Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биосенсоров специфичных к метанолу, этанолу и формальдегиду на основе клеток метилотрофных дрожжей

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биосенсоров специфичных к метанолу, этанолу и формальдегиду на основе клеток метилотрофных дрожжей"

РГБ ОН

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут мікробіології та вірусології

На правах рукопису

КОРПАН Ярослав Ізидоропііч

РОЗРОВКА ВЮСгНСОРІЗ СПЕЦИФІЧНИХ ДО МЕТАНОЛУ, ЕТАНОЛУ ТА ФОРМАЛЬДЕГІДУ НА ОСНОВІ КЛПЇ1Н мепіпотрофних дрохджіз

03.00.23 — біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття вченого ступеня калдпдата біологічних наук

ІСиїв - 1994

Робота виконана у відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики ІІЛН України (м. Київ) та відділенні регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (м. Львів)

Наукові кершиини:

доктор біологічних наук, М.Ф.Огародуб доктор біологічних наук, професор А.Л.Сибірітіі

Офіційні опонент: .

доктор біологічних наук, професор Г. М. Кременчуцький доктор біологічних наук, професор. Р.І.Гвозднн

Провідна устшюиа:

Київський медичний ушлерстст, кафедра біохімії (м.Київ)

Захист дисертації відбудеться 2‘ 1994 р. о ¡0 на

засіданні спеціалізованої ради Д 016.06.01 по захисту догаорсьгагх дисертацій при Інституті мікробіології та вірусології ім Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 252143, Київ — 143, пул. акяд. Заболотного, 154

Автореферат дисертації розіслано /? ІАМ.СІОІЛО.^С\ 1991р.

Вчешш секретар Спеціалізованої Родії кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Експресний, високоселективний, точний та високочутливий кількісний аналіз спирті а та альдегідів -один із важливих напрямків у сучасній аналітичній практиці, шслючшочн клініко-токсикологічні дослідження та аналіз у фармацевтачній, мікробіологічній і харчовій промисловостях, екологічніш моніторинг навколишнього середовища. Для цієї мети шіі:ористопуіоп>ся як класичні хімічні методи, так і ензимні хромогенні системи та біооенсорні пристрої. Особливо перспективними є сснсорн на балі напівпровідникових струїпур, оскільки ноші здатні інтегрувати реєструючу та перетворюючу функції. Біосенсори на цій основі шиоп, ряд сугтевнх перебіг у порівнянні з іншими сенсорішмн системами: порівняно малий

розмір, можливість створення мультифункціональних чіпів, хороша відтворюваність результатів, винятково висока чутливість, низька ціна робочих елементів при масовому виробництві, що дозволяє виготовляти датчики одноразового використання. Перспективнішії шідшоться біосенсорн на основі цілих клітин мікроорганізмів. Слід зазначити, що такі снтемн уже розроблено для аналізу деяких речовин, у тому числі і етанолу із застосуванням рН-чутливих польових транзисторів (рІІ-ПТ) та оцтово-кікушх бактерій, щюте селективність більшості із них дуже низька і шізначасться специфікою метаболізму кліпін мікроорганізмів. Молотнвим шляхом підвищення селективності клітинних датчиків є отримання мутантних мікроорганізмів, у яких генетичний блок певних ланок метаболізму може звузити селективність іслітииного відгуку.

У зв'язку з цим видалось актуальним вивчити можливість зміни закислювальної здатності клітин метилотрофних дрЬкджів шляхом введення певних генетичних блоків оішслешш метанолу,

о

етанолу та формальдегіду на стадії утворення органічних кислот і дослідиш можливість створення шісокоселективних клітинних біосенсоріигх пристроїв, чутливих до метанолу, етанолу та формальдегіду, на основі генетично сконструйованих штамів дріжджів із застосуванням напівпровідникових та кондуктометричних перетворювачів.

Мста тп завданім дослідження. Метою даної роботи було створення лабораторних моделей біосеиеорш на основі інтактних клітин метилотрофних дріжджів для визначення концентрації метанолу, етанолу та формальдегіду. 1

Основним завданням роботи було:

1. Пошук мутантів метилотрофних дріжджів із підвищеною закислювальною здатністю.

2. Вивчення механізму екструзії протонів, що іидукуеп>ся формальдегідом, у клітин метїілотрофних дріжджів

3. Вивчення шляхів ефективної іммобілізації дріжджоїиїх клітин на поверхні метало-керамічних перстворюиачів.

4. Конструювання варіантів клітинних сенсорів на основі pH-чутливих польових транзисторів та планарннх електродів.

5. Вивчення робочих параметрів сконструйованих сенсорних систем на базі клітин мікроорганізмів. >

Наукова новизна та практична цінність роботи. Підібрано мутанти метилотрофних дріжджів з генетично детермінованою селективністю відносно метанолу, етанолу та формальдегіду, проведено їх аналіз та охарактеризовано рушійні сили процесу екструзії протонів, що індукується формальдегідом.

Вперше дикі та мутантні клітщш метилотрофних -дріжджів родів Hansenula polymorpha, Candida boidirdi та Pic Ida pinus застосовано як основу чутливого біоелемента сенсора, створено лабораторні моделі клітинних біосенсорів на основі зазначених вище

клітин та рН-чутливих польових транзисторів і пленарних електродів як трансдукторів для визначення концентрадії метанолу, етанолу та формальдегіду.

Практтгчна цінність роботи полягає у тому, що отримані в ній результати свідчать про принципову можливість створення макетів та промислових варіантів мікробних сенсорів для визначення концентрації різноманітних первинних спиртів та альдегідів у медичній практиці, контролі технологічних процесів у промисловості та при проведенні екологічного моніторшігу навколишнього середовища, зокрема, для аналізу концентрації метанолу, етанолу та формальдегіду у водних та слабо забуферених розчинах.

Структура та об’см роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, результатів, обговорення, висновків та списку літератури, який включає 159 найменувань. Робота викладена на 100 сторінках машинописного тексту та містить 17 малюнків та 10 таблиць.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались на 15ому міжнародному симпозіум по дріжджах (Рига-ІОрмала, Латвія, 1991), симпозіумі по біосенсорах (Енсхеде, Нідерланди, 1991), 16-ій міжнародній конференції по генетиці та молекулярній біології дріжджіп (Відень, Австрія, 1992), симпозіумі "Євросенсори IV” (Сан-Ссбпст’ян, Іспанія, 1992), спільніші робочій нараді ”Ншеччина-СНД” (Мюнстер, ФРН, 1993), 6-ому Європейському конгресі з біотехнологн (Флоренція, Італія, 1993).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліїсоплно 8 журнальшгх статтей.

Всі дослідження виконано з ініціативи автора та за його безпосереднього участю в експериментах і аналізі отриманих результатів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

У роботі використовували такі штами метилотрофних дріжджів: "дикий тип” — llansenula polymorpha 34 (met9-2),

отриманий під д-ра P.Sudbery (Шеффілд, Великобританія), Picliia pinus 1031 та llansenula polymorpha 356 (leu2), люб'язно

переданий для досліджень д-ром Л.П.Тихомігровою (Пущшіо, Росія), Candida boidinii 706, переданий для експериментів д-ром С.С.Нагорною та мутантні штами: llansenula polymorpha 34-19 (дефектний по форміятдегідрогеназі), llansenula polymorpha АЗ (штам з відсутньою активністю формальдегідредуктази) та АЗ-11 (з порушеною індукцією синтезу алкогольоксидази та форміатдегідро-генази форміатом та відсутнього аітівністго формальдегідредуктази), люб'язно передані для досліджень д-ром В.М.Убийвовк і Pichia' pinus 2468 (ade2 argl acs2, штам із блоком синтезу ацетил-SKoA-синтетази), переданий для досліджень д-ром В.І.Титоренком.

Плітшш вирощували за постійної аерації (240 об./хв) при 30°С у рідкому середовищі такого мінерального складу, г/л: ІШ2РО4 - 1,0; (NH4)2S04 - 3,5; MgS04 х 7Н20 - 0,5; СаС12 -

0,1, як описано раніше [Корпан и др, 1992; Korpan et аі., 1993]. Біомасу клітин визначали за розсіюванням світла при 540 нм, як описано раніше [Гончар и др., 1990]. Безпосередньо перед експериментами клітини осаджували при 3500" та двічі промивали дистильованою водою.

Закислення середовища клітинами метилотрофних дріжджів, що індуїсуєгься метанолом або формальдегідом, реєстрували, як описано у роботі [Гончар и др., 1990]. У дослідах із інгібіторами гідрофобні речовини розчиняли у етиловому спирті, додаючи його до водної суспензії клітин у такій кількості, щоб концентрація спирту в інкубаційному середовищі не перевищувала 1%, інкубувяли

протягом 5 хв, а потім додавали індуктор закислення — метанол або формальдегід.

Активності ферментів обміну метанолу визначали у безклітинних екстрактах, отриманих руйнуванням клітин за допомогою скляних кульок діаметром 0,45-0,5 мм при 4°С протягом 4 хв. Концентрацію білку визначали за методом Лоурі [Lowry, 1950]. Активності ферментів визначали як описано раніше: алкогольоксидази [Сибирньгй и др., 1987], формальдегіддегідро-генази [Schutte et а]., 1976], формальдегідредуктази [Hou et al.,

1982], форміатдегідрогенази [Schutte et al., 1978]. Аналіз форміату проводили ферментативно [Johnson et al., 1964].

Клітини мікроорганізмів іммобілізували на поверхні польових транзисторів (ПТ) або золотих пленарних електродів (ПЕ) у Са-альгінатному гелі, як описано [Кограп el al., 1993].

Дослідження проводили на чіпах виробництва НДІ ’’Мікропроцесор” (Київ) та інноваційного центру "Емокон” (Київ). Особливості конструкції та функціональні параметри обох типів трансдукторів описано детально у роботах [Кограп et а]., 1994].

Концентрацію спиртів та формальдегіду визначали у скляній комірці об’ємом 2,5 мл, яка була заповнена дистильованою водою або ”нолімікс” буфером [Olsson, 1988]. Для стабілізації альгінатного гелю у деяких випадках додавали 20 мМ розчин GaCl2. Для датчика, вміщеного у вимірювальну кювету, фіксували базову лінію, після чого вносили аліквоту метанолу, етанолу чи формальдегіду. Зміну потенціалу або провідності на сенсорному чіггі реєстрували автоматично за допомогою самописця або IBM комп’ютера. Всі виміри проводили у диференційному режимі, при кімнатної температури за умов інтенсивного перемішування. Максимальна швидкість відгуку сенсора (dU/ilt)MaKO була мірою концентрації аналізованої речовини у розчині.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Пошук мутантів метилотрофшіх дріжджіп із підвищеного здатністю до екструзії протонів.

Раніше були отримані мутанти метилотрофних дріжджіп Іі.роіутогріиг, 34-19 і Р.ріпиз 2468, вивчені особливості їх метаболізму [БІЬІту сі аі.,1990; ТоЬІогикоу еі аі., 1989]. У першого мутшгга блок форміатдегідрогеназної реакції зупиняє процес окислення метанолу на утворенні мурашиної кислоти (рис. 1), що призводить до посилення процесу екструзії протонів (питома швидкість закислення 20-30 нмоль 11+ за 1 хв на 1 мг сухої маси клітин) у порівнянні із штамом дикого типу Н.роІутогрНа 34 (швидкість закислення 3-5 нмоль іІ+ за 1 хв на

1 мг сухої маси кліттін).

Метилотрофиі дріжджі дикого типу не закислюїоть середовище з екзогенним етанолом [Гончар и др, 1990], проте генетичне пошкодження ацетил-БКоА-синтетазн у мутанта Р.ріпив 2463 (рис. 1) .викликає появу ефективного викиду протонів у симпорті з ацетат аніонами, внаслідок блокування окислення етанолу на етапі перетворення ацетату до ацетил-БКоА (питома швидкість закислення складає 12-14 нмоль Н+ за 1 хв на 1 мг сухої маси клітин).

Штам Нашепиіа роїутогріїа АЗ-11 було відібрало серед колоній формальдегід—чутливих мутантів і встановлено, що він характеризується відсутністю активності одразу трьох ферментів: формальдегідредуктази, алкогольоксидази та форміатдегідрогепази (рис. 1). Однак слід зазначити, що блок синтезу алкогольоксидази та форміатдегідрогепази спостерігається лише у клітин, вирощених на середошіщі з сумішшю 0,2% гліцерину та 20 мМ форміату, рН 5,0 (табл. І)

A. HANSEXVLA POLYMORPIIA 34-19

°2 H2°2 NAD+ NADH(H+) NAD+ NADH(H+)

CHgOII.........> HCHO..............> HCOOH ..........>co^

AO ФдДГ І ФтДГ 1 “

HCOO" + H+

В. Piciiia PlMJS 2408

NAD+ NADH(H+) NAD+ NADH(H+) CoASH

C„H„OH.........>CH„CHO.............>CH,COOH------> CHqCOSCoA

2 5 З З 3

адг Адцг Гасі

CHgCOO' + н+

C. IlANSENULA POLYMORPIIA A3-11

02 H202 NAD+ NADH(H+) NAD+ NADH(H+)

CH,OH —-.........................-> HCHO -.> HCOOH...>co,,

[ao] ФдДГ І ФтДГ I “

NAD*'' NADH(H+) HCOO" + H+

<..................

Рис. 1. Схема окислення метанолу, етанолу та формальдегіду клітинами мутаїгппіх штамів метилотрофних дріжджів.

Позначенім: АО — алкогольоксидаза; ФдДГ — формальдегі-

дегідрогеиаза; ФтДГ — форміатдегідрогенага; ФдРед — формальдегідредуктаза; АДГ — алкогольдегідрогенага; АдДГ — ацетальдегідцегідрогеназа; АС — ацетил—бКоА—слнтетаза; рампа — генетичне пошкодження ферментів.

Формальдегід-індуковане закислення середовища та його біохімічна природа.

Інкубація клітин дикого типу Напзепиіа роїутогрНа 356 в пезабуференому водному розчині формальдегіду (15-35 мМ) призводить до швидкого закислення суспензії клітин. Протягом декількох хвилин спостерігається зсув pH суспензії на 1,5 одиниці та більше за вихідного значення pH 5,3-5,5. Встановлено, що інкубаціііне середовище, закислене за присутності 20 мМ формальдегіду, містить досить великі кількості форміату (0,6 мМ, pH .4.0). Таким чішом, процес викидання 11+ у зовнішній розчіш супроводжується снмпортом форміат-аліонів, які утворюються скоріше всього у реакції, що каталізується формольдегід-дегідрогеназою.

Швидшсть закислення зростає із збільшенням коцентрації формальдегіду та характеризується насиченням при 25-35 мМ, а потім швидко зменшується за концентрації НСНО вище 35 мМ. Слід зазначити, що область насичення для формальдегіду значно вужча, нілі для метанолу за метанол-індукованого закислення, де вона покриває діапазон 25-250 мМ [Гончар и др., 1990]. Це, очевидно, пов'язано з більшою токсичністю та хімічною активністю формальдегіду у порівнянні з метанолом.

Швидкість формальдегід-залежного закислення середовища прямо пропорційна концентрації клітин Н.роіутогріїа 356, тс і у вішадісу метанол-індукованого закислешш [Гончар др., 1990], і залежить від pH середовища з оптимумом у діапазоні 4.0-4.5. Це, можливо, перш за все, зумовлено властивостями плазмалемної } 1^ -АТФ-ази, яка має максимальну шгпшнісі-ь у кислому діапазоні pH [СоЯеаи еі аі., 1981].

Якщо виділення іслітинами протонів здійсшосться проти існуючого градієнту концентрації Н+, то цей процес мусить

залежати від енергетичного статусу клітин. Було проведено дослідження впливу інгібіторів енергетичного обміну на процес закислення. Суттєве інгібування процесу (більше 80%) викликає NaNg (0,1 мМ) - інгібітор мітохондріальних ферментів -термінальної оксидази і А'ГФази, а також антиміціш А (4 мкМ). Незначне зниження швидкості закислення спостерігається за присутності протонофору — 3-хлоркарбонілцианід-фенілгідразону (ХКФ, 0,01 мІМ) та неспецифічного інгібітора АТФ-аз -дициклогексил-карбодііміду (ДЦІІД, 0,5 мМ) — на 55% і 56% відповідно. Ортованадат - специфічний інгібітор Н+-АТФази плазматичнх мембран — у концентрації 0,1 мМ пригнічує виділення Н+ дріжджовими клітинами всього лиш на 44%. Цй, очевидно, зв'язано з його низькою проникністю в клітини дріжджів, вироіцеинх на середовищі з високим вмістом фосфатів [Bowman,

1983], внаслідок репресії внсокоафінної системи транспорту фосфату (і ванадату).

Обговорюючи можливу модель механізму виділення мурашиної кислоти, клітинами метилотрофних дріжджів, який викликається формальдегідом, перевагу слід, очевидно, піддати вторинно-активному транспорту форміат-аніону, контрольованого АТФ-залежною електрогенною 11+-помпою плазмалеммл, >пг. і за випадку метанол-індукованого закислення [Гоїгчар и др., 1090]. Роль мітохондрій, очевидно, полягає в окисленні НАДН і регенерації НАД+, який сполшвається u процесі цитоплазматичного окислення формальдегіду, у генерації АТФ, ягаїіі споживається за переносу іона Н+ через плазматичну мембрану.

Аігпшиості ферментів обміну метанолу і рівні закислення у дикого і мутантних штамів метилотрофшіх дріжджів, вирощених у середовищах з метанолом, етанолом, глюкозою чи сумішшю форміату з гліцерином, представлені в табл. 1 1 2.

Таблиц)! 1. Активності ферментів обміну метанолу у дикого та мутантних штамів Н.роІуіпогрЬа в залемшості від типу ростового субстрату. Коефіцієнти варіації паралельних визначень у одній і тій же ж серії дослідів складає 5-10%. Приводяться середні значення активностей у трьох незалежних серіях дослідів.

Скорочення: ,АО — алкогольоксидаза; НСНО-ДГ —

<{юрмальдегіддегідрогеназа; НСНО-Ред — формольдегідредуктаза; НСООН-ДГ — форміатдегідрогеназа

Штами Ростовий субстрат Питома активність ферменту, цмолі. за 1 хв па 1 sir білка

АО НСНО-ДГ ІІСНО-Ред НСООН-ДГ

Метанол 0,950 0,802 0,803 0,152

356 Етанол 0,000 0,004 0,500 0,001

(ДИКИЙ Глюкоза 0,000 0,002 0,910 0,000

тіш) Гліцерші т форміат 0,930 0,099 0,012 0,032

Метанол 1,270 0,912 0,003 0,139

АЗ Етанол 0,000 0,121 0,000 0,009

(мутант) Глюкоза 0,000 0,049 0,000 0,000

Гліцерші + форміат 1,100 0,123 0,000 0.031

Метанол 1,370 0,846 0,000 0,025

ЛЗ-11 Еталол 0,000 0,051 0,031 0,000

(мутант) Глюкоза 0,000 0,026 0,000 0,000

Гліцерші + форміат 0,000 0,013 0,000 0,000

Для всіх штамів відсутність метанол-залежного закислення у клітин, вирощених на глюкозі або етанолі, полспюетьсл повною репресією

першого ферменту обміну метанолу — алкогольоксидази. Формальдегіддегідрогеназа також підлягає глюкозній і етанольній катаболітній репресії, однак не у повній мірі, що, очевидно, пояснює збереження здатності до формальдегід-залежного викиду 11+ у клітин llanscnula polymorpJia 356 і похідних під нього мутантів A3 і A3-11 при рості на.средовшці з корепресорамн. Можна уявити конститутивність системи окислення формальдегіду у дріжджів Il.polymorpha. Проте це не узгоджується із загальноприйнятого природою регуляції синтезу глутатіон-залежної формальдегіддегідрогенази у клітин дикого типу метнлотрофппх дріжджів. Таке протиріччя може бути вирішено припущенням, ідо у метилотрофних дріжджів, окрім уже відомої метанол-індукованої формальдегіддегідрогенази, існує якась альтернативна ферментна система окислення формальдегіду, яка не підлягає регуляції ростовим субстратом.

Очікувалось, що введення в штам 356 генетичної« блоку формальдегідредуктазн може прискорити процес закислення, внаслідок посилення потоку окислення формальдегіду до мурашиної кислоти. Проте у дійсності (табл. 1) були отримані суперечливі результати: спостерігається як інтенсифікація, так і сповільнення швидкості закислення у випадку пггама A3. Можливо,

функціонування формальдегідредуктазн ш vivo обмежено в зв'язку з утворенням футильного циклу, у результаті чого блокування синтезу цього фермента не приводить до суттєвого підсилення процесу окислення формальдегіду.

Зі росту кліп її і Н.роіутотріш дикого типу на суміші

гліцерину (індиферентний до. регуляції метилотрофного обміну субстрат) і форміату (індуктор синтезу ферментів обміну метанолу) також індукується система закислення, специфічна j:k до формальдегіду, так і метанолу. У той же час у мутанта

Н.роІутогрЬа АЗ-11 з порушеною індукцією алкогольоксидази і форміатдегідрогенази форміатом, але не метанолом, за умов росту на середовищі з сумішшю гліцерину з форміатом спостерігається тільки формальдегідзалежне закислення (табл. 1 і 2).

Таблиця 2. Швидкості закислення середовища інкубації клітин дикого та мутантних штамів ІІ.роІуіиогрЬд, індукованого метанолом чи формальдегідом, в залежності від типу ростового субстрату.

Ш талі к Ростовий субстрат Питома швидкість закислення, нмоль 11+ за 1 хв на 1 мг сухої маси клітин

метанол формальдегід

Метанол 9,93 15,32

356 Етанол 0,00 6,86

(дикий Глюкоза 0,00 4,50

тіш) Гліцерин

+ форміат 12,81 8,01

Метанол 5,07 6,73

АЗ Етанол 0,00 0,61

(мутант) Глюкоза Гліцсріш 0,00 6,21

+ форміат 9,32 4,08

Метанол 23,1 23,8

АЗ-11 Етанол 0,00 6,46

(мутант) Глюкоза Гліцерил 0,00 3,96

+ форміат 0,00 6,85

Індукція алкогольоксидази метанолом у цього мутанта не порушена, у зо'лзку з чим для клітин, вирощених на метанолі, специфічність

закислення така ж, як у дикого штама. Швидкості метанол- і формальдегід-залежного закислення у клітин мутанта АЗ-11, вирощеного в середовищі з метанолом, помітно вищі, аніж для батьківських штамів. Можливо, це пов’язано з неповного індукцією форміатдегідрогенази у клітин мутанта АЗ-11 (табл. 1). Слід зазначити також, що при підвищенні специфічності закислювальної здатності мутантних клітин АЗ-11, вирощених на середовищі з гліцерином і форміатом, питома швидкість формальдегід-залежного виділення Н+ цими клітинами нижча, ніж за росту на метанолі. Це не зовсім тривіальний результат, так як очікувалось, що порушення індукції ({юрміатдегідрогенази у клітин, вирощенігх на середовищі з гліцерином і ({юрміатом, повинно блокувати перетворення мурашиної кислоти і, таким чином, посилити її виділення п інкубаційне середовище. Можливо, це пояснюється зниженням у цього мутанта активності формапьдсгіддегідрогенази - фермента, що каталізує утворення мурашиної кислоти. Не виключається також і конкурентний вплив на оішсленннл НСНО до НСООН і днгідроксиацетонсинтазної реакції кс и лул озом о но - < [юсі}»! тн ого циклу асиміляції <|хірмальдегіду. Складається враження, що закислюпальна аітівність клітин метилотрофних дріжджів залежить не стільки під абсолютних величин активностей ферментів, що приймають участь у метаболізмі С|-сполук, скільки від їх співвідношення, наприклад, відношення активності форміатдегідрогенази до активності формальдегіддегідрогенази.

Вивчення робочих характеристик клітинних біосенсорів для ішіпичоння концентрації метиполу та етанолу на основі рН-ПТ.

Для створення клітинних біосенсорів для визначення концентрації метанолу та етанолу використовували мутантні клітини

Н.роіутогріїа 34-19 та Р.ріпи5 2408 відповідно.

и

Локальне закислення середовища, яке індукується клітинами, спричиняє зміну заряду на поверхні іон-селективної мембрани яка виконує роль затвору pH-чутливого польового транзистора і ресструсгься за допомогою самописця. На рисунку 2 представлена характерна . крива відгуку сенсорів, чутливих до метанолу чи етанолу, яка характеризуется наявністю незначного лаг-періоду і мас вид гіперболи. Через 20-25 хв відгук досягає максимального рівня, що зумовлено, очевидно, встановлешілм рівноваги між процесами продукції протонів у мембрані та їх дифузією у аналізований розчин. '

Вивчаючи залежність швидкості зростання відгуку біосенсорів від концентрації метанолу чи етанолу досліджено, що мінімальний рівень спиртів, який можна визначити, в обох випадіздх складає

0,5 мМ, а лінійний діапазон цієї залежності знаходиться у межах 5-100 мМ аналіту (рис. 3).

Показано, що амплітуда сигналу клітинного сенсора надзвичайно сильно зменшується при збільшенні буферної ємності аналізованого розчину (рис. 4). Сенс цього феномену полягає у тому, що компоненти буферу дифундують у мембрану, іти містить

відгуку клітинного біосенсора іш основі pH-чутливих польових транзисторів у дистильованій воді за концентрації кііітіш (Р.ріпиз 24С8) 10 мг/мл.

Рис. 2. Тилова крива

клітини, зменшуючи концентрацію вільних протонів, які генеруються як клітинний відгук.

Рис. 3. Калібрувальні криві для специфічних клітинних біосенсорів на основі рН-ПТ, чугливнх до етанолу (1 -днстильпана вода; 2 * 0,5

мМ/рН та 3 - 2,0 мМ/рІІ "тюлімікс” буфер, рН 7,0;) І метанолу (4 - дистильована

вода). Концентрація клітин у біомембрані складає 8 мг/ил.

Рис. 4. Залежність відгуку сенсорів на етанол (1) та метанол (2) від буферної ємності розчину. Дослідження проводили у полімікс" буфері, рН 6,0; концентрація клітин у мембрані 10 иг/ил; концентрація спиртів 100 мМ.

Для вивчення залежності відгуку сенсора від величини рН застосовували мультикомпонентиий "полімікс” буг|>ер* який

характеризується стабільною буферного ємніспо у діапазоні ріі від

•і до 9. Це дозволяє визначати реальну рі І залежність підгуку клітинного біосенсорп» оскільки за зміни рП аналізованого розчину

Буферна «шість, нМ/рН

буферна смпість ного залишається незмінною. Встановлено, ідо крива рН-залежносгі етанольного дотчнка має куполоподібний вигляд з максимумом прії рН 7,0, тоді лк відгук сенсора длл визначення метанолу не залежить від величини рН у діапазоні від

Рис. 5. Залежність целл'шнн сигналу клітшашх біосснсорів дал визначен-ня концогграції етанолу (1) то метанолу (2) під pH аналізованого розчину. Вимірювання проводили ва буферної ємності 1 мМ/рії, концентрації клітин 10 мг/ид та концентрації спиртів 100 мМ.

Важливою характеристикою будь-якого сенсорного пристрою є його селективність. Досліджено, що етгшолышн сенсор специфічно реатуе на додавання цього спирту, не відповідаючії при цьому на метанол; метшюльїшй сенсор — vice versa. Обидва датчики не реагують нп внесення пропанолу, бутшюлу інших спиртів, глюкози, ацетату, «¡юрміату чи лактату, відповідаючи при цьому на формальдегід. За селективністю створені біосенсорні системи переважають описані у літературі датчики на основі бактерій Acelotiactcr всей та алкогольоксидази [Kitagawa et al., 1987].

Але не дивлячись на всі переваги залропоновашіх клітинних біосснсорів для роздільного визначення спиртів їм. притаманні деяїсі падн — шізька стабільність робочих елементів (датчики одноразового застосування) за функціонування та зберігання. Для вирішення цієї проблеми було проведено пошук мікроорганізміи, які здатні до росту

5,0 до 8,0 (рис. 5).

pH

на середовищі з етанолом та характеризуються високим рівнем закислення у відповідь на додавання С2Н5ОН серед штамів дикого типу роду Candida. Встановлено, що клітини C.boidinii 700 володіють необхіднішії властивостями і можуть бути застосовані для конструювання клітинних міїсросенсоріп для аналізу концентрації етанолу.

Коїідуктоліетри'їний сенсор для визначення концентрації етанолу.

У останні декілька років нового піднесення набули роботи по створенню нондуктометричнпх сенсорних пристроїв. Це зумовлено наявністю у кондуктометрнчніїх сенсорів таких же переваг, які притаманні pH-ПТ. Крім цього, ці трансдуктори порівняно дешеві, легко конструюються за допомогою використання технології інтегральних схем, що дає можливість масового виробництва та створення мультисенсорів. Тому у подальших експериментах було вирішено використати голоті тонкоплівкові пленарні електроди.

Додавання спирту у аналізований розчин спричиняє . зміну провідності у мембрані із альгінату кальцію за рахунок процесу секреції кислих метаболітів клітинами метшіотрофшіх дріжджів C.boidinii 706. Встановлено, що час відгуку кондуктометричного дріжджового сенсора досягає стаціонарного стану через 3 — 5 хв, а лінійність (у логарифмічному маштабі) спостерігається у межах 5 - 100 мМ. Показало, що залежності сигналу кондугстометрігчного біосенсора на основі клітин C.boidinii 706 від величини pH та буферної ємності аналізованого розчину аналогічні таким, що спостерігаються для металольного біосенсора на основі рН-ПТ.

Результати визначення коїщентрацїї етанолу у реальних рідинах (горілка, коньяк, шшо та харчовий спирт), отримані за допомогою кондуктометрігшого сенсора на основі клітин C.boidinii

та методу газо-рідшшої хроматографії, представлено на рис. 6. Встановлено хороший рівень кореляції даних, отриманих за допомогою клітинного біосенсора, з результатами, визначеними референтним методом. Коефіцієнт кореляції складає 0,9988.

Рис. 6. Результати визначення концентрації спирту у алкогольних напоях (1 - пиво; 2 - горілка; 3 - коньяк та 4 -харчовий спирт), отримані за допомогою концуктометрігч-ного клітинного біосенсора та методу газо-рідинної хроматографії.

Коефіцієнти розведення зразків складають 250 разів для горілки та коньяку, 500 разів дня спирту та 25 разів для пива.

Як і очікувалось, операційна стабільність сконструйованої системи була значно більшою і складала 5 годин (15 повторних визначень із інтервалом ЗО хв), а стандартне відхилення величин сигналу біосенсора у даному випадку не перевищувало 10 %. Було також протестовало стабільність підіуку кондуктометр нчного біосенсора за зберігання. Коли біомембрана сенсора експлуатувалась щоденно протягом 2-х годин та зберігалась у 20 мМ водному розчині СаСІ2 за температури 20-25°С, сигнал був стабільним протягом 3-х днів. Проте, при зберіганні робочих елементів сенсорів при 4°С кондуктометричний сигнал був стабільним протягом 12 днів.

Формальдегідний аналізатор на основі рІІ-НТ.

Для розробки високочутливого методу аналізу концентрації формальдегіду було застосовано клітшш мутанта метнлотрофшіх

Срганолу » ^ Хроматограф

дріжджів Hansenula polymorpha A3-11 fa порушеним синтезом алкогольоксидази, формальдегід ре дуктази та форміатдегідрогенази, який індукується іонами форміату.

Характерна крива відгуку мікробного сенсора після внесення формальдегіду має такий же ж вигляд, як і у випадку вищеописаних сенсорів, специфічних до метанолу чи етанолу на основі рН-ПТ. Проте сигнал наростає значно швидше і досягає стаціонарного стану через 3-5 хв. Можливо, більша швидкість відгуку формальдегідного сенсора (5-G кратна у порівнянні з описаними пище системами для аналізу спиртів на основі рН-ПТ) можна пояснити більшою швидкістю закислення, індукованого формальдегідом, що в свою чергу, можливо, зумовлено тим, що утворення ІІСООН із 1ІСНО відбувається за один, а із С1Ь>ОÎ1 - за два этапи окислення. Показано, що швидкість зміни потенціометричного відгуїсу (dU/dt) лінійно зростає із збільшення»! концентрації клітин у гелі і описується рівнянням: (сШ/(Н)макс (мВ/хв) = 1 îOSC^tj,,, (мг/мл) + 0,35 (мй/хв) із коефіцієнтом кореляції 0,999 ( в межах концентрації клітин до 25 мг/мл).

Мінімальна концентрація формальдегіду, яісу можна визначити, складає 0,5 мМ, а лінійний діапазон вімірювань знаходиться у межах 2-200 мМ (рис. 7).

Збільшення буферної ємності розчину призводить до драматичного падіння амплітуди потенціометричного сигналу. Залежність иідгуку сенсора від пеліпшш pH має шігляд сигмоїдної кривої з максимумом при pH від 7,0 і вище. Це може бути пов'язано із зміною властивостей гелю-носія при різних значеннях pH і їх впливом на дифузію продуктів. Адже альгінат - полімер, який містить карбоксильні групи, здатні зв'язувати II* у кислій області pH і, таким чином, сповільнювати їх дифузію п рН-чутлишш шар сенсора. З другого боку, відмінність pi І - залежності

формальдегідного сенсора (від метанольного та етанольного сенсорі»), можливо, пов’язана з особливою реакційною здатністю формальдегіду у порівнянні із спиртами.

Рис. 7. Залежність швидкості шросташія відіуку формальдегідного біосенсора від концентрації формальдегіду. Умови: дистнльопаїга вода (1) або "полімікс“ буфер (2, буферна ємність 1 мМ/рН, pH 7,0); концентрація клітин у гелі 14 чн 10 мг сухої маси клітин у

1 мл відповідно.

Збільшення температури від 20°С до 55°С приводить до 4-х кратного зростання відгуку мікробного сенсора. Подальше зростання температури до 70°С приводить до різкого зменшення величини потенціометричного відгуку до 0. Таке критичне падіння величини

сигналу зумовлено як температурною інактивацією дріжджових

клітин, так і деструкцією самого Са-альгінатного гелю.

Досліджена залежність величшш відгуку мікробного сенсора бід кратності його застосування. Проміжок часу між вимірюваннями не перевищував 20 хв. Операційна стабільність за таких умов складає не менше 4-х годин, а стандартне відхилення величин відгуку не перевищує 1-3%. У той же ж час стандартне відхилення величин потенціометричних сигналів для мембран, які були сформовані на поверхні перетворювача de novo, складає близько 10%.

Встановлено, що створений біоеенсор специфічно реагує на формальдегід (100%) та етанол (20%), не відповідаючи при цьому на метанол, пропанол, бутанол, форміат, ацетат, лактат, глюкозу.

^^формальдегіду »

Відгук до етанолу, можна пояснити скоріше всього ефектом так званої "розбалансовяності” активностей ферментів обміну етанолу. На відміну від клітин дикого типу, вирощених на середовищі з глюкозою або етанолом, де максимально індукуються ферменти утилізації етанолу, і оцтова кислота повністю перетворюється у ацетил-SKoA, у нашому випадку, за можливості окислення етанолу алігогольдегідрогеназого і ацетяльдегіддегідрогеназою до ацетату, подальша утилізація оцтової кислоти обмежена, внаслідок лімітування активності яцетил-SKoA синтетазн, що підсилює екструзію СН3СООН за присутності етанолу.

ВИСНОВКИ

1. Проведено скрінінг та підібрано мутантні штами метилотрофних дріжджів H.polymorpha 34-19, P.pinus *2428 та

Il.polymorpha A3-11 із пошкодженим синтезом форміат-дегідрогенази, ацетил-5КоЛ-еинтетази та алкогольоксидази, формальдегідредуктази і форміатдегідрогенази відповідно, які характеризуються підвищеною здатністю до екструзії протонів.

2. Встановлено, що клітини метилотрофних дріжджів

H.polymorpha зякислгоіогь середовище іішубації за присутності формальдегіду. Формальдегід-індуковане закислення властиве клітинам, вирощеним на різних ростових субстратах (метанолі, етанолі, глюкозі чи гліцерині). Процес супряжений із нагромадженням форміату п ііпсубяцііїному середовищі, чутливий до азиду натрію, антиміїщну А та ортоімшадату.

3. Розроблено лабораторні моделі клітшмнх біосенсорів на основі мутантних клітин метилотрофних дріжджів та рН-чутливнх польових транзисторів для роздільного визначення концентрації метанолу, етанолу та ({формальдегіду.

4. Вивчено робочі характеристики клітинних біосенеорів на основі pH-ПТ. Лінійна залежність між відгуком біосенсора і логарифмом концентрації аналіту спостерігається у межах 5-100 мМ для спиртів та 2-200 мМ для формальдегіду. Межа чутливості всіх систем сісладпс 0,5 мМ відповідного аналіту. Встановлено, що підвищення буферної смносгі зразку призводить до драматичного падіння величини сенсорного сигналу.

5. Розроблено лабораторну модель сенсора для визначення концентрації етанолу на основі клітин .метилотрофних дріжджів C.hoidinii 706 та кондуктометрнчшіх планарних електродів. Аналітичні параметри даної системи співпадають із такими на основі pH-ПТ. Показано, що сконструйований сенсор може успішно застосовуватися для визначення концентрації етилового спирту у деяїсих алкогольних напоях — пиві, горілці, коньяку та харчовому спирті.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гончар М.В., Корпан Я.І., Сибірний А.А. . Кількісний фотометричний аналіз етанолу з використанням очищеної алкогольоксидази та мутантних клітин метилотрофних дріжджів // Укр. біохім. j;;ypn.— 1991.— 63, №6.—С. 62-67.

2. Корпан Я.И., Гончар М.В., Солдаткип А.П., Старо дуб Н.Ф., Сандровский А.К., Сибирний А.А., Ельская A.B. Клеточние микробиосенсоры на основе pH—чувствительных полевцх транзисторов для определения метанола и этанола // Укр. биохим. журн.-1992.-64, №3.-С. 96-100.

3. Gonchar М.V., Кограп Y.I., Starodub N.F., Sibimy A.A. Formaldehyde-induced acidification of the medium by methylotrophic yeast cells and elaboration of cell biosensor based on this phenomenon

// Proc. of 3^ Int. onf. on Role of Formaldehyde in Biological Systems.-Sopron, Hungary.—1992.—P. 203-208.

4. Korpan Y.I., Gonchar M.V., Soldatkin A.P., Starodub N.F., Shul'ga A.A., Sibimy A.A., El’skaya A.V. Mothylotrophic yeast microbiosensor based on ion- sensitive field effect transistors for methanol and ethanol determination // Anal. Chim. Acta.—1993,—271.—P. 203-208.

5. Korpan Y.I., Gonchar M.V., Starodub N.F.. Shul’ga A.A., Sibimy A.A., El'skaya A.V. A cell biosensor secific for formaldehyde based on pH-snsitive transistors coupled to met hylotrophic yeast cells with genetically adjusted metabolism // Anal. Biochem.—1993,—215, №2.-P. 210-222

0. Korpan Y.I., Dzyadovich S.V., Zharova V.P., El'skaya A.V. Conductometric biosensor for ethanol detection based on whole yeast cells // Ukrainian Biochem. Journal.—1994.— 66, V.I.—P. 82-80.

7. Kopnan Я.И., Гончар M.B., Стародуб Н.Ф., Сибирный A.A., Ел1.ская А.В. Клетки метилотрофных дрожжей как биодопгчеаси антннныи материал для создания сенсорных устройств. Формальдегидный анализатор на основе pH-чувствительных полевых транзисторов // Биохимия,—1994,—59, №2.—С. 201-205.

8. Гончар М.В., Сибирнын А.А., Корпан Я.11., Стародуб 11.Ф., Ельская А.13. Формальдегид-индуцируемое закисленне среды и его биохимическая природа // Укр. биохим. HiypH.—1994.—66, ЛЬ5—С.

Korpan Ya.l. Development of biosensor» specific for methanol, ethanol and formaldehyde based on methytofrophlc yeast cells.

Dissertation for a degree of Candidate of Biological Sciences, specialization 03.00.23 - biotechnology, Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1994.

The thesis contains the results on elaboration of laboratory prototype of highly-selective cell-based biose.nsors for methanol, ethanol and formaldehyde determination. The influence of sample buffer capacity, pH and cell content in biomembrane on the sensor response, as well as lhenno-, working and storage stability, was investigated. It was established that the calibration curves were linear within the analyte concentration ranges from 5 to 100 mM for alcohols and

2 to 200 mM for formaldehyde.

Корпан Я.И. Разработка биосенсоров специфических к моїанолу, этанолу и формальдегиду на осново клеток мотилотрофных дрожжей.

Диссертация на соискание ученой степени кандидати биологических наук по специальности 03.00.23 — биотехнология, Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 1994.

В диссертационной работе представлены результаты по разработке лабораторных макетов высокоселек;ипных Сиосенсорных клеточных систем для определения концентрации меганола, этанола и формальдегида. Исследована зависимость величины сигнала сенсора от буферной емкости раствора, pH и концентрации і слеток в биомембране, а также термостабільності., операционная стабильность и стабильность при хранении. Установлено, что линейная зависимость между откликом биосенсора и концентрацией апалита наблюдается в пределах 5 — 100 мМ для спиртов и

2 — 200 мМ для формальдегида.

Ключоы слова: біосенсори, метанол, етанол, формальдегід, pH-чутливі польові транзистори, шіанарні електроди, мутанти.