Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота с использованием синтетических пептидов и олигонуклеотидов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота с использованием синтетических пептидов и олигонуклеотидов"

од

'гНа правах рукописи УДК 619:616.98:578.828:11:616-076:577.2

ПРОХВАТИЛОВА Лариса Борисовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ И ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

03.00.06 "Вирусология"

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир, 1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ) Минсельхозпрода РФ.

Научный руководитель: Рыбаков Сергей Сергеевич,

доктор биологических наук, профессор Научный консультант: Ломакин Александр Иванович, кандидат химических наук, старший научный сотрудник Официальные оппоненты: Рахманов Анатолий Михайлович,

' доктор ветеринарных наук, профессор,

заслуженный деятель науки Российской Федерации (ВНИИЗЖ, г. Владимир) Крикун Владимир Антонович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (МВА им. К.И.Скрябина, г.Москва) Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (г. Москва) Защита состоится июня 1998 г. в 11 часов на заседании

диссертационного совета Д 120.60.01 при Всероссийском научно. исследовательском институте защиты животных по адресу: 600900, Г.Владимир, пос. Юрьевец, ВНИИЗЖ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных. Автореферат разослан мая 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета - Ю.А.Черняев

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Лейкоз крупного рогатого скота - тяжелое хроническое заболевание, вызываемое вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС), который является представителем семейства Ке1гоу1пс1ае. Данное заболевание регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России, и причиняет большой экономический ущерб вследствие недополучения молока и приплода из-за преждевременной выбраковки коров, убоя быков-производителей, утилизации туш больных животных и дополнительных расходов на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий.

ВЛ КРС поражает В-лимфоциты, при этом вирусная РНК встраивается в геном клетки хозяина в виде ДНК-копии, образуя лровирус. Интегрированный в клеточный геном провирус может долгое время не экспрессироваться, чем и объясняется наличие длительного (от нескольких месяцев до нескольких лет) латентного периода в развитии заболевания, когда в крови животных не обнаруживаются антитела к вирусу, при этом инфицированные животные сами могут служить источником инфекции. В связи с этим актуальной является проблема диагностики лейкоза на ранних стадиях заболевания.

В настоящее время основным диагностическим методом, который широко применяется для массовых исследований, является реакция иммунодиффузии в геле агара (РИД). Однако не у всех заболевших животных уровень антител в крови достигает значений, тестируемых в РИД. Разработанные в последние годы ИФА-тесты позволяют обнаруживать инфицированных животных раньше и с большей чувствительностью, чем РИД. Наиболее перспективным подходом является создание диагностикумов, в которых в качестве антигенов используются синтетические пептиды, обладающие рядом преимуществ перед рекомбинантными или выделенными из клеточных культур вирусными антигенами: прежде всего, это безопасность производства и использования; во-вторых, технологичность производства и стабильность при хранении.

Вместе с тем, не всегда при диагностике лейкоза КРС серологические тесты могут дать однозначный результат, например, при наличии различных хронических заболеваний, вакцинации. Ассоциированность ВЛ КРС с клеточными структурами обуславливает выработку широкого спектра антител, в том числе и к

нормальным клеточным антигенам, что в ряде случаев затрудняет серологическую диагностику лейкоза крупного рогатого скота.

В связи с этим необходима разработка подтверждающих тестов, основанных на специфической индикации ВЛ КРС. Особый интерес представляют методы молекулярной биологии, и прежде всего, полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая обнаруживать вирусный геном в лимфоцитарной ДНК животных.

Перечисленные обстоятельства явились определяющими при выборе темы диссертационной работы.

Цели и задачи исследований. Основной целью нашей работы явилась разработка новых средств диагностики лейкоза крупного рогатого скота с использованием метода иммуноферментного анализа на основе синтетических пептидов и полимеразной цепной реакции.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- подобрать оптимальные условия концентрирования и очистки антигена ВЛ КРС;

- изучить возможность использования синтетических пептидов-фрагментов гликопротеида др51 ВЛ КРС для обнаружения антител к вирусу лейкоза в сыворотках крови инфицированных животных;

на основании сравнительного анализа известных нуклеотидных последовательностей гена др51 ВЛ КРС сконструировать праймеры и разработать метод выявления вирусспецмфической последовательности в лимфоцитарной ДНК животных с помощью ПЦР;

- провести сравнительное изучение возможности выявления методами РИД, ИФА и ПЦР естественно и экспериментально инфицированных ВЛ КРС животных;

- на основании проведенных исследований разработать методические рекомендации для серологической и молекулярно-биологической диагностики лейкоза КРС.

Научная новизна.

Оптимизированы условия выделения и очистки вируса лейкоза КРС из клеточной культуры Р1.К, хронически инфцированной ВЛ КРС.

Изучена диагностическая ценность ИФА на основе синтетических пептидов при выявлении антител к ВЛ КРС в сыворотках крови инфицированных животных.

Сконструированы лраймеры, позволяющие выявлять лровирус лейкоза КРС в лимфоцитарной ДНК инфицированных животных путем амплификации фрагмента гена др51 ВЛ КРС.

Обнаружены отдельные нуклеотидные замены в составе штамма Р1.К-В1.\/, являющегося продуцентом ВЛ КРС, и полевого изолята, выделенного на территории Владимирской области. Проведено сравнение определенной нуклеотидной последовательности с опубликованными структурами и прослежены вероятные филогенетические отношения.

Показано преимущество метода ПЦР по сравнению с серологическими методами диагностики при раннем выявлении заболевания у естественно и экспериментально инфицированных ВЛ КРС животных.

Практическая значимость работы. В процессе исследований разработаны: "Методика выявления в ИФА антител к вирусу лейкоза в сыворотках крови крупного рогатого скота с использованием синтетических пептидов" (утверждена директором ВНИИЗЖ 8 сентября 1995 г.); "Методика выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции" (утверждена директором института 16 апреля 1997 г.); "Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота" (проект), одобренные Ученым советом ВИЭВ (протокол №7 от 25 августа 1997г.) и секцией инфекционной патологии животных отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 2 от 17 июня 1997 г.) и представленные на утверждение в Департамент ветеринарии Минсельхозпрода России, позволяющие проводить анализ проб, взятых из неблагополучных хозяйств, с целью раннего выявления инфицированных лейкозом животных.

Положения, выносимые на защиту:

- метод выявления антител к ВЛ КРС в сыворотках крови животных с помощью ИФА на основе синтетических пептидов;

- метод выявления вируса лейкоза в крови инфицированных животных с помощью ПЦР на основе амплификации фрагмента гена др51 ВЛ КРС;

- результаты сравнительных исследований методами РИД, ИФА, и ПЦР образцов крови инфицированных животных при диагностике лейкоза КРС с целью раннего обнаружения инфекции.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены на конференции "Вирусные и микробные болезни

сельскохозяйственных животных" (Владимир, 1995 г.), на Международной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996 г.), на Международной научно-практической конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных", посвященной 100-летию открытия вируса ящура (Владимир, 1997 г.), а также на заседаниях Ученого Совета ВНИИЗЖ (1994-1997 гг.).

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ и одна работа находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 20 таблицами. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 192 источника, из которых 105 иностранных и приложение, содержащее документы, подтверждающие практическую ценность отдельных этапов работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры клеток. В работе использовали монослойные культуры перевиваемых линий клеток MDBK и FLK, которые были любезно предоставлены из музея клеточных культур ВНИИЗЖ к.в.н. Куляшбековой Ш.К.

Животные. Для получения вирусспецифических и антипептидных сывороток, а также для экспериментального заражения ВЛ КРС использовали кроликов породы шиншилла в возрасте 5-6 мес., овец романовской породы 6-мес. возраста и морских свинок массой 400 г.

Сыворотки и пробы крови КРС. При выполнении экспериментов были взяты образцы цельной крови и сыворотки крови КРС из различных хозяйств Владимирской и Нижегородской областей.

Реактивы. Для приготовления растворов использовали химические реактивы фирм Sigma, Serva, Merck, Fluka, Promega, Pharmacia, а также

отечественные реактивы марки "осч" и "ч", радионуклиды фирмы "Изотоп" (г.Обнинск).

Ферменты. В работе использовали ферменты фирм Serva, Promega, пероксидазные конъюгаты производства ИЭМ им. Н.И.Гамалеи. Кроме того, при проведении исследований использовали ИФА-наборы для выявления антител к ВЛ КРС фирм DR. Bommeli и IDEXX.

Концентрирование и очистка ВЛ КРС.1 ВЛ КРС получали из супернатанта хронически инфицированной вирусом лейкоза клеточной культуры FLK по методу Buck с соавторами (C.Buck, 1988) с некоторыми модификациями.

Выделение вирусной РНК. РНК из препаратов ВЛ КРС и из образцов крови животных выделяли по методу P.Chomzynski (1987) с модификациями (С.В.Безбородова, 1995).

Синтез кДНК на матрице РНК проводили с помощью AMV-ревертазы по ранее описанному методу (Т.Маниатис, 1984).

Выделение лимфоцитов крови проводили центрифугированием в градиенте фикола (Pharmacia) согласно наставлению фирмы-изготовителя.

Геномную ДНК из крови животных выделяли по описанным методикам (О.Г.Грибанов, 1996; Т.Маниатис, 1984; С.Н.Радюк, 1996).

Расчет и синтез праймеров. Расчет проводили с помощью программы Oligo, версия 3.3 (W.Rychlic, 1989). При оценке использовали как термодинамический подход, так и эмпирический метод, основанный на G-C содержании последовательности праймеров. Олигонукпеотиды химически синтезировали Н-фосфонатным методом на автоматическом синтезаторе "ASM-102U" ("Биоссет", Россия). Компьютерный анализ проведен к.б.н. С.Н.Колосовым, синтез олигонуклеотидных праймеров осуществлен к.х.н. А.И.Ломакиным.

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили по методу, описанному А. Ballagi-Pordany (1995) с некоторыми модификациями.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК.2 Первичную структуру ДНК определяли энзиматическим методом F.Sanger (1977).

Расчет и синтез пептидов-фрагментов гликопротеида др51 ВЛ КРС. Участки аминокислотной последовательности выбирали с использованием разработанного во ВНИИЗЖ пакета прикладных программ ANSITE (С.К.Базарова,

работа выполнена совместно о к.в.н. Фоминой Т.А. и к.в.н. Кременчугской С.Р. работ:! выполнена совместно с к.о.н. Аянотом П.К.

1988) и синтезировали твердофазным методом. Синтез пептидов проведен к.б.н. В.Н.Петровым.

Иммуноферментный анализ. В работе использовали непрямой вариант ИФА, а также коммерческие наборы Bovine leukemia virus antibody test kit (IDEXX) и Chekit-leucotest (DR. Bommeli).

Реакция иммунодиффузии. РИД проводили с использованием набора для серологической диагностики лейкоза КРС производства Курской биофабрики.

Статистический анализ материала. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по методу Стьюдента (Л.С.Каменский, 1964), а также методами, описанными в руководстве И.П.Ашмарина (1975) с использованием таблиц по математической статистике (П.Мюллер, 1982).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Концентрирование и очистка вируса лейкоза КРС

Для получения вируса лейкоза КРС нами были использованы два метода: метод ультрацентрифугирования и метод осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) с последующим центрифугированием.

В первом случае вируссодержащую суспензию очищали через 20% раствор сахарозы в буферном растворе TNE (50 мМ трис HCl, 150 мМ NaCI, 5 мМ ЭДТА. pH 7,4) при 22 тыс. об./мин. в роторе АН-627 центрифуги Sorvall в течение 35 мин., после чего концентрировали в 200 раз. Полученный таким образом препарат вновь очищали высокоскоростным центрифугированием в 11-55% градиенте сахарозы при 20 тыс. об./мин. в том же роторе в течение 2 ч. Фракционирование градиента проводили с помощью проточного спектрофотометра при длине волны 280 нм. Фракции, соответствующие пикам оптической плотности, объединяли и избавлялись от сахарозы переосаждением вируса при 21 тыс. об./мин. в роторе JA-21 центрифуги Beckman J2-21 в течение 1 ч., после чего вируссодержащую суспензию концентрировали в 500 раз по сравнению с исходным объемом.

В случае использования метода преципитации к вирусной суспензии добавляли 10% ПЭГ с молекулярной массой 6000 и выдерживали при 4°С в течение ночи. Осадки собирали центрифугированием при 9 тыс. об./мин. в роторе JA-10 центрифуги Beckman J2-21 в течение 10 мин., ресуспендировали в 1/20

исходного объема буферного раствора TNE. Дальнейшая обработка материала проводилась также, как в первом случае.

Полученные препараты характеризовались гомогенным пиком. При исследовании в ИФА показано, что фракции, соответствующие пику оптической плотности, были активны в реакции со специфическими сыворотками в разведении 1:512. Концентрация вируса, по данным электронной микроскопии, составила 10Э-Ю10 частиц/мл.

В результате проведенных экспериментов установлено, что приготовленный методом осаждения ПЭГ препарат BJ1 КРС при использовании в качестве антигена в ИФА давал высокий уровень фоновых реакций, поэтому в дальнейшем мы использовали метод высокоскоростного центрифугирования в 11-55% градиенте сахарозы. Полученный таким образом препарат вируса был пригоден для использования в качестве антигена в иммуноферментном анализе (С.П.Аминева, 1995). Вирус лейкоза, концентрированный ПЭГ, использовали для выделения вирусспецифической РНК.

2.2.2. Разработка метода ИФА с использованием синтетических пептидов для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого

скота

Для исследования возможности применения синтетических пептидов в качестве антигенов в ИФА с целью выявления антител к вирусу лейкоза у инфицированных животных были проведены эксперименты по выбору пептидных фрагментов и оптимизации условий проведения иммуноферментного анализа.

С учетом опубликованных ранее данных (D.Portetelle, 1989; I.Callebaut, 1993) и результатов теоретического анализа (В.М.Гуленкин, 1995) было синтезировано 8 пептидов из области гпикопротеида др51 ВЛ КРС (табл.1).

Иммуногенную активность пептидов исследовали на кроликах и морских свинках. Введение животным пептидов 77-90 и 255-268, конъюгированных с KLH, и 98-117 и 177-192, конъюгированных с OVA и BSA, индуцировало выработку антипептидных антител в титре от 7,0 до 9,0 log2, что подтверждено в ИФА реакцией полученных сывороток с соответствующими свободными пептидами.

Таблица 1

Аминокислотная последовательность синтезированных пептидов-фрагментов

др51ВЛ КРС

Пептид Последовательность аминокислот

77-90 СЕРВСРГУСАОКЯО

98-117 ЭС}А0С}СЗРУ\МНС}||_Р1.Н1-К

102-117 ОЗЗРУУЫНСЖРШ!.«

108-117 NHQIL.FL.HLK

177-192 Р0СА1С\Л/ЕРЭРР\Л;АРЕ

179-192 СА1С\Л/ЕРБРР\Л/АРЕ

183-192 \Л/ЕРЗРР\Л/АРЕ

255-268 I иЗТАЗЭАРРТРУНК

Проверка активности сывороток, полученных от животных, иммунизированных препаратами, приготовленными на основе синтетических пептидов, показала, что антипептидные сыворотки не реагировали с вирусным антигеном в РИД, а в ИФА активность антипептидных сывороток с ВЛ КРС была менее 5,0 1од2, что, возможно, обусловлено как гетерогенностью антител, полученных на различные конформационные структуры пептида, так и недоступностью пептидного участка нативной белковой молекулы (С.С.Рыбаков, 1992; О.Ро^еПе, 1989).

Антигенную активность пептидов изучали в непрямом варианте ИФА. С целью устранения высокого фона неспецифической активности, обусловленной макромолекулярным белком-носителем, в работе использовали свободные пептиды.

Изучение условий иммобилизации пептидов на полистироловых планшетах показало, что активность пептидов, сорбированных из карбонатного буферного раствора (рН 9,6), была, как правило, на 2-5 1од2 выше, чем при сорбции тех же пептидов из буферных растворов с другими значениями рН. В то же время при сорбционной иммобилизации пептидов не всегда результаты реакции оказывались воспроизводимыми, поэтому для повышения воспроизводимости результатов ИФА был разработан способ иммобилизации пептидов, включающий обработку полистирола поли-Ьлизином и последующим связывании с ним синтетических антигенов с помощью глутарового альдегида.

С помощью синтетических пептидов был испытан ряд сывороток КРС, предварительно протестированных в РИД. В качестве контрольного

использовали вирусный антиген, полученный из культуры клеток Р1.К, хронически инфицированной ВЛ КРС. Результаты исследования представлены в табл.2. Как видно из таблицы, результаты реакции иммунодиффузии коррелировали с результатами ИФА как с использованием вирусного, так и с использованием пептидного антигена. Коэффициент корреляции активности сывороток в РИД с активностью в ИФА с использованием вирусного антигена составил 0,871; коэффициент корреляции активности сывороток в РИД с активностью сывороток в ИФА с использованием синтетического антигена - 0,934; а коэффициент корреляции активности сывороток в ИФА с использованием вирусного и синтетического антигенов - 0,909. Титр антител в различных сыворотках, обнаруженный в реакциях с синтетическими пептидами, составлял от 5,0 до 11,0 1од2. При сравнительном исследовании активности пептидов - фрагментов др51 ВЛ КРС не выявлено статистически достоверных различий, активность одних и тех же сывороток, содержащих антитела к ВЛ КРС, в реакции с различными пептидными антигенами была приблизительно одинаковой и в среднем составляла 8,6 1од2.

Таблица 2

Результаты исследования сывороток крови КРС методами РИД и ИФА с вирусным и синтетическим антигенами

п = 3

Сыворотки №N2 Активность в РИД Активность в ИФА. 1од2

с вирусным антигеном с пептидом 108-117

9996 - 5,67+0,43 < 5,0

9990 - 6,33+0,47 <5,0

9972 - 5,0+0,00 < 5,0

3786 цельн. 7,67+0,42 7,0+0,00

6545 цельн. 7,67+0,42 6,3+0,40

2341 1:2 8,33+1,8 7,67+1,6

9898 цельн. 7,67+0,42 7,67+1,3

428 цельн. 8,33+1,8 6.3+1,3

8290 цельн. 7,0+0,00 7,67+0,98

336 1:2 9,67+0,41 8,3+1,80

9882 1:2 8,33+1,3 7.67+1,73

9627 1:2 8.33+1,8 7,0+0,00

7375 цельн. 7,0+1,33 5,67+0,70

4457 1:8 13,0+0,00 11.0+0,00

В результате проведенных исследований по использованию пептидов, имитирующих В-эпитопы гликопротеида др51 ВЛ КРС, нами показана принципиальная возможность обнаружения вирусспецифических антител в крови инфицированных лейкозом животных с помощью синтетических антигенов. В то же время на данном этапе исследований нам не удалось решить ряд проблем, связанных со специфичностью реакции. Обнаружено, что в некоторых случаях сыворотки КРС, инфицированного вирусом лейкоза, реагировали с неспецифическими антигенами (белками-носителями, синтетическими аналогами гормональных пептидов) с активностью, близкой к активности с пептидными антигенами ВЛ КРС. При исследовании большого количества сывороток с помощью синтетических антигенов, не конъюгированных с носителями, также показано, что около 10% сывороток КРС, положительно реагирующих в ИФА с синтетическими пептидами, не содержат антител к ВЛ КРС по результатам других тестов. Проблемы, связанные с получением в некоторых случаях ложноположительных результатов, не позволяют в настоящее время рекомендовать разработанную нами методику для широкого практического использования. В то же время, метод выявления антител к вирусу лейкоза КРС в сыворотках крови инфицированных животных с использованием синтетических пептидов в качестве антигенов является перспективным и может использоваться для обнаружения антител к ВЛ КРС в сыворотках крови животных в комплексе с другими методами.

2.2.3 .Разработка метода полимеразной цепной реакции для выявления провируса лейкоза крупного рогатого скота

Основной целью работы, изложенной в данном разделе, явилась разработка метода выявления генома ВЛ КРС в ДНК лимфоцитов крови инфицированных животных. Метод основан на обнаружении с помощью ПЦР специфических нуклеотидных последовательностей генов др51 и рХВь интегрированных в геном клетки хозяина.

Первый этап работы включал анализ опубликованных данных о первичной структуре генома различных вариантов ВЛ КРС: японского изолята (EMBL № К02120 [ N.Sagata, 1985]}; бельгийского изолята (EMBL № К0225 и М10987 [N.R.Rice, 1984; 1985]); австралийского изолята ВЛ КРС (D00647 [J.Coulston,

1990]), а также изолята, выделенного М.И.Ивановой с соавторами (EMBL № М38287 [1986]). С помощью программы ALIGN (версия 1.01, 1989, SES) было проведено выравнивание указанных выше последовательностей и определены консервативные участки как в области основной антигенной детерминанты белка др51, так и в pXBL области генома. С использованием программы Oligo были сконструированы олигонуклеотидные праймеры и осуществлен их химический синтез.

С целью оптимизации условий подготовки проб для проведения ПЦР было испытано несколько способов выделения ДНК из крови животных и из предварительно изолированных лимфоцитов: метод фенольной экстракции (Т.Маниатис, 1984), модифицированный вариант этого метода (С.Н.Радюк, 1996), метод с применением силикатных матриц (О.Г.Грибанов, 1996), а также коммерческие наборы Wizard Genomic DNA Purification Kit и Ready Amp Genomic DNA Purification System (Promega, США). Каждый из этих методов позволял получить высокомолекулярную ДНК, пригодную для амплификации в ПЦР, но, по нашим результатам, оптимальными являются два метода: разработанный во ВНИИЗЖ метод, основанный на применении силикатных матриц, (О.Г.Грибанов, 1996) и использование набора Ready Amp Genomic DNA Purification System. Процедура выделения ДНК по каждой из этих методик проста в исполнении и занимает около 50 минут. Надо отметить, что лимфоцитарную ДНК с одинаковой эффективностью выделяли как из предварительно изолированных лимфоцитов, так и из цельной крови, поэтому в дальнейшем, с целью упрощения процедуры подготовки проб для выделения ДНК, использовали цельную кровь. Также были проведены эксперименты по использованию в ПЦР образцов крови без предварительного выделения геномной ДНК, однако при этом не во всех образцах крови удавалось обнаружить провирусный фрагмент, что согласуется с данными K.Klintevall и соавторов (1994), которые отмечают, что использование в ПЦР выделенной ДНК повышает чувствительность и воспроизводимость реакции.

Условия проведения полимеразной цепной реакции (температуру отжига праймеров, время денатурации, отжига и синтеза, концентрацию праймеров и дезоксинуклеозидтрифосфатов, количество матрицы) подбирали в серии предварительных экспериментов. Оптимальный температурно-временной режим проведения ПЦР при амплификации фрагментов из области генов др51 и pXBL представлен в табл. 3. Для выявления фрагмента из области гена др51

использовали "nested" ПЦР: после 32 циклов амплификации с праймерами 1а и 1Ь отбирали аликвоту 2-3 мкл и проводили еще 32 цикла амплификации в том же режиме с праймерами 2а и 2Ь. Применение "nested" ПЦР увеличивало чувствительность и специфичность реакции при выявлении фрагмента из области гена др51, однако, в случае гена pXBL даже реамплификация с внутренними праймерами не всегда позволяла обнаруживать вирусспецифический фрагмент в тех образцах, где он был выявлен при помощи праймеров из области др51. Возможно, это связано с делециями в данной области генома, на что указывают некоторые авторы (J.L.Heeney, 1988; R.Johnson, 1991; K.KIintevall, 1995), поэтому в дальнейшем для обнаружения провируса ВЛ КРС использовали амплификацию фрагмента из области гена др51.

Таблица 3

Температурно-временной режим проведения ПЦР при амплификации фрагментов

из области генов др51 и pXBL.

Фрагмент генома Стадия реакции Температура Время Количество циклов

рХв1 Денатурация 94°С 30 с 25

Отжиг 64°С 30 с

Синтез 72°С 40 с

др51 Денатурация 94°С 45 с 32

Отжиг 55°С 1 мин.

Синтез 72°с 1 мин.

Денатурация 94°С 45 с 1

Отжиг 55°с 1 мин.

Синтез 72°с 10 мин.

При изучении возможности выявления вирусспецифической РНК вируса лейкоза в крови инфицированных животных фрагмент генома ВЛ КРС удавалось обнаружить в образцах крови только тех животных, у которых титр антител к вирусу лейкоза составил по результатам РИД 1:8 - 1:16. По-видимому, это связано с тем, что свободный вирус редко встречается в крови инфицированных животных (А.Вигпу, 1988; и.А.Со\л/1еу, 1992), и индикацию возбудителя более эффективно удается провести при выделении суммарной ДНК (5.Ве1ак, 1989; А.ВаПадьРогсЗапу, 1990; К.Ю^еуаН, 1994).

Для определения чувствительности разработанного нами метода выявления провируса лейкоза КРС в образцах крови животных готовили десятикратные разведения крови инфицированного животного кровью здорового животного, поддерживая таким образом балластное количество ДНК в каждом образце. После выделения ДНК каждая проба была исследована в ПЦР. Вирусспецифический фрагмент удавалось обнаружить в ДНК, выделенной приблизительно из 10 инфицированных клеток на фоне балластной ДНК из 40000 мононукпеарных клеток крови.

С целью подтверждения специфичности была определена первичная структура фрагментов, полученных путем амплификации клеточной ДНК из вируспродуцирующей культуры с внешними (1а и 1Ь) и внутренними (2а и 2Ь) праймерами (соответственно FLKi,0ia(«i и FLK„0ia(«2), а также фрагментов лимфоцитарной ДНК после проведения "nested" ПЦР (Isolate по 8). Сравнение нуклеотидной и предсказанной аминокислотной последовательностей секвенированных фрагментов размером около 260 пар нуклеотидов с опубликованными последовательностями показало, что секвенированный нами фрагмент, полученный из клеточной культуры FLK, имеет одну замену по сравнению с опубликованной последовательностью FLK-BLV. Это говорит о том, что в процессе культивирования клеток происходит изменение нуклеотидной последовательности провируса.

В то же время полевой изолят (Isolate по 8), вероятно, занимает промежуточное положение между представителями бельгийской и японской подгрупп (рис. 1). Из 7 нукпеотидных замен, отличающих эти две подгруппы на данном участке последовательности, по 3 позициям выделенный изолят близок к японской подгруппе, а по 4 заменам сходен с изолятами бельгийской подгруппы. Надо отметить, что изменение одного из нуклеотидов у изолятов бельгийской подгруппы связано с аминокислотной заменой (аргинин меняется на гистидин), приводящей к изменениям в эпитопе G, ответственном за образование вируснейтрализующих антител. Кроме того, в данном полевом изоляте выявлены три замены, одна из которых встречается также в последовательности FLKiS0iaie 1.2, а две другие являются специфическими и не обнаружены у других изолятов.

LB59 isolate Belgium isolate LB285 isolate FLK isolate 2 FLK isolate 1 FLK-BLV isolate

Australian isolate VdM isolate

Japan Isolate no8

Рис. 1. Дендрограмма, отражающая уровень гомологии различных штаммов ВЛ КРС, полученная сравнением нуклеотидных последовательностей участка гена

Таким образом, проведенные нами исследования по подбору праймеров, метода выделения ДНК, оптимизации условий постановки ПЦР позволили разработать метод, пригодный для обнаружения фрагмента генома ВЛ КРС в крови инфицированных животных. Определение первичной структуры амплифицированных фрагментов показало наличие последовательности, характерной для вируса лейкоза КРС.

2.2.4. Изучение возможности применения метода выявления провируса ВЛ КРС для диагностики лейкоза крупного рогатого

скота.

2.2.4.1. Выявление провируса ВЛ КРС у крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза.

Для тестирования разработанной нами методики были выбраны животные разных возрастных групп из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств Владимирской и Нижегородской областей. Так, в пробах крови 32 коров

др51 (5161-5421 н.).

4-11-летнего возраста из неблагополучного по лейкозу хозяйства, имеющих антитела к ВЛ КРС (титр в РИД от 1:2 до 1:16, титр в ИФА - от 7,0 до 13,0 и более log2), в ПЦР обнаруживали вирусспецифический фрагмент. Гематологическое исследование выявило у 12 животных изменения формулы крови, характерные для лейкоза.

При анализе 24 проб крови от племенного молодняка 12-14-месячного возраста из хозяйства, где все животные являются РИД-отрицательными в течение нескольких лет, ни у одного из телят не найден фрагмент, соответствующий участку генома ВЛ КРС. Все эти животные были негативны при исследовании в РИД и ИФА с использованием набора Bovine leukemia virus antibody (est kit (IDEXX).

Тот же комплекс методов был применен для изучения проб крови от 30 голов КРС черно-пестрой породы в возрасте 12-18 месяцев, случайным образом выбранных из различных хозяйств Нижегородской области. В 7 пробах обнаружен провирусный фрагмент, что также подтверждено результатами РИД и ИФА.

При исследовании еще одной группы КРС 15-месячного возраста черно-пестрой породы у 12 из 15 животных обнаружен провирусный фрагмент. Из этих 12 животных 9 позитивно реагировали в ИФА и только 4 животных были серопозитивны по результатам РИД, что позволяет говорить о более высокой чувствительности ПЦР и ИФА по сравнению с реакцией иммунодиффузии.

Таким образом, при исследовании образцов крови КРС из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств показано, что результаты, полученные с помощью ПЦР, согласуются с данными РИД и ИФА, а в некоторых случаях методом ПЦР удается выявить вирусспецифический фрагмент в пробах, в которых не обнаружено антител к ВЛ КРС. Суммарные результаты сравнительного исследования методами РИД и ПЦР, представленные в табл. 4, показывают, что все животные, у которых методом РИД обнаружены антитела к ВЛ КРС, положительно тестировались в ПЦР. В то же время не выявлено ни одного животного, имеющего положительную реакцию в РИД, у которого методом ПЦР не обнаруживали вирусспецифический фрагмент в лимфоцитарной ДНК. В целом около 16% РИД-отрицательного КРС несут в своем геноме провирусный фрагмент.

Таблица 4

Результаты выявления инфицированных ВЛ КРС животных методами ПЦР и РИД

Группа Возраст Характеристика Кол-во РИД ПЦР РИД*/

хозяйства проб + - + - ПЦР*

1. 3-11 лет коровы из неблагополучного по лейкозу хозяйства 32 32 0 32 0 32/32

2. 12-181 мес. молодняк, случайная выборка из хоз-в Нижегор. обл. 30 7 23 7 23 7/7

3. 15 мес. молодняк из неблагополучного по лейкозу хоз-ва Владимирск. обл. 15 4 11 12 3 4/12

4. 12-14 мес. бычки из племенного хоз-ва Владимирск. обл. 24 0 24 0 24 0/0

Всего по группам 43/51

Учитывая тот факт, что в нашу выборку намеренно были включены животные в возрасте 4-х лет и старше с гематологическим проявлением лейкоза, можно предположить, что при исследовании молодняка процент выявления среди РИД-отрицательных животных КРС, в лимфоцитах крови которого обнаруживается вирусспецифический фрагмент, будет выше, что позволяет рекомендовать метод ПЦР преимущественно для исследования животных данной возрастной группы, у которых может быть раннее инфицирование ВЛ КРС.

2.2.5. Изучение возможности использования полимеразной цепной реакции для раннего обнаружения инфекции у животных, экспериментально инфицированных вирусом лейкоза КРС

2.2.5.1. Использование метода ПЦР для выявления лейкозной инфекции у кроликов, экспериментально инфицированных ВЛ КРС

Одним из направлений изучения лейкоза крупного рогатого скота является экспериментальное воспроизведение инфекции у различных животных. Такой подход позволяет не только провести исследования по этиологии, патогенезу, эпизоотологии болезни, но и подобрать диагностические системы, способные выявить инфицированных животных на ранних стадиях инфицирования, что имеет большое значение в борьбе с данным заболеванием.

Несомненный интерес представляют исследования, связанные с применением в качестве модели для экспериментальной лейкозной инфекции лабораторных животных. В нашей работе мы провели экспериментальное заражение кроликов вирусом лейкоза с целью изучения возможности использования метода ПЦР для раннего обнаружения лейкозной инфекции.

Способ заражения и результаты исследования представлены в табл. 5. Три кролика (№ 8, 6, 9) пали соответственно на 8, 20 и 21 день по несвязанным с опытом причинам.

Провирусный фрагмент из области гена др51 ВЛ КРС в лимфоцитарной ДНК крови выявляли, начиная с 21 дня после заражения. Провирус отсутствовал в пробах крови кроликов № 10, 11, 12. В отличие от С.1Ч.\Л/уаи с соавторами (1989), которые отмечают, что специфическую последовательность ДНК провируса лейкоза КРС им удавалось обнаруживать лишь у одного из двух инфицированных кроликов спустя 12 месяцев после заражения, в наших экспериментах вирусспецифическая последовательность была найдена в лимфоцитарной ДНК всех зараженных вирусом лейкоза животных.

Таблица 5

Результаты исследования методами РИД и ПЦР образцов крови кроликов, экспериментально инфицированных ВЛ КРС

Группа № Материал для заражения ПЦР+ РИД+

(с какого дня) (с какого дня)

1 Кровь КРС 28 35

1 2 от гематологически 63 -

3 больного животного 28 42

4 (1,5х107 клеток, внутривенно) 21 35

5 ' Культура клеток 21 21

II 6 Я1К,хронически пал пал

7 инфицированная ВЛ КРС 21 21

8 (2x107 клеток, внутривенно) пал пал

III 9 Культура клеток мышиной пал пал

миеломы

10 (2,1х107 клеток, внутривенно) - -

IV 11 Контроль - -

12 (интактные) -

Антитела в РИД к вирусу лейкоза в сыворотках крови кроликов выявляли с 21 дня, что в целом согласуется с данными, полученными другими исследователями (В.С.Стасенко, 1982; Е.Н.Касьян, 1994). Как видно из представленных нами результатов, антитела к ВЛ КРС в случае введения культуры клеток Р1.К появлялись на 2-3 недели раньше, чем при инокуляции крови КРС, больного лейкозом. Кроме того, у животных, материалом для заражения которых служила культура клеток Р1К, одновременно выявляли провирус и антитела к ВЛ КРС. Вероятно, это объясняется тем, что в данном случае и для заражения животных, и в качестве антигена в РИД была взята клеточная культура Р1_К (Л.Г.Бурба, 1996), поэтому антитела у животных II группы, выявляемые в РИД на 21-й день после инфицирования, могут являться результатом иммунного ответа на введение клеток Р!_К.

В сыворотках крови кроликов N2 10, 11, 12 не выявляли антител к ВЛ КРС. У кролика № 2 до конца эксперимента (170 дней) также не обнаружено антител к

вирусу. Можно предположить, что в последнем случае антитела вырабатывались в титрах, которые не улавливали в РИД. У животного № 1 антитела в сыворотке крови выявляли, начиная с 35-го дня после заражения, а на 42 и 84 день регистрировали снижение количества антител до уровня, не определяемого в РИД. В то же время в лимфоцитах крови этого животного методом ПЦР обнаруживали вирусспецифический фрагмент. Такое же явление отмечается и другими авторами при экспериментальном воспроизведении лейкоза КРС (Н.В.Замараева, 1997; Е.Н.Касьян, 1996; C.R.Wyatt, 1989), что, вероятно, связано как с особенностью инфекционного процесса при лейкозе, так и с чувствительностью используемого серологического метода.

Через 170 дней после заражения кролики были убиты. При патолого-анатомическом исследовании у них отмечали увеличение подчелюстных лимфатических узлов, у отдельных животных - очаговые поражения печени, патогистологическое исследование выявило у животного № 3 лимфолейкоз.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов воспроизведена лейкозная инфекция на кроликах, что подтверждено персистентным образованием антител к гликопротеиду др51 ВЛ КРС в организме животных, выявляемых в РИД, и присутствием специфической провирусной последовательности в лимфоцитарной ДНК кроликов, обнаруживаемой в ПЦР, а также данными патогистологических исследований. Показано, что при экспериментальном заражении кроликов провирус ВЛ КРС в лимфоцитах крови кроликов может быть выявлен на 1-2 недели раньше, чем антитела в сыворотках крови животных. Полученные данные позволяют рекомендовать кроликов в качестве удобной и экономичной модели для воспроизведения лейкоза КРС с целью изучения особенностей инфекционного процесса при данном заболевании, а также для испытания диагностических тестов.

2.2.5.2. Использование метода ПЦР для выявления лейкозной инфекции у овец, экспериментально инфицированных ВЛ КРС

Логическим продолжением нашей работы по экспериментальному воспроизведению лейкозной инфекции на гетерологичных животных стали опыты по заражению ВЛ КРС овец. В проведенных экспериментах мы изучали

возможность практического применения разработанной методики выявления ВЛ КРС с помощью ПЦР для обнаружения провируса ВЛ КРС у экспериментально инфицированных овец на ранних стадиях заболевания.

В табл. 6 показан способ заражения животных и результаты исследования методами РИД и ПЦР образцов крови овец, экспериментально инфицированных ВЛ КРС.

Таблица 6

Результаты исследования методами РИД и ПЦР образцов крови овец, экспериментально инфицированных ВЛ КРС

I

№ Материал для Способ ПЦР+ РИД+

заражения заражения (с какого дня) (с какого дня)

1 Контроль - -

2 Кровь КРС 10 30

3 от 2,5х107 7 29

гематологически клеток,

4 внутривенно 6 14

5 больного 6 15

6 животного 2,5x10' клеток. 7 42

в тестикулы

Провирусный фрагмент из области гена др51 в лимфоцитах крови животных выявляли на 6-10-й день после инфицирования, что согласуется с результатами, полученными R.B.Brandon с соавторами (1991), которые выявляли вирусспецифическую последовательность в ДНК лимфоцитов овец через 1-3 недели после заражения.

Антитела к ВЛ КРС у инфицированных овец в РИД обнаруживали через 8-9 дней после обнаружения провируса или позже - через 20-26 дней, что также согласуется с данными литературы (M.Mammerickx, 1981; R.B.Brandon, 1991; А.Ф.Валихов, 1996). Кроме того, сыворотки крови овец были исследованы методом ИФА с помощью набора Chekit leucotest. График, отражающий уровень антител к ВЛ КРС у овец в течение всего эксперимента, представлен на рис. 2.

Рис. 2. Динамика накопления антител к ВЛ КРС у овец, экспериментально инфицированных вирусом лейкоза КРС, по результатам ИФА (СЬекК 1еисо(ез(). По оси абсцисс - дни после заражения, по оси ординат - выраженное в процентах отношение разности оптической плотности в лунке с исследуемым образцом и оптической плотности в лунке с отрицательным контролем к разности оптических плотностей в лунках с положительным и отрицательным контролями. А, В -уровни, соответствующие 50% (верхняя граница "серой зоны") и 30% (нижняя граница "серой зоны").

Сходный уровень антител, регистрируемый в ИФА, наблюдался у животных N2 2, 4 и 5 в течение 2-х недель после заражения, после чего титр антител у животного № 4 нарастал, а у животного № 2 этот процесс происходил менее интенсивно. У овцы № 5 титр антител резко снизился и оставался на постоянном уровне до конца эксперимента. У овцы № 3 с 7 до 28 дня после введения вируссодержащего материала титр антител, определяемый в РИД, равномерно увеличивался, после чего в течение 5-6 недель происходило колебание уровня антител в небольших пределах, а затем до конца эксперимента незначительное его увеличение. Скачкообразное изменение уровня антител в течение 6 недель после инокуляции обнаруживали при исследовании сывороток крови у барана №6, после чего также шло незначительное равномерное нарастание. Титр антител в сыворотке крови контрольного животного (№1), содержавшегося совместно с инфицированными, находился практически на нулевом уровне на протяжении всего опыта.

В целом, у всех инфицированных вирусом лейкоза животных продемонстрировано постоянное наличие антител к ВЛ КРС, выявляемое методами РИД и ИФА, с 2-7 недель после инокуляции и на протяжении всего эксперимента, что является одним из признаков, по которому определяется наличие лейкозной инфекции у КРС (С.Я.УУ/уаИ, 1989). Показано также, что время сероконверсии, а также динамика образования антител отличались у разных овец, что, вероятно, зависит от индивидуального иммунологического статуса каждого животного.

Проведенное гематологическое исследование показало увеличение числа лейкоцитов после(заражения у животных № 1, 3, 5 и 6, однако эти показатели не превышали нормальных величин для данного вида животных.

Спустя 5 месяцев после заражения все животные были убиты. Патологоанатомическое и гистологическое исследование не выявило изменений в тканях, характерных для лейкоза. Это согласуется с данными других исследователей, которые отмечают, что опухолевое проявление болезни не обнаруживается у овец, находящихся в эксперименте менее 200 дней (М.ОгипсИэоеск, 1991).

У животных № 3, 4, 5 были обнаружены плоды 2-3-месячного возраста. Образцы крови плодов исследовали на наличие антител к ВЛ КРС и провирусного фрагмента. Все пробы были отрицательны в РИД, вирусспецифический фрагмент присутствовал у всех трех плодов животного № 4 и у одного из двух плодов животного № 3. Оба плода овцы № 5 и один из двух плодов овцы № 3 не имели провируса в геномной ДНК. Можно отметить наличие соответствия между инфицированием плодов и титром антител в ИФА и РИД у матерей (максимальный титр обнаружен у животного № 4, минимальный - у животного № 5). Полученные данные подтверждают возможность внутриутробной передачи ВЛ КРС.

В результате экспериментального заражения ВЛ КРС путем выявления вирусспецифической последовательности в лейкоцитах крови животных и антител к ВЛ КРС показано наличие персистентной инфекции у овец. Установлено, что при внутривенном введении, а также при введении в тестикулы материала от больной лимфолейкозом коровы, провирус в лимфоцитарной ДНК овец обнаруживали на 2-7 недель раньше, чем антитела к этому вирусу.

Таким образом, получены положительные результаты по экспериментальному заражению вирусом лейкоза КРС модельных животных -кроликов и овец. Наличие лейкозной инфекции у данных животных подтверждено результатами серологических и молекулярно-биологических исследований Показано, что у экспериментально инфицированных овец и кроликов при внутривенном введении материала, содержащего ВЛ КРС, провирус в лимфоцитарной ДНК выявляли на 1-8 недель раньше, чем антитела к этому вирусу. Все это позволяет рекомендовать метод выявления провируса лейкоза КРС с помощью полимеразной цепной реакции для ранней диагностики лейкоза КРС, а также в качестве дополнительного теста, который может применяться наряду с иммунологическими методами.

3. ВЫВОДЫ

1. Разработан метод концентрирования и очистки ВЛ КРС, включающий двукратное высокоскоростное центрифугирование в градиентах плотности сахарозы, который позволяет получать препарат, пригодный для использования в качестве антигена в реакции иммуноферментного анализа.

2. Оптимизирован способ иммобилизации антигена и условия проведения ИФА с синтетическими пептидами. Предложена методика выявления антител к вирусу лейкоза в сыворотке крови крупного рогатого скота с использованием синтетических пептидов-фрагментов гликопротеида др51 ВЛ КРС.

3. Сконструированы праймеры к консервативным участкам генов др51 и pXBL ВЛ КРС для использования при обнаружении методом ПЦР провирусного фрагмента в лимфоцитарной ДНК животных, инфицированных вирусом лейкоза КРС.

4. Разработана методика выявления вируса лейкоза КРС в крови инфицированных животных с помощью ПЦР на основе амплификации фрагмента гена др51, отличающаяся высокой чувствительностью и позволяющая обнаруживать провирус ВЛ КРС в ДНК, выделенной из 10 лимфоцитарных клеток крови.

5. Определена первичная структура амплифицированных фрагментов из области др51 ВЛ КРС штамма FLK-BLV и полевого изолята, выделенного на территории Владимирской области. Установлено, что штамм FLK-BLV на данном участке

последовательности имеет одну нукпеотидную замену по сравнению с опубликованной структурой. Сравнение первичной структуры полевого изолята с последовательностями штаммов японской и бельгийской подгрупп ВЛ КРС показало, что данный изолят занимает промежуточное положение между этими двумя подгруппами. Кроме того, выявлены две нукпеотидные замены, специфичные для данного изолята.

6. При исследовании с помощью метода ПЦР образцов крови КРС различных возрастных групп из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств показано, что у всех животных, имеющих антитела к ВЛ КРС, в лимфоцитарной ДНК обнаружен, вирусспецифический фрагмент. Установлено, что около 16% молодняка КРС 12-18-месячного возраста, имеющего отрицательную реакцию в РИД, содержат в геномной ДНК провирус ВЛ КРС.

7. Установлено, что провирусная ДНК в лимфоцитах крови кроликов и овец, экспериментально инфицированных ВЛ КРС, с помощью метода ПЦР выявляется на 1-8 недель раньше, чем антитела в сыворотке крови этих животных, определяемые методами РИД и ИФА, что имеет важное значение для ранней диагностики данного заболевания.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В результате выполнения научных исследований разработаны методики, которые успешно применялись для анализа проб крови животных из хозяйств Нижегородской и Владимирской областей:

- "Методика выявления в ИФА антител к вирусу лейкоза в сыворотке крови крупного рогатого скота с использованием синтетических пептидов" (утверждена директором ВНИИЗЖ 8 октября 1995 г.);

- "Методика выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции" (утверждена директором ВНИИЗЖ 16 апреля 1997 г.).

2. Разработанный метод выявления ВЛ КРС с помощью полимеразной цепной реакции включен в "Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота" (проект), одобренные Ученым советом ВИЭВ (протокол № 7 от 25 августа 1997 г.) и представленные на утверждение в Департамент ветеринарии Минсельхозпрода России.