Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка калориметрического метода и капиллярного титрационного калориметра для изучения биохимических реакций

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка калориметрического метода и капиллярного титрационного калориметра для изучения биохимических реакций"

На правах рукописи

Моисеева Софья Петровна

РАЗРАБОТКА КАЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА И КАПИЛЛЯРНОГО ТИТРАЦИОННОГО КАЛОРИМЕТРА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

03.00.23 - биотехнология 05.13.05 - элементы и устройства вычислительной техники и систем

управления

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2005

Работа выполнена в Институте биологического приборостроения с опытным производством Российской Академии Наук

Научный руководитель: кандидат технических наук,

Котельников Григорий Владимирович

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Бирюков Валентин Васильевич

кандидат технических наук, доцент Анисимов Дмитрий Николаевич

Ведущая организация: Государственный Научный Центр

прикладной микробиологии при Министерстве здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится "у* ¿¿Л/э/пй 2005 г. в часов на

заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева по адресу 125047, Москва, Миусская пл., дом 9 в

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном Центре РХТУ им. Д.И.Менделеева

Автореферат разослан

2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13

///

ШакирИ.В.

Общая характеристика работы Актуальность темы исследований

Развитие фундаментальных и прикладных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии требует для оснащения работ в этой области создания новых технических средств, при этом титрационная калориметрия является ключевым направлением для биотехнологии, универсальным средством для измерения параметров кинетики ферментов.

Титрационная калориметрия представляет собой универсальный метод инженерной энзимологии при получении знаний условий и последовательности действий белковых ферментов в организме растений, животных и человека, в промышленных реакторах.

Метод титрационной калориметрии позволяет выполнять наиболее полно и точно термодинамическое описание процессов связывания. Титрационная калориметрия чрезвычайно информативна при изучении всех типов реакций связывания: антиген-антитело, белок-лиганд, белок-белок, ДНК-лекарственные препараты, рецептор-мишень - и обладает преимуществами перед традиционными методами, такими как равновесный диализ, динамический диализ, спект-рофотометрия и потенциометрия, имеющими ограничения из-за недостаточной чувствительности, а также ограничения по виду и концентрации лиганда и по условиям эксперимента.

Разработка методических основ и аппаратно-программных средств для реализации метода по теме диссертационной работы выполнена в рамках программы "Научное приборостроение РАН", объединяющей наиболее актуальные и перспективные разработки в биологии, биотехнологии, биохимии, физико-химической биологии, медицине и многих других областях науки и техники. Цель работы состоит в исследовании метода титрационной изотермической калориметрии для изучения биохимических реакций, обосновании и разработке аппаратно-программных средств для реализации метода.

Конкретными задачами исследования являются обоснование, разработка и исследование калориметрического метода для изучения биохимических реакций, обеспечивающего:

• выравнивание концентраций реагентов по объему калориметрической камеры;

• выделение рабочего объема с высокой точностью;

• введение реагентов без предварительного термостатирования;

• уменьшение количества используемых реагентов;

• создание капиллярного калориметра для реализации метода;

• классификацию титрационных калориметров по способности работать с минимальными концентрациями реагентов в исследуемых процессах на основании обоснованного критерия.

Научная новизна работы

• Выполнено обоснование и проведена экспериментальная проверка впервые использованной в титрационной калориметрии капиллярной калориметрической камеры, расположенной горизонтально.

• Получено принципиально новое решение смешивания реагентов в капиллярной калориметрической камере методом концентрационной диффузии и перемешиванием колеблющейся дозирующей иглой.

• Осуществлено введение реагентов в калориметрическую камеру в виде тонкого жгута, распределенного по длине калориметрической камеры.

• Обосновано и экспериментально проверено выделение рабочего объема калориметрической камеры методом теплового шунтирования.

• Обосновано и экспериментально проверено введение реагентов в камеру без предварительного термостатирования.

• Выполнено и экспериментально проверено техническое решение многослойной измерительной термобатареи, которая обеспечивает низкий уровень шумов и высокую стабильность капиллярного калориметра.

• Обоснован критерий сравнения титрационных калориметров по соотношению рабочего объема калориметрической камеры и уровня шума. Выбранный критерий позволяет классифицировать титрационные калориметры по способности работать с минимальными концентрациями реагентов в исследуемых процессах.

• Капиллярный калориметр выполнен на основе технических решений, обладающих новизной и полезностью.

Практическая значимость

На базе разработанного калориметрического метода для изучения биохимических реакций выполнены:

• обоснование критерия сравнения титрационных калориметров по соотношению рабочего объема калориметрической камеры и уровня шума с проведе-

нием классификации титрационных калориметров по способности работать с минимальными концентрациями реагентов в исследуемых процессах на основании обоснованного критерия;

• разработка капиллярного калориметра и изготовление его экспериментального образца, на котором выполнены исследования;

• технические решения калориметрической камеры, системы выделения рабочего объема, смешивания и ввода реагентов, которые обеспечили возможность работы с меньшим в 3 раза количеством веществ; возможность проведения исследований в объеме калориметрических камер, известном с погрешностью не более 0.2%; возможность смешивания реагентов различной плотности и возможность введения реагентов в камеру без предварительного термостатирования, которое не приводит к потере требуемых свойств вводимого образца;

• разработка и изготовление впервые многослойной измерительной термобатареи, которая обеспечила измерение мощности длительных тепловых процессов, продолжительностью до 10 часов, при максимальной чувствительности капиллярного калориметра 10-8 Вт;

• технические решения, которые могут быть запатентованы и позволят выпускать конкурентоспособные капиллярные калориметры для внутреннего и внешнего рынка, а также обеспечивают разработку новых перспективных калориметров: многоканального капиллярного дифференциального титрацион-ного калориметра; капиллярного дифференциального титрационного -сканирующего калориметра.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на 4-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, Россия, 1999), на XI конференции ISBC "Биотермодинамика. Молекулярная, физиологическая и экологическая" (Юта, США, 1999), итальянско-российском рабочем совещании "Новые направления в калориметрии и ее приложения" (Барга, Италия, 1999), конференции ИБП РАН (Пущино, Россия, 2000), конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, Россия, 2001), XI международной конференции по крахмалу Москва - Краков (Москва, Россия, 2003), 58 конференции по калориметрии (Гаваи, США, 2003), 31 ежегодной конференции по тепловому анализу и приложениям (Нью-Мексико, США, 2003), международном рабочем совещании "Партнерство науки и бизнеса в действии. Проблемы и решения

в открытии и использовании новых биомолекул: биомногообразие и окружающая среда" (Москва, Россия, 2004). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ. Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, заключения и списка литературы, включающего 108 наименований. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 3 таблицы. Содержание работы

Во введении рассмотрена актуальность проблемы, анализируются цель и задачи исследования.

В первой главе в обзоре литературы изложены сведения об универсальном методе инженерной энзимологии при получении знаний условий и последовательности действий белковых ферментов в организме растений, животных и человека, в промышленных реакторах, представляющем собой метод титраци-онной калориметрии для изучения всех типов реакций связывания.

Приводятся алгоритмы, позволяющие от расчетов, выполненных для концентраций реагентов, перейти к расчетам на основании измеряемых теплот взаимодействий.

Показаны тенденции в построении титрационных калориметров на основе анализа известных моделей титрационных калориметров, от первых установок до современных приборов, и определен подход при разработке метода тит-рационной изотермической калориметрии для изучения биохимических реакций.

Во второй главе сделано теоретическое обоснование методов, определивших построение капиллярного калориметра. Представлены метод выделения рабочего объема калориметрических камер; метод смешивания реагентов в капиллярной камере; метод ввода дозирующей иглы внутрь калориметрической камеры через активный тепловой шунт.

В третьей главе показаны основные технические решения капиллярного калориметра: конструкции узлов, системы автоматического регулирования, аппаратно-программные средства систем управления и обработки результатов измерений.

В четвертой главе приведены результаты исследований, полученные на разработанном капиллярном калориметре, и представлены новые научно-технические решения, позволяющие продолжить развитие метода титрационной ка-

лориметрии для изучения биохимических реакций путем создания новых калориметров.

Выводы и заключение завершают работу. Разработка метода титрационной изотермической калориметрии для изучения биохимических реакций

Метод выделения рабочего объема калориметрических камер в капиллярном калориметре

Рабочий объем калориметрических камер - это основной потребительский параметр, через который определяются количества фактически участвующих реагентов в эксперименте и производится расчет измеряемых параметров: изменение энтальпии, тепловая мощность и др. На рис.1 представлена тепловая модель калориметрической камеры. Калориметрическая камера имеет идеальный тепловой контакт с тепловым шунтом 1 и шунтом 2. Шунт 1 имеет идеальный тепловой контакт с изотермическим экраном, температура которого поддерживается постоянной и равна Т,к. Температура шунта 1 на поверхности контакта с экраном (Л=ЛШ) равна температуре экра нЖ£ истема регулирования поддерживает температуру теплового шунта 2, равную температуре изотермического экрана Рабочий объем камеры представлен частью капиллярной трубки, расположенной ниже теплового шунта 1. Показано, что существуют условия, при которых часть тепла, измеренного калориметром, является результатом тепловых процессов, возникающих в части капиллярной трубки, примыкающей к тепловому шунту 1, и равна нулю. Регистрируемый калориметром тепловой эффект реакции ^«определяется следующим образом:

<2р^йр+к<)и.= йуУРж (V, + К УШ ) ,

где - тепловой эффект, выделяемый в рабочем объеме калориметрической камеры; Qш - тепловой эффект, выделяемый в объеме теплового шунта который примыкает к рабочему объему - удельный тепловой эффект реакции; рж - плотность жидкости; К - коэффициент влияния теплового эффекта в зоне объемом на регистрацию теплового эффекта в рабочем объеме калориметрической камеры Погрешность измерения теплового эффекта в рабочем объеме калориметрической камеры зависящая от влияния теплового эффекта в объеме может быть определена как:

5=®*"'®'' -100% = А'—-100% (0<Ь<Ь). {?, £

Значение К определяется следующим выражением:

2а ■ 1 ■ гг

2Д„.А (

<1

1 +

где «р2'10*5Втмм'2"К*1 - коэффициент теплоотдачи; /"/=0.5 мм; 7^=0.6 мм; /,=50

мм; (платина) - коэффициент тепло-

проводности материала камеры; Дш=0.39 Вт'мм",-К"' (медь) - коэффициент теплопроводности материала шунта 1; Лж=0.00065 Вт-мм*,-К"' (вода) -коэффициент теплопроводности жидкости;

Рис.1. Калориметрический узел с тепловыми шунтами.

Для геометрии калориметрических камер длиной 50 мм и шунта высотой 8 мм численное значение К=2-10"4 и погрешность измерения теплового эффекта составляет 0.003%, из чего следует, что рабочий объем строго определяется конструктивными размерами элементов узла калориметрических камер. Метод смешивания реагентов в капиллярной камере

Известно, что при смешивании реагентов в калориметрической камере должно обеспечиваться полное выравнивание их концентраций по всему рабочему объему камеры. Предложено выравнивание концентрации титранта в образце, заполняющем калориметрическую камеру, посредством концентрационной диффузии титранта, расположенного по оси камеры в виде тонкого жгута. В качестве критерия, характеризующего выравнивание концентраций реагентов в рабочем объеме калориметрической камеры, использовано время этого выравнивания. Определенное теоретически время выравнивания сопоставляется со временем выравнивания, определенным экспериментально. Это время выравнивания определяется при взаимодействии кофермента (NAD-H) и лактат дегид-рогеназы (LDH), удобном для спектрофотометрических и калориметрических исследований. При этом время связывания NAD-H с LDH пренебрежимо мало, так как составляет с, что исключает ошибку при определении времени выравнивания.

Определение теоретической зависимости времени диффузионного выравнивания концентрации титранта по образцу в рабочем объеме цилиндрической калориметрической камеры проводилось при следующих условиях: объем жгута (дозы титранта), где - радиус жгута; - рабочий объем

калориметрической камеры, где - внутренний радиус калориметрической камеры; начальная концентрация (плотность) титранта в жгуте объемом - среднее текущее значение концентрации (плотности) титранта в объеме - начальная концентрация (плотность) титранта в объеме калориметрической камеры вне жгута - среднее текущее значение концентрации (плотности) титранта в объеме

- конечная концентрация (плотность) тит-ранта в рабочем объеме калориметрической камеры У/1 (см. рис.2).

Определяя изменение массы титранта в объеме жгута на основании закона сохранения массы и закона Фика для потока массы с поверхности жгута, получим следующее дифференциальное уравнение относительно концентрации в объеме жгута:

которое приводится к дифференциальному уравнению

Решая это уравнение относительно времени выравнивания концентрации ли-ганда по образцу в рабочем объеме калориметрической камеры, получаем:

где к=(р(т)-рк)/рк.

Данное выражение содержит коэффициент диффузии титранта в образце Значение Dt 0.5mM NAD-H в образце 4.28 цМ LDH в справочной литературе не приводится. Величина определяется экспериментально на основе времени выравнивания концентрационной диффузией лиганда в образце, находящемся в оптической ячейке спектрофотометра. Используя экспериментально полученное значение определили теоретическое значение времени выравнивания, равное 37 с, для использованной цилиндрической капиллярной калориметрической камеры при Время теплового эффекта при диффузионном смешивании дозы титранта 3.5мкл 0.5mM NAD-H в объеме 78.5 мкл образца 4.28 (iM LDH составило около 40 с. Таким образом, тепловой эффект при взаимодействии NADH с LDH по длительности соответствует времени диффузионного выравнивания концентрации в объеме капиллярной цилиндрической калориметрической камеры, что подтверждает соответствие полученных теоретических и экспериментальных данных. Тестирование капиллярного калориметра

Точное значение рабочего объема камер и полное выравнивание концентраций реагентов в нем являются необходимыми условиями для получения достоверных измеряемых термодинамических параметров исследуемых биохимических процессов. Для подтверждения правильности принятых решений по выделению рабочего объема и смешиванию реагентов в капиллярном калориметре дополнительно сделана оценка указанных заложенных решений. При этом определе-

(3)

dy

(4)

ны константа и энтальпия используемых в мировой практике процессов связывания Ва2+ с 18-Сгошп-б и Кп^е с 2'СМР методом ЬеуепЪе^-Мащиай (далее метод нелинейной оптимизации). Показано соответствие полученных параметров литературным данным. При тестировании была использована подпрограмма нелинейной оптимизации, входящая в ЬаЪ\!еш - интегрированную среду разработчика для создания программ сбора и обработки данных. Для определения параметров связывания взято известное математическое описание процесса связывания со стехиометрией 1:1

IM-AH-»¡К

\-(]+г)/г-х,12

[2 fx' - 2Х, (l ~г)+(1 + гУ)" J

- полная концентрация лиганда в реакционном объеме, М^ - полная концентрация макромолекул в реакционном объеме, К - константа связывания, - энтальпия связывания, У0 - рабочий объем калориметрической камеры, - изменение тепла при изменении концентрации связанного лиганда.

На рис.3 представлены результаты тестирования капиллярного калориметра.

Рис. 3. Калориметрическая кривая титрования RNase с 2'СМР. А - термограмма; В - обработанные данные (соответствующие данным рис. ЗА), где точками обозначены экспериментальные данные, а сплошная линия соответствует кривой наилучшего описания, полученного методом нелинейной оптимизации. Наилучшие параметры связывания К =27425 ± 1372 М*1 и ДН=-57.5б ± 2.87 1Дя0иоть. Образец: 78.5 мкл RNase (0.651шМ). Добавка. 0.4938 мкл 2-СМР (20.404 тМ). Буфер 0.2 М КС1, 0.2 М КАс; рН=5.5. Температура: 37°С. Перемешивание: колеблющаяся игла 30 Гц, амплитуда 0 8 мм. Все реагенты получены из Sigma.

Полученные данные К=2724 ± 137 М'1 и ДН=-29.62 ± 1.48 кДж/моль для Ва2+ с 18-Crown-6 и данные К = 27425 ± 1372 М"1 и ДН = -57.56 ± 2.87 кДж/мольдля RNase с 2'СМР соответствуют литературным данным.

Метод ввода дозирующей иглы внутрь калориметрической камеры через активный тепловой шунт

Во многих исследованиях необходимым условием является механическое перемешивание реагентов в камере в течение всего эксперимента. Для этого в капиллярном калориметре необходимо обеспечить режим ввода дозирующей иглы в калориметрическую камеру и проведения эксперимента, когда колеблющаяся игла в процессе измерений находится в камере. В работе сделано теоретическое обоснование данного режима дозирования.

Системой регулирования температура активного теплового шунта 2 (Тш) поддерживается равной температуре экрана (Т,„). Теплоемкость шунта 2 (Сш) много больше теплоемкости части иглы высотой, равной высоте шунта Игла, заполненная реагентом, перемещается при вводе ее в камеру со скоростью V. Начальная температура иглы (Т„) выше температуры шунта 2 (Тш). На выходе из теплового шунта 2 объем иглы высотой Нш имеет температуру Тк. Таким образом, при прохождении через тепловой шунт объем иглы высотой отдает тепло, которое отводится к шунту теплопроводностью и конвекцией через слой жидкости между иглой и стенкой камеры. Полагаем, что тепловой контакт камеры с шунтом 2 идеальный и температура камеры в зоне контакта с тепловым шунтом равна температуре теплового шунта 2. Это позволяет получить выражение, связывающее перегрев иглы с титрантом относительно шунта 2 на входе в тепловой шунт 2 (ЛТ=Т„-ТШ) и перегрев иглы с титрантом относительно шунта 2 на выходе из теплового шунта

где а - коэффициент теплоотдачи от иглы к шунту на высоте Нш\ Р - площадь иглы в зоне контакта с тепловым шунтом высотой Исходя из того, что тепло отводится от иглы с титрантом к тепловому шунту конвекцией и теплопроводностью и <5Т>0, для заданной Нш можно определить критическую скорость перемещения иглы с титрантом:

2СЛ.+ а-Г—!г-

(5)

и

При V < окр температура иглы с титрантом становится равной температуре теплового шунта 2 до выхода из теплового шунта 2. При 0 >4,^ температура иглы с титрантом при выходе из теплового шунта отличается от температуры теплового шунта на ¿Т. Эффективность теплового шунта снижается при увеличении скорости перемещения иглы с титрантом. Это следует из (5) при о—»со; 5Т—*Л Т. Этот расчет применим в случае, когда начальная температура иглы меньше температуры теплового шунта 2. В формулы (5) и (6) входит коэффициент теплоотдачи а. Выбор а для случая минимального теплообмена между иглой и шунтом 2 гарантирует эффективность шунта 2 при более высоком теплообмене между иглой и шунтом 2.

Таким образом, был получен а, равный 1000 Вт-м'2,К"'. Для вычисления критической скорости были предварительно определены и вычислены сш и причем по формуле (6) определена критическая скорость 0,^=13.7 мм/с. Капиллярный калориметр

Описание капиллярного калориметра. На рис.4 представлена функциональная схема капиллярного калориметра, включающая следующие элементы: рабочая 1 и эталонная 2 калориметрические камеры, пассивный тепловой шунт 3, термостатирующая оболочка 4, активный тепловой шунт 5, измерительная термобатарея 6, нагревательные элементы 7 и 8, термохолодильник 9, датчики температуры 10 и 11, многоканальный измерительный усилитель 12, компьютер 13, усилитель мощности 14, нагреватель термостатирующей оболочки 15, нагреватель активного шунта 16, нановольтметр 17, шприц для рабочей камеры 18, шприц для эталонной камеры 19, корпус шприцов 20, поршни дозирующих шприцов 21 и 22, связывающая пластина 23, винтовые механизмы 24 и 25, шаговые двигатели 26 и 27, вибрационное устройство 28.

Отмеченные выше технические решения позволили оптимизировать рабочий объем камеры, минимизировать тепловой шум прибора и упростить конструкцию калориметра. В результате использован прямой капилляр внутренним диаметром 1.4 мм, с рабочим объемом камеры 78.5 мкл; инъекционное устройство, содержащее иглу, перемещающуюся внутри калориметрической камеры по всей ее длине с помощью средства линейного перемещения.

Это позволяет равномерно распределять реагент, вводимый в виде тонкого жгута, в объеме другого реагента по всей длине капиллярных калориметрических камер. Изотермические условия калориметрических камер дифференциального титрационного калориметра обеспечиваются термостатирующей оболочкой и активным тепловым шунтом, размещенными в термохолодильнике. При введении дозы производится продольное перемещение шприцов механизмом 24 на всю длину калориметрических камер. Одновременно с этим производится перемещение поршней механизмом 25. За счет различной величины перемещений механизмов 24 и 25 шприцами осуществляется дозирование заданного количества реагентов. Для приведения игл инъекционного устройства в колебательное движение с компьютера 13 подается сигнал заданной частоты, который через блок 14 поступает на вибрационное устройство 28. В режиме измерения тепловой мощности без обратной связи сигнал с термобатареи 6, пропорциональный тепловой мощности, измеряется нановольтметром 17, снабженным интерфейсом И8-232, через который он подается на компьютер, регистрирующий тепловую мощность как функция времени. В компенсационном режиме измерения тепловой мощности компьютер формирует сигнал ШИМ, который через блок усилителей мощности подается на нагреватели 7 или 8 в соответствии со знаком разбаланса и обеспечивает равенство температур между камерами.

и _

Рис.4 Функциональная схема капиллярного калориметра.

Программное обеспечение (ПО)

Капиллярный калориметр является современным автоматизированным прибором. Программно в нем реализуются все основные функции: измерение, управление, обработка данных, отображение информации и др. На рис.5 представлена структура ПО капиллярного калориметра. Использование специальных средств позволило в полном объеме выполнить сложную задачу разработки ПО для капиллярного калориметра. Использованная Lab VIEW работает под управлением WINDOWS и представляет собой интегрированную среду разработчика для создания интерактивных программ сбора, обработки данных и управления периферийными устройствами. Программирование осуществляется на уровне функциональных блок-диаграмм.

Windows - операционная система PC

L Б п аЬУ1е№ - система графического программирования иблиотеки: сбор данных, управление последовательным портом, анализ данных, оставление данных, сохранение данных и др.

Система управления капиллярным калориметром

Управление калориметрическим блоком

Сбор данных САР экрана, САР основания, САР шунта Запись управляющих параметров Отображение на экране графиков измерительных и управляющих параметров

Управление нановольтметром НР34420А

Запуск измерения в требуемом диапазоне | САР камер

Управление титрационным узлом

Подготовка к титрованию Титрование: преобразование параметров титрования в управляющие параметры ШД Установка параметров титрования

Обработка данных

Выбор параметров фильтрации данных, фильтрация Выделение пихов, вычисление площадей эффектов Построение титрационной кривой, расчет параметров, документирование данных эксперимента

Рис.5. Структура программного обеспечения капиллярного калориметра.

Калориметрические камеры капиллярного калориметра

Техническое решение узла калориметрических камер является развитием конструкции капиллярных калориметрических камер, созданных в первом дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-1. Данное техническое решение хорошо зарекомендовало себя в первом отечественном дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре и послужило основой для всех дальнейших моделей приборов данного типа. В нем впервые реализовано решение калориметрической камеры в виде открыто-

го протяженного капилляра, снабженного тепловыми шунтами. При этом тепловые шунты обеспечили точное выделение рабочего объема калориметрических камер и исключили тепловые потоки в рабочий объем калориметрических камер по стенкам пассивной части камер и заполняющей их жидкости. Данное построение показало свою эффективность в сканирующем режиме. В изотермическом режиме решение указанных задач проще, так как в этом случае практически нет перепадов температур в элементах конструкции калориметрического узла. Поэтому в основу построения калориметрического узла капиллярного калориметра положено выше указанное техническое решение. Чувствительность калориметра на уровне 10-8 Вт во многом достигнута, благодаря специальной измерительной термобатарее, размещенной на капиллярах рабочего объема калориметрических камер. Термобатарея выполнена многослойной, состоящей из 4 слоев. Металлическая термобатарея обеспечила измерение мощности длительных тепловых процессов, продолжительностью до 10 часов. Аппаратные средства системы управления капиллярным калориметром Капиллярный калориметр состоит из калориметрической части, нановольтмет-ра НР34420А, титрующего узла, блока аналоговой электроники (ключи, источники питания и простые элементы), управляющего компьютера типа Pentium, в котором дополнительно установлены 2 многофункциональные платы сбора данных LabPC+ и плата ввода/вывода РС-ТЮ-10. Данное построение систем управления научными приборами активно используется с середины 90-х годов. Результаты исследований, полученных на капиллярном калориметре, и развитие метода титрационной калориметрии

Капиллярный калориметр для исследований дисперсных систем. На рис.6 представлены результаты исследований, выполненных на капиллярном калориметре. Кривая 1 соответствует минимальной скорости дыхания. В окружении митохондрий не содержится АДФ, который определяет ее дыхание. Начальный участок кривой 2 соответствует максимальной скорости дыхания. Физиологическая добавка АДФ обеспечивает стимуляцию дыхания в митохондриях. Дыхание вновь становится минимальным после исчерпывания АДФ. Кривая 3 соответствует трансформации всей энергии дыхания в тепло. Итак, капиллярный калориметр обеспечивает возможность введения нетермостатированной добавки. Это позволило выполнить данное исследование, при котором важнейшим условием является сохранение параметров вводимого в калориметр образца.

nV3ooo

2

1 »

-1—1-1 --1-•-1---1---i>i'

0 600 1000 1500 2000 2900 3000 t/S

Рис.6. Измерение трансформации энергии в митохондриях. Температура: 26 °С; частота перемешивания: 20 Гц; амплитуда: 1мм; скорость перемещения иглы при введении добавки в камеру: 2мм/с; объем образца: 156 мкл (камеры из золотых капилляров); добавка: 2 мкл; перед экспериментом добавка сохранялась в холодильнике. Время между забором добавки и ее инъекцией в камеру составляет 60 с.

Добавка: Митохондрия печени крысы (бедок 1мг/мл).

Среда: KCl 125 mM," КН2Р04 3mM, MgS04 ImM, HEPES ЮшМ,ЕОТА0.25шМрН7.4.

Субстрат: калия сукцинат 5 mM, калия глутамат 0.25 mM.

Комплексы включения, образуемые додецилсульфатом натрия и цикло-декстриновыми трубками

Изучено комплексообразование додецилсульфата натрия (ДСН) с молекулярными трубками на основе а- и ß-циклодекстринов (ЦД), полученными суспензионным методом. При титровании ДСН а-трубкой определены: энтальпия комплексообразования ДН°=-21±5 кДж/моль, константа диссоциации КДисс=0.47±0.19 шМ, доля связывающих центров N=2.1±0.4. Новые перспективные научно-технические решения, созданные в процессе выполнения диссертационной работы, позволяют продолжить развитие калориметрического метода путем создания новых калориметров: многоканального капиллярного дифференциального титрационного калориметра; капиллярного дифференциального титрационного сканирующего калориметра. Выводы

Предложенный калориметрический метод для изучения биохимических реакций обладает существенными новизной и достоинствами, такими как: • возможность исследования дисперсных систем наряду с однородными жидкими образцами, благодаря совершенной системе перемешивания реагентов в камере;

2000 1000

о

• выделение рабочего объема калориметрических камер с погрешностью не более 0.2%;

• строгие изотермические условия проведения экспериментов без термостати-рования вводимых реагентов;

• уменьшение в 3 раза количества реагентов, необходимых для эксперимента. Метод оснащен созданным впервые капиллярным калориметром, который конкурентоспособен и перспективен для дальнейшего развития калориметрического метода. Выполнена классификация титрационных калориметров на основании предложенного критерия оценки способности этих приборов работать с минимальной концентрацией реагентов. Также предложены перспективные решения дальнейшего развития разработанного калориметрического метода.

Список опубликованных по теме диссертации работ.

1. Комплексы включения, образуемые додецилсульфатом натрия и циклодекст-риновыми нанотрубками / Калашников ФА., Котельников Г.В., Моисеева С.П.,Топчиева И.Н. // Коллоидный журнал.- 2004.-Т.66, N5.- С.608-612.

2. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V. Differential Titration Calorimeter // Science and Business Partnerships in Action. Issues and solutions in discovery and use of novel biomolecules: biodiversity and environment: Proc. of the International Workshop 17-19 March, 2004, Moscow.- P. 171.

3. Capillary differential titration calorimeter CTD2156 for researches of the dispersoid systems / Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Maevsky E.I., Grishina E.V. // XI International starch convention Moscow-Cracow: Proc. of the conference 17-19 June, 2003, Moscow, Russia.-2003.-P.188-189.

4. CTD2156 is basis for the designing ofMulti-channel capillary differential titration calorimeter / Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Maevsky E.I., Grishina E.V. // Proc. the 31st Annual Conference ofthe North American Thermal Analysis Society on Thermal Analysis and Applications, September 22-24, 2003, Albuquerque, New Mexico, USA .-M.J. Rich, Ed.-2003.- on CD-ROM.

5. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V. Capillary Differential Titration Calorimeter // CALCON 2003: Program, Abstracts and Reports : Proc. of the 58th Calorimetry conference Together with the Japan society of calorimetry and thermal analysis at Brigham Young University, July 27-August 1, 2003, Laie, Hawaii, USA.-P.74.

6. New isothermal titration calorimeter for investigations on very small samples. Theoretical and experimental studies / Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. -2002.-Vol.68.-P.803-818.

7. Method of separating the sensitive volume of calorimetric cells in a differential titration calorimeter / Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. //Journal ofThermal Analysis and Calorimetry.-2000.-Vol.62.-P.39-50.

8. Method of separating the sensitive volume of calorimetric cells with a heat-conducting bridge in a differential titration calorimeter / Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. // New Trends in Calorimetry and its Applications: Proc. of the Italian-Russian Calorimetry Workshop October 31-November 03,1999, II Ciocco (Barga), Italy.-P.I-2.

9. Development of a titration isothermal calorimetric method for studying very small amounts of biological samples / Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Sivasheva T.N., Lasukov Yu.I., Mezhburd E.V. // Biothermodynamics. Molecular, Organismal and Ecological: Proc. of the ISBC XI Conference 6-10.06.99, Alta, Utah, USA.-P.52.

10. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P. and Krayev V.P. Calorimetric method for adjusting the mass of culture fluid in a bioreactor // Review of Scientific Instruments.- 1998.- Vol.69, N5.- P.2137-2140.

11. Котельников Г.В., Моисеева СП. Система автоматического регулирования температуры биореактора // "Приборное оснащение науки, промышленного и сельскохозяйственного производства, природопользования, жилищно-коммунального хозяйства": Тезисы докладов конференции, Москва, 26-27 ноября 1997,-С.53-55.

Подписано в печать

-/£/2. 09

Заказ № 4

Формат 60x90 1/16 . Усл. печ. л. ./¿г . Тира жэ к з Отпечатано на копировально-множительном оборудовании в отделе методов автоматизированного проектирования и -унификации ИБП РАН.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Моисеева, Софья Петровна

Введение.

Глава 1 .Метод титрационной калориметрии для определения термодинамических параметров процессов связывания.

1.1. Определяемые параметры связывания и достоинства метода.

1.2. Алгоритмы определения параметров связывания.

1.3.Использование изотермической титрационной калориметрии в биотехнологии.

1.4. Использование титрационной калориметрии для определения параметров кинетики ферментативных реакций.

1.5.Титрационная калориметрия - универсальный метод для изучения молекулярных взаимодействий.

1.6. Первые установки и современные титрационные калориметры.

1.7.Тенденции в построении титрационных калориметров.

Глава 2. Разработка метода титрационной изотермической калориметрии для изучения биохимических реакций.

2.1. Метод выделения рабочего объема калориметрических камер в капиллярном калориметре.

2.2. Оценка точности выделения рабочего объема калориметрической камеры в капиллярном калориметре.

2.3. Экспериментальная проверка метода теплового шунтирования.

2.4. Смешивание реагентов в капиллярной калориметрической камере капиллярного калориметра.

2.5.Определение времени выравнивания концентрации титранта по образцу в рабочем объеме цилиндрической калориметрической камеры.

2.6. Определение коэффициента диффузии по времени выравнивания концентрации титранта в образце, заполняющем оптическую кювету спектрофотометра.

2.7. Тестирование капиллярного калориметра.

2.8.Ввод дозирующей иглы внутрь калориметрической камеры через активный тепловой шунт.

Глава 3. Капиллярный калориметр.

3.1.Обоснование построения капиллярного калориметра.

3.2.Описание конструкции капиллярного калориметра.

3.3.Программное обеспечение.

3.4. Системы автоматического регулирования температуры теплового экрана.

3.5.Калориметрические камеры капиллярного калориметра.

3.6. Аппаратные средства системы управления капиллярным калориметром.

Глава 4. Результаты исследований, полученные на капиллярном калориметре, и развитие метода титрационной калориметрии.

4.1. Капиллярный калориметр для исследований дисперсных систем.

4.2. Комплексы включения между додецилсульфатом натрия и циклодекстрин-содержащими трубками.

4.3.Капиллярный калориметр как основа для разработки многоканального капиллярного дифференциального калориметра.

4.4. Дифференциальный титрационный сканирующий калориметр.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка калориметрического метода и капиллярного титрационного калориметра для изучения биохимических реакций"

Актуальность темы исследований

Развитие фундаментальных и прикладных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии требует создания новых технических средств для оснащения работ в этой области, при этом титрационная калориметрия является ключевым направлением для биотехнологии, универсальным средством для измерения параметров кинетики ферментативных реакций.

Титрационная калориметрия представляет собой универсальный метод инженерной энзимологии при получении знаний условий и последовательности действий белковых ферментов в организме растений, животных и человека, в промышленных реакторах.

Метод титрационной калориметрии позволяет выполнять наиболее полно и точно термодинамическое описание процессов связывания. Титрационная калориметрия чрезвычайно информативна при изучении всех типов реакций связывания: антиген-антитело, белок-лиганд, белок-белок, ДНК-лекарственные препараты, рецептор-мишень - и обладает преимуществами перед традиционными методами, такими как равновесный диализ, динамический диализ, спектрофотометрия и потенциометрия, имеющими ограничения из-за недостаточной чувствительности, а также ограничения по виду и концентрации лиганда и по условиям эксперимента.

Разработка методических основ и аппаратно-программных средств для реализации метода по теме диссертационной работы выполнена в рамках программы "Научное приборостроение РАН", объединяющей наиболее актуальные и перспективные разработки в биологии, биотехнологии, биохимии, физико-химической биологии, медицине и многих других областях науки и техники.

Цель работы состоит в исследовании метода титрационной изотермической калориметрии для изучения биохимических реакций, обосновании и разработке аппаратно-программных средств для реализации метода.

Конкретными задачами исследования являются обоснование, разработка и исследование калориметрического метода для изучения биохимических реакций, обеспечивающего:

• выравнивание концентраций реагентов по объему калориметрической камеры;

• выделение рабочего объема с высокой точностью;

• введение реагентов без предварительного термостатирования;

• уменьшение количества используемых реагентов;

• создание капиллярного калориметра для реализации метода;

• классификацию титрационных калориметров по способности работать с минимальными концентрациями реагентов в исследуемых процессах на основании обоснованного критерия.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Моисеева, Софья Петровна

Выводы

Обоснован, разработан и исследован калориметрический метод для изучения биохимических реакций, обеспечивший:

• построение титрационного калориметра, в котором калориметрические камеры впервые выполнены в виде капилляров, расположенных горизонтально;

• новое решение смешивания реагентов в капиллярной калориметрической камере методом концентрационной диффузии и перемешиванием колеблющейся дозирующей иглой при введении реагентов в калориметрическую камеру в виде тонкого жгута, распределенного по длине калориметрической камеры;

• выделение рабочего объема калориметрической камеры методом теплового шунтирования с погрешностью не более 0.2%, что на порядок меньше, чем у аналогов;

• введение реагентов в камеру без предварительного термостатирования;

• обоснование критерия сравнения титрационных калориметров по соотношению рабочего объема калориметрической камеры и уровня шума;

• классификацию титрационных калориметров по способности работать с минимальными концентрациями реагентов в исследуемых процессах на основании обоснованного критерия;

• измерение мощности длительных тепловых процессов, продолжительностью до 10 часов, при максимальной чувствительность капиллярного калориметра 10"8 Вт;

• разработку капиллярного калориметра, в котором уменьшено в 3 раза количество необходимых для эксперимента реагентов, и изготовление экспериментального образца капиллярного калориметра, на котором выполнены научные исследования;

• технические решения, которые могут быть запатентованы, позволят выпускать конкурентоспособные капиллярные калориметры для внутреннего и внешнего рынка и обеспечивают разработку новых перспективных калориметров.

Заключение

Предложенный калориметрический метод для изучения биохимических реакций обладает существенными новизной и достоинствами, такими как

• возможность исследования дисперсных систем наряду с однородными жидкими образцами, благодаря совершенной системе перемешивания реагентов в камере;

• выделение рабочего объема калориметрических камер с погрешностью не более 0.2%;

• строгие изотермические условия проведения экспериментов без термостати-рования вводимых реагентов;

• уменьшение в 3 раза количества реагентов, необходимых для эксперимента. Метод оснащен созданным впервые капиллярным калориметром, который конкурентоспособен и перспективен для дальнейшего развития калориметрического метода. Выполнена классификация титрационных калориметров на основании предложенного критерия оценки способности этих приборов работать с минимальной концентрацией реагентов. Также предложены перспективные решения дальнейшего развития разработанного калориметрического метода.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Моисеева, Софья Петровна, Пущино

1. Бронштейн И.Н., Семендяев К.А. Справочник по математике для инженеров и учащихся втузов 13-е изд., исправленное .- М.гНаука, Гл. ред. физ.-мат. лит., 1986 544 с.

2. Изерман Р. Цифровые системы управления: Пер. с англ.-М.Мир, 1984.-541с.

3. Киппер А.И., Котельников Г.В., Эскин В.Е. Метод определения теплоемкости макромолекул в растворе // Высокомолекулярные соединения.-1976.-T.XIX, N5.-C.1173-1175.

4. Комплексы включения, образуемые додецилсульфатом натрия и циклодекс-триновыми нанотрубками / Калашников Ф.А., Котельников Г.В., Моисеева С.П., Топчиева И.Н. // Коллоидный журнал.- 2004.-T.66,N5.- С.608-612.

5. Котельников Г.В., Сидорович А.В. Микрокалориметр ДСМ-2М при исследовании полимеров // Высокомолекулярные соединения.-1983.-T.XXV, N12.-С.2622-2626.

6. Кутателадзе С.С., Боришанский В.М. Справочник по теплопередаче.-М.:Энергоиздат, 1959.-416 с.

7. Ю.Овчинников Ю.А. Биология и биотехнология: достижения и прогнозы // Химия жизни: Избранные труды .-М.:Наука,1990 С.432-440

8. Теория автоматического управления / Под ред. А.В.Нетушила. М.:Высшая школа, 1976 400 с.

9. A New Ultrasensitive Scanning Calorimeter / Plotnikov V.V., Brandts J.M., Lin L.-N., Brandts J.F. // Anal. Biochem.-1997.-Vol.250,N2.-P.237-244.

10. A twin titration micricalorimeter for the stude of biochemical reactions / McKinnon I.R., Fall L., Parody-Morreale A., Gill S.J. // Anal. Biochem.-1984.-Vol.139.-P. 134-139.

11. An electrical impedance tomography measurement systen for experimental use / Savolainen Т., Kaipio J.P., Karjalainen P.A., Vauhkonen M. // Rev. Sci. Instrum.-1996.-Vol.67,N10.-P.3605-3609.

12. An isothermal titration microcalorimeter / Christensen J.J., Gardner J.W., Eatough D.J., Izatt R.M., Watts P.J., Hart R.M. // Rev. Sci. Instrum.-1973.-Vol.44,N4.-P.481-484.

13. Barcelo F., Ortiz-Lombardia M., Portugal J. Heterogeneous DNA binding modes of berenil //Biochim. et Biophys. Acta.-2001.-Vol.l519.-P.175-184.

14. Bianconi M.L. Calorimetric determination of thermodynamic parameters of reaction reveals different enthalpic compensations of the yeast hexokinase isozymes//J. Biol. Chem.-2003.-Vol.278.-P. 18709-18713.

15. BindWorks Data Modeling Software // Technical Information Brief .-Calorimetry Sciences Corp.:Spanish Fork, Utah,USA.-2000.-2p.

16. Black C.B., Cowan J.A. A critical evaluation of metal-promoted Klenow 3b-5b exonuclease activity: calorimetric and kinetic analyses support a one-metal-ion mechanism // JBIC.-1998.-Vol.3.-P.292-299.

17. Briggner L.E., Wadso I. Test and calibration processes for microcalorimeters, with special reference to heat conduction instruments used with aqueous systems // J. Biochem. Biophys. Methods.-1991.-Vol.22.-P.101-l 18.

18. Christensen J J., Izatt R.M., Hansen L.D. New precision thermometric titration calorimeter//Rev. Sci. Instrum.-1965.-Vol.36,N6.-P.779-783.

19. Christensen J.J., Johnston H.D., Izatt R.M. An isothermal titration calorimeter // Rev. Sci. Instrum.-1968.-Vol.39,N9.-P. 1356-1359.

20. Clugston S.L., Yajima R., Honek J.F. Investigation of metal binding and activation of Escherichia coli glyoxalase I: kinetic, thermodynamic and mutagenesis studies 11 Biochem J.-2004.-Vol.377.-P.309-316.

21. Complexation studies of zwitterionic amino acids with crown and guanidinium compounds using titration calorimetry / Czekalla M., Stephan H., Habermann В., Trepte J., Gloe K. and Schmidtchen F.P.// Thermochimica Acta.-1998.-Vol.313-P.137-144.

22. Constantin F., Dumitru M., Korschinek G. Computer controlled high-voltage injector//Rev. Sci. Instrum.-1996.-Vol.67,Nl.-P.l 61-164.

23. CSC 5200 Jet Titration Calorimeter // Technical Information Brief.-Calorimetiy Sciences Corp.:Provo,Uta,USA.

24. CSC Web page: www.calscorp.com

25. CTD2156 is basis for the designing of Multi-channel capillary differential titration calorimeter / Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Maevsky E.I.,

26. Grishina E.V. I I Proc. the 31st Annual Conference of the North American Thermal Analysis Society on Thermal Analysis and Applications, September 22-24, 2003, Albuquerque, New Mexico, USA .-M.J. Rich, Ed.-2003.- on CD-ROM.

27. Demchenko A.P., Rusyn O.I., Saburova E.A. Kinetics of the lactate dehydrogenase reaction in high-viscosity media // Biochim. et Biophys. Acta.- 1989.-Vol.998.-P.l 96-203.

28. Design and testing of a new microcalorimetric vessel for use with living cellular systems and in titration experiment / Gorman Nordmark M., Laynez J., Schon A., Suurkuusk J., Wadso I. // J. Biochem. Biophys. Methods.-1984.-Vol.l O.P.I 87-202.

29. Determination of thermodynamic and kinetic parameters from isothermal heat conduction microcalorimetry: application to long-term-reaction studies / Willson R.J., Beezer A.E., Mitchell J.C., Watson Loh // J.Phys.Chem .- 1995 .- Vol.99.-P.7108-7113.

30. Donnert J., Caruthers M.H.and Gill S.J. A calorimetric investigation of the interaction of the lac repressor with inducer // J. Biol. Chem.-1982.-Vol.257, N24.-P. 14826-14829.

31. El Harrous M., Gill S.J. and Parody-Morreale A. Description of a new Gill titration calorimeter for the study of biochemical reactions. I: assembly and basic response of the instrument//Meas. Sci. Technol.- 1994.-Vol.5.-P. 1065-1070.

32. Eli W., Chen W. and Xue Q. The association of anionic surfactants with |3-cyclodextrin. An isothermal titration calorimeter study // J. Chem. Thermodynamics." 1999 .-Vol.31 .-P. 1283 -1296

33. Freire E. Thermodynamic-based algorithms in drug design. High affinity, selectivity and adaptibility // 2003 Current Trends in Microcalorimetry: Proc. of the Conference July 20-26 2003 Boston, MA.- MicroCal Inc.:Northampton,MA, USA.-2003

34. Freire E., Mayorga O., Straume M. Isothermal Titration // Anal. Chem.- 1990.-Vol.62, N18.-P.950-959.

35. Gaisford S., Buckton G.Potential applications of microcalorimetry for the study of physical processes in pharmaceuticals // Thermochimica Acta.-2001.-Vol.3 80.-P.185-198.

36. Garcia-Fuentes L., Baron C.and Mayorga O.L. Influence of dynamic power compensation in an isothermal titration microcalorimeter // Anal. Chem.-1998.-Vol.70, N21-P.4615-4623.

37. Green D.P., Balcom B.J., Lees T.J. Sensor measuremenr and experimental control in nuclear magnetic resonance imaging // Rev. Sci. Instrum.-1996.-Vol.67,Nl.-P.102-107.

38. Gruen M., Prinz H., Gautel M.cAPK-phosphorylation controls the interaction of the regulatory domain of cardiac myosin binding protein С with myosin-S2 in an on-off fashion // FEBS Letters.-1999.-Vol.453.-P.254-259.

39. Hansen L.D. Future projections from some past developments in calorimetric instruments and techniques at Brigham Young University, 1960-2000 // Thermochimica Acta.-2000.-Vol.355.-P.89-94.

40. Haq I. Calorimetry in the fast lane: The use of ITC for obtaining enzyme kinetics constants // LLC application note.- Microcal, Inc.Northampton, MA,USA,2002.-P.6.

41. Harrous M.E., Mayorga O.L., Parody-Morreale A. Description of a new Gill titration calorimeter for the study of biochemical reactions. II'.operational characterization of the instrument//Meas. Sci. Technol.-1994.-Vol.5.-P. 1071-1077.

42. Heat of protonation of endoglucanase V catalytic domain (EGV-core) from Humicola insolens / Galletto R., Attanasio F., Dossi E., Schulein M., Rialdi G. // Thermochimica Acta.-1998.-Vol.321 .-P.l 7-21.

43. Holbrook J.J., Stinson R.A. The use of ternary complexes to study ionizations and isomerizations during catalysis by lactate dehydrogenase // Biochem. J.-1973.-Vol.131, N4.-P.739-748.

44. Ikeda Т., Ooya Т., Yui N. Inclusion complexation of fractionated a-cyclodextrin molecular tube with sodium dodecyl sulfate // Polymers for Advanced Technologies.-2000.- Vol.11.-P. 830-836.

45. Improved control and data-acquisition electronics for high-resolution electron energy loss spectroscopy / Xie J., Wang Y., Mitchell W.J., Felino A., Schick M., Weinberg W.H. //Rev. Sci. Instrum.-1996.-Vol.67,N3.-P.710-714.

46. Interaction of heparin with annexin V / Capila I., VanderNoot V.A., Mealy T.R., Seaton B.A., Linhardt R.J. // FEBS Letters.-1999.-Vol.446.-P.327-330.

47. Karlsson R., Kullberg L. A computer method for simultaneous calculation of equilibrium constants and enthalpy changes from calorimetric data // Chemica Scripta.-1976.-Vol.9.-P.54-57.

48. Kelley R.F., O'Connell M.P.Thermodynamic analysis of an antibody functional epitope // Biochemistry .-1993.-Vol.32,N27.-P.6828-6835.

49. Kemp R.B., Lamprecht I.- La vie est done un feu pour la calorimetrie: half a century of calorimetry Ingemar Wadso at 70 // Thermochimica Acta.-2000.-Vol.348.-P.l-17

50. Kinetic and structural characterization of a product complex of 6-hydroxymethyl-7,8-dihydropterin pyrophosphokinase from Escherichia coli / Garcon A., Bermingham A., Lian L.Y., Derrick J.P. // Biochem J.-2004.-Vol.380.-P.867-873.

51. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Krayev V.P. Calorimetric method for adjusting the mass of culture fluid in a bioreactor // Rev. Sci. Instrum.- 1998.- Vol.69, N5.-P.2137-2140.

52. Lab View. User Manual.-National Instruments: Austin,'Texas, USA, 1998.-514P.

53. Ladbury J. Isothermal titration calorimetry: application to structure-based drug design // Thermochimica Acta.-2001.-Vol.380.-P.209-215.

54. Marquardt D. An Algorithm for least squares estimation of nonlinear parameters // SIAM J.Appl. Math.-1963.-Vol. 11 .-P.431-441.

55. Method of separating the sensitive volume of calorimetric cells in a differential titration calorimeter / Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. //J. Therm. Anal. Cal.-2000.-Vol.62.-P.39-50.

56. More J.J. The Levenberg-Marquardt Algorithm: Implementation and Theory // Numerical Analysis. Lecture notes in mathematics .-Berlin: Springer-Verlag, 1977.-VoI.630.-P. 105-116.

57. Morin P.E., Freire E. Direct calorimetric analysis of the enzymatic activity of yeast cytochrome с oxidase // Biochemistry.- 1991.- Vol.30.-P.8494-8500.

58. Myers M., Mayorga O.L., Emtage J., Freire E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes // Biochemistry.-1987.-Vol.26.-P.4309-4315.

59. New isothermal titration calorimeter for investigations on very small samples. Theoretical and experimental studies / Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. // J. Therm. Anal. Cal.-2002.-Vol.68.-P.803-818.

60. Ohyama Т., Cowan J.A. An approach to the evaluation of RNA solution structure and metal coordination chemistry by titration calorimetry // JBIC.-1996.-Vol.l.-P.83-89.

61. Ohyama Т., Cowan J.A. Influence of monovalent cations on magnesium binding to poly-RNA by solution titration calorimetry: an analysis of the salt dependence of binding enthalpies and entropies // JBIC.-1996.-Vol. 1.-P. 111-116.

62. Okubo M., Suzuki Т., Sakauchi A. Microanalysis of the surface concentration of sulfate groups at polystyrene particle by isothermal titration calorimetry // Colloid Polym. Sci.-1999.-Vol.277.-P.579-582.

63. OMEGA Data Analysis in Origin.-MicroCal, Inc.: Northampton, MA,USA.-1991.-71p.

64. Ortiz-Salmeron E., Baron C., Garcia-Fuentes L. Enthalpy of captopril-angiotensin I-converting enzyme binding // FEBS Letters.-1998.-Vol.435.-P.219-224.

65. Patent U.S. 2003/0113748 Int. CI.7: C12Q 1/70 Metods for determinig plasma free drug concentration by direct measurement of binding affinity of prorease inhibitors to plasma proteins / D.Xie, W. Cao, J.W.Erickson.-14p.:fig.

66. Patent U.S. 3,899,918 Int.Cl.2 :G01K 17/00 Differential microcalorimeter / Privalov P.L., Makurin P.S., Plotnikov V.V., Koryagin V.V., Polpudnikov V.S., Stepanjuk G.P.-6p.:fig.

67. Patent U.S. 4,112,734, Int.Cl.2: G01K 17/00 Differential Scanning Micro-calorimeter / Goryachev V.I., Kotelnikov G.V., Makurin P.S.-6p.:fig.

68. Patent U.S. 5,707,149, Int.Cl.6: GO IK 017/00 Device and method for measuring the heat of reaction resulting from mixture of a plurality of reagents / Freire E., Privalov G.P., Privalov P.L. and Kavina V.V.-12p.:fig.

69. Patent U.S. 5,967,659, Int.Cl.6: G02N 25/20 Ultrasensitive differential microcalorimeter with user-selected gain setting / Plotnikov V.V., Brandts J.F., Brandts M. J.- llp.:fig.

70. Petit C.M., Koretke K.K. Characterization of Streptococcus pneumoniae thymidy-late kinase: steady-state kinetics of the forward reaction and isothermal titration calorimetry // Biochem. J.-2002.-Vol.363.-P.825-831.

71. Pluschke G., Mutz M. Use of isothermal titration calorimetry in the development of molecularly defined vaccines // J. Therm. Anal. Cal.-1999.-Vol.57.-P.377-388.

72. Poznanski J., Wszelaka-Rylik M., Zielenkiewicz W.Concentration dependencies of NaCl salting of lysozyme by calorimetric methods // Thermochimica Acta.-2004.-Vol.409.-P.25-32.

73. Ramsay G., Prabhu R., Freire E. Direct measurement of the energetics of association between myelin basic protein and phosphatidylserine vesicles // Biochemistry.-1986.-Vol.25.-P.2265-2270.

74. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter / Wiseman Т., Williston S., Brandts J.F. and Lin L. // Anal. Biochem.-1989.-Vol. 179.-P. 131-137

75. Saboury A. New methods for data analysis of isothermal titration calorimetry // J. Therm. Anal. Cal.-2003 .-Vol.72.- P.93-103.

76. Saboury A.A. Isothermal titration microcalorimetric method for studying the combined ligand binding with application to the binding of ethylurea and (N,N)dimethylurea on urease // Thermochimica Acta.-1998.-Vol.320.-P.97-100.

77. Schon A., Freire E. Thermodynamics of intersubunit interactions in cholera toxin upon binding to the oligosacchride portion of its cell surface receptor, ganglioside GMi // Biochemistry.-1989.-Vol.28.-P.5019-5024.

78. Spink C., Wadso I. Calorimetry as an analytical tool in bio-chemistry and biology // Methods Biochem. Anal.-1976.-Vol.23.-P.l-159.

79. Spokane R.B.and Gill S J. Titration microcalorimeter using nanomolar quantities of reactants // Rev. Sci. Instrum.-1981.-Vol.52, N11-P. 1728-1733.

80. Srinivas V.R., Reddy G.B., Surolia A.A predominantly hydrophobic recognition of H-antigenic sugars by winged bean acidic lectin: a thermodynamic study // FEBS Letters.-1999.-Vol.45O.-P. 181-185.

81. Tellez-Sanz R., Garcia-Fuentes L., Baron C. Calorimetric analysis of lisinopril binding to angiotensin I-converting // FEBS Letters.- 1998.-Vol.423.-P.75-80.

82. Thompson K.C. Pharmaceutical applications of calorimetric measurements in the new millennium // Thermochimica Acta.-2000.-Vol.355.-P.83-87.

83. Time-resolved electron spectrum diagnostics for a free-electron laser / Gillespie W.A., MacLeod A.M., Martin P.F., van der Meer A.F.G., van Amersfoort P.W. // Rev. Sci. Instrum.-1996.-Vol.67,N3.-P.641 -648.

84. Time-resolved fluorescence lifetime imaging microscopy using a picosecond pulsed tunable dye laser system / Periasamy A., Wodnicki P., Wang X.F., Kwon S., Gordon G.W., Herman B. // Rev. Sci. Instrum.-1996.-Vol.67,N10.-P.3722-3731.

85. Todd M.J., Gomez J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: A general assay for enzyme activity // Anal. Biochem.-2001.-Vol.296.-P.179-187.

86. Use of isothermal titration calorimetry to measure enzyme kinetic parameters // ITC Application Note .- Microcal,Inc. Northampton,MA,US A,2004 .-P.6

87. Utzig E. Heat conduction microcalorimeter for thermokinetics and titration experiments //J. Therm. Anal. Cal.-1998.-Vol.54.-391-397.

88. VP-ITC MicroCalorimeter User's Manual.-Microcal, Inc.: Northampton, MA, USA, 2001.-P.93.

89. Wadso I. Design and testing of a micro reaction calorimeter // Acta chemica scandinavica.-1968.-Vol.22.-P.927-937.

90. Waldron T.T., Schrift G.L., Murphy K.P. Salt effects in Rnase-Ligand interaction: screening or competitive binding? // 2003 Current Trends in Micro-calorimetry: Proc. of the Conference July 20-26, 2003, Boston, MA.

91. Wang W., He T. A high precision micropositioner with five degrees of freedom based on an electromagnetic driving principle // Rev. Sci. Instrum.-1996.-Vol.67,Nl .-P.312-317.

92. Wartski L., Schwebel C., Aubert J. Radio frequency. Microwave, and electron cyclotron resonance ion sources for industrial application // Rev. Sci. Instrum.-1996.-Vol.67,N3 .-P. 895-900.

93. Watt G.D. A microcalorimetric procedure for evaluating the kinetic parameters of enzyme-catalyzed reactions: kinetic measurements of the nitrogenase system // Anal. Biochem.-1990.-Vol. 187.-P. 141 -146.

94. Wave form analysis of constant capacitance-voltage transient deep level transient spectroscopy using an iterative feedback system / Okamoto Y., Yonekura H., Morimoto J., Miyakawa T. // Rev. Sci. Instrum.-1996.-Vol.67,N3.-P.809-812.

95. Williams B.A., Toone E.J. Calorimetric evaluation of enzyme kinetics parameters //J. Org. Chem.-1993.-Vol.58.-P.3507-3510.1. Основные обозначения

96. ЕС 3.1.27.5; тип ХИ-А RS-232 интерфейс передачи данных

97. VP-ITC изотермический титрационный калориметр, выпускаемый

98. MicroCal, Inc. (США) АДФ аденозин-5-дифосфат

99. АЦП аналого-цифровой преобразователь

100. ДАСМ-1 дифференциальный адиабатический сканирующий микрокалориметр, выпускаемый СКБ БП АН СССР ПО программное обеспечение

101. САР система автоматического регулирования1. Ср изобарная теплоемкость

102. ЦАП цифро-аналоговый преобразователь

103. ШИМ широтно-импульсная модуляция

104. Выражаю свою признательность Романову Льву Степановичу за долголетнее творческое сотрудничество при создании капиллярного дифференциального титрационного калориметра.

105. Благодарю всех сотрудников лаборатории разработки методов и приборов для исследований микроорганизмов ИБП РАН, оказавших помощь при выполнении работы.