Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка клеточных биоэлементов сенсоров и ферментативных методов для анализа метанола, этанола и формальдегида.

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка клеточных биоэлементов сенсоров и ферментативных методов для анализа метанола, этанола и формальдегида."

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

"Б ОД

МАЙДАН МИКОЛА МИКОЛАЙОВИЧ

• 7 ОКТ 1998

УДК 577.150.87

РОЗРОБКА КЛІТИННИХ БІОЕЛЕМЕНТІВ СЕНСОРІВ ТА ФЕРМЕНТАТИВНИХ МЕТОДІВ ДЛЯ АНАЛІЗУ МЕТАНОЛУ, ЕТАНОЛУ ТА ФОРМАЛЬДЕГІДУ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Львів -1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (м. Львів).

Наукові керівники:

доктор біологічних наук, професор Сибірний Андрій Андрійович

Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, зав. відділом біохімічної генетики

кандидат хімічних наук, доцент Гончар Михайло Васильович

Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, старший науковий співробітник

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Луцик Максим Дмитрович

Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Магеровський Юрій Васильович Львівський НДІ патології крові та трансфузійних препаратів, старший науковий співробітник

Провідна установа: Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (м. Київ), відділ фітопатогенних бактерій

Захист відбудеться "2 " 1998 року о на засіданні

спеціалізованої вченої ради К 35.238.01 у Відділенні регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 290005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Автореферат дисертації розісланий " ^ \ 998 р.

Вчений секретар ¿у?

спеціалізованої вченої ради Федорович Д. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Проведення швидкого і надійного аналізу таких полук як метанол, етанол та формальдегід є необхідним в медицині, фармакології, імічних та біотехнологічних виробництвах, у справі контролю стану оточуючого ередовища. Для аналізу цих сполук використовується кілька підходів, і серед них се більшого застосування набувають новітні ферментативні та біосенсорні методи, la сьогодні відомо декілька біосенсорних систем для аналізу спиртів та юрмальдегіду, в яких чутливим елементом є інтактні клітини. Слід зазначити, що акі системи мало селективні [Wiseman, 1992J, а це вимагає використання нових ідходів при роботі в цьому напрямку.

Гончаром MB. із сп. [1996] на прикладі метилотрофних дріжджів показано іерспективність застосування при розробці аналітичних систем генетичного онструювання мутантних штамів мікроорганізмів із наперед заданими порушеннями ¡евних ланок метаболізму. Скерована зміна біохімічної відповіді мутантних клітин на іаявність певних сполук відкриває перспективу створення клітинних елементів :енсорів, які би володіли перевагами ферментних елементів (швидкий відгук, висока Флективність) і біоелементів на основі інтактних клітин (простота одержання, низька :обівартість).

У зв'язку з цим видалось актуальним провести пошук штамів дріжджів, іридатних для використання в аналітичних цілях, та дослідити можливість створення ¡исокоселективних клітинних біосенсорних пристроїв, чутливих до метанолу, гтанолу та формальдегіду, на основі генетично сконструйованих та природних итамів різних видів дріжджів із застосуванням електрохімічних та напівпровідникових перетворювачів.

У аналітичній біохімії широко використовується ферментативний підхід для фотометричного визначення різноманітних речовин. Відомі фірми “Boehringer Hannheim” та “Sigma” пропонують великий асортимент тест-наборів для фотометричного аналізу низькомолекулярних сполук. Слід зазначити, що аналітичні діагнос-гикуми у структурі ринку біотехнологічних продуктів розвинутих країн займають у вартісному вираженні провідне місце, тоді як вітчизняна промисловість випускає незначний асортимент продуктів такого типу, незважаючи на гостру потребу в них.

Аналітичні набори для кількісного визначення етанолу, метанолу та формальдегіду в Україні, як і в країнах СНД, взагалі відсутні, а імпортні набори для аналізу етанолу дуже дорогі, а тому часто не доступні вітчизняним споживачам. Для зизначення метанолу використовують, як правило, газо-рідинну хроматографію, збладнання для якої є недоступним для більшості лабораторій.

У зв'язку з цим створення вітчизняних аналітичних діагностикумів для ферментативного визначення етанолу, метанолу, формальдегіду видається актуальним питанням.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є

частиною досліджень відділу біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ за темами: "Екструзія протонів та перекису водню клітинами метилотрофних дріжджів та модуляція цих процесів на генетичному та метаболічному рівнях", "Регуляція утворення та детоксикації перекису водню у метилотрофних дріжджів", “Розробка ферментативних діагностикумів для кількісного визначення етанолу, метанолу, формальдегіду та глюкози в біологічних рідинах та харчових продуктах”.

Мета та завдання дослідження.

Метою даної роботи було:

- створення лабораторних моделей біосенсорів на основі клітин дріжджів для кількісного визначення метанолу, етанолу та формальдегіду;

- розробка ферментативних методів аналізу вищевказаних сполук.

Основними завданнями роботи було:

1. Проведення скринінгу штамів метилотрофних дріжджів за активністю поглинання кисню та продукції перекису водню у присутності етанолу та метанолу.

2. Створення клітинних елементів Ог- і НгОг-електродів для визначення алкоголю та вивчення умов стабілізації клітинних біоелементів.

3. Дослідження природи окислення екзогенного формальдегіду в клітинах дріжджів та пошук штамів дріжджів із підвищеною закислювальною здатністю, індукованою формальдегідом.

4. Конструювання клітинних сенсорів на основі pH-чутливих польових транзисторів (pH-ПТ) для аналізу формальдегіду.

5. Вивчення робочих параметрів сконструйованих мікробних сенсорних систем.

6. Розробка ферментативних фотометричних методів аналізу етанолу те метанолу із застосуванням алкогольоксидази метилотрофних дріжджів.

Наукова новизна та практична цінність роботи. Виявлено штами дріжджів : метаболічно детермінованою селективністю до формальдегіду, проведено їх анапі: та охарактеризовано природу окислення формальдегіду в клітинах метилотрофних та неметилотрофних дріжджів. Вперше показано роль мітохондріальної

альдегіддегідрогенази в окисленні in vivo екзогенного формальдегіду, що може служити одним із механізмів його детоксикації.

Вперше клітини неметилотрофних дріжджів Candida maltosa та Saccharomyces cerevisiae застосовано як основу біоелементів чутливих до формальдегіду сенсорів, створено лабораторні моделі клітинних біосенсорів на основі зазначених вищє клітин та pH-ПТ як трансдукторів для визначення формальдегіду.

Розроблено біоелементи Ог- і Н202-датчиків для аналізу алкоголю на основ пермеабілізованих клітин мутантних штамів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha.

Розроблено метод селективного визначення метанолу за формальдегідом, який утворюється у алкогольоксидазній реакції, із застосуванням 4-аміно-З-

з

ідразино-5-меркапто-1,2,4-тріазолу. Аналітичний метод може бути призначено для :онтролю стану навколишнього середовища і сертифікації харчових та фармацевтичних продуктів.

Безпосередня практична цінність роботи полягає у розробці нових ііосенсорних та ферментативних методів аналізу спиртів (метанолу та етанолу) і формальдегіду та створенні нового біотехнологічного продукту - ферментативного ііагностикуму "АЛКОТЕСТ” для визначення алкоголю в біологічних рідинах людини, гарчових продуктах та бродильних рідинах. Набір "АЛКОТЕСТ" рекомендовано Фармакологічним комітетом МОЗ України для серійного виробництва.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду іітератури, експериментальної частини, результатів та їх обговорення, висновків та :писку літератури, який включає 182 найменування. Робота викладена на 126 сторінках машинописного тексту і містить 29 рисунків та 12 таблиць. З рисунка та 3 таб-іиці винесено на окремі сторінки. Список літератури розташований на 18 сторінках.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Дисертантом розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Дослідження аналітичних параметрів формальдегідного аналізатора проводилось у співпраці зі співробітниками відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та •енетики НАНУ (м. Київ), які є співавторами наукових праць здобувача. Обговорення га аналіз результатів досліджень проведено з науковими керівниками.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались на І установчому (VIII) з'їзді Українського мікробіологічного товариства, (Одеса, 1993), 7-ому міжнародному симпозіумі з генетики промислових мікроорганізмів (Монреаль, Канада, 1994), 2-ому симпозіумі з судово-медичних наук "Кримінальні сліди" (Краків, Польща, 1994), Конгресі "Мікробна фізіологія та генна регуляція" (Гаага, Нідерланди, 1995), VII Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1997), 19-ому міжнародному спеціалізованому симпозіумі з дріжджів (Брага, Португалія, 1998).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 2 статті, 1 патент України, 1 технічні умови, 10 тез доповідей.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У роботі використовували наступні штами мікроорганізмів:

Hansenula polymorpha 356 (Іеи2) лінії DL1 (дикий тип), люб'язно переданий для досліджень д-ром Л. П. Тихоміровою (Пущіно, Росія); Н. polymorpha 356-83 (fdh~) -мутант, дефектний за формальдегіддегідрогеназою; Н polymorpha С1 (Ієи2, fdh~) -сегрегант гібрида 356-83 та Іеи2 лінії CBS4732; Н. polymorpha К-105 (дсг1, саГ) -безкаталазний мутант зі знятою катаболітною репресією (конститутивний синтез алкогольоксидази при рості на глюкозному середовищі); Н. polymorpha 33-7-4А

(gcrl); Candida maltosa (ade2, дикий тип); Saccharomyces cerevisiae FH4C (дикий тип) з колекції відділу біохімічної генетики Відділення Інституту біохімії.

Клітини культивували до середини логарифмічної фази росту в колбах при 30°С на качалці при постійній аерації (240 об./хв) у мінеральному середовищі .наступного складу, г/л: КН2Р04 - 1; (NH4)2S04 - 3,5; MgS04 х 7Н20 - 0,5; СаСІ2 -0,1. Середовище містило дріжджовий екстракт "Діфко" (0,05%) як джерело мікроелементів та вітамінів. В окремих випадках дріжджовий екстракт додавали у

0,3% концентрації. При необхідності в середовище додавали відповідні фактори росту - лейцин або аденін (0,004%). Як джерело вуглецю використовували окремо 1% (v/v) метанол, 1% (v/v) етанол, 1% (w/v) глюкозу або суміш 0,2% (v/v) гліцерину з 20 мМ форміатом натрію. Біомасу визначали за мутністю розведених суспензій шляхом їх фотометрування.

Визначення закислювальної здатності клітин дріжджів проводили при постійному перемішуванні у незабуференій водній суспензії клітин, попередньо відмитих від середовища. pH середовища вимірювали потенціометрично за допомогою іонометра ЕВ-74. Зміни pH реєстрували за допомогою самописця.

Активності ферментів визначали у безклітинних екстрактах, отриманих руйнуванням клітин у планетарному дезінтеграторі за допомогою скляних кульок. Концентрацію білка визначали за методом Лоурі. Аналіз форміату проводили ферментативно.

Хімічну пермєабілізацію клітин проводили як описано [Zhang and Wang, 1994] та [Пуста и др., 1993]. Ліофільне висушування клітин проводили на промисловому ліофілізаторі на базі Львівського заводу лікарських препаратів.

Аналіз етанолу, метанолу та формальдегіду здійснювали за допомогою транзисторних елементів виробництва НДІ "Мікропроцесор" (м. Київ), перекисного датчика Model 27 та кисневого датчика Model 5330 виробництва Yellow Springs Instruments (США).

При розробці методів ферментативного аналізу спиртів використовували алкогольоксидазу, яку виділяли із безклітинного екстракту мутантного штаму Н. poiymorpha К-105, висолюючи фермент сульфатом амонію.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Використання клітин дріжджів мутантних штамів H. poiymorpha як біоелементів електрохімічних сенсорів для аналізу спиртів.

Перспективним об’єктом для створення систем аналізу алкоголю є метилотрофні дріжджі. Вибір метилотрофних дріжджів зумовлений їх здатністю до надзвичайно високого рівня синтезу алкогольоксидази (АО). Це забезпечує інтенсивне поглинання кисню клітинами та продукцією перекису водню в присутності спиртів, що можливо реєструвати за допомогою електрохімічних датчиків.

Раніше у відділі біохімічної генетики Інституту біохімії ім. О. В Палладіна

^НУ шляхом ступінчатого УФ-мутагенезу був отриманий мутант метилотрофних іріжджів Hansenula polymorpha К-105 [Gonchar et al., 1990] із повним блоком :аталази та конститутивним синтезом АО в середовищі з глюкозою. Клітини цього итаму продукують перекис водню в присутності етанолу та метанолу. Обробка юверхнево-активними речовинами (бромід цетилтриметиламонію або дигітонін) іризводила до підвищення Н202-екскретуючої активності безкаталазних мутантних літин приблизно втричі. Активність продукування перекису водню у перерахунку на І мг сухої ваги оброблених клітин складала 1-1,2 мкмоль/хв. Позитивний ефект іермеабілізації пояснюється порушенням бар'єрної функції цитоплазматичної мембрани.

Оскільки у сухому стані біоелементи проявляють найвищу стабільність, їивчались умови приготування сухих клітинних препаратів та вплив деяких речовин на активність АО під час їх висушування та зберігання. Перед ліофілізацією до ;успензії клітин додавались наступні сполуки: дульцит, сорбіт, сахароза, інозит. За наявності дульциту, сахарози, інозиту під час ліофілізації зберігалось 100% вихідної активності АО. Сорбіт не проявляв помітного стабілізуючого ефекту - під час зисушування активність АО знижувалась на 40-45%, як і у контрольному варіанті без іобавок. Показано високу стабільність АО в сухих препаратах клітин: варіант із ггабілізатором демонстрував зниження активності в перші 5 діб інкубації при 37°С пише на 14-20% і збереження цього рівня активності протягом 3-ох наступних тижнів.

Висока алкоголь-індукована Н202-продукуюча активність дозволила зикористати клітинні препарати штама К-105 як чутливий до спиртів елемент іерекисного датчика. Чутливу мембрану формували розміщенням суспензії зиготовлених клітинних препаратів між полікарбонатною (зовнішня) та ^елюлозоацетатною (внутрішня) мембранами. Одержану мембрану типу "сендвіч" іакріплювали на чутливій поверхні Н202-електроду.

При додаванні розчину спирту до робочої комірки реєстрували змперометричний сигнал. Досягнення стаціонарної фази відгуку займало коло 1,5 хв. Величина сигналу прямо пропорційно змінювалась в межах концентрації 0,4-4,0 мМ для етанолу і 0,05-1,2 мМ для метанолу (рис. 1). Більша чутливість сенсора до метанолу пояснюється кращими кінетичними характеристиками АО по відношенню цо метанолу.

Для біоелементів на основі клітин безкаталазного штаму показано, що при іроведенні 20-25 аналізів на добу протягом двох-трьох днів відгук зберігається на постійному рівні і поступово зменшується протягом наступних 4 днів до 80% від точаткового рівня (рис. 2).

Для створення біосенсора для аналізу спиртів на основі кисневого датчика, Зуло використано клітини мутантного штаму Н. polymorpha 33-7-4А. Певна регуляторна мутація дала змогу підвищити рівень клітинного синтезу АО в ;ерсдовищі з глюкозою і, таким чином, збільшити швидкість поглинання кисню у

присутності алкоголю до 1,3 мкмоль 02/хв . мг клітин, що в 4 рази перевищує рівень, характерний для штаму дикого типу.

Максимальне споживання кисню спостерігалось для інтактних клітин, вирощених на глюкозі, при використанні спиртів (метанолу або етанолу) як дихальних субстратів. У присутності глюкози рівень споживання кисню приблизно в 10 разів менший, ніж за наявності спиртів у інкубаційній суміші.

Хімічна обробка клітин поверхнево-активними речовинами (дигітонін або бромід цетилтриметиламонію) сприяє щезанню дихання в присутності глюкози, у той же час дихання в присутності спиртів залишається на високому рівні. Це, очевидно, зумовлено виходом з клітин кофакторів та гліколітичних ферментів, необхідних для окислення глюкози, а індуковане спиртами дихання викликане поглинанням кисню за участю алкогольоксидази, яка зберігає внутрішньоклітинну локалізацію після пермеабілізації клітин.

Отже, введення певних мутацій та хімічна обробка мутантних клітин сприяє підвищенню селективності дихального відгуку клітин. Препарат клітин штаму 33-7-4А було застосовано як селективний елемент 02-датчика для аналізу спиртів. Сухі клітинні препарати штаму 33-7-4А було виготовлено за методикою, описаною для клітин штаму К-105, з використанням сахарози як стабілізуючого агента. Результати дослідження стабільності АО в таких препаратах виявили подібну закономірність, яка спостерігалась для ліофілізованих клітин Н. роїутогріїа К-105. За умов зберігання при 37°С у перші 6 днів аістивність АО поступово знижувалась до 80% від вихідної, а потім залишалась незмінною протягом наступних трьох тижнів.

Клітинні препарати іммобілізували в гелі альгінату кальцію між тефлоновою та

0 ' 1 ' 2 ' З ' 4

Концентрація спирту, мМ

Рис. 1. Залежність величини сигналу клітинного Н202-біосенсора від концентрації етанолу (о) та метанолу (•).

120

х

СГ

т 20 -

0-1—.—,—,—,—,—,—,—,—,—,—,—г-0 20 40 60 80 100 120

Час, год

Рис. 2. Операційна стабільність біоелементів сенсорів на основі клітин Н. роїутогрЬа К-105 (о) та Н. роїутогрЬа 33-7-4А (•).

полікарбонатною мембранами і закріплювали на чутливій поверхні кисневого електроду. Додавання спирту в робочу комірку сенсора веде до локальної зміни концентрації кисню на чутливій поверхні датчика, що призводить до падіння сили струму. Для відгуку біосенсора характерно, що сигнал розвивався швидше, ніж у

ія менш ніж за 0,5 хв.

Лінійний діапазон залежності зміни сили струму від концентрації спирту в аналізованому розчині складав 0,21,2 мМ для етанолу і 0,03-0,35 мМ для метанолу (рис. 3). Стабільність біоелемента на основі клітин штаму 33-7-4А подібна до тієї, яка спостерігалась для клітин штама К-105. Величина сигналу не змінювалась протягом двох днів і поступово зменшувалась до 80% від вихідного рівня протягом наступних 4 днів експлуатації (див. рис. 2). Відносна стандартна похибка паралельних вимірювань для обох біосенсорів не перевищувала 7%.

Імовірно, що подальший прогрес у конструюванні селективних біосенсорів для диференційного аналізу спиртів і альдегідів може бути досягнутий створенням мембран із заданою проникливістю (розділення спиртів та альдегідів) або скерованою зміною субстрат-зв'язуючих центрів алкогольоксидази методами білкової інженерії.

Вивчення ферментативної природи окислення екзогенного формальдегіду в клітинах дріжджів.

Порівняно недавно було виявлено сильно виражену здатність інтактних клітин метилотрофних дріжджів Напзепиіа роїутогріїа закислювати середовище інкубації у відповідь на внесення формальдегіду. Крім теоретичного аспекту, це явище має прикладний інтерес. Адже висока селективність даного процесу дозволяє розглядати продукцію кислих метаболітів як специфічну клітинну відповідь на наявність у середовищі формальдегіду. Тому було вирішено провести пошук штамів дріжджів із підвищеною закислювальною здатністю, індукованою формальдегідом, з метою використання відібраних штамів для створення сенсорів на основі рН-чутливих польових транзисторів (рН-ПТ) для визначення формальдегіду.

Раніше для метилотрофних дріжджів було показано залежність індукованого формальдегідом закислення інкубаційного середовища від активності ферментів

випадку НгОг-єлектроду, і досягав стаціонарного рівь

Концентрація спирту, мМ

Рис. 3. Залежність величини амперометричного сигналу клітинного 02-бюсенсора бід концентрації етанолу (о) та метанолу («).___________________________

прямого шляху окислення метанолу [Гончар и др., 1994]. Тому очевидним здається твердження, що окислення формальдегіду до мурашиної кислоти каталізує глутатіонзалежна формальдегіддегідрогеназа (ФдДГ) за схемою [Fujii & Tonomura, 1972]:

спонтанно ФдДГ ФДГ

нсно + gsh „ ►GS-CH2OH/' ►нсоон y—-^»со2

Н20 GSh\ NAD* NADH(H*)

NAD* NADH(H*)

ФДГ - форміатдегідрогеназа НСОСГ+Н*

Синтез ФдДГ індукується при рості дріжджів у середовищі з метанолом і репресується етанолом і глюкозою [Sahm, 1977]. Тим не менше, мутантні клітини Н. polymorpha 356-83 та С1, позбавлені активності ФдДГ, зберігали здатність до формальдегідзалежного закислення середовища (табл. 1). На основі цього було зроблено припущення, що в клітині існує альтернативний, неспецифічний до природи альдегідів фермент, який здатен окислювати формальдегід in vivo. Незважаючи на відсутність ФдДГ (табл. 2) у цих штамів, повного блокування індукованої формальдегідом екструзії мурашиної кислоти у них не спостерігалось. Для штаму дикого типу ефективність викиду протонів варіювала в залежності як від ростового

Таблиця 1

Залежність швидкості закислення від метаболічного стану клітин дріжджів диких і мутантних штамів та індуктора закислення (М ± m, п = 5)

Штам Ростовий субстрат Питома швидкість закислення, нмоль Н*» хв'1. мг'1 клітин

формальдегід бензальдегід

Н. polymorpha 356 глюкоза етанол гліцерин+ форміат метанол 4.6 ±0,32 5.7 ±0,37 15,9 ± 1,2 17,0 + 1,4 4.2 ±0,33 4,0 ±0,29 5.2 ±0,37

С. maltosa глюкоза етанол 1,7 +0,13 14,8 ± 1,1 1,4 ±0,12 14,2 ±1,1

S. cerevisiae глюкоза етанол 1,5 ±0,11 21,0 ±1,2 1,2 ±0,12 20,3 ±1,3

H. polymorpha 356-83 глюкоза етанол гліцерин+ форміат метанол 3,2 ±0,23 3,4 ±0,25 3,6 ± 0,22 3,0 + 0,18 3.0 ±0,16 4.0 ±0,27 3.1 ±0,16

H. polymorpha C1 глюкоза етанол гліцерин+ форміат метанол 4.6 ±0,33 6,2 + 0,37 6.6 ±0,35 5,4 ± 0,28 4,6 ±0,19 5,3 ±0,27 5,0 ±0,29

Позначення:- не аналізували.

Таблиця 2

Залежність активності деяких ферментів обміну спиртів та альдегідів від метаболічного стану клітин дріжджів диких та мутантних штамів (М + т, п = 5)

Ростовий Питома активність ферментів,

Штам субстрат МКМОЛЬ', хв • мґ білка

ФдДГ ФдР АдДГ

H. polymorpha глюкоза 0,042 ±0,003 0,45 ±0,014 0,028 ±0,003

356 етанол 0,034 ±0,002 0,43 ±0.017 0,044 ±0,003

гліцерин+ форміат 0,40 ±0,024 0,45 ±0,021 0,026 ±0,011

метанол 0,58 ±0,042 0,70 ±0,029 0,043 ±0,004

C. maltosa глюкоза 0,00 0,10 ±0,009 0,031 +0,004

етанол 0,00 3,12 ±0,12 0,29 ±0,017

S. cerevisiae глюкоза 0,00 0,15 ±0,009 0,030 ±0,003

етанол 0,00 5,11 ±0,13 0,56 ±0,029

H. polymorpha глюкоза 0,00 2,18+0,092 0,046 ±0,003

C1 етанол 0,00 1,61 ±0,11 0,050 ±0,017

гліцерин+ форміат 0,00 1,62 ±0,093 0,041 ±0,015

метанол 0,00 - -

H. polymorpha глюкоза 0,00 1,21 ±0,068 0,030 ±0,003

356-83 етанол 0,00 1,56 ±0,060 0,039 ±0,004

гліцерин+ форміат 0,00 1,55 ±0,071 0,032 ±о,ооз

метанол 0,00 - -

означення: ФдДГ - глутатіонзалежна формальдегіддегідрогеназа; ФдР -

юрмальдегідредуктаза; АдДГ - альдегіддегідрогеназа, - не аналізували у зв'язку зі іабким ростом клітин.

/бстрату, так і "індуктора" закислення, тоді як величина швидкості цього процесу ало змінювалась у мутантних штамів метилотрофних дріжджів. Вона складала 180% від максимального рівня, характерного для штаму дикого типу при етилотрофному рості, що практично співмірно зі швидкістю закислення ередовища клітинами дикого типу в умовах репресії ФдДГ глюкозою і етанолом.

Екструзія протонів із паралельним нагромадженням у середовищі іонів юрміату притаманна також і парафінутилізуючим дріжджам Candida maltosa і екарським дріжджам Saccharomyces cerevisiae (див. табл. 1), хоча у цих видів ікроорганізмів не виявляється характерна для метилотрофів глутатіонзалежна 'дДГазна активність. Виявлено, що клітини цих дріжджів, вирощені на середовищі з гано лом, здатні до інтенсивної екструзії протонів у відповідь на внесення юрмальдегіду у середовище інкубації. Швидкість закислення позаклітинного ростору співрозмірна з величиною, характерною для метилотрофно вирощених ріжджів дикого типу H. polymorpha (див. табл. 1). Як у випадку індукованого юрмальдегідом закислення клітинами метилотрофних дріжджів H. polymorpha, иділення Н* клітинами неметилотрофних дріжджів при інкубації з формальдегідом упряжено з викидом форміат-аніонів. Після 5 хв інкубації клітин (1 мг/мл)

ферментативним аналізом у середовищі виявлено 0,1-0,15 мкМ форміат.

Одержані результати можна пояснити участю у процесі окислення формальдегіду у метилотрофних дріжджів, крім глутатіонзалежної ФдДГ, іншого ферменту, здатного окислювати формальдегід. Парафінутилізуючі дріжджі С. maltosa та пекарські дріжджі S. cerevisiae, які здатні іп vivo окислювати екзогенний формальдегід і екскретувати мурашину кислоту, також володіють подібним ферментом, малоселективним до природи альдегіду. Відповідний фермент тісно пов'язаний з обміном етанолу, оскільки індукується цим спиртом, а вирощені на глюкозному середовищі клітини володіють цією здатністю значно меншою мірою.

зв'язок цього процесу з рівнем (АдДГ), активність якої значно зростає при рості на середовищі з етанолом (див. табл. 2). На рис. 4 показано, як у процесі росту клітин С. maltosa у

періодичній культурі відбувається зміна активності АдДГ, яка корелює з відповідним

рівнем закислюючої здатності клітин. Для метилотрофних

клітин індукції даного фермента етанолом практично не спостерігалось (див.табл. 2), що відображується в однаковому

рівні закислювальної здатності клітин метилотрофних дріжджів, вирощених на цих субстратах.

На основі наведених даних можна припускати, що ферментом, який здійснює окислення екзогенного формальдегіду до мурашиної кислоти, є АдДГ, яка каталізує другий етап утилізації етанолу в клітинах дріжджів. Дріжджова АдДГ має широку субстратну специфічність до альдегідів [Steiman et al., 1968], що відображується ) практично однакових рівнях закислення, ініційованого формальдегідом бензальдегідом,, для клітин С. maltosa, S. cerevisiae та мутантних штамів Н polymorpha (див. табл. 1). Цей фермент може розглядатися як компонент системі» окислення формальдегіду та екструзії мурашиної кислоти у досліджуваних дріжджів що служить, вірогідно, формою детоксикації формальдегіду і доповнює уже відом шляхи забезпечення резистентності клітин дріжджів до екзогенного формальдегід} через необоротне відновлення до метанолу продуктом гену ADH1 [Grey et al., 1996 та його окислення за участю алкогольдегідрогенази, кодованої геном ADH5 [Wehne et al., 1993].

Для С. maltosa і S. cerevisiae виявлено активності неспецифічної альдегіддегідрогенази

Є"

ч:55

Час, год

Рис. 4. Залежність швидкості закислення середовища інтактними клітинами дріжджів С. maltosa та питомої активності АдДГ від фази росту в періодичній культурі (ростовий субстрат - етанол).

Для клітин S. cerevisiae спостерігалась аналогічна залежність.

Вивчення робочих характеристик клітинних біосенсорів на основі рН-ПТ ля аналізу формальдегіду.

Клітини С. maltosa і S. cerevisiae, вирощені на етанолі, володіють сильно ираженою здатністю до екструзії мурашиної кислоти при інкубації їх з юрмальдегідом завдяки індукції у клітин неспецифічної АдДГ. Метанол у таких пітин не викликає закислення через відсутність фермента, здатного окислювати цю полуку. Тому клітини цих дріжджів було застосовано для розробки високочутливого :етоду аналізу формальдегіду.

Додавання аналізованого розчину формальдегіду в робочу комірку сенсора икликало локальне закислення середовища клітинами, іммобілізованими в льгінатному гелі на затворі рН-чутливого польового транзистора. Закислення /мовлено окисленням клітинами формальдегіду до мурашиної кислоти і екструзією

Н спричиняє зміну заряду на поверхні іон-селективної мембрани. На рис. 5 зображено типову криву відгуку сенсора, чутливого до формальдегіду. Вона характеризувалась наявністю незначного лаг-періоду. Через 3-5 хв відгук досягав стаціонарного рівня. Відновлення базової лінії відгуку біосенсора спостерігалось при промиванні протягом 10-20 хв. У зв'язку з відносно повільним розвитком сигналу виміри проводились у кінетичному режимі за максимальною швидкістю зміни потенціалу - [dU/dt]„»Kc-la рис. 6 представлено залежність сигналу клітинного сенсора від концентрації юрмальдегіду для незабуферених водних розчинів. Лінійна залежність швидкості ідгуку біосенсорів від концентрації формальдегіду знаходилась в діапазоні 1-75 мМ апівлогарифмічної шкали як при використанні клітин С. maltosa, так і S. cerevisiae. Іінімальна концентрація, яку можна визначити, в обох випадках складала 0,3 мМ.

Досліджено залежність величини відгуку мікробного сенсора від кратності його астосування. Проміжок часу між вимірюваннями не перевищував 20 хв. Операційна габільність за таких умов складала не менше 5-х годин. Протягом цього часу постерігалась хороша відтворювальність величин потенціометричних сигналів -ідносний коефіцієнт варіації вимірів при тій самій мембрані не перевищував 7%. тандартне відхилення величин потенціометричних сигналів для мембран, формованих на поверхні перетворювача de novo, складало близько 10%.

Величина відгуку клітинного сенсора сильно зменшувалась при збільшенні уферної ємності аналізованого розчину, оскільки компоненти буферу, дифундуючи

Рис. 5. Характерна крива відгуку іітинного біосенсора на основі рН-ПТ.

Вимірювання проводили у дистильованій оді. Концентрація клітин (5. сегем'ї/ае) - 15 г/мл.

у мембрану з іммобілізованими клітинами, зменшують концентрацію вільних протонів.

Створений біосенсої є високоселективним п< відношенню до формальде гіду. Серед протестовани: речовин реєструвався пози тивний потенціометричниі сигнал тільки на формаль дегід та бензальдегід негативний - на метанол етанол, пропанол, бутанол ізопропанол, лактат, глюко зу.

Розробка ферментативного методу кількісного аналізу алкоголю.

Алкогольоксидаза, крім метанолу, здатна окислювати і інші первини аліфатичні спирти, зокрема, етанол:

СН3СН2ОН + 02-------------> СНзСН=0 + Н202

На останній реакції грунтується аналітичне використання АО для визначена етанолу за утвореним перекисом водню. Останній окислює в пероксидазній реакці хромоген до забарвленого продукту (барвника), концентрацію якого виміркжт фотометрично:

Пероксидаза

H202 + SH2--------------->S + 2H20

Хромоген Барвник

Для розробки діагностикуму для ферментативного аналізу етанолу на основ алкогольоксидазно-пероксидазного методу як прототип було відібрано спосіЕ визначення активності пероксидази із використанням як хромогена неканцероген ного дигідрохлориду 3,3',5,5'-тетраметилбензидину (ТМБ) [Holland et al., 1974].

При відробці стандартних умов брались до уваги чутливість, зручний час проведення аналізу (10-25 хв), економічність затрат. При підборі умов визначена етанолу показано, що в режимі "плато" межі аналізованих концентрацій алкоголк зміщуються в область малих значень (0,2-6 мкг етанолу в 4 мл реакційної суміші) Така висока чутливість вносить деяку незручність при рутинних аналізах, бо прі. цьому більшість зразків потребує додаткового розведення. Кінетичний режи\ дозволяє адаптувати чутливість методу до конкретних вимог об'єкту (цільна кров сироватка). У кінцевому варіанті аналізу вміст АО в реакційній суміші складав 0,0£ од./мл. Для швидкого перетворення перекису водню, який утворюється Е

Концентрація формальдегіду, мМ

Рис. 6. Залежність сигналу клітинних бюсенсорів на основі рН-ПТ від концентрації формальдегіду.

Вимірювання проводили у дистильованій воді. Концентрація клітин (1 - S.cerevisiae\ 2 - С. maltosa) у біомембрані - 15 мг/мл.

лкогольоксидазній реакції, пероксидаза додавалась в надлишку (за активністю). Як уферну систему було вибрано 50 мМ К-фосфатний буфер, рН 7,0, при якому ктивність АО є максимальною і добре виражено блакитне забарвлення суміші, що егко ідентифікується візуально.

Фотометрування згідно із розробленим методом здійснювалось при рН 1,8 ісля додавання соляної кислоти до кінцевої концентрації 0,1 М. Це пояснюється

необхідністю зупинки реакції та більшим коефіцієнтом екстинкції продукту окислення ТМБ при низьких значеннях рН. На рис. 7 наведено типову калібрувальну криву для визначення етанолу в модельних розчинах за розробленою методикою.

Відтзорювальність результатів паралельних вимірювань аналізувалась на модельних сироватках із різним вмістом алкоголю. У залежності від концентрації алкоголю, коефіцієнт варіації паралельних вимірювань коливається від 1% (3,6 г/л) до 12% (0,1 г/л). При концентраціях, що перевищують юридично допустимий рівень (1 г/л), цей параметр не більший 3%.

На основі розробленого методу створено аналітичний набір "АЛКОТЕСТ". Випробування набору проводились на базі лабораторії токсикології Київського НВО швидкої допомоги та медицини катастроф і лабора-зрії судмедекспертизи Київського гарнізону МО України. Було досліджено проби зові та сироватки 42-х пацієнтів на наявність алкоголю паралельно трьома етодами: газо-рідинною хроматографією, алкогольдегідрогеназним (набір фірми їідта"), алкогольоксидазним (набір "АЛКОТЕСТ"). Виявлено високу кореляцію гзультатів одержаних трьома методами (на рис. 8 приводяться дані для двох етодів).

Термін зберігання набору "АЛКОТЕСТ" визначається стабільністю ферментів.

0,00 0,06 0,12 0,18 0,24 0,30 0,36

Кінцева концентрація етанолу, мМ

Рис. 7. Типова залежність значення оптичної істини від концентрації етанолу в фотометрованій робі.

З

. 2-

1 -

0

0

1

АЛКОТЕСТ

Рис. 8. Кореляція результатів аналізу етанолу І!і), одержаних АО і АДГ методами.

Для перевірки терміну придатності один набір витримували при кімнатній температурі (~20°С), другий - при 4°С. Для першого набору майже повна інактивація (на 95%) відбувалась за 12 тижнів. Зберігання при 4°С протягом 10 місяців не виявило суттєвої зміни активності ферментів.

Розробка ферментативно-хімічного методу кількісного аналізу метанолу.

Фотометричний метод визначення метанолу за генерованим у алкогольоксидазній реакції перекисом водню не дає можливості розрізнити метанол на фоні етанолу, що актуально в токсикологічній практиці. Тому було застосовано інший підхід при розробці методу аналізу метанолу, а саме, за другим продуктом окислення метанолу алкогольоксидазою - формальдегідом.

Для розробки методу визначення метанолу було вибрано спосіб визначення альдегідів із використанням 4-аміно-5-гідразино-3-меркапто-1,2,4-тріазолу (АГМТ), який в реакції з альдегідами формує забарвлений продукт [АуідасІ, 1983]. Спектр поглинання продукту взаємодії цієї сполуки з формальдегідом (максимум поглинання при Х=548 нм) різко відрізняється від спектра поглинання продукту реакції з ацетальдегідом та іншими альдегідами (максимум поглинання при >„=349-355 нм). Чутливість даного методу дозволяє визначати формальдегід в діапазоні концентрацій 0,5-50 нмоль у 1 мл пробі.

Кінцева концентрація метанолу, мкМ Кінцева концентрація метанолу, мкМ

Рис. 9. Калібрувальні криві для визначення метанолу ферментативно-хімічним методом (1 - оптична густина при Я=548 нм; 2 - при Х=355 нм)

А - у модельних розчинах метанолу;

Б - у суміші метанол + етанол (у співвідношенні 1:10)__________________________________

Аналіз проводився у напівкінетичному режимі. Реакція зупинялась додаванням лужного розчину АГМТ для розвитку специфічної кольорової реакції на альдегіди. За таких умов за 10 хв. інкубації окислювалось ~30% метанолу при проведенні аналізу в концентраційному діапазоні 0,3-3,0 нг (-10-100 нмоль) у фотометрованій суміші. У разі наявності етанолу можливість кількісного визначення метанолу у суміші із етанолом зберігалось при їх співвідношенні 1:10 за молярною концентрацією (рис. 9). При таких концентраціях етанол практично не конкурує з

етанолом в алкогольоксидазній реакції.

ВИСНОВКИ

1. Вивчено умови стабілізації алкогольоксидази в ліофіпізованих препаратах пітин мутантних штамів метилотрофних дріжджів Н. poíymorpha. На основі иготовлених клітинних препаратів та 02- і Н202- електродів сконструйовано юдельні клітинні сенсори для аналізу етилового і метилового спиртів та досліджено с аналітичні характеристики.

2. Проведено відбір штамів метилотрофних і неметилотрофних дріжджів за цатністю до індукованої формальдегідом екструзії протонів інтактними клітинами, іперше показано, що інтенсивна генерація мурашиної кислоти в присутності юрмальдегіду відбувається при інкубації інтактних клітин неметилотрофних ріжджів - парафінутилізуючих (Candida maltosa) та пекарських (Saccharomyces erevisiae).

3. Виявлено тісну кореляцію між процесом закислення та активністю еспецифічної, індукованої етанолом альдегіддегідрогенази, що свідчить про участь ього фермента в окисленні екзогенного формальдегіду.

4. Розроблено лабораторні моделі клітинних біосенсорів на основі клітин еметилотрофних дріжджів С. maltosa і S. cerevisiae та pH-чутливих польових ранзисторів для кількісного визначення формальдегіду. Вивчено робочі арактеристики клітинних біосенсорів на основі рН-ПТ.

5. Розроблено методи ферментативного визначення етилового і метилового пиртів за допомогою алкогольоксидази метилотрофних дріжджів. Метод, який зунтується на супряженій алкогольоксидазно-пероксидазній реакції, покладено в снову впровадженого в практику аналітичного набору "АЛКОТЕСТ" для ютометричного аналізу алкоголю в біологічних рідинах та харчових продуктах.

6. Показано, що використання реакції з 4-аміно-3-гідразино-5-меркапто-1,2,4-оіазолом дозволяє селективно визначати метанол у суміші з етанолом за знерованим в алкогольоксидазній реакції формальдегідом Діапазон вимірюваних знцентрацій розробленого метода знаходиться в межах 10-100 нмоль у 1 мл пробі.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

. Gonchar M.V., Maidan. М.М, Korpan Y.I., Sibirny A.A., El'ska A.V. New approaches for irmaldehyde assay based on use of enzymatic kit or pH-sensitive field effect transistor iosensor // In: Enviromental Biotechnology: Principles and Practice (M.Moo-Young, J.A Anderson, A.M.Charkrabarty, eds), Kluwer Academic Publishers, 1995, P.689-700.

. Майдан H.H., Гончар М.В., Сибирный A.A. Окисление экзогенного формальдегида клетках метилотрофных и неметилотрофных дрожжей // Биохимия,- 1997 - т.62 -744-749.

. Гончар М.В., Майдан М.М, Сибірний A.A. Спосіб кількісного визначення перекису

водню та субстратів оксидаз у біологічних об’єктах. Пат. України 10752 А; Заяв. 10.07.95; Опубл. 25.12.96; Бкзл. Пром. Власн.- N 4.

4. Гончар М.В., Сибірний A.A., Майдан М.М. Аналітичний набір для ферментативного визначення алкоголю в біологічних рідинах "АЛКОТЕСТ" // Технічні умови: Затверджено МОЗ України 29.03.1994 p.- Львів, 1994,- 23 с.

5. Maidan М.М., Gonchar M.V., Sibirny A.A., Labedz J., Gubala W. A new analytical kit "ALCOTEST" for enzymatic assay of alcohol and its application for forensic medicine / Abstr. of 2nd Symp.of forensic sciences "Criminalistic Traces".- Kracow (Poland).- 1994.-P.37.

6. Maidan M.M., Gonchar M.V., Sibirny A.A.,. New approach to enzymatic assays of alcohols II Abstr. of 35th IUPAC Congress - Istambul (Turkey).-1995,- Sec. 1-3, P.71

7. Maidan M.M., Gonchar M.V., Korpan Y.I., Sibirny A.A., El’skaya A V. The new cell elements for pH-SFET formaldehyde specific sensor II Abstr. of Fourth World Congress on Biosensors "Biosensors 96",- Bangkok (Thailand).- 1996,- P. 236.

8. Гончар M В., Майдан M. M., Сибірний А. А. Пермеабілізовані мутантні клітини метилотрофних дріжджів як елементи електрохімічних біосенсорів на алкоголь II Тези доповідей VII Укр. біохім. з'їзду (4.1).- Київ,- 1997,- С. 140-141.

АНОТАЦІЯ

Майдан М.М. Розробка клітинних біоелементів сенсорів та ферментативних методів для аналізу метанолу, етанолу та формальдегіду. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Львів, 1998.

У дисертаційній роботі представлено результати роботи по створенню лабораторних моделей клітинних біосенсорних систем та ферментативних методів для кількісного визначення метанолу, етанолу і формальдегіду.

Для підвищення селективності і чутливості біосенсорів на основі електрохімічних (02- і Н202-електроди) і напівпровідникового (pH-чутливі польові транзистори) перетворювачів використано спеціально сконструйовані мутантні штами різних видів дріжджів. Досліджено залежність величини сигналу біосенсоріЕ від буферної ємності розчину, pH, концентрації клітин у чутливих мембранах та ряр інших аналітичних характеристик.

Розроблено фотометричні методи аналізу етанолу і метанолу : використанням алкогольоксидази метилотрофних дріжджів. На основ алкогольоксидазно-пероксидазного підходу створено аналітичний набір "АЛКОТЕСТ для аналізу етанолу в клінічній практиці.

Ключові слова: аналіз, біосєнсор, метанол, етанол, формальдегід, pH чутливі польові транзистори, 02- і НгОг-елекгроди, дріжджі, алкогольоксидаза.

АННОТАЦИЯ

щан Н.Н. Разработка клеточных биоэлементов сенсоров и ферментативных одов для анализа метанола, этанола и формальдегида. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по циальности 03.00.04 - биохимия. - Отделение регуляторных систем клетки титута биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Львов, 1998.

В диссертационной работе представлены результаты работы по созданию ораторных моделей клеточных биосенсорных систем и ферментативных одов для количественного анализа метанола, этанола и формальдегида.

Для повышения селективности и чувствительности биосенсоров с ользованием электрохимических (02- и Н202-электроды) и полупроводникового -чувствительные полевые транзисторы) преобразователей использованы циально сконструированные мутантные штаммы различных видов дрожжей, ледованы зависимость величины сигнала биосенсоров от буферной ёмкости гвора, pH, концентрации клеток в чувствительных мембранах и ряд других литических характеристик.

Разработаны фотометрические методы анализа этанола и метанола с ользованием алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей. На основе эгольоксидазно-пероксидазного подхода создан аналитический набор КОТЕСТ” для анализа этанола в клинической практике.

Ключевые слова: анализ, биосенсор, метанол, этанол, формальдегид, рН-зтвительные полевые транзисторы, 02- и Н202-электроды, дрожжи, огольоксидаза.

SUMMARY

dan М.М. Development of cell sensor bioelements and analytical methods for lysis of methanol, ethanol and formaldehyde. - Manuscript.

Dissertation for the degree of Candidate of Biological Sciences, specialization Ю.04 - biochemistry. - Division of Cell Regulatory System of A.V. Palladin Institute of :hemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 1998.

The thesis contains the results on elaboration of laboratory prototype of cell-based ;ensor systems and enzymatic methods for quantitative assays of methanol, ethanol formaldehyde.

For enhancement of selectivity and sensitivity of biosensors based on ;trochemical (02- and H202-probes) and semiconductor (pH-sensitive field effect sistors) transducers specially constructed mutant strains of different yeasts have been ± The influence of sample buffer capacity, pH and cell content in sensitive membrane he sensors’ response, and other analytical characteristics have been investigated.

The photometric methods for ethanol and methanol assays by use of alcohol ase have been elaborated. The alcohol oxidase-peroxidase approach has been used ievelopment of the analytical kit “ALCOTEST” for ethanol assays in clinical medicine.

Key words: analysis, biosensor, methanol, ethanol, formaldehyde, pH-sensitive effect transistors, 02- and H202-probes, yeasts, alcohol oxidase.