Разработка методов диагностики инфекции, вызываемой Mycoplasma hyopneumoniae

Бирюченкова, Марина Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методов диагностики инфекции, вызываемой Mycoplasma hyopneumoniae
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов диагностики инфекции, вызываемой Mycoplasma hyopneumoniae"

На правах рукописи

БИРЮЧЕНКОВА Марина Вячеславовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE

03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров-2011

1 7 [.]>.? 2011

4840682

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»),

Научный руководитель

доктор ветеринарных наук, профессор

(ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир) Русалеев Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

(ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров) Селянинов Юрий Олегович

Кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

(ФГУ«ВНИИЗЖ», г.Владимир) Волкова Марина Алексеевна

Ведущая организация - Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности», г. Щелково

Защита диссертации состоится «25» марта 2011 года в 11— часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская обл., г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел./факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан иЛ/ 011 года

Ученый секретарь диссертационного совета, ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии, кандидат биологических наук ' Е.А. Балашова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Mycoplasma hyopneumoniae является этиологическим агентом энзоотической пневмонии (ЭП) свиней. Ей также принадлежит важная роль в развитии респираторного симптомокомплекса свиней (РСКС) - многокомпонентного заболевания, являющегося одной из наиболее актуальных проблем современного свиноводства [12,25].

В качестве инфекционного агента, вызывающего ЭП свиней, М. hyopneumoniae была определена Goodwin et al., Маге и Switzer в 1965 году [1, 11]. Заболевание распространено во всем мире [16]. Экономический ущерб от энзоотической пневмонии свиней составляет в странах с развитым свиноводством до одного миллиарда долларов в год [8, 20]. В некоторых странах проведенные исследования выявили поражения, типичные для хронической формы заболевания, у 80% поросят группы откорма [26].

Коинфицирование свиней микоплазмами и другими патогенами (прежде всего такими, как вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней, цирковирус свиней второго типа, вирус гриппа свиней, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis) отягощает проявление основных симптомов пневмонии и приводит к формированию респираторного симптомокомплекса свиней. РСКС наносит значительный экономический ущерб свиноводству во всем мире. В различных хозяйствах заболеваемость поросят может достигать 30-70%, а летальность - 15% в зависимости от количества ассоциированных инфекционных агентов [13].

эпизоотологических данных, клинических признаках болезни, результатах патологоанатомического вскрытия и лабораторных исследований.

1.2. Степень разработанности проблемы. На настоящий момент иностранными авторами разработано несколько тест-систем, основанных на иммунофлюоресцентных, иммуногистохимических методах [14, 18, 22] и на различных модификациях ПЦР, позволяющих выявлять М. Иуорпеитотае в носовых, трахеобронхиальных смывах, а также в легочной ткани [7, 9, 10, 24, 27]. Также за рубежом осуществляют серодиагностику микоплазменной инфекции с использованием реакций агглютинации, связывания комплемента и ИФА в различных вариантах [15,17,19,21].

В России до текущего времени не было разработано надёжных и достоверных диагностических методов по обнаружению М. Иуорпеитотае. Слабоизученным оставался широкий круг проблем, связанных с этим видом микоплазм: масштабы распространения М. куорпеитотае в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ, ее роль в развитии РСКС в российских свиноводческих хозяйствах, филогенетичекие особенности отечественных изолятов бактерии.

1.3. Цели и задачи исследования.

Цель данной работы состояла в разработке методов обнаружения М. Ьуорпеитотае и антител к ней, а также в применении разработанных методов для изучения распространения этого вида микоплазм на территории РФ и его роли в респираторных болезнях свиней в российских хозяйствах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать методы обнаружения ДНК М. Ьуорпеитотае, основанные на ПЦР;

- применить разработанные методы в диагностических исследованиях;

- провести филогенетический анализ полевых изолятов М. куорпеитотае;

получить рекомбинантный видоспецифичный белок М. куорпеитотае и разработать на его основе непрямой вариант иммуноферментного анализа (н-ИФА) для выявления антител к данному инфекционному агенту в сыворотках крови свиней;

- провести с использованием разработанного иммуноферментного метода серомониторинг микоплазменной инфекции и определить статус российских свиноводческих хозяйств.

- изучить распространение М куорпеитотае в дикой фауне РФ.

1.4. Научная новизна исследований. Впервые в РФ разработан метод обнаружения ДНК М. куорпеитотае, основанный на ПЦР с электрофоретической детекцией.

Впервые в России разработан метод количественного обнаружения ДНК М. куорпеитотае, основанный на ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

Проведен филогенетический анализ полевых изолятов М. куорпеитотае.

Впервые в РФ получен рекомбинантный видоспецифичный белок р65 М. куорпеитотае, и на его основе разработан непрямой вариант иммуноферментного анализа для выявления антител к М. куорпеитотае.

Проведён мониторинг микоплазменной инфекции свиней, показано широкое распространение М. куорпеитотае в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ.

С использованием непрямого варианта ИФА определен серологический статус более 5 тысяч племенных свиней, ввезенных в

Россию в 2005-2009 гг из Канады и европейских стран, в отношении микоплазменной инфекции.

1.5. Практическая значимость исследований. В результате проведённых исследований утверждены следующие нормативные документы:

«Методика обнаружения антител к Mycoplasma hyopneumoniae в непрямом варианте иммуноферментного анализа», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 08.02.2006 г.;

«Методика обнаружения Mycoplasma hyopneumoniae с использованием полимеразной цепной реакции», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 20.03.2006 г.;

«Методические указания по выявлению и количественному анализу Mycoplasma hyopneumoniae методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 10.03.2010 г.

Разработанные методики и методические указания используются при проведении диагностических и мониторинговых исследований для выявления М. hyopneumoniae и антител к ней.

1.6. Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе три работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.7. Апробация работы. Материалы диссертации представлены, опубликованы и обсуждены на научно-практической конференции "Ветеринарное обеспечение свиноводства: современное состояние и пути развития" (Харьков, 2005 г.), в материалах международной научно-практической конференции "Современные проблемы ветеринарной медицины в свиноводстве" (Киев, 2006 г.), на XV московском международном ветеринарном конгрессе по болезням мелких домашних

животных "Проблемы инфекционной патологии свиней" (Москва, 2007 г.), а также на заседаниях учёного совета ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" в период 2005-2009 гг.

1.8. Личный вклад:

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники лаборатории диагностики особо опасных инфекций: к.б.н. А. С. Яковлева, к.в.н. А. В. Каньшина, к.в.н. А. М. Тимина, заведующий лабораторией, к.б.н. А. В. Щербаков.

1.9. Основные положения, выносимые на защиту:

Метод обнаружения ДНК M. hyopneumoniae, основанный на ПЦР с электрофоретической детекцией.

Метод количественного обнаружения ДНК M. hyopneumoniae, основанный на ПЦР в реальном времени.

Филогенетический анализ полевых изолятов M. hyopneumoniae.

Рекомбинантный видоспецифичный белок M hyopneumoniae и разработанный на его основе непрямой вариант ИФА для выявления антител к микоплазме.

Результаты использования разработанных методов при проведении диагностических и мониторинговых исследований микоплазменной инфекции.

1.10. Структура и объём работы. Диссертация изложена на 134 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение и выводы. Список используемой литературы включает 215 источников, из которых 185 иностранных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 17 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы

2.1.1. Патологический материал. В работе использовали органы и ткани от свиней и диких кабанов из свиноводческих и охотничьих хозяйств РФ.

2.1.2. Штаммы микроорганизмов. В работе использовали эталонный штамм J № 27715 М. hyopneumortiae, полученный из Американской коллекции типовых культур (США).

Для проверки специфичности разработанных методов использовали следующие штаммы и изоляты бактерий: Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma flocculare, Mycoplasma arginini, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma gallisepticum, Acholeplasma laidlawii, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae.

2.1.3. Сыворотки. Использовали сыворотки от домашних свиней и диких кабанов из свиноводческих и охотничьих хозяйств различных регионов России.

2.1.4. Бактериальные штаммы для рекомбинантных плазмид.

Для трансформации и экспрессии рекомбинантных плазмид использовался штамм М15 E.coli: [pREP4] E.coli К12 (паГ, str5, rif, lac", ara", gal", mtl", F'\ recA+, uvr+, lon+) pREP4 - kanr. Источник штамма - фирма «Qiagen».

2.1.5. Плазмиды. Для получения экспрессирующей конструкции была использована плазмида pQE (фирма «Qiagen»).

2.1.6. ПероксидазнЫй конъюгат. Использовали коммерческий препарат антител против иммуноглобулина IgG свиньи, меченных пероксидазой хрена (Sigma, США).

2.2. Методы

2.2.1. Выделение нуклеиновых кислот. Выделение суммарной нуклеиновой кислоты из патологического материала проводили по модифицированному методу О.Г. Грибанова с соавторами [3].

2.2.2. Расчёт и синтез праймеров. Расчёт праймеров выполняли на основе нуклеотидных последовательностей штаммов М. hyopneumoniae, представленных в базе данных GeneBank. Синтез праймеров осуществляла научно-производственная компания «Синтол» (Москва).

2.2.3. ПЦР проводили в реакционной смеси следующего состава: 2,5 мкл 10х буфера для Taq-ДНК-полимеразы, 3 мМ Mg2+, 0,2 мМ dNTPs, 1,0 ед. Taq-ДНК-полимеразы, по 5 пмоль праймеров, 3 мкл раствора бактериальной ДНК и вода до конечного объема 25 мкл. Амплификацию проводили на ДНК-амплификаторе «Mastercycler gradient» (Германия) при следующем температурном режиме: 3 минуты предварительной денатурации при 94°С, 35 циклов амплификации (30 секунд денатурации при 94°С, 30 секунд отжига праймеров при 55°С, 40 секунд элонгации при 72°С) и 2 минуты заключительной элонгации. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем 0,001% бромистого этидия, при силе тока 50 мА.

2.2.4. ПЦР-РВ проводили в реакционной смеси следующего состава: 3 мкл 10х буфера для Taq-ДНК-полимеразы, 3 мМ Mg2+, 0,2 мМ dNTPs, 1,0 ед. Taq-ДНК-полимеразы, по 10 пмоль праймеров, 7 пмоль зонда, 3 мкл раствора ДНК и вода до конечного объема 30 мкл. Компоненты вносили в 96-луночные оптические планшеты («MJ Research») и проводили ПЦР на амплификаторе «CFX96» («BioRaD») при следующем температурном режиме: 3 мин предварительной денатурации при 95°С и 40-50 циклов реакции (денатурация при 95°С 15 сек, отжиг и элонгация при 60°С 50 сек). Регистрацию сигнала флюоресценции

осуществляла система «Bio-Rad CFX Manager» для мультиканальной детекции ПЦР-продуктов в режиме реального времени («BioRaD»).

2.2.5. Нуклеотидное секвенирование осуществлялось на автоматическом секвенаторе «ABl Prism 3100» (Applied Biosystems, США).

2.2.6. Молекулярное клонирование продуктов ПЦР. Продукты ПЦР очищали от компонентов реакционной смеси по методике, аналогичной выделению нуклеиновых кислот. Реакции рестрикции и лигирования проводили в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей ферментов. Трансформацию и приготовление компетентных клеток Е. coli проводили по методике Д. Ханаана [6]. Е. coli культивировали в среде LB и на LB-arape при 37 С. Скрининг клонов проводили методом ПЦР. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli осуществляли в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва).

2.2.7. Экспрессия рекомбинантных белков. Экспрессию рекомбинантных белков проводили добавлением индуктора (ИПТГ) в 3-хчасовую культуру клеток, достигшую логарифмической фазы роста.

2.2.8. Очистка рекомбинантных белков. Очистку рекомбинантных белков проводили с помощью металл-хелатной хроматографии. Осадок клеток E.coli обрабатывали лизирующим буфером, затем центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. К надосадку добавляли Ni-NTA agarose («Qiagen») и инкубировали при помешивании 15 мин. Сорбент дважды промывали лизирующим буфером. Белки переводили в раствор с помощью элюирующего буфера. Уровень экспрессии и степень очистки препарата белка оценивали с помощью электрофореза в ПААГе. Концентрацию белков определяли по методу Бредфорд [5].

2.2.9. Непрямой вариант ИФА. Тестирование сывороток в ИФА методом последовательных разведений и методом одного разведения проводили по общепринятой методике с некоторыми модификациями.

При использовании коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» фирмы IDEXX (США) постановку ИФА и интерпретацию результатов проводили в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

2.2.10. Статистическая обработка результатов. Определение среднего арифметического ( X ) при количестве опытов (п), среднего квадратичного отклонения (о) средней арифметической проводили согласно руководству И.В.Полякова [4].

Для обработки данных ИФА использовали компьютерную программу Power Basic, которая регрессионным анализом (приближение функций по методу наименьших квадратов) позволяла рассчитывать значения параметров уравнения А, В, значение коэффициента корреляции R, стандартную ошибку и построить линию регрессии.

При определении согласованности разработанной

иммуноферментной тест-системы и коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» фирмы IDEXX (США) использовали метод капа-статистики [2,23].

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Разработка ПЦР для выявления ДНК Mycoplasma hyopneumoniae

В качестве мишени для ПЦР был выбран ген, кодирующий мембранный белок р46. Данный ген и кодируемый им белок являются видоспецифичными для М. hyopneumoniae и не встречаются у других видов микоплазм. В пределах вида М. hyopneumoniae этот ген отличается достаточно высокой консервативностью.

Для расчета праймеров был проведен сравнительный анализ имеющихся в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей гена р46 различных штаммов М. hyopneumoniae. На основе результатов

сравнительного анализа была рассчитана пара праймеров МЬр1 и МЬр2, комплементарных высококонсервативным участкам гена. Праймеры фланкируют участок размером 510 п.н.

1 2 3 4 5 6 7

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

510 п.н.

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК различных видов бактерий в ПЦР с праймерами Mhpl и Mhp2

Примечание: 1 - маркер (снизу вверх: 100, 200, 300, 400, 500, 600 п.н. и т.д.);

2-М. hyopneumoniae;

3-17 - М. hyorhinis, М. hyosynoviae, M.flocculare, М. arginini, М. bovis, М. bovirhinis, М. ovipneumoniae, М. salivarium,

М. arthritidis, М. fermentans, М. gallisepticum, Acholeplasma laidlawii, Pasteurella multocida, Haemophilusparasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae; 18 - отрицательный контроль

Для проверки аналитической специфичности метода

использовали материалы, содержащие различные бактериальные патогены, в том числе микоплазмы: Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma flocculare, Mycoplasma arginini, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma gallisepticum, Acholeplasma laidlawii, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae.

Синтез специфического фрагмента ДНК наблюдался только в пробе, содержащей Mycoplasma hyopneumoniae (рис.1).

Таким образом, сконструированные нами праймеры обладали видовой специфичностью и исключали перекрестные реакции с гетерологичными видами микоплазм и другими бактериями.

Аналитическую чувствительность метода определяли с помощью ДНК-стандартов с известной концентрацией. Для получения стандартов ген р46 М. Иуорпеитомае был клонирован в составе плазмидного вектора в Е. сой. Из культуры рекомбинантного клона кишечной палочки выделили плазмиду и секвенированием подтвердили корректность клонированной последовательности гена р46.

Концентрацию очищенного препарата рекомбинантной плазмиды измеряли спектрофотометрически и определяли число молекул плазмиды в 1 мл (N1) по формуле:

N = концентрация плазмиды (г/мкл) * число Авогадро (молекул/моль), молярная масса плазмиды (г/моль)

Поскольку молярная масса 1 п.н. составляет 660 г/моль, то молярная масса плазмиды равна 660 х 6200 п.н. = 4092000 г/моль. Следовательно, концентрация плазмиды в препарате составляла:

N = 1.186 х 10~6 (г/мл) х 6 х 1023 (молекул/моль) = 1,74 х 10" молекул/мл 4092000 (г/моль)

Из исходного препарата плазмиды приготовили серию 10-кратных разведений, содержащих от 1,74 * 10й до 1,74 х 10° копий/мл. Со всеми разведениями была проведена ПЦР, результаты реакции показаны на рисунке 2.

Предельное разведение, в котором обнаружили амплифицируемый фрагмент, составило 1,74 х Ю4 копий плазмиды/мл (17,4 копий плазмиды/мкл). Учитывая, что в реакцию брали по 3 мкл раствора разведенной плазмиды, ПЦР была способна выявлять 17,4 х 3 = 52,2 копии ДНК на реакцию.

gjHj,

щцщ MW ми «мм» --500 п.н.

<--250 п.н.

. «^■■НННИЯПк. ■■

-К 10" 10' 10' 105 10J 103 Ю2 10' ДНК-маркер геномных эквивалентов/мл

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации в ПЦР 10-кратных разведений плазмидных стандартов М. hyopneumoniae

Поскольку ген р46 представлен в геноме М. hyopneumoniae единственной копией, то плазмида, содержащая ген р46, может рассматриваться как эквивалент генома М. hyopneumoniae. Следовательно, аналитическая чувствительность метода составляла 52 геномных эквивалента М. hyopneumoniae на реакцию.

Таким образом, разработанный метод отличался высокой аналитической чувствительностью.

По результатам комиссионных испытаний предложенная «Методика обнаружения Mycoplasma hyopneumoniae с использованием полимеразной цепной реакции» была одобрена Учёным советом и утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 20.03.2006 г.

3.2. Применение ПЦР в диагностических исследованиях

С целью выяснения этиологической роли М. hyopneumoniae в респираторной патологии свиней в свиноводческих хозяйствах РФ с использованием разработанного метода было исследовано более 850 проб патологического материала. Пробы были получены в период 2005-2009гг от свиней с поражениями респираторного тракта из 195 хозяйств 43 регионов РФ.

Поводом для исследований служили любые нарушения со стороны респираторной системы у свиней разного возраста. Для анализа отбирали образцы ткани, имеющие характерные макроскопические изменения: серозно-катаральные очаги воспаления в верхушечных и средних долях

легких, отек паренхимы легких, бронхи с признаками воспаления, увеличенные регионарные лимфоузлы.

Параллельно пробы патологического материала исследовали на наличие М. ИуогЫтв, при этом использовали ранее разработанный в ФГУ «ВНИИЗЖ» метод обнаружения этого вида микоплазм с помощью ПЦР.

10%

52%

12%

- отрицательно

- Mycoplasma hyopneumoniae

26%

- Mycoplasma hyorhinis

- Mycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyorhinis

Рис. 3. Видовое соотношение патогенных микоплазм у свиней с респираторным синдромом

В результате проведенных исследований у поросят с респираторными заболеваниями микоплазмы были обнаружены в 48% случаев. При этом М. куорпеитотае была выявлена в 22% проб, а М. ИуогЫтз - в 38%. В 12% исследованных образцов патологического материала оба этих вида были выявлены одновременно (рис. 3).

При обследовании животных различных возрастных групп - от новорожденных поросят до свиноматок - была выявлена зависимость частоты обнаружения М. куорпеитотае в патматериале от возраста животных (рис. 4).

Наиболее часто М. Иуорпеитотае обнаруживалась у поросят в послеотьемный период (возраст 2-4 месяца) и в период откорма (возраст 46 месяцев): 26,6% и 24,2%, соответственно. У больных животных в возрасте старше 6 месяцев М. Иуорпеитотае была выявлена в 16,3%

случаев. Частота выявления М. куорпеитотае у поросят-сосунов с респираторной патологией была значительно меньше - 5,2% случаев.

? 30

2 25

5 20 н

I 15

о 10 с

5 5 я

Рис. 4. Частота выявления М. Иуорпеитотае в патологическом материале от животных различных возрастных групп

Наши исследования подтвердили, что респираторные заболевания, ассоциированные с М. куорпеитотае, присущи, главным образом, поросятам послеотъёмного периода и периода откорма; кроме того, довольно высокий процент инфицированных М. куорпеитотае животных приходится на возраст старше 6 месяцев.

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что во многих российских хозяйствах респираторные болезни свиней ассоциированы с микоплазмами, причем частота выявления М куорпеитотае зависит от возраста животных.

3.3. Разработка ПЦР в реальном времени для количественного обнаружения ДНК М. Иуорпеитотае По сравнению с классическим форматом реакции ПЦР в режиме реального времени имеет ряд преимуществ, одним из которых является возможность проводить количественный анализ ДНК микоплазмы, используя стандарты и определяя число копий мишени в стартовом материале.

Для индикации ДНК М куорпеитотае методом ПЦР-РВ рассчитали олигонуклеотидные праймеры и гибридизационный зонд TaqMan для

¿в

"II'

;

! 1-• \ ;:■...

0-2 мес 2-4 мес 4-6 мес >6 мес

видоспецифичного гена р46. Праймеры ограничивали фрагмент гена длиной 114 п.н., а зонд являлся комплементарным высококонсервативному участку этого фрагмента. При синтезе зонда в качестве флюорофора использовали R6G на 5-конце, а в качестве гасителя флюоресценции -BHQ-1 на З'-конце.

Данные флюоресценции анализировали при помощи программного обеспечения «Bio-Rad CFX Manager» и Microsoft Excel. При оптимальных условиях специфический сигнал детектировали на 16±1 цикле реакции.

Аналитическую специфичность ПЦР-РВ оценивали по результатам реакции с ДНК 11 видов микоплазм и одного вида ахолеплазм, а также ДНК, выделенной из легких здоровых свиней. Положительный результат получили только с ДНК М. hyopneumoniae. При тестировании ДНК других видов микоплазм, A. laidlawii и легочной ткани здоровых свиней неспецифических продуктов реакции не наблюдали.

Относительную чувствительность ПЦР-РВ проверяли в сравнении с классической ПЦР. Для этого в ПЦР-РВ исследовали 20 проб легких свиней с респираторной патологией, в которых ранее обнаружили М hyopneumoniae с помощью ПЦР. Тест показал положительную реакцию во всех пробах. Таким образом, чувствительность ПЦР-РВ оказалась не ниже, чем у традиционной ПЦР.

Аналитическую чувствительность ПЦР-РВ проверяли с помощью ДНК-стандартов. В качестве стандартов использовали рекомбинантную плазмиду с встроенным геном р46. Предельное разведение плазмиды, при котором регистрировали положительный сигнал, содержало 1740 копий плазмиды/мл (1,74 копий плазмиды/мкл, рис. 5). Учитывая, что в реакцию брали по 3 мкл раствора разведенной плазмиды и то, что плазмида может рассматриваться как эквивалент генома М. hyopneumoniae, ПЦР-РВ была способна выявлять 5,22 геномных эквивалентов на реакцию, что соответствовало 522 эквивалентам генома в 1 мл. Таким образом, по

аналитической чувствительности ПЦР-РВ в десять раз превосходила разработанный нами метод на основе традиционной ПЦР.

10"

Рис. 5. Динамический диапазон TaqMan-ПЦP от Ю10 до 10° копий/мл (амплификационные кривые, построенные для М. Iгуорпеитопше)

1А .... .: г

: 0) :: :•:*: 8 / 7 * ■И ь 2 и

О Ак /

г-9- У

;. ,/ У

гх • з: / п >

/, ... к

1,2,3

+К

№ цикла

1д геномных эквивалентов/мл

Рис. 6. Кривые накопления с ДНК М. Иуорпеитошае (А) и количественная оценка ДНК М. куорпеитотае относительно плазмидных стандартов (Б): Примечание: +К - эталонный штамм АТСС 27715, 1-3 - положительные образцы, -К - отрицательный образец,

- расположение образцов на стандартной кривой

Полученные стандарты ДНК использовали для количественной оценки содержания М. Иуорпеитотае в пробах патологического материала. С этой целью образцы, давшие положительную реакцию в ПЦР-РВ, количественно тестировали относительно плазмидных стандартов (рис. 6).

Исходя из того, что для выделения ДНК использовали 10%-ную суспензию патологического материала, количество клеток М. hyopneumoniae в 1 г последнего подсчитывали умножением на 10 количества геномных эквивалентов/мл, установленного в ПЦР-РВ. При проведении количественной ПЦР-РВ определили, что у поросят с выраженными проявлениями пневмонии число клеток М. hyopneumoniae в 1 г легочной ткани составляло 105-106.

Таким образом, разработанный метод с высокой чувствительностью и специфичностью позволяет обнаруживать М. hyopneumoniae и определять количество копий ДНК микоплазмы в исследуемых образцах.

По результатам комиссионных испытаний предложенные «Методические указания по выявлению и количественному анализу Mycoplasma hyopneumoniae методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» были одобрены Учёным советом и утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 10.03.2010 г.

3.4. Разработка непрямого варианта ИФА на основе рекомбинантного белка М. hyopneumoniae для выявления антител в сыворотках крови

Диагностика инфекции, обусловленной М. hyopneumoniae, может осуществляться не только путем обнаружения микроорганизма в органах и тканях свиней, но и определением антител к нему в сыворотках крови животных, причем обнаружение антител имеет преимущество при проведении массовых исследований. В связи с этим одна из целей нашей работы состояла в разработке иммуноферментной тест-системы для выявления антител к М. hyopneumoniae. Поскольку культивирование М. hyopneumoniae является чрезвычайно длительным и сложным процессом по причине требовательности данной бактерии к условиям роста, в качестве антигена для ИФА использовали рекомбинантный видоспецифичный поверхностный белок р65.

3.4.1. Получение рекомбинантного белка М. куорпеитошае в системе экспрессии Е. соИ

Схема конструирования плазмиды, экспрессирующей рекомбинантный белок М. Иуорпеитотае, показана на рисунке 7.

Участок генома Mycoplasma hyopneumoniae

Рис. 7. Схема клонирования гена р65 М. hyopneumoniae в экспрессирующую плазмиду pQE

ДНК М. hyopneumoniae выделяли из 10%-ной суспензии легких поросёнка с признаками ЭП. Ген, кодирующий поверхностный белок р65, амплифицировали методом ПЦР, в реакции использовали праймеры, в структуру которых были заложены сайты рестрикции Ваш HI и Hind III. После обработки соответствующими рестриктазами ампликон клонировали в экспрессирующий плазмидный вектор pQE.

В результате трансформации рекомбинантной плазмидой компетентных клеток М15 Е. coli получили клоны, экспрессирующие белок М. hyopneumoniae, содержащий на N-конце гистидиновый 6-членный пептид.

Молекулярная масса рекомбинантного белка соответствовала расчётной (рис. 8). Из клонов, экспрессирующих белок М. hyopneumoniae, выделили рекомбинантные плазмиды и проверили методом нуклеотидного

секвенирования на отсутствие нуклеотидных замен и сдвигов в рамке считывания, приводящих к изменению аминокислотного состава рекомбинантного белка.

М 1 2 3

к Да .

'зо —*■ > 4 .;■„. а"

р65

95 -ч ,

"Я ?

72 —► itüi^-MiriJ I

V/ ■ .

* 3

f I. -j

Рис. 8. Электрофоретический анализ рекомбинантного белка р65 М. hyopneumoniae в 12%-ном полиакриламидном геле Примечание: М-маркер;

1 - белки Е. coli до индукции;

2 - белки Е. coli через 4 часа после индукции;

3 - очищенный рекомбииантный белок М. hyopneumoniae

Экспрессию рекомбинантного белка проводили в течение 4 часов путем внесения в культуру Е. coli ИПТГ в концентрации 0,2 мМ. Очистку рекомбинантного белка осуществляли методом металл-хелатной хроматографии с применением Ni-NTA агарозы в соответствии с инструкцией производителя (Qiagen). Выход очищенного белка со 100 мл культуры Е. coli достигал 2,5 мг.

Антигенную активность белка проверяли в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками. В качестве контрольных использовали положительную и отрицательную сыворотки, проверенные в ИФА

коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (фирма IDEXX, США).

Результаты проверки антигенной активности рекомбинантного белка отражены на рисунке 9. Концентрация рекомбинантного белка, при которой оптическая плотность положительного контроля в 2 раза превышала оптическую плотность отрицательного контроля, составляла 1,25 мкг/мл.

to 1.5

с *

¡11 V о

? S 0.5 о о

-сыв.положительная ■сыв.отрицательная

0 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 Концентрация антигена (икг/мл)

Рис. 9. Антигенная активность рекомбинантного белка в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками

Антигенную специфичность рекомбинантного белка проверяли в непрямом варианте ИФА с сыворотками крови свиней, содержащими антитела к вирусам классической чумы свиней, болезни Ауески, репродуктивно-респираторного синдрома свиней, трансмиссивного гастроэнтерита, парвовирусу свиней и РаьгеигеИа тикоайа. Активность антигена с гетерологичными сыворотками не превышала фоновый уровень, полученный в реакции с отрицательной сывороткой.

3.4.2. Разработка непрямого варианта ИФА по одному разведению

сывороток крови При разработке непрямого варианта ИФА были решены следующие задачи: определена рабочая концентрация антигена (4-8 мкг/мл), отработаны условия сенсибилизации лунок микропанелей (сорбция антигена, разведенного в карбонатно-бикарбонатном буфере, в течение 16-18 ч при температуре 4°С), установлены оптимальное рабочее разведение сывороток (1:40), позитивно-негативный порог реакции (0,25>8Р>0,20), допустимые величины оптических плотностей отрицательных (0,066-0,106 ОЕ) и

положительных (0,800-1,400 ОЕ) сывороток, показатель воспроизводимости реакции - коэффициент вариации (3,46%), критерий согласованности разработанного варианта ИФА и коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (фирма IDEXX, США) - k-критерий (0,92).

Диагностические специфичность и чувствительность ИФА по определению антител проверяли на заведомо отрицательных и заведомо положительных сыворотках.

В качестве заведомо положительных были использованы сыворотки крови от 132 свиней, вакцинированных против М. hyopneumoniae. При исследовании в н-ИФА этих сывороток антитела к М. hyopneumoniae были выявлены в 128 пробах, еще две пробы показали сомнительный результат. Таким образом, на данной панели сывороток диагностическая чувствительность разработанного нами непрямого варианта ИФА составила 97,0%.

Для оценки диагностической специфичности в н-ИФА исследовали 6155 сывороток крови свиней из хозяйств, свободных от М. hyopneumoniae. Только 70 проб показали положительный (в данном случае ложноположительный) результат. Таким образом, диагностическая специфичность н-ИФА на этой панели сывороток составила 98,9%.

Для сравнения разработанного метода относительно референтной тест-системы 1087 сывороток крови свиней исследовали на наличие антител к М. hyopneumoniae в непрямом варианте ИФА и с использованием коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (фирма IDEXX, США). Согласованность двух тестов определяли методом капа статистики. Полученное в нашем случае значение k-критерия, равное 0,92, свидетельствует об очень хорошей согласованности результатов двух тест-систем.

3.5. Серомониторинг инфекции, обусловленной М. Иуорпеитотае, в свиноводческих хозяйствах РФ

С применением разработанной иммуноферментной тест-системы исследовали более 20000 проб сывороток крови свиней из 136 свиноводческих хозяйств РФ. В 76 хозяйствах у свиней обнаружили антитела к М. Иуорпеитотае. Сыворотки крови, полученные от животных из 60 хозяйств, оказались отрицательными в отношении данного вида микоплазм. Таким образом, было установлено широкое распространение М. Иуорпеитотае в свиноводческих хозяйствах Российской Федерации, а также определен статус большого числа российских хозяйств в отношении этого микроорганизма.

В неблагополучных по энзоотической пневмонии хозяйствах антитела к М. Иуорпеитотае у поросят до приёма молозива не обнаружили. У поросят до 2-месячного возраста антитела к возбудителю выявили в 10,9% случаев, у поросят в возрасте 2-4 месяца - в 14,3% случаев, у 4-6-месячных поросят - в 38,3% случаев, в 43,7% случаев для ремонтного молодняка и в 36,0% - для взрослых животных (рис. 10).

2 60 -| А

| 50 -

Г"

о 30 "

5 [-

* 20 -о

с -

п. 10 " -

и и

* ------- , I I ,

безмолозивные 0-2 мес. 2-4 мес. 4-6 мес. ремонтный взрослые

молодняк

Рис. 10. Изменение количества сероиозитивных в отношении М. куорпеитотае животных в зависимости от возраста

Результаты ИФА показали, что максимальное количество серопозитивных животных приходится на ремонтный молодняк. В то же

время, по результатам ПЦР максимальное количество положительных на М. Иуорпеитотае проб приходилось на поросят-отъемышей. Разницу в результатах двух методов можно объяснить продолжительным сроком сероконверсии в случае естественного инфицирования свиней М. Иуорпеито/иае.

С использованием разработанной тест-системы проанализировали уровень антител к М. Иуорпеитотае у 5395 племенных животных, закупленных рядом российских свиноводческих хозяйств в Канаде, Польше, Эстонии, Литве, Великобритании, Германии, Венгрии, Франции, Чехии, Ирландии, Испании и Дании. Все свиньи, импортированные из Канады, Эстонии, Чехии, Польши и Ирландии, оказались серонегативными в отношении М. Иуорпеитотае, а доля серопозитивных животных, ввезенных в РФ из Франции, Дании, Германии, Великобритании, Литвы, Венгрии и Испании, значительно варьировала: от 3,8% (Франция) до 88,0% (Венгрия, Испания).

3.6. Изучение распространения М. Иуорпеитотае в дикой фауне

России

Для многих инфекционных заболеваний свиней дикие кабаны рассматриваются как природный резервуар и потенциальный источник инфекции. Для изучения распространения М Иуорпеитотае в дикой фауне РФ были использованы разработанные нами диагностические методы.

С использованием ПЦР на наличие М. Иуорпеитотае исследовали патологический материал от диких кабанов, павших или отстрелянных с диагностической целью в Тверской, Смоленской, Владимирской, Московской, Курской и Ярославской областях, а также в Ставропольском крае. Данный материал был исследован также на наличие М. ИуогЫт& с целью установить доминирующий у кабанов вид микоплазм. М. Иуорпеитотае была обнаружена в 48 из 130 исследованных проб (36,9%), в то время как М. куогЫтз - всего лишь в 4 пробах (3,1%).

С помощью разработанного н-ИФА на наличие антител к М. hyopneumortiae исследовали сыворотки крови диких кабанов из шести регионов России. Серопозитивных животных выявили во всех пяти обследованных областях Центрального федерального округа России: Владимирской, Московской, Тверской, Белгородской и Смоленской. Кабаны из Забайкальского края были серонегативными, однако число исследованных сывороток оказалось слишком мало, чтобы делать какие-либо выводы о распространении М. hyopneumoniae в дикой фауне Забайкалья.

Таким образом, полученные с использованием ПЦР и ИФА результаты свидетельствуют о широком географическом распространении М hyopneumoniae в популяции диких кабанов ЦФО РФ.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработанным методом обнаружения ДНК М. hyopneumoniae, основанным на ПЦР с электрофоретической детекцией, установлено, что из исследованных 850 проб патологического материала от свиней из 195 хозяйств 43 регионов РФ М. hyopneumoniae выявлена в 22% проб.

2. Разработанный метод количественного определения ДНК М hyopneumoniae, основанный на ПЦР в режиме реального времени, позволяет установить концентрацию микоплазмы в легких больных свиней, которая обычно составляет 105-106 клеток/г.

3. На основе полученного рекомбинантного антигена разработан непрямой вариант ИФА для выявления антител к М. hyopneumoniae в сыворотках крови свиней. Диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность непрямого варианта ИФА составляет 97,0% и 98,9%, соответственно.

4. С использованием разработанного иммуноферментного метода проведен серомониторинг микоплазменной инфекции в хозяйствах РФ.

Антитела к М. Иуорпеитотае у свиней выявлены в 76 из 136 обследованных хозяйств РФ.

5. Определен серопозитивный статус племенных свиней, ввезенных в Россию в 2005-2009 гг из Франции, Дании, Германии, Великобритании, Литвы, Венгрии и Испании, в отношении инфекции, обусловленной М. Иуорпеитотае.

6. С использованием ПЦР и ИФА установлено, что М. Иуорпеитотае распространена в ЦФО России среди кабанов, являющихся природным резервуаром данного возбудителя.

7. Проведен филогенетический анализ полевых изолятов М. Иуорпеитотае. Установлено, что все изоляты формируют два сильно отличающихся кластера. Один кластер включает изоляты как от домашних свиней, так и от кабанов, второй кластер объединяет изоляты М. Иуорпеитотае исключительно от кабанов.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

«Методика обнаружения Mycoplasma Иуорпеитотае с использованием полимеразной цепной реакции»;

«Методические указания по выявлению и количественному анализу Mycoplasma Иуорпеитотае методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени».

«Методика обнаружения антител к Mycoplasma Иуорпеитотае в непрямом варианте иммуноферментного анализа».

Разработанные методики и методические указания используются при проведении диагностических и мониторинговых исследований для выявления М. Иуорпеитотае и антител к ней.

Список использованной литературы

1. Губин С.Н. Комплекс респираторных заболеваний свиней (PRDC) // Гл. зоотехник. - 2009. - №2. - С. 59.

2. Дудников СЛ. Количественная эпизоотология: основы прикладной эпидемиологии и биостатистики. - Владимир: Демиург, 2005. - 460 с.

3. Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК-плазмид и РНК / О.Г. Грибанов [и др.] // Биохимия. - 1996. - Т. 21, №6. - С. 1064-1070.

4. Поляков И. О. Практическое пособие по медицинской статистике. - Л.: Медицина, 1975. - 150 с.

5. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров [и др.]. -М.: Высш. школа, 1991. - 288 с.

6. Ханаан Д. Методы трансформации. Клонирование ДНК / под ред. Д. Гловера. - М., 1988. - 487 с.

7. Application and field validation of a PCR assay for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae from swine lung tissue samples / H.Y. Cai [et al.] // J. Vet. Diagn. Invest. - 2007. - Vol. 19. - P. 91-95.

8. A processed multidomain Mycoplasma hyopneumoniae adhesion binds fibronectin, plasminogen and swine respiratory cilia / Lisa M. Seymour [et al.] / URL: www.jbc.org/cgi/doi/10.1075/jbc.M110.104463.

9. Caron J., Ouardani M., Dea S. Detection and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis by PCR amplification of the P36 and P46 genes // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol. 38. - P. 1390-1396.

10. Detection of Mycoplasma hyopneumoniae in bronchoalveolar lavage fluids of pigs by PCR / A.K. Baumeister, M. Runge, M. Ganter, A.A. Feenstra // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36. - P. 1984-1988.

11. Detection of Mycoplasma hyopneumoniae in nose swabs from pigs by in vitro amplification of the 16S rRNA gene / L.G. Mattsson [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1995. - Vol. 33. - P. 893-897.

12. Done S.H. Porcine respiratory disease complex (PRDC) // Pig J. - 2002. - Vol. 50.-P. 174-196.

13. Kim T.J. In vitro expression of the 50-kDa and 30-kDa fragments of the P97 adhesin of Mycoplasma hyopneumoniae in Escherichia coli and their use for serodiagnosis // Can. J. Vet. Res. - 2007. - Vol. 71. - P. 278-282.

14. Kobish M., Friis N.M. Swine mycoplasmoses // Rev. Sei. Off. Int. Epizoot. -

1996.-Vol. 15.-P. 1569-1606.

15. Levonen K. The detection of respiratory diseases in swine herds by means of antibody assay on colostrum from sows: acad. diss. / Faculty of Veterinary Medicine of the University of Helsinki. - Helsinki, 2000. - 91 p.

16. Minion C.F. Molecular pathogenesis of mycoplasma animal respiratory pathogens // Frontiers Biosci. - 2002. - Vol. 7. - P. 1410-1422.

17. Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs: duration of the disease and evaluation of fout diagnostic assays / V. Sorensen [et al.] // Vet. Microbiol. -

1997. - Vol. 54. - P. 23-34.

18. Patterns of Mycoplasma hyopneumoniae infections in Belgian farrow-to-finish pig herds with diverging disease-course / J. Vicca [et al.] // J. Vet. Med. Ser. B. - 2002. - Vol. 39. - P. 349-353.

19. PCR-based detection of Mycoplasma species / H. Okada [et al.] // J. Microbiol. -2005,-Vol. 44.-P. 42-49.

20. Proteolytic processing of the Mycoplasma hyopneumoniae cilium adhesion / S. Djordjevic [et al.] // Infect. Immun. - 2004. - Vol. 72. - P. 2791-2802.

21. Rapp-Gabrielson V. Evaluation of duration of immunity after vaccination of swine with a single dose of Mycoplasma hyopneumoniae bacterin (M+Pac ) // Proceedings Am. Swine Vet.: Annual Meeting. - 2002. - P. 105.

22. Ross R.F. Mycoplasmal diseases // Diseases of Swine / ed. B.E. Straw [et al.]. -8th ed. - Ames, Iowa, 1999. - P. 495-509.

23. Shoukri M. N., Edge V.L. Statistical Methods for Health Sciences. - N. Y.: CRC Press Inc., 1996.

24. Sibila M., Olvera A., Calsamiglia M. Development of a real-time PCR (TaqMan) assay for Mycoplasma hyopneumoniae detection and quantification 11 Proceedings 18th IPVS Congr., Hamburg, Germany. - 2004. - Vol. 1. - P. 1568-1578.

25. Thacker E.L., Thacker B.J., Janke B.H. Interaction between Mycoplasma hyopneumoniae and swine influenza virus // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol. 39. - P. 2525-2526.

26. Thacker E.L. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae II J. Swine Health Prod. - 2004. - Vol. 12. - P. 252-254.

27. Use of a Mycoplasma hyopneumoniae nested polymerase chain reaction test to determine the optimal sampling sites in swine / K.T. Kurth [et al.] // J. Vet. Diagn. Invest. - 2002. - Vol. 14. - P. 463-469.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Современные методы диагностики болезней свиней инфекционной этиологии / В.Ф. Ковалишин, A.B. Щербаков, A.M. Тимина, A.C. Яковлева, М.В. Челышева // Вет. медицина: м1жвщ. тем. наук. зб1рник. -Харюв, 2006. - Вып. 86. - С. 179-185.

2. Новые подходы в диагностике болезней свиней и их практическая значимость / В.Ф. Ковалишин, A.B. Щербаков, A.B. Каньшина, A.M. Тимина, A.C. Яковлева, М.В. Челышева // Ветеринарна бютехнолопя. Бюл. № 9: матер. М1жнар. наук.-практ. конф. - Кшв, 2006. - С.121-131.

3. Челышева М.В. Разработка непрямого варианта ИФА на основе рекомбинантного белка Р65 для определения антител к Mycoplasma hyopneumoniae / М.В. Челышева, A.B. Щербаков II Вет. патология. - 2006. - № 4. - С. 109-113.

4. Комплекс респираторных болезней свиней в свиноводческих хозяйствах России / С.А. Кукушкин, Т.З. Байбиков, М.В. Челышева, В.Ф. Ковалишин // Всерос. вет. конгр. 15-й Моск. междунар. вет. конгр. по болезням мелких домашних ж-ных. Пробл. инфекц. патологии свиней: матер, секции. - М., 2007. - С.24-27.

5. Щербаков A.B. Обнаружение и видовая идентификация микоплазм с использованием полимеразной цепной реакции / A.B. Щербаков, М.В. Челышева, A.M. Тимина // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 202-211.

6. Результаты исследования сывороток крови племенных свиней, импортированных в Россию, на наличие антител к различным инфекционным агентам / A.B. Каньшина, Н.В. Вавилова, М.В. Челышева, A.C. Яковлева, A.M. Тимина, В.Ф. Ковалишин, A.B. Щербаков // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 272-277.

7. Тимина A.M. Разработка ПЦР в реальном времени для выявления и количественной оценки Mycoplasma hyopneumoniae / A.M. Тимина, M.B. Челышева, A.B. Щербаков // Рос. вет. журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ "ВНИИЗЖ". - 2008. - Сент. - С. 53-55.

8. Изучение комплекса респираторных болезней свиней в свиноводческих хозяйствах России / С.А. Кукушкин, Т.З. Байбиков, A.M. Тимина, М.В. Челышева, В.Ф. Ковалишин // Рос. вет. журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ "ВНИИЗЖ". - 2008. - Сент. - С. 55-57.

9. Результаты мониторинга инфекции, обусловленной Mycoplasma hyopneumoniae, в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне России / М.В. Челышева, A.M. Тимина, Е.С. Орлова, А.В.Щербаков // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2009. - Т. 7. - С. 122-130.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Тираж 90 экз., февраль 2011г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бирюченкова, Марина Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Возбудитель энзоотической пневмонии свиней.

1.1.1. Таксономическое и филогенетическое положение.

1.1.2. Морфология и строение.

1.1.2.1. Структура микоплазмы.

1.1.2.2. Геном Mycoplasma hyopneumoniae.

1.2. Общая характеристика энзоотической пневмонии свиней.

1.2.1. Патогенез.

1.2.2. Клиническая картина заболевания.

1.2.3. Патологоанатомические изменения.

1.2.4. Иммунитет и специфическая профилактика.

1.3. Диагностика энзоотической пневмонии свиней.

1.3.1. Обнаружение Mycoplasma hyopneumoniae.

1.3.2. Методы молекулярного типирования.

1.3.3. Обнаружение антител к Mycoplasma hyopneumoniae.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов диагностики инфекции, вызываемой Mycoplasma hyopneumoniae"

Актуальность темы. Mycoplasma hyopneumoniae является этиологическим агентом энзоотической пневмонии (ЭП) свиней. Ей также принадлежит важная роль в развитии респираторного симптомокомплекса свиней (РСКС) - многокомпонентного заболевания, являющегося одной из наиболее актуальных проблем современного свиноводства [87, 193, 199].

В качестве инфекционного агента, вызывающего ЭП свиней, М. hyopneumoniae была определена Goodwin et al., Маге и Switzer в 1965 году [6, 79]. Заболевание распространено во всем мире [142]. Экономический ущерб от энзоотической пневмонии свиней составляет в странах с развитым свиноводством до одного миллиарда долларов в год [100, 43]. В некоторых странах проведенные исследования выявили поражения, типичные для хронической формы заболевания, у 80% поросят группы откорма [201].

Коинфицирование свиней микоплазмами и другими патогенами (прежде всего такими, как вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней, цирковирус свиней второго типа, вирус гриппа свиней, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis) отягощает проявление основных симптомов пневмонии и приводит к формированию респираторного симптомокомплекса свиней. РСКС наносит значительный экономический ущерб свиноводству во всем мире. В различных хозяйствах заболеваемость поросят может достигать 30-70%, а летальность -15% в зависимости от количества ассоциированных инфекционных агентов [116].

Эффективность мер по борьбе с респираторными заболеваниями, ассоциированными с М. hyopneumoniae, во многом зависит от своевременной их диагностики, которая основывается на эпизоотологических данных, клинических признаках болезни, результатах патологоанатомического вскрытия и лабораторных исследований. Проблема осложняется тем, что до настоящего времени в России не было разработано надёжных и достоверных диагностических методов по обнаружению М. Пуорпеитопгае. Слабоизученным оставался широкий круг проблем, связанных с этим видом микоплазм: масштабы распространения М. Нуорпеитотае в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ, ее роль в развитии РСКС в российских свиноводческих хозяйствах, филогенетичекие особенности отечественных изолятов бактерии.

Степень разработанности проблемы. На настоящий момент иностранными авторами разработано несколько тест-систем, основанных на иммунофлюоресцентных, иммуногистохимических методах [131, 153, 179] и на различных модификациях ПЦР, позволяющих выявлять М. Нуорпеитотае в носовых, трахеобронхиальных смывах, а также в легочной ткани [42, 65, 69, 76, 206]. Также за рубежом осуществляют серодиагностику микоплазменной инфекции с использованием реакций агглютинации, связывания комплемента и ИФА в различных вариантах [137, 149, 154, 167].

В России до текущего времени не было разработано надёжных и достоверных диагностических методов по обнаружению М. Нуорпеитотае. Слабоизученным оставался широкий круг проблем, связанных с этим видом микоплазм; масштабы распространения М. Нуорпеитотае в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ, ее роль в развитии РСКС в российских свиноводческих хозяйствах, филогенетичекие особенности отечественных изолятов бактерии.

Цели и задачи исследования.

Цель данной работы состояла в разработке методов обнаружения М. Нуорпеитотае и антител к ней, а также в применении разработанных методов для изучения распространения этого вида микоплазм на территории РФ и его роли в респираторных болезнях свиней в российских хозяйствах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать методы обнаружения ДНК М. куорпеитотае, основанные на ПЦР;

- применить разработанные методы в диагностических исследованиях;

- провести филогенетический анализ полевых изолятов М. куорпеитотае;

- получить рекомбинантный видоспецифичный белок М. куорпеитотае и разработать на его основе непрямой вариант иммуноферментного анализа (н-ИФА) для выявления антител к данному инфекционному агенту в сыворотках крови свиней;

- изучить распространение М. куорпеитотае в дикой фауне РФ.

Научная новизна исследований. Впервые в РФ разработан метод обнаружения ДНК М. куорпеитотае, основанный на ПЦР с электрофоретической детекцией.

Проведен филогенетический анализ полевых изолятов М. куорпеитотае.

С использованием непрямого варианта ИФА определен серологический статус более 5 тысяч племенных свиней, ввезенных в Россию в 2005-2009 гг из Канады и европейских стран, в отношении микоплазменной инфекции.

Практическая значимость исследований. В результате проведённых исследований утверждены следующие нормативные документы:

Методика обнаружения антител к Mycoplasma hyopneumoniae в непрямом варианте иммуноферментного анализа», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 08.02.2006 г.;

Методика обнаружения Mycoplasma hyopneumoniae с использованием полимеразной цепной реакции», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 20.03.2006 г.;

Методические указания по выявлению и количественному анализу Mycoplasma hyopneumoniae методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 10.03.2010 г.

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе три работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены, опубликованы и обсуждены на научно-практической конференции "Ветеринарное обеспечение свиноводства: современное состояние и пути развития" (Харьков, 2005 г.), в материалах международной научно-практической конференции "Современные проблемы ветеринарной медицины в свиноводстве" (Киев, 2006 г.), на XV московском международном ветеринарном конгрессе по болезням мелких домашних животных "Проблемы инфекционной патологии свиней" (Москва, 2007 г.), а также на заседаниях учёного совета ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" в период 2005-2009 гг.

Личный вклад. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники лаборатории диагностики особо опасных инфекций: к.б.н. А. С. Яковлева, к.в.н. А. В. Канынина, к.в.н. А. М. Тимина, заведующий лабораторией, к.б.н. А. В. Щербаков.

Основные положения, выносимые на защиту:

Метод обнаружения ДНК М. куорпеитотае, основанный на ПЦР с электрофоретической детекцией.

Метод количественного обнаружения ДНК М. куорпеитотае, основанный на ПЦР в реальном времени.

Филогенетический анализ полевых изолятов М. куорпеитотае.

Рекомбинантный видоспецифичный белок М. куорпеитотае и разработанный на его основе непрямой вариант ИФА для выявления антител к микоплазме.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 134 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение и выводы. Список используемой литературы включает 215 источников, из которых 185 иностранных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 17 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Бирюченкова, Марина Вячеславовна

4. ВЫВОДЫ

3. На основе полученного рекомбинантного антигена разработан непрямой вариант ИФА для выявления антител к М. hyopneumoniae в i сыворотках крови свиней. Диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность непрямого варианта ИФА составляет 97,0% и 98,9% соответственно.

4. С использованием разработанного иммуноферментного метода проведен серомониторинг микоплазменной инфекции в хозяйствах РФ. Антитела к М. hyopneumoniae у свиней выявлены в 76 из 136 обследованных хозяйств РФ.

6. С использованием ПЦР и ИФА установлено, что М. hyopneumoniae распространена в ЦФО России среди кабанов, являющихся природным резервуаром данного возбудителя.

7. Проведен филогенетический анализ полевых изолятов М hyopneumoniae. Установлено, что все изоляты формируют два сильно отличающихся кластера. Один кластер включает изоляты как от домашних свиней, так и от кабанов, второй кластер объединяет изоляты М. hyopneumoniae исключительно от кабанов.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

Методика обнаружения антител к Mycoplasma hyopneumoniae в непрямом варианте иммуноферментного анализа»;

Методика обнаружения Mycoplasma hyopneumoniae с использованием полимеразной цепной реакции»;

Методические указания по выявлению и количественному анализу Mycoplasma hyopneumoniae методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени».

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем свиноводства являются респираторные заболевания. В хозяйствах Российской Федерации и за рубежом широко распространена энзоотическая пневмония свиней, этиологическим агентом которой является М. куорпеитотае. Как монозаболевание энзоотическая пневмония встречается редко и обычно является составной частью респираторного симптомокомплекса свиней.

В России до настоящего момента неизученным оставался широкий круг вопросов, связанных с М. куорпеитотае: степень распространения возбудителя среди домашних свиней и диких кабанов, вовлечённость М. куорпеитотае в инфекционную патологию. Для решения этих задач необходимо иметь в распоряжении надежные методы диагностики микоплазменной инфекции свиней.

В результате проведенных исследований был разработан метод ПЦР, позволяющий выявлять ДНК М. куорпеитотае в легких животных с респираторной патологией. Метод основан на использовании пары видоспецифичных праймеров, комплементарных участку гена р46. Было показано, что данный метод обладает высокой аналитической^ специфичностью и чувствительностью.

С помощью разработанного-метода в период с 2005 по 2009 'годы исследовали более 850' проб патологического материала от свиней с респираторной патологией из 195 хозяйств 43 регионов РФ. В. результате проведенных исследований М. куорпеитотае была выявлена в 22% проб.

При исследованиях материала от свиней различных возрастных групп оказалось, что наиболее часто М. куорпеитотае обнаруживалась у поросят в послеотъемный период (возраст 2-4 месяца) и в период откорма (возраст 4-6 месяцев): 26,6% и 24,2%, соответственно. У животных старше 6 месяцев М. куорпеитотае также выявляли в значительном количестве случаев (16,3%). У поросят-сосунов с респираторной патологией микоплазму обнаруживали значительно реже. Таким образом, наши исследования подтвердили данные литературы [93, 142, 196, 197] о том, что респираторные заболевания, ассоциированные с М. куорпеитотае, присущи, главным образом, поросятам послеотъемного и откормочного периодов.

У животных с респираторной патологией кроме М. куорпеитотае обнаруживали и другие виды патогенных бактерий и вирусы: М. куогЫтз, бактерии семейства Ра81еиге11асеае, ЦВС-2, вирус РРСС. Вирус гриппа свиней обнаруживали редко. Полученные результаты подтверждают данные литературы [50, 98, 116, 132] о значении ассоциаций респираторных патогенов в развитии осложнений энзоотической пневмонии.

Таким образом, в результате проведенных нами исследований было установлено, что спектр патогенов, обнаруживаемых у свиней, пораженных РСКС (чаще всего поросят групп отъема и откорма), включает М. куорпеитотае в ассоциации с рядом других инфекционных агентов вирусной и бактериальной природы.

Для обнаружения ДНК М. куорпеитотае нами был также разработан метод ПЦР в режиме реального времени. В основе метода лежит использование пары праймеров и зонда, комплементарных участку гена р46. ПЦР-РВ имел ряд преимуществ по сравнению с классическим вариантом ПЦР. Аналитическая чувствительность ПЦР-РВ' на порядок превышала чувствительность ПЦР с электрофоретической детекцией. Кроме того, ПЦР-РВ позволяет проводить количественную оценку содержания! М. hyopneumoniae в исследуемых пробах. Для этого нами путем- молекулярного клонирования гена р46 были получены стандарты, ДНК. С использованием количественной ПЦР-РВ мы определили, что у поросят с выраженными признаками пневмонии содержится 105-106 клеток микоплазмы в 1г легочной ткани.

С целью разработки иммуноферментной тест-системы для выявления антител к М hyopneumoniae экспрессией в Е. coli был получен рекомбинантный видоспецифичный белок М. hyopneumoniae. В непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками показали его высокую антигенную активность и специфичность.

На основе рекомбинантного антигена разработали непрямой вариант ИФА для выявления антител к М. hyopneumoniae в сыворотках крови свиней. Определили рабочее разведение антигена и сывороток, оптимальные режимы постановки реакции, установили позитивно-негативный порог реакции, допустимые значения оптической плотности контрольных сывороток и коэффициент вариации.

Диагностические чувствительность и специфичность метода, установленные на панели заведомо положительных и заведомо отрицательных сывороток, составляли 97,0% и 98,9%, соответственно.

Показано, что результаты, получаемые в н-ИФА, очень хорошо согласуются с результатами, получаемыми при использовании коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX, США). Согласованность двух тест-систем определяли по методу капа-статистики, значение k-критерия равнялось 0,92.

С использованием разработанной иммуноферментной тест-системы исследовали более 20000 проб сывороток крови от свиней из 136 хозяйств 43 регионов . РФ. В-* 76* хозяйствах у животных обнаружили антитела к М. куорпеитотае. В результате проведенного серомониторинга впервые было показано широкое распространение этого вида, микоплазм в РФ, а также определен статус большого- числа российских хозяйств в отношении инфекции, обусловленной'М. куорпеитотае. При исследовании сывороток крови племенных свиней, ввезенных в РФ из-за рубежа, было установлено, что количество серопозитивных животных, импортированных из некоторых стран Европы, достигало 88%. Животные, ввезенные из Канады, Польши, Эстонии, Чехии и Ирландии оказались серонегативными в отношении данного возбудителя.

С использованием разработанных методов и методик изучено распространение М. куорпеитотае в дикой фауне РФ. ДНК микоплазмы и/или антитела к ней были обнаружены у диких кабанов, павших или отстрелянных с диагностической целью в Тверской, Смоленской, Владимирской, Московской, Курской, Белгородской областях и в Ставропольском крае. Таким образом, было показано широкое географическое распространение М. куорпеитотае в дикой фауне России.

С целью изучения генетического разнообразия * российских изолятов М.куорпеитотае проведено секвенирование фрагмента гена р46 микоплазм, выявленных у домашних свиней из 9 хозяйств и диких кабанов из 4 областей ЦФО. Филогенетический анализ установленных нуклеотидных последовательностей показал, что все изоляты формируют два сильно отличающихся кластера. Один кластер включал изоляты М. куорпеитотае, выделенные от домашних свиней в России, Канаде и Японии. В этот кластер вошли также несколько изолятов от диких кабанов из ЦФО РФ. Второй кластер формировали изоляты М. куорпеитотае исключительно от диких кабанов.

Таким образом, в результате проведенных исследований было разработано несколько методов и методик по обнаружению возбудителя энзоотической пневмонии свиней, а именно: ПЦР и ПЦР-РВ, а также непрямой вариант ИФА для выявления антител к М. hyopneumoniae в сыворотках крови животных. Применение разработанных методов и методик в диагностических исследованиях позволило установить степень распространения М. hyopneumoniae среди домашних свиней и диких кабанов, а также роль возбудителя- в ассоциированной респираторной патологии свиней.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бирюченкова, Марина Вячеславовна, Покров

1. Бессарабов Б.Ф., Воронин Е.С., Ватутин А.А. Инфекционные болезни животных. М.: КолосС, 2007. - 671 с.

2. Болезни свиней / В. Сидоркин, В. Гавриш, А. Егунова, С. Убираев. М.: Аквариум, 2007. - 274' с.

3. Гафаров Х.З., Романова Е.А. Инфекционные болезни свиней и современные средства борьбы с ними. — Казань: Школа, Шестой элемент, 2003.-200 с.

4. Гельвиг Э.Г. Заболевания свиней: пер. с нем. М.: Астрель, ACT, 2003.112 с.

5. Говорун В.М. Молекулярно-биологические методы выявления и идентификации инфекционных агентов, клиническая лабораторная аналитика, частные аналитические технологии в клинической лаборатории / под ред. В.В. Меньшикова. М.: КолосС, 1999. - 432 с.

6. Губин С.Н. Комплекс респираторных заболеваний свиней (PRDO) // Гл. зоотехник. 2009. - №2. - С. 59.

7. Диагностика микоплазменных заражений- с помощью направленной амплификации / Е.Ю. Жуланова, М.С. Вонский, В.В. Лисин и др. // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. 1993. - №2. - С. 913.

8. Дудников С.А. Количественная эпизоотология: основы прикладной эпидемиологии и биостатистики. Владимир: Демиург, 2005. - 460 с.

9. Жбанова Т.В., Дрыгин В.В., Дудникова Н.С. Микоплазмозы свиней: обзор литературы. Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ», 2005. - 76 с.

10. Инфекционная патология животных / ред. А .Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. — М.: Академкнига, 2006. -807 с.

11. Инфекционная патология животных: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ», Владимир, 30-31 окт. 2003 г. -Владимир, 2003. — 155 с.

12. Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК-плазмид и РНК / О.Г. Грибанов и др. //

13. Биохимия. 1996.-Т. 21, №6.-С. 1064-1070.

14. Каныпина A.B. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней: дис. . канд. вет. наук. Владимир, 2004. - 123 с.

15. Кирьянов Е.А. Микоплазмы и JI-формы бактерий в патологии животных. Уссурийск: Приморский с.-х. ин-т, 1983. - 554 с.

16. Кукушкин С.А. Особенности течения и вакцинопрофилактика репродуктивно-респираторного синдрома свиней в Российской Федерации: дис. . канд. вет. наук. Владимир, 2000. - 176 с.

17. Лобзин Ю.В. Руководство по инфекционным болезням. СПб.: Фолиант, 2000. - 932 с.

18. Малоголовкин А. С. Биологические и генетические характеристики цирковирусов свиней: дис. .канд. биол. наук. Покров, 2009. - 131 с.

19. Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных методом полимеразной цепной реакции / под ред. A.A. Гусева, А.Н. Панина. Владимир: ОКНИИиМС ВНИИЗЖ, 1998.-519 с.

20. Палунина В.В. Носительство микроорганизмов в носовой полости у поросят // Ветеринария. 2004. - №1. - С. 29-30.

21. Поляков И. О. Практическое пособие по медицинской статистике. Л.: Медицина, 1975. - 150 с.

22. Прозоровский С.Р., Левина Г.А., Рыжов Е.В. Сравнительное изучение патогенных свойств некоторых видов L-форм бактерий и микоплазм // Вестн. АМН СССР. 1969. - №5. - С. 72.

23. Пыльнов В.А. Разработка молекулярно-биологических методов обнаружения и штаммовой дифференциации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней: дис. . канд. биол. наук. Владимир, 2003.-112 с.

24. Ресурсы основных видов охотничьих животных и охотничьи угодья России (1991-1995ГГ.) / И.К. Ломанов и др.. М.: ЦНИЛ Охотдепартамента Минсельхозпрода России, 1996. - 226 с.

25. Сатина Т.А. Цирковирусные инфекции свиней: обзор литературы. -Владимир, 2003. 101 с.

26. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров и др.. -М.: Высш. школа, 1991.-288 с.

27. Тимаков В.Д., Каган Г.А. L-формы бактерий и семейство Mycoplasmatoceae в патологии. М.: Медицина, 1973. — 392 с.

28. Тимина A.M. Разработка методов лабораторной диагностики цирковирусной инфекции свиней: дис. . канд. вет. наук. Владимир, 2006.- 130 с.

29. Ханаан Д. Методы трансформации. Клонирование ДНК / под ред. Д. Гловера. М., 1988. - 487 с.

30. Этиологическая структура инфекционных болезней свиней в животноводческих хозяйствах России: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ», Владимир, 30-31 окт. 2003 г. -Владимир, 2003. 210 с.

31. Яковлева А.С., Канынина А.В., Щербаков А.В. Экспрессия в Е. coli рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и 3 АВ вируса ящура / Труды Федерального центра охраны здоровья животных. Владимир: Транзит-ИКС, 2005. - Т. 3. - С. 105-114.

32. Absence of strictly age-related resistance to Mycoplasma hyosynoviae infection in 6-week-old pigs / К. T. Lauritsen et al. // Vet. Microbiol. 2008. - Vol. 130. - P. 385-390.

33. Adams C., Pitzer J., Minion F. C. In vivo expression analysis of the P97 and PI02 paralog families of Mycoplasma hyopneumoniae II Infect. Immun. -2005. Vol. 73. - P. 7784-7787.

34. A longitudinal; study of serological, patterns of respiratory infections in? nine infected Danish swine herds / Ml Andreasen et al. // Prevent. Vet. Med; -2000.-Vol. 25.-P. 221-235;

35. Ameri-Mahabadi M., Zhou E.M., Hsu W.H. Comparison of two swine Mycoplasma hyopneumoniae enzyme-linked- immunosorbent: assays fön detection: of antibodies from vaccinated pigs and Held serum samples // J. Vet. Diagn. Invest.- 2005.- Vol. 17.- P. 61-64,

36. Amikam D.G., Rasin S. Mycoplasmas (Mollicutes) have: a low number of rRNA genes // J. Bacteriology. 1984. - Vol. 158. - P. 376-378.

37. Amplified-fragment length polymorphism fingerprinting of Mycoplasma species / B. Kokotovic et al,. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 3300-3307.

38. A multiplex PCR to identify porcine mycoplasmas present in broth cultures / T. Stakenborg et al. // Vet. Res. Commun. 2006; - Vol. 30: - P. 239-247.

39. A mycoplasma genetic element resembling'prokaryotic insertion sequences / Ferrell R.V. et al.-// Mol. Microbiol: 1989. - Vol. 3. - P. 957-967.

40. A nested PCR assay for the detection of Mycopasma hyopneumoniae in tracheobronchiolar washings from pigs / Verdin E. et al. // Vet. Microbiol. -2000.-Vol. 76.-P. 31-40.

41. An improved enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of porcine serum antibodies against Mycoplasma hyopneumoniae / S.P. Djordjevic et al. // Vet. Microbiol. 1994. - Vol. 39. - P. 261-273.

42. Antimicrobial susceptibility of Mycoplasma hyorhinis / C.C. Wu et al. // Vet. Microbiol. 2000; - Vol. 76. - P. 25-30.

43. Application and field validation of a PCR assay for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae from swine lung tissue samples / H.Y. Cai et al. //J. Vet. Diagn. Invest.- 2007. Vol. 19. - P; 91-95.

44. A processed multidomain Mycoplasma hyopneumoniae adhesion binds fibronectin, plasminogen and swine respiratory cilia / Lisa M. Seymour et al. /URL: www.jbc.org/cgi/doi/10.1075/jbc.Ml 10.104463.

45. Array-based comparative hybridization analysis of field strains of Mycoplasma hyopneumoniae / M.L. Madsen et al. // J. Bacteriol. 2007. -Vol. 189. - P. 7977-7982.

46. Artiushin S., Minion F.C. Arbitrarily primed PCR analysis of Mycoplasma hyopneumoniae field isolates demonstrates genetic heterogeneity // Int. J. System. Bacteriol. 1996. - Vol. 1. - P. 324-328.

47. Associations between pathogens in healthy pigs and pigs with pneumonia I A. Palzer et al. // Vet. Ree. 2008. - Vol. 162. - P. 267-271.

48. Automated annotation of keywords for proteins related to Mycoplasmataceae using machine learning techniques / L.C. Bazzan et al. // Bioinformatics. — 2002.-Vol. 18.-P. 35-43.

49. Association of lysogenic bacteriophage MAV1 with virulence of Mycoplasma arthritidis / L.L. Voelker et al. // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 40164023.

50. Aymard R.T. Neuraminidase assays // Dev. Biol. 2003. - Vol. 115. - P. 7583.

51. Baker R.B. Respiratory disease in growing pigs: with emphasis on diagnosis, treatment, and control of bacterial pneumonia // North California Healthy Hog Seminar. 1998.

52. Barry M.A., Lai W.C., Johnston S.A. Protection against mycoplasma infection using expression-library immunization // Nature. 1995. - Vol. 377. - P. 632635.

53. Baseman J.B., Lange M., Criscimangna N.L. Interplay between mycoplasmas and host target cells // Microb. Pathog. 1995. - Vol. 19. - P. 105-116.

54. Battrell M.A., Farms M., Hill R. Managing swine respiratory disease // J. Gen. Virol. 2008. - Vol. 87.-P. 1264-1274.

55. Benfield D. A. Porcine reproductive and respiratory syndrome // Diseases of Swine / ed. D.J. Taylor. Ames, Iowa, 1999. - P. 201-224.

56. Berner H. Impfung-eine neue methode der Bekämpfung der Enzootischen Pneumoniae des Schweines // Prakt. Tierarzt. 1995. - P. 668-682.

57. Bisping W., Amtsberg G. Mycoplasms // Farbatlas zur Diagnose Bakterieller Infektionserreger der Tiere. Berlin, Hamburg, 1988. - P. 307-323.

58. Blank W.A., Stemke G.W. A physical and genetic map of the Mycoplasma hyopneumoniae strain J genome // Can. J. Microbiol. 2000. - Vol. 46. - P. 832-840.

59. Blending of a conventional Mycoplasma hyopneumoniae vaccine with a positive marker: tracking of immunized pigs by peptide-specific antibodies raised to the marker component / B. Walders et al. // Res. Vet. Sci. 2005. -Vol. 78.-P. 135-141.

60. Botner A. Diagnosis of PRRS // Vet. Microbiol. 1997. - Vol. 55. - P. 295301.

61. Bruggmann S., Keller H. Quantitative detection of antibodies to Mycoplasma suipneumoniae in pigs' sera by an enzyme-linked immunosorbent assay // Vet. Rec.- 1977.-Vol. 101.-P. 109-111.

62. Burch D.G.S. The comparative efficacy of antimicrobials for the prevention and treatment of enzootic pneumonia and some of their pharmacokinetic // Pig J. 2004. - Vol. 53. - P. 8-27.

63. Calsamaglia M., Pijoan C., Trigo A. Application of a nested polymerase chain reaction assay to detect Mycoplasma hyopneumoniae from nasal swabs // J. Vet. Diagn. Invest. 1999. - Vol. 11. - P. 246-251.

64. Caron J., Ouardani M., Dea S. Detection and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis by PCR amplification of the P36 and P46 genes // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 1390-1396.

65. Characterization of the Mycoplasma genome / Rasin R. et al. // J. Biol. Med. 1983.-№56.-P. 357.

66. Choi Y.K., Goyal S.M., Joo H.S. Retrospective analysis of etiologic agents associated with respiratory diseases in pigs // Can. Vet. J. 2003. - Vol. 44. -P. 735-737.

67. Chronological'study of Mycoplasma hyopneumoniae infection, seroconversion and associated lung lesions in vaccinated and non-vaccinated pigs / M. Sibila et al. // Vet. Microbiol. 2007. - Vol. 122. - P. 97-107.

68. Comparison of transmission of Mycoplasma hyopneumoniae in vaccinated and non-vaccinated populations / T. Meyns et al. // Vaccine. 2006. - Vol. 24. -P. 701-7086.

69. Construction of the mycoplasma evolutionary tree from 5S rRNA sequence data / M. J. Rogers et al. // PNAS. 1985. - Vol. 82. - P. 1160-1164.

70. Controlling Mycoplasma hyopneumoniae / F. Joisel et al. // Merial, France. -2001.

71. Current perspectives on the diagnosis and epidemiology of Mycoplasma hyopneumoniae infection / M.Sibila et al. // Vet. J. 2008. - Vol. 3. - P. 125129.

72. Debey M.C., Roth J.A., Ross R.F. Enhancement of the increase in intracellular calcium concentration in stimulated" neutrophils by Mycoplasma hyopneumoniae H Vet. Res. Commun. 1993. - Vol. 17. - P. 249-257.

73. Detection and treatment of mycoplasma contamination in cultured cells // H. Jung et al. // Med. J. 2003. -Vol. 26. - P. 250-258.1.l

74. Detection of Mycoplasma hyopneumoniae in bronchoalveolar lavage fluids of pigs by PCR / A.K. Baumeister, M. Runge, M. Ganter, A.A. Feenstra // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 1984-1988.

75. Detection of Mycoplasma hyopneumoniae DNA by the polymerase chain reaction / Harasawa R. et al. // Molecular Cell Probes. 1991. - Vol. 5. - P. 103-109.

76. Detection of Mycoplasma hyopneumoniae in lung and nasal swab samples from pigs by nested PCR and culture methods / Y. Otagiri et al. // J. Vet. Med. Sei. 2005. - Vol. 67. - P. 801-805.

77. Detection of Mycoplasma hyopneumoniae in nose swabs from pigs by in vitro amplification of the 16S rRNA gene / L.G. Mattsson et al. // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P. 893-897.

78. Detection of Mycoplasma hyopneumoniae in porcine nasal swabs using realtime PCR / F. Zeeh et al. // Proceedings 18th IPVS Congr. Hamburg, Germany, 2004. - Vol. 1. - P. 178.

79. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyorhinis antigens in pulmonary lesions of pigs suffering from respiratory syndrome / K. Kawashima et al. // J. Comp. Pathol. 1996. - Vol. 114.-P. 315-323.

80. Detection of respiratory pathogens in porcine lung tissue and lavage fluid / L. Moorkamp et al. // Vet. J. 2008. - Vol. 175. - P. 273-275.

81. Development of two real-time PCR assays for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in clinical samples / C.R. Dubosson et al. // Vet. Microbiol. -2004.-Vol. 102.-P. 55-65.

82. Differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae, M. flocculare and M hyorhinis on the basis of amplification of a 16S rRNA gene sequence / G.W. Stemke et al. // Am. J. Vet. Res. 1994. - Vol. 55. - P. 81-84.

83. Diversity of Mycoplasma hyopneumoniae in pig farms revealed by direct molecular typing of clinical material / D. Mayor et al. // Vet. Res. — 2007. -Vol. 38.-P. 391-398.

84. Done S.H. Enzootic pneumonia (mycoplasmosis) revisited // Pig Vet. J. 1996. -Vol. 38.-P. 40-61.

85. Done S.H. Porcine respiratory disease complex (PRDC) // Pig J. 2002. - Vol. 50.-P. 174-196.

86. Dussurget O., Roulland-dussoix D. Rapid, sensitive PCR-based detection of Mycoplasmas in simulated samples of animal sera // Appl. Environ. Microbiol. 1994.-Vol. 60.-P. 953-959.

87. Dybvig K. Molecular biology of mycoplasmas // Annu. Rev. Microbiol. -1996.-Vol. 50.-P. 25-57.

88. Dybvig K. Mycoplasmal genetics // Annu. Rev. Microbiol. 1990. - Vol. 44. -P. 81-104.

89. Easterday B.C. Swine influenza // Diseases of Swine / ed. D.J. Taylor. Ames, Iowa, USA, 1999. - P. 277-290.

90. Effect of sow vaccination against Mycoplasma hyopneumoniae on sow and piglet colonization and seroconversion, and pig lung lesions at slaughter / M. Sibila et al. // Vet. Microbiol. 2008. - Vol. 127. - P. 165-170.

91. Effect of vaccination against Mycoplasma hyopneumoniae in pig herds with an all-in/all-out production system / D. Maes et al. // Vaccine. 1999. - Vol. 17. -P. 1024-1034.

92. Enzootic pneumoniae in pigs / D. Maes et al. // Vet. Quart. 1996. - Vol. 18. -P. 104-109.

93. Erlandson K.R. Evaluation of three serum antibody enzyme-linked immunosorbent assays for Mycoplasma hyopneumoniae II J. Swine Health and Production. -2005. Vol. 13. - P. 198-203.

94. Evaluation of tRNA gene for identification of Mollicutes / T. Stakenborg et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 4558-4566.

95. Fagan P.K., Djordjevic S.P., Chin J. Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimumum uroA expressing a recombinant Mycoplasma hyopneumoniae antigen (NrdF) // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 2502-2507.

96. Fano E., Pijoan C.,. Dee S. A longitudinal assessment of Mycoplasma hyopneumoniae serology, comparing three different infection routes and two ELISA tests // Proceedings 18th IPVS Congr. Hamburg, Germany. - 2004: -Vol. 1. - P. 128.

97. Fano E., Pijoan C., Dee S. Dynamics and persistence of Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs // Can. J. Vet. Res. 2005. - Vol. 69. - Pi 223228.

98. Frey J., Haldimann A., Nicolet J. Chromosomal heterogeneity of various Mycoplasma hyopneumoniae field strains // Int. J. System. Bacteriol. 1992. -Vol. 42. P. 275-280.

99. Friis N.F. Mycoplasma hyorhinis in the etiology of serositis among piglets // Acta Vet. Scand. 1994. - Vol. 35. - P. 93-98.

100. Galfre G., Howe S.C., Milstein C. Antibodies to major histocom-patibility antigens produced by hybrid cell lines // Nature. 1977. - Vol. 266. - P. 550552.

101. Genus- and species-specific identification of Mycoplasmas by 16S rRNA amplification / Kuppeveld F.J.M. et al. // Appl. Envir. Microbiol; 1992. -Vol. 58.-P. 2606-2615.

102. Global transcriptional analysis of Mycoplasma hyopneumoniae following exposure to hydrogen peroxide / E.R. Schafer et al. // Microbiology. 2007. -Vol. 153.-P. 3785-3790.

103. Gundersen D.E., Lee I.M., Davis R.E. Phylogeny of mycoplasma like organisms: a basis for their classification // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. - P. 5244-5254.

104. Halbur P.G. Emerging and recurring diseases in growing pigs. 2001. - P. 435-437.

105. Harasawa R., Asada K., Kato I. A novel repetitive sequence from Mycoplasma hyopneumoniae II J. Vet. Med. Sei. 1995. - Vol. 57. - P. 557558.

106. Holko J., Urbanova J., Holkova T. Diagnostics of main bacterial agents of porcine respiratory diseases complex (PRDC) using PCR detection of Mycoplasma hyopneumoniae II Vet. Med. 2004. - Vol. 49. - P. 35-41.

107. Hsu T., Artiushin S., Minion F.C. Cloning and functional analysis of the P97 swine cilium adhesion gene of Mycoplasma hyopneumoniae II J. Bacteriol. -1997.-Vol. 179.-P. 1317-1323.

108. Hsu T., Minion F.C. Identification of the cilium binding epitope of the Mycoplasma hyopneumoniae P97 adhesin // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. -P. 4762-4766.

109. Humoral immune response to Mycoplasma hyopneumoniae in sows and offspring following an outbreak of mycoplasmosis / P. Wallgren et al. // Vet. Microbiol. 1998. - Vol. 60. - P. 193-205.

110. Identification and characterization of cytopathogenic Mycoplasma hyorhinis from swine farms with a history of abortions /"J.H. Shin et al. // J. Vet. Med. Sei. 2003. - Vol. 65. - P. 501-509.

111. Identification and mapping of immunogenic region of Mycoplasma hyopneumoniae P65 surface lipoprotein expressed in Escherichia coli from a cloned genomic fragment / Kim M. F. et al. // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58.-P. 2637-2643.

112. Immune response of gnotobiotic piglets against Mycoplasma hyopneumoniae / J.Muneta et al. // J. Vet. Med. Sei. 2008. - Voll 70. - P. 1065-1070.

113. Immunoblot assays using recombinant antigens; for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae antibodies / S. Subramaniam et al. // Vet. Microbiol: 2000. - Voli 75: - P. 99-106.

114. Immunoblotting analysis of antibody response in swine experimentally inoculated with Mycoplasma hyopneumoniae / Y. Mori // Vet. Immunol. Immunopathol. 1988. - Vol. 19. - P. 239-250.

115. Immunological and pathological reactions in piglets experimentally infected with Mycoplasma hyopneumoniae and/or Mycoplasma flocculare / M. Strasser et al. // Vet. Immun. Immunopathol. 1992. - Vol. 31. - P. 141-153.

116. Isolation, identification and diversity of Mycoplasma hyopneumoniae strains / T. Stakenborg et al. // Enzootic Diseases. 2002. - Vol. 4. - P. 459463.

117. Isolation of Mycoplasma hyopneumoniae from different sampling sites in experimentally infected and contact SPF piglets / C. Marois et al. // Vet. Microbiol. 2007. - Vol. 120. - P. 96-104.

118. General properties of mollicute genomes / P. Sirand-Pugnet et al.,// Res. Microbiol. 2007. - Vol. 158 - P. 754-766.

119. Jang E.J., Kim T.J. In vitro expression of the 50-kDa and 30-kDa fragments of the P97 adhesin of Mycoplasma hyopneumoniae in Escherichia coli and their use for serodiagnosis // Can. J. Vet. Res. 2007. - Vol. 71. - P. 278-282.

120. Kapur V., Elam M.R., Pawlovich T.M. Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern United States / // J. Gen. Virol. 1996. - Vol. 77. - P. 1271-1276.

121. Kazama S., Yagihasshi T., Morita T. Isolation of Mycoplasma hyorhinis and Mycoplasma argininvtrom the ears of pigs with otitis media // Res. Vet. Sci. — 1994.-Vol. 56.-P. 108-110.

122. Keffaber K. K. Reproductive failure of unknown etiology // Am. Assoc. Swine Pract. Newslatter. 1989. - Vol. 1. - P. 1-9.

123. Kleven S.H. Mycoplasmas in the Etiology of Multifactorial Respiratory Disease // Poultry Sci. 1998. - Vol. 77, №8. - P. 1146-1149.

124. Kobish M., Friis N.M. Swine mycoplasmoses // Rev. Sci. Off. Int. Epizoot. -1996.-Vol. 15.-P. 1569-1606.

125. Kohne K., Huebert P. Mixed respiratory infections associated with the porcine respiratory disease complex detected with multiplex-PCR // Proceeding 19th Int. Congr. Pigs Vet. Soc. 2006. - P. 313.

126. Koostra W., Adams J., Smith P. In vitro selection and identification of antibiotic-resistant Mycoplasma mutants // J. Bacteriol. 1966. - Vol. 91, №6.-P. 23-86.

127. Kwon D., Chae C. Detection and localization of Mycoplasma hyopneumoniae DNA in lungs from naturally infected pigs by in situ hybridization using a digoxigenin-labeled probe // Vet. Pathol. 1999. - Vol. 36.-P. 308-313.

128. Kwon D., Choi C., Chae C. Chronologic localization of Mycoplasma hyopneumoniae in experimentally infected pigs // Vet. Pathol. 2002. - Vol. 39.-P. 584-587.

129. Landis J. R., Koch G. G. The measurement of observer agreement for categorical data // Biometrics. 1977. - Vol. 33. - P. 159-174.

130. Levonen K. The detection of respiratoiy diseases in swine herds by means of antibody assay on colostrum from sows: acad. diss. / Faculty of Veterinary Medicine of the University of Helsinki. Helsinki, 2000. - 91 p.

131. Loreto E.L.S., Ortiz M.F., Porto J.I.R. Insertion sequences as variability generators in the Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma synoviae genomes // Gen. Molec. Biol. 2007. - Vol. 30. - P. 283-289.

132. Madden D.L., McCullough N.B. Basic biological characteristics of Mycoplasma// J. Am. Vet. Med. Assoc. 1967. - №151. - P. 16-38.

133. Maes D., Segales J., Meyns T. Control of Mycoplasma hyopneumoniae infections in pigs // Vet. Microbiol. 2007. - Vol. 126. - P. 297-309.

134. Microorganisms associated with pneumonia in slaughter weight swine / R.B. Morrison et al. // Can. J. Comp. Med. 1985. - Vol. 49. - P. 129-137.

135. Minion C.F. Molecular pathogenesis of mycoplasma animal respiratory pathogens // Frontiers Biosci. 2002. - Vol. 7. - P. 1410-1422.

136. Minion C.F., Lefkowitz E.J., Madsen M.L. The genome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 232, the agent of swine mycoplasmosis // J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186. - P. 7123-7133.

137. Mitochondrial activities in human cultured skin fibroblasts contaminated by Mycoplasma hyorhinis / N. Darin et al. // BMC Biochem. 2003. - Vol. 4. -P. 15.

138. Mori Y., Hamaoka T., Sato S. Use of monoclonal antibody in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against Mycoplasma hyopneumoniae // Isr. J. Med. Sei. — 1987. Vol. 23. - P. 657-662.

139. Mrazek J. Analysis of distribution indicates diverse functions of simple sequence repeats in mycoplasma genomes // Molec. Biol. Evol. 2006. - Vol. 23.-P. 1370-1385.

140. Mycoplasma diseases of animals / J.W. Simeska et al. // Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis / ed. J. Maniloff [et al.]. Washington, 1992.-P. 391-415.

141. Mycoplasma hyopneumoniae increases intracellular calcium release in porcine ciliated tracheal cells / S-C. Park et al. II Infect. Immun. 2002. -Vol. 2.-P. 126-129.

142. Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs: duration of the disease and evaluation of fout diagnostic assays / V. Sorensen et al. // Vet. Microbiol. -1997.-Vol. 54.-P. 23-34.

143. Mycoplasma hyorhinis in Taiwan: Diagnosis and isolation of swine pneumoniae pathogen / J.H.Lin et al. // Vet. Microbiol. 2006. - Vol. 115. -P. 111-116.

144. Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis / J.S. Ellison et al. Am. Soc. Microbiol. 1992. - P. 491-504.

145. O.I.E. WAHID, 2007. URL: www/oie.int/wahis/public.php?page=home.

146. Patterns of Mycoplasma hyopneumoniae infections in Belgian farrow-to-finish pig herds with diverging disease-course / J. Vicca et al. // J. Vet. Med. Ser. B. 2002. - Vol. 39. - P. 349-353.

147. PCR-based detection of Mycoplasma species / H. Okada et al. // J. Microbiol. 2005. - Vol. 44. - P. 42-49.

148. Pollack J.D., Wiliams M.V., Banzon J. Comparative metabolism of Mesoplasma, Entomoplasma, Mycoplasma and Acholeplasma II Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. - Vol. 46. - P. 885-890.

149. Polymerase chain reaction for Mycoplasma detection in tracheobronchiolar washings from pigs / B. Blanchard et al. // Mol. Cell Probes. 1996. - Vol. 10.-P. 15-22.

150. Pommier P., Pagot E., Keita A. Epidemiological study of porcinereproductive and respiratory syndrome virus in French farrowing-to-finishing>herds // Proceedings 4l Int. Symp. Emerging and Re-emerging Pig Dis. — Rome, 2003.-P. 62-63.

151. Prevalence of respiratory diseases and their association with growth rate and space in randomly selected swine herds / M.R. Wilson et al. // Can. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 50. - P. 209-216.

152. Proceedings of the 30th-Annual Meeting of the American Association of Swine Practitioners: Abstracts. St. Louis, 2007. - 540 p.

153. Protein and antigenic variability among Mycoplasma hyopneumoniae strains by SDS-PAGE and immunoblot / P. Assuncao, C. De la Fe, A.S. Ramirez, O. Gonzales Llamazares // Vet. Res. Commun. 2005. - Vol. 29. - P. 563-574.

154. Protein variability among Mycoplasma hyopneumoniae isolates / D. Calus et al. // Vet. Microbiol. 2007. - Vol. 120. - P. 284-291.

155. Rapid detection of mycoplasma contamination in cell cultures using SYBR Green-based real-time polymarese chain reaction / Y. Tshikawa et al. // In vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2006. - Vol. 42. - P. 63-69.

156. Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent assay. Comparison of computation methods for measuring antibody titers in a single serum dilution / D. B. Snyder et. al. // Avian Dis. 1982. - Vol. 27, №2. - P. 474-484.

157. Rapp-Gabrielson V. Evaluation of duration of immunity after vaccination ofswine with a single dose of Mycoplasma hyopneumoniae bacterin (M+Pac ) // Proceedings Am. Swine Vet.: Annual Meeting. 2002. - P. 105.

158. Rasin S. Characteristics of the mycoplasmas as a group // Meth. Mycoplasmol. N. Y. - 1983. - P. 3-7.

159. Rautiainen E.J. Mycoplasma hyopneumoniae aspects of epidemiology, protection and control: acad. diss. / Faculty of Veterinary Medicine of the University of Helsinki, 2001.- 106 p.

160. Razin S., Freundt E.A. The Mollicutes, Mycoplasmatales and Mycoplasmatacae // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / ed. N. Krieg, J.G. Holt.-Baltimore; London, 1984. Vol. 1. - P. 740-793.

161. Razin S. The genera*Mycoplasma, Ureaplasma, Acholeplasma, Anaeroplasma and Asteroplasma // The Prokaryotes / ed. A. Balows. N. Y., 1991. - P. 19371959.

162. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas //Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 64. - P. 1094-1156.

163. Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: an alternative to the TaqMan assay for a relative quantitation of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions / F. Ponchel et al. // BMC Biotechnol. -2003.-Vol.3.-P. 1-13.

164. Reiterated repeat region variability in the ciliary adhesion gene of Mycoplasma hyopneumoniae / J.L. Wilton et al. // Microbiol. 1998. - Vol. 144.-P. 1931-1943.

165. Rolle M. Bakterien ohne Zellwand, Mykoplasmen // Medizinische Microbiologie, Infektions- und Seuchenlehre. 6 Auflage. - Stuttgart, 1993. -P. 797-810.

166. Ruiz A., Galina 1., Pijoan C. Mycoplasma hyopneumoniae colonization of pigs sired by different boars // Can. J. Vet. Res. 2002. - Vol. 66. - P. 79-85.

167. Schmidt J.A., Browning G.F., Markham P.F. Mycoplasma hyopneumoniae p65 surface lipoprotein is a lipolytic enzyme with a preference for shorter-chain fatty acids // J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186. - P. 5790-5798.

168. Schwartz K. Pathological diagnosis of mycoplasmosis in swine // Swine Mycoplasmal Pneumonia Technical Workshop, Kansas City, MO, FDA/CVM. -2002.

169. Sensitive detection of mycoplasmas in cell cultures by using two-step polymerase chain reaction / R. Harasawa et al. // J. Vet. Med. Sei. 1993. - P. 227-232.

170. Seroepidemiology of M. hyopneumoniae in pigs from farrow-to-finish farms /E.A. Leon et al. //Vet. Microbiol. 2001. - Vol. 78. - P. 331-341.

171. Shoukri M. N., Edge V.L. Statistical Methods for Health Sciences. N. Y.: CRC Press Inc., 1996.

172. Sibila M., Olvera A., Calsamiglia M. Development of a real-time PCR (TaqMan) assay for Mycoplasma hyopneumoniae detection and quantification

173. Proceedings 18th IPVS Congr., Hamburg, Germany. 2004. - Vol. 1. - P. 1568-1578.

174. Sieverding E. Handbuch Gesunde Schweine. Osnabrück, 2000. - P. 176179.

175. Stark K.D., Keller H., Eggenderger E. Risk factors for the reinfection of specific pathogen free breeding herds with enzootic pneumoniae // Vet. Ree. — 1992.-Vol. 131.-P. 532-535.

176. Stark K.D., Nicolet J., Frey J. Detection of Mycoplasma hyopneumoniae by air sampling with a nested PCR assay // Appl. Envir. Microbiol. 1998. - Vol. 64. - P. 543-548.

177. Stemke G.W., Robertson J.A. The growth response of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma flocculare based upon ATP-dependent luminometry // Vet. Microbiol. 1990. - Vol. 24. - P. 135-142.iL

178. Stevenson G.W. Bacterial pneumoniae in swine // Proc. 15 IPVS Congress. -1998.-P. 11-20.

179. Stipkovits L. Isolation and pathogenecity of mycoplasmas from geese // Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur). 1984. - №135A . - P. 91.

180. Swine and poultry pathogens: the complete genome sequences of two strains of Mycoplasma hyopneumoniae and a strain of Mycoplasma synoviae / A.T.R. Vasconcelos, H.B. Ferreira, C.V. Bizarro, S.L. Bonatto // J. Bacteriol. 2005. -Vol. 187.-P. 5568-5577.

181. Thacker E.L., Thacker B.J. MH and PRRS in the Finisher // American Association of Swine Practitioners. 1999.-P. 145-146.

182. Thacker E.L., Thacker B., Minion F.C. Development of improved diagnostic PCR assays for Mycoplasma / College of Veterinary Medicine Iowa State University Ames.

183. Thacker E.B. Factors affecting the efficacy of the Mycoplasma hyopneumoniae vaccine / Veterinary Medical Research Institute, Iowa State University.

184. Thacker E.L. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae // J. Swine Health Prod. 2004. - Vol. 12. - P. 252-254.

185. The transmission of Mycoplasma hyopneumoiae between sow and piglets during the first 14 days of piglets life / E. Rautianien et al. // 15th Congr. Int. Pig Vet. Soc. Birmingham, 1998. - P. 250.

186. Ultrastructural observation of the airways of recovered and susceptible pigs after inoculation with Mycoplasma hyopneumoniae / L.F. Irigoyen et al. // Pesq. Vet. Bras. 1998. - Vol. 18. - P. 135-141.

187. Uphoff C.C., Drexler H.G. Detection of mycoplasma contaminations in cell cultures by PCR analysis II Hum. Cell. 1999. - Vol. 12. - P. 229-236.

188. URL: www.mcxpx.ru/basegvc/vetzac/document/351.html/

189. Use of a Mycoplasma hyopneumoniae nested polymerase chain reaction test to determine the optimal sampling sites in swine / K.T. Kurth et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 2002. - Vol. 14. - P. 463-469.

190. Use of a novel serum ELISA method and the tonsil-carrier state for evaluation of Mycoplasma hyosynoviae distributions in pig herds with or without clinical arthritis / E. O. Nielsen et al. // Vet. Microbiol. 2005. - Vol. 111. - P. 41-50.

191. Variable number of tandem amino acid repeats in adhesion-related CDS products in Mycoplasma hyopneumoniae strains / L.A. de Castro et al. // Vet. Microbiol. 2006. - Vol. 116. - P. 258-269.

192. Veilleux C., Razin S., May L.H. Detection of mycoplasma infection by PCR // Molecular and Diagnostic Procedures on Mycoplasmology. — 1996. Vol. 2. -P. 431-438.

193. Vengust G., Valencak Z., Bidovec A. A serological survey of selected pathogens in wild boar in Slovenia // J. Vet. Med. Ser. B. 2006. - Vol. 52. - P. 24-27.

194. Vicente J., Leon-Vizcaino L., Gortazar C. Antibodies to selected viral and bacterial pathogens in European wild boars from southcentral Spain // J. Wildl. Dis. 2002. - Vol. 38. - P. 649-652.

195. Welsh J., McClelland M. Genomic fingerprints produced by PCR with consensus tRNA gene primers // Nucleic Acids Res. 1991. - Vol. 19. - P. 861-866.

196. Woeste K., Grosse Beilage E. Transmission of agents of the porcine respiratory disease complex between swine herds // Dtsch. Tieravztl. Wochenschr. 2007. - Bd. 114. - P. 364-366.

197. Yagihashi T., Kazama S., Tajima M. Seroepidemiology of mycoplasmal pneumonia of swine in Japan as surveyd by an enzyme-linked immunosorbent assay //Vet. Microbiol. 1993. - Vol. 34. - P. 155-166.

198. Zimmermann W., Tshudi P., Nicolet J. ELISA-Serologie in Blut und Kolostralmilch: eine Möglichkeit zur Überwachung der enzootischen Pneumoniae (EP) in Schweine-Beständen// Schweiz. Arch. Tierheilk. 1986. -Bd. 128.-P. 299-306.

Информация о работе

Бирюченкова, Марина Вячеславовна
кандидата биологических наук
Покров, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка методов диагностики инфекции, вызываемой Mycoplasma hyopneumoniae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы