Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики микоплазмозов птиц

Волкова, Ирина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики микоплазмозов птиц
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики микоплазмозов птиц"

Направахрукописи

Л/9

ВОЛКОВА Ирина Александровна

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ МИКОПЛАЗМОЗОВ ПТИЦ

03.00.06 "В ирусол огия"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир-2004

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» Научный руководитель - кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник, ДРЫГИН Владимир Викторович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник, РУСАЛЕЕВ Владимир Сергеевич

доктор биологических наук, профессор,

СМОЛЕНСКИЙ Владимир Иванович

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский и

технологический институт биологической промышленности (ВНИТИБП, г. Щелково).

¿6 -бшлйщ

2004 г. в

4о -

часов на

Защита диссертации состоится заседании диссертационного совета Д 220.015.01. при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, п. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр

охраны здоровья животныу/ У

I &л " ШШиЩ11! 2004 г. /

Автореферат разослан I

Ученый секретарь диссертационного совета канд. биол. наук, с.н.с.

Семенова Г.М.

2005-4 13643

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Респираторный микоплазмоз и микоплазмозный синовит - инфекционные заболевания кур и индеек, характеризующиеся поражением органов и суставов, вызываемые Mycoplasma gallisepticum (Mr) и Mycoplasma synoviae (Mc), соответственно.

Впервые микоплазмозы были зарегистрированы в 1935 г. в США (Nelson J.), а впоследствии - во всех странах с развитым птицеводством, что связывают с крупномасштабной индустриализацией птицеводства, увеличивающимся экспортом и импортом птицы. Экономический ущерб от этих заболеваний складывается из потерь от гибели эмбрионов и цыплят, снижения массы тела птицы, яйценоскости, оплодотворяемости яиц, выводимости цыплят. Кроме того, микоплазмы обладают выраженным супрессирующим влиянием на иммунную систему организма и осложняют течение многих вирусных и бактериальных инфекций.

Отсутствие должного внимания к микоплазмозам на фоне бурного развития птицеводства и создания новых систем содержания птицы привело к широкому распространению этих инфекций в течении последних лет.

В настоящее время в большинстве крупнейших птицеводческих хозяйств разрабатываются программы мероприятий, направленных на улучшение ситуации по заболеваниям, вызываемым микоплазмами. Важная роль при контроле этих заболеваний уделяется своевременной и качественной диагностике. Трудности в выделении и серологической идентификации Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae ввиду большой изменчивости вирулентности и антигенных свойств их штаммов, а также атипичное, зачастую хроническое течение заболеваний, осложняет эту задачу.

Поэтому окончательный диагноз устанавливают на основе лабораторного исследования, включающего традиционные методы ранней и ретроспективной диагностики, к которым относятся: реакция агглютинации (РА), реакция торможения геммагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция задержки роста (РЗР). Однако при всех своих преимуществах (простота постановки и непродолжительность по времени, достаточно высокая чувствительность и специфичность), они отличаются субъективностью оценки, часто дают ложнопо-ложительные результаты. Использование таких современных методов, как поли-меразная цепная реакция (ПЦР) для массовых исследований ограничено высокой стоимостью оборудования и компонентов.

Поэтому в настоящее время широкое распространение получил ИФА, как высокочувствительный и специфичный метод. Быстрота получения, воспроизводимость и автоматизированный учет результатов реакции, возможность стандартизации условий постановки анализа делают этот метод наиболее эффективным, удобным, экономичным и выгодным для массовых серологических исследований. Многими зарубежными коммерческими фирмами (KPL, IDEEX, BioChek и др.) предложены тест-системы на основе непрямого ИФА для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в сывортках крови в одном разведении пробы. Но массовое применение этих наборов ограничено высокой стоимостью. Поэтому отечественная ветеринарная практика заинтересована в создании качественных и доступных по цене наборов для выявления антител к мико-плазмам иммуноферментным методом. Для этого необходимо проводить исследования по разработке и испытанию диагностических наборов для выявления антител как к Mycoplasma gallisepticum так и к Mycoplasma synoviae.

Для профилактики микоплазмозов используют иммунизацию птицы живыми и инактивированными вакцинами и антибиотикотерапию. При этом для оценки активности вакцинного сырья используют реакцию геммагглютинации (РГА). При всех своих преимуществах (простота в исполнении, низкая стоимость) РГА не обладает специфичностью по отношению к другим гемагглютинирующим вирусам (ССЯ-76, грипп птиц, НБ). Для количественной оценки специфического антигена многих возбудителей болезней птиц используют такие варианты иммунофермент-ного анализа, как «сэндвич-ИФА» и «блокирующий-ИФА». Актуальными являются исследования по разработке подобных тест-систем для Mycoplasma gallisepticum, позволяющих контролировать качество изготовляемых вакцин и антигенов, предназначенных для создания диагностических наборов.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы явилась разработка иммуноферментных тест-систем для определения уровня антител к возбудителям респираторного микоплазмоза и микоплазменного синовита в сыворотках крови кур и количественной оценки Mycoplasma gallisepticum в бактериальных суспензиях, используемых для производства вакцин и диагностических наборов.

При разработке тест-систем для выявления и определения уровня антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур по конечной точке титрования и при использовании метода одного разведения с компьютерной обработкой результатов необходимо было решить следующие задачи:

- отработать методы получения высокоочищенных и концентрированных препаратов антигенов Mr и Мс и специфических контрольных сывороток крови кур;

- стандартизировать условия проведения реакции;

- установить критерии качественной и количественной оценки результатов;

- провести сравнительное изучение и установить корреляцию между результатами, полученными с помощью разработанной тест-системы, базовых тестов РТГА, РА и зарегистрированных на территории РФ иммуноферментных диагностических наборов (Mycoplasma gallisepticum N POSS US. ФВ01. A08003. и Mycoplasma synoviae N POSS US. ФВ01. A08004.) фирмы KPL (США);

- с помощью разработанных тест-систем провести исследования по оценке иммунного статуса поголовья птиц и определения степени инфицированности стад микоплазмами.

При разработке тест-систем для выявления и количественной оценки антигена Мг в антигенсодержащих суспензиях были поставлены следующие задачи:

- получить высокоочищенные, концентрированные препараты антигена Mr и специфических иммуноглобулинов, выделенных из сывороток крови лабораторных животных;

- стандартизировать условия проведения реакции;

- установить критерии качественной и количественной оценки результатов;

- провести сравнительное изучение и установить корреляцию между результатами, полученными с помощью разработанной тест-системы и базового теста РГА;

- с помощью разработанных тест-систем провести исследования по количественной оценке Mycoplasma gallisepticum в бактериальных суспензиях, используемых для производства вакцин и диагностических наборов.

автоматически с использованием компьютерной программы для регистрации, обработки, хранения результатов иммуноферментного анализа в ветеринарии "СИНКО-ИФА", разработанной во ВНИИЗЖ.

Для выявления и количественной оценки антигена Mycoplasma gallisepticum в антигенсодержащем сырье, предназначенном для производства вакцинных препаратов и диагностикумов, впервые в России разработаны иммуноферментные тест-системы на основе "сэндвич-варианта" иммуноферментного анализа и непрямого жидкофазного блокирующего варианта иммуноферментного анализа с использованием в качестве блокирующих антител аффинно-очищенных IgG сывороток крови животных.

С помощью зарегистрированных на территории РФ иммуноферментных диагностических наборов фирмы KPL (США) и разработанных нами тест-систем проведены исследования по Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae за 1998-2003 гг. с анализом результатов серологического мониторинга ряда птицефабрик из всех регионов Российской Федерации.

Научная новизна полученных нами результатов подтверждена получением патента на изобретение.

Практическая значимость. Утверждены в установленном порядке нормативно-технические документы на «Набор для определения антител к Mycoplasma gallisepticum в сыворотках крови кур иммуноферментным методом» (ТУ 9388-115-00495527), «Набор для определения антител к Mycoplasma gallisepticum иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» (ТУ 9388-116-00495527), «Набор для определения антител к Mycoplasma synoviae иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» (ТУ 9388-087-00495527). Разработаны и утверждены директором ВНИИЗЖ: «Методика очистки и концентрирования антигена Mycoplasma gallisepticum», «Методика определения титра антител к Mycoplasma gallisepticum в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммуно-ферментного анализа», «Методика очистки и концентрирования антигена Mycoplasma synoviae», «Методика определения титра антител к Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммуноферментного анализа», «Методика выявления и определения активности антигена Mycoplasma gallisepticum в непрямом «сэндвич-варианте» иммунофер-ментного анализа», «Методика выявления и определения активности антигена

Mycoplasma gallisepticum в непрямом жидкофазном блокирующем варианте имму-ноферментного анализа».

Разработанные иммуноферментные тест-системы применяются в научно-исследовательской и ветеринарной практике при оценке качества сырья для изготовления диагностических наборов и вакцин, при ретроспективной диагностике Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae и контроле поствакцинального иммунитета.

При использовании диагностических наборов для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae на основе разработанных имму-ноферментных тест-систем в течение 2000-2003 г.г. было исследовано около 20000 сывороток из 297 птицеводческих хозяйств России и ближнего зарубежья, а также реализовано более 900 коммерческих наборов, выпускаемых в ФГУ ВНИ-ИЗЖ.

Основные положения, выносимые на защиту:

- тест-системы на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении;

- результаты использования разработанных тест-систем для контроля иммунного статуса поголовья птицефабрик;

- тест-система на основе «сэндвич-варианта» ИФА для выявления и количественной оценки антигена Mycoplasma gallisepticum в антигенсодержащем сырье;

- тест-система на основе непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА для выявления и количественной оценки антигена Mycoplasma gallisepticum и My-coplasma synoviae в антигенсодержащем сырье;

- результаты применения разработанной тест-системы для определения концентрации антигена в бактериальной суспензии, используемой для производства вакцин и диагностических наборов.

г.), на «Международной конференции молодых ученых» (г. Щелково, 2002 г.), на «Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию IEKBM» (г. Харьков, 2002 г.), на «Международной научной конференции посвященной 45 летию ФГУ ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2003 г.), на «Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института» (г. Покров, 2003 г.), на «Конференции по птицеводству» (г. Зеленоград, 2003 г.), на конференции молодых ученых «Мониторинг и генодиагностика инфекционных болезней животных» (г. Владимир, 2004 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах, иллюстрирована 25 таблицами и 18 рисунками. Список использованной литературы включает 180 источников, из них 161 на иностранных языках.

Исследования по диссертационной работе выполнены в течение 1999-2004 г.г. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир).

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Антигены. Для получения очищенного и концентрированного антигена Мг использовали вакцинный штамм S6 Mycoplasma gallisepticum, для антигена Мс -вакцинный штамм WVU 1853 Mycoplasma synoviae, полученные из ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ, г.Москва). Для получения биомассы Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae использовали среду Frey с 10-15%-ным раствором лошадиной сыворотки и 1% никотинамидадениндинуклеоти-дом (для Мс). Культивирование проводили при температуре 37°С и частоте вращения колб 120 об./мин в течение 24 часов. Отсутствие контаминации бульонной культуры проверяли высевом на селективные среды (мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ) и среду Сабуро.

Инактивация антигенов. Бульонные культуры Мг и Мс инактивировали димером аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,3% при 24°С в течение 6 часов при постоянном перемешивании. Полноту инактивации и отсутствие контаминации проверяли высевом на PPLO-arap, МПА, МПБ, среду Чапека (для Мс), среду Сабуро. Рост культуры отсутствовал.

Предварительная очистка и концентрирование антигенов. Бульонные культуры Mr и Мс концентрировали центрифугированием при ЮОООд в течение 30 мин на центрифуге "К-70" (Германия) и осадок двукратно отмывали от питательной среды фосфатно-буферным раствором (ФБР), рН 7,2. Надосадочную

жидкость сливали, осадок ресуспендировали в ФБР до 1/100 исходного объёма, гомогенизировали и спектрофотометрически определяли концентрацию белка по методу Бредфорда.

Лабораторные животные. Для получения специфических сывороток в качестве доноров использовали клинически здоровых кроликов в возрасте 90-180 дней с массой 2,5-3 кг, клинически здоровых морских свинок в возрасте 30-80 дней с массой 0,4-0,5 кг и кур в возрасте 30-60 дней.

Стандартные антигены. В качестве отрицательного контроля при проведении «сэндвич-варианта» ИФА и непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА использовали среду Frey с добавлением 15% лошадиной сыворотки. В качестве положительного контроля использовали антиген Мг штамм S6 и антиген Мс штамм WVU 1853.

Сыворотки. Материалом для исследования служили сыворотки крови кур с разным уровнем антител к Мг и Мс, определенным предварительно с использованием коммерческих наборов фирмы KPL (США).

Специфические сыворотки кур, кроликов и морских свинок получали путем иммунизации клинически здоровых животных вакцинами и очищенными инактиви-рованными концентратами антигенов Мг и Мс.

Нормальные сыворотки кур, кроликов и морских свинок получали от здоровых доноров, не имеющих антител к Мг и Мс.

Препараты антител. Антитела из специфических гипериммунных сывороток выделяли путем осаждения белков насыщенным раствором сульфата аммония (иммуноглобулины курицы и морской свинки) или аффинной хроматографией с использованием сефарозы с белком А (иммуноглобулины кролика).

Конъюгаты. Использовали коммерческие препараты антивидовых имму-нопероксидазных конъюгатов к IgG курицы, кролика, морской свинки, полученные из ГУНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва) и фирмы KPL (США). Рабочее разведение коньюгата определяли при проведении непрямого варианта ИФА.

Коммерческие наборы. В работе использовали коммерческие наборы "Mycoplasma gallisepticum Antibody Test Kit" и "Mycoplasma synoviae Antibody Test Kit" фирмы KPL (США), зарегистрированные на территории Российской Федерации. Реакцию проводили согласно наставлениям по применению наборов.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Электрофорез проводили по Laemmli (1970) с некоторыми модификациями.

Определение гемагглютинирующей активности антигенов Мг и Мс. Реакцию проводили по стандартной методике на планшетах с использованием 1-2%-ной суспензии эритроцитов кур.

Определение активности антигенов Мг и Мс в реакции агглютинации. Реакцию проводили по стандартной методике на предметных стеклах (Adler Н.Е. 1965).

Постановка реакции торможения гемагглютинации для выявления антител к мимоплазмам в сыворотках крови кур. Проводили по общепринятой методике, разработанной в ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ, г.Москва) и утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ РФ в 1997 г.

Иммуноферментный анализ. В работе использовали непрямой «сэн-двич»-вариант, непрямой жидкофазный блокирующий вариант и непрямой твердофазный варианты ИФА, оптимальные условия постановки которых определяли экспериментально. Окрашивание проводили субстратной смесью ортофенилен-диамином (ОФД) или 2,2'-азино-ди(3-этилбензотиазолина-6-сульфокислоты) ди-аммониевой соли (АБТС). Результаты реакции учитывали на спектрофотометре-ридере при длине волны 492 нм для ОФД или 405 нм для АБТС.

Статистический анализ данных. Для статистической обработки данных использовали компьютерную программу "Statistics for Windows" (USA, Release 4,3, Inc. 1993).

Компьютерный учет результатов. Учет результатов непрямого варианта ИФА, обработку, хранение и анализ полученных данных проводили с использованием компьютерной программы "СИНКО-ИФА" (ФГУ ВНИИЗЖ, свидетельство о регистрации №2000611338).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Получение очищенных и концентрированных препаратов антигенов Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae

В качестве исходного материала использовали выращенную в среде Frey и предварительно очищенную по п. 2.1. бактериальную суспензию, содержащую штамм S6 Mr или штамм WVU 1853 Мс.

Для разрушения микоплазм применяли различные методы, описанные в литературе: обработку ультразвуком; лизис материала с помощью карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ); метод, сочетающий обработку КББ, ДНК-зой и РНК-зой; разрушение клеток додецилсульфатом натрия (ДСН). Как показал анализ результатов, из четырех, опробованных нами методов, оптимальным является метод разрушения клеток микоплазм ДСН с последующим диализом против фос-фатнобуферного раствора (ФБР, рН 7,2-7,4), с добавлением 0,001 М этилендиа-минтетраацетатом (ЭТДА), препятствующим агрегации белков после удаления ДСН. Чистоту полученных таким образом препаратов, концентрация белка в которых составляла 3-5 мг/мл, оценивали под электронным микроскопом и посредством электрофореза в 12,5%-ном полиакриламидном геле (рис. 1). Активность препаратов в РГА составила 7-9 log2, в «сэндвич»-варианте ИФА - 1:12800-25600.

Рис. 1. Электрофорез в 12,5% полиакриламидном геле

Примечание. 1 - очищенный и концентрированный препарат антигена Mycoplasma synoviae; 2 -концентрированный препарат антигена Mycoplasma gailisepticum; 3 - маркер.

Антигены, обработанные ДСН и сенсибилизированные в лунках планшетов, сохраняли активность в ИФА не менее 1 месяца при хранении при 37°С и не менее 12 месяцев при хранении при 4°С и могли быть использованы для проведения непрямого варианта ИФА, а также для иммунизации животных с целью получения специфических сывороток.

2.2.2. Разработка тест-систем для выявления и определения активности антигенов Мг в бактериальной суспензии

2.2.2.1. Разработка тест-системы на основе непрямого «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа. В результате работы определен ряд параметров для оптимизации условий постановки непрямого «сэндвич-варианта» ИФА.

При проверке с контрольными антигенами оптимальные результаты показала комбинация из улавливающих иммуноглобулинов кролика и ^ морских свинок в качестве детекторных антител. Электрофорез препаратов представленный на рис. 2, свидетельствовал о высокой степени очистки при использовании аффинной хроматографии . Иммобилизацию ^ кролика проводили в двух временных режимах: в течение 16-18 часов при 4°С и в течение 2 часов при 37°С в 0.1М карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,5-9,6. Исследования показали, что последний из выбранных режимов оказался недостаточным для полной сорбции антител на планшеты. Для всех последующих стадий ИФА использовали 0,05 М трис^^ с 0,2 М NaCI буферный раствор, рН 7,4-7,6.

Рис.2. Электрофорез в 12,5%полиакриламидномгеле

Примечание. 1 - иммуноглобулины морской свинки, после осаждения (МН^ЭО^асыщ ; 2 - сыворотка морской свинки; 3, 7 - маркеры; 4 - иммуноглобулины кролика после аффинной очистки из сыворотки; 5 - иммуноглобулины кролика, после осаждения (МН^гЗО^асыщ ; 6 - сыворотка кролика, Н -тяжелые цепи иммуноглобулинов, L-легкие цепи иммуноглобулинов.

Время инкубирования на всех этапах составило 1 час при температуре 37°С. При подборе иммунологически индифферентных белков для блокирования остаточных свободных центров связывания лунок планшетов руководствовались тем, что многие белки, используемые для этих целей, входят в состав среды для культивирования микоплазм, поэтому их применение уменьшит специфичность тест-системы. Было проведено сравнение результатов, полученных при использовании планшетов, заблокированных 10% раствором сыворотки крови лошади, 1% обезжиренным сухим молоком, 5% яичным альбумином, 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА). Анализ результатов показал возможность использования в качестве иммунологически индифферентных белков 1% БСА . Проверка на длительность хранения планшетов, сенсибилизированных препаратом ^ G кролика в разведении 1:500, показала наличие у образцов специфической активности в течение двух месяцев (период наблюдения) при 4°С. Оптимальная концентрация специфических ^ морских свинок (детекторные антитела) и антивидового конъюгата, определенная в ИФА, составила 1:1500 и 1:3000, соответственно.

2.2.2.2. Сравнительная оценка «сэндвич»-варианта ИФА и РГА. Для изучения корреляционной зависимости между результатами определения активности антигена МГ в непрямом «сэндвич»-варианте ИФА и РГА были исследованы 25 проб антигенсодержащих материалов. Данные тестирования показали наличие высокого коэффициента корреляции (0,97) между результатами методов (табл.1 ).

Таблица 1

Результаты определения титра антигена Mycoplasma gallisepticum в антигенсодержащих культурах, используемых для изготовления вакцин и диагностических наборов в «сэн-двич»-варианте ИФА и РГА___

№ пробы титр антигена № пробы титр антигена

РГА ИФА РГА ИФА

1 128* 160 15 4096 5120

2 4096 5120 16 2048 2560

3 4096 10240 17 4096 5120

4 254 320 18 2048 2560

5 8192 10240 19 254 320

6 64 160 20 512 1280

7 512 1280 21 2048 2560

8 128 160 22 64 160

9 64 80 23 4096 10240

10 512 1280 24 4096 5120

11 128 254 25 254 640 I

12 2048 5120 Аг' 512 1280

13 4096 10240 Аг' <2 <10

14 8192 20480 коэффициент корреляции 0,97

Примечание Аг * - положительный контрольный препарат антигена, Аг' - отрицательный контрольный препарат антигена, *- за титр антигена в ИфА и РГА принимали величину, обратную разведению

Для выявления и количественной оценки антигенов наряду с «сэндвич»-вариантом широко применяется блокирующий вариант ИФА (Б-ИФА). Этот метод более прост в постановке за счёт меньшего количества стадий, не требует большего количества компонентов, и при этом не уступает «сэндвич»-варианту по чувствительности и специфичности. Поэтому использование его для оценки вакцинного сырья экономически более оправдано и занимает меньше времени. Нами была разработана тест-система на основе Б-ИФА для выявления Mycoplasma gallisepticum в вакцинном сырье.

2.2.2.3. Разработка тест-системы на основе непрямого Б-ИФА для выявления и количественной оценки антигена Мг.

Выбор блокирующих антител. Нами были исследованы препараты иммуноглобулинов из сывороток крови морской свинки, очищенные с помощью сульфата аммония, и кролика, выделенные посредством аффинной хроматографии. Последний метод позволил получить наиболее чистый образец, что подтверждают данные электрофореза (рис.2). Активность препарата антител в непрямом ИФА, составила 1:25600. Этот образец был взят в качестве блокирующих антител.

Оптимизация условий постановки Б-ИФА. В качестве базового варианта нами был принят непрямой блокирующий ИФА, состоящий из жидкой и твердой фаз, и основанный на использовании для выявления антигена антител одного вида. При проведении жидкой фазы ИФА использовали разведение препарата иммуноглобулинов кролика в буферном растворе 0.05М трис-HCI с 0,2М NaCI, pH 7,4-7,6 в рабочем разведении 1:3000, определенном в непрямом ИФА. Оптималь-

ным режимом связывания иммуноглобулинов кролика с исследуемыми пробами являлась их инкубация в пробирке в течение 1 часа при 37° С, после чего смесь наносили на планшет с адсорбированным на нем антигеном Мг. Используя шахматный порядок постановки, определили оптимальные концентрации антигена и антивидового конъюгата, составившие 1:800 и 1:6000 соответственно. Непрямой вариант ИФА для выявления иммуноглобулинов, несвязавшихся в жидкой фазе анализа с антигеном исследуемой пробы, проводили по стандартной методике.

Вычисление позитивно-негативного порога и учет результатов. Полученные значения оптической плотности контрольных и исследуемых проб с блокирующими антителами (БА) переводили в значение процента блокирования (Б(%)) по формуле:

Б(%) = 100- ОП иссл пробы с БА - ОП буфер, р-ра

ОП контроля БА - ОП буфер, р-ра Х100

Для устанавления позитивно-негативного порога (ПНП) вычисляли Б(%) 35 проб модифицированной среды для выращивания микоплазм, не содержащих Мг, протестированных с помощью полимеразной цепной реакции. Разность среднего значения ОП и двух стандартных отклонений определила наибольшее отрицательное значение ОП, разность среднего значения ОП и трех стандартных отклонений - наименьшее положительное значение ОП. Для повышения специфичности системы с учетом возможных погрешностей выделили сомнительную зону. Таким образом, проба с Б(%) 0-40% считалась отрицательной, 41-50% - сомнительной, 51% и выше - положительной. Титром считалось максимальное разведение исследуемой пробы, при котором процент блокирования выше рассчитанного значения ПНП (Б(%)> 50).

2.2.2.4. Сравнительная оценка блокирующего варианта ИФА и реакции гем-магглютинации. При исследовании 50 проб суспензии микоплазм (табл.2) в Б-ИФА и РГА коэффициент корреляции составил 0.96. Пробы с титром выше 16 в РГА (положительные) были положительными в ИФА и показали % Б> 40%. Во ВНИИЗЖ для производства вакцин против респираторного микоплазмоза используют бактериальную суспензию с титром в РГА не менее 1:32. Титр проб бактериальной суспензии в РГА составил от 1:32 до 1:4096, процент блокирования от 51 до 96%. Полученные данные подтверждали возможность применения данных антигенов для изготовления вакцин.

Для определения специфичности разработанной тест-системы наряду с суспензией Мг в Б-ИФА и РГА исследовались вируссодержащие жидкости, используемые для производства моно- и ассоциированных вакцин (в том числе с Мг), бактериальные суспензии, содержащие другие виды микоплазм и модифицированные среды для наработки микоплазм. Анализ результатов показал специфичность Б-ИФА при проверке геммагглютинирующих антигенов. Процент блоки-

рования в реакции с различными гетерологичными антигенами в разведении 1 2 Б(%) составил <40% (табл 3)

Таблица 2

Результаты определения титра антигена Мг в антигенсодержащих культурах, ис-

пол ьзуемых для изготовления вакцин и диагн остических не боров в Б-ИФА и РГА

№ п/п Пробы Титр в РГА Титр в ИФА %Б

1 Культура Мг с лошадиной сывороткой 10% 64* 100 55

2 Культура Мг с лошадиной сывороткой 10% 32 80 51

3 Культура Мг с лошадиной сывороткой 15% 128 160 59

4 Культура Мг с экстрактом желтка 64 80 58

5 Культура Мг с свиной сывороткой 10% 64 100 61

6 Культура Мг с свиной сывороткой 10% 32 100 55

7 Культура Мг с свиной сывороткой 15% 128 100 53

8 Культура Мг с свиной сывороткой 15% 64 160 57

9 Концентрат Мг с лошадиной сывороткой 10% 1024 800 76

10 Концентрат Мг с лошадиной сывороткой 15% 2048 3200 88

11 Концентрат Мг с лошадиной сывороткой 15% 4096 6400 93

12 Концентрат Мг с экстрактом желтка 1024 800 79

13 Концентрат Мг с свиной сывороткой 10% 1024 800 81

14 Концентрат Мг с свиной сывороткой 15% 4096 12800 96

15 Концентрат Мг с свиной сывороткой 15% 2048 6400 92

16 Концентрат Мг с свиной сывороткой 15% 2048 6400 85

17 Аг* 1024 800 79

18 Аг 4 <40 28

Примечание * - за титр принимали величину обратную разведению

Таблица 3

Результаты определения антигена Mycoplasma gallisepticum в антигенсодержащем сырье и

питате льных среда х методами РГА и ИФА

№ пробы титр АГ в РГА Б(%) в Б-ИФА № пробы титр АГ в РГА Б(%) в Б-ИФА № пробы титр АГ в РГА Б(%) в Б-ИФА

1 <2" 8 8 <2 1 15 н/и 37

2 128 29 9 <2 9 16 н/и 17

3 16 1 10 <2 1 17 н/и 4

4 2048 7 11 <2 30 18 4096 64

5 1024 5 12 <2 32 19 4 25

6 4096 2 13 н/и 17 20 512 79

7 <2 10 14 н/и 4

Примечание * - за титр принимали величину обратную разведению,

** - выделены результаты, интерпретированные как отрицательные, н/и - не исследовались,

пробы №1-9 - суспензии, используемые для изготовления вакцин против РЕО, МС,

ИБК, НБ (4-5), ССЯ-76, ИЭП, ИББ, ИЛТ, соответственно,

проба №10- нормальная аллантоисная жидкость,

проба №11- модифицированная среда для МС,

проба №12- модифицированная среда для МГ,

проба №13-17- бактериальные суспензии М bovirhinis, M iowae, M salivanum, Bacillus shuttles, Acholeplasma laidlawn (в РГА не исследовались), проба №18-смесь (11111) вирусных и бактериальных суспензий (НБ+ИБК+ССЯ-76+МС+МГ)

пробы №19-20- контроли Аг- и Аг+ соответственно,

Таким образом, результаты , полученные с помощью Б-ИФА и «сэндвич»-варианта ИФА, были сопоставимы с базовой реакцией, что позволяет применять разработанные тест-системы для контроля бактериальной суспензии, используемой для изготовления моно- и ассоциированных вакцин и диагностических наборов на разных этапах технологического процесса

2.2.3. Разработка тест-систем для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae на основе непрямого варианта иммуно-ферментного анализа

Разработка тест- систем включала в себя определение рабочего разведения сывороток, выведение уравнения линейной регрессии для вычисления титра, определения оптимального диапазона оптической плотности контролей, установление позитивно-негативного порога и на его основе - наименьшего отрицательного титра для количественного учета результатов

Оптимальное разведение сыворотки. Непрямой вариант иммунофер-ментного анализа проводили по стандартной методике с использованием субстрата АБТС. Для выбора оптимального рабочего разведения исследовали 90 сывороток с разным уровнем антител к Мг и Мс в разведениях 1:100, 1:200, 1.400, вычисляли значения S/P (отношение оптической плотности испытуемой сыворотки к разнице между оптическими плотностями положительного и отрицательного контролей) и коэффициент корреляции со значением титров, определенных методом последовательных разведений. Разведение 1:400, имевшее для Мг и Мс наибольший коэффициент корреляции (0,94 и 0,97, соответственно), было выбрано рабочим.

Уравнения линейной регрессии. В соответствии со значениями оптических плотностей исследуемых сывороток были построены калибровочные кривые и выведены уравнения линейной регрессии для определения титров антител к Мг: LG Т = 3,7303 + 1,3591 • LG S/P и к Мс - LG Т = 3,6623 + 1,3752 • LG S/P (рис. 3).

LgT» 3 7303» 1 3591 Чв S/P L(I-16613 HlWLtSi

Коэффициент корреляции г" 93482 Котффикит lopptuun« i" 97171

Lg S/P LlJ*"

Рис.3. Калибровочные кривые и уравнения для определения значения титра антител к Мг (А) и Мс (В)

Выбор допустимых значений оптических плотностей контрольных сывороток. Для получения достоверных результатов при подсчете титра антител в исследуемых сыворотках необходимо учитывать входят ли значения ОП положительного и отрицательного контролей в диапазон допустимых значений.

Эти диапазоны были определены как среднее значение ОП исследованных контрольных сывороток из разных серий с учетом доверительного интервала и составили для Мг: от 0,450 до 1,050 - положительный контроль; от 0,040 до 0,150 -отрицательный контроль; для Мс: от 0,450 до 1,000 и от 0, 065 до 0,150 - положительный и отрицательный контроли, соответственно.

Вычисление позитивно-негативного порога (ПНП). Для этого методом последовательных разведений были исследованы в трех повторностях 30 сывороток крови от цыплят, не имеющих антител к Мг и Мс. Среднее значение их оптических плотностей, суммированное с утроенным стандартным отклонением, составило значение ОП, соответствующее наименьшему положительному значению. По уравнениям линейной регрессии определяли пороговые значения S/P и находили пороговые значения титра, которые составили для Мг - 416, для Мс -425. С учетом возможных погрешностей, допустимых в пределах одного разведения где Т/2 < Т > Т • 2, выделялась сомнительная зона. Таким образом, для Мг титр антител в пределах 0-416 считался отрицательным, 417 - 833 - сомнительным, от 834 и выше - положительным; для Мс: 0 - 425 -отрицательным, 426 - 850 - сомнительным, от 851 и выше - положительным.

Определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем по выявлению антител к Мг и Мс. Проводили сравнительный анализ результатов тестирования сывороток крови кур с применением разработанных тест-систем и коммерческих наборов фирмы KPL (США) (таб. 4).

Таблица 4

Результаты исследования в ИФА 310 сывороток крови кур, присланных из различных пти-

цехозяйств на наличие антител к Mycoplasma ga illisepticum и Mycoplasma synoviae

Исследуемый возбудитель Используемый набор Результат

положительный отрицательный

Mycoplasma gallisepticum набор "KPL" 252J81,9%) 58(18,1%)

набор "ВНИИЗЖ" 250 (80%) 60 (20%)

Mycoplasma synoviae набор"KPL" 268 (86,5%) 42(13 5%)

набор "ВНИИЗЖ" 263 (84,8%) 47(15,2%)

Чувствительность и специфичность разработанных тест-систем по отношению к коммерческим наборам фирмы KPL подсчитывали по методике Hayhow С. S. (1992). Относительная чувствительность составила 98% для Mycoplasma gallisepticum, 96% для Mycoplasma synoviae; специфичность 97% и 90% соответственно. Параметры разработанной тест-системы были введены в компьютерную программу "СИНКО-ИФА", разработанную во ВНИИЗЖ для регистрации, обработки, хранения и анализа результатов исследований.

2.2.4. Применение наборов на основе разработанных тест-систем для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae

2.2.4.1. Выявление антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в ИФА при контроле вакцинных препаратов. Была проведена однократная вакцинация цыплят образцами сорбированной (группы 2, 3) и эмульсионной (группы 1,4) вакцин против Мг (группы 1,2) и Мс (группы 3,4). К 14 дню во всех группах были выявлены антитела к Мг и Мс, причем у цыплят групп 1, 4 - в более высоких титрах. К 28 дню титр антител составил 4,02±0,03 Ig (для Мг) и 3,47±0,05 Ig (для Мс) (рис.4).Таким образом анализ данных динамики поствакцинального иммунитета к Мг и Мс показал более высокий прирост титров антител в группе цыплят, иммунизированных антигеном с масляным адъювантом . В качестве подтверждающего теста использовали реакцию агглютинации, выявившую прирост антител уже на седьмой день после вакцинации (табл. 5).

Рис. 4. Динамика титров антител к Mycoplasma gallisepticum в ИФА у цыплят разных групп после введения эмульсионной и сорбированной вакцин

Таблица 5

Динамика накопления антител к Mycoplasma synoviae в сыворотках крови цыплят, определенная в РА и ИФА, в различные сроки после вакцинации

Тит

эы антител к Mycoplasma synoviae в

Груп до вакцин 7 сут. 14 сут 21 сут 30 сут 60 сут

па РА ИФА РА ИФА РА ИФА РА ИФА РА ИФА РА ИФА

№3 отр. отр (228*) пол. отр (356) пол. пол (897) пол. пол. (2520) пол пол. (2960) пол. пол. (2380)

№4 отр. отр (302) пол. отр. (411) пол. пол. (1182) пол. пол. (3115) пол. пол. (3498) пол. пол. (3214)

контроль отр. отр. (270) отр. отр. (327) отр. отр (282) отр. отр. (350) отр. отр. (370) отр. отр (345)

Примечание: № 3 - цыплята, привитые сорбированной вакциной, № 4 - цыплята, привитые эмульсионной вакциной; * - за титр принимали величину обратную разведению.

2.2.4.2. Исследования полевых сывороток на наличие антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae с применением базовых реакций РА, РТГА и разработанных тест-систем. Определение динамики накопления материнских антител. При анализе результатов тестирования 40 проб сывороток крови цыплят, отобранных в возрасте 1, 3, 7, 14, 18 дней на наличие антител к Мг и Мс из трех птицефабрик была выявлена общая тенденция падения уровня титра ниже минимального положительного к 15-20 дню (рис 5) Наличие в суточном возрасте антител к Мг и Мс в 30% проб свидетельствует о возможном инфицировании родительских стад микоплазмами

1600 т--

О CL

о в

и g-

Ю 20 30 40 50 дни

Рис 5. Динамика падения титров материнских антител против Мг и Мс

Определение степени инфицированности стад микоплазмами. Исследовали 100 сывороток от невакцинированной птицы с различным уровнем антител к Мг в РТГА и ИФА и 60 сывороток с различным уровнем антител к Мс в РА и ИФА Результаты тестов подвергали регрессионному анализу Коэффициент корреляции между результатами РТГА и ИФА составил 0,790, между результатами РА и ИФА-0,786

На основании приведенных результатов исследований можно заключить, что разработанные тест-системы на основе непрямого варианта ИФА могут быть использованы для количественной оценки антител к Мг и Мс при определении иммунного статуса птицы, а также эффективности вакцинации наряду с коммерческими наборами ИФА и базовыми реакциями

3.2.5. Изучение эпизоотической ситуации по респираторному микоплазмозу и инфекционному синовиту на птицефабриках Российской Федерации в 1996-2003 годах по данным серологического мониторинга с применением наборов ИФА

С использованием наборов ИФА на основе разработанных тест-систем и коммерческих наборов фирмы KPL (США) в 1996-2003гг были исследованы 31650 полевых сывороток крови кур на антитела к Мг, и 22696 - на антитела к Мс, из 290 птицехозяйств 56 областей, относящихся к 7 регионам РФ, не проводивших вакцинацию против этих заболеваний

Рис.6. Возрастная динамика уровня антител к Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур, полученных из птицефабрик РФ

12000

8000

4000

i Ij jJ

| ■ , ■ IM« HI и Ii |.l|l|.i Vi mjraq

1.-5 10- 20- 20- 30- 60- 90- 120- 150- 200- 300- 400 20 30 30 60 90 120 150 200 300 400 И>

Рис.7. Изменение уровня антител к Mycoplasma gallisepticum в зависимости от возраста в сыворотках крови кур на исследованных птицефабриках РФ

Часть этих сывороток была проверена одновременно на обе инфекции (рис. 6, 7).

Результаты проведенного серомониторинга:

- показали повсеместное распространение Мг и Мс в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации, причем наибольшие значения титров антител в крови кур были выявлены на птицефабриках Центрального Нечерноземья, Поволжья и Восточной Сибири;

- подтвердили результаты проведенных ранее исследований о том, что к трехнедельному возрасту у цыплят полностью исчезают материнские антитела к Mr и Мс, уровень которых в суточном возрасте был максимальным;

- показали, что до пятой недели антитела не выявляются, а затем начинается постепенный прирост титров антител;

- выявили общую тенденцию к нарастанию титров антител в хозяйствах до 1000+100 при респираторном микоплазмозе к 16-22 неделе, а при инфекционном синовите к 16-19, а в некоторых стадах, к 8-10 неделе.

Данные, полученные при испытании тест-систем, позволили разработать и утвердить комплекты НТД и организовать выпуск коммерческих иммунофермент-ных наборов для выявления и количественного определения антител к микоплаз-мам птиц.

5. ВЫВОДЫ

1. Отработаны методики очистки и концентрирования антигенов Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae; получены иммуноспецифические компоненты: препараты антигена и гипериммунных сывороток.

2. Разработана тест-система на основе непрямого «сэндвич-варианта» ИФА для выявления и определения активности суспензии Mycoplasma gallisepticum, используемой в производстве вакцин и диагностических наборов При сравнении тест-системы с базовой реакцией РГА получен высокий коэффициент корреляции (0.97) между результатами тестирования гомологичных и гетерологичных образцов.

3. С помощью аффинной хроматографии выделены иммуноглобулины кролика, с применением которых разработана тест-система на основе непрямого жидкофаз-ного блокирующего варианта ИФА для выявления и количественного определения антигена Mycoplasma gallisepticum в бактериальной суспензии. Показана его специфичность по сравнению с РГА, что позволяло выявлять Mycoplasma gallisepticum в смеси с другими геммаглютинирующими микоплазмами или вирусами.

4. Разработаны тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и количественного определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae при исследовании сывороток в одном разведении, относительные чувствительность и специфичность которых по сравнению с коммерческим набором фирмы KPL составили 98% и 97% для Mycoplasma gallisepticum; 96% и 90%для Mycoplasma synoviae, соответственно.

5. При использовании разработанных тест-систем для выявления антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в ИФА для контроля вакцинных препаратов, установлено, что иммунизация птицы микоплазменными антигенами с масляным адъювантом стимулировала получение более выраженного иммунного ответа у привитой птицы, чем введение антигенов, сорбированных на гидроокиси аллюминия.

6. Установлена статистически достоверная корреляция между результатами выявления титров антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae при исследовании полевых сывороток с использованием разработанных тест-систем и с помощью базовых реакций. Коэффициент корреляции между результатами, полученными с применением РТГА и ИФА составил 0,790, между результатами, полученными с применением РА и ИФА - 0,786.

7. Серологический мониторинг птицеводческих хозяйств Российской Федерации, проведеный в 1998-2003гг, с использованием коммерческих и разработанных им-муноферментных тест-систем, свидетельствовал о распространении микоплазмо-зов в 80-100% обследованных птицехозяйств.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагается нормативно-техническая документация:

- на "Набор для выявления антител к Mycoplasma gallisepticum иммунофермент-ным методом", Технические условия и Наставление по применению, которые утверждены Департаментом ветеринарии РФ в 2004г.;

- на "Набор для выявления антител к Mycoplasma gallisepticum иммунофермент-ным методом при тестировании сывороток в одном разведении", Технические условия и Наставление по применению, которые утверждены Департаментом ветеринарии РФ в 2004г.;

- на "Набор для выявления антител к Mycoplasma synoviae иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении", Технические условия и Временное наставление по применению, которые утверждены Департаментом ветеринарии РФ в 2002г.;

Кроме того для использования предлагаются разработанные и утвержденные директором ФГУ ВНИИЗЖ следующие методики:

- «Методика очистки и концентрирования антигена Mycoplasma gallisepticum» (авторы: Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С.Дрыгин В.В., Борисов А.В, Ирза В.Н.) 2000 г.;

- «Методика очистки и концентрирования антигена Mycoplasma synoviae» (авторы: Волкова И.А., Волков М.С., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Ирза В.Н.), 2003 г.;

- «Методика выявления титра антител к Mycoplasma gallisepticum в сыворотках крови кур иммуноферментным методом» (авторы: Волкова И.А., Гирин М.В., Муд-рак Н.С.,Дрыгин В.В., Борисов А.В, Ирза В.Н.), 2001 г.;

- «Методика определения титра антител к Mycoplasma gallisepticum в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммуноферментного

анализа» (авторы: Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С.Дрыгин В.В., Борисов

A.В, Ирза В.Н.), 2001 г.;

- «Методика определения титра антител к Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммуноферментного анализа» (авторы: Волкова И.А., Волков М.С., Мудрак Н.С..Дрыгин В.В., Ирза В.Н.), 2004 г.;

- «Методика выявления и определения активности антигена Mycoplasma gallisepticum в непрямом «сэндвич-варианте» иммуноферментного анализа» (авторы: Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С..Дрыгин В.В., Ирза В.Н.), 2002 г.

- «Методика выявления и определения активности антигена Mycoplasma gallisepticum в непрямом жидкофазном блокирующем варианте иммуноферментного анализа» (авторы: Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С.Дрыгин В.В., Ирза

B.Н.), 2002 г.

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ . ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выбор оптимальных условий очистки антигена возбудителя респираторного микоплазмоза птиц для непрямого варианта ИФА/Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В.//Достижения молодых ученых в вет. практ. (Матер, конф. мол-х уч-х). -Владимир. -2000. -С.200-201.

2. Сравнительная оценка РТГА и непрямого варианта ИФА при определении антител к Mycoplasma gallisepticum/Волкова И. А., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Гирин М.В., Борисов А.В., Ирза В.Н.//Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации вет. препаратов: тез. докл. - М . -2001. -С.123-124.

3. Разработка тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к Mycoplasma gallisepticum при тестировании сывороток в одном разведении/Волкова И. А., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Гирин М.В., Борисов А.В., Ирза В.Н.//Уч. зап. Витебск, гос. акад. вет. мед. -Витебск. -2001. -Т.37,4.2. - С.23-24.

4. Разработка непрямого жидкофазного блокирующего варианта иммуно-ферментного анализа для выявления и определения активности антигена Mycoplasma gallisepticum/Волкова И. А., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В.//С6. докл. Меж-дунар. конф. молодых ученых. -Щелково. -2002. -С.77-79.

5. Разработка непрямого «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа для выявления и определения активности антигена Mycoplasma

»t78 9ft

gallisepticum/Волкова И. А., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В.//Вет. медицина: Мiжвид. тем. наук. зб. 80 рок. 1ЕКВМ. -Харкiв. -2002. -С.132-136.

6. Изучение эпизоотической ситуации no Mycoplasma synoviae

на птицефабриках Российской Федерации в 1999-2001 годах по данным серологического мониторинга с применением ИФА/И.А. Волкова, М.С. Волков, Н.С. Мудрак,

B.В. Дрыгин, В.Н. Ирза//Мат. межд. науч. конф. поев. 45 лет. ФГУ ВНИИЗЖ. -Владимир. -2003. -С.265-269.

7. Разработка и применение тест-системы на основе непрямого иммуно-ферментного анализа для определения антител к возбудителю инфекционного синовита в сыворотках крови кур методом одного разведения/И.А. Волкова, М.С. Волков, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза//Мат. межд. науч. конф. поев. 45 лет. ФГУ ВНИИЗЖ. -Владимир. -2003. -С.260-265.

8. Серологический монитиринг птицехозяйств РФ по авиреовирусной инфекции и синовиальному микоплазмозу/Куприянов А.И., Волкова И.А., Шкиря В.В., Мудрак Н.С, Ирза В.Н., Дрыгин В.В., Старое С.К.//Аграрная Россия. -2002. -№2. -

C.20-24.

9. Набор для обнаружения антител к возбудителю респираторного мико-плазмоза птиц/ Гирин М.В., Ирза В.Н., Волкова И.А., Борисов А.В., Кузнецов В.Н., Гусев А.А., Дрыгин В.В.// Патент на изобретение № 2202797. -Москва. - 2003. -8с.

10. Применение РДП при диагностике микоплазмозного синовита птиц/Волков М.С, Ирза В.Н., Волкова И.А., Оковытая Т.В.//Вет. и мед. аспекты зооантропонозов: Тр. Международ, науч. практ. конф., посвящ. 45-летию института. -Покров. -2003. -4.2. -С -482-486.

11. Разработка и испытание диагностического набора для обнаружения антител к возбудителю микоплазмозного синовита птиц в реакции агглютинации/ Волков М.С, Ирза В.Н., Борисов А.В., Волкова И.А., Черняева Т.Ю.//Конференция по птицеводству: Матер, конф. -Зеленоград. -2003. -С.223-224.

12. Разработка и применение тест-системы на основе непрямого иммуноферментного анализа для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза кур в сыворотках крови птиц методом одного разведения/Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С, Дрыгин В.В., Ирза В.Н.// Международ, науч. конф. Молодых ученых: «Проблемы монитиринга и генодиагностики инфекционных болезней животных». - 2004. - С.118-123.

РНБ Русский фонд

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ ««Феде

Тираж 100 экз; с

13643

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волкова, Ирина Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения о респираторном микоплазмозе и инфекционном синовите.

2.2. Общая характеристика возбудителей респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита.

2.2.1.Таксономическое положение Мг и Мс.

2.2.2.Морфология колоний и структурно-химический состав.

2.2.3.Резистентность к физико-химическим воздействиям.

2.2.4.Антигенная активность Мг и Мс.

2.2.5.Геммаглютинирущая активность Мг и Мс.

2.2.6.Патогенность Мг и Мс.

2.3. Патогенез и патоморфологические изменения.

2.4. Эпизоотологические данные.

2.5. Иммунитет, лечение и профилактика.

2.6. Диагностика респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита.

2.6.1.Обнаружение антигенов Мг и Мс.

2.6.2,Обнаружение антител к Мг и Мс.

2.7. Иммуноферментный анализ.

2.7.1.Сущность иммуноферментного анализа.

2.7.2.ИФА для обнаружения антигенов.

2.7.3.ИФА для обнаружения антител.

2.7.4.Применение ИФА для выявления микоплазменных антител.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики микоплазмозов птиц"

Впервые микоплазмозы были зарегистрированы в 1935 г. в США (Nelson J.), а впоследствии - во всех странах с развитым птицеводством, что связывают с крупномасштабной индустриализацией птицеводства, увеличивающимся экспортом и импортом птицы [106, 123, 128]. Экономический ущерб от этих заболеваний складывается из потерь от гибели эмбрионов и цыплят, снижения массы тела птицы, яйценоскости, оплодотворяемости яиц, выводимости цыплят. Кроме того, микоплазмы обладают выраженным супрессирую-щим влиянием на иммунную систему организма и осложняют течение многих вирусных и бактериальных инфекций [60,107].

Поэтому окончательный диагноз устанавливают на основе лабораторного исследования, включающего традиционные методы ранней и ретроспективной диагностики, к которым относятся: реакция агглютинации (РА), реакция торможения геммагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция задержки роста (РЗР) [109, 111]. Однако при всех своих преимуществах (простота постановки и непродолжительность по времени, достаточно высокая чувствительность и специфичность), они отличаются субъективностью оценки, часто дают ложноположительные результаты. Использование таких современных методов, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) для массовых исследований ограничено высокой стоимостью оборудования и компонентов.

Поэтому в настоящее время широкое распространение получил ИФА, как высокочувствительный и специфичный метод [93, 108]. Быстрота получения, воспроизводимость и автоматизированный учет результатов реакции, возможность стандартизации условий постановки анализа делают этот метод наиболее эффективным, удобным, экономичным и выгодным для массовых серологических исследований. Многими зарубежными коммерческими фирмами (KPL, IDEEX, BioChek и др.) предложены тест-системы на основе непрямого ИФА для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в сывортках крови в одном разведении пробы [100]. Но массовое применение этих наборов ограничено высокой стоимостью. Поэтому отечественная ветеринарная практика заинтересована в создании качественных и доступных по цене наборов для выявления антител к микоплазмам им-муноферментным методом. Для этого необходимо проводить исследования по разработке и испытанию диагностических наборов для выявления антител как к Mycoplasma gallisepticum так и к Mycoplasma synoviae.

Для профилактики микоплазмозов используют иммунизацию птицы живыми и инактивированными вакцинами и антибиотикотерапию. При этом для оценки активности вакцинного сырья используют реакцию геммагглютинации (РГА). При всех своих преимуществах (простота в исполнении, низкая стоимость) РГА не обладает специфичностью по отношению к другим гемагглюти-нирующим вирусам (ССЯ-76, грипп птиц, НБ). Для количественной оценки специфического антигена многих возбудителей болезней птиц используют такие варианты иммуноферментного анализа, как «сэндвич-ИФА» и «блоки-рующий-ИФА». Актуальными являются исследования по разработке подобных тест-систем для Mycoplasma gallisepticum, позволяющих контролировать качество изготовляемых вакцин и антигенов, предназначенных для создания диагностических наборов.

- отработать методы получения высокоочищенных и концентрированных препаратов антигенов Мг и Мс и специфических контрольных сывороток крови кур;

- стандартизировать условия проведения реакции;

- установить критерии качественной и количественной оценки результатов;

- получить высокоочищенные, концентрированные препараты антигена Мг и специфических иммуноглобулинов, выделенных из сывороток крови лабораторных животных;

- стандартизировать условия проведения реакции;

- установить критерии качественной и количественной оценки результатов;

Научная новизна. Впервые в России разработана иммуноферментная тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для выявления и количественной оценки специфических антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae при тестировании сывороток крови в одном разведении. Метод учета результатов тестирования предусматривает определение титра антител по уравнению регрессионной зависимости, осуществляемое автоматически с использованием компьютерной программы для регистрации, обработки, хранения результатов иммуноферментного анализа в ветеринарии "СИНКО-ИФА", разработанной во ВНИИЗЖ.

Научная новизна полученных нами результатов подтверждена получением патента на изобретение.

Практическая значимость. Утверждены в установленном порядке нормативно-технические документы на «Набор для определения антител к

Mycoplasma gallisepticum в сыворотках крови кур иммуноферментным методом» (ТУ 9388-115-00495527), «Набор для определения антител к Mycoplasma gallisepticum иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» (ТУ 9388-116-00495527), «Набор для определения антител к Mycoplasma synoviae иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» (ТУ 9388-087-00495527). Разработаны и утверждены директором ВНИИЗЖ: «Методика очистки и концентрирования антигена Mycoplasma gallisepticum», «Методика определения титра антител к Mycoplasma gallisepticum в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммуноферментного анализа», «Методика очистки и концентрирования антигена Mycoplasma synoviae», «Методика определения титра антител к Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммуноферментного анализа», «Методика выявления и определения активности антигена Mycoplasma gallisepticum в непрямом «сэндвич-варианте» иммуноферментного анализа», «Методика выявления и определения активности антигена Mycoplasma gallisepticum в непрямом жидкофазном блокирующем варианте иммуноферментного анализа».

При использовании диагностических наборов для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae на основе разработанных иммуноферментных тест-систем в течение 2000-2003 г.г. было исследовано около 20000 сывороток из 297 птицеводческих хозяйств России и ближнего зарубежья, а также реализовано более 900 коммерческих наборов, выпускаемых в ФГУ ВНИИЗЖ.

Основные положения, выносимые на защиту: - тест-системы на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении;

- результаты использования разработанных тест-систем для контроля иммунного статуса поголовья птицефабрик;

- тест-система на основе непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА для выявления и количественной оценки антигена Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в антигенсодержащем сырье;

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1999-2003 г., на конференции молодых ученых ФГУ ВНИИЗЖ «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2000 г.), на Всероссийской научной конференции во ВГНКИ «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (г. Москва, 2001 г.), на международной научной конференции в БГВА «Современные проблемы генетики» (г. Витебск, 2001 г.), на «Международной конференции молодых ученых» (г. Щелково, 2002 г.), на «Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию IEKBM» (г. Харьков, 2002 г.), на «Международной научной конференции посвященной 45 летию ФГУ ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2003 г.), на «Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института» (г. Покров, 2003 г.), на «Конференции по птицеводству» (г. Зеленоград, 2003 г.), на конференции молодых ученых «Мониторинг и генодиагностика инфекционных болезней животных» (г. Владимир, 2004 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ.

Исследования по диссертационной работе выполнены в течение 19992004 г.г. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ ВНИ-ИЗЖ, г. Владимир).

Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. H.A. Перевозчиковой, д.б. н. В.Л. Узюмову, д.б.н. А.П. Пономареву, к.б.н. Н.С. Мудрак, к.в.н. В.Н. Ир-зе, к.б.н. H.H. Луговской, к.б.н. М.А. Волковой, к.в.н. М.В. Гирину, к.б.н. М.С. Волкову, Ю.В. Зинковскому, к.б.н Т.В. Оковытой, к.б.н. А.И. Куприянову- за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Волкова, Ирина Александровна

5. ВЫВОДЫ

1. Для разработки иммуноферментных тест-систем для выявления микоплаз-менных антигенов и для выявления антител к микоплазмам отработаны методики очистки и концентрирования антигенов Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae; получены иммуноспецифические компоненты: препараты антигена и гипериммунных сывороток.

2. Разработана тест-система на основе непрямого «сэндвич-варианта» ИФА для выявления и определения активности бактериальной суспензии Mycoplasma gallisepticum, используемой для производства вакцин и диагностических наборов. При сравнении тест-системы с базовой реакцией РГА получен высокий коэффициент корреляции (0.97) между результатами тестирования гомологичных и гетерологичных образцов.

3. С помощью аффинной хроматографии получены иммуноглобулины кролика, на основе которых разработана тест-система на основе непрямого жидко-фазного блокирующего варианта ИФА для выявления и количественного определения антигена Mycoplasma gallisepticum в бактериальной суспензии. Показана его специфичность по сравнению с РГА, что позволяло выявлять Mycoplasma gallisepticum в смеси с другими геммаглютинирующими микоплазма-ми или вирусами.

5. При использовании разработанных тест-систем для выявления антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в ИФА при контроле вакцинных препаратов, установлено, что иммунизация птицы микоплазменными антигенами с масляным адъювантом стимулировала получение более выраженного иммунного ответа у привитой птицы, чем введение антигенов, сорбированных на гидроокиси аллюминия.

7. При проведении в 1998-2003гг. серологического мониторинга птицеводческих хозяйств Российской Федерации, не проводящих вакцинацию птицы против Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae, с использованием ИФА установлено широкое распространение микоплазмозов (80-100% от исследованных).

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагается нормативно-техническая документация:

- на "Набор для выявления антител к Mycoplasma gallisepticum иммунофер-ментным методом" Технические условия и Наставление по применению, которые утверждены Департаментом ветеринарии РФ в 2004г.;

- на "Набор для выявления антител к Mycoplasma gallisepticum иммунофер-ментным методом при тестировании сыворотки в одном разведении" Технические условия и Наставление по применению, которые утверждены Департаментом ветеринарии РФ в 2004г.;

- на "Набор для выявления антител к Mycoplasma synoviae иммунофермент-ным методом при тестировании сыворотки в одном разведении" Технические условия и Временное наставление по применению, которые утверждены Департаментом ветеринарии РФ в 2002г.;

Кроме того для использования предлагаются разработанне и утверждение директором ФГУ ВНИИЗЖ следующие методики:

- «Методика очистки и концентрирования антигена Mycoplasma gallisepticum» (авторы: Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С.,Дрыгин В.В., Борисов А.В, Ир-за В.Н.);

- «Методика очистки и концентрирования антигена Mycoplasma synoviae» (авторы: Волкова И.А., Волков М.С., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Ирза В.Н.)

- «Методика выявления титра антител к Mycoplasma gallisepticum в сыворотках крови кур иммуноферментным методом», авторы: Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С.,Дрыгин В.В., Борисов А.В, Ирза В.Н.;

- «Методика определения титра антител к Mycoplasma gallisepticum в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммунофер-ментного анализа», авторы: Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С.,Дрыгин В.В., Борисов А.В, Ирза В.Н.

- «Методика определения титра антител к Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммунофермент-ного анализа», авторы: Волкова И.А., Волков М.С., Мудрак Н.С.,Дрыгин В.В., Ирза В.Н.

- «Методика выявления и определения активности антигена Mycoplasma gallisepticum в непрямом «сэндвич-варианте» иммуноферментного анализа», авторы: Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С.,Дрыгин В.В., Ирза В.Н.

- «Методика выявления и определения активности антигена Mycoplasma gallisepticum в непрямом жидкофазном блокирующем варианте иммуноферментного анализа», авторы: Волкова И.А., Гирин М.В., Мудрак Н.С.,Дрыгин В.В., Ирза В.Н.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волкова, Ирина Александровна, Владимир

1. Антитела. Методы / Под. ред. Д. Кэтти. М.: Мир, 1991. - 382с.1а.Байдевлятов А.Б. Пути повышения жизнеспособности птицы в промышленном птицеводстве // Научно-технический бюллетень Украинского НИИ птицеводства. 1979. - №6. - с.38.

2. Балашова В.В. Микоплазмы и железобактерии. М.: Наука. 1974. - С.65.2а.Грошева Г.А. Микоплазменные инфекции и меры борьбы с ними //Тр. ВНИИ экспер. вет., М. 1980. - №51. - с.10-15.

3. Дудникова Е.К. Разработка и применение ИФА для выявления противоящур-ных антител в сыворотках крови животных: Дис. канд. вет. наук. Владимир, 1997.-161с.

4. Дьяконова Е.В., Шубин В.А. Изучение экспериментальной смешанной инфекции ларинготрахеита и микоплазмоза у цыплят // Бюл. ВИЭВ. № 68. - С.4 -22.

5. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: Высш. школа, 1991. 288с.

6. Ибрагимов А. А., Голд Я. Р., Осколков В. С. Патоморфология и дифференциальная диагностика болезней птиц // Ветеринария. 1981. - № 4. - с. 42-45.

7. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т. Т. Нго, Г. Ленхоффа. М.: Мир, 1988.- 444 с.

8. Каулен Д.Р., Каган Г.Я., Ланге А. Микоплазма новый объект микробиологии/Будущее науки. Междунар. ежегодник - М., 1984. - №17. - С. 224-243.

9. Киприч В.В. Изучение биологических свойств птичьих микоплазм при культивировании их на различных питательных средах // Ветеринария, Киев. 1966.- № 9. С.113.

10. Киприч В.В. О серологической диагностике микоплазмозов птиц // Ветеринария.-1967.-№ 5.-С.46.

11. Коваленко Я.Р., Шегидевич Э.А., Яблонская И.А. Методические рекомендации по выделению, культивированию и идентификации микоплазм, ахолеплазм и уреплазм. М, 1982. - 43 с.

12. Коромыслов Г. Ф., Месарош Я., Штипкович Л. и др. Микоплазмы в патологии животных. М.: Агропромиздат, 1987. - 256 с.

13. Прозоровский С. Р., Левина Г. А, Рыжов Е. В. Сравнительное изучение патогенных свойств некоторых видов L-форм бактерий и микоплазм // Вестн. АМН СССР.-1969.-№5.-С. 72.

14. Прокофьева М. Т., Гурова Е. И., Киприч В. В., Герман В. В. Микоплазмоз кур и биологические свойства его возбудителя // Ветеринария. 1964. - № 2. - С. 32.

15. Пустовар А. Я., Киприч В. В., Авдосьева И. К. Микоплазмозы сельскохозяйственных животных. Киев: Урожай, 1978. - 115 с.

16. Сергеев В. Д., Никитина Н. В., Мухамедшина А. Р. Иммуноферментный метод в диагностике болезни птиц // Основы профилактики болезней с.х птицы. Л., 1989.-С. 75-82.

17. Скрипаль И. Г. Биология микоплазм (молликутов) // Успехи микробиологии. -1984. № 3. - С. 74-106.

18. Сюрин В. Н., Самуйленко А. Я., Соловьев Б. В., Фомина Н. В. Вирусные болезни животных. М.: ВНИИТиБП, 1998.

19. Abdelmoumen В. В., Roy R. S. An enzyme-linked immunosorbenc assay for detection of avian mycoplasmas in culture //Avian Dis. -1995. -V.39. -P.85—93.

20. Adier H. E. Mycoplasma, the cause of chronic respiratory disease. Ann // N. Y. Acad. Sci. 1960 V. 79. - P. 703-712.

21. Adier H. E., Yamamoto R, 1956. Studies on chronic coryza (Nelson) in the domestic fowl // Cornell Vet. 1956 V.46 P. 337-343.

22. Adler H. E., McMartin D. A., Ortmayer H. The effect of infectious bronchitis virus on chickens infected with Mycoplasma gallisepticum II Avian Dis. 1962. - V.6. - P. 267-274.

23. AI Afaleq A., Bradbury J. M, Jones R. C, Metwali A. M. Mixed infection of turkeys with Mycoplasma synoviae and reovirus: field and experimental observations // Avian Pathol. 1989 V.18 P. 441-453.

24. Amikam D. G., Rasin S. Mycoplasmas (Mollicutes) have a low number of rRNA genes // J. Bacteriology.- 1984.- V. 158.- P. 376 378.

25. Anderson D. P., Wolfe R. R., Cherms F. L., Roper, W. E. 1968. Influence of dust and ammonia on the development of air sac lesions in turkeys // Am. J. Vet. Res. -1968.-V.29-P. 1049-1058.

26. Ando K. Diagnosis and prevention of CRD Mycoplasma gallisepticum infection of chicken in Japan // Bull. Off. Jnt. Epiz. 1969. - V. 72. - N1. - P.381.

27. Ansari A. A., Taylor R.F., Chang T.S. Application of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detecting Antibody to Mycoplasma gallisepticum Infections in Poultry // Avian Dis.- 1983.- V.27.-1.- P.21-35.

28. Arvinti Libiana, Carol-Dumitrin Emilia. Aspect ale infectimixe Mycoplasma gallisepticum E.coli // Zucr stilnst agron N. Bleescu. 1976. - V. 16. - P. 37-40.

29. Asnani P. J., Agarwal S.C. Biological properties of avian mycoplasma species in India // Proc. Indian Nat. Sei. Acad. 1975. - V.134, N 4. - P. 390-396.

30. Athana A., Rosengarten R., Livinson S., e.a. Adherence of Mycoplasma gallisepticum involves variable surface membrane proteins. // Infect. Immun. 1997.- V.65.-P. 2468-2471.

31. Avakian A. P., Kleven S. H. The humoral immune response of chickens to Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae studied by immunoblotting // Vet. Microbiol. -1990. -V. 20. P.95-107.

32. Baba T., Masumoto K., Nishida S. e. a. Harderian gland dependency of immunoglobulin A production in the lachrymal fluid of chickens // Immunology. 1988. -V.65. — P. 67-71.

33. Barile M.F., Razin S. The Mycoplasmas. I. Cell Biology. Acad. N. Y.: Press. -1979.-P.

34. Barile M.F., Razin S., Smith P.F., Tully J.G Reviews of infectious disease. Suppl. Current Topics of Mycoplasmology / Univ. of Chicago Press, -1982. V.4.

35. Barile M. F., Rotten S. Mycoplasmas in cell culture II Kahane J. Rapid diagnosis of mycoplasmos. N. Y.- 1993.- P. 155 - 189.

36. Baseggio, N. Glew M. D., Markham P. F. e. a. Size and genomic location of the pMGA multigene family of Mycoplasma gallisepticum / Microbiology. 1996. -V.142.-P. 1429-1435.

37. Baseman J. B., Lange M., Criscimangna N. L., e. a. Interplay between mycoplasmas and host target cells//Microb. Pathog.- 1995.-V. 19.-P. 105-116.

38. Bencina, D., Kleven S. H., Elfaki M. G„ e.a. Russ, Variable expression of epitopes on surface of Mycoplasma gallisepticum demonstrated with monoclonal antibodies //Avian Pathol.-1994 V.23 - P.19-36.

39. Bradbury J.M., Aldul-Wahab O.M.S., Vavari C.A., e. a. Mycoplasma imitans sp. Nov. Is related to Mycoplasma gallisepticum and found in birds // Int. J. Syst. Bacte-riol.-1993-V.43. P. 721-728.

40. Bradbury, J. M. Avian mycoplasma infections: prototype of mixed infections with mycoplasmas, bacteria and viruses. Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur). 1984 - V. -135.-P. 83-89.

41. Bradbury, J. M., Garuti A. Dual infection with Mycoplasma synoviae and a tenosynovitis inducing reovirus in chickens //Avian Pathol. 1978. - V.7. - P. 407-420.

42. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. -V.72.-P. 248-254.

43. Bradley, L. S., Snyder D. B.,Van R. A. Den-sen. Identification of species-specific and imerspe-cies-specific polypeptides of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae //Am. J. Vet. Res.- 1998.- V.49. P. 511-515.

44. Branton S. L., Gerlach H., Kleven. S. H. Mycoplasma gallisepticum isolation in layers//Poultry. Sci. -1984.-V.-63.-P. 1917-1919.

45. Branton S. L., Simmons J. D. Design of a poultry disease isolation facility with programmable environmental control //Appl. Eng. Agric. -1992. -V.8. P.695 — 699.

46. Cane U., McNamee R. The spread of infection in a heterogeneous population // J. of Appl. Probability. 1982. - Spec. V. I9a. - P. 173.

47. Carlson H. C. Serological and cultural studies of chicken breeding flocks and their progeny for Mycoplasma // Avian Dis. 1967. - V.2, N 1. - P. 24.

48. Carpenter T.E., Mallinson E.T., Miller K.F., e. a. Vaccination with F-strain to reduce production losses in layer chickens//Avian Dis.-1981.-V.25.-P.404 -409.

49. Cassell G. H., Clyde W. A., Davis J. K. Mycoplasmas respiratory infections // Rasin S., Baril (ed), The Mycoplasmas. Mycoplasma pathogenicity // Inc. Orlando, Academic Press.-1985.- V.4.- P.69 106.

50. Cassell G.H., Brown M. B. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antimycoplasmal antibody // Methods in Mycoplasmology / Razin S. , Tully J.G. eds. Academic Press, N. V. USA; London, UK. 1983.-V. 1. - P.457-469.

51. Chalguest R.R. A Statistical Model to optimize indirect Sandwich Enzyme-Linked immunosorbent assay parameters of antigen and antibody: a microcomputer program // Avian Dis. -1987. -V. 31. P. 509-512.

52. Clyde W. A. Growth inhibition tests // Methods in Mycoplasmology. Vol. I. Razin S., Tully J.G. eds. Acad. Press, N. Y. USA; London, UK. - 1983. - P. 405-410.

53. Cole B. C. Mycoplasma interaction with the immune system: implication for disease pathology//ASM News.-1996.-V.62.- P.471 -475.

54. Czifra G., Sundquist B., Tuboly T. Stipkovitts L. Evaluation a monoclonal blocking enzyme-linked immunosorbent assay for the detection Mycoplasma gallisepticum-specific antibodies // Avian Dis. 1993. - V. 37. - P.680-688.

55. Dascher C. C. and Maniloff J. Heat shock response // Maniloff J. Elhaney P. N. Finch L. R. Baseman J. B. (ed). Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis / American Society for Microbiology. Washington D. C.-1992.- P. 349 - 354.

56. Dierks R. E., Newman J. A., Pomeroy B. S. Characterization of avian mycoplasma //Ann. N. Y. Acad. Sci. -1967. -V. 143. - P.170-189.

57. Dybvig K. Molecular biology of mycoplasmas//Annu. Rev. Microbiol.- 1996.- V.50.-P.25-57.

58. Dybvig K. Mycoplasmal genetics. //Annu. Rev. Microbiol.-1990.-V.44.- P.81 -104.

59. Edward D.G., Leach R.H. The need for Standardisation of Serological Techniques for the Detection of Mycoplasma gallisepticum in Poultry // Vet. Ree. 1966. -V.79, N20.-P. 580.

60. Edvard D.G. A selective medium for PPLO // Microbiol. 1966. - V.47, N1. - P.238.

61. Elfaki M.G., Kleven S.H., Ragland W.L. Characterization of strain-specific monoclonal antibodies against Mycoplasma gallisepticum // Fed. Am. Soc. Exp. Biol.-1990.-V.4.-P. 2197.

62. Ellison J. S., Olson L. D. Immunity and vaccine development// Maniloff J., Elhaney P. N. Finch L. R., Baseman J. B. (ed). Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. / American Society for Microbiology. Washington D. C. - 1992.-P.491 - 504.

63. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. 1971. - V.8. - P. 871-874.

64. Evans R. P., Hafez Y.S. Evaluation of a Mycoplasma gallisepticum strain exhibiting reduced virulence for prevention and control of poultry mycoplasmosis // Avian Dis.-1992.-V.36.-P. 197-201.

65. Fabricant J. Serological studies of avian pleuropneumonia-like organisms (PPLO) with Edwards technique //Avian Dis. -1960. -V.4. -P. 505-514.

66. Fan H. H., Kleven S. H., Jackwood M. W., 1995a. Application of polymerase chain reaction with arbitrary primers to strain identification of Mycoplasma gallisepticum II Avian Dis. -1995 a. V. 39. - P. 729-735.

67. Fan H. H., Kleven S. H., Jackwood M. W. Studies of intraspecies heterogeneity of Mycoplasma synoviae, M. meleagridis, M. iozwe with arbitrarily primed polvmerase chain reaction //Avian Dis.- 1995 b. V.39. - P. 766-777.

68. Fetcher O.I. Pathology of the avian respiratory system // J. Poultry Sei. 1980. -V.59. N 12.-P. 266.

69. Für K. Untersuchungen über das vorkommen von Mycoplasmen und virusantikor-pem bei huhner mit und ohne erkrankungen des respiratorischen systems // Dtsch. tierarztl. Wschr. 1969. - V.76. - N 1. - P.7.

70. Foresyth M.H., Sayed A.S., Geary S.J. Sequence and transcriptional analysis of the genes encoding the class-ll topoisomerase of Mycoplasma gallisepticum // Gene. -1995. V.163. - P.161-162.

71. Freeman B.M. Stress and the domestic fowl: a physiological appraisal // Wid's Poult. Sei. J. 1971. - V. 27. - P. 263.

72. Freundt E.A. General principles of laboratory diagnosis of Mycoplasma infections // Isr .J. Med. Sei. 1981.- V.17. - N 7. - P.641.

73. Freund E.A., Erm N., Lemcke Ruth H. Identification of mycoplasmas // Meth. Microbiol., London. 1979. -V.13. - P. 377-434.

74. Frey M. L., Hanson R. P., Anderson D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas //Vet. Res.-1968.-V. 29.- P. 2163-2171.

75. Galfre, G., Howe S. C., Milstein C, a. e. Antibodies to major histocom-patibility antigens produced by hybrid cell lines // Nature. 1977. - V. 266. - P. 550-552.

76. Garcia M., Mohamed G. E., Kleven S.H. Analysis of the variability in expression of Mycoplasma gallisepticum surface antigens. // Vet. microbiol.- 1994.-V.42, N 2.-P.147-158.

77. Gentry R.F., Kantor С. Т., Marthouse D. Factors influencing the growth and storage of M. gallisepticum Propagated in Embryonated chicken Eggs // Ann. N. Y. Acad. Sei. 1967. - V.143. - N 1. - P.256.

78. Giambrone, J. J., Eidson C. S., Kleven S. H., 1977. Effect of infectious bursal disease on the response of chickens to Mycoplasma synoviae, Newcastle disease virus, and infectious bronchitis virus // Am. J. Vet. Res. 1977. - V.38. - P.251-253.

79. Glisson J.R., Kleven S.H. Mycoplasma gallisepticum vaccination: Effects on egg transmission and egg production //Avian Dis.-1984.-V. 28.-P.406-415.

80. Gordon R.F. Some diseases associated with changes in the structure of poultry industry// Poultry .Rev. 1961. - N 1. - P. 10.

81. Gordon R.F. The economic effect of disease on the poultry industry // Vet. Ree. -1967.- V.80.-N3.-P. 101.

82. Goren E. Mycoplasma control in poultry in Netherlands // Vet. Ree. 1976. - N 99. -P.148.

83. Gross W.B., Siegel H.S. The effect of social stress on resistance to infection with Escherichia coli or Mycoplasma gallisepticum II Poult. Sei. 1965. - V. 44. - N 4. -P. 998.

84. Gross, W. B. Factors affecting the development of respiratory disease complex in chickens. Avian Dis.1990. V. 34. - P. 607-610.

85. Gundersen D. E., Lee I. M., Davis R. E. Phylogeny of mycoplasma like organisms: a basis for their classification // J. Bacteriol.- 1994.-V.176.- P. 5244 5254.

86. Gupta H.S., Sharma S.N. Serological typing of avian mycoplasma // Indian Vet. J. -1976. V.53, N 10. - P. 735-738.

87. Halen P. Les mycoplasmosis et leur role an pathology // Ann. Med. Vet. 1967. -V. 3, N 1.-P.23.

88. Higgins, P. A., Whithear K. G. Detection and differentiation of Mycoplasma gallisepticum and M. synoviae antibodies in chicken serum using en zyme-linked immunosorbent assay // Avian Dis. 1986.- V.30. - P. 160-168.

89. Hinz K.H. Nachweis der Infektiösen synovitis bei Puten in der CRD // Vet. Med. Nachrichten. 1972. - N 2. - P. 161.

90. Hopkins S. R., Yoder H.W. Influence of infectious bronchitis strains and vaccines on the incidence of Mycoplasma synoviae airsacculitis // Avian Dis. 1982. - V.26. -P.741-752.

91. Hopkins, S. R., H. W. Yoder, 1984. Increased incidence of airsacculitis in broilers infected with Mycoplasma synoviae and chicken passaged infectious bronchitis vaccine virus // Avian Dis. 1984.- V. 28. - P.386-396.

92. Howard C. J., Taylor G. Humoral and cell mediated immunity // Razin S. Barile (ed). The Mycoplasmas, Mycoplasma pathogenicity Inc. Orlando, Academic Press Fla.-1985.- V.4 P.259 — 292.

93. Howell L.J. Delayed growth and atypical colony formation of Mycoplasma synoviae II Res. Vet. Sci. 1974. - V.17, N 3. - P.408-410.

94. Hwang Y.S., Panangala V.S., Rossi C.R., a. e. Monoclonal antibodies that recognize specific antigens of Mycoplasma galllsepticum and M. Synoviae / /Avian Dis.-1989.-V. 33.-P. 42-52.

95. IDEXXs instruction for an enzyme immunoassay for the detection of antibody in chicken serum // IDDEXX Laboratories, Inc. Westbrook, USA. 1996. -P.30.

96. Jordan F.T . Mycoplasma-induced arthritis in poultry // Avian Dis. -1980. V. 24, N 2 . - P. - 493-497.

97. Jordan F.T.W., Knight D. The minimum inhibitory concentration of kitasamy-cin, tylosin, and tiamilin for Mycoplasma gallisepticum and their protective effect on infected chicks//Avian Pathol. 1984. - V.13. - P.151-162.

98. Jordan F.T.W., Kulasegaram P. Latent infection of chickens and turkeys with Mycoplasma gallisepticum. The Influence of Debilitating (Stress) Factors // Vet. Rec. 1968. - V. 82, N 23. - P.655.

99. Jordan F.T.W., Amin M.M. A survey of mycoplasma infections in domestic poultry // Rec. Vet. Sci. 1980. - V.28, N 1. - P.96-100.

100. Jungherr E. L., Luginbuhl R. E. The pathology of chronic respiratory disease (in domestic fowl) as a diagnostic aid // Poultry, Sci.-1952.-V.31.-P. 922.

101. Kaiji T., Nonomura J., Sato S., e. a Pathogenicity of Avian Reovirus and its influence on the infection of Mycoplasma gallisepticum in chickens // Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. 1970. - V. 10, N 2. - P. 49.

102. Kardi V., Szegletes, Forgach K., Toth B. Use of ELISA methods for determination of IBD (Gumboro) virus antigen and antibody // 11th International Congress of the World Veterinary Poultry Association: Abstr. -Budapest, Hungary, 1997.-P. 269.

103. Kahane I., Adoni A. (ed) Rapid diagnosis of mycoplasmas N. Y.: Plenum Press, 1993.

104. Kerr K. M., Olson N.O. Pathology in Chickens Experimentally inoculated or contact infected with Mycoplasma gallisepticum II Avian Dis. 1967. - V. 2, N 4. -P. 559.

105. Khan M. I., Lam K.M., Yamamoto R. Mycoplasma gallisepticum strain variations detected by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis // Avian Dis.-1987.-V.31 .-P.315-20.

106. Khan M.I., Yamamoto R. Differentiation of the vaccine F-strain trom other strains of Mycoplasma gallisepticum by restriction endonuclease analysis/A/et. Mi-crobiol.-1989.-V.19.-P. 167-174.

107. Kleven C.H., Eidson C. S., Anderson D. P., Fletcher O.J. Depression of the Serologic Response to Mycoplasma synoviae in chickens infected with Marek's Disease Herpesvirus // J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1971. - V. 158, N 11. - P. 1906.

108. Kleven S.H., Morrow C.J., Whithear K.J. Comparison of Mycoplasma gallisepticum strains by hemagglutination-inhibition and restriction endonuclease analysis //Avian Dis.-1988.-V.32.-P.731-741.

109. Kleven S.H. Mycoplasmas in the Etiology of Multifactorial Respiratory Disease // Poultry Sei- 1998.- V.77.- N 8.- P.1146-1149.

110. Kludas K.H. Ernahrungs und Stoffweehseluntersuchungen an Mycoplasma gallisepticum S6//Arch. Exp. Veterinarmed. 1968. - V.22, N 2. - P. 407.

111. Koostra W., Adams J., Smith P. In vitro selection and identification of antibiotic-resistant Mycoplasma mutants // J. Bact. 1966. - V. 91, N 6. - P. 23-86.

112. Kotani H., McGarrity G.J. Identification of mycoplasma colonies by im-munoblotting // Chn. Microbiol.-1986.- V.23.- P.783-785.

113. Lawson K.F., Hcrtler R.T. A report on the use of a serum plate antigen for the Detection of the Antibodies to Mycoplasma gallisepticum // Poultry. Sei. 1969.-V.48, N 1. - P. 295.

114. Levisohn S., Kleven S.N. Avian mycoplasmosis (Mycoplasma gallisepticum) // Rev. Sei. Tech. Off. Jnt. Epiz.- 2000.- V. 19.- N 2.- P.425-442.

115. Levisohn S., Dykstra M.J., Lin M.Y., Kleven S.H. Comparison of in vivo and in vitro methods for pathogenicity evaluation for Mycoplasma gallisepticum in respiratory infection //Avian Pathol.-1986.-V.15.-P. 233-246.

116. Lim M.Y., Kleven S.H. Egg transmission of two strain of Mycoplasma gallisepticum in chickens //Av. Dis. 1982. - V.26, N 3. - P.487-495.

117. Lim M.Y., Kleven S.H. Evaluation of attenuated strains of M. gallisepticum, as vaccines in young chickens // Avian Dis. 1984. - N 28. -P.899.

118. Liu T., Garcia M., Levisohn S., Yogev D., Kleven S. H. Molecular variability of the adhesin-encoding gene pvpA among Mycoplasma gallisepticum strains and its application in diagnosis // Clin Microbiol. 2001. - N 39(5). -P.1882-1888.

119. McFerran J.B., McNulty M. S., Curran W.L. Diagnosis of avian viral disease by electron microscopy // Am. J. Vet. Res. -1978. -V. 39. -P. 505-508.

120. McMartin D. A. Latent infection of chickens with Mycoplasma gallisepticum II Vet.Ree. -1968. V.83, N 2. - P. 280.

121. McMartin D.A. Avian Respiratory Mycoplasmosis // Bull. Off. int. Epiz. -1969. -V.72, N 1.-P.207.

122. Madden D. L., McCullough N.B. Basic biological characteristics of Mycoplasma // J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1967. - N 151. - P. 16-38.

123. Mallison E.T ., Eckroade R. J., Kleven S.H. In vivo bioassay and supplemental serological techniques for the detection of mycoplasma in suspect breeding chickens//Avian Dis. 1981.-V. 25.- P. 1077-1082.

124. Markham P. F., Glew M. D., Brandon M. R., D. Walker I. D., Whithear K. G. Characterization of a major hemagglutinin protein from Mycoplasma gallisepti-cum//lnfect. Immun.-1992.-V.60.-P.3885-3891.

125. Markham P.F., Walker I.D., Brandon M.R., e. a. Characterization of an immunogenic protein of Mycoplasma gallisepticum //OM, Letters.-1990.-V. 8.-P. 353354.

126. Markham P. F., Glew M. D., Whithear K. G. Molecular cloning of a member of the gene family that encodes pMGA, a hemagglutinin of Mycoplasma gallisepticum II Infect. Immun.- 1993.- V 61. P.903 - 909.

127. Marquardt W.W., Johnson R.B., Odenwald W.F., Schlotthober B.A. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies in chickens //Avian Diseases. -1980. -V. 24. -P. 375-385.

128. Matsui Koran, Ando Keitaro, Hayami Toshio, Okubo Teruo. The in vitro sensitivity of Mycoplasma gallisepticum to antibiotics and nitrofurans // Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. 1967. - N 1. - P. 124.

129. Matthes S., Hinz K.H. Augenerkrankungen bei Huhnern im Zusammenhang mit Mycoplasma infektionen // Zbl. Veterinarmed. 1970. - V.17, N 9. - P. 935.

130. May J. D., Branton S. L., Pruett S. B., Ainsworth A. J. Differentiation of two strains of Mycoplasma gallisepticum with monoclonal antibodies and flow cytometry // Avian Dis. -1994. -V.38. -P.542-547.

131. Minamimoto S., Suzuki K., Tanaka K., e. a. Contact transmission of Mycoplasma gallisepticum and its prevention // Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. 1970. -V.10, N2.-P.66.

132. Morein, B., Sundquist B. G., Hoglund S, K. a e. Iscom, a novel structure for antigenic presentation of membrane proteins from enveloped viruses // Nature. -1984.- V.308. P.457-460.

133. Morse, J. W., Boothby J. T., R. Yamamoto. Detection of Mycoplasma gallisepticum by direct immunofluorescence using a species-specific monoclonal antibody // Avian Dis.- 1986.- V. 30. P.204-206.

134. Morsy M. A., Panangala V. S., Gresham M. M. Identification of Mycoplasma gallisepticum by use of monoclonal antibody in a rapid slide agglutination test // Am. J. Vet. Res. -1991. -V.52. -P. 1602-1605.

135. Olson N. O., Shelton D. C., Munro D. A. Infections synovitis control by medication effect of strain differensis and pleuropneumonia-like organisms // Am. J. Vet. Res.-1957.-V.18.-P.735-739.

136. Olson N. O., Solomon D. P. A natural outbreak of synovitis caused by the viral artritis agent//Avian Dis.-1968.-V.12.-P.311-316.

137. Olson N.O., Kerr K.M., Campbell A. Control of infectious synovitis. Preparation of an agglutination test antigen//Avian Dis.-1963.-V.7.-P.310-317.

138. Olson N. 0., Yamamoto R., Ortmayer H. Antigenic relationship between Mycoplasma synoviae and Mycoplasma gallisepticum II Am. J. Vet. Res. -1965. -V.26. -P.195-198.

139. Page R.K., Fletcher O.J. and Villegas P. Infectious synovitis in young turkeys //Avian Diseases. 1982.- V. 26. - P. 924-927.

140. Panangala V. S., Morsy M. A., Gresham M., Toivio-Kinnucan M. Antigenic variation of Mycoplasma gallisepticum as detected by use of monoclonal antibodies //Am. J. Vet. Res.-1992.-V.53.-P.1139-1144.

141. Parageorgiou C.P. Las micoplasmosis // Granja ESP. 1976. - V.23, N 282. -P. 9-14.

142. Razin S., Yogev D., and Naot Y. Molecular Biology and Pathogenicitity of Mycoplasmas // Microboilogy and Molecular Biology Reviews.- 1998.-V 62, N 4.-P. 1094-1156.

143. Razin R. et al. Characterization of the Mycoplasma genom // J. Biol. Med. -1983.-N56.-P. 357.

144. Razin S. Characteristics of the mycoplasmas as a group // Meth. Mycoplas-mol. N.Y., 1983.-P. 3-7.

145. Roberts D. H. Avian Mycoplasma Serotypes // Vet. Ree. 1968. - V. 83, N 24.-P.611.

146. Roberts D. H. Non-specific agglutination reactions with Mycoplasma Gal-lisepticum antigens // Vet. Ree. 1970. - V. 87, N 5. - P. 125.

147. Roberts D. H., Olesiuk 0. M. Serological studies with Mycoplasma synoviae II Avian Dis. -1967. -V.11. -P. 104-119.

148. Rodriguez R., Kleven S.H. Pathogenicity of two strains of Mycoplasma gal-lisepticum in broiler chickens //Avian Dis.-1980.-V.24.-P.801-807.

149. Rodwell A. W., Whitcomb R. F. Methods for direct and indirect measurement of mycoplasma growth // Methods in Mycoplasmology. V. 1. Mycoplasma characterization / S. Razin, Tully J. G, eds, N.Y. Academic Press -1983. -P. 185-196.

150. Rosengarten R., Wise K. S. Phenolypic switching in mycoplasmas. Phase variation of diverse surface lipoproteins // Science.-1990.-V.247.-P.315-318.

151. Shepard M.C. Fundamental Biology of the T-Strains // The Mycoplasma-tales and the L-phase of Bacteria, USA, 1969. -Part 2.- P. 49.

152. Spanoghe L., Lagasse A., Devos A., Viaenc N. Morphologic in vitro of Mycoplasma gallisepticum II Vlaams Diergeneesk. Tijdschr. 1967. - V. 37, N 2. • P.566.

153. Springer W. T. Role of Mycoplasma synoviae in the Airsacculitis Syndrome // J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1971. -V. 158, N 2. - P.1896.

154. Stipkovits L. Isolation and pathogenicity of mycoplasmas from geese // Ann. Microbiol. (Inst.Pasteur). 1984. - N 135A. - P.91.

155. Talkington F. D., Kleven S.H. A classification of laboratory strains of avian mycoplasma serotypes by direct immunofluorescence // Avian Dis.-1983.- V.27.-P.422-429.

156. Timms L. Effects of storage of sera on the diagnosis of avian Mycoplasmosis //Vet. Rec. 1971. -V.88, N 26. - P.698.

157. Thomas C. B., Sharp P. T. Detection of antigenic variation among strains of Mycoplasma gallisepticum by enzyme-linked immunosorbent inhibition assay (ELISIA) and Western blot analysis //Avian Dis.-1988.-V.32.-P.748-756.

158. Tully J.G. Cloning and filtration techniques for mycoplasma II Methods in Mycoplasmology., V. 1.S. Razin, J.G. Tully eds. II N.Y. Academic Press.-1983.-P.173-177.

159. Uppal P. K., Wise D. R., Boldero Muriel K. Ultrastructural characteristics of Mycoplasma gallisepticum, M. gallinarum, M. meleagridis II Res. Vet. Sci. 1972. -V.13, N 2. - P. 200.

160. Vardaman Т. H., Yoder H. W. Mycoplasma synoviae and Mycoplasma gallisepticum infections: Differentiation by the Hemagglutination inhibition Test // Poultry. Sci. 1970. - V.49, N 1.-P. 157.

161. Whithear K.G., Soeripto K.E., Harrigan, Ghiocas E. Safety of temperature sensitive mutant Mycoplasma gallisepticum vaccine // Aust. Vet J.-1990.-V.67.-P.159-165.

162. Whithear K.G., Walker I.D. Physical mapping of a repertoire of homologous haemagglutinin genes in Mycoplasma galliseplicum // IOM Letters.- 1992.-V. 2.- P. 262.

163. Wyeth P.J. Influence of route of infection on response of chickens to M. synoviae //Vet. Rec. 1974. - V.95, N 10. - P.208.

164. Yoder H.W. A historical account of the diagnosis and characterization of strains of Mycoplasma gallisepticum //Avian Dis.-1986.-V.30.-P.510-518.

165. Yoder H.W. Jr., Hofstad M.F. A previously unreported serotype of avian mycoplasma //Avian Dis.-1962.-V.6.~ P.147-160.

166. Yoder H.W., Hopkins S.R, Mitchell B.W. Evaluation of inactivated Mycoplasma gallisepticum oil emulsion bacterins for protection against air sacculitis in broilers //Avian Dis.-1984.-V.28.-P.224-234.

167. Yogev D., Levisohn S., Kleven S.H., e. a. Ribosomal RNA gene probes to detect intraspecies heterogeneity in Mycoplasma gallisepticum and M. synoviae // Avian Dis.-1988.-V.32.-P.220-231.

168. Yogev D., Levisohn S., Razin S. Genetic and antigenic relatedness between Mycoplasma galliepticum and Mycoplasma synoviae // Vet. Microbiol.-1989.-V.19.-P.75-84.

169. Yale J. Cultivation and identification of mycoplasmas //J. Biol, and Med. -1983 .I -V.56, N 5. P.819.

170. Zander D.V. Origin of S6 strain Mycoplasma // Avian Dis.-1961.-V.5.-P.154-156.

Информация о работе

Волкова, Ирина Александровна
кандидата биологических наук
Владимир, 2004
ВАК 03.00.06

Диссертация

Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики микоплазмозов птиц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики микоплазмозов птиц ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики микоплазмозов птиц"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волкова, Ирина Александровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики микоплазмозов птиц"

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Волкова, Ирина Александровна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волкова, Ирина Александровна, Владимир

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики микоплазмозов птиц
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология