Разработка методов детекции нейрональных a7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов

Шелухина, Ирина Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методов детекции нейрональных a7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов детекции нейрональных a7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов"

Учреждение Российской Академии Наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М.М. Шемякина иЮ.А. С

Шелухина Ирина Валерьевна

Разработка методов детекции нейрональных а7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов

Специальность: 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени Кандидата биологических наук

Москва-2011

1 /, ДПР 2011

4843864

Работа выполнена в Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Научный руководитель:

д.х.и., профессор, чл.-корр. РАН Цетлин Виктор Ионович

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор, чл.-корр. РАН Габнбов Александр Габибович

д.б.н., профессор Евгсньев Михаил Борисович

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук

Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита состоится 2011 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан /и&^шА 2014, г. .

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Среди нейрональных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) особое место занимает гомопентамерный а.1 нАХР. Данный подтип, вероятно, является наиболее широко распространенным нАХР в организме, где он встречается как в нервной системе, так и за ее пределами. Он также уникален своей аминокислотной последовательностью, фармакологическим профилем и наиболее высокой проницаемостью для ионов кальция. Изменение уровня а7 нАХР в головном мозге наблюдается при шизофрении, а также связано с нарушением холинергической передачи и ухудшением когнитивных способностей при таких нейродегенеративных заболеваниях как болезни Альцгеймера и Паркинсона. В последнее время появились работы, указывающие на возможность изменения уровня нАХР на форменных элементах крови при различных патологических состояниях. Таким образом, как для диагностики, так и для исследования механизмов возникновения и протекания заболеваний очевидна необходимость разработки надежных методов для обнаружения и количественного определения уровня а7 нАХР.

При постановке подобных задач классическим подходом является использование антител, однако недавние исследования показали, что многие широко используемые антитела против а7-субъединицы нАХР неспецифически окрашивают ткани нокаутных по данному гену мышей (а7-/-). Для повышения надёжности результатов в сочетании с антителами применяют а-нейротоксины из ядов змей, являющиеся высокоаффинными специфическими лигандами некоторых подтипов нАХР. В то же время токсины редко имеют сродство только к одному подтипу рецепторов, что часто затрудняет интерпретацию результатов, особенно, учитывая обнаружение в последние годы нАХР в нетипичных для них тканях, а также большее разнообразие их подтипов, чем ранее предполагалось. В связи с этим актуальной является разработка метода избирательной детекции а7 нАХР.

Цель работы. Цель настоящего исследования состояла в разработке методов О специфической детекции нейрональных а7 нАХР с использованием антител и

токсинов. Задачами представленной работы стали получение и тестирование набора поликлональных антител против синтетических фрагментов а7-субъединицы нАХР и различных производных длинных а-нейротоксинов из ядов змей, в том числе их коммерчески доступных конъюгатов. Применимость этих инструментов для поставленной цели исследовалась в ряде методов анализа с использованием как рекомбинантных, так и природных а7 нАХР. Главной задачей стала разработка метода избирательной гистохимической детекции а7 нАХР, основанного на применении флуоресцентно-меченого а-нейротоксина длинного типа в качестве маркера и комбинации длинных и коротких а-нейротоксинов в качестве специфических ингибиторов с последующей его апробацией для исследования экспрессии и транспорта а7 нАХР нейронами спинномозговых ганглиев крыс.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе получен набор поликлональных антител против синтетических фрагментов а7-субъединицы нАХР и впервые проведено комплексное тестирование их специфичности с использованием рекомбинантных экстрацеллюлярного домена а7-субъединицы нАХР и полноразмерного а7 нАХР, природных источников рецепторов, а также тканей мышей, нокаутных по гену а7-субъединицы нАХР. Оптимизирована методика получения мембранных препаратов тканей животных и их стандартизации для последующей количественной оценки содержания а7 нАХР методом радиолигандного анализа. Впервые установлено, что биотинилированный а-кобратоксин может быть использован для детекции а7 нАХР в мембранных препаратах нервной ткани. Разработан метод избирательной гистохимической детекции а7 нАХР, основанный на применении флуоресцентно-меченого а-нейротоксина длинного типа в качестве маркера и комбинации длинных и коротких а-нейротоксинов в качестве специфических ингибиторов. С использованием предложенного метода и дополнительных маркеров впервые были охарактеризованы нейроны спинномозговых ганглиев, экспрессирующие и транспортирующие а7 нАХР. Обнаружено, что по меньшей мере четверть из них являются ноцицептивными

нейронами. В практическом плане разработанные методы детекции важны для изучения роли а7 нАХР в различных патологических состояниях.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), на Восточно-европейском симпозиуме «Центральная и периферическая синаптическая передача» (Варна, Болгария, 2006), конференции «Ионные каналы: структура и функции» (С.-Петербург, 2009), IV российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на 4-й конференции Европейского нейрохимического общества (Лейпциг, Германия, 2009), на конференции Нейробиологического общества по нАХР (Чикаго, США, 2009), на международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва-Пущино, 2009), на международном конгрессе «Молекулярные механизмы неврологических и психических расстройств» (Мартин, Словакия, 2009), на 4-й конференции Международного нейрохимического общества (Эриче, Италия, 2010), на немецко-российском симпозиуме «Молекулярная нейробиология сегодня и завтра» (Берлин, Германия, 2010). По теме диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста и включает 48 рисунков и 6 таблиц, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 323 наименования.

Содержание работы

Исследования с использованием антител

На первом этапе данной работы была протестирована специфичность набора поликлональных антител против синтетических фрагментов различных доменов а7-субъединицы нАХР (табл. 1). В качестве контроля были использованы иммуноглобулины преиммунной сыворотки кроликов, антитела к аналогичным участкам других нейрональных субъединиц нАХР и

рекомбинантного экстрацеллюлярного домена al-субъединицы нАХР мышечного типа (табл. 1).

Таблица 1. Связывание политональных антител с нАХР мышечного типа Torpedo californica и экстрацеллюлярным доменом а7-субъединицы нАХР.

Эпитоп Иммунный ответ Расположение эпитопов в аминокислотной последовательности нАХР в рамках современной пространственной модели

нАХР T.californica экстр ацеллюлярный домен а7-субъединицы

ИФА Вестерн-блоттинг ИФА Вестерн-блоттинг

а7(1-23) - - ++ + Л'-концевая а-спираль и часть следующей за ней петли экстрацеллюлярного домена

а7(8-25) +/- - +/- +

а2(11-27) + - - -

а4(8-22) +/- - +/- +

Р2(6-22) +/- - +

а7(179-190) +/- - ++ + Лигандсвязывающий участок экстрацеллюлярного домена

аЗ(181-192) - - + -

а4{181—192) +/- -

«5(180-190) - - -

а7(322-338) + - +/- - Фрагмент цитоплазматической петли

а4(342—371) +/- - - -

(52(330-346) + - -

al(l-209) ++ al + + Экстрацеллюлярный домен

На первом этапе антитела были протестированы с использованием

«модельных систем»: рекомбинантного экстрацеллюлярного домена а7-субъединицы нАХР, мембран электрического органа ската Torpedo californica, содержащих нАХР мышечного типа, и крысиной гипофизарной клеточной линии GH4C1, экспрессирующей рекомбинантный al нАХР человека и не содержащей эндогенных нАХР. По результатам ИФА и Вестерн-блотгинга с экстрацеллюляным доменом а7-субъединицы нАХР и мембранами T.californica нами были выбраны антитела против синтетических пептидов а7(1—23) и а7(179-190) как наиболее перспективные для детекции а7 нАХР (табл. 1).

Дальнейшее тестирование данных антител методом ИФА показало их высокое сродство к клеткам GH4C1 на фоне отсутствия связывания антител против Р2-субъединицы и иммуноглобулиновой фракции преиммунной сыворотки кролика (рис. 1).

Далее методом Вестерн-блоттинга была исследована способность антител к а7(1-23) и а7(179-190) связываться с природными объектами, отличающимися сравнительно высоким содержанием а7 нАХР: мембранными препаратами

гиппокампа и мозга крысы, а также гиппокампа и таламуса человека (рис. 2). Антитела против а 7(1-23) специфично окрашивали белковую полосу с молекулярной массой ~ 62 кДа на всех исследованных мембранных препаратах, в то же время антитела против а7( 179—190) обнаруживали белковые полосы массой ~ 53 и 54 кДа (рис. 2). В контрольных опытах при преинкубации антител к а7(1-23) и а7(179—190) с пептидом а7(1-23) и с рекомбинантным экстрацеллюлярным доменом а7(7-208), соответственно, окрашивания данными антителами мембранных препаратов мозга не наблюдалось (рис. 2).

1.8

2 1.6 (М

01 1.4

7 1,2

о о

Е 1,о

о с

с 0,8 к го

о 0.6 ш

? 0,4

0,20,0

концентрация антител, мкг^мл ■■ Ю

ЕИЗ 5

! I 2,5 £ЕЗ 1,25 Е2Э 0,625 ^ 0.3125

Рис. 1. ИФА связывания поликлональных антител с гипофизарной клеточной линией йН^С/, экспрессирующей а! нАХР человека.

АвеЦЬ

% ш

гиппокамп таламус человека (а) человека и мозг крысы (б)

В связи с неоднозначностью литературных

данных нельзя было определить, какая из

окрашиваемых белковых полос соответствует

а7-субъединице нАХР. Для разрешения

противоречивых результатов были проведены

эксперименты с тканями мышей, нокаутных по

гену а7-субъединицы нАХР (а7—/-). Для контрольных опытов использовались

ткани мышей из того же помета, гомозиготных по нативному варианту гена а7-

субъединицы нАХР (а7 +/+).

мозг крысы гиппокамп

преинкубация антител с крысы

доменом а7(7-208) и пептидом а7(1-23)

кДа _1__2

116 ш

66,2 -шт 45 шт

35 «ИИ* Шш 35 ОП

«да) (а) (б) (а) (б)

Рис. 2. Вестерн-блоттинг мембранных препаратов отделов мозга с аффинно-очищенными антителами (1) к а7(179-190) и (2) к а7(1~23).

Антитела к а7( 179-190) с одинаковой эффективностью связывались с

гомогенатами мозга а7+/+ и а7-/- мышей как в ИФА, так и при Вестерн-

«Да 2 кДа 1 2 кДа 1

..... 94

66,2 V* УМ 67— 67

45 # " Ш 43 — 43

блоттинге (рис. 3). Стоит отметить, что при взаимодействии с мембранным препаратом мозга мыши антитела к а7(179-190) обнаруживали единственную белковую полосу с молекулярной массой ~ 54 кДа, а при использовании гомогената мозга мыши данные антитела дополнительно окрашивали две белковые полосы с большей молекулярной массой (рис. 3).

Рис. 3. ИФА и

Вестерн-блоттинг взаимодействия антител к а7(179-190) с препаратами мозга мышей.

Специфичность антител к а7(1-23) исследовалась с использованием криостатных срезов тканей нокаутных мышей (а7-/-). Хотя при разработке иммуногистохимического протокола данные антитела окрашивали тела нейронов в гиппокампе, области мозга с наиболее высоким содержанием а7 нАХР, при дальнейшем тестировании они проявили неспецифическое связывание со срезами пищевода и легких а7—/— мышей (рис. 4).

Рис. 4. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к а7(1-23) криостатных срезов пищевода (верхний ряд) и легких (нижний ряд) а7— /— и а7+/+ мышей.

Таким образом, протестированные антитела к а7(179-190) и к а7(1—23) могут применяться для работ с рекомбинантными белками: экстрацеллюлярными доменами а7-субъединицы нАХР и полноразмерными а7 нАХР. Несмотря на то, что а7 подтип является одним из наиболее распространённых нАХР в организме, содержание этих рецепторов по отношению к другим белкам недостаточно для надежного анализа с помощью антител (например, исходя из литературных данных, содержание ГАМК- или глутаматергических рецепторов превышает содержание а7 нАХР на несколько порядков). В связи с этим далее для

Гомогенаты мозга а7+/+ и а7 -/- мышей

Мозг мыши

Б о.з

кДа

116 95 72 56 43 34

За; Еа 2с

концентрация антител к а7(179-190), мкг/мл

■В

% \ . а7+/+ # ф" I 1 * ' 100 мш

разработки метода детекции было решено использовать специфические антагонисты al нАХР - трехпетельные длинные а-нейротоксины из ядов змей.

Исследования с использованием токсинов

а-Нейротоксины длинного типа (66-75 а.о., 5 дисульфидньгх связей) являются селективными конкурентными антагонистами а7, а9 и мышечного типа нАХР. В данной работе были использованы полученные в нашем отделе их меченые производные - биотинилированный а-кобратоксин (биот-СТХ) и FITC-меченый а-кобратоксин (FITC-CTX). а также коммерчески доступные производные - йодированный а-бунгаротоксин (['^IJ-aBgt) и Alexa Fluor 488 - меченый aBgt (Alexa-aBgt).

Йодированный aBqt

Метод радиолигандного анализа с использованием [l23I]-aBgt является традиционным для обнаружения al нАХР в гомогенатах и мембранных препаратах тканей. Достоинствами этого метода являются возможность количественной оценки содержания рецепторов и высокая чувствительность. При этом не следует забывать о трудностях стандартизации образцов для количественного анализа при высокой чувствительности метода и небольших различиях в содержании рецепторов в экспериментальной и контрольной группах животных. В связи с этим нами была критически проанализирована и оптимизирована методика получения мембранных препаратов тканей животных и их стандартизации. С использованием разработанной методики было показано, что иммунизация синтетическим фрагментом a7(173-193) предотвращает снижение уровня al нАХР в мозге мышей, вызванного моделированием болезни

Альцгеймера (рис. 5).

Рис. 5. Влияние иммунизации пептидом а7(173-193) на уровень содержания а7 нАХР в коре больших полушарий мышей с моделью болезни Альцгеймера (БА). Проведен радиолигандный анализ связывания [,2yI]-aBgt с мембранными препаратами. К - контрольная группа мышей.

Другим классическим методом детекции al нАХР с помощью [li:>I]-aBgt является авторадиография, существенные минусы

иммунизация пептидом <х7(173-193)

БА БА

которой - низкое разрешение и невозможность выявления нескольких белков одновременно. Для гистохимических задач, требующих детального анализа экспрессии а7 нАХР на уровне отдельных клеток и их отростков, а также изучения сопутствующих веществ, более перспективными казались биотинилированные и флуоресцентные производные а-нейротоксинов.

Биотинилированный СТХ

Ранее методом радиолигандного анализа с использованием [1251]-аЕ^ было показано, что биотинилированный СТХ (биот-СТХ) близок к нативному токсину по способности связываться с нАХР мышечного типа Т. саИ/огтса (1С50 (биот-СТХ) = 257 нМ и ГС50 (СТХ) =112 нМ), а также специфически связывается с экстрацеллюлярным доменом а7(7—208) (Коротина и др., 2003). В данной работе методом твердофазного анализа было показано специфическое связывание биот-СТХ с мембранами Т. саИ/огтса, с клетками ОН4С(, экспрессирующими а7 нАХР, а также мембранами гиппокампа и коры больших полушарий крысы, сорбированными на стандартном планшете для ИФА (рис. 6).

При Вестерн-блоттинге мембран Т. саИ/огтса биот-СТХ, так же как и [1251]-аВ^, связывался только с а-субъединицей нАХР мышечного типа (рис. 6), что подтверждало его селективность. В то же время, в отличие от ткани электрического органа Т.саИ/огтса, обогащенной нАХР мышечного типа (1-5 нмоль/мг белка), данный метод оказался недостаточно чувствительным для детекции малых количеств а7 нАХР (4 фмоль-1,15 пмоль/мг белка), содержащихся в препаратах клеток СН4Сь гиппокампа и мозга крысы, а также гиппокампа человека (рис. 6). При этом стрептавидин-пероксидаза неспецифически окрашивала ряд белковых полос — вероятно, как результат связывания эндогенного биотина в денатурирующих условиях, но не обнаруживала связанного биот-СТХ (рис. 6).

Далее была исследована возможность использования биот-СТХ для гистохимического анализа природных объектов. При исследовании экспрессии а7 нАХР в мозге крысы было обнаружено, что фиксация ткани раствором параформальдегида препятствовала связыванию биот-СТХ. В то же время на криостатных срезах нефиксированной ткани было показано специфическое

окрашивание токсином различных областей гиппокампа (рис. 7), перивентрикулярной области, коры больших полушарий и ядер перегородки. На контрольных срезах, преинкубированных с пятидесятикратным избытком немеченого СТХ, связывания биот-СТХ не наблюдалось.

мембраны T.californica (нАХР мышечного типа)

клеточная линия GH4C, (а7 нАХР)

— биот-СТХ I преинкубация с СП

кДа 100 75

Í5 é

'"Ш

Рис.

0,9 0,3 0,1 цМ

6. Твердофазный

— биот-СТХ I I преинкубация с СТХ

КД а 116

66,2

0,6 0,4 0.2 0.1 цМ

45 -

анализ и Вестерн-блоттинг связывания биотиншированного а-кобратоксина (биот-СТХ) с нАХР мышечного типа (показаны а-, /?- и д-субъединицы) Т. саИ/огтса и с экспрессирующими а7 нАХР клетками СН^С^

Гиппокамп интересен высоким содержание а7 нАХР по сравнению с другими отделами ЦНС. Мы показали, что биот-СТХ преимущественно окрашивал слои гиппокампа, обогащенные отростками, но не телами нейронов, что видно на микрофотографии зубчатой фасции (ЗФ) и поля СА4 (рис. 7).

ЗФ, СА4 СА1 СА1

\ 'V» ' é

gCv -"'S - » СА4

А» •

ЗФ

Hoechst, СТХ 200 мкм Hoechst, СТХ 20 мш GFAp стх 20 мкм

Рис. 7. Гистохимическое окрашивание зубчатой фасции (ЗФ) и полей CAI и СА4 (hilus) гиппокампа крысы с использованием биот-СТХ (красный цвет), ядерного красителя Hoechst (синий цвет) и антител к GFAP (glial fibrillary acidic protein — маркер астроцитов, зеленый цвет).

Аналогичное связывание было показано для СА1-САЗ полей гиппокампа. Наблюдаемое окрашивание располагалось вблизи ядер нейронов и в большинстве случаев не совпадало с окрашиванием астроцитов, однако некоторые участки связывания биот-СТХ были удалены от ядер, что могло

свидетельствовать о присутствии рецепторов на телах и отростках нейронов, соответственно (рис. 7).

Представленные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности использования биот-СТХ для выявления нАХР на срезах мозга, однако его эффективная концентрация составляла 5 мкМ, что потенциально могло привести к реакции с низкоафинными участками связывания, отличными от al нАХР. Таким образом, его применимость для гистохимических исследований ограничена.

Флуоресцентно-меченый aBqt

Для повышения чувствительности метода по сравнению с биот-СТХ, с одной стороны, и для повышения разрешающей способности по сравнению с радиоактивными лигандами, с другой стороны, мы исследовали возможность применения для гистохимических экспериментов флуоресцентно-меченого aBgt.

Из литературных данных известно, что присоединение к токсинам крупных радикалов может приводить к сильному изменению их характеристик и ухудшать их способность связываться с рецептором. В связи с этим перед использованием коммерчески доступного конъюгата aBgt с Alexa Fluor 488 (Alexa-aBgt) в гистохимии было исследовано влияние присоединения флуоресцентной метки на его аффинность и специфичность.

Сначала методом радиолигандного анализа мы сравнили аффинность Alexa-aBgt и нативного aBgt к клеточной линии GH4Cb экспрессирующей al нАХР человека (рис. 8). Полученные результаты показали, что Alexa-aBgt -высокоаффинный конкурентный антагонист а7 нАХР (IC50 = 56,6 нМ), хотя введение флуоресцентной метки значительно снизило его ингибиторную способность по сравнению с нативным aBgt (IC50 -1,1 нМ).

Специфичность Alexa-aBgt была также подтверждена его способностью избирательно конкурировать за связывание с рецептором с а-нейротоксинами длинного и короткого типа. СТХ, обладающий высоким сродством как к нАХР мышечного типа, так и к а7 нАХР, успешно конкурировал с Alexa-aBgt за связывание с клетками GH4C1 (IC50 = 17,5 нМ), тогда как короткий а-нейротоксин II (NTII), селективный антагонист нАХР мышечного типа, не влиял

на связывание вплоть до концентрации 4 мкМ (рис. 9). Ранее наблюдалось аналогичное ингибирование связывания [l25I]-aBgt с химерным а7 нАХР для высоких концентраций (3 мкМ - 1мМ) коротких a-нейротоксинов. В контрольных экспериментах оба токсина (СТХ и NTII) одинаково эффективно ингибировали связывание Alexa-aBgt с нАХР мышечного типа Т. californica. Таким образом, была показана возможность дискриминации между мышечным и а7 нАХР при использовании Alexa-aBgt в комбинации с СТХ и NTII в качестве ингибиторов.

Alexa-aBgt 1С,,, 56.6 пМ

100

О) CQ ? &0-S 0)

< 602 о

^ 40-СВ

NTII

1д (нейротоксины), М

Рис. 8. Радиолигандный анализ конкуренции Alexa-aBgt (▼) и нашивного aBgt (я) с [12:>I]-aBgt за связывание с клеточной линией ОН4С[, экспрессирующей а.7 нАХР человека.

1д (нейротоксины), М

Рис. 9. «Флуоресцентный» анализ конкуренции СТХ (») и NTII (А) с Alexa-aBgt за связывание с клеточной линией GH4Ci, экспрессирующей а7 нАХР человека.

Метод гистохимической детекции

Данная комбинация токсинов была использована при разработке метода специфической гистохимической детекции а.1 нАХР. Производные длинных а-нейротоксинов широко применяются для выявления мышечного, а7, а9 и а9/а10 нАХР в связи с высокой аффинностью к перечисленным рецепторам и низкой скоростью диссоциации из комплекса с рецептором. Ранее возможность селективной детекции того или иного подтипа нАХР основывалась на их избирательной экспрессии в различных тканях. Так, нАХР мышечного типа экспрессируется в нервно-мышечных синапсах, а9/а10 нАХР - на волосковых клетках внутреннего уха, а в мозге большинство сайтов связывания аВ^ соответствует а7 нАХР. В последнее время появляется все больше данных о

присутствии нАХР в нетипичных для них тканях: экспрессия нАХР мышечного типа на уровне мРНК была обнаружена в парасимпатических ганглиях кур и спинном мозге человека, на уровне белка — в раковых клетках легких и в спинном мозге эмбрионов кур. а7 нАХР экспрессируется рядом клеток как в нервной системе, так и за ее пределами: астроцитами, клетками микроглии, лимфоцитами, макрофагами и др. а9 субъединица нАХР найдена в кератиноцитах и сперматозоидах, совместно саЮ-в лимфоцитах человека и нейронах спинномозговых ганглиев. Таким образом, актуальной задачей является разработка гистохимического метода избирательной детекции а7 нАХР, основанной на применении комбинации а-нейротоксинов для дискриминации между мышечным и нейрональным типом нАХР, а также использовании тканей а!-/— мышей для исключения возможности окрашивания <х9/<х10 нАХР.

в -/Рис. 10. Связывание Alexa-aBgt с нервно-мышечными синапсами на криостатных срезах языка а7+/+ и а7—/— мышей. А — временная зависимость эффективности связывания. Б, В (б и в) - ингибирование связывания Alexa-aBgt избытком NTI1 и СТХ.

На первом этапе были подобраны

оптимальные условия связывания Alexa-

aBgt с нАХР мышечного типа, для чего

были использованы криостатные срезы

языка а7+/+ и а7-/- мышей. Окрашивание

нервно-мышечных синапсов, на

постсинаптической мембране которых располагаются нАХР мышечного типа,

усиливалось с увеличением времени инкубации с Alexa-aBgt до 15 часов, при

этом уровень фонового окрашивания не изменялся (рис. 10А). Преинкубация

срезов языка с избытком СТХ приводила к полному блокированию связывания

Alexa-aBgt, доказывая его специфичность (рис. 10В в). Избыток NTII полностью

ингибировал связывание А1еха-аВ§^ с большинством нервно-мышечных синапсов (рис. 10В б), но несколько слабоокрашенных синапсов оставались видны на срезе, что было характерно для ткани как а7+/+, так и а!—/— мышей и не зависело от времени преинкубации с N111 и его концентрации (рис. 10Б). Таким образом, слабое остаточное окрашивание не может объясняться присутствием а7 нАХР, а скорее всего, является следствием более быстрой кинетики диссоциации ЫТП по сравнению с А1еха-аВ§£ из комплекса с рецептором.

А. Спинномозговой ганглий Б. Спинной мозг

Рис. 11. Связывание Alexa-aBgt (А) с телами нейронов на срезах спинномозговых ганглиев и (Б) с отростками нейронов на срезах в переднем роге спинного мозга а7+/+ и а7-/— мышей, (б), (в) - ингибирование связывания Alexa-aBgt избытком NT1I и СТХ, соответственно, (г) - отсутствие связывания Alexa-aBgt со срезами нервной ткани а!—/— мышей. Стрелкой и острием стрелки показаны окрашенная плазматическая мембрана и внутриклеточные структуры, соответственно.

Далее специфичность детекции а7 нАХР по разработанному на ткани языка гистохимическому протоколу проверялась на срезах нервной ткани а7+/+ и а7-/- мышей. Основным объектом исследования были выбраны спинномозговые ганглии, скопления тел первичных афферентных нейронов. Такой выбор был продиктован большим разнообразием нАХР, представленных в этих ганглиях. В них, судя по литературным данным, были найдены мРНК всех нейрональных

субъединиц нАХР, в том числе а.9 и а 10, которые способны образовывать aBgt-чувствительные ионные каналы. Целью данного этапа работы было выяснить, может ли Alexa-aBgt служить специфическим инструментом для гистохимической детекции а7 нАХР в тех участках нервной ткани, где потенциально могут присутствовать и другие aBgt-связывающие мишени.

Alexa-aBgt окрашивал небольшой процент тел нейронов в спинномозговом ганглии а7+/+ мышей (рис. 11А (а)). Интенсивность окрашивания возрастала при увеличении времени инкубации с токсином, что наблюдалось ранее и для срезов языка (рис. 10А). Избыток NTII не оказывал влияния на взаимодействие Alexa-aBgt со срезами ганглиев (рис. НА (б)), а избыток СТХ полностью его подавлял (рис. 11А (в)), доказывая, что наблюдается специфическое окрашивание нейрональных нАХР. Срезы спинномозговых ганглиев а7-/-мышей не окрашивались Alexa-aBgt (рис.11 А (г)). Полученные результаты свидетельствуют, что а7 нАХР являются основными aBgt-связывающими центрами в спинномозговых ганглиях мышей и могут быть специфически выявлены с помощью представленного гистохимического метода.

Спинномозговые ганглии - удачный объект для исследования тел нейронов, но они содержат мало отростков и в них практически отсутствуют синаптические контакты. Чтобы убедиться, что разработанный метод позволяет выявлять а7 нАХР на уровне отдельных отростков нейронов, мы включили в наше исследование срезы спинного мозга а7+/+ и а7-/— мышей. Alexa-aBgt окрашивал отдельные нервные волокна на срезах а7+/+ мышей, располагавшиеся, в основном, в переднем роге спинного мозга рядом с телами мотонейронов (рис. 11Б (а)), что согласуется с ранее опубликованными данными ауторадиографии. Результаты контрольных экспериментов были аналогичны опытам со спинномозговыми ганглиями: NTII не затрагивал связывания Alexa-aBgt, тогда как СТХ его полностью подавлял и а7—/- ткань не окрашивалась (рис. 11Б (б), (в), (г), соответственно).

Применение флуоресцентно-меченого aBgt для гистохимической детекции а7 нАХР

Спинномозговые ганглии

Данный объект интересен тем, что нейроны спинномозговых ганглиев являются первым звеном в восприятии болевых, тактильных и других ощущений — следовательно, вещества, способные модулировать их активность, потенциально могут стать лекарственными препаратами. Одними из таких веществ являются агонисты нАХР, например, эпибатидин, которые оказывают анальгетическое действие при болях разной этиологии. Механизм их действия не до конца ясен. Имеются сведения о том, что на разных уровнях проведения болевого сигнала анальгетический эффект может обеспечиваться разными подтипами нАХР. Наше исследование было посвящено а7 нАХР, доминирующему в спинномозговых ганглиях крыс.

Окрашивание Alexa-aBgt срезов спинномозговых ганглиев мышей (рис. 11 А) и крыс (данные не приведены) было сходным: окрашивался небольшой процент средних и крупных нейронов, избыток NTII не оказывал влияния на связывание Alexa-aBgt, а СТХ полностью его подавлял. Alexa-aBgt связывался как с плазматической мембраной нейронов, так и с внутриклеточными структурами, расположенными вокруг ядра, вероятнее всего, с эндоплазматическим ретикулумом (рис. 11А (а)). Накопление а7 нАХР внутри тела нейрона, видимо, необходимо для последующего аксонального транспорта (см. раздел Аксональный транспорт а7 нАХР). Иногда рядом с телами нейронов были заметны специфично меченные Alexa-aBgt структуры, напоминающие дуги (рис. 126). Двойное окрашивание срезов ганглиев с использованием Alexa-aBgt и антител к цитоплазматическому белку нейронов PGP 9.5 (protein gene product 9.5) (рис. 12в и г) не выявили никаких дополнительных Alexa-aBgt-связывающих структур помимо аксонов и тел нейронов (рис. 12г и в, соответственно). Вероятно, обнаруженные дуги являлись изогнутой плазматической мембраной нейронов. Таким образом, разработанный протокол

позволяет надежно детектировать а7 нАХР, расположенные на нейронах спинномозговых ганглиев.

Рис. 12. Окрашивание срезов спинномозговых ганглиев крысы Alexa-aBgt (зеленый цвет) и антителами к цитоплазматическому белку нейронов PGP 9.5 (protein gene product 9.5) (красный цвет). Видны окрашенные Alexa-aBgt тела и (а), (г) аксоны нейронов, а также (6) дополнительные структуры.

Характеристика al нАХР-экспрессирующих нейронов спинномозговых ганглиев

Нейроны спинномозговых ганглиев не являются однородной популяцией. Они отличаются по размерам, спектру экспрессируемых белков, электрофизиологическим и другим свойствам. Так как различные подтипы нейронов специализированы для восприятия и передачи информации разного типа, то существует корреляция между некоторыми характеристиками нейронов и выполняемой ими функцией. Так, клетки малого размера с тонкими аксонами в основном передают информацию о болевых ощущениях, тогда как нейроны с большим диаметром тел и аксонов участвуют в передаче тактильных ощущений.

Первой задачей для характеристики нейронов, экспрессирующих а7 нАХР, было измерение среднего диаметра их тел, составившего 20 - 65 мкм (рис. 136). Сравнив распределение по размерам Alexa-aBgt-связывающих нейронов и всех нейронов в ганглии, мы обнаружили, что первые в среднем на ~ 5 мкм крупнее (рис. 13 а и б). Из гистограммы на рис. 1 Зв видно, что а 7 нАХР-экспрессирующие клетки отсутствовали среди самых мелких нейронов (15-20 мкм в диаметре), но составляли до 12% крупных нейронов (45-50, 55-60 и 60-65 мкм в диаметре). Таким образом, Alexa-aBgt-связывающие нейроны составляют немногочисленную субпопуляцию (~ 4% всех нейронов в ганглии),

характеризующуюся особым распределением по размерам, статистически достоверно отличающимся от такового для всей популяции нейронов в спинномозговых ганглиях крыс.

Исследования субпопуляции ['~Ч]-аВ|£-связывающих нейронов спинномозговых ганглиев шейного отдела обезьян, выполненные зарубежными авторами, также выявили их небольшую численность (11,7%) и более крупный размер относительно общей популяции нейронов. Электрофизиологические эксперименты, проведенные на первичной культуре нейронов спинномозговых ганглиев новорожденных крыс, показали, что 77% крупных нейронов и 32% мелких нейронов экспрессировали а7 нАХР. Высокий уровень экспрессии а7 нАХР в неонатальный период также характерен для мозга. Таким образом, наши исследования и данные литературы показывают предпочтительную экспрессию а7 нАХР средними и крупными нейронами в спинномозговых ганглиях новорожденных и взрослых крыс.

Рис. 13. Гистограммы распределения (а) всех нейронов спинномозговых ганглиев крыс и (б) Alexa-aBgt-связывающих нейронов по размерам, (в) Процентное содержание Alexa-aBgt-cвязывaющla клеток среди средний"диагГетр н'ейроно^ мт нейронов спинномозговых ганглиев разного размера.

Нейроны каких функциональных подтипов экспрессируют а7 нАХР?

Избирательная экспрессия а7 нАХР малой субпопуляцией нейронов предполагает определенную функциональную роль этих рецепторов в спинномозговых ганглиях. Для характеристики данной субпопуляции мы использовали гистохимическую классификацию нейронов спинномозговых ганглиев. Полученные результаты показали, что около половины А1еха-аВ^-связывающих нейронов составляли богатые нейрофиламентами крупные клетки

с аксонами, окруженными миелиновой оболочкой (рис. 14а и г). Следовательно, вторая половина а7 нАХР-экспрессирующих нейронов состояла из мелких клеток с безмиелиновыми нервными волокнами и низким уровнем экспрессии нейрофиламентов, большинство которых являются ноцицепторами.

В зависимости от пути дифференцировки предшественники ноцицепторов развиваются в пептидергические, экспрессирующие СОЯР и вещество Р, и непептидергические, связывающие изолектин В4 (1В4), ноцицепторы. Большинство ноцицепторов обоих классов реагируют на аппликацию капсаицина возникновением токов Са2+ и экспрессируют его рецептор Т11РУ1, который служит их гистохимическим маркером.

Можно было ожидать совместной экспрессии ТЯРУ1 и а.1 нАХР на основании литературных данных о присутствии а7 нАХР на части капсаицин-чувствительных нейронов в спинномозговых ганглиях. Эти данные были получены на первичной культуре нейронов, подвергнутых действию протеолитических ферментов и механическому разделению. Разработанная нами гистохимическая методика позволила изучать нативное распределение а7 нАХР в спинномозговых ганглиях.

Ранее была предпринята попытка изучения совместной экспрессии ТЯРУ1 и а7 нАХР на срезах спинномозговых ганглиев иммуногистохимически, что, исходя из показанной в последние годы неселективности антител, могло приводить к ложноположительным результатам. Мы использовали АЬха-аВ^, специфически взаимодействующий с а7 нАХР в спинномозговых ганглиях, что было подтверждено опытами с а.1—1— тканями.

В нашем исследовании примерно четверть (23%) Акха-аВ^-связывающих нейронов экспрессировали П1РУ1 (рис. 146 и г), т.е. потенциально являлись ноцицепторами. Небольшой процент клеток, продуцирующих оба рецептора, не вызывал удивления, т.к. результаты измерения размера тел нейронов показали, что ТЫРУ1-иммунопозитивные нейроны (ТЯРУ1+) в среднем гораздо мельче а.1 нАХР-экспрессирующих клеток.

(г) А1еха-аВд1 ЮШШШНШВШ 100%

А1еха-аВд1 + ЫР200 ШПИК 47%

А1еха-аВд1 + ТРРУ1 ШШ 23%

А1еха-аВ^ + ССЗНР вЯЯШШШШШШШЯ 90%

Рис. 14. Двойное окрашивание срезов спинномозговых ганглиев крысы Alexa-aBgt (зеленый цвет) и антителами к (а) №200 (высокомолекулярный белок (200 кДа) нейрофшаментов), (б) ТЛРУ1 и (в) ССЯР (красный цвет), (г) Внизу рисунка приведено процентное содержание иммунопозитивных среди Alexa-aBgt-связывающих нейронов. Масштаб: 40 мкм.

Далее мы решили определить процент пептидергических ноцицепторов

среди а7 нАХР-экспрессирующих нейронов. Для этого было проведено двойное

окрашивание срезов спинномозговых ганглиев крыс антителами к СОИР и

А1еха-аВ§£. Неожиданно высокий процент (90%) А1еха-аВ^-связывающих

нейронов экспрессировали СО ЯР (рис. 14в и г). Результаты контрольных

экспериментов в совокупности с типичным точечным рисунком окрашивания

нейронов спинномозговых ганглиев крыс (рис. 14в), доказывали специфичность

использованных антител к СОКР.

Рис. 15. Двойное окрашивание среза спинномозгового ганглия крысы антителами к ТЯРУ1 (зеленый цвет) и СО^Р (красный цвет).

Различие в экспрессии двух гистохимических маркеров ноцицептивных нейронов среди А1еха-aBgt-cвязывaющиx клеток - 23% (ШРУ1) и 90% (СОЮ3) - могло объясняться тем, что некоторые СО Я Р-и м м у н о п оз итив н ы е нейроны не

экспрессируют ТЯРУ1. В связи с неоднозначностью литературных данных мы провели двойное окрашивание срезов спинномозговых

ганглиев антителами к ТЯРЧМ и ССКР и показали, что 71,4 % СОЯР-иммунопозитивных нейронов продуцировали ТИР VI (рис. 15). Таким образом, оставшаяся часть ~ 30% СОЯР-иммунопозитивных нейронов не содержат та.РУ1 (СОКР+/ТКРУ1-) и составляют большинство а7 нАХР-экспрессирующих нейронов в спинномозговых ганглиях крыс (рис. 15). Их распределение по размерам оказалось наиболее сходно с таковым для субпопуляции А1еха-с^1;-связывающих нейронов, что подтверждает правильность нашего вывода о преобладании СОКР+/ТЯРУ1- нейронов среди экспрессирующих а7 нАХР (рис. 15).

Аксональный транспорт а 7 нАХР

Основными функциями нейронов спинномозговых ганглиев являются восприятие сигналов и передача сенсорной информации в ЦНС, которые они способны выполнять благодаря своим уникальным аксонам, имеющим две ветви, одна из которых оканчивается на периферии, а вторая - в спинном мозге. Тело нейрона не участвует в передаче нервного импульса, в нём синтезируются вещества, необходимые для поддержания функционирования аксона. На основании литературных данных и собственных наблюдений мы предположили, что экспрессируемые в телах нейронов а7 нАХР транспортируются по аксонам к месту их функциональной активности.

Рис. 16. Двойное окрашивание среза спинномозгового ганглия крысы Alexa-aBgt (зеленый цвет) и антителами к МР200 (красный цвет).

Для подтверждения этого предположения и

определения типа нервных волокон,

выполняющих данную функцию, было проведено

их двойное окрашивание антителами к гистохимическим маркерам и А1еха-аВ^

как на срезах спинномозговых ганглиев, так и на срезах нервов в месте

пережатия, где накопились транспортируемые вещества. Исходя из ранее

полученных результатов (рис. 14г), предполагалось, что большинство

переносящих а7 нАХР волокон будут ССЯР-иммунопозитивны. Из-за низкого содержания мы не смогли детектировать СОКР и "П^РХМ в нервных волокнах на срезах спинномозговых ганглиев, но показали, что А1еха-аВ^-связывающие аксоны были иммунонегативны к №200 (рис. 16) и, следовательно, с высокой степенью вероятности, были тонкими безмиелиновыми ноцицептивными

Рис. 17. Связывание Alexa-aBgt со срезами (а) заднего корешка спинного мозга, (б)

спинномозгового нерва, (в) седалищного нерва и (г) переднего корешка спинного мозга крысы в месте их пережатия. Видно накопление а.7 нАХР,

транспортируемых по аксонам нейронов спинномозговых ганглиев (а, б, в), в отличие от аксонов мотонейронов (г). Стрелками обозначены места пережатия.

Пережатие корешков спинного мозга, спинномозгового и седалищного нервов приводило к накоплению переносимых внутри аксонов веществ, что позволило продемонстрировать интенсивный антероградный (от тела нейрона к окончанию аксона) (рис. 17а-в) и более слабый ретроградный (рис. 176) транспорт а7 нАХР по отросткам нейронов спинномозговых ганглиев, а также показать иммуногистохимически, что часть данных аксонов СОКР-ергические

Рис. 18. Двойное окрашивание Alexa-aBgt (зеленый цвет) и антителами к ССЯР (красный цвет) среза спинномозгового нерва крысы в месте пережатия. Видно накопление транспортируемых по аксонам а7 нАХР и ССЯР. Стрелками обозначены места пережатия. Острием стрелки обозначен один из аксонов, переносящих совместно а7 нАХР и ССЯР.

волокнами.

(а) | Периферия ЦНС (б) | Периферия ЦНС

(в) Периферия ЦНС (г) Периферия 1 1НС 100 мш

(рис. 18).

Выводы

1. Получен набор поликлональных антител против синтетических фрагментов а7-субъединицы нАХР и показана возможность их использования для детекции рекомбинантных белков: экстрацеллюлярного домена а7-субъединицы нАХР и полноразмерного рецептора.

2. Установлено, что биотинилированный а-кобратоксин может быть использован для детекции а7 нАХР в мембранных препаратах нервной ткани, однако его применимость для гистохимических исследований ограничена.

3. Разработан метод избирательной гистохимической детекции а7 нАХР, основанный на применении флуоресцентно-меченого а-нейротоксина длинного типа в качестве маркера и комбинации длинных и коротких а-нейротоксинов в качестве специфических ингибиторов.

4. С помощью предложенного метода при использовании дополнительных маркеров установлена экспрессия и транспорт а7 нАХР ноцицептивными нейронами спинномозговых ганглиев крыс.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Шелухина И.В.. Крюкова Е.В., Скок М.В., Лыхмус Е.Ю., Жмак М.Н., Мордвинцев Д.Ю., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Анализ специфичности антител против синтетических фрагментов субъединиц различных нейрональных никотиновых холинорецепторов. Биохимия 2006, 71: 924-935.

2. Tsetlin V., Shelukhina I.. Kruykova E., Burbaeva G., Starodubtseva L., Skok M., Volpina O. and Utkin Yu. Detection of cc 7 nicotinic acetylcholine receptors with the aid of antibodies and toxins. Life Sciences 2007, 80: 2202-2205.

3. Шелухина И.В.. Крюкова Е.В., Кашеверов И.Е., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы нервной и иммунной системы. Аллергология и иммунология 2008, 9: 436-437.

4. Shelukhina I.V., Kryukova E.V., Lips K.S., Tsetlin V.I. and Kummer W. Presence of a7 nicotinic acetylcholine receptors on dorsal root ganglion neurons proved using knockout mice and selective a-neurotoxins in histochemistry. J.Neurochemistiy 2009, 109: 1087-1095.

5. Kamynina A.V., Volpina O.M., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.J., Volkova T.D., Koroev D.O., Samokhin A.N., Nesterova I.V., Shelukhina I.V., Kryukova E.V., Tsetlin V.I., Ivanov V.T., Bobkova N.V. Vaccination with peptide 173-193 of acetylcholine receptor alpha7-subunit prevents memory loss in olfactory bulbectomized mice. J.AlzJieimers Dis. 2010, 21: 249-61.

Тезисы докладов:

1. Шелухина И.В.. Фуфачева Е.Н., Ильин В.И., Жмак М.Н., Крюкова Е.В., Кашеверов И.Е., Титова М.А., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Алексеев Т.А., Вольпина О.М., Цетлин В.И. Использование антител к иммуноактивным участкам никотиновых холинорецепторов для характеристики их подтипов. Тезисы докладов и стендовых сообщений научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 2005, 207.

2. Shelukhina I.V.. Kryukova E.V., Skok M.V., Zhmak M.N., Kasheverov I.E. and Tsetlin V.I. Analysis of specificity of antibodies produced against synthetic fragments of different neuronal nicotinic acetylcholine receptor subtypes. East-European symposium «Central and peripheral synaptic transmission», Varna, Bulgaria, 2005. Auton Autacoid Pharmacol 2006, 26(1), 107.4.

3. Кашеверов И.Е., Уткин Ю.Н., Шелухина И.В.. Крюкова Е.В., Кузьмин Д.А., Осипов А.В., Жмак М.Н., Цетлин В.И. Материалы научной конференции «Ионные каналы: структура и функции», С.-Петербург, 2009. Биологические мембраны 2009, 26 (4): 315-316.

4. Шелухина И.В.. Крюкова Е.В., Липе К.С., Куммер В. и Цетлин В.И. Гистохимическая детекция а7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов в нервной ткани. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» Казань, 2009, с.116.

5. Shelukhina I.V.. Kruykova E.V., Kasheverov I., Kummer W and Tsetlin V.I. Labeled peptide and protein neurotoxins in detection of nicotinic acetylcholine receptors at normal and pathological states. «The 4th European society for neurochemistry conference on advances in molecular mechanisms of neurological disorders», Leipzig, Germany, 2009. J.Neurochemistry 2009, 110 (1): 80.

6. Kasheverov I., Zhmak M., Khrushchov A., Shelukhina I.. Kruykova E., Tsetlin V. Labeled peptide and protein neurotoxins for basic study on nicotinic acetylcholine receptors and for practical applications. Satellite meeting to the Society for Neuroscience "Nicotinic acetylcholine receptors as therapeutic targets" Chicago, USA, 2009. Biochemical Pharmacology 2009, 78: 902.

7. Шелухина И.В.. Крюкова E.B., Липе К.С., Куммер В. и Цетлин В.И. Гистохимическое исследование экспрессии а7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов нейронами спинномозговых ганглиев с использованием селективных а-нейротоксинов. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова Москва-Пущино, 2009, 2: 263-266.

8. Shelukhina I.V.. Kryukova E.V., Lips K.S., Kummer W. and Tsetlin V.I. Development of a reliable method for fluorescent histochemical detection of a7 nicotinic acetylcholine receptors in nervous tissue. XII Meeting of the Czech and Slovak neurochemical society. International congress "Molecular mechamisms of neurological and psychiatric disorders". Martin, Slovakia, 2009, p. 79

9. Tsetlin V., Kasheverov I., Shelukhina I.. Kuzmin D., Schmalzing G., Laube B. and H.Betz. Extracellular and membrane domains in structure and function of Cys-loop receptors. The fourth ISN special conference "Membrane domains in CNS physiology and pathology". Erice (Trapani), Sicily, Italy, 2010. J.Neurochemistry 2010, 113 (1), 29.

10. Shelukhina I.V. Alpha 7 nAChRs are expressed by nociceptive neurons in dorsal root ganglia of adult rat. Academies meet: Russian Academy of Sciences and BerlinBrandenburg Academy of Sciences and Humanities. German-Russian symposium: "Molecular neurobiology today and tomorrow". Berlin, Germany, 2010.

Подписано в печать:

17.03.2011

Заказ №5147 Тираж-75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шелухина, Ирина Валерьевна

1 Список сокращений.

2 Введение.

3 Обзор литературных данных.

3.1 Никотиновые ацетилхо линовые рецепторы (нАХР).

3.1.1 Строение нАХР.

3.1.1.1 Экстрацеллюлярный домен.

3.1.1.1.1 АХ-связывающие белки - модель экстрацеллюлярного домена нАХР.

3.1.1.1.2 Участки связывания лигандов.

3.1.1.2 Трансмембранный домен.

3.1.1.3 Внутриклеточный домен.

3.1.2 Функционирование нАХР.

3.1.3 Мышечный тип нАХР.

3.1.4 Нейрональный тип нАХР.

3.1.4.1 Особенности а7-су бъединицы нАХР.

3.1.4.2 Распространение а7 нАХР.

3.1.4.2.1 В нервной системе.

3.1.4.2.2 Вне нервной системы.

3.1.4.3 Связь а7 нАХР с заболеваниями.:.

3.1.4.3.1 Шизофрения.

3.1.4.3.2 Болезнь Альцгеймера.

3.1.5 Детекция нАХР.

3.1.5.1 Испо льзов ание антител.

3.1.5.1.1 Иммуногенность различных участков нАХР.

3.1.5.1.2 Антитела, полученные на рецептор.

3.1.5.1.3 Антитела, полученные на бактериально экспрессированные домены нАХР.

3.1.5.1.4 Антитела, полученные на синтетические петиды.

3.1.5.1.5 Примеры использования антител для исследований.

3.1.5.1.6 Характеристика специфичности антител.

3.1.5.2 Использование токсинов.

3.1.5.2.1 а-Конотоксины.

3.1.5.2.2 а-Нейротоксины длинного типа.

4 Материалы и методы.

4.1 Синтетические пептиды.

4.2 По лиютональные антитела.

4.3 Производные а-кобратоксина (СТХ).

4.4 Объекты исследований:.

4.5 Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).

4.6 Твердофазный анализ с использованием биот-СТХ.

4.7 Вестерн-блоттинг.

4.7.1 Поликлональные антитела.4Е

4.7.1.1 Антигены: экстрацеллюлярный домен а7(7—208) и мембраны электрического органа ската Т. саШЪгшса.

4.7.1.2 Антигены: экстрацеллюлярный домен а7(8-208), гомогенаты и мембранные препараты нервной ткани.

4.7.2 Биотинилированный а-кобратоксин (биот-СТХ).

4.8 Радиолигандный анализ.

4.8.1 Прямое связывание.

4.8.2 Конкурентное связывание.

4.9 «Флуоресцентный» анализ конкурентного связывания.

4.10 Генотипирование.

4.11 Гистохимическое окрашивание.

4.11.1 Окрашивание фиксированных срезов с использованием антител.

4.11.2 Окрашивание парафинизированных срезов с использованием антител.

4.11.3 Окрашивание фиксированных и парафинизированных срезов с использованием биот-СТХ.

4.11.4 Окрашивание криостатных срезов с использованием антител и биот-СТХ.

4.11.5 Окрашивание криостатных срезов с использованием антител и А1еха

4.11.5.1 Подготовка тканей.

4.11.5.1.1 Свежезамороженная ткань.

4.11.5.1.2 Фиксированная ткань.

4.11.5.2 Гистохимическое окрашивание.

4.12 Математическая обработка данных.:.

4.13 Анализ гомологии.

4.14 Построение модели пространственной структуры экстрацеллюлярного домена нАХР.

5 Результаты и обсуждение.

5.1 Исследования с использованием антител.

5.1 Л Получение поликлональных антител.

5.1.2 Тестирование антител на «модельных системах».

5.1.3 Тестирование антител с использованием природных объектов.

5.2, Исследов ания с использованием токсинов.

5.2.1 Йодированный аЕ^.

5.2.2 Биотинилированный СТХ.

5.2.3 Флуоресцентно-меченый аВ^.

5.2.3.1 Метод гистохимической детекции.

5.2.3.2 Применение флуоресцентно-меченого а

§1 для гистохимической детекции а7 нАХР.

5.2.3.2.1 Спинномозговые ганглии.

5.2.3.2.2 Характеристика а7 нАХР-экспрессирующих нейронов спинномозговых ганглиев.

5.2.3.2.3 Нейроны каких функциональных подтипов экспрессируют а7 нАХР?.

5.2.3.2.4 Аксональный транспорт а7 нАХР.

6 Выводы.

7 Литература.

1 Список сокращений

Alexa-aBgt - Alexa Fluor 488 — меченый aBgt

CGRP - calcitonin gene-related peptide - пептид, экспрессирующийся при альтернативном сплайсинге гена кальцитонина

СТХ - а-кобратоксин (Naja kaouthia)

DAPI — 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид

EAMG - экспериментально-индуцированная аутоиммунная миастения

FITC - флуоресцеинизотиоцианат

FITC-CTX — FITC-меченый СТХ

GFAP - glial fibrillary acidic protein — глиальный фибриллярный кислый белок IB4 — изолектин В

МВР — myelin basic protein — основной белок миелина MIR — main immunogenic region — главный иммуногенный регион NF200 — высокомолекулярный белок (200 кДа) нейрофиламентов NTII — а-нейротоксин II (Naja oxiana)

PGP 9.5 - protein gene product 9.5 - цитоплазматический белок нейронов PVDF - поливинилидендифторид

TRPV1 - капсаицин-чувствительный ванилоидный рецептор YR1, относящийся к семейству неселективных ионных каналов TRP а7-/— мыши - мыши, гомозиготные по нокаутному варианту гена а7-субъединицы нАХР а7+/+ мыши - мыши, гомозиготные по нативному варианту гена а7-субъединицы нАХР aBgt - а-бунгаротоксин (Bungarus multicinctus) aBgt-BP — aBgt-связывающий белок АХ — ацетилхолин

АХБ - ацетилхолинсвязывающий белок биот-СТХ - биотинилированный СТХ БСА — бычий сьтороточный альбумин ГАМК — у-аминомасляная кислота ЗФ - зубчатая фасция

ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ КЗЭ - конформационно-зависимый эпитоп мАТ — моноклональные антитела нАХР — никотиновый ацетилхолиновый рецептор

ПААГ - полиакриламидный гель пАТ — поликлональные антитела ПЦР - полимеразная цепная реакция ТСУ - токсин-связывающий участок ФНО - фактор некроза опухолей ЦНС — центральная нервная система

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов детекции нейрональных a7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов"

Актуальность проблемы. Среди нейрональных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) особое место занимает гомопентамерный а7 нАХР. Данный подтип, вероятно, является наиболее широко распространенным нАХР в организме, где он встречается как в нервной системе, так и за ее пределами. Он также уникален своей аминокислотной последовательностью, фармакологическим профилем и наиболее высокой проницаемостью для ионов кальция. Изменение уровня а7 нАХР в головном мозге наблюдается при шизофрении, а также связано с нарушением холинергической передачи и ухудшением когнитивных способностей при таких нейродегенеративных заболеваниях как болезни Альцгеймера и Паркинсона В последнее время появились работы, указывающие на возможность изменения уровня нАХР на форменных элементах крови при различных патологических состояниях. Таким образом, как для диагностики, так и для исследования механизмов возникновения и протекания заболеваний очевидна необходимость разработки надежных методов для обнаружения и количественного определения уровня а7 нАХР.

При постановке подобных задач классическим подходом является использование антител, однако недавние исследования показали, что многие широко используемые антитела против а7-субъединицы нАХР неспецифически окрашивают ткани нокаутных по данному гену мышей (а7-/—). Для повышения надёжности результатов в сочетании с антителами применяют а-нейротоксины из ядов змей, являющиеся высокоаффинными специфическими лигандами некоторых подтипов нАХР. В то же время токсины редко имеют сродство только к одному подтипу рецепторов, что часто затрудняет интерпретацию результатов, особенно, учитывая обнаружение в последние годы нАХР в нетипичных для них тканях, а также большее разнообразие их подтипов, чем ранее предполагалось. В связи с этим актуальной является разработка метода избирательной детекции а7 нАХР.

Цель работы. Цель настоящего исследования состояла в разработке методов специфической детекции нейрональных а7 нАХР с использованием антител и токсинов. Задачами представленной работы стали получение и тестирование набора поликлональных антител против синтетических фрагментов а7-субъединицы нАХР, а также использование различных производных длинных а-нейротоксинов из ядов змей, в том числе их коммерчески доступных конъюгатов. Применимость этих инструментов для поставленной цели исследовалась в ряде методов анализа с использованием как рекомбинантных, так и природных а7 нАХР. Главной задачей стала разработка метода

•-Ч избирательной гистохимической детекции а7 нАХР, основанного на применении флуоресцентно-меченого а-нейротоксина длинного типа в качестве маркера и комбинации длинных и коротких а-нейротоксинов в качестве специфических ингибиторов с последующей апробацией этого метода для исследования экспрессии и транспорта а7 нАХР нейронами спинномозговых ганглиев крыс.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), на Восточноевропейском симпозиуме «Центральная и периферическая синаптическая передача» (Варна, Болгария, 2006), конференции «Ионные каналы: структура и функции» (С.Петербург, 2009), IV российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на 4-й конференции Европейского нейрохимического общества (Лейпциг, Германия, 2009), на конференции Нейробиологического общества по нАХР (Чикаго, США, 2009), на международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва-Пущино, 2009), на международном конгрессе «Молекулярные механизмы неврологических и психических расстройств» (Мартин, Словакия, 2009), на 4-й конференции Международного нейрохимического общества

Эриче, Италия, 2010), на немецко-российском симпозиуме «Молекулярная нейробиология сегодня и завтра» (Берлин, Германия, 2010). По теме диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шелухина, Ирина Валерьевна

6 Выводы

2. "Установлено, что биотинилированный а-кобратоксин может быть использован для детекции а7 нАХР в мембранных препаратах нервной ткани, однако его применимость для гистохимических исследований ограничена.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шелухина, Ирина Валерьевна, Москва

1. V. Tsetlin, D. Kuzmin, 1. Kasheverov, Assembly of nicotinic and other Cys-loop receptors, J Neurochem 116 (2011) 734-741.

2. G.B. Wells, Structural answers and persistent questions about how nicotinic receptors work, Front Biosci 13 (2008) 5479-5510.

3. A. Tasneem, L.M. Iyer, E. Jakobsson, L. Aravind, Identification of the prokaiyotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels, Genome Biol 6 (2005) R4.

4. N. Bocquet, L. Prado de Carvalho, J. Cartaud, J. Neyton, C. Le Poupon, A. Taly, T. Grutter, J.P. Changeux, P.J. Corringer, A prokaryotic proton-gated ion channel from the nicotinic acetylcholine receptor family, Nature 445 (2007) 116-119.

5. A.C. Missias, G.C. Chu, B.J. Klocke, J.R. Sanes, J.P. Merlie, Maturation of the acetylcholine receptor in skeletal muscle: regulation of the AChR gamma-to-epsilon switch, DevBiol 179 (1996) 223-238.

6. J.M. Lindstrom, Nicotinic acetylcholine receptors of muscles and nerves: comparison of their structures, functional roles, and vulnerability to pathology, Ann N Y Acad Sci 998 (2003) 41-52.

7. R.C. Drisdel, W.N. Green, Neuronal alpha-bungarotoxin receptors are alpha7 subunit homomers, JNeurosci 20 (2000) 133-139.

8. C. Gotti, F. Clementi, Neuronal nicotinic receptors: from structure to pathology, Prog Neurobiol 74 (2004) 363-396.

9. C. Gotti, M. Zoli, F. Clementi, Brain nicotinic acetylcholine receptors: native subtypes and their relevance, Trends Pharmacol Sci 27 (2006) 482-491.

10. F. Hucho, Weise, C., Ligand-gated ion channels, Angew.Chem.Int.Ed. 40 (2001) 31003116.

11. N. Le Novere, J.P. Changeux, Molecular evolution of the nicotinic acetylcholine receptor: an example of multigene family in excitable cells, J Mol Evol 40 (1995) 155172.

12. P.J. Corringer, M. Baaden, N. Bocquet, M.v Delarue, V. Dufresne, H. Nuiy, M. Prevost, C. Van Renterghem, Atomic structure and dynamics of pentameric ligand-gated ion. channels: new insight1 from bacterial homologues, J Physiol 588 (2010) 565-572

13. N. Unwin, Acetylcholine receptor channel imaged in the open state, Nature 373 (1995) 37-43.

14. N. Unwin, Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4A resolution, J Mol Biol 346 (2005) 967-989.

15. F. Hucho, V.I. Tsetlin, J. Machold, The emerging three-dimensional structure of a receptor. The nicotinic acetylcholine receptor, Eur J Biochem 239 (1996) 539-557.

16. A. Strecker, P. Franke, C. Weise, F. Hucho, All potential glycosylation sites of the nicotinic acetylcholine receptor delta subunit from Torpedo californica are utilized, Eur J Biochem 220 (1994) 1005-1011.

17. C.D. Dellisanti, Y. Yao, J.C. Stroud, Z Z. Wang, L. Chen, Crystal structure of the extracellular domain of nAChR alphal bound to alpha-bungarotoxin at 1.94 A resolution, NatNeurosci 10 (2007) 953-962

18. C.J. daCosta, D:E. Kaiser, J.E. Baenziger, Role of glycosylation and membrane environment in nicotinic acetylcholine receptor stability, Biophys J 88 (2005) 1755-1764.

19. A. Miyazawa, Y. Fujiyoshi, M. Stowell, N. Unwin, Nicotinic acetylcholine receptor at 4.6 A resolution: transverse tunnels in the channel wall, J Mol Biol 288 (1999) 765-786.

20. K. Brejc, W.J. van Dijk, R.V. Klaassen, M. Schuurmans, J. van Der Oost, A.B. Smit, T.K. Sixma, Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the hgand-binding domain of nicotinic receptors, Nature 411 (2001) 269-276.

21. S.B. Hansen, T.T. Talley, Z. Radic, P. Taylor, Structural and ligand recognition characteristics of an acetylcholine-binding protein from Aplysia californica, J Biol Chem 279 (2004) 24197-24202.

22. P.H. Celie, S.E. van Rossum-Fikkert, W.J. van Dijk, K. Brejc, A.B. Smit, T.K. Sixma, Nicotine and carbamylcholine binding to nicotinic acetylcholine receptors as studied in AChBP crystal structures, Neuron 41 (2004) 907-914.

23. S.B. Hansen, G. Sulzenbacher, T. Huxford, P. Marchot, P. Taylor, Y. Bourne, Structures of Aplysia AChBP complexes with nicotinic agonists and antagonists reveal distinctive binding interfaces and conformations, EMBO J 24 (2005) 3635-3646.

24. R. Lape, D. Colquhoun, L.G. Sivilotti, On the nature of partial agonism in the nicotinic receptor superfamily, Nature 454 (2008) 722-727

25. J Machold, C. Weise, Y. Utkin, V. Tsetlin, F. Hucho, The handedness of the subunit arrangement of the nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica, Eur J Biochem 234 (1995) 427-430.

26. S. Amiri, K. Tai, O. Beckstein, P.C. Biggin, M.S. Sansom, The alpha7 nicotinic acetylcholine receptor: molecular modelling, electrostatics, and energetics, Mol Membr Biol 22(2005) 151-162.

27. N. Le Novere, T. Grutter, J.P. Changeux, Models of the extracellular domain of the nicotinic receptors and of agonist- and Ca2+-binding sites, Proc Natl Acad Sci U S A 99 (2002) 3210-3215.

28. K.C. Chou, Insights from modelling the 3D structure of the extracellular domain of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor, Biochem Biophys Res Commun 319 (2004) 433438.

29. D.Y. Mordvitsev, Y.L. Polyak, D.A. Kuzmin, O.V. Levtsova, Y.V. Tourleigh, Y.N. Utkin, K.V. Shaitan, V.I. Tsetlin, Computer modeling of binding of diverse weak toxins to nicotinic acetylcholine receptors, ComputBiol Chem 31 (2007) 72-81.

30. H.R. Arias, P. Bhumireddy, C. Bouzat, Molecular mechanisms and binding site locations for noncompetitive antagonists of nicotinic acetylcholine receptors, Int J Biochem Cell Biol 38 (2006) 1254-1276. ■ •

31. L. Curtis, B. Buisson, S. Bertrand, D. Bertrand, Potentiation of human alpha4beta2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor by estradiol, Mol Pharmacol 61 (2002) 127135.

32. S. Nirthanan, G. Garcia, 3rd, D.C. Chiara, S.S. Husain, IB. Cohen, Identification of binding sites in the nicotinic acetylcholine receptor for TDBzl-etomidate, a photoreactive positive allosteric effector, J Biol Chem 283 (2008) 22051-22062.

33. H.R. Arias, P. Bhumireddy, G. Spitzmaul, J.R. Trudell, C. Bouzat, Molecular mechanisms and binding site location for the noncompetitive antagonist crystal violet on nicotinic acetylcholine receptors, Biochemistry 45 (2006) 2014-2026.

34. G. Akk, J.H Steinbach, Galantamine activates muscle-type nicotinic acetylcholine receptors without binding to the acetylcholine-binding site, J Neurosci 25 (2005) 19922001.

35. L. Zhang, W. Xiong, Modulation of the Cys-loop ligand-gated ion channels by fatty acid and cannabinoids, Vitam Horm 81 (2009) 315-335.

36. B. Hsiao, K.B. Mihalak, S.E. Repicky, D. Everhart, A.H. Mederos, A. Malhotra, C.W. Luetje, Determinants of zinc potentiation on the alpha4 subunit of neuronal nicotinic receptors, Mol Pharmacol 69 (2006) 27-36.

37. S. Seo, J.T. Henry, A.H. Lewis, N. Wang, M.M. Levandoski, The positive allosteric modulator morantel binds at noncanonical subunit interfaces of neuronal nicotinic acetylcholine receptors, J Neurosci 29 (2009) 8734-8742.

38. H. Nury, C. Van Renterghem, Y. Weng, A. Tran, M. Baaden, V. Dufresne, J P. Changeux, J.M. Sonner, M. Delarue, P.J. Corringer, X-ray structures of general anaesthetics bound to a pentameric ligand-gated ion channel, Nature 469 (2011) 428-431.

39. G.T. Young, R Zwart, A.S. Walker, E Sher, N.S. Millar, Potentiation of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors via an allosteric transmembrane site, Proc Natl Acad Sci USA 105 (2008) 14686-14691.

40. M. Samochocki, M Zerlin, R. Jostock, P.J. Groot Kormelink, W.H. Luyten, EX. Albuquerque, A. Maelicke, Galantamine is an allosterieally potentiating ligand of the human alpha4/beta2 nAChR, Acta Neurol Scand Suppl 176 (2000) 68-73.

41. A. Schrattenholz, E.F. Pereira, U. Roth, K.H. Weber, E.X. Albuquerque, A. Maelicke, Agonist responses of neuronal nicotinic acetylcholine receptors are potentiated by a novel class of allosterieally acting ligands, Mol Pharmacol 49 (1996) 1-6.

42. S.B. Hansen, P. Taylor, Galanthamine and non-competitive inhibitor binding to ACh-binding protein: evidence for a binding site on non-alpha-subunit interfaces of heteromeric neuronal nicotinic receptors, J Mol Biol 369 (2007) 895-901.

43. I. Ivanov, X. Cheng, S.M. Sine, J. A. McCammon, Barriers to ion translocation in cationic and anionic receptors from the Cys-loop family, J Am Chem Soc 129 (2007) 8217-8224.

44. G. Spitzmaul, J. Corradi, C. Bouzat, Mechanistic contributions of residues in the Ml transmembrane domain of the nicotinic receptor to channel gating, Mol Membr Biol 21 (2004) 39-50.

45. V. Kukhtina, D. Kottwitz, H. Strauss, B. Heise, N. Chebotareva, V. Tsetlin, F. Hucho, Intracellular domain of nicotinic acetylcholine receptor: the importance of being unfolded, J Neurochem 97 Suppl 1 (2006) 63-67.

46. J. Mukherjee, A. Kuryatov, S J. Moss, J.M. Lindstrom, R Anand, Mutations of cytosolic loop residues impair assembly and maturation of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors, J Neurochem 110 (2009) 1885-1894.

47. X.M. Yu, Z.W. Hall, A sequence in the main cytoplasmic loop of the alpha subunit is required for assembly of mouse muscle nicotinic acetylcholine receptor, Neuron 13 (1994) 247-255.

48. Y.P. Kuo, L. Xu, J.B. Eaton, L. Zhao,'J. Wu, R.J. Lukas, Roles for nicotinic acetylcholine receptor subunit large cytoplasmic loop sequences in receptor expression and function, J Pharmacol Exp Ther 314 (2005) 455-466.

49. J. Xu, Y. Zhu, S.F. Heinemann, Identification of sequence motifs that target neuronal nicotinic receptors to dendrites and axons, J Neurosci 26 (2006) 9780-9793.

50. M.A. Pacheco, T.E. Pastoor, L. Wecker, Phosphorylation of the alpha4 subunit of human alpha4beta2 nicotinic receptors: role of cAMP-dependent protein kinase (PKA) and protein kinase C (PKC), Brain Res Mol Brain Res 114 (2003) 65-72.

51. A. Wiesner, C. Fuhrer, Regulation of nicotinic acetylcholine receptors by tyrosine kinases in the peripheral and central nervous system: same players, different roles, Cell Mol Life Sci 63 (2006) 2818-2828.

52. C.P. Fenster, M.L. Beckman, J.C. Parker, E.B. Sheffield, T.L. Whitworth, M.W. Quick, R.A. Lester, Regulation of alpha4beta2 nicotinic receptor desensitization by calcium and protein kinase C, Mol Pharmacol 55 (1999) 432-443.

53. M. Colledge, S.C. Froehner, Tyrosine phosphorylation of nicotinic acetylcholine receptor mediates Grb2 binding, J Neurosci 17 (1997) 5038-5045.

54. C.H. Cho, W. Song, K. Leitzell, E. Teo, A.D. Meleth, M.W. Quick, R.A. Lester, Rapid upregulation of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors by tyrosine dephosphorylation, J Neurosci 25 (2005) 3712-3723.

55. K. Wang, J.T. Hackett, M.E. Cox, M. Van Hoek, J.M. Lindstrom, S.J. Parsons, Regulation of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor by SRC family tyrosine kinases, J Biol Chem 279 (2004) 8779-8786.

56. N. Unwin, A. Miyazawa, J. Li, Y. Fujiyoshi, Activation of the nicotinic acetylcholine receptor involves a switch in conformation of the alpha subunits, J Mol Biol 319 (2002) 1165-1176.

57. Y. Paas, G. Gibor, R. Grailhe, N. Savatier-Duclert, V. Dufresne, M. Sunesen, L.P. de Carvalho, J.P. Changeux, B. Attali, Pore conformations and gating mechanism of a Cys-loop receptor, ProcNatl Acad Sci U S A 102 (2005) 15877-15882.

58. X. Cheng, B. Lu, B. Grant, R.J. Law, J.A. McCammon, Channel opening motion of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor as suggested by normal mode analysis, J Mol Biol 355 (2006)310-324.

59. R.J. Hilf, R. Dutzler, X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel, Nature 452 (2008) 375-379.

60. N. Bocquet, H. Nury, M. Baaden, C. Le Poupon, J.P. Changeux, M. Delarue, P.J. Corringer, X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation, Nature 457 (2009) 111-114.

61. R.J. Hilf, R Dutzler, Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel, Nature 457 (2009) 115-118.

62. R.J. Hilf, R. Dutzler, A prokaryotic perspective on pentameric ligand-gated ion channel structure, Curr Opin Struct Biol 19 (2009) 418-424.

63. G.B. Banks, C. Fuhrer, M.E. Adams, S.C. Froehner, The postsynaptic submembrane machinery at the neuromuscular junction: requirement for rapsyn and the utrophin/dystrophin-associated complex, J Neurocytol 32 (2003) 709-726.

64. Y. Lee, J. Rudell, M. Ferns, Rapsyn interacts with the muscle acetylcholine receptor via alpha-helical domains in the alpha, beta, and epsilon subunit intracellular loops, Neuroscience 163 (2009) 222-232.

65. B. Zhang, S. Luo, Q. Wang, T. Suzuki, W.C. Xiong, L. Mei, LRP4 serves as a coreceptor of agrin, Neuron 60 (2008) 285-297.

66. N. Kim, A.L. Stiegler, T.O. Cameron, P.T. Hallock, A.M. Gomez, J.H. Huang, S.R. Hubbard, M.L. Dustin, S.J. Burden, Lrp4 is a receptor for Agrin and forms a complex with MuSK, Cell 135 (2008) 334-342.

67. D.J. Glass, D.C. Bowen, T.N. Stitt, C. Radziejewski, J. Bruno, T.E. Ryan, D.R. Gies, S. Shah, K. Mattsson, S.J. Burden, P.S. DiStefano, D.M. Valenzuela, T.M. DeChiara, G.D. Yancopoulos, Agrin acts via a MuSK receptor complex, Cell 85 (1996) 513-523.

68. O.L. Gervasio, P.F. Armson, W.D. Phillips, Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability, Dev Biol 305 (2007) 262-275.

69. M.B. Friese, C.S. Blagden, S.J. Burden, Synaptic differentiation is defective in mice lacking acetylcholine receptor beta-subunit tyrosine phosphorylation, Development 134 (2007) 4167-4176.

70. A.A. Osman, A.D. Schrader, A.J. Hawkes, O. Akil, A. Bergeron, L.R. Lustig, D.D. Simmons, Muscle-like nicotinic receptor accessory molecules in sensory hair cells of the inner ear, Mol Cell Neurosci 38 (2008) 153-169.

71. S. Heinemann, J. Boulter, J. Connolly, E. Deneris, R. Duvoisin, M. Hartley, I. Hermans-Borgmeyer, M. Hollmann, A. O'Shea-Greenfield, R. Papke, et aL, The nicotinic receptor genes, Clin Neuropharmacol 14 Suppl 1 (1991) S45-61.

72. R. Schoepfer, W.G. Conroy, P. Whiting, M. Gore, J. Lindstrom, Brain alpha-bungarotoxiri binding protein cDNAs and MAbs reveal subtypes of this branch of the ligand-gated ion channel gene superfamily, Neuron 5 (1990) 35-48.

73. E.S. Dene ris, J. Connolly, J. Boulter, E. Wada, K. Wada, L.W. Swanson, J. Patrick, S. Heinemann, Primary structure and expression of beta 2: a novel subunit of neuronal nicotinic acetylcholine receptors, Neuron 1 (1988) 45-54.

74. S. Vernino, M. Amador, C.W. Luetje, J. Patrick, J. A. Dani, Calcium modulation and high calcium permeability of neuronal nicotinic acetylcholine receptors, Neuron 8 (1992) 127134.

75. P. Seguela, J. Wadiche, K. Dineley-Miller, J.A. Dani, J.W. Patrick, Molecular cloning, functional properties, and distribution of rat brain alpha 7: a nicotinic cation channel highly permeable to calcium, J Neurosci 13 (1993) 596-604.

76. S. Fucile, M. Renzi, P. Lax, F. Eusebi, Fractional Ca(2+) current through human neuronal alpha7 nicotinic acetylcholine receptors, Cell Calcium 34 (2003) 205-209.

77. S.S. Khiroug, P.C. Harkness, P.W. Lamb, S.N. Sudweeks, L. Khiroug, N.S. Millar, J.L. Yakel, Rat nicotinic ACh receptor alpha7 and beta2 subunits co-assemble to form functional heteromeric nicotinic receptor channels, J Physiol 540 (2002) 425-434.

78. E. Palma, L. Maggi, B. Barabino, F. Eusebi, M. Ballivet, Nicotinic acetylcholine receptors assembled from the alpha7 and beta3 subunits, J Biol Chem 274 (1999) 1833518340.

79. J. Lindstrom, Autoimmune diseases involving nicotinic receptors, J Neurobiol 53 (2002) 656-665.

80. M Alkondon, E.X. Albuquerque, Diversity of nicotinic acetylcholine receptors in rat hippocampa! neurons. I. Pharmacological and functional evidence for distinct structural subtypes, J Pharmacol Exp Ther 265 (1993) 1455-1473. ^

81. M. Alkondon, E.F. Pereira, W.S. Cortes, A. Maelicke, E.X. Albuquerque, Choline is a selective agonist of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors in the rat brain neurons, Eur J Neurosci 9 (1997) 2734-2742.

82. R.L. Papke, M. Bencherif, P. Lippiello, An evaluation of neuronal nicotinic acetylcholine receptor activation by quaternary nitrogen compounds indicates that choline is selective for the alpha 7 subtype, Neurosci Lett 213 (1996) 201-204.

83. V.V. Uteshev, E.M. Meyer, R.L. Papke, Regulation of neuronal function by choline and 40H-GTS-21 through alpha 7 nicotinic receptors, J Neurophysiol 89 (2003) 1797-1806.

84. E.D. Levin, C. Bettegowda, J. Blosser, J. Gordon, AR-R17779, and alpha7 nicotinic agonist, improves learning and memory in rats, Behav Pharmacol 10 (1999) 675-680.

85. M. Hajos, R.S. Hurst, W.E. Hoffmann, M. Krause, T.M. Wall, N.R. Higdon, V.E. Groppi, The selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987 N-[(3R)-1 -Azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl]-4-chlorobenzamide hydrochloride] enhances

86. GABAergic synaptic activity in brain slices and restores auditory gating deficits in anesthetized rats, J Pharmacol Exp Ther 312 (2005) 1213-1222.

87. D. Feuerbach, J. Nozulak, K. Lingenhoehl, K. McAllister, D. Hoyer, JN403, in vitro characterization of a novel nicotinic acetylcholine receptor alpha7 selective agonist, Neurosci Lett 416 (2007) 61-65.

88. H. Kitagawa, T. Takenouchi, R Azuma, K.A. Wesnes, W.G. Kramer, D.E. Clody, A.L. Burnett, Safety, pharmacokinetics, and effects on cognitive function of multiple doses of GTS-21 in healthy, male volunteers, Neuropsychopharmacology 28 (2003) 542-551.

89. M.N. Sabbagh, Drug development for Alzheimer's disease: where are we now and where are we headed?, Am J Geriatr Pharmacother 7 (2009) 167-185.

90. K. Hashimoto, M. Iyo, R. Freedman, K.E. Stevens, Tropisetron improves deficient inhibitory auditory processing in DBA/2 mice: role of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors, Psychopharmacology (Berl) 183 (2005) 13-19.

91. K. Hashimoto, Y. Fujita, T. Ishima, H. Hagiwara, M. Iyo, Phencyclidine-induced cognitive deficits in mice are improved by subsequent subchronic administration of tropisetron: role of alpha7 nicotinic receptors, Eur J Pharmacol 553 (2006) 191-195.

92. J. Toyohara, J. Wu, K. Hashimoto, Recent development of radioligands for imaging alpha7 nicotinic acetylcholine receptors in the brain, Curr Top Med Chem 10 (2010) 1544-1557.

93. K. Hashimoto, S. Nishiyama, H. Ohba, M. Matsuo, T. Kobashi, M. Takahagi, M. Iyo, T. Kitashoji, H. Tsukada, 11C]CHIBA-1001 as a novel PET ligand for alpha7 nicotinic receptors in the brain: a PET study in conscious monkeys, PLoS One 3 (2008) e3231.

94. A.B. Elgoyhen, D.S. Johnson, J. Boulter, D.E. Vetter, S. Heinemann, Alpha 9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells, Cell 79 (1994) 705-715.

95. Y.N. Utkin, V.V. Kukhtina, E.V. Kryukova, F. Chiodini, D. Bertrand, C. Methfessel, V.I. Tsetlin, "Weak toxin" from Naja kaouthia is a nontoxic antagonist of alpha 7 and muscle-type nicotinic acetylcholine receptors, J Biol Chem 276 (2001) 15810-15815.

96. E.F. Pereira, M. Alkondon, J.M. Mcintosh, E.X. Albuquerque, Alpha-conotoxin-Iml. a competitive antagonist at alpha-bungarotoxin-sensitive neuronal nicotinic receptors in hippocampal neurons, J Pharmacol Exp Ther 278 (1996) 1472-1483.

97. M. Ellison, J.M. Mcintosh, B.M. Olivera, Alpha-conotoxins Iml and Imll. Similar alpha 7 nicotinic receptor antagonists act at different sites, J Biol Chem 278 (2003) 757-764.

98. M. Ellison, C. Haberlandt, M.E. Gomez-Casati, M. Watkins, A.B. Elgoyhen, J.M. Mcintosh, B.M. Olivera, Alpha-RgIA: a novel conotoxin that specifically and potently blocks the alpha9alphal0 nAChR, Biochemistry 45 (2006) 1511-1517.

99. N.M. Broxton, J.G. Down, J. Gehrmann, P.F. Alewood, D.G. Satchell, B.G. Livett, Alpha-conotoxin Iml inhibits the alpha-bungarotoxin-resistant nicotinic response in bovine adrenal chromaffin cells, JNeurochem 72 (1999) 1656-1662.

100. S. Luo, T.A. Nguyen, G.E. Cartier, B.M. Olivera, D. Yoshikami, J.M. Mcintosh, Single-residue alteration in alpha-conotoxin PnIA switches its nAChR subtype selectivity, Biochemistry 38 (1999) 14542-14548.

101. S. Dutertre, A. Nicke, R.J. Lewis, Beta2 subunit contribution to 4/7 alpha-conotoxin binding to the nicotinic acetylcholine receptor, J Biol Chem280 (2005) 30460-30468.

102. A. Nicke, M.L. Loughnan, E.L. Millard, P.F. Alewood, D.J. Adams, N.L. Daly, D.J. Craik, R.J. Lewis, Isolation, structure, and activity of GID, a novel alpha 4/7-conotoxin with an extended N-terminal sequence, J Biol Chem 278 (2003) 3137-3144.

103. A. Nicke, M. Samochocki, M.L. Loughnan, P.S. Bansal, A. Maelicke, R.J. Lewis, Alpha-conotoxins EpI and AuIB switch subtype selectivity and activity in native versus recombinant nicotinic acetylcholine receptors, FEBS Lett 554 (2003) 219-223.

104. J.M. Ward, V.B. Cockcroft, G.G. Lunt, F.S. Smillie, S. Wonnacott, Methyllycaconitine: a selective probe for neuronal alpha-bungarotoxin binding sites, FEBS Lett 270 (1990) 4548.

105. L. Yum, K.M. Wolf, V.A. Chiappinelli, Nicotinic acetylcholine receptors in separate brain regions exhibit different affinities for methyllycaconitine, Neuroscience 72 (1996) 545-555.

106. S. Thornton, A. Schedel, S. Besenfelder, H. Kluter, P. Bugert, Cholinergic drugs inhibit in vitro megakaryopoiesis via the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor, Platelets (2011).

107. C.S. Roegge, E.D. Levin, Nicotinic Receptor Antagonists in Rats, (2006).

108. N.S. Millar, C. Gotti, Diversity of vertebrate nicotinic acetylcholine receptors, Neuropharmacology 56 (2009) 237-246.

109. L.W. Role, D.K. Berg, Nicotinic receptors in the development and modulation of CNS synapses, Neuron 16 (1996) 1077-1085.

110. C. Gotti, F. Clementi, A. Fornari, A. Gaimarri, S. Guiducci, I. Manfredi, M. Moretti, P. Pedrazzi, L. Pucci, M. Zoli, Structural and functional diversity of native brain neuronal nicotinic receptors, Biochem Pharmacol 78 (2009) 703-711.

111. K. Ono, T. Toyono, K. Inenaga, Nicotinic receptor subtypes in rat subfornical organ neurons and glial cells, Neuroscience 154 (2008) 994-1001.

112. J. Xiu, A. Nordberg, X. Qi, Z.Z. Guan, Influence of cholesterol and lovastatin on alpha- ' form of secreted amyloid precursor protein and expression of alpha7 nicotinic receptor on astrocytes, Neurochem Int 49 (2006) 459-465.

113. J. Barik, S. Wonnacott. Indirect modulation by alpha7 nicotinic acetylcholine receptors of noradrenaline release in rat hippocampal slices: interaction with glutamate and GABA systems and effect of nicotine withdrawal, Mol Pharmacol 69 (2006) 618-628.

114. T. Endo, Y. Yanagawa, K. Obata, T. Isa, Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus, J Neurophysiol 94 (2005) 3893-3902.

115. Z.W. Zhang, J.S. Coggan, D.K. Berg, Synaptic currents generated by neuronal acetylcholine receptors sensitive to alpha-bungarotoxin, Neuron 17 (1996) 1231-1240.

116. D. Ji, J.A. Dani, Inhibition and disinhibition of pyramidal neurons by activation of nicotinic receptors on hippocampal interneurons, J Neurophysiol 83 (2000) 2682-2690.

117. C.J. Frazier, A.V. Buhler, J.L. Weiner, T.V. Dunwiddie, Synaptic potentials mediated via alpha-bungarotoxin-sensitive nicotinic acetylcholine receptors in rat hippocampal interneurons, JNeurosci 18 (1998) 8228-8235.

118. M. Alkondon, E.F. Pereira, E.X. Albuquerque, alpha-bungarotoxin- and methyllycaconitine-sensitive nicotinic receptors mediate fast synaptic transmission in interneurons of rat hippocampal slices, Brain Res 810 (1998) 257-263.

119. D.K. Berg, W.G. Conroy, Nicotinic alpha 7 receptors: synaptic options and downstream signaling in neurons, J Neurobiol 53 (2002) 512-523.

120. G. Sharma, S. Vijayaraghavan, Nicotinic cholinergic signaling in hippocampal astrocytes involves calcium-induced calcium release from intracellular stores, Proc Natl Acad Sci U SA98 (2001)4148-4153.

121. E.M. Ullian, P.B. Sargent, Pronounced cellular diversity and extrasynaptic location of -nicotinic acetylcholine receptor subunit immunoreactivities in the chicken pretectum, J Neurosci 15 (1995) 7012-7023. ;

122. H.L. Horch, P.B. Sargent, Perisynaptic surface distribution of multiple classes of nicotinic acetylcholine receptors on neurons in the chicken ciliary ganglion, J Neurosci 15 (1995) 7778-7795.

123. J.S. Coggan, T.M. Bartol, E. Esquenazi, J.R. Stiles, S. Lamont, M.E. Martone, D.K. Berg, M.H. Ellisman, T.J. Sejnowski, Evidence for ectopic neurotransmission at a neuronal synapse, Science 309 (2005) 446-451. »

124. I. Wessler, C.J. Kirkpatrick, Acetylcholine beyond neurons: the non-neuronal cholinergic system in humans, Br J Pharmacol 154 (2008) 1558-1571.

125. S. Di Angelantonio, C. Matteoni, E. Fabbretti, A. Nistri, Molecular biology and electrophysiology of neuronal nicotinic receptors of rat chromaffin cells, Eur J Neurosci 17(2003)2313-2322.

126. R.A. Corriveau, S.J. Romano, W.G. Conroy, L. Oliva, D.K. Berg, Expression of neuronal acetylcholine receptor genes in vertebrate skeletal muscle during development, J Neurosci 15 (1995) 1372-1383.

127. U. Fischer, S. Reinhardt, E.X. Albuquerque, A. Maelicke, Expression of functional alpha7 nicotinic acetylcholine receptor during mammalian muscle development and denervation, Eur JNeurosci 11 (1999) 2856-2864.

128. S.J. Romano, P.C. Pugh, J.M. Mcintosh, D.K. Berg, Neuronal-type acetylcholine receptors and regulation of alpha 7 gene expression in vertebrate skeletal muscle, J Neurobiol 32 (1997) 69-80.

129. H. Wang, M. Yu, M. Ochani, C.A. Amelia, M. Tanovic, S. Susarla, J.H. Li, H. Yang, L. Ulloa, Y. Al-Abed, C.J. Czura, K.J. Tracey, Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation, Nature 421 (2003) 384-388.

130. V.A. Pavlov, K.J. Tracey, The cholinergic anti-inflammatory pathway, Brain Behav Immun 19 (2005) 493-499.

131. W.J. de Jonge, L. Ulloa, The alpha7 nicotinic acetylcholine receptor as a pharmacological target for inflammation, Br J Pharmacol 151 (2007) 915-929.

132. P. Paldi-Haris, J.G. Szelenyi, T.H. Nguyen, S.R. Hollan, Changes in the expression of the cholinergic structures of human T lymphocytes due to maturation and stimulation, Thymus 16(1990) 119-122.

133. Y. Kuo, L. Lucero, J. Michaels, D. DeLuca, R.J. Lukas, Differential expression of nicotinic acetylcholine receptor subunits in fetal and neonatal mouse thymus, J Neuroimmunol 130 (2002) 140-154.

134. G. Sharma, S. Vijayaraghavan, Nicotinic receptor signaling in nonexcitable cells, J Neurobiol 53 (2002) 524-534.

135. C. Heeschen, M. Weis, A. Aicher, S. Dimmeler, J.P. Cooke, A novel angiogenic pathway mediated by non-neuronal nicotinic acetylcholine receptors, J Clin Invest 110 (2002) 527-536.

136. R.D. Shytle, T. Mori, K. Townsend, M. Vendrame, N. Sun, J. Zeng, J. Ehrhart, A.A. Silver, P.R. Sanberg, J. Tan, Cholinergic modulation of microglial activation by alpha 7 nicotinic receptors, J Neurochem 89 (2004) 337-343.

137. A.J. Middlebrook, C. Martina, Y. Chang, R.J. Lukas, D. DeLuca, Effects of nicotine exposure on T cell development in fetal thymus organ culture: arrest of T cell maturation, J Immunol 169 (2002) 2915-2924.

138. M.V. Skok, E.N. Kalashnik, L.N. Koval, V.I. Tsetlin, Y.N. Utkin, J.P. Changeux, R. Grailhe, Functional nicotinic acetylcholine receptors are expressed in B lymphocyte-derived cell lines, Mol Pharmacol 64 (2003) 885-889.

139. Y. Wang, E.F. Pereira, A.D. Maus, N.S. Ostlie, D. Navaneetham, S. Lei, E.X. Albuquerque, B.M. Conti-Fine, Human bronchial epithelial and endothelial cells express alpha7 nicotinic acetylcholine receptors, Mol Pharmacol 60 (2001) 1201-1209.

140. H.K. Plummer, 3rd, M. Dhar, H.M. Schuller, Expression of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor in human lung cells, Respir Res 6 (2005) 29.

141. R. Freedman, M. Hall, L.E Adler, S. Leonard, Evidence in postmortem brain tissue for decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia, Biol Psychiatry 38 (1995) 22-33.

142. Z.Z. Guan, X. Zhang, K. Blennow, A. Nordberg, Decreased protein level of nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain, Neuroreport 10 (1999) 1779-1782.

143. A. Marutle, X. Zhang, J. Court, M. Piggott, M. Johnson, R. Perry, E. Perry, A. Nordberg, Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical regions in schizophrenia, J ChemNeuroanat 22 (2001) 115-126.

144. R. Freedman, A. Olincy, R.G Ross, M.C. Waldo, K.E. Stevens, L.E. Adler, S Leonard, The genetics of sensory gating deficits in schizophrenia, Curr Psychiatry Rep 5 (2003) 155-161.

145. O. Perl, T Ilani, R.D. Straus, R. Lapidus, S. Fuchs, The alpha7 nicotinic acetylcholine receptor in schizophrenia- decreased mRNA levels in peripheral blood lymphocytes, FASEB J 17 (2003) 1948-1950.

146. S.E. Counts, B. He, S. Che, M.D. Ikonomovic, S.T. DeKosky, S.D. Ginsberg, E.J. Mufson, Alpha7 nicotinic receptor up-regulation in cholinergic basal forebrain neurons in Alzheimer disease, Arch Neurol 64 (2007) 1771-1776.

147. E. Hellstrom-Lindahl, M. Mousavi, X Zhang, R. Ravid, A. Nordberg, Regional distribution of nicotinic receptor subunit mRNAs in human brain: comparison between Alzheimer and normal brain, Brain Res Mol Brain Res 66 (1999) 94-103.

148. Alzheimer's disease- histotopographical correlation with amyloid plaques and hyperphosphorylated-tau protein, Eur J Neurosci 11 (1999) 2551-2565.

149. Z.Z. Guan, X. Zhang, R. Ravid, A. Nordberg, Decreased protein levels of nicotinic receptor subunits in the hippocampus and temporal cortex of patients with Alzheimer's disease, J Neurochem 74 (2000) 237-243.

150. P. Davies, S. Feisullin, Postmortem stability of alpha-bungarotoxin binding sites in mouse and human brain, Brain Res 216 (1981) 449-454.

151. K. Sugaya, E. Giacobini, V.A. Chiappinelli, Nicotinic acetylcholine receptor subtypes in human frontal cortex: changes in Alzheimer's disease, J Neurosci Res 27 (1990) 349-359.

152. M.D. Ikonomovic, L. Wecker, E.E. Abrahamson, J. Wuu, S.E. Counts, S.D. Ginsberg, E.J. Mufson, S.T. Dekosky, Cortical alpha7 nicotinic acetylcholine receptor and beta-amyloid levels in early Alzheimer disease, Arch Neurol 66 (2009) 646-651.

153. T. Teaktong, A. Graham, J. Court, R. Perry, E. Jaros, M. Johnson, R. Hall, E. Perry, Alzheimer's disease is associated with a selective increase in alpha7 nicotinic acetylcholine receptor immunoreactivity in astrocytes, Glia 41 (2003) 207-211.

154. H.Y. Wang, W. Li, N.J. Benedetti, D.H. Lee, Alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors mediate beta-amyloid peptide-induced tau protein phosphorylation, J Biol Chem 278 (2003)31547-31553.

155. Q. Liu, H. Kawai, D K. Berg, beta -Amyloid peptide blocks the response of alpha 7-containing nicotinic receptors on hippocampal neurons, Proc Natl Acad Sci U S A 982001)4734-4739.

156. D.L. Pettit, Z. Shao, J.L. Yakel, beta-Amyloid(l-42) peptide directly modulates nicotinic receptors in the rat hippocampal slice, J Neurosci 21 (2001) RC120.

157. G. Dziewczapolski, C.M. Glogowski, E. Masliah, S.F. Heinemann, Deletion of the alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor gene improves cognitive deficits and synaptic pathology in a mouse model of Alzheimer's disease, J Neurosci 29 (2009) 8805-8815.

158. P. Whiting, J. Lindstrom, Purification and characterization of a nicotinic acetylcholine receptor from rat brain, Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987) 595-599.

159. L.W. Swanson, D.M. Simmons, P.J. Whiting, J. Lindstrom, Immunohistochemical localization of neuronal nicotinic receptors in the rodent central nervous system, J Neurosci 7 (1987) 3334-3342

160. S.J. Tzartos, D.E. Rand, B.L. Einarson, J.M. Lindstrom, Mapping of surface structures of electrophorus acetylcholine receptor using monoclonal antibodies, J Biol Chem 256 (1981) 8635-8645.

161. K.E. McLane, X. Wu, J.M. Lindstrom, B.M. Conti-Tronconi, Epitope mapping of polyclonal and monoclonal antibodies against two alpha-bungarotoxin-binding alphai subunits from neuronal nicotinic receptors, J Neuroimmunol 38 (1992) 115-128.

162. W.G. Conroy, A.B. Vernallis, D.K. Berg, The alpha 5 gene product assembles withmultiple acetylcholine receptor subunits to form distinctive receptor subtypes in brain, Neuron 9 (1992) 679-691.

163. R. Fabian-Fine, P. Skehel, M.L. Errington, H A. Davies, E. Sher, M.G Stewart, A. Fine, Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in ratihippocampus, J Neurosci 21 (2001) 7993-8003.

164. H. Kawai, W. Zago, D.K. Berg, Nicotinic alpha 7 receptor clusters on hippocampal GABAergic neurons: regulation by synaptic activity and neurotrophins, J Neurosci 222002) 7903-7912.

165. M. Zoli, M. Moretti, A. Zanardi, J.M. Mcintosh, F. Clementi, C. Gotti, Identification of the nicotinic receptor subtypes expressed on dopaminergic terminals in the rat striatum, J Neurosci 22 (2002) 8785-8789.

166. B.M. Conti-Fine, S. Lei, K.E. McLane, Antibodies as tools to study the structure of membrane proteins: the case of the nicotinic acetylcholine receptor, Annu Rev Biophys Biomol Struct 25 (1996) 197-229.

167. D.L. Herber, E.G. Severance, J. Cuevas, D. Morgan, M.N. Gordon, Biochemical and histochemical evidence of nonspecific binding of alpha7nAChR antibodies to mouse brain tissue, J Histochem Cytochem 52 (2004) 1367-1376.

168. S. Neff, K. Dineley-Miller, D. Char, M. Quik, J. Patrick, Production of polyclonal antisera that recognize and distinguish between the extracellular domains of neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunits, JNeurochem 64 (1995) 332-339.

169. S. Vailati, M. Moretti, R. Longhi, G.E. Rovati, F. Clementi, C. Gotti, Developmental expression of heteromeric nicotinic receptor subtypes in chick retina, Mol Pharmacol 63 (2003) 1329-1337.

170. S. Di Angelantonio, M.E. De Stefano, A. Piccioni, L Lombardi, C. Gotti, P. Paggi, Lack of dystrophin functionally affects alpha3beta2/beta4-nicotinic acetylcholine receptors in sympathetic neurons of dystrophic mdx mice, Neurobiol Dis 41 528-537.

171. M. Tomizawa, J.E. Casida, Minor structural changes in nicotinoid insecticides confer differential subtype selectivity for mammalian nicotinic acetylcholine receptors, Br J Pharmacol 127 (1999) 115-122.

172. I.E. Kasheverov, Y.N. Utkin, V.I. Tsetlin, Naturally occurring and synthetic peptides acting on nicotinic acetylcholine receptors, Curr Pharm Des 15 (2009) 2430-2452.

173. P.A. Quiram, J.J. Jones, S.M. Sine, Pairwise interactions between neuronal alpha7 acetylcholine receptors and alpha-conotoxin Iml, J Biol Chem274 (1999) 19517-19524.

174. P.A. Quiram, J.M. Mcintosh, S.M. Sine, Pairwise interactions between neuronal alpha(7) acetylcholine receptors and alpha-conotoxin PnIB, J Biol Chem 275 (2000) 4889-4896.

175. C. Ulens, R.C. Hogg, P.H. Celie, D. Bertrand, V. Tsetlin, A.B. Smit, T.K. Sixma, Structural determinants of selective alpha-conotoxin binding to a nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP, Proc Natl Acad Sci U S A 103 (2006) 3615-3620.

176. E.G. Livett, D.W. Sandall, D. Keays, J. Down, K R. Gayler, N. Satkunanathan, Z. Khalil, Therapeutic applications of conotoxins that target the neuronal nicotinic acetylcholine receptor, Toxicon48 (2006) 810-829.

177. A.J. Hone, P. Whiteaker, J.L. Mohn, M H. Jacob, J.M. Mcintosh, Alexa Fluor 546-ArIBVllL;V16A] is a potent ligand for selectively labeling alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors, J Neurochem 114 (2010) 994-1006.

178. A. J. Hone, P. Whiteaker, S. Christensen, Y. Xiao, E L. Meyer, J.M. Mcintosh, A novel fluorescent alpha-conotoxin for the study of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors, J Neurochem 111 (2009) 80-89.

179. P.C. Pugh, R.A. Corriveau, W.G. Conroy, D.K. Berg, Novel subpopulation of neuronal acetylcholine receptors among those binding alpha-bungarotoxin, Mol Pharmacol 47 (1995)717-725.

180. C.J. Keiger, D. Prevette, W.G. Conroy, R.W. Oppenheim, Developmental expression of nicotinic receptors in the chick and human spinal cord, J Comp Neurol 455 (2003) 86-99.

181. V.T. Nguyen, A. Ndoye, S.A. Grando, Novel human alpha9 acetylcholine receptor regulating keratinocyte adhesion is targeted by Pemphigus vulgaris autoimmunity, Am J Pathol 157(2000) 1377-1391.

182. P. Kumar, S. Meizel, Nicotinic acetylcholine receptor subunits and associated proteins in human sperm, J Biol Chem 280 (2005) 25928-25935.

183. H. Peng, R.L. Ferris, T. Matthews, H Hiel, A. Lopez-Albaitero, L.R. Lustig, Characterization of the human nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha (alpha) 9 (CHRNA9) and alpha (alpha) 10 (CHRNA10) in lymphocytes, Life Sci 76 (2004) 263280.

184. K.S. Lips, U. Pfeil, W. Kummer, Coexpression of alpha 9 and alpha' 10 nicotinic acetylcholine receptors in rat dorsal root ganglion neurons, Neuroscience 115 (2002) 1-5.

185. C.M. McGann, J. Bracamontes, J.H. Steinbach, J.R. Sanes, The cholinergic antagonist alpha-bungarotoxin also binds and. blocks a subset of GAB A receptors, Proc Natl Acad Sci U S A 103 (2006) 5149-5154.

186. P.B. Clarke, R.D. Schwartz, S.M. Paul, C.B. Pert, A. Pert, Nicotinic binding in rat brain: autoradiographic comparison of 3H]acetylcholine, [3H]nicotine, and [125I]-alpha-bungarotoxin, J Neurosci 5 (1985) 1307-1315.

187. I. W. Jones, S. Wonnacott, Precise localization of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors on glutamatergic axon terminals in the rat ventral tegmental area, J Neurosci 24 (2004) 11244-11252.

188. I.W. Jones, J. Barik, M.J. O'Neill, S. Wonnacott, Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors, J Neurosci Methods 134 (2004) 65-74.

189. J.M. Gershoni, E. Hawrot, T.L. Lentz, Binding of alpha-bungarotoxin to isolated alpha subunit of the acetylcholine receptor of Torpedo californica: quantitative analysis with protein blots, Proc Natl Acad Sci U S A 80 (1983) 4973-4977.

190. Y. Sekine-Aizawa, R.L. Huganir, Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors, Proc Natl Acad Sci U S A 101 (2004) 17114-17119.

191. Y. Xiao, G.R. Abdrakhmanova, M. Baydyuk, S. Hernandez, K.J. Kellar, Rat neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing alpha7 subunit: pharmacological properties of ligand binding and function, Acta Pharmacol Sin 30 (2009) 842-850.

192. C.J. Frazier, Y.D. Rollins, C.R. Breese, S. Leonard, R. Freedman, T.V. Dunwiddie, Acetylcholine activates an alpha-bungarotoxin-sensitive nicotinic current in rat hippocampal interneurons, but not pyramidal cells, J Neurosci 18 (1998) 1187-1195.

193. R. Ogier, X. Liu, E. Tribollet, D. Bertrand, M. Raggenbass, Identified spinal motoneurons of young rats possess nicotinic acetylcholine receptors of the heteromeric family, Eur J Neurosci 20 (2004) 2591-2597.

194. N. Kaneko, H. Okano, K. Sawamoto, Role of the cholinergic system in regulating survival of newborn neurons in the adult mouse dentate gyrus and olfactory bulb, Genes Cells 11 (2006) 1145-1159.

195. S. Aznar, V. Kostova, S.H. Christiansen, G.M. Knudsen, Alpha 7 nicotinic receptor subunit is present on serotonin neurons projecting to hippocampus and septum, Synapse 55 (2005) 196-200.

196. B. Csillik, P. Rakic, E Knyihar-Csillik, Peptidergic innervation and the nicotinic acetylcholine receptor in the primate basal nucleus, Eur JNeurosci 10 (1998) 573-585.

197. C.J. Dean, Preparation, and characterization of monoclonal antibodies to proteins and other cellular components, Methods MolBiol 32 (1994) 361-379.

198. A.S. Korotina, E.V. Kriukova, E.A. Azeeva, A.F. Sheval'e, N. Utkin Iu, V.I. Tsetlin, Sensitive nonradioactive screening method, for compounds interacting with alpha7-cholinoreceptor], Bioorg Khim 29 (2003) 391-396.

199. C. Virginio, A Giacometti, L. Aldegheri, J.M. Rimland, G.C. Terstappen, Pharmacological properties of rat alpha 7 nicotinic receptors expressed in native and recombinant cell systems, Eur J Pharmacol 445 (2002) 153-161.

200. G.L. Peterson, A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable, Anal Biochem 83 (1977) 346-356.

201. M.A. Cascieri, T. Liang, Characterization of the substance P receptor in rat brain cortex membranes and the inhibition of radioligand binding by guanine nucleotides, J Biol Chem 258 (1983) 5158-5164.

202. R.E. Hibbs, T.T. Talley, P. Taylor, Acrylodan-conjugated cysteine side chains reveal conformational state and ligand site locations of the acetylcholine-binding protein, J Biol Chem 279 (2004) 28483-28491.

203. B.M. Conti-Tronconi, S.M. Dunn, E.A. Barnard, J.O. Dolly, F.A. Lai, N. Ray, M.A. Raftery, Brain and muscle nicotinic acetylcholine receptors are different but homologous proteins, Proc Natl Acad Sci U S A 82 (1985) 5208-5212.

204. R.I. Norman, F. Mehraban, E.A. Barnard, J.O. Dolly, Nicotinic acetylcholine receptor from chick optic lobe, Proc Natl Acad Sci U S A 79 (1982) 1321-1325.

205. S.N. Sudweeks, J.L. Yakel, Functional and molecular characterization of neuronal nicotinic ACh receptors in rat CA1 hippocampal neurons, J Physiol 527 Pt 3 (2000) 515528.

206. D. Servent, V. Winckler-Dietrich, H.Y. Hu, P. Kessler, P. Drevet, D. Bertrand, A. Menez, Only snake curaremimetic toxins with a fifth disulfide bond have high affinity for the neuronal alpha7 nicotinic receptor, J Biol Chem 272 (1997) 24279-24286.

207. R. Chicheportiche, J.P. Vincent, C. Kopeyan, H. Schweitz, M. Lazdunski, Structure-function relationship in the binding of snake neurotoxins to the torpedo membrane receptor, Biochemistry 14 (1975) 2081-2091.

208. T. Endo, M. Nakanishi, S. Furukawa, F.J. Joubert, N. Tamiya, K. Hayashi, Stopped-flow fluorescence studies on binding kinetics of neurotoxins with acetylcholine receptor, Biochemistry 25 (1986) 395-404.

209. V.I. Tsetlin, F. Hucho, Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications, FEBS Lett 557 (2004) 9-13.

210. D.M. Fambrough, H.C. Hartzell, Acetylcholine receptors: number and distribution at neuromuscular junctions in rat diaphragm, Science 176 (1972) 189-191.

211. A. Ishiyama, I. Lopez, P.A. Wackym, Distribution of efferent cholinergic terminals and alpha-bungarotoxin binding to putative nicotinic acetylcholine receptors in the human vestibular end-organs, Laryngoscope 105 (1995) 1167-1172.

212. J.R. Genzen, W. Van Cleve, D.S. McGehee, Dorsal root ganglion neurons express multiple nicotinic acetylcholine receptor subtypes, J Neurophysiol 86 (2001) 1773-1782.

213. R.V. Haberberger, N. Bernardini, M. Kress, P. Hartmann, K.S. Lips, W. Kummer, Nicotinic acetylcholine receptor subtypes in nociceptive dorsal root ganglion neurons of the adult rat, Auton Neurosci 113 (2004) 32-42.

214. K.K. Rau, R.D. Johnson, B.Y. Cooper, Nicotinic AChR in subclassified capsaicin-sensitive and -insensitive nociceptors of the rat DRG, J Neurophysiol 93 (2005) 13581371.

215. N.J. Sucher, T.P. Cheng, S.A. Lipton, Neural nicotinic acetylcholine responses in sensory neurons from postnatal rat, Brain Res 533 (1990) 248-254.

216. G. Polz-Tejera, S.P. Hunt, J. Schmidt, Nicotinic receptors in sensory ganglia, Brain Res 195 (1980) 223-230.

217. M.I. Damaj, M. Fei-Yin, M. Dukat, W. Glassco, R.A. Glennon, B.R. Martin, Antinociceptive responses to nicotinic acetylcholine receptor ligands after systemic and intrathecal administration in mice, J Pharmacol Exp Ther 284 (1998) 1058-1065.

218. S.D. Gilbert, T.M. Clark, C.M. Flores, Antihyperalgesic activity of epibatidine in the formalin model of facial pain, Pain 89 (2001) 159-165.

219. Y.L. Liu, H.M. Lin, R. Zou, J.C. Wu, R Han, L.N. Raymond, P.F. Reid, Z.H. Qin, Suppression of complete Freund's adjuvant-induced adjuvant arthritis by cobratoxin, Acta Pharmacol Sin 30 (2009) 219-227.

220. P. Curzon, A.L. Nikkei, A.W. Bannon, S.P. Arneric, M.W. Decker, Differences between the antinociceptive effects of the cholinergic channel activators A-85380 and (+/-)-epibatidine in rats, J Pharmacol Exp Ther 287 (1998) 847-853.

221. Y. Wang, D.M. Su, R.H. Wang, Y. Liu, H. Wang, Antinociceptive effects of choline against acute and inflammatory pain, Neuroscience 132 (2005) 49-56.

222. R.C. Drisdel, E. Manzana, W.N. Green, The role of palmitoylation in functional expression of nicotinic alpha7 receptors, J Neurosci 24 (2004) 10502-10510.

223. R.J. Thompson, J.F. Doran, P. Jackson, A.P. Dhillon, J. Rode, PGP 9.5~a new marker for vertebrate neurons and neuroendocrine cells, Brain Res 278 (1983) 224-228.

224. M. Ninkovic, S.P. Hunt, Alpha-bungarotoxin binding sites on sensory neurones and their axonal transport in sensory afferents, Brain Res 272 (1983) 57-69.

225. M. Zoli, N. Le Novere, J.A. Hill, Jr., J.P. Changeux, Developmental regulation of nicotinic ACh receptor subunit mRNAs in the rat central and peripheral nervous systems, J Neurosci 15 (1995) 1912-1939.

226. M. Fornaro, J.M. Lee, S. Raimondo, S. Nicolino, S. Geuna, M. Giacobini-Robecchi, Neuronal intermediate filament expression in rat dorsal root ganglia sensory neurons: an in vivo and in vitro study, Neuroscience 153 (2008) 1153-1163.

227. S.N. Lawson, M.J. Perry, E. Prabhakar, P.W. McCarthy, Primary sensory neurones: neurofilament, neuropeptides, and conduction velocity, Brain Res Bull 30 (1993) 239243.

228. D.L. Bennett, S. Averill, D.O. Clary, J.V. Priestley, S.B. McMahon, Postnatal changes in the expression of the trkA high-affinity NGF receptor in primary sensory neurons, Eur J Neurosci 8 (1996) 2204-2208.

229. D.C. Molliver, D.E. Wright, M.L. Leitner, A.S. Parsadanian, K. Doster, D. Wen, Q. Yan, W.D. Snider, IB4-binding DRG neurons switch from NGF to GDNF dependence in early postnatal life, Neuron 19 (1997) 849-861.

230. C.J. Woolf, Q. Ma, Nociceptors-noxious stimulus detectors, Neuron 55 (2007) 353-364.

231. A. Guo, L. Vulchanova, J. Wang, X. Li, R. Elde, Immunocytochemical localization of the vanilloid receptor 1 (VR1): relationship to neuropeptides, the P2X3 purinoceptor and IB4 binding sites, Eur J Neurosci 11 (1999) 946-958.

232. W.D. Snider, S.B. McMahon, Tackling pain at the source: new ideas about nociceptors, Neuron 20 (1998) 629-632.

233. M. Tominaga, M.J. Caterina, A.B. Malmberg, T.A. Rosen, H. Gilbert, K. Skinner, B.E. Raumann, A.I. Basbaum, D. Julius, The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli, Neuron 21 (1998) 531-543.

234. M.J. Caterina, M.A. Schumacher, M. Tominaga, T.A. Rosen, J.D. Levine, D. Julius, The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway, Nature 389 (1997)816.824.

235. C. Torsney, R.L. Anderson, K.A. Ryce-Paul, A.B. MacDerraott, Characterization of sensory neuron subpopulations selectively expressing green fluorescent protein in phosphodiesterase 1C BAC transgenic mice, Mol Pam 2 (2006) 17.

236. J.R. Genzen, D.S. McGehee, Short- and long-term enhancement of excitatory transmission in the spinal cord dorsal horn by nicotinic acetylcholine receptors, Proc Natl Acad SciU S A 100 (2003) 6807-6812.

Информация о работе

Шелухина, Ирина Валерьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Разработка методов детекции нейрональных a7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы