Ассоциированная иммунизация и усовершенствование технологии производства вакцин против респираторного микоплазмоза и вирусных болезней птиц

Панкратов, Сергей Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Ассоциированная иммунизация и усовершенствование технологии производства вакцин против респираторного микоплазмоза и вирусных болезней птиц
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Ассоциированная иммунизация и усовершенствование технологии производства вакцин против респираторного микоплазмоза и вирусных болезней птиц"

На правах рукописи

ПАНКРАТОВ СЕРГЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

АССОЦИИРОВАННАЯ ИММУНИЗАЦИЯ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИН ПРОТИВ РЕСПИРАТОРНОГО МИКОПЛАЗМОЗА И ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

2 4 ОКТ 2013

ОИ

Санкт-Петербург - 2013

005535814

Работа выполнена в организации с ограниченной ответственностью научно-производственном предприятие (ООО НПП) «АВИВАК».

Научный руководитель: Рождественская Татьяна Николаевна

доктор ветеринарных наук

Официальные оппоненты: Алиев Алаутдин Серажутдинович

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии

Смоленский Владимир Иванович

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ ВГНКИ), заместитель директора по государственному контролю и стандартизации, заведующий отделением биологических лекарственных средств для животных

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московская государственная

академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Защита диссертации состоится «15» ноября 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан «14» октября 2013 г., размещен на сайте ВАК Минобрнауки РФ и 1Прр: // spbgavm.ru.

Ученый секретарь

диссертационного совета Белова Лариса Михайловна

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время проблема смешанных инфекций в промышленном птицеводстве чрезвычайно актуальна в связи с возрастающей частотой проявления ассоциированных форм патологии птиц. При смешанных вирусных и вирус-бактериальных инфекциях затруднена не только своевременная и точная диагностика болезни, но также снижается эффективность противоэпизоотических мероприятий, что наносит существенный экономический ущерб отрасли (Алиев А.С. и др., 2013). Одним из эффективных средств профилактики инфекционных болезней является применение ассоциированных вакцин включающих как вирусные, так и бактериальные антигены (Рождественская Т.Н., Панкратов С.В. и др., 2010).

Главным преимуществом ассоцированных инактивированных вакцин по сравнению с моновакцинами, как известно, является: создание у привитых птиц напряженного и продолжительного иммунитета одновременно к нескольким возбудителям, сокращение количества вакцинаций и стрессовых факторов, снижение трудозатрат на проведение иммунизации (Борисов В.В. и др., 2009).

Смешанные инфекции очень часто сопровождаются проявлением респираторного синдрома, ключевую роль в развитии которого играет Mycoplasma gallisepticum (Рождественская Т.Н. Борисенкова А.Н., и др., 2006).

За рубежом для специфической профилактики респираторного микоплазмоза (РМ) широко применяют инактивированные масляно-эмульсионные вакцины (Б.У. Кэлнек, 2011).

В отечественной литературе имеются данные по применению моновакцины против РМ (Гирин М.В., 2004; Зоткин Г.В. и др., 2004; Черняева Е. и др., 2007) и различные варианты ассоциации с вирусными антигенами (Джавадов Э.Д. и др., 2007, 2009; Дубовой А.С. и др.,2004). Однако, авторы не приводят сведения об основных параметрах технологии их производства, а также о результатах испытаний эффективности вакцин с многокомпонентным составом в экспериментальных и производственных условиях.

В связи с этим исследования, по разработке технологии изготовления и схем применения отечественной моновакцины против РМ птиц и ее ассоциированных форм с антигенами инфекционного бронхита кур (ИБК), ньюкаслской болезни (НБ), синдрома снижения яйценоскости (ССЯ-76) и реовирусной инфекции (РЕО) являются весьма актуальными и соответствуют требованиям современного промышленного птицеводства.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - усовершенствование технологии изготовления и контроля качества инактивированной эмульсионной вакцины против РМ и её ассоциированных форм с вирусными антигенами (ИБК, НБ, ССЯ-76 и PEO) и оценка протективных свойств полученных препаратов.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:

- отработать методику инактивации М. gallisepticum;

- подобрать адъювант, обеспечивающий физические свойства, безвредность и повышение антигенной активности моновакцины против РМ и её ассоциированных составляющих компонентов против вирусных болезней птиц;

- разработать технологию производства и методов контроля вакцин против «РМ» и «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76»;

- оценить эффективность разработанных препаратов в лабораторных и производственных условиях;

организовать промышленное производство инактивированной эмульсионной вакцины против РМ и её ассоциированных форм с вирусными антигенами (ИБК, НБ, ССЯ-76 и PEO) и внедрить их в ветеринарную практику.

Научная новизна. Усовершенствован технологический процесс изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против респираторного микоплазмоза птиц, включающий отработку режима инактивации М. gallisepticum теотропином и мертиолятом, определено оптимальное содержание антигена в одной иммунизирующей дозе, предложены методы контроля качества серий биопрепарата, сроков и режима её хранения.

Подобран масляный адъювант обеспечивающий высокую антигенную активность и ареактогенность моно- и ассоциированных форм эмульсионных вакцин против респираторного микоплазмоза птиц .

Теоретически обоснована и внедрена технология промышленного производства ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» с учетом оптимального соотношения антигенных компонентов и адъюванта. Доказана высокая протективная эффективность вакцины в лабораторных условиях.

Практическая значимость работы. На основании полученных результатов разработаны и утверждены:

- Регламент производства вакцины инактивированной эмульсионной против респираторного микоплазмоза птиц «АВИВАК-РМ»;

- Технические условия (ТУ) 9384-002-46262188-04 на инактивированную эмульсионную вакцину против респираторного микоплазмоза птиц «АВИВАК-РМ»;

- Инструкция по применению вакцины инактивированной эмульсионной против респираторного микоплазмоза птиц «АВИВАК-РМ»;

- Вакцина инактивированная эмульсионная против респираторного микоплазмоза птиц «АВИВАК-РМ» зарегистрирована в РФ (регистрационное свидетельство лекарственного препарата для ветеринарного применения 29-1-5.12-0572№ПВР-1-3.5/01540);

Подготовлен и утвержден проект документации на ассоциированную вакцину инактивированную эмульсионную против РМ, ИБК, НБ и ССЯ-76, который рассмотрен и одобрен на заседании научно-технического совета НПП «АВИВАК» (протокол № 3 от 12.03.2012г.).

В период с 1.01. 2006 г. и по настоящее время выпущено и применено 12,5 млн. доз вакцины «АВИВАК-РМ».

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

- методика инактивации штамма «86» М. gallisepticum теотропином и мертиолятом;

- компонентный состав и иммунобиологические свойства вакцины инактивированной эмульсионной против РМ;

- компонентный состав, иммунобиологические и физико-химические свойства ассоциированной вакцины инактивированной эмульсионной «АВИВАК-РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» и «АВИВАК-РЕО+РМ»;

эффективность применения моновакцины «АВИВАК-РМ» и ассоциированной вакцины инактивированной эмульсионной «АВИВАК-РМ+ИБК+НБ-ССЯ-76»;

- результаты производственных испытаний вакцины «АВИВАК-РМ».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы

доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Эффективность ведения промышленного птицеводства в современных условиях» (Санкт-Петербург, 2009 - 2013 г., на VI и VII Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (Москва, 2010 и 2011 гг.) и на заседании Научно-технического совета НПП «АВИВАК» (2013 г.).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах компьютерного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения. Список использованной литературы включает 225 источников, из которых 105 зарубежных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 5 рисунками. Приложение включает 5 документов, подтверждающих достоверность результатов исследований.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в период с 2003 - 2013 гг. в НПП «АВИВАК» в соответствии с научно-производственными заданиями.

При выполнении работы использовали следующие материалы:

- штамм «S6» М. gallisepticum, вирулентный штамм «Чапаевский» вируса ИБК, штамм «Ла-Сота» вируса НБ, штамм «В8/78» вируса ССЯ-76, вирулентный штамм «1733» вируса PEO;

- масляный адъювант (МА) «АВИВАК» (Маркол-52 (95%) + Span (2,5%) + Silicon (2,5%)) и МА «ISA-70» (Montanide ISA 70 VG производства «SEPPIC»);

- инактиванты формалин, теотропин и мертиолят (тиомирсал натрия);

- диагностикумы для выявления антигена М. gallisepticum в РА, антител к вирусам НБ и ССЯ-76 в РТГА, антител к М. gallisepticum, вирусам ИБК и PEO методом иммуноферментного анализа (ИФА), производства НПП «АВИВАК;

- эмбрионы СПФ-кур в количестве 154 шт. получали из фирмы « Lohmann Tierzucht» (Германия); эмбрионы от коммерческих кур в количестве 344 шт. -из ООО «Племрепродуктор Назия»; 10-ти суточные эмбрионы уток в количестве 92 шт. - из ГУП «ППЗ Благоварский»;

- цыплята яичных кроссов «Хайсекс белый», «Хайсекс коричневый» и «Ломанн-браун» различных возрастов в количестве 600 гол - из птицеводческих хозяйств Ленинградской области.

Культивирование микроорганизмов. Накопление штамма «S6» М. gallisepticum осуществляли на обогащенной питательной среде из гидролизата кильки, при температуре 37,7° С в течение 96 ч.

Для получения вируссодержащего материала ИБК и НБ использовали 9-

суточные СПФ РЭК и ССЯ-76 - 10-суточные РЭУ. Заражение РЭК и РЭУ проводили в аллантоисную полость в объеме 0,2 см3 матровой расплодки. Зараженные РЭК инкубировали при температуре 37,5 °С в течение 72 ч, а РЭУ -96 ч.

Реовирус культивировали роллерным методом на первичной культуре фибробластов эмбрионов СПФ-кур при температуре 37°...38°С в течение 96 ч.

Инактивация микроорганизмов. Для отработки режима инактивации M.gallisepticum использовали растворы теотропина и формальдегида в концентрациях 0,025; 0,05; 0,075 и 0,1%, при температурах 37,0° и 20...22°С в течение 24 ч, соответственно, мертиолятом - в концентрациях 0,00025; 0,0005; 0,00075 и 0,001%, при температуре 37,0°С в течение 24 ч.

Инактивацию вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76 и PEO проводили теотропином в конечной концентрации 0,1% при температуре 20±2°С или формалином в конечной концентрации 0,1% по формальдегиду при температуре 37,0°С в течение 24 ч.

Изготовление и контроль инактивированных вакцин. Для изготовления вакцин в качестве водной фазы использовали инактивированные антигены вирусов ИБК, НБ, ССС-76, PEO и бакмассу М. gallisepticum, а в качестве масляной основы - адъюванты «АВИВАК» и «ISA-70». Эмульгирование проводили на диспергаторе IKA с модулем типа МК.

Полученные образцы вакцин расфасовывали в стерильные флаконы и контролировали внешний вид, стабильность и вязкость эмульсии, стерильность, безвредность и антигенную активность.

Определение стерильности исследуемых материалов проводили согласно ГОСТ 28085.

Определение агглютинирующей активности М. gallisepticum проводили согласно ТУ 10.19.44-88, гемагглютинирующей активности антигенов вируса НБ и ССЯ-76 — по общепринятым методикам.

Инфекционную активность вирусов ИБК и НБ определяли титрованием на 10-суточных СПФ куриных эмбрионах, вируса PEO - в монослойной культуре фибробластов кур 24-часовой инкубации, выращенной в пробирках. Титр вируса вычисляли по методу Кербера в модификации Ашмарина.

Полноту инактивации М. gallisepticum исследовали 3-ми последовательными пассажами на обогащенной питательной среде из гидролизата кильки, вирусов ИБК и НБ на РЭК, ССЯ-76 - РЭУ 9-10-суточного

возраста, РЕО - в культуре куриных фибробластов.

Стабильность эмульсии определяли методом центрифугирования, вязкость - с помощью вискозиметра ВПЖ-2м.

Для определения безвредности и антигенной активности вакцины ее среднюю пробу вводили цыплятам подкожно в область нижней трети шеи или внутримышечно в грудную мышцу в объеме 2,0 и 0,5 см3, соответственно.

Вакцину считали антигенно активной, если через 28 сут. после иммунизации титр антител к вирусам НБ и ССЯ-76 в РТГА составлял не менее, чем у 80 % привитых цыплят не ниже 4,0 и 5,0 log2, соответственно. К M.gallisepticum, вирусам ИБК и РЕО в ИФА не менее, чем у 80% привитых цыплят в два и более раз выше минимального положительного значения титров, предусмотренных инструкцией по применению используемых тест-систем. Минимальное положительное значение титров в тест-системах ИФА производства НПП «АВИВАК» составляло для вируса ИБК - 1:765, РЕО -1:1899 и M. gallisepticum - 1:1029.

Эффективность разработанных препаратов изучали в экспериментальных и производственных условиях путем сравнения основных эпизоотологических показателей (заболеваемость, смертность, сохранность птицы и др.) в подопытных и контрольных группах. Напряженность иммунитета оценивали по уровню специфических антител в сыворотках крови привитой птицы.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ OpenOffice Cale, Microsoft Excel и Microsoft Access.

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Подбор оптимальных препаратов для инактивации микробной

массы штамма «Se» M. gallisepticum

Для изучения инактивирующей активности теотропина, формальдегида и мертиолята на М. gallisepticum в предварительно концентрированную микоплазменную массу вносили рабочий раствор инактиванта и через определенные интервалы времени (6,12, 18 и 24 ч) отбирали пробы для определения полноты инактивации.

Полноту инактивации М. gallisepticum определяли методом 3-кратных последовательных пассажей. Для этого одновременно делали высевы отобранных проб в объеме 1,0 см3 в три пробирки с 5,0 см3 обогащенной питательной средой из гидролизата кильки. Посевы выдерживали в термостате при температуре 37,5°С в течение 5 сут. Затем делали два последовательных

пассажа с интервалом 5 сут. Аналогичным образом проводили посев и культивирование исходного штамма «S6» М. gallisepticum, который служил в качестве контроля.

Исследуемый материал считали инактивированным полностью, если ни в одной из засеянных пробирок в результате трех последовательных пассажей рост М. gallisepticum не наблюдался.

Полученные результаты исследований инактивирующей способности препаратов показали, что скорость инактивации М. gallisepticum повышается по мере увеличения концентрации теотропина в суспензии. Полная инактивация его происходит при 0,075%-й концентрации через 24 ч и 0,1%-й через 18 ч. Инактивация культуры микоплазм формальдегидом наступает при 0,1%-й концентрации через 18 и 24 ч., что практически сопоставимо с применением теотропина.

Инактивирующее действие мертиолята на М. gallisepticum проявляется значительно активнее по сравнению с теотропином и формальдегидом, и достигается при концентрации 0,001% за 18 ч, что на два порядока ниже по сравнению с другими химическими реагентами. Таким образом, быстрым и надежным способом инактивации микоплазм является 0,001%-й раствор мертиолята при +37°С в течение 18 ч инкубации.

2.2.2. Подбор оптимального масляного адыованта для изготовления ннактивированной эмульсионной моновакцины против РМ

В процессе конструирования вакцины были испытаны два вида масляных адъювантов: «АВИВАК» и «ISA-70» в процентном отношении 40/60 и 30/70, соответственно. Для изготовления экспериментальных образцов вакцин к инактивированному антигену М. gallisepticum добавляли адъюванты «АВИВАК» и «ISA-70». Полученную смесь гомогенизировали в течение 30-45 мин.

Опытные серии вакцины ннактивированной эмульсионной против РМ проверяли на стерильность, безвредность, стабильность и вязкость эмульсии. Результаты испытаний показали, что полученные серии вакцин представляют собой однородную, стерильную, стабильную эмульсию белого цвета, вязкость которой составляла 41 мм2/с2 и 33 мм2/с2, соответственно.

Для определения безвредности вакцины было сформировано две группы цыплят кросса «Хайсекс-коричневый» 25-суточного возраста по 10 голов в каждой. Цыплятам 1-й группы вакцину на основе адъюванта «АВИВАК» вводили в нижнюю треть шеи подкожно в объеме 2,0 см3, а цыплятам 2-й

группы - образец вакцины с адъювантом «ISA-70». Результаты опыта учитывали через 10 дн после вакцинации путем убоя цыплят с последующим их патологоанатомическим вскрытием. При учете результатов безвредности на месте введения вакцины у цыплят 1-й группы в области нижней трети шеи и зоба были обнаружены остатки не рассосавшейся вакцины с обширным разрастанием соединительной ткани.

У цыплят 2-й группы на месте введения вакцины с вентральной стороны имелись не рассосавшиеся её остатки в виде крупинок размером с маковое/ просяное зерно. Признаков воспалительного процесса не обнаружено.

Таким образом, вакцина изготовленная на основе адъюванта «ISA 70», является безвредной, тогда как вакцина, полученная с применением адъюванта «АВИВАК», вызывает неспецифические изменения на месте введения препарата, т.е. является реактогенной.

2.2.3. Определение оптимальной концентрации антигена М. gallisepticum в инактивированнои эмульсионной вакцине

Для определения оптимальной концентрации антигена М. gallisepticum в составе инакгивированной вакцины против РМ были изготовлены опытные образцы препаратов, компонентный состав которых приведен в табл. 1. Исходным материалом служила бактериальная масса М. gallisepticum с агглютинирующей активностью 1:32 в реакции агглютинации.

Таблица 1

Компонентный состав образцов инактивированных вакцин против РМ

№ образца вакцины Состав одной дозы вакцины - 500 мкл

Водная фракция Адъювант, мкл

Концентрат антигена, мкл ФБР, мкл

1 0,75 149,25 350

2 1,5 148,5 350

3 2,25 147,75 350

Антигенную активность полученных серий вакцин оценивали на цыплятах 30-суточного возраста, которым препараты вводили подкожно в область нижней трети шеи в объеме 0,5 мл. Контролем служили цыплята, не привитые вакциной. Спустя 28 сут сыворотку крови исследовали в ИФА. Результаты сравнительного изучения антигенной активности вакцин представлены на рис. 1.

Титр антител 3954

Рис. 1. Антигенная активность инактивированной вакцины против РМ с разным компонентным составом

Как следует из представленных данных, антигенная активность полученных образцов вакцины находится в прямой зависимости от концентрации антигена в ее составе. Так, вакцина, содержащая 0,75 и 1,5 мкл антигена, индуцировала низкий иммунный ответ. Максимальный уровень антител в группе 1:3954 установлен при введении вакцины, содержащей специфический антиген в количестве 2,25 мкл в одной иммунизирующей дозе. В дальнейшем все выпускаемые серии инактивированной вакцины против РМ содержали в одной иммунизирующей дозе 2,25 мкл антигена.

2.2.4. Определение антигенных и физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной против РМ при хранении

Для обоснования режима хранения и сроков годности эмульсионной вакцины были проведены опыты по оценке качества препарата сразу после изготовления и в различные сроки хранения при температуре +2.. .+8 С.

Оценку антигенной активности вакцины проводили на цыплятах кросса «Хайсекс-коричневый» 35-суточного возраста. До и через 30 и 60 сут после первичной иммунизации, а также через 30 и 60 сут после ревакцинации от цыплят получали сыворотки крови и тестировали их в ИФА (табл. 2).

Таблица 2

Антигенная активность инактивированной вакцины против РМ при

хранении(п=20)

Срок хранения вакцины (мес) Титр антител к М. gallisepticum в ИФА

Фон После вакцинации, сут

1-й 2-й

30 60 30 60

0 45 1:4109 1:5080 1:10800 1:12104

6 79 1:4170 1:4907 1:11678 1:12345

12 48 1:3470 1:4203 1:10051 1:11307

Установлено, что однократное введение вакцины вызывает достаточно

высокий уровень антител независимо от сроков ее хранения (Р>0,05) при температуре +2...+8°С (гарантийный срок реализации 12 мес.)- Ревакцинация, проведенная после первичной иммунизации, вызывает достоверное повышение титра антител, значение которого сопоставимо с показателями, полученными при использовании, как свежеприготовленной вакцины, так и при её хранении в течение 6 и 12 мес.

Вакцина против РМ, приготовленная с использованием MA «ISA-70», на протяжении 12 мес при температуре хранения +2...+8°С, представляла гомогенную эмульсию белого цвета с постоянными физическими свойствами стабильности (после центрифугирования вакцины, высота сформировавшегося в верней части столбика прозрачной фракции составляла 3 мм) и вязкостью 40 мм2/с2, при нормативных показателях не более 10 мм и 400 мм2/с2, соответственно.

Таким образом, антигенная активность вакцины инактивированной эмульсионной против РМ не снижается при хранении в течение 12 мес.

2.2.5. Производственные испытания вакцины инактивированной эмульсионной против РМ

Изучение антигенных свойств вакцины инактивированной эмульсионной

против РМ проводили в производственных условиях на 21700 цыплятах. Вакцину вводили в область нижней трети шеи с дорсальной стороны в объёме 0,5 см3 первый раз в возрасте 35 сут и ревакцинировали в 95-суточном возрасте

Срок исследования после вакцинации, сут

Рис. 2. Антигенная активность вакцины инактивированной эмульсионной «АВИВАК-РМ»

Из данных рис. 2 следует, что перед началом опыта титр антител к М.

даШБерисшп у птиц в ИФА составил 1:158, что соответствует диагностически

отрицательным значениям.

Уровень антител через 30 и 60 сут после первичной иммунизации составил 1:2311 и 1:5579, соответственно, что в 2,2 и 5,4 раза превышает минимальный положительный показатель, принятый при использовании наборов производства АВИВАК (1:1029). Эти данные свидетельствуют об антигенной активности вакцины после однократного введения.

Максимальный титр антител при ревакцинации составил 1:12374 на 105-е сутки опыта, который сохранялся на достаточно высоком уровне до 225 сут (1:6119), а затем наблюдали период стабилизации (1:4373 - 1:3768).

В контрольной группе титр антител во все указанные сроки не превышал 1:398, что подтверждает достоверность полученных результатов.

2.2.6. Сравнительное испытание ассоциированной вакцины против ИБК, НБ и ССЯ-76 изготовленной на основе адъювантов «АВИВАК» и «ISA-70 VG»

В качестве адъювантов при изготовлении вакцин против НБ, ИБК и ССЯ-76 испытано большое количество различных веществ. Однако, практическое применение нашли в основном масляные адъюванты. В связи с тем, что в задачу наших исследований входили вопросы, связанные с усовершенствованием технологии получения ассоциированной вакцины против НБ, ИБК и ССЯ-76, для этого была проведена серия экспериментов.

Сначала были проведены сравнительные испытания безвредности и антигенной активности двух опытных образцов препарата, приготовленных на основе масляных адъювантов «АВИВАК» и «ISA-70» в соотношении 60:40 и 70:30 адъюванта с антигеном соответственно. При этом, согласно ранее принятой на предприятии рецептуре, изложенной в производственном регламенте, доля антигенов НБ и ССЯ-76 составила по 25% каждого и 50% вируса ИБК от общего объема водной фракции.

Безвредность и антигенную активность определяли на молодняке кур, кросса «Ломан белый» 100-суточного возраста. Для определения антигенной активности вакцины у подопытных птиц брали кровь за сутки до и через 1, 3, 6, 9 и 12 мес после иммунизации.

При оценке безвредности вакцин, приготовленных на разных адъювантах, была установлена разная степень проявления их реакции на месте введения. Через 10 сут после иммунизации 4-кратной дозой (2,0 см3) вакциной, изготовленной на основе адъюванта «АВИВАК» на месте введения отмечали остатки не рассосавшейся вакцины в виде крупинок с рисовое/просяное зерно и

небольшую отечность подкожной клетчатки. На месте введения вакцины, изготовленной с использованием адъюванта «ISA 70», были обнаружены лишь вкрапления не рассосавшейся вакцины размером с просяное/маковое зерно, что свидетельствует о безвредности препарата.

Иммунный ответ к вирусу ИБК через 1 и 3 мес после применения вакцины на основе адъюванта «АВИВАК» составил 1:13037 и 1:9074 и был выше по сравнению с вакциной на основе адъюванта «ISA 70» (1:10740 и 1:8034). Однако, уровень антител в более поздние сроки (6 и 12 мес) наоборот, был выше в группе цыплят, привитых вакциной на адъюванте «ISA 70» (1:8088 и 1:7417), по сравнению с вакциной на основе адъюванта «АВИВАК» (1:6393 и 1:6149), соответственно (рис. 3).

"ИСКЧНС-ССЯ-?« ■ АЕИВ\К —-||[Ж-ИЕ-ССЯ-74" IMJDVt КОНТРОЛЬ —"НБК+НБ+ССЯ-Ti" ЛВИВЛК —"НБК+НБ.ССЯ-7(" 1SA-70 YG КОНТРОЛЬ

0 1 3 6 9 12

Срок исследования после вакцинации, мес

Рис. 3 Динамика выработки титров антител к вирусу ЦБК

О 1 3 6 9 12

Спок исследования после вакцинации, мес

Рис. 4 Динамика выработки титров антител к вирусу НБ

Как следует из данных рис. 4, максимальный титр антител к вирусу НБ регистрировали через месяц после иммунизации образцами вакцин на основе адъювантов «АВИВАК» и «ISA 70» (8,9 и 10,3 log2)i который продолжительное

время находился на высоком уровне и к концу опыта составил 6,6 и 8,0 log2, соответственно. При этом

существенных различий в формировании поствакцинального иммунитета к вирусу НБ у кур, в подопытных групп птиц не наблюдали. Результаты определения титра

антител к вирусу ССЯ-76 в РТГА представлены на рис.5. Максимальный титр к вирусу ССЯ-76 в вакцинированных группах

0 1 3 6 9 12

Срок исследования после вакцинации, мес

Рис. 5 Динамнка выработки титров антител к вирусу ССЯ-76

установлен через три месяца после иммунизации (9,5 и 10,9 log2) и последующие 9 мес сохранялся без существенных изменений у цыплят в обеих группах (Р>0,05).

В контрольной группе птиц титры антител к вирусам НБ и ИБК на протяжении исследований незначительно отличались от предвакцинального уровня, а антитела к вирусу ССЯ-76 отсутствовали.

На основании результатов проведенных исследований можно сделать заключение, что вакцины, изготовленные на основе адъювантов «АВИВАК» и «ISA 70», являются безвредными и обладают выраженной антигенной активностью по всем компонентам - ИБК, НБ и ССЯ-76, входящим в её состав. Однако, после иммунизации образцом, изготовленным на адъюванте «ISA-70», антигенная активность гемагглютинирующих компонентов (НБ и ССЯ-76) была несколько выше, чем при применении вакцин на основе адъюванта «АВИВАК».

2.2.7. Определение антигенных и физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной против ИБК, НБ и ССЯ-76 при хранении

В этом эксперименте оценивали качество образца ассоциированной вакцины против «ИБК+НБ+ССЯ-76», изготовленной на основе адъюванта «1SA-70» свежеприготовленной и при хранении 18 мес при температуре + 2...+8°С.

Для оценки антигенной активности вакцины в разные временные промежутки иммунизировали цыплят кросса «Хайсекс коричневый» 80...90 -суточного возраста. Титры антител к вирусам ИБК, НБ и ССЯ- 76 после вакцинации представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты контроля антигенной активности инактивированной вакцины

против ИБК, НБ и ССЯ-76 с разным сроком её хранения (п=20)

Титр Сроки хранения вакцины, мес

антител 0 6 12 1 8

к вирусу Сроки исследований, сут

0 28 0 28 0 28 0 28

ИБК* 1:2789 1:10735 1:2135 1:9787 1:1975 1:9536 1:2931 1:8936

НБ** 3,8 11,3 3,6 11,3 3^2 10,8 3,6 10,5

ССЯ-76** 0 8,4 0 8,3 0 8,1 0 8,2

Примечание: - средний титр антител определен в ИФА;

- средний титр антител определен в РТГА и выражен в Как показывают результаты опыта, существенной разницы между

показателями титров антител ко всем компонентам, входящих в состав вакцины при ее введении сразу после изготовления и после хранения в течение 18 мес, не установлено (Р>0,05).

Исследование физических свойств показало, что на протяжении всего периода хранения вакцина представляла собой гомогенную эмульсию белого цвета с постоянными физическими свойствами стабильности (после центрифугирования вакцины, высота сформировавшегося в верней части столбика прозрачной фракции составляла 3-4 мм) и вязкостью 40 мм2/с2.

Таким образом, вакцина инактивированная против ИБК+НБ+ССЯ-76 при длительном хранении (до 18 мес) сохраняет физические свойства и не снижает своей антигенной активности по входящим в нее компонентам.

2.2.8. Лабораторные испытания ассоциированных инактивированных эмульсионных вакцин

Для каждого птицеводческого хозяйства очень важно правильное составление конкретной программы вакцинаций, с сокращением количества профилактических обработок птицы. Основным средством решения этой задачи является использование ассоциированных вакцин. Для экспериментального подтверждения было сконструировано 2 варианта инактивированных эмульсионных вакцин: против РМ, ИБК, НБ и ССЯ-76, и против РМ и PEO.

В качестве контрольных препаратов использовали моновалентные образцы вакцин против РМ и PEO, с одинаковой концентрацией антигенов РМ и PEO, что и в экспериментальных образцах.

Для оценки определения антигенной активности было сформировано 5 групп цыплят кросса «Ломанн-браун» 50-суточного возраста. Птица первой группы была двукратно иммунизирована вакциной «РМ», вторая группа -вакциной «PEO» и третья - вакциной «РМ+РЕО». Вакцины вводили с интервалом 45 сут. Цыплят четвертой группы первый раз иммунизировали вакциной «РМ», второй через 45 дн вакциной «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76». Вакцина во всех случаях вводилась в объеме 0,5 см3, подкожно в область нижней трети шеи. Пятую группу цыплят не вакцинировали (интактный контроль). Для проведения серологических исследований от птиц получали сыворотки крови в следующие сроки: за сутки до и через 1 и 1,5 мес после первой иммунизации, а также через 1 мес после второй иммунизации.

Установлено, что однократное введение моновакцины против «РМ» вызывает повышение титра антител к М. gallisepticum в 4 раза на 30-е сут опыта

и достигает максимальной величины 1:4218 через 1,5 мес, а при ревакцинации -до 1:13140.

Уровень антител к антигену «PEO» через 1 и 1,5 мес после иммунизации составил — 1:2986 и 1:3017, соответственно и возрос до 1:29693 после ревакцинации. В третьей группе после однократного введения ассоциированной вакциной «РМ+РЕО» уровень антител как к М. gallisepticum, так и к реовирусу в исследуемые сроки был несколько ниже по сравнению с показателями в первой и второй группах цыплят. Ревакцинация, хотя и способствовала существенному увеличению титра антител к обоим компонентам, входящих в состав вакцины, но показатели были значительно ниже по сравнению с моновалентными вариантами вакцин независимо от кратности их введения. Следовательно, бивалентная вакцина «РМ+РЕО» по антигенной активности уступает одноименным моновакцинам.

Иммунный ответ в четвертой группе птиц, привитых ассоциированной вакциной «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76», сопоставим с данными предыдущего опыта, где цыплята были привиты ассоциированной вакциной без микоплазменного компонента. Эти данные свидетельствуют о совместимости в составе ассоциированной вакцины бактериальных и вирусных антигенов.

Таким образом, разработанные инактивированные эмульсионные вакцины как в moho-, так и в ассоциированной форме обладают выраженной антигенной активностью ко всем компонентам.

С целью определения динамики выработки и сроков выявления антител при ассоциированной иммунизации вакцинами «РМ» и «ИБК+НБ+ССЯ-76» в сравнении с иммунизацией вакциной «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» нами был проведен опыт на 50 цыплятах 30-суточного возраста породы «Ломанн-Браун». Подопытную группу цыплят (40 гол.) подкожно вакцинировали в область нижней трети шеи моновакциной «РМ» в объеме 0,5 см3. Часть цыплят (10 гол.) были не привиты и служили в качестве контроля. На 60 сут опыта цыплят подопытной группы разделили на четыре подгруппы. Птиц 1-й подгруппы иммунизировали вакциной «РМ», 2-й - «ИБК+НБ+ССЯ-76», 3-й -«РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76». В 4-й подгруппе вакцину «ИБК+НБ+ССЯ-76» вводили внутримышечно в правое бедро, а вакцину «РМ» - в левое бедро в объеме по 0,5 см3. Кровь отбирали до и через 1 и 2 мес после первой иммунизации и через 1 мес - после второй.

Титр антител к M.gallisepticum у цыплят до начала опыта был

отрицательный 1:335. Средние титры на введение моновакцины против «РМ» во всех подопытных группах цыплят через 30 и 60 сут различались незначительно и находились в пределах 1:5320 - 1:6935 (Р<0,05). Ревакцинация цыплят первой подгруппы моновакциной приводила к повышению иммунной реакции через 1мес в 2,3 раза.

У цыплят второй подгруппы, которых иммунизировали ассоциированной вакциной без микоплазменного антигена, регистрировали снижение специфических антител к М. gall¡septicum (1:3175), что служит подтверждением недостаточности однократной иммунизации моновакциной против «РМ» для обеспечения необходимого уровня антител. В третьей и четвертой подгруппах, где применяли ассоциированную вакцину «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» и одновременно вакцины «РМ» и «ИБК+НБ+ССЯ-76», цыплята имели почти одинаковые титры антител к М. gaШsepticum 1:10761 и 1:11006, соответственно, но ниже, чем при двукратном введении моновакцины против «РМ».

Антигенная активность по валентности ИБК во второй подгруппе цыплят, иммунизированных ассоциированной вакциной без антигена М. gaШsepticum была выше (1:12662) по сравнению с третьей (1:7901) и четвертой (1:8584) подгруппами цыплят, привитых вакцинами, содержащими антиген М. galIisept¡cum. Результаты исследований подтверждают литературные данные других авторов (Н.В. Медуницин, 2006).

Следует подчеркнуть, что титр специфических антител к вирусам НБ и ССЯ-76 в ответ на введение ассоциированных вариантов вакцин находился на одном уровне и составил около 11,7 и 7,9 1о§2, соответственно.

Анализ вышеизложенных результатов свидетельствует о том, что ассоциированная инактивированная эмульсионная вакцина «ИБК+НБ+ССЯ-76+РМ» вызывает у цыплят образование высокого протективного уровня антител по всем компонентам, хотя к антигену М. gallisepticum - несколько ниже, чем после двукратного применения моновакцины РМ.

Вакцина против РМ, ИБК, НБ и ССЯ-76 обеспечивает выработку титра антител ко всем компонентам на одном уровне, как и при ассоциированной иммунизации вакцинами «ИБК+НБ+ССЯ-76» и «РМ».

2.2.9. Оценка иммунологической активности инактивированных вакцин против «РМ» и «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76»

Задачей следующего эксперимента явилась оценка эффективности специфической профилактики микоплазмоза птиц путем последовательного

применения моновакцины «РМ» и ее ассоциированного варианта. Для этого 20 цыплятам в возрасте 30 сут. ввели моновакцину и через два месяца - вакцину «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» в дозе 0,5 см3/гол в область нижней трети шеи соответственно. Вторая группа в количестве 10 гол была интактным контролем. Сыворотку крови для анализа отбирали до и через 1 и 2 месяца после первой иммунизации, а также до и каждый месяц в течение года после введения ассоциированной вакцины.

Содержание в сыворотках крови специфических антител к M. gallisepticum до начала опыта составило 1:281, а через 1 и 2 месяца их титр увеличился в 8,3 и 16,4 раза, соответственно (Р<0,01). Последующее введение ассоциированной вакцины через 2 мес. индуцировало максимальный уровень сероконверсии к М. gallisepticum 1:12385, но через 4 мес. регистрировали некоторое снижение активности 1:8694, которая сохранялась в пределах 1:2949 в течение 12 мес. Следует подчеркнуть, что эти значения превышают минимальные положительные показатели в ИФА.

Пик иммунного ответа к вирусу ИБК у птиц (1:11287) вьивляли через 2 мес. после применения ассоциированной вакцины, который сохранялся на этом уровне до 6 мес. (1:9360), а к завершению опыта снизился до 1:5694.

Динамика формирования поствакцинального иммунитета к вирусам НБ и ССЯ-76 у птицы, иммунизированной ассоциированной вакциной имеет одинаковую картину. Максимальные титры антигемагглютининов к возбудителям НБ и ССЯ-76 отмечали через 1 и 2 мес после иммунизации и они находились в пределах 11,4 и 9,8 log2, соответственно, и к завершению опыта снизились до 7,3 log2.

Статистическая обработка титров специфических антител до вакцинации и после введения инактивированной вакцины «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» показала достоверную разницу (Р<0,05-0,001).

В контрольной группе птиц титры антител к M. gallisepticum и к вирусам ИБК и НБ на протяжении всего опыта не превышали предвакцинального уровня, а антитела к вирусу ССЯ-76 отсутствовали.

На основании результатов проведенных экспериментов можно заключить, что ассоциированная инактивированная эмульгированная вакцина против РМ, ИБК, НБ и ССЯ-76 обладает выраженной антигенной активностью и формирует иммунитет по всем специфическим компонентам, включенным в состав препарата продолжительностью до 12 мес. (срок наблюдения).

3. Выводы

1. Разработана и внедрена технология изготовления и контроля моновалентной и ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины «АВИВАК-РМ» и «АВ ИВ А К-РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76 ».

2. Полнота инактивации культуры М. gallisepticum достигается воздействием теотропина и формальдегида в 0,1%-ной концентрацией, в течение 24 часов при температуре 37±0,5 °С и 20-22°С, соответственно, и 0,001% мертиолятом в течение 24 часов при температуре 37±0,5 °С.

3. При сравнительном испытании образцов инактивированной вакцины с различными масляными адъювантами доказано, что наиболее эффективными и безвредными являются препараты, изготовленные на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG, «SEPPIC».

4. Установлено, что оптимальный объем антигена М. gallisepticum с исходной агглютинирующей активностью 5 log2 составляет 2,25 мкл на дозу вакцины.

5. Вакцина «РМ+РЕО» после двукратного введения обеспечила выработку антител в титрах достаточных для защиты птиц от инфицирования возбудителям РМ и PEO. При этом моновалентные варианты вакцин «РМ» и «PEO» индуцировали уровень антител выше в 2,3 и 2,9 раза, соответственно.

6. Ассоциированная вакцина «АВИВАК-РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» обеспечивает формирование напряженного иммунитета, сопоставимого с иммунитетом, создаваемым при раздельном введении вакцин «АВИВАК-РМ» и «АВИВАК-ИБК+НБ+ССЯ-76».

7. Ассоциированная инактивированная эмульсионная вакцина «АВИВАК-РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76» вызывает у цыплят образование высокого защитного уровня антител ко всем антигенам, входящим в её состав, в условиях птицехозяйств.

4. Предложения для практики

4.1. В качестве инактиванта штамма «S6» М. gallisepticum предложен препарат мертиолят в 0,001% концентрации в течение 24 часов при температуре 37±0,5 °С. Определено оптимальное количество антигена М. gallisepticum с агглютинирующей активностью 5,0 log2 в одной иммунизирующей дозе вакцины 0,5 см3, которое составляет 2,25 мкл. Для изготовления вакцин против вирусных и бактериальных болезней птиц подобран эффективный и безвредный масляный адъювант «ISA-70», Полученные результаты

используются в НПП «АВИВАК» для серийного производства инактивированных вакцин против респираторного микоплазмоза и вирусных болезней птиц.

4.2. Разработаны и утверждены: промышленный регламент производства, технические условия, инструкция по применению и получено регистрационное свидетельство на вакцину инактивированную эмульсионную против респираторного микоплазмоза птиц «АВИВАК-РМ».

4.3. Внедренная в промышленное птицеводство вакцина инактивированная эмульсионная против респираторного микоплазмоза птиц «АВИВАК-РМ» широко применяется на птицефабриках Российской Федерации и странах ближнего зарубежья и в комплексе с другими противоэпизоотическими мероприятиями обеспечивает благополучие хозяйств по респираторному микоплазмозу птиц.

4.4. Подготовлен проект НД (промышленный регламент производства, стандарт организации, инструкция по применению) на ассоциированную вакцину инактивированную эмульсионную против РМ, ИБК, НБ и ССЯ-76, который рассмотрен и одобрен на заседании научно-технического совета НПП «АВИВАК» (протокол № 3 от 12.03.2012г.).

5. Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ:

1. Рождественская Т.Н. Микоплазмозы птиц: особенности эпизоотологии, диагностики и профилактики / Т.Н. Рождественская, А.Н. Борисенкова, C.B. Панкратов // Российский ветеринарный журнал. С.-х. животные.- 2006.-№3,-С.38-40.

2. Терюханов А.Б. Результаты испытаний инактивированной эмульсионной вакцины «АВИВАК ИБК+ НБ +ССЯ-76» / А.Б. Терюханов, C.B. Панкратов, Т.В. Уткина // Российский ветеринарный журнал. С.-х. животные.-2006.-№4,-С.41-42.

3. Терюханов А.Б. Антигенная активность вируса ныокаслской болезни, инактивированного разными препаратами / А.Б. Терюханов, C.B. Панкратов, С.А. Емельянова // Российский ветеринарный журнал. С.-х. животные,- 2007,-№4.-С.4б-47.

Статьи, опубликованные в сборниках материалов конференций:

4. Рождественская Т.Н. Инактивированные вакцины для профилактики бактериальных болезней птиц / Т.Н. Рождественская, C.B. Панкратов, С.Н.

Гаврилов // III Международный конгресс по птицеводству 10-13 апреля 2007 г., M., 2007.-С.187-190.

5. Рождественская Т.Н. Респираторный микоплазмоз птиц: особенности эпизоотологии, диагностики и профилактики / Т.Н. Рождественская, А.Н. Борисенкова, C.B. Панкратов, Е.В. Кононенко // НПП «АВИВАК» - 20 лет на благо промышленного птицеводства.- Санкт-Петербург, 2010.-С.55-60.

6. Рождественская Т.Н. Эффективность ассоциированных вакцин против вирусных и микоплазменных инфекций Т.Н. Рождественская, C.B. Панкратов, В.А. Белкин, С.Н. Гаврилов // VI Международный ветеринарный конгресс по птицеводству. 2б-29апреля 2010, г. Москва,- М.,2010.-С.48-51.

7. Рождественская Т.Н. Оценка антигенной активности инактивированных вакцин против респираторного микоплазмоза и вирусных инфекций кур / Т.Н. Рождественская, C.B. Панкратов, Н.Д. Придыбайло // VII Международный ветеринарный конгресс по птицеводству. 12-15 апреля 2011, г. Москва.-М..2010.-С.53-55.

Подписано в печать 10.10.2013 Тираж 100 экз. Заказ Л» 777 Отпечатано в ЗАО «Атташе» 191040, Санкт-Петербург, Лиговский проспект 63/15

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Панкратов, Сергей Вячеславович, Санкт-Петербург

ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «АВИВАК»

(ООО « НЛП «АВИВАК»)

ПАНКРАТОВ СЕРГЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

Ассоциированная иммунизация и усовершенствование технологии производства вакцин против респираторного микоплазмоза и вирусных

болезней птиц

Специальность: 06.02.02 - ветеринарная микробиология,

^ вирусология, эпизоотология, микология

00 с микотоксикологией и иммунология.

СО оч

со ^

со оЗ Диссертация

0 на соискание ученой степени кандидата

ветеринарных наук.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук

Рождественская Т.Н.

Санкт-Петербург - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. Введение...................................................................................4

2. Обзор литературы........................................................................8

2.1. Эпизоотология заболеваний, специфическая профилактика и оценка

ее эффективности при РМ, НБ, ИБК и ССЯ-76.....................................8

22. Вакцинация - основа эпизоотического благополучия в промышленном птицеводстве.......................................................................................21

23. Общая характеристика инакгивированных вакцин...................................23

2.4. Подбор микроорганизмов для инакгивированных вакцин.....................24

2.5. Характеристика инактивантов вакцинных антигенов........................26

2.6. Основные классы иммуноадъювантных веществ и их краткая характеристика............................................................................30

3. Собственные исследования............................................................35

3.1. Материалы и методы..................................................................35

3.1.1. Материалы исследований........................................................35

3.1.2. Методы исследований.............................................................37

3.2. Результаты собственных исследований..........................................51

3.2.1. Создание инактивированной эмульсионной вакцины против респираторного микоплазмоза птиц....................................................51

3.2.1.1. Подбор оптимальных препаратов для инактивации микробной массы штамма «Бб» М. gaШsepticum....................................................51

3.2.1.2. Подбор оптимального масляного адъюванта для изготовления инактивированной эмульсионной моновакцины против РМ......................53

3.2.1.3. Определение оптимальной концентрации антигена М. §аШзерйсит в инактивированной эмульсионной вакцине........................55

3.2.1.4. Определение антигенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против РМ при введении ее разными методами......57

3.2.1.5. Определение антигенных и физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной против РМ при хранении.....................59

3.2.1.6. Производственные испытания вакцины инактивированной эмульсионной против РМ................................................................61

3.2.2. Усовершенствование технологии изготовления ассоциированной вакцины против ИБК, НБ и ССЯ-76 инактивированной эмульсионной.....63

3.2.2.1. Сравнительное испытание ассоциированной вакцины против ИБК, НБ и ССЯ-76 изготовленной на основе адъювантов «АВИВАК» и «1БА-70 Ув»................................................................................63

3.2.2.2. Определение антигенных и физических свойств вакцины инактивированной эмульсионной против ИБК, НБ,ССЯ-76 при хранении.....................................................................................67

3.2.3. Лабораторные испытания ассоциированных инактивированных эмульсионных вакцин...................................................................70

3.2.4. Оценка иммунологической активности инактивированных вакцин против «РМ» и «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76».............................................78

4. Обсуждение результатов исследования...........................................82

5. Выводы...................................................................................92

6. Предложения для практики.........................................................93

7. Список опубликованных работ по теме диссертации..........................94

8. Список сокращений....................................................................95

9. Список литературы...................................................................96

10. Приложения...........................................................................121

1. Введение

Актуальность темы. В настоящее время проблема смешанных инфекций в промышленном птицеводстве чрезвычайно актуальна в связи с возрастающей частотой проявления ассоциированных форм патологии птиц. При смешанных вирусных и вирус-бактериальных инфекциях затруднена не только своевременная и точная диагностика болезни, но также снижается эффективность противоэпизоотических мероприятий, что наносит существенный экономический ущерб отрасли [1]. Одним из эффективных средств профилактики инфекционных болезней является применение ассоциированных вакцин включающих как вирусные, так и бактериальные антигены [92, 94].

Главным преимуществом ассоциированных инактивированных вакцин по сравнению с моновакцинами является: создание у привитых птиц напряженного и продолжительного иммунитета одновременно к нескольким возбудителям, сокращение количества вакцинаций и стрессовых факторов, снижение трудозатрат на проведение иммунизации [21].

Смешанные инфекции очень часто сопровождаются проявлением респираторного синдрома, ключевую роль в развитии которого играет Mycoplasma gallisepticum [90].

За рубежом для специфической профилактики респираторного микоплазмоза (РМ) широко применяют инактивированные масляно-эмульсионные вакцины [14].

В отечественной литературе имеются данные по применению моновакцины против РМ [30, 48] и различных вариантов ассоциации антигена РМ с вирусными антигенами [36, 37, 38, 43, 44]. Однако авторы не приводят сведения об основных параметрах технологии производства, а также о результатах испытаний эффективности вакцин с многокомпонентным составом в экспериментальных и производственных условиях.

В связи с этим исследования по разработке технологии изготовления и

схем применения отечественной моновакцины против РМ птиц и ее ассоциированных форм с антигенами инфекционного бронхита кур (ИБК), ныокаслской болезни (НБ), синдрома снижения яйценоскости (ССЯ-76) и реовирусной инфекции (PEO) являются весьма актуальными и соответствуют требованиям современного промышленного птицеводства.

Цель и задачи исследований. Цель исследований — усовершенствование технологии изготовления и контроля качества инактивированной эмульсионной вакцины против РМ и её ассоциированных форм с вирусными антигенами (ИБК, НБ, ССЯ-76 и PEO) и оценка протективных свойств полученных препаратов.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:

- отработать методику инактивации М. gallisepticum;

- разработать технологию производства и методы контроля вакцин против «РМ» и «РМ+ИБК+НБ+ССЯ-76»;

- оценить эффективность разработанных препаратов в лабораторных и производственных условиях;

Подобран масляный адъювант обеспечивающий высокую антигенную активность и ареактогенность моно- и ассоциированных форм эмульсионных

вакцин против респираторного микоплазмоза птиц .

Практическая значимость работы. На основании полученных результатов разработаны и утверждены:

В период с 1.01. 2006 г. и по настоящее время выпущено и применено 12,5 млн. доз вакцины «АВИВАК-РМ».

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

- методика инактивации штамма «S6» M. gallisepticum теотропином и мертиолятом;

- компонентный состав и иммунобиологические свойства вакцины инактивированной эмульсионной против РМ;

- результаты производственных испытаний вакцины «АВИВАК-РМ».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы

доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Эффективность ведения промышленного птицеводства в современных условиях» (Санкт-Петербург, 2009 - 2013 г.), на VI и VII Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (Москва, 2010 и 2011 гг.) и на заседании Научно-технического совета НПП «АВИВАК» (2013 г.).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно.

2. Обзор литературы 2.1. Эпизоотология заболеваний, специфическая профилактика и оценка ее эффективности при РМ, НБ, ИБК и ССЯ-76

Респираторный микоплазмоз птиц (РМ) - инфекционная субклиническая или хронически протекающая болезнь птиц, для которой характерны поражения органов дыхания и глаз - насморк, чихание, воспаление носовых и подглазничных синусов, воздухоносных мешков, конъюнктивы глаза.

Основным возбудителем РМ является Mycoplasma gallisepticum, хотя сходную симптоматику могут вызывать и другие, менее патогенные виды микоплазм, в т.ч. М. sinoviae, М. meleagridis и М. iowae [26].

Микоплазмы - самые маленькие саморегулирующие формы жизни на нашей планете. Клетки плеоморфные, от сферических или грушевидных (0,3-0,8 мкм в диаметре) до тонких разветвленных нитей, варьирующих по длине от нескольких до 150 мкм. Грамотрицательные. Они не имеют истинной клеточной стенки, а ограничены лишь трехслойной липопротеидной цитоплазматической мембраной. Эволюция позволила им стать факультативными внутриклеточными паразитами, следовательно, труднодоступными для факторов иммунитета, антибиотиков и химиотерапевтических препаратов [90,140].

Респираторный микоплазмоз, вызванный М. gallisepticum, регистрируется во всех странах мира, где птицеводство ведется на промышленной основе. Наиболее восприимчивы к нему куры (цыплята 20-45-сут возраста и куры-несушки в период начала и на пике яйцекладки) и индейки, в меньшей степени - фазаны, цесарки, павлины, куропатки, перепелки и комнатные птицы [8, 49, 75].

В возникновении болезни большое значение имеет инфицированность птицы эшерихиями, стафилококками, синегнойной палочкой, пастереллами ослабленной вирулентности, орнитобактериями, вирусами ГТТ, НБ, ИБК, ИЛТ,

МПВИ, способными как в ассоциации с микоплазмами, так и самостоятельно вызвать респираторный синдром [181]. Это значительно затрудняет своевременную постановку диагноза и разработку мер борьбы [13, 17, 34, 55, 63].

РМ занимает одно из лидирующих мест в инфекционной патологии птиц и наносит огромные экономические убытки. Например, экспериментальное заражение суточной бульонной культурой М. gallisepticum индеек, полученных из хозяйства, благополучного по инфекционным болезням, вызвало задержку яйцекладки до 280-285-дневного возраста, что на 4 недели превышает нормативный возраст, а часть индеек (10%) вообще не начала яйцекладку. При последующей яйцекладке количество неоплодотворенных яиц составило 66%, при 25% в контроле. Вывод индюшат составил 29,0 % от заложенных и 57,8% от оплодотворенных яиц, в то время как в контрольной группе (от неинфицированных индеек) эти показатели составили 52,0 и 93,7%, соответственно [89].

Аналогичных примеров экономических потерь при РМ можно привести множество.

Для успешной борьбы с респираторным микоплазмозом необходима правильная и своевременная диагностика болезни [151].

Диагноз на РМ ставят комплексно с учетом эпизоотологической ситуации, клинического и патологоанатомического проявления болезни, данных лабораторных исследований, в т.ч. изоляции и идентификации возбудителя, выявления специфических антител в сыворотке крови птицы и молекулярное обнаружение нуклеиновой кислоты методом ПЦР.

Для серологической диагностики РМ пользуются СКРА (пробирочным или микрометодом на стекле) и ИФА. Отечественные тест-системы СКРА выпускают ГНУ «ВНИВИП», НПП «АВИВАК» и ФГУ «ВНИИЗЖ», а ИФА -Hi 111 «АВИВАК» и ФГУ «ВНИИЗЖ». Благодаря высокой чувствительности и специфичности данные тесты позволяет контролировать динамику энзоотий

микоплазмозов, корректировать сроки вакцинации и обоснованно планировать профилактическое применение лекарственных препаратов.

Кроме того, разработаны различные варианты ПЦР-диагностики, которая позволяет выявить возбудитель, а не наличие к нему антител [180, 186]. Однако имеются данные, что у кур-несушек ПЦР лучше всего выявляет М. sinoviae ( в 18 из 19 хозяйств), в то время как М. gallisepticum не обнаружена ни в одном случае. Кроме того были получены различные результаты из лабораторий, использующих один и тот же коммерчески доступный ПЦР-набор, специфичный для определения микоплазм. Следовательно, диагностика, основанная на ПЦР, имеет свои ограничения, в первую очередь связанные с материальными затратами и наличием специализированных лабораторий.

Обеспечение эпизоотического благополучия птицехозяйства в отношении респираторного микоплазмоза гарантирует увеличение продуктивности несушек и бройлеров, повышение эффективности использования кормов, повышение сохранности птицепоголовья и в целом улучшение производственных и финансово-экономических показателей предприятия.

Контроль респираторного микоплазмоза предусматривает три основных подхода: поддержание стад, свободных от патогенов, включая методы комплектования и биобезопасности; лечение и профилактику для предотвращения клинических признаков и снижения экономических потерь; вакцинацию против М. gallisepticum и М. synoviae [14].

Первое направление является наиболее эффективным способом контроля, однако достичь этого уровня очень сложно, так как требуются значительные материальные затраты и возможны рецидивы микоплазменной инфекции [67].

Самым распространенным, на сегодняшний день, средством борьбы с респираторным микоплазмозом являются химиотерапевтические препараты. При правильном подборе антимикоплазменных средств инфекцию можно подавить, при этом вовсе не обязательно полное удаление возбудителя из организма, что практически сделать невозможно. Этим решается задача

снижения давления микоплазм на организм птицы и получения генетически запланированной продуктивности птиц.

Наиболее эффективными средствами лечения являются антибиотики, ингибирующие синтез белка: тилан, тилозин, тиамулин, фармазин, фрадизин, тиланик, а также синергические препараты в сочетании с указанными антибиотиками [12, 13, 27, 56, 157, 171, 185].

Тем не менее, применение антибактериальных препаратов с целью профилактики респираторного микоплазмоза за последние годы значительно уменьшилось, что связано с проблемой резистентности к ним у человека, потребляющего продукты птицеводства. Поэтому возрос интерес к специфической профилактике этой болезни [11].

С этой целью разработаны и применяются на практике живые и инактивирован�

Информация о работе

Панкратов, Сергей Вячеславович
кандидата ветеринарных наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 06.02.02

Диссертация

Ассоциированная иммунизация и усовершенствование технологии производства вакцин против респираторного микоплазмоза и вирусных болезней птиц - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы