование пук.кошдш.и поск'лопзю.н.нопсн изолягов MG. Амплифицированные в ПЦР фрагменты кДНК генов gapA, mgc2, pvpA и межгенного спсйеерного участка изолятов MG очищали с помощью набора "Wizard PCR Preps" (Promega, США). Для определения первичных иуклеотидных последовательностей использовали метод прямого ссквенирования с помощью автоматического сскве1штора"АВ1 Prism 3130" (Applied Biosystems, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Выравнивание иуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы ClustalW пакета программ BioEdit версия 7.0. Построение дендрограмм проводили с помощью программы MEGA 3.1.

Дифференциация выявленных изолятов MG проводилась с использованием опубликованных праймеров по последовательностям геиов-цитадгезииов gapA, mgc2 и pvpA (Garcia et al., 2005; Hnatow et al., 1998; Lui el al., 2001).

Статистический анализ полученных данных. Полученные результаты анализировали с помощью критерия х_квадРат> двустороннего точного критерия Фишера, критерия Манна-Уитни. Полученные значения считали статистически значимыми прир<0,05.

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.3.1. Разработка ПЦР и ПЦР-РВ

Выбор праймеров. Проведен анализ опубликованных иуклеотидных последовательностей генов, кодирующих мембранные цнтадгезины mgc2 MG и vlhA MS. Всего было проанализировано 79 последовательностей участка гена mgc2 и 34 последовательности участка гена vlhA. Были выбраны последовательности праймеров, не содержащие более двух вырожденных

позиций (рис, I). Буквами Гиг обозначены смысловые и антисмыеловые праймеры, соответственно. Обозначения рег и И в названии праймеров соответствовали дПЦР и дПЦР-РВ, соответственно. Специфичность смысловых и антисмысловых праймеров для МО и М5 оценивали экспериментально.

Конструирование внутреннего контрольного образка. Для оценки влияния факторов, снижающих эффективность ПЦР, была предложена система ВКО. Данная система представляет собой гетерологичную ДНК, которую добавляют в определенном количестве в каждую пробу перед выделением, и соответствующую пару праймеров, ограничивающих фрагмент длиной 187 п.н. и 104 п.н. в дПЦР и дПЦР-РВ, соответственно, при сборе смеси ПЦР. При положительном результате амплифицируется кДНК микоплазмы и внутреннего контрольного образца. При отрицательном результате - только кДНК ВКО. При ложноотрицательном результате матрица кДНК ВКО не амплифицируется.

Определение аналитической чувствительности дПЦР.

Аналитическую чувствительность дПЦР оценивали с помощью панели 10-кратных разведений геномной ДИК Мв штамма Б6 и МБ штамма \VVlj 1853, полученных из культур с концентрацией 1x105 КОЕ/мл каждая (рис. 2).

ШИПЯ

MS 105 104 W5 10г 10 1 ОК М МС. 10* 104 К)' 10г 10 I ок м MG-const (10") MS-const <104)

Рис. 2. Результаты тестирования аналитической чувствительности дПЦР используя 10-кратные разведения выделенной ДНК культуральиых препаратов MG и MS

Условные обозначении: М - маркер «GeneRuler-IOObp DNA ladder plus» (Fcrmentas, США) с диапазоном фракции 100-3000 п.н., ОК- отрицательный контроль

Для оценки возможности дПЦР выявлять ДНК МО или МБ, которая находится в меньшей относительной концентрации, были протестированы разведения ДНК одной микоплазмы (Ю4 - 101 КОЕ/мл) при постоянной концентрации геномной ДНК другой микоплазмы (104 КОЕ/мл). Получены

одинаковые результаты по чувствительности, как без матрицы другой микоплазмы, так и в сё присутствии. Было также установлено, что увеличение концентрации ВКО до значений, на 4 порядка превышающих значения концентрации искомой матрицы микоплазмы, не влияло на аналитическую чувствительность выявления. Полученные результаты показали чувствительность тест-системы дПЦР, равную 100 КОЕ-оквивалентов/мл для MG и MS при использовании геномной ДНК в качестве стандарта.

Определение аналитической чувствительности дПЦР-РВ. Значение Ст (threshold cycle) выражает нецелочисленное значение цикла, на котором количество искомой матрицы в процессе амплификации достигает минимального регистрируемого порогового значения. Для оценки эффективности и линейности было проведено 3 повторных эксперимента. В процессе реакции сигнал флуоресцентного красителя (FAM для MG, VIC для MS и TAMRA для ВКО) был нормализован к сигналу референтного красителя ROX. Все значения Ст определялись только у тех флуоресцентных сигналов, которые превышали уровень фона флуоресценции и имели вид экспоненциальных кривых. Пробы считались отрицательными, если эмиссия красителя не превышала флуоресцентного шума. Чувствительность или предел чувствительности оценивали с помощью панели 10-кратных разведений геномной ДНК штамма MG S6 и MS WVU 1853 с концентрацией 7x106 КОЕ/мл и 1х105 КОЕ/мл, соответственно.

Максимальное разведение, давшее положительный результат, составило 1:106 и 1:105 для MG и MS, соответственно. Предел чувствительности составил 7 КОЕ-экв/мл для MG и 1 КОЕ-экв/мл для MS при использовании геномной ДНК в качестве стандарта. Проводили также тестирование чувствительности метода в смеси геномной ДНК MG и MS при различных относительных концентрациях. Разница в относительной концентрации геномной ДНК другой матрицы составляла от 1 до Зх порядков. Чувствительность реакции осталась без изменения для ДНК, которая присутствовала в меньшей относительной концентрации. Было также установлено, что увеличение концентрации ВКО до значений, на 4 порядка превышающих значения концентрации искомой матрицы микоплазмы, на чувствительность выявления не влияло.

С помощью средних значений Сг, была получена линейная регрессия зависимости числа циклов ПЦР от разведения в трёх повторностях для N40 и МЭ, соответственно (рис. 3 п 4).

Рис. 3. Линейность результатов дПЦР-РВ при тестировании 10-кратных разведений выделенной ДНК культуральных препаратов Мб и М8 (слева для МС, справа - для Мв)

Таблица 1

Аналитическая чувствительность дПЦР-РВ для МС

Разведение геномной ДНК МО Среднее значение С-г' ■ ■ Б" г :

10 1 20,33 + 0,16

ю-' 23,66 + 0,07

ю-3 27,03 + 0,03

ю-4 30,60 + 0,06

ю-5 33,81 + 0,39

10" 37,55 | 0,53

ю-' .1 -

Примечания: - среднее значение цикла для построения линейной регрессии; 2- Б- стандартное отклонение;3"-" - отрицательный результат.

Подставляя коэффициенты наклона в формулу расчета эффективности амплификации, получена эффективность амплификации (Б) 95,43% и 93,82% для МО и МБ, соответственно, которая показывает количество полученных копий на единицу матрицы за 1 цикл.

Воспроизводимость определяли с помощью величины стандартного отклонения (8) для каждого разведения, используя значения Ст, полученные в трёх повторностях. Стандартное отклонение 8 варьировало от 0,036 до 0,53 и от 0,095 до 0,93 для Мв и М8, соответственно (табл. 1 и 2).

Таблица 2

Аналитическая чувствительность дПЦР-РВ для MS

Разведение геномной ДНК MS Среднее значение Cr1 S>

10" 24,27 i 0,93

10"J 27,56 + 0,09

ю-1 30,26 ±0,12

10"4 33,88 ±0,12

38,36 1 0,74

10" -

10 " - -

- S-стандартное отклонение;

отрицательный результат.

Определение аналитической специфичности дПЦР и дПЦР-РВ. При

тестировании разработанных систем ПЦР на культуральиых пробах референтных штаммов МО Э6 и М8 \VVLJ 1853 были получены специфические продукты амплификации ожидаемой величины (рис. 5).

А М

MS 372 л.и.

ВКО 187 п.н. ***-MG 130 п.н.

MG MS ВКО

tim. iem mm ъта 94 102 104 фрагмент п.н.

Рис. 5. Элскгрофорсграммы ПЦР-иродуктов разработанных методов ПЦР Условные обозначения:

М - маркер «OeneRuler-lOObp DNA ladder plus» (Fermentas, США) с диапазоном фракций 100-3000 п.н.; А - метод дПЦР: продукты дПЦР (сверху вниз): MS-372 п.н., ВКО-187 пл., MG-130 пл.; Б - метод дПЦР-РВ: продукты дПЦР-РВ (слева направо): MG-94 п.н, MS-102 пл., ВКО 104 п.н.

Специфичность была также проверена при тестировании методов дПЦР и ДПЦР-РВ с нуклеиновой кислотой (НК) вирусов и бактерий, используемых в исследовании. При анализе оба метода были способны специфично выявлять МО и М8 без ложноположительных результатов. Для подтверждения полученных результатов было протестировано 5 групп смесей, состоящих из НК микроорганизмов, используемых в исследовании в различных комбинациях

(табл. 3). Результаты, полученные с помощью лПЦР и дПЦР-РВ, при оценке специфичности были подтверждены методами Г1ЦР ОарА и 11ЦР 16Б в 100% случаев.

Таблица 3

Результаты оценки аналитической специфичности дПЦР и дПЦР-РВ

Группа дПЦРд дГЩР-РВ"

Мв М8 МОМБ

ДНК штаммов МОА +

ДНК штаммов -1- +

ДНК штаммов МО и МЭ + + + +

ПК микроорганизмов, за исключением штаммов МО и Мв" - -

ПК всех микроорганизмов + + + +

Примечания: А - все штаммы МО (4 штамма), используемые в исследовании; Б - ДНК штамма МЭ и полевог о изолята МБ, используемых в исследовании; В - все микроорганизмы, используемые в исследовании, за исключением МО и МЭ; Г- все микроорганизмы, используемые в исследовании; Д- результаты получены одновременно.

Определение диагностической специфичности разработанных методов дПЦР и дПЦР-РВ. Для определения ДС использовали интакгных птиц породы белый леггорн, серонегативных к МО и МБ (Г руппа А), в возрасте 6 недель в количестве 80 голов. Все трахеальиые смывы, отобранные па 6 неделе, были отрицательны в дПЦР и дПЦР-РВ, а также в Г1ЦР ОарА и Г1ЦР 16Б для МО и МБ. Таким образом, ДС для дНЦР и дПЦР-РВ при использовании ПЦР ОарА и ПЦР 16Э в качестве стандарта составила 100%. Все трахеальиые смывы, отобранные на 12 неделе от той же группы птиц, были отрицательны в дПЦР и дПЦР-РВ, а также в ПЦР ОарА и ПЦР 168 для МО и М$.

2.3.2. Выявление МС и М8 у экспериментально заряженных птиц.

Для экспериментального заражения было сформировано 3 группы птиц (Б, В и Г). Группа Б состояла из 40 птиц породы белый леггорн, серонегативных к Мй и МБ, в возрасте 4 недель, которые были распределены в 2 группы по 29 птиц и отрицательного контроля (10 птиц). Птиц заражали культуралыюй суспензией МО Я1о\у общим объемом 0,5 мл на птицу с концентрацией 106 КОЕ/мл интраназалыю и перорально. Группа В состояла из 40 птиц породы белый леггорн, серонегативных к МО и М?, в возрасте 4 недель, которые были распределены в 2 группы по 20 птиц и контрольной группы (10 птиц). Птиц

экспериментальных групп заражали культуральной суспензией МЭ (изолят М8_У05) общим объемом 0,5 мл на птицу с концентрацией Ю1 КОИ/мл пнтраназально и перорально. Группа Г состояла из 40 птиц породы белый леггорн, ссронегативных к МО и МБ в возрасте 4 недель, которые были распределены в 2 группы по 20 птиц и контрольной группы (10 птиц). Птиц экспериментальных групп заражали культуральной суспензией МБ Шо\у общим объемом культурального препарата 0,5 мл с концентрацией 10" КОЕ/мл и культурой МК (изолят МЯ_У05) общим объемом 0,5 мл с концентрацией 105 КОЕ/мл пнтраназально и пероралыю (табл. 4).

Таблица 4

Выявление MG и MS и антител с помощью дПЦР, дПЦР-РВ и ИФД, соответственно, до заражения и на 14 день после заражения

Группа До заражения Па 14 день после заражения До заражения На 14 день после заражения

дПЦР-РВ н дПЦР дПЦР-РВ и дПЦР ИФА ИФЛ

MG MS MG MS MG MS MG MS

Б (зараженные только MG) 0/40д 0/40 40/40 0/40 0/40 0/40 25/40 0/40

В (зараженные только MS) 0/40 0/40 0/40 40/40 0/40 0/40 0/40 19/40

Г (зараженные MG+MS) 0/40 0/40 40/40ь 40/40'' 0/40 0/40 23/40 18/40

Примечания: - в числителе указано количество положительных, в знаменателе -количество исследованных проб; 6 - результаты на МО и М5 получены одновременно.

До инокуляции и па 14 день после инокуляции у птиц брали трахеальные смывы стерильными, предварительно увлажненными ватными аппликаторами согласно общепринятой процедуре; отбирали кровь и готовили сыворотки для тестирования на антитела против MG и MS. На 14 день после заражения положительные результаты ИФА были зарегистрированы больше, чем в 50% проб (табл. 4). До заражения все пробы, которые анализировали с помощью методов ПЦР (дПЦР, дПЦР-РВ, ПЦР GapA и ПЦР 16S), были отрицательны. На 14 день после заражения, с помощью разработанных методов ПЦР (дПЦР и дПЦР-РВ) выявляли MG и MS как отдельно, так и одновременно: в группе Б 100% трахеальных смывов были положительны только па MG; в группе В 100% трахеальных смывов

были положительны только на МБ; в группе Г 100% трахеальных смывов были одновременно положительны на МО и МЯ (табл. 4).

Ни НЦР, чи ИФА не выявляла МО или антитела к Мб, соответственно, у птиц, зараженных только МБ. Ни ПЦР, ни ИФА не выявляли МБ или антитела к МБ, соответственно, у птиц, зараженных только МО. Все пробы от птиц контрольной группы были отрицательны в дПЦР и дПЦР-РВ. Корреляция результатов ПЦР варА и ПЦР 165 для Мб и М5 с дПЦР-РВ и дПЦР при тестировании проб от экспериментально зараженных птиц составила 100%.

2.3.3. Результаты выявления МС и Мв методами ПЦР (дПЦР, дПЦР-РВ, ПЦР СарА н ПЦР 168 для МС и М8) и выделением чистой культуры из патологического материала. Результаты выделения и ПЦР (дПЦР, дПЦР-РВ ПЦР СарА и ПЦР 165) представлены на рис. 6. Из 620 образцов, отобранных ог птиц из 164 птицефабрик, 35 образцов были положительны только на МС! в дПЦР, дПЦР-РВ и ПЦР СарА; 55 образцов были положительны только па М8 в л ПЦР, дПЦР-РВ п ПЦР 165. Одновременно положительны на МО и МЭ были 30 образцов как в дПЦР, так и в дПЦР-РВ. Из вышеуказанных положительных в дПЦР и дПЦР-РВ проб при выделении были положительны 16 и 21 проба на МО и МБ, соответственно, тогда как 83 образца были отрицательны. Два образца были положительны на Мб в дПЦР-РВ и отрицательны в дПЦР и ПЦР СарА, однако выделение чистой культуры МО было положительно только в одном из двух образцов. Три образка были положительны на МБ в дПЦР-РВ и отрицательны в дПЦР и ПЦР 168. Выделение чистой культуры М5 было положительно в двух образцах. Не выявлено проб, которые были отрицательны в дПЦР-РВ н/или дПЦР, по положительны в ПЦР СарА и ПЦР 16Б для МО и М5. Отрицательными в дПЦР, дПЦР-РВ и ПЦР СарА и ПЦР 165 для МО и М5 были 495 проб, из которых 1 проба была положительна при выделении на МО и 1 проба - на МБ. Всего 493 пробы были отрицательны при выделении МО и М5>. При использовании выделения МО и М5 в качестве стандарта ДЧ лля дПЦР-РВ, лПЦР и ПЦР СарА для МО составила 0,94, 0,88 и 0,88, соответственно. ДЧ для дПЦР-РВ, дПЦР и ПЦР 16Б для МБ составила 0,96, 0,У7 и 0,Н7 соответственно.

| ТО

£ 50

§ 40

Ш ПЦРОарА Н аыделекие М<3- -ПЦР165 .

' ' аыдвлелие М5

дНЦР-РВ -

лНПР-

ДШЦМ'В <-л11ЦР-

дПШ'-РВ-

д/ЩР-РВ.

«ПЦР-

Рис. 6. Результаты сравнительного исследования проб патологического материала от птиц из птицефабрик методами дПЦР-РВ, дПЦР, ПЦР СарА и ПЦР 168 для МС и >18 и выделением МО и МБ1

Примечания: на рисунке а каждой колонке указаны положительные результаты, полученные методами ПЦР, и результаты выделения из тех же образцов. Числа над каждым столбиком показывают количество положительных результатов, полученных разными методами. Результаты дПЦР с ПЦР ОарА и ПЦР 163 совпадали в 100% случаев, соответственно.

При сравнении друг' с другом результаты дПЦР-РВ и ПЦР ОарА для МО совпадали в 97% случаев, а результаты дПЦР-РВ и ПЦР 168 для МБ - в 96,6% случаев. При сравнении друг с другом результатов дЦЦР с ПЦР ОарА и ПЦР 16Б для МО и М8 отмечали 100% совпадение. Таким образом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что разработанный метод дПЦР не уступал по чувствительности и специфичности стандартным методам ПЦР варА и ПЦР 165, а дПЦР-РВ превосходил их.

При исследовании 620 проб патологического материала (трахеальные смывы и суспензии внутренних органов), поступившего из 164 птицефабрик, МО выявляли в пробах из 19 птицефабрик (11,5% п/ф), а МЭ - в 34 птицефабриках (20,7% п/ф). Положительными на обе микоплазмы были пробы из 28 птицефабрик (17% п/ф) (р<0,01). Таким образом, с помощью ПЦР выявили МО и М8 в пробах от птиц из 29% и 38% птицефабрик, соответственно. Доля птицефабрик, в пробах от птиц из которых выявляли МО и/или Мв, показана на рис. 7.

1 Работа выполнена совместно с Кодотиловым А.11

40 35

I 30

§ 25 | 20

1 15 г? 10 5 о

п = 164 29 38

Рис. 7. Результаты исследования проб из птицефабрик па МО и МБ Примечания: п - число птицефабрик, приславших птиц для анализа; числа над каждым столбиком показывают процент птицефабрик: серый - птицефабрики, где выявляли только МБ; черный - птицефабрики, где выявляли только МО; белый — птицефабрики, где выявляли одновременно Мв и МБ.

2.3.4. Выявление МС и VI8 в пробах от птиц с ассоциированными вирусными инфекциями (инфекционного бронхита кур, ларинготрахеита, метапневмовирусной и реовирусной инфекций). При исследовании проб от птиц в 67 положительных пробах на МО ассоциированные вирусные агенты (вирус инфекционного бронхита, реовирус, вирус инфекционного ларинготрахеита кур и метапневмовирус) выявляли в 27 пробах (40% проб): наиболее часто выявляли вирус инфекционного бронхита (13 проб), а пневмовирус и ИЛТ - в 5 и 9 пробах, соответственно. Результаты выявления МО в комбинациях с вышеуказанными патогенами представлены в табл. 5. Результаты выявления данных патогенов по возрастам в МО-положительных пробах представлены на рис. 8.

до 45 дней 50-150 дней 151 день и больше

Рис. 8. Выявление МО и вирусов И Б К, МПВП и ИЛТ в [Неположительных пробах по возрастным группам2 Примечапие: п - число исследованных проб для каждой возрастной группы.

3 - Работа выполнена совместно с Овчинниковой Е.В., Хлебовец З.Б., Ерошиной Т.И.

У бройлеров до 45 суток наиболее часто регистрировали вирус И15К (I I проб), вирус ИЛТ и МПВП регистрировали в 4 и 2 пробах, соответственно. У птиц в возрасте от 46 до 151 дня вирус ИЛТ не обнаруживали, а вирус ИЬК и МПВП выявляли в 1 и 3 пробах, соответственно. У несушек старше 151 дня вирус МПВП не выявляли, а вирус ИБК и ИЛТ регистрировали в 1 и 5 пробах, соответственно. МО наиболее часто выявляли в пробах от бройлеров 33-45 суточного возраста (36 проб) и несушек старше 151 дня (27 проб). МО в пробах от птиц возрастной группы от 50 до 150 дней выявляли только в 4 пробах (рис. 8).

МБ наиболее часто выявляли в пробах от несушек старше 151 дня (48 проб) и бройлеров (34 пробы) (рис. 9). МБ в пробах от птиц возрастной группы от 50 до 150 дней выявляли только в 6 пробах. В 88 положительных пробах на МЯ рсовирус кур выявили в 17 пробах (19% проб) (табл. 5).

Таблица 5

Дифференциация микоплазмозов от вирусных иифекций кур

Тип заражения Выявление патогенов

Только МО 43

МО + ИВК 10

МО + ИЛТ 7

МО + МПВП 3

Только М5 7!

М5 + реовирус 17

Примечание:*- количество положительных проб из 620 исследованных.

з?

I | & 20 § о Ю 5 й о

п=292 __„„.,

__._ЕЗШШШ&_-_____

до 45 дней

50-150 дней

151 день и больше

■ реовирус

Рис. 9. Выявление МБ и реовируса в МБ-иоложитсльных пробах по возрастным группам1

Примечание: п - число исследованных проб для каждой возрастной группы.

1 - Рабств ньпюлнеш совместное Зиняковым 11.1

Для 87% исследованных проб вышеперечисленные патогены выявлены не были. Заболевания у данных птиц могли быть вызваны Escherichia coli, Ornithobacterium rh'motracheale, вирусом болезни Ньюкасла и т.д. или другими причинами.

2.3.5. Ингибироваиис ВКО. При исследовании проб патологического материала, особенно суспензий внутренних органов от павших птиц, в течение периода исследования при помощи тест-систем (ПЦР и ПЦР-РВ) с ВКО, было выявлено 12 случаев (2% исследованных проб), в которых амплификации матрицы ВКО не наблюдали. Это не выходит за пределы ожидаемой частоты ложноотрицательных результатов - от 1 до 18 % от общего количества проб при исследовании с помощью ПЦР (Rosenstraus et al., 1998). Несмотря на разнообразие причин, приводящих к подавлению амплификации ВКО и специфической матрицы, мы применили следующий подход для удаления ПЦР-ингибиторов из пробы: инкубация 24 ч выделенной пробы при 4° С и последующее 10-кратное разведение буфером или использование альтернативного метода выделения ДНК с магнитными частицами (Блоком, Москва). Среди повторно исследованных проб после разведения ингибирование ПЦР не отмечали, а среди вновь анализируемых проб была выявлена проба положительная на MG и MS и одна проба - на МО. При использовании метода с магнитными частицами (без разведения) ингибирование ПЦР в этих же пробах было зарегистрировано в 4 из 12 образцах. Однако этот метод менее предпочтителен из-за более низкой чувствительности (данные не представлены).

2.3.6. Оценка гибели куриных эмбрионов при заражении изолятамн MG. Выбор изолятов для исследования осуществлялся по двум критериям: ростовым свойствам и филогенетическому положению. Было выбрано пять изолятов (MG250106, MG070306, MG140905 и MG200705, MG030506). Для заражения использовали 16 КЭ 6-7-днсвного возраста для введения культуралыюй суспензии инфекционного агента (0,2 мл) в желточный мешок и 16 КЭ 9-10-дневного возраста при инокуляции материала (0,2 мл) в аллантоисную полость. При вскрытии эмбрионов, погибших через 48 ч после заражения и позднее, обнаруживали диспропорцию и отставание в развитии зародыша, кровоизлияния в подкожной клетчатке головы, на теле и конечностях, застойные изменения в легких, отеки и кровоизлияния в

околоплодных оболочках. В результате заражения эмбрионов в желточный мешок или аллоптоиеную полость были получены результаты, представленные в табл. 6.

Таблица 6

Гибель куриных эмбрионов после заражения нзолитамн MG

Изолят МО Метод заражения Результат в дПЦР

в желточный мешок в аллантоисную полость

MG MS

MG250106 15/16а 5/16 + -

MG200705 16/16 5/16 + -

MGI40905 13/16 16/16 + -

MG штамм «S6» 12/16 4 16 . , -

MG070306 13/16 1/16 + -

MG штамм Rlow 16/16 16/16 + -

MG030506 12/16 1/16 + -

Контроль 0/16 0/16 ' - -

Примечание: А - в числителе указано количество погибших эмбрионов, в знаменателе--количество зараженных4.

Установлено, что гибель эмбрионов была значительно выше при инокуляции изолятов в желточный мешок, чем при заражении в аллантоисную полость, за исключением изолята М0140905. Наличие соответствующих микоплазм в патологическом материале от погибших КЭ и цыплят было показано в Г1ЦР.

При сравнении результатов заражения КЭ установлено, что гибель эмбрионов при инокуляции изолятов МС140905, N10070306, МС070306 и М0030506 в желточный мешок составила от 75 до 81%, а М0250106, МС200705 и для штамма Шош - 94-100%. При заражении в аллантоисную полость 100% гибель КЭ наблюдали только для изолята МО 140905 и высокопагогешюго штамма Шо\у.

С целыо дифференциальной диагностики с помощью Г1ЦР было исключено наличие в пробах от зараженных эмбрионов возбудителей инфекционного ларииготрахеита и инфекционного бронхита кур, вируса болезни Ньюкасла и метапневмовируса.

2.3.7. Изучение свойств изолятов МО с использованием трахсальной органной культуры. Оценку патогенное™ изолятов МО проводили с

- работа ныиолненп ешшесшо с Колотилоным A.1I.

использованием трахеальных органных культур. Для исследования использовали культуральные препараты референтных штаммов MG S6 и Rlow и изогатов MG250106, MG070306, MG030506, MG140905 и MG200705. ТОК готовили и поддерживали в жизнеспособном состоянии согласно методике (Чупина и др., 2006) с некоторыми модификациями. Титрование культур MG проводили в ТОК, приготовленной из эмбрионов кур категории SPF сроком инкубации 21 сутки. Титрование проводили с десятикратным разведением и заражающей дозой 0,2 мл. Титр инфекционной активности исследованных образцов был рассчитан в дозах, вызывающих пилиостаз в половине зараженных культур (lg С05(>/мл) (табл. 7).

Таблица 7

Титр инфекционной активности изолятов MG (п=10)

Изолят MG Цилиостатическая доза

(lg CDWmji)

MG250I06 6,83+0,7А,,б

MG070306 4,55+1,2,

MG030506 4,20+0,3,

MG200705 4,0±0,1»

MG140905 7,1610,1 г,

Штамм Rlow (контроль) 7,23+0,35

Штамм S6 5,36+1,0»

Примечания: А - среднее значение + стандартное отклонение; В - значения в пределах колонки с разными строчными буквами являются статистически значимыми (р<0,05)\

Результаты проведенных исследований показали, что только изоляты МО 140905 и М0250106 показали активность, сходную с активностью высокопатогенного штамма Шо>у (¡)<0,05).

2.3.8. Определение патогенности изолятов МО для восприимчивых птиц. По 10 не иммунных цыплят к МО и МБ в возрасте 10-20 суток заражали культуральной суспензией изолятов МС250106, МС070306, МС030506, М0200705, МО 140905 и штамма в дозе 0,5 мл. Материал содержал 500 СО50/мл. Из общего объема4 заражающего материала 2 капли вносили на конъюнктиву глаз, 2 капли - интраназально, а оставшуюся часть выпаивали. Для каждой птицы индивидуально и для каждой группы определяли среднюю ЦА трахеи в баллах согласно методике Чупиной О.Н. (Чупина и др., 2006). При вскрытии нтрц через 14 суток после заражения изолятами М0250106,

- работ слслана совместно с Руниной II. А.

МС070306, МС030506, МС200705 отмечали только трахеиты. ' У тип, зараженных штаммом Шо\у и изолятом М0140905 на 7 и 14 сутки после заражения выявляли синуситы, аэросаккулиты и очаговую пневмонию. Цклнарная активность эпителия трахеи птиц, зараженных изолятами МО, представлена в табл. 8.

Таблица 8

Цилиарпая активность трахеи цыплят, зараженных нзолятамн МО

И юлят Мв Средняя цилиарпая активность тозхеи

7 суток после заражения 14 суток после заражения (н=5)

МС250Ю6 1,8+0,44аль . 2,11 +0,44„АЬ

М0070306 2,1 Ю,44я 3,0+0,33«

М0030506 1,7+0,33, 3,66+0,44»

М0200705 1,9+0,11. 3,0+0,22в ■

МО 40905 0,5+0,218 1,Ю+0,22Г "

Штамм Шо\у 0, 0,33+0,44,

Контроль 3,8+0,33г 3,78+0,35,

Примечание: А - среднее значение + стандартное отклонение; Б - значения в пределах колонки с разными строчными буквами являются статистически значимыми (/)< 0,05)'\

Изучение патогенное™ изолятов на живых гест-системах показало, что наиболее патогенным среди изученных российских изолятов является изолят М0140905 (¡1<0,05). Данный изолят показал наибольшую цилиостатическую активность.

2.4. Анализ нуклеотндных последовательное гей выявленных изолятов МС. Основной целыо изучения нуклеотндных последовательностей генов был анализ возможных филогенетических связей изолятов МС, выявленных па территории РФ.

Нуклсотидные последовательности фрагментов генов £арА, т§с2 и рурА были получены только для 26 полевых изолятов, включая всс выделенные в чистой культуре. Невозможность провести анализ по всем трем генам остальных изолятов, по-видимому, была обусловлена разной чувствительностью данных ПЦР, т.к. анализировали пробы без предварительного культивирования. Анализ участков генов-нитадгезинов §арА, т%с2 и рурЛ показал, что большинство : российских изолятов группируется отдельно от референтных штаммов.

'' ~ работа сделана совместно с Руинной И.А.

рурА 301-407 п.н

mgc2 184 - 252 п.н

ЯарА 247 н.н

М0161008 Мв120208 МС3130807

г?-""Л л».

М<33005С5 М30607С5 М3140308Ь МЫ403С7

ЛЯЗ£?90"Г07 М(3250Ю6 М 0040408 МО200407 М <3280405 М314030ВЯ Мв040805

К3839НР&4 К2Ю1СК84 \1G080508 Мв310807 чивООВЗ КЗ&Ч4ТК95 КА593НРЭ8 АиЭ7019 1э11

К4931ТКОО НР51

К51090СК01

\MG-140905

'К3020ТК90

- А5969

М0030506

• ге

......* К703

| К503

— К730

- магоо7оз

з г— ■■ М0070306

М Iувэг

'- — —■ ""''.} М<5100305 ^ МС31 10407

-Л«;* 11105 магвобов

КЮ 300505

мвюозоз

Л90040408 •4 М0040805 „Г МО200705 1- МС280405 х МЫ 10407 Мв130807 М&120208 МвОГО 306 МС070607 МО140г07 М&090107 М<3 О305О6 МСЧ 40308а

мсгбоюб

М0200407 «6050705

- М0260С08

— МОИТГОБ Мв151008

мвозюов г Ма140308Ь

МвЗЮ807 КЭ344ТК95 К3020ТК90 Э6

маозо$о8 мыао 905

, К4931ГК00 .1 К4&93ЯРЭ8 (ИРЭ'!

К3039НРЭ4 г Р

Аи9?019 V- А5969 .} К5Ю95СК01

1 Аив00£3 К2101С К84

Мв070607

меозюов ме-мозовэ

N43200407

Ма140308Ь Мв040806

¡КГ30 ЙК703 >К603

1 А5969 I М0030506

К51 09ВСК01 КД931ТК00 АиЗООвЗ " Аи97019 К394ЛТК95

МС530050И Мв110407 метюе

Рис. 10. Дендрограмма, отражающая нуклеотидные отличия Мв, построена с помощью алгоритма Ш на основе опубликованных и полученных в нашем исследовании последовательностей (обозначены жирным шрифтом и курсивом) генов-цитадгезинов Мв

Примечание: над рисунком указан ген и длина анализируемого участка.

Всего тринадцать изолятов группировались вместе по всем 3 последовательностям. Установлено, что по последовательности .гена %арА для российских изолятов характерны точечные замены в четырех позициях: 122, 129, 171 и 174, отсутствующие у других штаммов. По гену российские изоляты отличаются вставкой (три нуклеотида) в позициях с 584 по 586. По гену рхрА изоляты отличались точечными заменами в ;позипиях 120 и 270, отсутствующими у других штаммов, а для изолятоа МО 140905, МО 140307, М0040408, М0080508 и МО310807 были свойственны делеции от: 59 до 108 нуклеотидов в позициях с 187 по 326. Дендрограммы представлены на.рис. 10. Показано, что патогенный российский изолят М0140905 по последовательностям генов %с\рЛ и пщс2 был на 100% и 98% идентичен соответствующим участкам высокопатогенного штамма я1о\у. Изоляты МОЗ10807 и МС080508, выделенные из одного птицеводческого хозяйства, группируются вместе по последовательностям re.ua. gapA с вакцинным штаммом 1511, тогда как по гену тцс2 они входят в группу российских изолятов. Уровень отличий между 26 изолятами по участкам %арЛ, пщс2 и ргрА не превышал 3,6%, 12% и 7%, соответственно. При исследовании проб, поступавших из одной и той же птицефабрики в течение 2-3 лет, выявляли разные изоляты МО в разное время. Наибольшее количество (по 4 изолята) было выявлено в пробах из птицефабрик Тульской и Самарской областей.

Но гену gapA в первом случае выявленные изоляты не формировали обшей группы, а были распределены в три разные группы с уровнем отличий до 2,5%, а из птицефабрики Самарской области изоляты формировали одну гспстичсскую группу с уровнем отличий до 0,5%. Подобная гетерогенность изолятов МО, возможно, связана с наличием нескольких близкородственных изолятов, циркулирующих на данной птицефабрике, или заносом изолятов при смене племрепродуктора при поставках молодняка,

3. ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы дПЦР и дПЦР-РЕ$ с использованием ВКО для выявления МО и МБ в пробах от птиц с респираторным комплексом. Показано, что разработанные методы обладают высокой чувствительностью

и специфичностью. Чувствительность ПЦР составила 100 КОЕ-экв/мл для MG и MS, а ПЦР-РВ - 7 КОЕ-экв/мл и 1 КОЕ-экв/мл для MG и MS, соответственно.

2. При исследовании 620 проб патологического материгша из 164 птицефабрик в период с 2005 по 2008 гг. было выявлено 67 изолятов MG из 47 птицефабрик (29%) и 88 изолятов MS из 62 птицефабрик (38%), из которых 30 проб из 28 птицефабрик (17%) были одновременно положительны на MG и MS (р<0,05).

3. При анализе встречаемости вирусов ИБК, Hi IT, М11ВП и реовируса показано, что MG и MS ассоциированы с данными вирусами в 40% (р<0,01) и 19% (р<0,01) случаев, соответственно.

4. Методом секвенирования определены участки последовательностей генов gapA, mgc2 и pvpA 26 изолятов MG. Показано, что большинство выявленных изолятов MG генетически отличаются от референтных штаммов и формируют отдельную филогенетическую группу.

5. В результате экспериментального заражения куриных эмбрионов, трахеальных органных культур и естественно-восприимчивых животных 5 изолятами MG: MG250106, MG070306, MG030506, MG200705 и MG140905, установлено, что наиболее патогенным среди изучаемых российских изолятов является изолят MG140905 (р<0,05), который генетически близок к высокопатогенному штамму Rlow по последовательностям генов gapA и mgc2.

¿ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Практическая значимость. Для практического использования предлагаются одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методики:

- «Методика выявления генома Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae с использованием подимеразной цепной реакции в формате мультиплскс»;

- «Методика выявления и .количественного анализа Mycoplasma galliseplicum и Mycoplasma synoviae с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с внутренним контрольным образцом».

5. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Подбор условий для выделения полевых изолятов возбудителен микоплазмозов птиц от больных птиц и из проб патологического материала / И.А. Рушша, М.И. Сорокина, М.Ю. Волков, А.Н. Коло+илов, Д.Б. Андрейчук, A.B. Спрыгни, Т.Ю. Черняева, В.В. Дрыгин, В.Н.'Ирза, Н.С. Мудрак // 2-й Междунар. вет. конгр. по птицеводству. - М., 2006. - С.89-92.

2. Изучение распространения M.gallisepticum и M.synoviae в 'птицеводческих хозяйствах на территории РФ с помощью ИФА и методов генетического анализа/ Д.Б. Андрейчук, A.B. Спрыгни, Т.В. Оковытая, М.С. Волков, А.Н. Колотилов, В.Н. Ирза, В.В. Дрыгин // 2-й Междунар. вст. конгр. по птицеводству. - М., 2006. - С.92-95.

3. Метод дуплекс-ПЦР с внутренним контрольным образцом для выявления генома M.gallisepticum и M.synoviae в биологических пробах'''/ Д. Б. Андрейчук, A.B. Спрыгни, И.А. Рунина, М.С. Волков, В.Н. Ирза, В.В. Дрыгин // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир,

2007. - Т. 5. - С. 325-336.

4. Оценка иммунобиологических свойств изолятов M.gallisepticum с использованием трахеальных органных культур / И.А. Рунина, O.A. Чупина, М.И. Сорокина, Д.Б. Андрейчук, A.B. Спрыгин, Т.Ю. Черняева, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 353-360.

5. Метод дуплекс-ПЦР с внутренним контрольным образцом для выявления генома M.gallisepticum и M.synoviae/ Д. Б. Андрейчук, A.B. Спрыгин, И.А. Рунина, М.С. Волков, В.Н. Ирза, В.В. Дрыгин // БИО. - 2008.№ 1-2. - С. 56. ■■ ' " h'""r

6. Оценка иммунобиологических свойств изолятов M.gallisepticum с использованием трахеальных органных культур / И.А. Рунина, Д.Б. Андрейчук, A.B. Спрыгин, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза // Вст. патология. - 2007. - № 4(23). - С. 171-174.

7. Оценка эффективности использования облучателя-рециркулятора воздуха ультрафиолетового бактерицидного ОРУБ-О! "КРОНТ" при работе с возбудителями микоплазмозов птиц: научное издание / И.А. Рунина, A.B. Спрыгин, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин. II Птах1вництво: матер. 7-й Укр. конф. - м. Алушта, АР Крим, 2006. - Вып. 58. - С. 1451-1453.

8. ПЦР в режиме реального времени с внутренним контрольным образцом для выявления и количественного анализа M.gallisepticum и M.synoviae! A.B. Спрыгин, Д.Б. Андрейчук, В.В. Дрыгин, H.A. Перевозчикова II Рос. вет. журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ "ВНИИЗЖ". -

2008. - Септ. - С. 90-93.

9. Генетическое типирование изолятов M.gallisepticum, выявленных на птицеводческих хозяйствах РФ в течение 2005-2007 гг. по

последовательности 16S-23S рРНК межгенного спейсерного участка / Л.В. Спрыгни, Д.Б. Андрейчук, М.С. Волков, А.Н. Колотидов, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Вет. медицина: мЬквщ. тем. наук. зб. - Харкт, 2008. - Вип. 91. - С.449-453.

10. Применение ПЦР в формате дуплекс в птицеводстве для выявления изолятов M.gallisepticum и M.synoviae в полевых образцах, поступивших из разных регионов РФ в 2005-2008 гг. / А.В. Спрыгин, Д.Б. Андрейчук, Н.С. Мудрак, В.Н. Ирза, В.В. Дрыгин // Актуал. пробл. соврем, птиц-ва; матер. 9-й Украинской конф. по птиц-ву с междунар. участием. - Алушта, 2008. - С. 182-189.

11. Multiplex PCR with internal control for detection of M.gallisepticum и M.synoviae genomes / D.B. Andreychuk, A.V. Sprygin, l.A. Runina, M.S. Volkov, V.N. Irza, V.V. Drygin // 15th World Veterinary Poultry Congress: Abstract Book. - Beijing, China, 2007. - P. 531.

12. Spread of M.gallisepticum и M.synoviae on poultry farms in the territory of the Russian Federation / D.B. Andreychuk, A.V. Sprygin, T.V. Okovytaya, V.N. Irza, V.V. Drygin // 15th World Veterinary Poultry Congress: Abstract Book. -Beijing, China, 2007. - P. 529.

13. Phylogenetic analysis of M.gallisepticum isolates recovered from poultry farms of the Russian Federation / A.V. Sprygin, D.B. Andreychuk, l.A. Runina, N.S. Mudrak, V.N. Irza, V.V. Drygin // MEEGID IX Congress. - California, Irvine,

2008.: P.70-71.

14. Multiplex real-time PCR with internal control for Mycoplasma galliseptlcum and Mycoplasma synoviae detection in field samples / A.V. Sprygin, D.B. Andreychuk, l.A. Runina, V.N. Irza, N.S. Mudrak, A.V.Borisov, V.V. Drygin // 16th World Veterinary Poultry Congress: Abstract Book. - Marakesh, Morocco,

2009. - P.383.

ООО "Мещера", ИНН 5050006864, М.О., г. Щелково, ул. Свирская, д.8 Тираж 100. Заказ № 652. 20

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Спрыгин, Александр Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Краткая характеристика микоплазм.

2.2. Филогенетические отношения MG.

2.3. Структурная организация клетки MG.

2.4. Иммунные реакции при заражении MG.

2.5. Генетические особенности MG и MS.

2.6. Патогенность микоплазм.

2.6.1 Конкуренция за субстрат.

2.6.2. Адгезия и цитадгезины MG и MS.

2.6.3. Фенотипическое разнообразие микоплазм.

2.6.4. Проникновение в клетку.

2.6.5. Цитопатическое действие MG.

2.7 Выявление MG и MS при смешанных инфекциях.

2.7.1. ПЦР с использованием в качестве матрицы генов 16S рРНК и гемагглютининов.

2.7.2 Сравнение ПЦР с другими методами.

2.7.3. Дифференциация штаммов MG и MS.

2.7.4. Роль микоплазм в ассоциированном течении инфекционных заболеваний.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов диагностики микоплазмозов кур и изучение изолятов Mycoplasma gallisepticum, выявленных на территории Российской Федерации"

Актуальность темы. Микоплазмы являются уникальными микроорганизмами, занимающими особое положение среди бактерий [160]. Для птицеводства наибольший интерес среди рода Mycoplasma представляют Mycoplasma gallisepticum (MG) и Mycoplasma synoviae (MS), которые наряду с метапневмовирусом птиц (МПВП), вирусом инфекционного бронхита кур (ИБК), ларинготрахеита (ИЛТ) и реовирусом вызывают респираторный синдром и теносиновит [20, 26, 89, 104, 121, 131, 137, 171]. MG и MS наносят значительный экономический ущерб промышленному птицеводству, снижая яйценоскость у птиц и осложняя . течение ассоциированных вирусных и бактериальных заболеваний [19, 34, 121].

В настоящее время для выявления MG и MS используют несколько методов. Выделение культуры микроорганизма является надежным, но весьма трудоемким методом, так как это требует значительного времени и специальных селективных сред. К тому же процесс культивирования может осложняться ростом вторичной микрофлоры [141].

Серологические методы являются быстрыми и высокопроизводительными, но для выработки достаточного количества антител в крови, которые могут быть выявлены серологическими методами, требуется от 1-й до 3-х недель с момента начала инфекции [101], что затрудняет выявление инфекции на ранней стадии.

Лабораторные методы, основанные на выявлении генетического материала MG и MS, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с культуральными и серологическими методами и сокращают время постановки диагноза до 4-5 часов с момента отбора проб. В последнее время появились методы ПЦР для выявления MG [110, 172, 176] и MS [51], а также запатентованные диагностикумы для MG (IDEXX, США; ИнтерЛабСервис, г. Москва). Сейчас также применяют методы ПЦР, с помощью которых можно идентифицировать MG и MS одновременно [57, 205]. Сравнительно недавно для выявления MG развитие получил такой метод, как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [25, 52). Однако выявление MS с помощью ПЦР-РВ еще не описано. Метод ПЦР-РВ более чувствителен и позволяет проводить количественный анализ. Одним из общих недостатков метода ПЦР является возможность ингибирования реакции при исследовании суспензий тканей и органов, таких, как мозг, печень и т.п., содержащих большое количество липидов и ферментов. Для исключения ингибирования и контроля процесса выделения используется внутренний контрольный образец (ВКО), т.е. гетерологичная ДНК, которая добавляется в пробу перед выделением.

Существующие штаммы MG, включая референтные, могут значительно отличаться по антигенным и биологическим свойствам [12, 164], поэтому необходимо не только выявлять изоляты, но также изучать их свойства. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей вариабельных генов даст возможность устанавливать пути распространения инфекции [135]. Более того, использование живых вакцин против MG делает актуальной задачу дифференциации полевых изолятов. К тому же генетическое разнообразие изолятов MG, встречающееся на территории РФ, остаётся в настоящее время неизученным.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

2. Провести анализ частоты встречаемости MG и MS в ассоциации с вирусами ИБК, МПВП, ИЛТ и реовируса кур, соответственно, при исследовании проб патологического материала.

3. Изучить патогенность некоторых выявленных изолятов MG.

4. Провести анализ нуклеотидных последовательностей участков вариабельных генов выявленных изолятов MG.

Научная новизна:

- разработаны методы выявления MG и MS на основе дПЦР и дПЦР-РВ с внутренним контрольным образцом;

- показана возможность дифференциации MG и MS от вирусов ИБК, МПВП, ИЛТ и реовируса кур в пробах патологического материала от птиц;

- изучена патогенность 5 выявленных изолятов MG;

- впервые проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов gapA, mgc2 и pvpA 26 российских изолятов MG;

- получены последовательности фрагментов генов gap A, mgc2 и pvpA 26 изолятов MG, депонированные в международной базе данных Genbank под номерами FJ965750-FJ965767, FJ965769-FJ965783, FJ965785-FJ965815, FJ965817-FJ965827 и FJ972630-FJ972632.

- «Методика выявления генома Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae с использованием полимеразной цепной реакции в формате мультиплекс» (2006 г.);

- «Методика выявления и количественного анализа Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с внутренним контрольным образцом» (2008 г.).

Данные методики одобрены учёным советом, утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и включены в сборник «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием ПЦР» (2008 г.), который допущен Россельхознадзором РФ в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.

Основные положения, выносимые на защиту:

Методы ПЦР для выявления MG и MS: одновременная детекция геномов MG и MS методом дуплекс ПЦР и дуплекс ПЦР-РВ с внутренним контрольным образцом.

Результаты выявления MG и MS в пробах от птиц с респираторным комплексом, полученных из птицеводческих хозяйств различных регионов РФ и СНГ в период с 2005 по 2008 гг.

Результаты изучения биологических свойств изолятов MG.

Результаты анализа первичных нуклеотидных последовательностей фрагментов генов gapA, mgc2 и pvpA изолятов MG, выявленных на территории РФ в 2005-2008 гг.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 149 страницах и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, заключение по обзору литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и приложения. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 18 рисунками. Список использованной литературы включает 210 источников. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Спрыгин, Александр Владимирович

6. ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы дПЦР и дПЦР-РВ с использованием ВКО для выявления MG и MS в пробах от птиц с респираторным комплексом. Показано, что разработанные методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью. Чувствительность ПЦР составила 100 КОЕ-экв/мл для MG и MS, а ПЦР-РВ - 7 КОЕ-экв/мл и 1 КОЕ-экв/мл для MG и MS, соответственно.

2. При исследовании 620 проб патологического материала из 164 птицефабрик в период с 2005 по 2008 гг. было выявлено 67 изолятов MG из 47 птицефабрик (29%) и 88 изолятов MS из 62 птицефабрик (38%), из которых 30 проб из 28 птицефабрик (17%) были одновременно положительны на MG и MS (р<0,05). к.б.н. Колосову С.Н., к.б.н. Руниной И.А. вет. врачу Колотилову А.Н., а также Овчинниковой Е.В, Хлебовец З.Б., Зинякову Н.Г. и Ерошиной Т.И. за методическую помощь в выполнении отдельных этапов работы.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

MG и MS являются опасными инфекционными агентами, которые представляют серьезную угрозу птицеводческим хозяйствам. У инфицированной птицы снижается яйценоскость, прирост массы тела, наблюдается гибель поголовья, что наносит значительный экономический ущерб. Эффективность мер по борьбе с микоплазмозами во многом зависит от своевременного выявления возбудителя с помощью лабораторных методов. Использование современных методов диагностики инфекционных заболеваний, особенно основанных на технологии выявления генетического материала возбудителя, имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными лабораторными методами. Во-первых, высокая чувствительность молекулярно-биологических методов значительно ускоряет процедуру постановки диагноза, позволяя избежать трат времени на выделение чистой культуры микроорганизма. При этом реакция может быть построена так, что выявление идет сразу на несколько возбудителей. Во-вторых, изучение структуры генома и его части позволяет в высокой степени дать индивидуальную характеристику выявленного изолята, которая при сравнительном анализе может служить основой для определения его филогенетической принадлежности, а также определения возможных источников и путей распространения. Это особенно важно для микоплазм, у которых отсутствуют яркие серологические отличия.

В настоящем исследовании были разработаны методы ПЦР для выявления и дифференциации MG и MS при ассоциированных вирусных инфекциях птиц. Методы включают дПЦР и дПЦР-РВ, в которых генами-мишенями являются mgc2 и vlhA гены MG и MS, соответственно. Оба метода включают внутренний контрольный образец, который позволяет контролировать процесс выделения и исключать ложноотрицательные результаты вследствие ингибирования ПЦР или старения реактивов. Таким образом, одновременное выявление MG и MS в ПЦР позволяет сократить время анализа и экономно использовать дорогостоящие реактивы.

При использовании геномной ДНК культуральных препаратов штаммов MS и MG методы дПЦР и дПЦР-РВ были оптимизированы по температуре отжига праймеров, а также была оценена чувствительность реакции. Она составила 1-7 КОЕ-экв/мл (для MG и MS) и 100 КОЕ-экв/мл (для MG и MS) для ПЦР-РВ и ПЦР соответственно. При оценке чувствительности реакции дПЦР и дПЦР-РВ в присутствии избытка геномной ДНК другой выявляемой микоплазмы, было установлено отсутствие конкуренции при амплификации как специфических матриц, так и матрицы ВКО.

Тестирование специфичности дПЦР и дПЦР-РВ проводили в присутствии вирусных и бактериальных инфекционных агентов. Результаты показали, что неспецифической амплификации отмечено не было, а разработанные методы специфично выявляли ДНК MG и MS как отдельно, так и в формате дуплекс.

В ходе данной работы было исследовано 620 проб патологического материала от птиц с клиническими признаками инфекции, поступивших из 164 птицеводческих хозяйств. При исследовании 620 проб патологического материала из 164 птицефабрик в период с 2005 по 2008 гг. было выявлено 67 изолятов MG из 47 птицефабрик (29%) и 88 изолятов MS из 62 птицефабрик (38%), из которых 30 проб из 28 птицефабрик (17%) были одновременно положительны на MG и MS (р<0,05). Для подтверждения результатов дПЦР и дПЦР-РВ при анализе проб патологического материала были выбраны, в качестве референтных, методы ПЦР GapA и ПЦР 16S для MG и MS. Показано, что дПЦР не уступал по чувствительности и специфичности стандартным методам ПЦР GapA и ПЦР 16S, а дПЦР-РВ превосходил их.

При исследовании проб от птиц в 67 положительных пробах на MG ассоциированные вирусные агенты (вирус инфекционного бронхита, вирус инфекционного ларинготрахеита кур и метапневмовирус) выявляли в 27 пробах (40%) проб) (р<0,01): наиболее часто выявляли вирус инфекционного бронхита (13 проб), а пневмовирус и ИЛТ - в 5 и 9 пробах, соответственно. В 88 положительных пробах на MS реовирус кур выявили в 17 пробах (19% проб) (р<0,01)

MG наиболее часто выявляли в пробах от бройлеров (36 проб) и птиц старше 151 дня (27 проб) с вирусом ИБК (11 проб) и ИЛТ (5 проб), соответственно.

MS наиболее часто выявляли в пробах от несушек старше 151 дня (48 проб) и бройлеров (34 пробы) с реовирусом в 10 и 5 пробах, соответственно.

Наибольшее количество изолятов MG и MS выявили в пробах от птиц с клиническими признаками инфекции из птицефабрик Центрального, Приволжского и Южного федеральных округов. Случаи выявления микоплазм были также отмечены в пробах от птиц из птицефабрик Уральского и Дальневосточного федеральных округов. В пробах от птиц из птицефабрик Сибирского ФО MG и MS в период исследования зарегистрированы не были. В пробах от птиц из птицефабрик Северо-Западного ФО была выявлена только MS. Однако на данное время объективного вывода по Уральскому, Дальневосточному и Северо-Западному федеральному округу сделать невозможно по причине малого количества исследованных проб из различных птицефабрик.

Наибольшее число случаев при микоплазмозе птиц было связано с поражением верхних дыхательных путей, что сопровождалось развитием аэросаккулита, трахеита, коньюктивита и синусита.

Для повышения надежности ПЦР-систем обнаружения MG и MS разработана система внутреннего контрольного образца для ПЦР и ПЦР-РВ. В качестве ВКО для ПЦР использовали ампликон участка S1 гена реовируса кур, а для ПЦР-РВ - ДНК-плазмиду со специфической вставкой фрагмента S3 гена реовируса кур.

С помощью внутреннего контрольного образца удалось идентифицировать ложноотрицательные результаты при исследовании проб патологического материала, которые по-видимому, были связаны с присутствием ингибиторов в исследуемой пробе. При повторном исследовании этих проб после десятикратного разбавления суспензии пробы ложноотрицательные результаты не регистрировали.

Изучены патогенные свойства 5 выделенных изолятов MG на куриных эмбрионах, трахеальных органных культурах и естественновосприимчивых животных. Выбор изолятов для исследования осуществлялся по ростовым характеристикам и филогенетическому положению. Установлено, что гибель эмбрионов была значительно выше при инокуляции полевыми изолятами MG в желточный мешок, чем при заражении в аллантоисную полость. Эксперимент по заражению куриных эмбрионов показал, что при заражении в желточный мешок и аллантоисную полость наибольшей патогенностью для куриных эмбрионов обладал изолят MG MG140905. Высокая патогенность данного изолята также была продемонстрирована в ТОК и на восприимчивых животных. Данный изолят вызывал почти полный цилиостаз в ТОК и, при заражении однодневных SPF-цыплят, вызывал значительные патолого-анатомические изменения в органах (р<0,05). Для дифференциации 26 выявленных изолятов использовали опубликованные системы праймеров на гены gapA, mgc2, pvpA и межгенный спейсерный участок ISR. При сравнении последовательностей ампликонов изучаемых участков генов показано, что большинство российских изолятов группируются отдельно от референтных штаммов. Всего 13 изолятов MG120208, MG140308a, MG070607, MG200407, MG031008, MG090107, MG130807 и MG040408 MG040805, MG280405, MG140307, MG060705, MG151008 группировались вместе по 4 изучаемым последовательностям, что свидетельствует об эндемичности MG. Изолят MG140905 группируется с патогенным штаммом Rlow по последовательности mgc2 и gapA. Изоляты MG310807 и MG080508, выделенные из одного птицеводческого хозяйства, группируются вместе по последовательностям ISR и gapA с вакцинным штаммом tsll и др., тогда как по mgc2 они входят в группу российских - изолятов. Уровень отличий между всеми выявленными изолятами по участкам gap A, mgc2, pvpA и ISR не превышал 3,6 %, 12 %, 7% и 4,5%, соответственно.

3. При анализе встречаемости вирусов ИБК, ИЛТ, МПВП и реовируса показано, что MG и MS ассоциированы с данными вирусами в 40% (р<0,01) и 19% (р<0,01) случаев, соответственно.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Практическая значимость. Для практического использования предлагаются одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методики:

- «Методика выявления генома Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae с использованием полимеразной цепной реакции в формате мультиплекс»;

- «Методика выявления и количественного анализа Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae с помощью полимеразной цепной реакции режиме реального времени с внутренним контрольным образцом».

Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., профессору Дрыгину В.В. за консультативную помощь в процессе выполнения данной работы. Автор также признателен

Установлена корреляция по филогенетической принадлежности (по последовательности gapA и mgc2 и биологическим свойствам изолята MG140905 с патогенным штаммом Rlow.

При исследовании проб, поступавших из одной и той же птицефабрики в течение 2-3 лет, выявляли разные циркулирующие изоляты. Наибольшее количество, по 4 изолята, было выявлено в пробах из птицефабрик из Тульской и Самарской областей. В первом случае выявленные изоляты не формировали общей группы, а были распределены по дендрограмме с уровнем отличий, не превышающим 2,5%; во втором случае группировались вместе, причём три из них были идентичны. Установленные факты могут подтверждать как длительную совместную персистенцию неродственных изолятов, так и изменение генома в результате многолетней персистенции MG в птицехозяйстве. Установить связь между выявленными изолятами, датой выявления и географической локализации птицефабрик, в которых они выявлялись, не удалось.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Спрыгин, Александр Владимирович, Щёлково

1. Борхсениус, С.Н. Микоплазмы. Молекулярная и клеточная биология, патогенность, диагностика / С.Н. Борхсениус, О.А. Чернова. Л.: Наука, 1989.- 156 с.

2. Коровин, Р.Н. Лабораторная диагностика болезней птиц/ Р.Н. Коровин, В.П. Зеленский, Г.А. Трошева. М.: Агропромиздат, 1989. -С. 172-174.

3. Методические указания по приготовлению и поддержанию трахеальной органной культуры куриных эмбрионов и цыплят / О.Н. Чупина, С.В. Фролов, В.Н. Диев, А.В. Борисов; ФГУ "ВНИИЗЖ". -Владимир, 2006. 4с.

4. Прозоровский, С.В. Медицинская микоплазмология / С.В. Прозоровский, И.В. Раковская, Ю.В. Вульфович. М.: Медицина, 1995.-С. 56-78.

5. A gene family in Mycoplasma imitans closely related to the pMGA family of Mycoplasma gallisepticum /P.F. Markham, M.F.Duffy, M.D. Glew, G.F. Browning // Microbiology.- 1999. Vol. 145. - P. 2095-2103.

6. A novel mechanism for control of antigenic variation in the haemagglutinin gene family of Mycoplasma synoviae/AM. Noormohammadi, P.F. Markham, A. Kanci et al. И Mol. Microbiol. -2000. Vol. 35. - P. 911- 923.

7. A putative transposase gene in the 16S-23S rRNA intergenic spacer region of Mycoplasma imitans / R. Harasawa, D. G. Pitcher, A. S. Ramirez, J. M. Bradbury // Microbiology. 2004. - Vol. 150. - P. 10231029.

8. A surface epitope undergoing high-frequency phase variation is shared by Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma bovis / D.Yogev, D.Menaker, K. Strutzberg et al. // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 4962-4968.

9. Abdulmawjood, A. Two methods for construction of internal amplification controls for the detection of Escherichia coli 0157 by polymerase chain reaction / A. Abdulmawjood, S. Roth, M. Bulte // Mol. Cell. Probes. 2002. - Vol. 16. - P. 335-339.

10. Acylation and immunological properties of Mycoplasma gallisepticum membrane proteins /G. Jan, C. Fontenelle, M. Le Henaff, H. Wroblewski // Res. Microbiol.- 1995. Vol. 146. - P. 739-745.

11. Adherence of Mycoplasma gallisepticum involves variable surface membrane proteins / A. Athamna, R. Rosengarten, S. Levisohn et al. И Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, N 6. - P. 2468-2471.

12. Akhtar, M. Chick embryo mortality studies using different strains of Mycoplasma gallisepticum / M.Akhtar, N. Aisha, A. Khan / Journal of Islamic Academy of Sciences. 1991. - Vol. 4. -P.297-300.

13. An internal control for the diagnosis of crown gall by PCR / J. Cubero, J. van der Wolf, J. van Beckhoven, M. M. Lopez // J. Microbiol. Methods. -2002. Vol. 51. - P. 387-392.

14. An internal control for routine diagnostic PCR: design, properties, and effect on clinical performance / M. Rosenstraus, Z. Wang, S.Y. Chang et al. И J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 191-197.

15. Analysis of cytadherence-deficient, Go/^-negative Mycoplasma gallisepticum strain R / L. Papazisi, K.E. Troy, T.S. Gorton et al. II Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 6643-6649.

16. Antigenic variation of Mycoplasma gallisepticum, as detected by use of monoclonal antibodies /V.S. Panangala, M.A. Morsy, M.M. Gresham, M. Toivio-Kinnucan // Am. J. Vet. Res. 1992. - Vol. 53. - P. 1139-1144.

17. Bencina, D. Haemagglutinins of pathogenic avian mycoplasmas / D. Bencina //Avian Pathol. 2002. - Vol. 31, N 5. - P. 535-547.

18. Bradbury, J. M. Poultry mycoplasmas: sophisticated pathogens in simple guise / J. M. Bradbury / Brit. Poultry Sci. 2005. - Vol. 46. - P. 125-136.

19. Bradbury, J.M. Dual infection with Mycoplasma synoviae and a tenosynovitis-inducing reovirus in chickens /J.M. Bradbury, A. Garuti// Avian Pathol. -1978,- V. 7. P.407-419.

20. Braunius, W.W. Respiratory problems in reovirus infection in broiler chicks / W.W. Braunius // Tijdschr. Diergeneeskd. 1992. - Vol. 117. -P. 390-391.

21. Bredt, W. Motility of mycoplasmas / W. Bredt // Ann. N.Y.Acad. Sci. -1973. Vol. 225. - P. 246-250.

22. Bredt, W. Gliding motility of Mycoplasma hominis / W. Bredt, U. Radestock // J.Bacteriol. 1977. - Vol. 130. - P. 937-938.

23. Brightwell, G. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis / G. Brightwell, M. Pearce, D. Leslie // Mol. Cell. Probes. 1998. - Vol. 12. - P. 367- 377.

24. Browning, G.F. The organization of the multigene family which encodes the major cell surface protein,pMGA, of Mycoplasma gallisepticum / G.F. Browning, K.G Whithear, I.D. Walker // FEBS Letters. 1994. - Vol. 325.-P. 347-352.

25. Carli, K.T. Real-time polymerase chain reaction for Mycoplasma gallisepticum in chicken trachea / K.T. Carli, A. Eyigor / Avian Dis. -2003. Vol. 47, N 3. - P. 712-717.

26. Cavanagh, D. Appearance of type В avian pneumovirus in Great Britain / C. Naylor, K. Shaw, P. Britton et al. // Avian Pathol. 1997. - Vol. 26. - P.327-338.

27. Cecchini, K.R. Transcriptional responces of Mycoplasma gallisepticum strain R in association with eukaryotic cell / K.R Cecchini, T.S Gorton, S.J Geary // J. Bacteriol. 2007. Vol.189. - P. 5803-5807.

28. Chambaud, I. Interactions between mycoplasma lipoprotein and the host immune system / I. Chambaud, H. Wroblewski, A. Blanchard //Current Trends Microbiol. 1999. - Vol. 7. - P. 493- 499.

29. Chambaud, I. The complete genome sequence of the murine respiratory pathogen Mycoplasma pulmonis/ I. Chambaud, R. Heilig, S. Ferris // Nucleic Acids Res. 2001. - Vol. 29. - P. 2145-2153.

30. Characterization of a major hemagglutinin protein from Mycoplasma gallisepticum /P.F. Markham, M.D.Glew, M.R. Brandon et al. II Infect. Immun. 1992. -Vol. 60.-P. 3885-3891.

31. Chemokine and cytokine gene expression profiles in chickens inoculated with Mycoplasma gallisepticum strains Rlow or GT5 /J. Mohammed, S. Frasca, K. Cecchini et al. II Vaccine.- 2007. Vol. 25 - P. 8611-8621.

32. Chu, H.P. Single and mixed infections of avian infectious bronchitis virus and Mycoplasma gallisepticum / H.P.Chu, P.K. Uppal // Dev. Biol. Stand. 1975.-V. 28. P. 101-14

33. Cloning and characterization of a putative cytadhesin gene (mgcl) from Mycoplasma gallisepticum / L.C. Keeler, L.L. Hnatow, P.L. Whetzel, J.E. Dohms // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 1541-1547.

34. Cluss, R.G. Interaction of albumin and phospholipid: cholesterol liposomes in growth of Mycoplasma spp / R.G. Cluss, N.L. Somerson // Appl Environ Microbiol.- 1986. Vol. 51, N 2. - P. 281-287.

35. Comparison of culture, PCR, and different serologic tests for detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae infections / A. Feberwee, D.R. Mekkes, J.J de Wit et al. //Avian Dis. 2005. - Vol. 49, N2.-P. 260-268.

36. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae /R. Himmelreich, H. Hilbert, H. Plagens et al. II Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 24. - P. 4420-4449.

37. Control of membrane lipids in MG: effect on lipid order / C. Le Grimellec, J. Cardinal, M.C. Giocondi et al. II J. Bacteriol. 1981. -Vol. 146.-P. 155-162.

38. Correlates of immune protection in chickens vaccinated with Mycoplasma gallisepticum strain GT5 following challenge with pathogenic MG strain Rlow / M.A. Javed, S. Frasca, D. Rood et al. И Infect. Immun. 2005. -Vol. 73, N9.-P. 5410-5419.

39. Courtney, В. С. Development of internal controls for probe-based nucleic acid diagnostic assays / В. C. Courtney, M. M. Smith, E. A. Henchal // Anal. Biochem. 1999. - Vol. 270. - P. 249-256.

40. Cullen, G.A. A cell-free haemagglutinating antigen of Mycoplasma synoviaeand its use in haemagglutination inhibition tests / G.A. Cullen, G.C. Snell // J. Biol. Standard. 1976. - Vol. 4. - P. 203-207.

41. Cytadherence-deficient mutants of Mycoplasma gallisepticum generated by transposon mutagenesis /S. Mudahi-Orenstein, S. Levisohn, S.J. Geary, D.Yogev// Infect. Immun. -2003. Vol. 71, N 1. - P. 3812-3820.

42. DaMassa, A.J. Mycoplasmas of sheep and goats / A.J. DaMassa, P.S. Wakenell, D.L. Brooks // J. Vet. Diagn. Invest. 1992. - Vol. 4. - P. 101113.

43. Detection and identification of avian mycoplasmas by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism assay / I. Kiss, K. Matiz, E. Kaszanyitzky et al. // Vet. Microbiol. 1997. - Vol. 58, N 1. -P. 23-30.

44. Determination of cholesterol asymmetry by rapid kinetics of filipin-cholesterol association: effect of modification in lipids and proteins / R. Bittman, L. Blau, S. Clejan, S. Rottem // Biochemistry. 1981. - Vol. 20, N9.-P. 2425-2432.

45. Development and application of a multiplex polymerase chain reaction for avian respiratory agents IY. Pang, H. Wang, T. Girshick et al. //Avian Dis. 2002. - Vol. 46, N 3. - P. 691-699.

46. Development and evaluation of a diagnostic PCR for Mycoplasma synoviae using primers located in the intergenic spacer region and the 23 S rRNA gene / A.S. Ramirez, C.J. Naylo, P.P. Hammond, J.M. Bradbury // Vet. Microbiol. 2006. - Vol. 118. - P. 76-82.

47. Development and validation of a real-time taqman polymerase chain reaction assay for the detection of mycoplasma allisepticum in naturally infected birds / S. Callison, A. Riblet, S. Sun et al. II Avian Dis. 2006. -Vol. 50.-P. 537-544.

48. Differentiation of Mycoplasma gallisepticum strains using molecular methods / J. Biro, N. Erdei, I. Szekely, L. Stipkovits // Acta. Vet. Hung. -2006. Vol. 54, N 4. - P. 437-448.

49. Discrimination of Streptomyces albidoflavus strains based on the size and number of 16S-23S ribosomal DNA intergenic spacers IT. Hain, N. Ward-Rainey, R. M. Kroppenstedt et al. II Int. J. Syst. Bacterid.- 1997. -Vol. 47.-P. 202-206.

50. Displaying the protein of Mycoplasma gallisepticum agglutinin on the cell surface of Bacillus thuringiensis with the S-layer protein / M. Liu, S. Guo, S. Hu et al. // Vet. Microbiol. 2008. - Vol.130, N 1-2. - P. 99-106.

51. Dual infection of turkey poults with avian pneumovirus and Mycoplasma synoviae /R. S. Khehra, R. C. Jones, J. M. Bradbury et al. //Avian Pathol. 1999.- V. 28. P. 401-404

52. Dybvig, K. Molecular biology of mycoplasmas / K. Dybvig //Annu. Rev. Microbiol. 1996. - Vol. 50. - P. 25 - 57.

53. Early detection of tracheal damage in chickens by scanning electron microscopy / I. Hod, Y. Yegana, A. Herz, S. Levinsohn //Avian Dis. -1982. Vol. 26. N 6. - P. 450-457.

54. Eleven, S.H. Mycoplasma synoviae infection / S.H. Eleven // Diseases of Poultry / ed. B.W. Calnek 10th ed. Ames, IA: Iowa State Univer. Press.-1997.-P. 220-225.

55. Elgavish, S. Lectin-carbohydrate interactions: different folds, common recognition principles / S. Elgavish, B. Shaanan // Trends Biochem. Sci. -1997. Vol. 22. - P. 462-467.

56. Erdmann, Т. Untersuchungen zur Morphologie, Vermehrung und Beweglichkeit von M.gallisepticum: M.D. thesis / T. Erdmann. Mainz, Germany: Johannes Gutenberg Univer. 1976. - 146 S.

57. Evaluation and comparison of various PCR methods for detection of Mycoplasma gallisepticum infection in chickens / M. Garcia, A.N. Ikuta, S. Levisohn, S.H. Kleven // Avian Dis. 2005. - Vol. 49, N 1. - P. 125132.

58. Evaluation of cytopathologic changes induced in chicken tracheal epithelium by Mycoplasma gallisepticum in vivo and in vitro / M.J. Dykstra, S. Levisohn, O.J. Fletcher, S.H. Kleven // Am. J. Vet. Res. -1985.-Vol. 49, N l.-P.l 16-122.

59. Expression of two members of the pMGA gene family of Mycoplasma gallisepticum oscillates and is influenced by pMGA-specific antibodies /P.F. Markham, M.D.Glew, G.F. Browning et al. // Infect. Immun. -1998. Vol. 66, N 6. - P. 2845-2853.

60. Expression studies on four members of the pMGA multigene family in Mycoplasma gallisepticum S6 / M.D. Glew, P.F. Markham, G.F. Browning, I.D. Walker I I Microbiology. 1995. - Vol. 141. - P. 30053014.

61. Fabricant, J. Experimental production of complicated chronic respiratory disease infection ("airsac" disease) / J. Fabricant, P. P. Levine. // Avian. Dis.- 1962.-V. 6. P.13-23.

62. Fan, H.H. Application of polymerase chain reaction with arbitrary primers to strain identification of Mycoplasma gallisepticum / H.H. Fan, S.H. Kleven, M.W. Jackwood //Avian Dis. 1995. - Vol. 39, N 4. - P. 729735.

63. Fan, H.H. Species identification of avian mycoplasmas by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis / H.H. Fan, S.H. Kleven, M.W. Jackwood et al. II Avian Dis. 1995. -Vol. 39, N2-P. 398-407.

64. Forterre, P. Where is the root or the universal tree of life? /Р. Forterre, H. Philippe //Bioessays. 1999. - Vol. 21. - P. 871-879.

65. Fox, G.E. How close is close? 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity /G.E. Fox, J.D. Wisotzkey, P. Jurtshuk // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. - Vol. 42. - P. 166-170.

66. GAA trinucleotide repeat region regulates M9IpMGA gene expression and Mycoplasma gallisepticum / L. Liu, K. Dybvig, V.S. Panangala et al. II Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 871- 876.

67. Gatt, S. Lysophospholipase-catalyzed hydrolysis of lysophospholipids in Mycoplasma gallisepticum membranes IS. Gatt, B. Morag, S. Rottem // J. Bacteriol. 1982.-Vol. 151, N3.-P. 1095-1101.

68. Georgiades, G. Cases of swollen head syndrome in broiler chickens in Greece /G. Georgiades, P. Iordanidis, M. Koumbati // Avian Dis. 2001. -Vol. 45. N3.-P. 745-750.

69. Ghosh, A. Lack of repair of ultraviolet light damage in Mycoplasma gallisepticum /А. Ghosh, J. Das, J. Maniloff// J. Mol. Biol. 1977. - Vol. 116, N2.-P. 337-344.

70. Hasegawa, M. Estimation of branching dates among primates by molecular clocks of nuclear DNA which slowed down in hominoidea / M. Hasegawa, H. Kishino, T.A. Yano // J. Hum. Evol. 1989. - Vol. 18. -P. 461-476.

71. Homologue of macrophage-activating lipoprotein in Mycoplasma gallisepticum is not essential for growth and pathogenicity in tracheal organ cultures /P.F. Markham, A. Kanci, G. Czifra et al. I I J. Bacteriol.-2003. Vol. 185, N 8. - P. 2538-47.

72. Hoorfar, J. Critical aspects of standardization of PCR /J. Hoorfar, N. Cook // Methods Mol. Biol. 2003. - Vol. 216. - P. 51-64.

73. Hunter, P. R. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity /Р. R. Hunter, M. A. Gaston // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26. - P. 2465-2466.

74. Huynen, M.A Measuring genome evolution /М.А. Huynen, P. Bork // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 5849-5856.

75. Identification of fibronectin-binding proteins in Mycoplasma gallisepticum strain R /М. May, L. Papazisi, T.S. Gorton, S.J.Geary // Infect. Immun.-2006. Vol. 74, N3.-P. 1777-1785.

76. Identification of major immunogenic proteins of Mycoplasma synoviae'isolztQs / R.Bercic, B.Slavec, M. Lavric et al. // Vet. Microbiol. -2008.-Vol.127.-P.147-154.

77. Incorporation and modification of exogenous phosphatidylcholines by mycoplasmas / S. Rottem, L. Adar, Z. Gross et al. II J.Bacteriol. 1986. -Vol. 167.-P. 299-304.

78. Infectious bronchitis / D. Cavanagh, S. A. Naqi, B.W. Calnek et al. //Diseases of Poultry.- 10th ed.- Ames, IA: Iowa Univer. Press, 1997. P. 511-526.

79. Inter- and intraspecies comparison of the 16S-23S rRNA operon intergenic spacer regions of six Listeria spp /Т. A. Graham, E. J. Golsteyn-Thomas J. E. Thomas, V. P. J. Gannon // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - Vol. 47. - P. 863-869.

80. Isolation and characterization of a 6/85-like Mycoplasma gallisepticum from commercial laying hens / S.J Throne Steinlage, N. Ferguson, J.E. Sander et al. I/ Avian. Dis. 2003. - Vol. 47, N 2. - P. 499-505.

81. Jan, G. Purification of Mycoplasma gallisepticum membrane proteins p52, p67 (pMGA), and p77 by high-performance liquid chromatography /G. Jan, C. Brenner, H. Wroblewski I I Protein' Expression and Purification. -1996.-Vol. 7.-P. 160-166.

82. Jagoueix, S.Comparison of the 16S/23S ribosomal intergenic regions of Candidatus Liberobacter asiaticum and Candidatus Liberobacterafricanum / S. Jagoueix, J. M. Bove, M. Gamier // Int. J. Syst. Bacteriol. -1997. Vol. 47. - P. 224-227.

83. Jones, B.V. The preparation of chicken tracheal organ cultures for virus isolation, propagation and titration / B.V. Jones, R.M. Hennion // Methods Mol. Biol. -2008. Vol. 454. - P. 103-107.

84. Kasper, D.L. Bacterial capsule—old dogmas and new tricks/ D.L. Kasper // J. Infect. Dis. 1986. - Vol. 153, N 3. - P. 407-415.

85. Kempf, I. Comparison of serological tests for detection of Mycoplasma gallisepticum antibodies in eggs and chicks hatched from experimentally infected hens / I. Kempf, F. Gesbert, M. Guittet // Res. Vet. Sci. 1997. -Vol. 63, N3.-P. 211-213.

86. Kempf, I. DNA amplification methods for diagnosis and epidemiological investigations of avian mycoplasmosis / I. Kempf //Acta Vet. Hung. -1997. Vol. 45, N 3. - P. 373-386.

87. Kenny, G.E. Mycoplasma contamination of cell cultures / G.E. Kenny //1. Gylstorff (ed.). Infectionen durch Mycoplasmatales. Germany:VEB, 1985.-S. 210-227.

88. Kheyar, A. The 64 kDa lipoprotein of Mycoplasma gallisepticum has two distinct epitopes responsible for haemagglutination and growth inhibition / A. Kheyar, S.K. Reddy, A. Silim // Avian Pathol. 1995. - Vol. 24. - P. 55-68.

89. Kleven, S. H. Antibody response to avian mycoplasmas / S.H. Kleven // Am. J. Vet. Res. 1975. - Vol. 36. - P. 563-565.

90. Lam, K.M. Mycoplasma gallisepticum-'mduced alterations in cytokine genes in chicken cells and embryos / K.M. Lam // Avian Dis. 2004. -Vol. 48, N 1.-P. 215-219.

91. Langman, R.E. A theory of the ontogeny of the chicken humoral immune system: the consequences of diversification by gene hyperconversion and its extension to rabbit / R.E. Langman, M. Cohn // Res. Immunol. 1993. -Vol. 144.-P. 422-446.

92. Laryngotracheitis IT. J. Bagust, J. S. Guy, B. W. Calnek et al. II Diseases of Poultry.- 10th ed.- Ames, IA: Iowa Univer. Press, 1997. P. 527-540.

93. Lauerman, L. H. Mycoplasma PCR Assays / L. H. Lauerman // Nucleic Acid Amplification Assays for Diagnosis of Animal Diseases /Am. Assoc. Vet. Lab. Diagn.- Auburn, AL, 1998. P. 41-52.

94. Le Grimellec, C. Analysis of membrane fractions from Mycoplasma gallisepticum / C. Le Grimellec, M. Zollinger, M.C. Giocondi // Biochim Biophys Acta. 1982. - Vol. 689, N 2. - P. 309-318.

95. Legume lectin structure / R. Loris, T. Hamelryck, J. Bouckaert, L. Wyns //Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol. 1383. - P. 9-36.

96. Levisohn, S. A quantitative study of single and mixed infection of the chicken trachea by Mycoplasma gallisepticum IS. Levisohn, M.J. Dykstra 11 Avian Dis. 1987. - Vol. 31. N 1. - P. 1-12.

97. Ley, D.H. Mycoplasma gallisepticum infection / D.H. Ley, H.W. Yoder // Diseases of Poultry.- 10th ed.- Ames, IA: Iowa Univer. Press, 1997. P. 194-200.

98. Lipid composition and synthesis in the pleuropneumonia-like organism Mycoplasma gallisepticum / M.E. Tourtellotte, R.G. Jensen, G.W. Gander, H.J. Morowitz // J. Bacteriol. 1963. - Vol. 86. - P. 370-379.

99. Liu, L. Trinucleotide GAA repeats dictate pMGA gene expression in Mycoplasma gallisepticum by affecting spacing between flanking regions / L. Liu, V.S. Panangala, K. Dybvig // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184, N 5.-P. 1335-1339.

100. Legume lectin structure / R. Loris, T. Hamelryck, J. Bouckaert, L. Wyns //Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol. 1383. - P. 9-36.

101. Lymphocytic infiltration in the chicken trachea in response to Mycoplasma gallisepticum infection / J.E. Gaunson, C.J. Philip, K.G. Whithear, G.F. Browning // Microbiology. 2000. - Vol. 146, N 5. - P. 1223-1229.

102. Maniloff, J. Partial purification of a membrane-associated deoxyribonucleic acid complex from Mycoplasma gallisepticum /J.

103. Maniloff, D.C. Quinlan // J. Bacteriol. 1974. - Vol. 120, N 1. - P. 495501.

104. Maniloff, J. Ultrastructure and ribosomes of Mycoplasma gallisepticum /J.Maniloff, H.J. Morowitz, R.J.Barrnett // J. Bacteriol.- 1965. Vol. 90, N l.-P. 193-204.

105. Marois, C. Polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma gallisepticum in environmental samples / C. Marois, F. Dufour-Gesbert, I. Kempf//Avian Pathol.-2002.-Vol. 31, N2.-P. 163-168.

106. Mekkes, D.R. Real-time polymerase chain reaction for the qualitative and quantitative detection of Mycoplasma gallisepticum / D.R. Mekkes, A. Feberwee // Avian Pathol. 2005. - Vol. 34, N 3. - P. 348-354.

107. Miloseviac-Berliac, T. Sequence polymorphisms within the pMGA genes and pMGA antigenic variants in Mycoplasma gallisepticum /Т. Miloseviac-Berliac, D. Benacina, P. Dovac // FEMS Microbiol. Letters. — 2000.-Vol. 184.-P. 133-139.

108. Mixed infection of turkeys with Mycoplasma synoviae and reovirus: Field and experimental observations / A. AlAfaleq, J.Bradbury, R. Jones et al. II Avian Pathol. 1989. -V.18. P.441 - 453

109. Mohammed, H. О. Economic impact of M.gallisepticum and M. synoviae in commercial layer flocks / H. O. Mohammed, Т. E. Carpenter, R. Yamamoto // Avian. Dis.- 1987.- V. 31.- P.477 482.

110. Molecular and biochemical analysis of a 105 kDa Mycoplasma gallisepticum cytadhesin (GapA) /M.S. Goh, T.S. Gorton, M.H. Forsyth etal. //Microbiology. 1998.-Vol. 144, N 11.-P. 2971-2978.

111. Molecular cloning of a member of the gene family that encodespMGA, a hemagglutinin of Mycoplasma gallisepticum / P.F. Markham, M.D.Glew, K.G. Whithear, I.D. Walker // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 903909.

112. Molecular characterization of the Mycoplasma gallisepticum pvpA gene which encodes a putative variable cytadhesin protein / S. Boguslavsky, D. Menaker, I. Lysnyansky et al. // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 7. -P. 3956-3964.

113. Molecular variability of the adhesin-encoding gene pvpA among Mycoplasma gallisepticum strains and its application in diagnosis / T. Liu, M. Garcia, S.Levisohn et al. // J.Clin. Microbil.- 2001. Vol. 39. - P. 1882-1888.

114. Morowitz, H.J. Analysis of the life cycle of Mycoplasma gallisepticum /H.J.Morowitz, J. Maniloff // J. Bacteriol. 1966. - Vol. 91, N 4. - P. 1638-1644.

115. Mrazek, J. Analysis of distribution indicates diverse functions of simple sequence repeats in Mycoplasma genomes /J. Mrazek // Mol. Biol. Evol. -2006.-Vol. 23, N 1. -P. 1370-1385.

116. Multigene families encoding the major hemagglutinins in phylogenetically distinct mycoplasmas /А.Н. Noormohammadi, P.F. Markham, M.F. Duffy et al. 11 Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 3470-3475.

117. Mycoplasma gallisepticum infection / D.H. Ley, H. W., Yoder, B. W. Calnek et al. II Diseases of Poultry. 10 ed. - Ames, Iowa: Univers. Press. - 1997.-P. 194-207.

118. Mycoplasma gallisepticum: influence of cell invasiveness on the outcome of experimental infection in chickens / P. Much, F. Winner, L. Stipkovits et al. И FEMS Immun. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 34. - P. 181186.

119. Mycoplasma gallisepticum invades chicken erythrocytes during infection / G. Vogl, A. Plaickner, S.Szathmary et al. //Infect. Immun. 2007-Vol.76. - P.71-77.

120. Mycoplasma gallisepticum strain differentiation by arbitrary primer PCR (RAPD) fingerprinting /S.J. Geary, M.H. Forsyth, S. Aboul Saoud et al. II Mol. Cell. Probes. 1994.-Vol. 8, N4.-P. 311-316.

121. Mycoplasma infection / D.H. Ley, Y. M. Saif, H. J. Barnes et al. // Diseases of Poultry. 11th ed.- Ames, IA: Iowa Univer. Press, 2003. - P. 722-744.

122. Mycoplasma synoviae has two distinct phase-variable major membrane antigens, one of which is a putative hemagglutinin /А.Н. Noormohammadi, P.F. Markham, K.G. Whithear et al. // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 2542-2547.

123. Mycoplasma synoviae infection / S.H. Kleven, B. W. Calnek, H.J Barnes et al. II Diseases of Poultry. 10 ed. - Ames, Iowa: Univers. Press. -1997.-P. 220-227.

124. Mycoplasma synoviae infection / S.H. Kleven, Y.M. Saif, HJ Barnes et al. 11 Diseases of Poultry. 12 ed. - Ames, Iowa: Univers. Press. - 2003. -P. 756-766.

125. Mycoplasma synoviae invades non-phagocytic chicken cells in vitro fD. Dusanic, R.L. Bercic I. Cizelj et al. И Vet. Microbiol.- 2009. -V. 138. P. 114-119.

126. Mycoplasmas in the etiology of multifactorial respiratory disease / S.H. Kleven, R.M. Fulton, M. Garcia et al. II Avian Dis. 2004. - Vol. 48, N 3.-P. 562-569.

127. Mycoplasmosis / S.H. Kleven, D.E. Swayne, J.R. Glisson et al. II A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens. 4th ed. - Kennett Square, PA, -1998. - P.74-80.

128. Noormohammadi, A.H. Role of phenotypic diversity in pathogenesis of avian mycoplasmosis /А.Н. Noormohammadi // Avian Pathol. 2007— Vol. 36, N6. -P. 439-444.

129. Natural case of salpingitis apparently caused by Mycoplasma gallisepticum in chickens /Т. Nunoya, M. Tajima, T. Yagahashi, S.Sannai // Avian Pathol. 1997.- Vol. 26. - P. 391-398.

130. Naylor, C. J. Exacerbation of Mycoplasma gallisepticum infection in Turkeys by rhinotracheitis virus/ C. J. Naylor, A. R. Al-Ankari, A. I. Al-Afaleq et al. I/ Avian Pathol. 1992,- V.21. P.295 - 305.

131. OIE quality Standard and Guidelines forVeterinary Laboratories: infectious diseases. OIE, Paris, 2008.

132. Olson, N.O. Studies of infectious synovitis in chickens / N.O. Olson, D.C. Shelton, J.K. Bletner et al. II Am. J. Vet. Res. 1956. - V.-17. P. 747-754.

133. Olson, N.O. Mycoplasma synoviae infection /N.O. Olson // Diseases of Poultry, 8th edition. Diseases of Poultry. 8 ed. - Ames, Iowa: Univers. Press. - 1984.P. 212-220.

134. Oshima, K. Phylogenetic relationships among Mycoplasmas based on the whole genomic information / K.Oshima, H.Nishida // J. Mol. Evol. -2007.-Vol. 65. P.249-258.

135. Pakpinyo, S. Molecular characterization and determination of antimicrobial resistance of Mycoplasma gallisepticum isolated fromchickens IS. Pakpinyo, J.Sasipreeyajan // Vet. Microbiol. 2007. - Vol. 125.-P. 59-65.

136. Pancholi, V. Multifunctional alpha-enolase: its role in diseases /V. Pancholi // Cell. Mol. Life Sci. 2001. - Vol. 58, N 7. - P. 902-920.

137. Pathogenicity of Mycoplasma lipofaciens strain ML64 for turkey embryos /М. Lierz, S. Deppenmeier, A.D. Gruber et al. II Avian Pathol. 2007. -Vol. 36, N5.-P. 389-393.

138. Phillips, M.C. Mechanisms and consequences of cellular cholesterol exchange and transfer /М.С. Phillips, W.J. Johnson, G.H. Rothblat // Biochim. Biophys. Acta.- 1987. Vol. 906, N 3. - P. 223-276.

139. Portnoy, V. Mycoplasma gallisepticum as the first analyzed bacterium in which RNA is not polyadenylated N. Portnoy, G. Schuster // FEMS Microbiol. Letters. -2008. Vol. 283. - P. 97-103.

140. Pour-El, I. Construction of mini-Tn4001tet and its use in Mycoplasma gallisepticum / I. Pour-El, C. Adams, F.C. Minion // Plasmid. 2002. -Vol. 47, N2.-P. 129-137.

141. Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis of Mycoplasma gallisepticum isolates from turkeys from the central valley of California / B.R. Charlton, A.A. Bickford, R.P. Chin, R.L.Walker // J. Vet. Diagn. Invest. 1999.-Vol. 11, N5.-P. 408-415

142. Razin, S. Mycoplasma adhesion / S. Razin, E Jacobs // J. Gen. Microbiol. 1992. - Vol. 138. - P. 407- 422.

143. Razin, S. Mycoplasma adherence / S. Razin, M.F. Barile // The Mycoplasmas. Vol.4. Mycoplasma Pathogenicity. Orlando, FL: Acad. Press, 1985.-P. 161-202.

144. Razin, S. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas / S. Razin, D. Yogev, Y. Naot // Microbiol. Mol. Biology Rev. 1998. - Vol. 62.-P. 1094-1156.

145. Reductive evolution suggested from the complete genomesequence of a plant-pathogenic phytoplasma / K. Oshima, S. Kakizawa, H. Nishigawa et al. II Nature Genet. 2004.- Vol. 36. - P. 27-29.

146. Rodwell, A.W. MG requires exogenous phospholipids for growth / A.W Rodwell // FEMS Microbiol. Letters. 1983. - Vol. 172. - P. 265-268.

147. Role of Mycoplasma synoviae in commercial layer Escherichia coli Peritonitis Syndrome / Z. Raviv, N. Ferguson-Noel, V. Laibinis et al. //Avian Dis. 2007. V. 51. P. 685-690.

148. Rosengarten, R. Variant colony surface antigenic phenotypes within mycoplasma strain populations: implications for species identification and strain standarization / R. Rosengarten, D Yogev // J. Clin. Microbiol. -1996.-Vol. 34.-P. 149-158.

149. Rottem, S. Cholesterol distribution and movement in the Mycoplasma gallisepticum cell membrane /S. Rottem, G.M. Slutzky, R.Bittman // Biochemistry. 1978. - Vol. 17, N 14. - P. 2723-2726.

150. Rottem, S. Proton motive force across the membrane of Mycoplasma gallisepticum and its possible role in cell volume regulation / S. Rottem,

151. C. Linker, Т.Н. Wilson // J Bacteriol. 1981. - Vol. 145, N 3. - P. 12991304.

152. Rottem, S. Symmetrical distribution and rapid transbilayer movement of cholesterol in Mycoplasma gallisepticum membranes /S. Rottem, D. Shinar, R. Bittman // Biochim. Biophys Acta. 1981. - Vol. 649, N 3. -P. 572-580.

153. Roussan, D. Molecular Survey of Avian Respiratory Pathogens in Commercial Broiler Chicken Flocks with Respiratory Diseases in Jordan /

154. D. A. Roussan, R. Haddad, G. Khawaldeh //Poultry Sci. 2009. - V. 87. P.444-448.

155. Sachadyn, P. The construction and use of a PCR internal control / P. Sachadyn, J. Kur // Mol. Cell. Probes. 1998. - Vol. 12. -P. 259-262.

156. Sahu, S.P. Comparison of the characteristics of avian reoviruses isolated from the digestive and respiratory tract, with viruses isolated from the synovia / S.P. Sahu, N.O. Olson // Am. J. Vet. Res.- 1975. Vol. 36, N 6. -P. 847-50.

157. Screening for infectious diseases of animals // Applied Veterinary Epidemiology and the Control of Disease in Populations / B. Toma B. Dufour, M. Sanaa et al. IIAEEMA. Maisons-Alforr, France, 1999. - P. 41-86.

158. Slavi, M. F. Development and evaluation of the polymerase chain reaction method for diagnosis of Mycoplasma, gallisepticum infection in chickens

159. M.F. Slavi, R. F. Wang, W. W. Cao // Mol. Cell. Probes. 1993. - N. 7. -P. 459-463.

160. Strain differentiating real-time PCR for Mycoplasma gallisepticum live vaccine evaluation studies / Z. Raviv, S.A. Callison, N. Ferguson-Noel, S.H. Kleven //Vet. Microbiol. -2008. Vol.129 - P. 179-187.

161. Structural and functional characterization of an organic hydroperoxide resistance protein from Mycoplasma gallisepticum / C. Jenkins, R. Samudrala, S.J. Geary, S.P. Djordjevic // J.Bacteriol.- 2008. Vol. 190, N6.-P. 2206-2216.

162. Swine and poultry pathogens: the complete genome sequences of two strains of Mycoplasma hyopneumoniae and a strain of Mycoplasma synoviae/ A.T. Vasconcelos, H.B.Ferreira, C.V.Bizarro \et al. II J. Bacterid-2005.-Vol. 187.-P. 5568-5577.

163. Tajima, M. An ultrastructural study on the interaction of Mycoplasma gallisepticum with the chicken tracheal epithelium / M. Tajima, T. Nunoya, T. Yagihashi // Am. J. Vet. Res. 1979. - Vol. 40, N 7. - P. 1009-1014.

164. Tajima, M. Capsular material of Mycoplasma gallisepticum and its possible relevance to the pathogenic process / M. Tajima, T.Yagihashi, Y.Miki // Infect. Immun. 1982. - Vol. 36. N 2. - P. 830-833.

165. Thomas, L. Methaemoglobin formation by MG: the role of hydrogen peroxide / L. Thomas, W. Bitensky // Nature (London). 1966. - Vol. 210.-P. 963-964.

166. Thomas, L. Studies of PPLO infection. The production of cerebral polyarteritis by MG in turkeys: the neurotoxic property of the mycoplasma / L. Thomas, M. Davidson, R.McCluskey // J. Exp. Med. -1966a.-Vol. 123.-P. 897-912.

167. Thomas, L. The neurotoxins of M.neurolyticum and MG / L. Thomas 11 Ann. N.Y.Acad. Sci. 1967. - Vol. 143. - P. 218-224.

168. The complete genome and proteome of Mycoplasma mobile / J.D. Jaffe, N. Stange-Thomann, C. Smith et al. II Genome Res 2004. - Vol. 4. -P. 1447-1461.

169. The complete genome sequence of the avian pathogen Mycoplasma gallisepticum strain Rlow /L. Papazisi, T.S. Gorton, G. Kutish, P.F. Markham et al. // Microbiology. 2003. - Vol. 149. - P. 2307-2316.

170. The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis / F. Kunst, N. Ogasawara, I.Moszer et al. II Nature. 1997. -Vol. 390.-P. 249-256.

171. The complete genomic sequence of Mycoplasma penetrans, anintracellular bacterial pathogen in humans / Y. Sasaki, J. Ishikawa, A. Yamashita, K. Oshima et al. II Nucleic Acids Res. 2002. - Vol. 30. -P. 5293-5300.

172. The genome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 232, the agent of swine mycoplasmosis /F.C. Minion, EJ. Lefkowitz, M.L. Madsen et al. //J Bacteriol. 2004. - Vol. 186, N21.-P. 7123-7133.

173. The genome sequence of Mycoplasma mycoides subsp mycoides SC typestrain PG1, the causative agent of contagious bovine pleuropneumonia / J. Westberg, A. Persson, A. Holmberg et al. II Genome Res.- 2004. Vol. 14. - P. 221-227.

174. The complete sequence of the mucosal pathogen Ureaplasma urealyticum /J.I. Glass, E.J. Lefkowitz, J.S. Glass et al. II Nature. 2000. - Vol. 7. -P. 757-762.

175. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium /С.М. Fraser, J.D. Gocayne, O. White, M.D.Adams //Science. 1995. - Vol. 270. - P. 397-403.

176. The Mycoplasma gallisepticum 16S-23S rRNA intergenic spacer-region sequence as a novel tool for epizootiological studies / Z. Raviv, S.A. Callison, N. Ferguson-Noel et al. II Avian Dis.- 2007. Vol. 51, N 2. -P. 555-560.

177. The Mycoplasma gallisepticum OsmC-like protein MG1142 resides on the cell surface and binds heparin / C. Jenkins, S.J. Geary, M. Gladd, S.P. Djordjevic//Microbiology.-2007.-Vol. 153. N5.-P. 1455-1463.

178. The non-variable 78 kDa Mycoplasma synoviae membrane protein has a diagnostic potential / P.F. Markham, S. Zohari, A. Kanci et al. II Proce. 15th Congr. Inter. Organization for Mycoplasmology. Athens, GA, 2004.- P. 86.

179. The organisation of the multigene family which encodes the major cell surface protein, pMGA, of Mycoplasma gallisepticum / P.F. Markham, M.D. Glew, J.E. Sykes et al. IIFEBS Letters. 1994. - Vol. 352, N 3. -P. 347-352.

180. The rationale and method for constructing internal control DNA used in pertussis polymerase chain reaction /F.M. Muller, N. Schnitzler, O. Cloot et al. II Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1998. - Vol. 31. - P. 517-523.

181. Tracheal organ cultures as a useful tool to study Felid herpesvirus infection in respiratory epithelium / G. Leeming, M.L. Meli, P. Cripps et al. IIJ Virol. Methods. 2006. - Vol. 138, N 1-2. - P. 191-195.

182. Transition mutations in the 23 S rRNA of erythromycin-resistant isolates of Mycoplasma pneumoniae / T.S. Lucier, K. Heitzman, S.K Liu, P.C. Hu //Antimicrob. Agents Chemother. 1995. - Vol. 39. - P. 2770-2773.

183. Transposon mutagenesis of Mycoplasma gallisepticum / P.L. Whetzel, L.L. Hnatow, C.L. Keeler, J.E. Dohms // Plasmid. 2003. - Vol. 49, N 1. -P. 34-43.

184. Use of an alkaline phosphatase-labelled probe for the detection of Mycoplasma synoviaein chickens / H. Salisch, M. Ryll, R. Leise, U. Neumann // J. Vet. Med. B. 2000. - Vol. 47, N 1. - P. 27-35.

185. Wambura, P.N. Comparative propagation of shape Newcastle disease virus (strains 1-2 and V4) on chicken embryo tracheal explants / P.N. Wambura // Vet. Res. Commun. 2006. - Vol. 30, N 6. - P. 673-677.

186. Wang, H. Multiplex PCR for avian pathogenic mycoplasmas / H. Wang, A.A. Fadl, M.I. Khan //Mol Cell Probes. 1997. - Vol. 11, N 3. - P. 211216.

187. Winner, F. In vitro cell invasion of Mycoplasma gallisepticum / F. Winner, R. Rosengarten, C. Citty // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 4238- 4244.

188. Variable expression of epitopes on surface of Mycoplasma gallisepticum demonstrated with monoclonal antibodies / D. Bencina, S. H. Kleven, M. Elfaki et al. // Avian Pathol. 1994. - Vol. 23. - P. 19-36.

189. Woese, C.R. Towards a natural system of organisms proposal for the domains archaea, bacteria, andeucarya / C.R. Woese, O. Kandler, M.L. Wheelis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - Vol. 87. - P. 45764579.

190. Yashpal, S. M. Detection of three avian respiratory viruses by single-tube multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction assay / S. M. Yashpal, P. P. Devi, M. G. Sagar // J. Vet. Diagn. Invest. 2004. - V. 16. P. 244-248

191. Yogev, D. Genetic and antigenic relatedness between Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae/ D. Yogev, S. Levisohn, S. Razin // Vet. Microbiol. 1989. - Vol. 19. - P. 75-84.

Информация о работе

Спрыгин, Александр Владимирович
кандидата биологических наук
Щёлково, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка методов диагностики микоплазмозов кур и изучение изолятов Mycoplasma gallisepticum, выявленных на территории Российской Федерации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы