Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интенсивность энергетического обмена в раннем онтогенезе животных по данным непрямой и прямой калометрии

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Интенсивность энергетического обмена в раннем онтогенезе животных по данным непрямой и прямой калометрии"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ ик. Н. К. КОЛЬЦОВА

2 9 ДПР На ЦРавах РУКОПИСИ

УДК 591.1:577.23

КЛЕЙМЁНОВ Сергей Юрьевич

ИНТЕНСИВНОСТЬ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ ЖИВОТНЫХ ПО ДАННЫМ НЕПРЯМОЙ И ПРЯМОЙ КАЛОРИМЕТРИИ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва, 1996

Работа выполнена в лаборатории биофизики развития Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова Российской Академии наук.

Научный руководитель :

Доктор биологических наук, профессор А. И. Зотин

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Б. Н. Манухин Кандидат физико-математических наук Т. А. Воробьёва

Ведущее учреждение:

Биологический факультет Московского Государственного Университета

им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 1996 года в ^ часов

на заседании специализированного совета Д 002.85.01 по защите диссертаций при Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул. Вавилова, 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН (Москва, ул.Вавилова, 26)

Автореферат разослан ^а^еа^ 1996 года.

Учбный секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е. В. Волина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Способ получения дополнительной информации о физиологическом состоянии животных посредством сравнения показаний непрямого и прямого методов измерения интенсивности их энергетического обмена известен давно. В конце XVIII века таким способом Лавуазье доказал справедливость закона сохранения энергии для живых существ. Последующие эксперименты с использованием более совершенной техники показали, что равенство между данными непрямого (респирометрического) и прямого (собственно калориметрического) методов часто нарушается. Достоверная разность между результатами непрямой и прямой калориметрии обнаружена у взрослых животных в состоянии наркоза и гипотермии (Чередниченко, 1965), при различного рода инфекциях (Лихачёв, Авроров, 1902; Barr, Du Bois, 1918; Зыкина, 1959) и выполнении физической работы (Jéquler, 1977). Расхоздение результатов непрямой и прямой калориметрии отмечены также во время постнатального (Barott, Pringle, 1946; Грудницкий, 1972; Loehr et all, 1976) и эмбрионального (Barott, 1936; Bell, 1940; Dunkel et all, 1979; Грудницкий, 1983) роста животных и развития ооцитов (Зотин, 1975). Рост культур одноклеточных организмов также сопровождался различиями в показаниях одного и другого методов (Schaarschmidt et all, 1975; 1977; Корягин, Коновалов, 1980; Bermudes et all, 1984; 1985).

Факты расхождения данных непрямой и прямой калориметрии можно подразделить на физиологические (кратковременные) и онтогенетические (долговременные).

Несмотря на разную природу воздействий, вызывавших физиологическое расхождение данных непрямой и прямой калориметрии, одной из его причин является изменение теплосодержания организма вследствие неравенства скорости образования и отвода тепла (Чередниченко, 1965; Webb et all, 1980). Вторая причина состоит во временном (частичном или полном) переходе на анаэробный тип энергетического обмена при гипоксии и аноксии (Gnelger, 1983b).

Расхождения результатов непрямой и прямой калориметрии, сохраняющееся на протяжении целых этапов (периодов) онтогенеза, не имеют столь очевидных причин. Отрицательная разность между респирометрическими данными и прямой калориметрией указывает на

то, что организм расходует больше энергии, чем получает в результате окислительного фосфоршшрования. Недостаток энергии может восполняться за счет гликолиза (Gnelger, 1983b), недо-окисленные продукты которого могут выводиться из клетки или использоваться при синтезе необходимых макромолекул (Hochachka et all, 1973; Хочачка, Сомеро, 1977).

Положительная разность между непрямой и прямой калориметрией означает, что в результате окислительного фосфорилирования организм производит больше энергии, чем расходует в гомеостати-ческих процессах. Из феноменологической теории развития, роста и старения (Зотин, Зотина, 1993) следует, что на ранних стадиях онтогенеза организм как термодинамическая система удалён от стационарного состояния. Вследствие этого соотношения между термодинамическими силами и потоками подчинены нелинейным законам, что делает возможным неравенство потока поступащей в организм энергии и потока энтропии между ним и средой.

Изучение причин возникновения онтогенетической положительной разности между данными непрямой и прямой калориметрии позволит решить вопрос биоэнергетики, вызывающий в настоящее время острые споры среди учёных, так как из-за отсутствия теоретического обоснования это явление иногда рассматривают как противоречие первому началу термодинамики (Иванов, 1990).

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было расширенное изучение феномена расхождения данных непрямой и прямой калориметрии в раннем онтогенезе животных и его связи с ростом и развитием организма. Задачи исследования:

1. Разработка и изготовление специального респирационного калориметра для одновременного измерения теплопродукции прямым и непрямым методами.

2. Создание программного обеспечения для обработки экспериментальных данных.

3. Определение интенсивности потребления кислорода и интенсивности теплопродукции в период эмбрионального развития кур, эмбрионального и постнатального развития ящериц и личиночного роста сверчков.

4. Изучение соотношения полученных данных непрямой и прямой калориметрии.

5. Выявление коррелятивных связей расхождения данных непрямой и

прямой калориметрии с морфологическими и физиологическими изменениями организмов в процессе их развития.

Научная новизна и практическая значимость. в работе установлено расхождение результатов непрямой и прямой калориметрии во время развития зародышей прыткой ящерицы, зародышей двух гибридов домашних кур и личинок сверчков. Обнаружено, что при циклическом характере роста разность показаний непрямой и прямой калориметрии испытывает синхронные циклические колебания, но её величина всегда положительна. Впервые интенсивность энергетического обмена развивающихся зародышей измерена в одном приборе обоими методами, что сводит к минимуму методические ошибки. Впервые показана корреляция величины расхождения данных непрямой и прямой калориметрии с удельной скоростью роста животных. На основании установленной закономерности и аппарата термодинамики необратимых процессов высказана гипотеза о возникновении неравновесного распределения веществ в новообразованных клетках как причине этого неравенства.

Предложено уравнение, описываицее интенсивность энергетического обмена растущего организма:

где <} - интенсивность энергетического обмена; ш - масса; t -время; к , к2, к3 - коэффициенты, из которых: к1 зависит от таксономической принадлежности животного, к» -0.27, к„~ 1540

г з

Кдж-г . Уравнение устанавливает соответствие между межвидовой и онтогенетической зависимостью интенсивности энергетического обмена от массы животных.

Практическое значение работы заключается в использовании установленной закономерности для прижизненного определения скорости роста животных, взвешивание которых не может дать адекватной информации: раковинных моллюсков, некоторых видов ракообразных и рептилий (черепах). Метод может быть использован для определения оптимальных условие развития гетеротрофных организмов, и в экологической экспертизе.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на коллоквиумах лаборатории биофизики и научных конференциях МБР им. Н. К. Кольцова РАН (1985-1995), на научной конференции молодых учёных по физике, Тбилиси, 1983; Всесоюзной

конференции "Термодинамика необратимых процессов и её применения", Черновцы, 1984; Всероссийской конференции "Регуляция энергетического обмена и энергетическая основа жизни", Санкт-Петербург, 1ЭЭЗ. Методика эксперимента и ее применение в экологической экспертизе доложена на международных конференциях "Биотест" в Тварминне (Финляндия, 1991) и Москве (1993).

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, 1 находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на /УУ- страницах, содержит 17 рисунков и 19 таблиц, 1 приложение. Описок литературы включает 145 источников.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования выбраны из представителей разных классов и даже типов для того, чтобы проследить самые общие закономерности изменения данных непрямой и прямой калориметрии в раннем онтогенезе животных.

Растущие сверчки, благодаря циклическому характеру их роста, предоставляют возможность отделить влияние прироста массы на интенсивность энергетического обмена от изменений, связанных с возрастом животного. Развивающиеся зародыши кур - хорошо изученный объект биологии развития, что позволяет сопоставить полученные данные с известными результатами морфологических и физиологических исследований. Преимущества зародышей ящериц состоит в том, что они представляют природную популяцию, генофонд которой не нарушен искусственным отбором. Кроме того, исследований энергетического обмена зародышей рептилий при помощи прямой калориметрии до сих пор не проводилось.

Домашний сверчок (Acheta domestica L). Исследовали личинки, вылупившиеся из яиц, которые были получены от животных из инсектария ИБР РАН. Яйца инкубировали при температуре 28*С, при той же температуре содержали личинок и проводили измерения. Группы животных для измерения параметров энергетического обмена

формировали из особей, принадлежащих к одной кладке.

Прыткая ящерица (lacerta agllls i.). Яйца прыткой ящерицы были получены в лаборатории от беременных самок, отловленных в Воронежской области в конце периода спаривания. Всего было получено 126 яиц ( 12 кладок по 6-12 яиц в каждой ). Инкубацию яиц проводили при оптимальной температуре развития этого вида 25'С (Захаров и др., 1982).

Домашняя курица (Gallus dornest leus L.). В экспериментах были использованы развивающиеся яйца двух гибридов кур "Брой-лер-6" и "Старт-13". Эти гибриды отличаются друг от друга скоростью роста цыплят и весом взрослых особей. Веса 1.8 кг цыплята гибрида "Бройлер 6" достигают через 2 месяца после вылупле-ния, а цыплята гибрида "Старт 13" - через 12 месяцев.

Интенсивность энергетического обмена растущих сверчков, развивающихся зародышей и взрослых ящериц измеряли при помощи респирометра Варбурга (непрямая калориметрия) по стандартной методике (Умбрейт, 1951) и изотермического микрокалориметра МИД-200 (прямая калориметрия) серийного производства с объёмом камер 100 мл и разрешающей способностью 2 мквт. Сосуды аппарата Варбурга и калориметрические камеры после помещения в них объекта перед началом измерений вентилировали воздухом 100% влажности для исключения испарения воды во время эксперимента.

Теплопродукция и потребление кислорода у одного и того же объекта измерялись последовательно с минимальной разницей во времени при одинаковой температуре.

Измерения интенсивности энергетического обмена развивающихся зародышей кур проводили при помощи специально разработанного и изготовленного для проведения данных исследований респи-рационного калориметра, который объединяет функции респирометра и калориметра в одном приборе и позволяет одновременно регистрировать теплопродукцию и потребление кислорода. Прибор построен по дифференциальной схеме, состоит из двух идентичных камер, из которых одна служит контрольной. Калибровку прибора производили эффектом Джоуля. Разрешающая способность прибора по теплу 20 мквт, по кислороду 60 мкл.

Для вычисления интенсивности энергетического обмена по результатам респирометрических измерений использовался оксика-лорический коэффициент 5.59 дж-мл_102 (4.81 кал-мл~102, или 460

- кдж-моль_102). Это значение коэффициента соответсвует такому типу обмена, когда основным источником энергии являются углевода и частично жиры, а вклад белков мал. Дыхательный коэффициент • (RQ) в этом случае должен находиться в пределах от 0.8 до 1. Ранее было показано, что дыхательный коэффициент на всем протяжении эмбрионального развития кур не выходит за пределы 0.75 -0.82 (Romanoii, 1967). Аналогичная величина RQ наблюдалась во время развития яиц рептилий (Clark, 1952) и роста насекомых (Тыщенко, 1986).

Для аппроксимации зависимости интенсивности энергетического обмена от массы животных в сравнительной биоэнергетике используется аллометрическая (показательная) функция вида q=a-Mb. Здесь q - интенсивность энергетического обмена, определенная , любым методом, Ы - масса тела, а и b - коэффициенты. Многие исследователи показали на обширном экспериментальном материале, что коэффициент Ъ в этом уравнении примерно равен -0.25 для удельных величин и 0.75 для абсолютных (Brody, 1945; Винберг, 1976; Дольник, 1978; Вызова, 1972; Gould, 1966; Владимирова, Зотин 1985). Поэтому данные как прямой, так и непрямой калориметрии были аппроксимировны также уравнением q=a-M .

Вычисления скорости роста приводились при помощи аналитического дифференцирования сглаживающего кубического сплайна (Завьялов и др., 1980; Де Бор, 1985), аппроксимирующего зависимость массы объекта исследования от его возраста. Для построения сглаживающего сплайна была написана программа для персонального компьютера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Зависимость интенсивности энергетического обмена от массы животных.

Результаты, полученные в настоящей работе показали, что у всех исследованных объектов наблюдалось снижение интенсивности энергетического обмена в процессе развития как по данным непрямой, так и прямой калориметрии (рис. 1). Разность между результатами непрямой и прямой калориметрии была достоверна при р< 0.05 и тоже снижалась в процессе роста объектов исследова-

Рис. 1. Интенсивность энергетического обмена во время роста личинок сверчка (А), эмбрионального и постнатального роста прыткой ящерицы (Б), и эмбрионального роста кур гибридов Бройлер 6 (В) и Старт 13 (Г) по результатам непрямой (1) и прямой (2) калориметрии.

ния. Вычисление коэффициентов степенной регрессии интенсивности энергетического обмена по массе животных в период эмбрионального и постнатального роста показало их несоответствие хорошо известной зависимости интенсивности энергетического обмена от массы животных, рассчитанной по результатам измерений взрослых представителей разных таксонов, которая выражается алломет-рическим уравнением с показателем степени при массе равным -0.27 - -0.24. Только у растущих зародышей кур гибрида "Бройлер-6" наклон обеих линий регрессии оказался близким к указанному (табл. 1). У остальных объектов исследования для данных как непрямой, так и прямой калориметрии (или хотя бы одного из них) он отличался от известной закономерности.

Таблица 1. Коэффициенты а и Ъ аллометрического уравнения зависимости интенсивности энергетического обмена от массы тела.

Непрямая калориметрия Прямая калориметрия

Объект а (мвт-г-1) Ь а (мвт-г 1) Ь

сверчок: рост лич. рост прытко! эмбрион, постнат. эмбриогенез Бройлер 6 Старт 13 2.98 ± 0.30 I ящерицы: 1.88 ± 0.06 0.47 ± 0.03 кур: 16.51 ± 1.61 16.44 ± 1.15 -0.17 ± 0.03 -0.76 ± 0.04 -0.13 ± 0.07 -0.27 ± 0.05 -0.24 ± 0.03 3.15 ± 0.53 0.94 ± 0.03 0.43 ± 0.02 13.81 ± 1.25 12.25 ± 0.73 -0.05 ± 0.05 -0.83 ± 0.06 -0.13 ± 0.06 -0.26 ± 0.04 -0.17 ± 0.03

Несоответствие уравнений регрессии для внутривидовой (онтогенетической) зависимости энергетического обмена от массы животных и межвидовой (филогенетической) известно давно и показано на большом статистическом материале (НештЗлвзеп, 1960; АИтап, БШтег, 1968; *М.езег, 1984), хотя и не имеет удовлетворительного объяснения (Шмидт-Нильсен, 1987).

Однако возможность описания зависимости интенсивности энергетичекого обмена от массы животного одним аллометрическим уравнением на протяжении всего онтогенеза вызывает сомнения, поскольку для точной аппроксимации данных необходимо несколько

раз изменить его коэффициенты, что отражается в изменении наклона линии регрессии на графике, построенном в логарифмических координатах. Результаты проведённых экспериментов показывают, что в онтогенезе ящериц наклон линии регрессии изменяется при переходе от эмбрионального к постнатальному развитию, а в эмбриогенезе кур изменение наклона линии регрессии происходит дважды (рис. 1). Изменения коэффициентов аллометрического урав-нзния указывают на то, что наряду с онтогенетическим снижением интенсивности энергетического обмена изменяется скорость этого снижения, то есть меняется характер зависимости энергетического обмена от массы растущего животного.

2. Влияние скорости роста на интенсивность энергетического обмена.

Периодичность изменения массы растущих личинок сверчков, обусловленная линьками, способствует более чёткому выделению пиков интенсивности энергетического обмена, связанных с изменением скорости роста. Максимальная скорость прироста массы наблюдается вскоре после очередной линьки. Затем она постепенно снижается и непосредственно перед следующей линькой достигает минимума. Изменения интенсивности энергетического обмена, совпадающие по времени с изменениями удельной скорости роста, были зарегистрированы обоими методами калориметрии во второй серии экспериментов на растущих сверчках (рис. 2).

Локальные максимумы интенсивности энергетического обмена оба метода отмечают в первой половине или первой трети каждого личиночного возраста. В это же время скорость роста сверчков была максимальной.

Принципиальное отличие характера роста зародышей кур и личинок сверчков состоит в том, что скорость роста первых снижается в процессе эмбриогенеза, тогда как скорость роста вторых имеет локальные минимумы и максимумы. Сравнение эмбрионального роста кур и личиночного роста сверчков показывает, что интенсивность энергетического обмена снижается более или менее плавно, если удельная сокрость роста не испытывает заметных колебаний, в противном случае она оказывается подвержена периодическим колебаниям синхронно с изменением последней.

масса, г. 0.04

-0.03

q>

0.02

0.01

10 20 30 40 50 60 возраст, сутки.

Рис. 2. Изменение интенсивности энергетического обмена по результатам непрямой (1) и прямой (2) калориметрии и массы (3) растущих личинок сверчка. II серия.

МВт/ г 2.4

q.

2.1 1.8 1.5 1.2 0.9

800

0 200 400 600

возраст, сутки.

Рис. 3. Аппроксимация зависимости интенсивности энергетического обмена (непрямая калориметрия) от возраста растущих меченосцев. По: Грудницкий, 19726. -Ю-

Таким образом, нэ только масса, но и скорость ей прироста влияет на интенсивность энергетического обмена. Этот вывод подтверждают коэффициенты парной корреляции интенсивности энергетического обмена, определённой непрямым способом, с возрастом, массой и удельной скоростью роста (табл. 2).

Таблица 2. Коэффициенты парной корреляции интенсивности энергетического обмена по данным непрямой калориметрии с возрастом (I), массой (II) и удельной скоростью роста (III).

Объект Возраст Масса Уд. скор.

роста

(I) (II) (III)

Личинки сверчков -0.46 -0.48 0.70

р< 0.1 р< 0.1 р< 0.01

Зародыши ящериц -0.76 -0.68 0.66

р< 0.05 р< 0.1 р< 0.1

Зародыши кур:

гибрид "Бройлер 6" -0.67 -0.51 0.94

р< 0.05 р< 0.1 р< 0.001

гибрид "Старт 13" -0.84 -0.67 0.95

р< 0.01 р< 0.05 р< 0.001

У растущих сверчков интенсивность энергетического обмена не коррелирует ни с возрастом, ни с массой, а лишь с удельной скоростью роста. Это происходит от того, что за время наблюдения во второй серии экспериментов масса сверчков изменилась незначительно: от 2 до 37 миллиграмм. Поэтому её влияние, как и влияние возраста, не проявилось на фоне мощного периодического положительного и отрицательного изменения удельной скорости роста в каждом личиночном возрасте.

У растущих зародышей кур интенсивность энергетического обмена хорошо коррелирует с возрастом и удельной скоростью роста, но не с массой. Это объясняется тем, что у кур при более высоком по сравнению с другими изученными объектами уровне стандартного обмена, его интенсивность снижается в онтогенезе быстрее, что и отражается в коэффициентах корреляции. Скорость роста зародышей кур также высока и заметно изменяется в эмбрио-

генезе, хотя и не так резко, как у растущих сверчков.

Ящерицы по всем рассмотренным параметрам занимают промежуточное положение. Скорость роста зародышей не претерпевает резких изменений, эмбриогенез занимает полтора месяца, поэтому зависимость энергетического обмена от возраста проявляется так же хорошо, как и от массы, которая увеличивается не слишком быстро. Такое соотношение указанных параметров эмбриогенеза не позволяет выделить среди них один, влияние которого на интенсивность энергетического обмена превалирует.

Таким образом, интенсивность прироста массы влияет на интенсивность энергетического обмена наряду с такими известными факторами как масса и возраст. Однако, обнаружить это влияние можно лишь при определённом сочетании всех трёх факторов. Следует также отметить высокий уровень корреляции интенсивности энергетического обмена изученных животных с удельной скоростью роста вместе с его высокой достоверностью. Как и то, что эта корреляция всегда была положительна.

3. Соотношение данных непрямой и прямой калориметрии растущего организма.

Результаты непрямой калориметрии были выше прямой у всех трёх объектов исследования. Несмотря на то, что рост сверчков сопровождался периодическими изменениями уровня энергетического обмена, такое соотношение показаний двух методов сохранялось на всём протяжении периода роста так же, как и в эмбриогенезе ящериц и кур, где подобных колебаний не было.

Интенсивности энергетического обмена, определённые непрямым и прямым способами, связаны между собой линейной зависимостью вида:

%к= сГ%к + V где с^- интенсивность энергетического обмена, определённая

прямым калориметрическим способом; та же величина, рассчитанная по скорости потребления кислорода; с0 и с1 - коэффициенты, величины которых приведены в таблице 3.

Таблица 3. Коэффициенты линейного уравнения зависимости расхода энергии (прямая калориметрия) от ее поступления в организм (непрямая калориметрия).

Объект С1 с0, мвт-г 1 Л2

личинки сверчков 0.83 ± 0.04 -0.02 ± 0.03 96%

р< 0.01 р< 0.5

зародыши ящериц 0.65 ± 0.007 0.41 ± 0.50 99%

р< 0.01 р< 0.5

зародыши кур:

гибрид "Бройлер 6" 0.76 ± 0.009 0.98 ± 0.20 99%

р< 0.01 р< 0.05

гибрид "Старт 13" 0.50 ± 0.02 3.75 ± 0.45 98%

р< 0.01 р< 0.05

Коэффициент с0 не отличается от нуля ни у личинок сверчка, ни у зародышей ящериц, однако у зародышей кур он достоверно отличен от нуля у обоих гибридов. Коэффициенты с1 у всех объектов исследования оказались близкими по величине. Это означает, что пропорция между непрямой и прямой калориметрией примерно одинаковая, но у высокопродуктивных гибридов кур общий уровень энергетического обмена заметно выше. Является ли это следствием гетерозиса, систематического положения или каких-то иных причин, покажут будущие исследования.

4. Расхождение данных непрямой и прямой калориметрии и скорость роста животных

Анализ результатов экспериментов, проведенных в настоящей работе, позволил установить корреляцию разности между удельными величинами энергетического обмена (с[) , определенными непрямым

и прямым способом, с удельной скоростью роста £ ~ - -д^-] У всех

объектов исследования и вычислить коэффициенты линейной регрессии

значения которых проведены в таблице 4.

Таблица 4. Коэффициенты линейного уравнения зависимость разности между интенсивностью энергетического обмена, определенной непрямым и прямым способом, от удельной скорости роста.

Объект d1, Кдж-г 1 dQ, мвт-г 1 R2

Личинки сверчков 813 ± 164 0.10 ± 0.19 84%

р< 0.1 р< 0.5

Зародыши ящериц 966 ± 492 0.66 ± 1.02 66%

р< 0.1 р< 0.5

Зародыши кур:

гибрид "Бройлер 6" 832 ± 112 -1.42 ± 0.74 93%

р< 0.05 р< 0.05

гибрид "Старт 13" 674 ± 104 -0.65 ± 0.62 93%

р< 0.05 р< 0.1

Дисперсионный анализ показал отсутствие достоверных различий в коэффициентах di уравнений регрессии для всех объектов, как и достоверных отличий коэффициентов dQ от нуля. Поэтому данную зависимость можно считать пропорциональной, с коэффициентом 773 ± 207 Кдж-г-1. Было также определено, что пропорциональная зависимость апцроксимирует результаты экспериментов так же хорошо, как и линейная, и что нет оснований для предпочтения линейной зависимости. Таким образом, можно считать, что разность показаний непрямого и прямого методов калориметрии прямо пропорциональна удельной скорости прироста массы с коэффициентом 770 килоджоулей на грамм.

На связь данного параметра энергетического обмена со скоростью роста указывали проведенные ранее исследования других авторов (Студенский, 1897; Schaarschmidt et all, 1975), однако тип зависимости и коэффициенты регрессии не были определены. При изучении роста культуры дрожжей была установлена корреляция разности интенсивностей энергетического обмена, определённых непрямым и прямым способом, с удельной скоростью прироста количества клеток в культуре (Schaarschmidt et all, 1975).

5. Вероятная причина расхождения данных непрямой и прямой калориметрии.

Наиболее вероятной причиной расхождения результатов непрямой и прямой калориметрии выглядит рост и дифференцировка, поскольку этот феномен наблюдался у ооцитов (Зотин, 1975), зародышей (ВагаИ;, 1936; Грудницкий, 1983) и растущих животных (Грудницкий, 1972; Грудницкий, Никольская, 1977), но отсутствовал у взрослых, закончивших рост. Однако, если способность к росту сохраняется всю жизнь животного, как это наблюдается, например, у рыб и рептилий, то веб это время сохраняется и расхождение результатов непрямой и прямой калориметрии (Зотин, Грудницкий, 1970; Грудницкий, 1975).

В настоящей работе установлена положительная корреляция между разностью интнесивностей энергетического обмена, полученных непрямым и прямым способом, и удельной скоростью роста, и вычислены коэффициенты пропорциональности между ними, что доказывает зависимость этого явления от скорости роста организма.

Механизм возникновения изучаемого феномена, вероятно, состоит в том, что в период интенсивного роста в организме образуются новые границы раздела, на которых должны быть созданы градиенты определбнних веществ. В это время работа по перераспределению концентрации молекул относительно границ раздела должна быть больше потерь потенциальной энергии за счёт диффузии на величину, пропорциональную увеличению площади границ раздела. Таким образом, в растущем организме есть конкретный процесс, в результате которого часть свободной энергии АТФ переходит в потенциальную форму, накапливаясь в виде химического и электрического потенциала на внутренних и внешних границах раздела образующихся клеток. Вследствие этого часть энергии, полученной организмом при окислительном фосфорилировании, не превращается в тепло, а связывается внутри него в потенциальной форме.

Следствием такого механизма возникновения изучаемого феномена является неизбежное несоответствие филогенетической и онтогенетической зависимостей интенсивности энергетического обмена от веса животных, поскольку для описания последней должна применяться формула, учитывающая скорость прироста массы:

ч = + VII--8-]

где 4 - интенсивность энергетического обмена; т - масса; г -время; к1, к2, к3 - коэффициенты, из которых: к, зависит от таксономической принадлежности животного, -0.27. Величина коэффициента к3= 1540 Кдж-г-1 вычисляется из установленной пропорции между расхождением данных непрямой и прямой калориметрии и скоростью роста 770 Кдж-г"1 и среднего коэффициента полезного действия биохимических процессов 50% (Иванов, 1990).

Проверка предложенной формулы на данных В. А. Грудницкого по энергетическому обмену растущих меченосцев МрюрЬогиэ Ье11ег1 (Грудницкий, 19726) показала соответствие теоретической кривой и результатов эксперимента (рис. 3).

Таким образом, проведённые исследования интенсивности энергетического обмена в раннем онтогенезе животных методами непрямой и прямой калориметрии позволили установить связь расхождения данных, полученных этими методами со скоростью роста организма. Определён коэффициент пропорциональности между разностью результатов непрямой и прямой калориметрии и удельной скоростью роста. Предложенный механизм возникновения данного феномена позволяет объединить известные эмпирические филогенетическую и онтогенетическую зависимости интенсивности энергетического обмена от веса животных.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и изготовлен специальный респирационный калориметр для одновременного измерения теплопродукции прямым и непрямым методами.

2. Создана программа численного дифференцирования на основе аппроксимации экспериментальных данных сглаживающим кубическим сплайном. Программа применялась для вычисления удельной скорости роста объектов исследования и проверки гипотезы о природе расхождения результатов непрямой и прямой калориметрии.

3. Определена интенсивность энергетического обмена одновременно прямым и непрямым калориметрическими методами в период эмбрионального развития гибридов кур "Бройлер 6" и "Старт 13",

эмбрионального и постнатального развития прыткой ящерицы и личиночного роста сверчков.

4. В раннем онтогенезе животных зависимость интенсивности энергетического обмена от массы тела не может быть описана одним аллометрическим уравнением с принятым ранее показателем степени при массе -0.27 - -0.24. Для адекватной аппроксимации этой зависимости в онтогенезе прыткой ящерицы необходимо изменить оба коэффициента аллометрического уравнения при переходе от эмбриогенеза к постнотальному онтогенезу, а в эмбриогенезе кур необходимо использовать три различные пары коэффициентов.

5. Установленное изменение коэффициентов аллометрического уравнения онтогенетической зависимости интенсивности энергетического обмена от массы организма, указывает на существование дополнительного фактора (кроме массы), определяющего эту зависимость. В качестве такого фактора предложено рассматривать скорость роста на основании корреляции интенсивности энергетического обмена со скоростью роста животных (0.66 < г < 0.95).

6. У всех исследованных объектов независимо от характера роста и таксономической принадлежности в раннем онтогенезе интенсивность энергетического обмена, измеренная методом непрямой калориметрии, устойчиво превышает данные прямой калориметрии. Разность интенсивностей энергетического обмена, определённых непрямой и прямой калориметрией, достоверно коррелирует с удельной скоростью роста животных.

7. Коэффициент пропорциональности между разностью показаний непрямой и прямой калориметрии и скоростью роста организма приблизительно равен 770 Кдж-г-1. Достоверных различий в величине этого коэффициента у разных объектов исследования не обнаружено.

8. Зависимость интенсивности энергетического обмена, определенной непрямым методом, от массы растущего животного описывается уравнением

где <з - интенсивность энергетического обмена; т - масса; t -время; к - коэффициент, зависящий от таксономической принадлежности животного, к« -0.27; к3 ~ 1540 Кда-г-1.

9. Предложен механизм возникновения расхождения результатов непрямой и прямой калориметрии, состоящий в формировании градиентов концентраций молекул и ионов на вновь возникающих поверхностях раздела в период интенсивного деления клеток растущих животных.

1. С. Ю. Клейменов, В. А. Грудницкий, Н. Т. Изкенов. Рес-пирационный калориметр для птичьих яиц. Онтогенез, 1984, т. 15, » 1, 104-107.

2. С. Ю. Клеймбнов, Н. Т. Изкенов, А. И. Зотин. Изменение диссипативных функций в эмбриогенезе кур. Материалы 2 всесоюзной конференции "Термодинамика необратимых процессов и её применения" (18-20 сент. 1984 г. Черновцы), 139-140.

3. Н. Т. Изкенов, С. Ю. Клеймбнов. И. В. Журавлев, А. И. Зотин. Дыхание и теплопродукция в эмбриогенезе кур. Онтогенез, 1985, т. 16, J6 5, 518-520.

4. С. Ю. Клеймёнов. Потребление кислорода и теплопродукция во время роста ящериц Lacerta agilis L. Онтогенез, 1991, т. 22, * 3, 269-273.

5. С. Ю. Клеймёнов. Энергетический обмен растущих личинок сверчка Acheta domestica L. по данным непрямой и прямой калориметрии. Докл. Акад. Наук, (в печати).

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Клейменов, Сергей Юрьевич, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К.КОЛЬЦОВА

на правах рукописи УДК 591.1:577.23

КЛЕЙМЁНОВ Сергей Юрьевич

ИНТЕНСИВНОСТЬ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ ЖИВОТНЫХ ПО ДАННЫМ ПРЯМОЙ И НЕПРЯМОЙ КАЛОРИМЕТРИИ

(03.00.13 - физиология животных)

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научный руководитель . доктор биологических наук, профессор А.И. Зотин.

Москва, 1996.

- г -

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................8

2.1. Методы непрямой и прямой калориметрии..............8

2.2. Применение методов калориметрии в исследованиях энергетического обмена животных........10

2.3. Кратковременное (физиологическое) расхождение результатов непрямой и прямой калориметрии.......................14

2.4. Долговременное (онтогенетическое) расхождение результатов непрямой и прямой калориметрии.......................20

2.5. Анализ фактов расхождения результатов непрямой и прямой калориметрии............27

2.6. Термодинамический подход к проблеме расхождения данных непрямой и прямой калориметрии. ... 32

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............38

3.1. Объекты исследования................38

3.2. Методы исследования................42

3.2.1. Респирометрия................42

3.2.2. Калориметрия....................45

3.2.3. Респирационная (комплексная) калориметрия. ..................49

3.3. Вычисления и обработка результатов.........53

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................56

4.1. Рост личинок сверчка. ...............56

4.2. Рост прыткой ящерицы................69

4.3. Рост зародышей домашней курицы...........77

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.................92

5.1. Зависимость интенсивности энергетического

обмена от массы..................92

5.2. Влияние скорости роста на интенсивность энергетического обмена...................97

5.3. Соотношение данных непрямой и прямой калориметрии растущего организма.............100

5.4. Вероятный механизм возникновения разности между результатами непрямой и прямой калориметрии................... .... 103

5.5. Проверка гипотезы.................107

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................ИЗ

7. ВЫВОДЫ.........................115

8. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................117

ПРИЛОЖЕНИЕ.........................132

1. ВВЕДЕНИЕ.

Вопрос о соотношении результатов непрямой и прямой калориметрии является традиционным для русской физиологической школы. В конце прошлого века в Петербурге И. А. Пашутин со своими учениками П. П. Авроровым, А. А. Лихачёвым и А. А. Студенским изучал энергетический обмен человека и лабораторных животных (собак). Исследования проводились с целью подтверждения на более совершенном оборудовании, каким по сравнению с ледяным калориметром Лавуазье был в то время водяной калориметр, применимость закона сохранения энергии к живым существам. Одновременно с теплопродукцией они измеряли скорость потребления кислорода и выделения углекислого газа и воды для определения интенсивности "сгорания" пиши в организме. Исследования сотрудников И. А. Пашутина, как и работы зарубежных учёных, проведённые примерно в то же время, успешно подтвердили справедливость закона сохранения энергии для живых существ (ИиЬпег, 1883; Авроров, 1899; Лихачёв, Авроров, 1902; Atwateг 1904).

А. А. Студенский, исследуя энергетический обмен беременных собак, обнаружил увеличение разности между количеством энергии, получаемом при окислении пищи, и теплопродукцией в процессе беременности (Студенский, 1897). Возникший парадокс, который состоял в том, что вместе с успешным доказательством справедливости закона сохранения энергии в биологических системах был получен неоспоримый факт протоворечащий ему, не заставил А. А. Студенского усомниться в справедливости термодинамических законов или собственной квалификации экспериментатора. Напротив, обнаруженный феномен он трактовал как основу для дальнейших

исследований: "...неожиданное несоответствие между прямой и непрямой теплотой может указать исследователю на процессы синтеза сил там, где нельзя ожидать этого с первого взгляда." (Студенский, 1897). Факт устойчивого расхождения расчётной и измеряемой величины теплопродукции не мог быть объяснён с позиций классической термодинамики, рассматривающей равновесные состояния и равновесные процессы. Вскоре исследования этого феномена из-за отсутствия теоретической базы были надолго оставлены.

Созданная в 40х-50х годах нынешнего века термодинамика необратимых процессов (Prigoglne, 1947; Prigoglne, 1967) распространила методологию термодинамики на открытые неравновесные системы, к которым относятся все живые существа. В то же время происходило накопление фактического материала о соотношении количества энергии, полученного организмом в результате окисления пищи, с его теплопродукцией. Однако основное внимание учёных было направлено не на онтогенетические, а на физиологические процессы, существенный вклад в изучение которых также внесли русские физиологи (Hardy and. Du Bois, 1937; Hardy et ail, 1944; Весёлкин, 1963; Граменицкая 1965; Чередниченко, 1965; Весёлкин и др., 1967; Webb, 1971; Webb et all, 1980 ).

Накопленный фактический материал и методический опыт позволили вернуться к изучению онтогенетических процессов и применить к их анализу аппарат неравновесной термодинамики. Это было сделано в лаборатории биофизики Института биологии развития им. Н. К. Кольцова под руководством А. И. Зотина (Зотин, Зотина, 1969; Зотин, Грудницкий, 1970; Zotln, 1972; Грудницкий, 1975; Грудницкий, Никольская, 1977). А. И. Зотин рассматривает инди-

видуальное развитие организма как единый процесс приближения открытой неравновесной системы к конечному стационарному состоянию (Зотин, Зотина, 1993). В такой трактовке разность между количеством энергии, получаемой при окислении пищи, и теплоро-дукцией является одним из параметров, характеризующих степень уклонения системы (организма) от конечного стационарного состояния, и может быть использована в практических целях (Зотин, 1979; гог1п, ЬашргесМ, 1982).

Дальнейшее развитие этого направления исследований заключается в изучении возможных механизмов возникновения данного феномена и его связи с основными морфогенетическими и физиологическими процессами, происходящими в онтогенезе. На ранних этапах онтогенеза, по теории А. И. Зотина, организм наиболее удалён от конечного стационарного состояния, поэтому расхождения расчётной и измеряемой величины теплопродукции должны наиболее отчётливо проявляться именно в это время, что было экспериментально подтверждено В. А. Грудницким (Грудницкий, 1975; Грудницкий, Никольская, 1977).

Целью настоящей работы было расширенное изучение феномена расхождения данных непрямой и прямой калориметрии в раннем онтогенезе животных. Для обнаружения наиболее универсальных закономерностей, связанных с ростом и развитием организма объектами исследования были выбраны представители разных классов и типов (насекомые, пресмыкающиеся и птицы), различные по характеру роста и уровню стандартного обмена.

В задачи исследования входило:

1. Разработка и изготовление специального респирационного калориметра для одновременного измерения теплопродукции прямым и непрямым методами.

2. Создание программного обеспечения для обработки экспериментальных данных.

3. Определение интенсивности потребления кислорода и интенсивности теплопродукции в период эмбрионального развития кур, эмбрионального и постнатального развития ящериц и личиночного роста сверчков.

4. Изучение соотношение полученных данных непрямой и прямой калриметрии.

5. Выявление коррелятивных связей расхождения данных непрямой и прямой калориметрии с морфологическими и физиологическими изменениями организмов в процессе их развития.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Методы непрямой и прямой калориметрии.

На первый взгляд, непрямая и прямая калориметрия - это два способа определения одной физиологической характеристики организма: интенсивности энергетического обмена. Однако, в связи с поставленной задачей сравнения данных об интенсивности энергетического обмена, полученных одним и другим методом в раннем онтогенезе животных, необходимо определить, какие физиологические процессы в организме служат источником первичной информации каждому из методов.

Непрямая калориметрия основана на том, что при окислении дыхательного субстрата с участием одного моля кислорода высвобождается известное количество энергии. Окисление углеводов, жиров и белков до углекислого газа, воды и мочевины даёт соответственно 477, 442 и 435 Кдж энергии на один моль поглощённого кислорода (Gneiger, 1983а; Gneiger, Kemp, 1990). Уточнить окси-калорический коэффициент можно измерив пропорцию между количеством поглощённого кислорода и выделенного за то же время углекислого газа - дыхательный коэффициент (RQ). Его величина указывает пропорцию жиров и углеводов в субстрате дыхания. Доля белков может быть определена по измерению суммарного азота мочи (Шмидт, Тевс, 1985). В экспериментах с животными, как правило, ограничиваются измерением дыхательного коэффициента и, если он не выходит за пределы 0.7-1.0, принимают оксикадорический коэффициент равным 455-460 Кдж■моль~102.

Поскольку кислород выполняет роль конечного акцептора

электронов в дыхательной цепи, его потребление клеткой пропорционально интенсивности окислительного фосфорилирования АДФ. То есть источником первичной информации для непрямой калориметрии служит синтез АТФ сопряжённый с переносом электрона в цепи цитохромов.

До изобретения Кларком закрытых мембраной электродов, позволивших измерять напряжение кислорода, а затем и углекислого газа, практически в любой жидкости, основным методом непрямой калориметрии был манометорический метод Варбурга (Умбрейт и др., 1951). В настоящее время большинство исследований выполняется с применением серийных оксиметров использующих электроды Кларка.

Прямая калориметрия измеряет поток тепла, которое организм отдает в окружающую среду. Часть энергии, полученной при окислении шпци, переходит в тепло ещё в процессе окислительного фосфорилирования. К. П. Иванов приводит величину КПД синтеза АТФ при окислении глюкозы 40%. То есть до 60% энергии выделяется в виде тепла (Иванов, 1993). Коэффициент полезного действия остальных биохимических процессов изучен намного слабее, но физиологические исследования позволяют утверждать, что он не превышает 50% (Hill and Wyse, 1989).

Любая работа полностью обращается в тепло, если в результате её совершения внутренняя энергия системы не увеличивается. Поэтому, если в условиях эксперимента не изменяется температура тела, давление, мембранный и химический потенциалы и не производится работа, в результате которой увеличивалась бы потенциальная энергия внешней среды, вся затраченная энергия согласно первому закону термодинамики должна в итоге обратиться в тепло

и может быть измерена в калориметре. Итак, для прямой калориметрии первичным источником информации служит скорость деградации энергии при совершении работы в организме.

На рубеже прошлого и нынешнего веков работами М. Рубнера, У. Этуотера и школы И. А. Пашутина было доказано совпадение данных непрямой и прямой калориметрии у животных в покое в состоянии физиологической нормы (Rubner, 1883; Atwater 1904; Авроров, 1899; Лихачёв, 1894). Это было убедительным доказательством выполнения в биологических системах закона сохранения энергии. Тем не менее, измерению одним и другим методом подлежат разные параметры энергетического обмена, поскольку источники первичной информации у непрямой и прямой калориметрии разные. По аналогии с пластическим обменом, можно сказать, что непрямая калориметрия измеряет скорость поступления энергии в организм, тогда как прямая - скорость ее выведения (в виде тепла) из организма. Любые изменения одной из этих сторон энергетического обмена, не синхронизированные с другой, могут привести к нарушению равенства результатов непрямой и прямой калориметрии.

2.2. Применение методов калориметрии в исследованиях энергетического обмена животных.

Основная масса данных об энергетичеком обмене накоплена и систематизирована сравнительной биоэнергетикой, изучающей интенсивность энергетического обмена или энергетическую стоимость физиологических процессов у представителей различных таксонов (Fry, 1957; Hemmingsen, 1960; Bartholomew, Tucker, 1964;

Hutchison et all, 1968; Зотин, Владимирова, 1986а; Зотин, Владимирова, 19866) или экологических груш (Andersen, 1969; Yousef, Johnson, 1975). Однако, межвидовой анализ особенностей энергетического обмена не требует детального изучения механизмов и путей превращения энергии внутри организма. Поэтому проведенные в этих работах измерения ограничены определением интенсивности потребления энергии и основаны на использовании только непрямой калориметрии как наиболее производительного и дешевого метода.

Физиологические эксперименты, в которых была измерена интенсивность энергетического обмена у интактного животного, связаны, в основном, с исследованием острой реакции организма на разного рода физические (Krogh, 1941; Chevillard, 1966; Мир-рахимов, 1967; Bartolomew, 1977; Владимирова, Зотин, 1989), химические (Brocker, Hell, 1954; Wessley, 1956), или фармакологические (Hardy et all, 1944; Агаев, Чеснокова, 1958; Abracham et all, 1958; Беркович, 1964; Дардымов, 1976) воздействия. При изучении и моделировании таких процессов основное внимание уделяется относительным изменениям и динамическим характеристикам энергетического обмена, для определения которых достаточно применения только одного метода. В подавляющем большинстве случаев здесь используется непрямая калориметрия.

На фоне большого числа публикаций, относящихся к области биоэнергетики, количество исследований, в которых одновременно использовались оба метода калориметрии, выглядит ничтожно малым. Однако, несмотря на то, что эти работы выполнены на разных объектах и с разной целью, накопление данные все же позволяют провести их анализ для выяснения общих закономерностей.

Прежде чем приступить к обсуждению научных публикаций, в которых производится сравнение данных непрямой и прямой калориметрии, необходимо уделить некоторое внимание способу представления этих данных.

В литературе встречаются два способа сравнения результатов непрямой и прямой калориметрии. Первый способ состоит в том, что на основании фиксированной величины оксикалорического коэффициента 460 Кдж-моль~102 (4.82 Ккал-литр~102) и с учетом поправок на тип обмена, производят расчет потребления энергии по результатам измерения потребления кислорода. Известны аналогичные коэффициенты и для соответствующих расчетов по результатам измерения скорости выделения углекислого газа. Полученная величина имеет размерность мощности (ватты). Ту же размерность имеют результаты измерения теплопродукции прямым методом в калориметре. Полученные величины легко сравнивать между собой. Однако, для сравнения параметров энергетического обмена у животных, существенно различающихся по массе, необходимо пользоваться удельными величинами, которые устраняют ошибки восприятия, связанные с изменением размера. С этой целью результаты измерения делят на массу животного, получая интенсивность энергетического обмена в размерности ватт на килограмм или милливатт на грамм.

Другой способ оценки соотношения данных непрямой и прямой калориметрии заключается в вычислении оксикалорического коэффициента по результатам измерений теплопродукции и скорости потребления кислорода. В этом случае не возникает необходимости в удельных величинах потребления и расхода энергии при сравнении животных разных размеров. Данные калориметрии делят непо-

средственно на скорость потребления кислорода, измеренную в респирометре. Таким способом получают оксикалорический коэффициент с размерностью джоуль-моль-10£, величину которого сравнивают со стандартным значением (Опе^ег, 1983а). Если он превосходит 470 Кдж-моль~102 это означает, что данные прямой калориметрии были выше, чем результаты непрямой. Иными словами, во время эксперимента расход энергии в организме превышал её поступление за счет окислительного фосфорилирования. Оксикалорический коэффициент ниже 430 Кдж-моль~102 указывает на то, что интенсивность энергетического обмена по результатам непрямой калориметрии выше результатов прямых калориметрических измерений.

Совпадение данных непрямой и прямой калориметрии говорит о том, что за период наблюдений энергия, полученная при окислении дыхательных субстратов, была полностью израсходована организмом и рассеяна в виде тепла в окружающей среде. Такое соотношение результатов обоих методов, которое было получено Лавуазье еще в 1776 году, можно найти во многих учебниках физиологии в качестве доказательства применимости закона сохранения энергии к живым существам. Тем больший интерес представляют факты нарушения этого равенства, особенно случаи, не имеющие простого объяснения, поскольку именно они могут быть связаны с биологическими процессами, обойденными вниманием иследователе�