Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma hominis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma hominis"

На правах рукописи

Шершнёва Наталья Николаевна

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ

ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ MYCOPLASMA PNEUMONIAE И MYCOPLASMA HOMINIS.

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009.

003472040

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Горина Луиза Георгиевна.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Батуро Алла Петровна.

доктор медицинских наук,

профессор Бондаренко Виктор Михайлович.

Ведущая организация: ФГУН Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических

препаратов им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора.

Защита диссертации состоится «22 мая 2009г.» в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 при ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан «21» апреля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор. Е.В.Русакова

Актуальность работы:

В последнее время внимание многих исследователей направлено на изучение микоплазм, часто являющихся причиной развития патологических процессов в органах мочеполовой и респираторной системы. Основным возбудителем респираторного микоплазмоза является Mycoplasma pneumoniae. Среди всех респираторных инфекций доля респираторного микоплазмоза, вызванного M.pneumoniae, составляет 10-20%, пневмонии микоплазменной природы регистрируются в 10-16,3% случаев от общего числа пневмоний в различных возрастных группах (Прозоровский С.В. и соавт., 1995, Razin S., et. al. 2002, Горина Л.Г., 2005). Ureaplasma urealyticuM, M.hominis и M.genitalium заселяют урогенитальный тракт и вызывают воспалительные, чаще всего хронические заболевания мочеполового тракта человека и могут служить причиной повторных спонтанных абортов, мужского и женского бесплодия (Taylor-Robinson D., Furr P.M., 1997). Распространенность M.hominis среди населения по данным разных авторов варьирует от 10 до 50%. Внутриутробные заболевания среди новорожденных, обусловленные M.hominis, составляют 34,4% среди всех внутриутробных инфекций (Blanchard A., Bebear С.М., 2002; Раковская И.В., Горина Л.Г., 1999).

Микоплазмы являются мембранными паразитами, при этом тесное взаимодействие с мембраной клетки хозяина способствует обмену антигенными комплексами, что позволяет им "ускользать" от иммунологического надзора со стороны иммунной системы хозяина, а повторное инфицирование, или затяжное, хроническое течение болезни может способствовать возникновению аутоиммунного синдрома (Razin S., et. al., 2002).

Факторы патогенности возбудителя генетически детерминированы. Их принято подразделять на 4 группы: (1) определяющие взаимодействие возбудителя с эпителием соответствующих экологических ниш и колонизацию зоны первичного инфицирования; (2) обеспечивающие устойчивость микробов

к факторам защиты макроорганизма и способность к размножению in vivo; (3) индуцирующие синтез цитокинов и медиаторов воспаления, ассоциированных с иммунопатологией; (4) токсины, и токсические продукты, вызывающие патологические изменения в органах и тканях макроорганизма (В.М.Бондаренко, 1999). Патогенное действие микоплазм может проявляться как токсическими биомолекулами (токсины, ферменты, метаболиты), так и факторами патогенности, обеспечивающими адгезию, колонизацию и персистенцию возбудителя в организме хозяина. Микоплазменные инфекции не имеют патогномонических особенностей, что чрезвычайно затрудняет клиническую диагностику заболеваний и это обстоятельство выделяет раздел лабораторной диагностики в один из наиболее важных.

В настоящее время диагностика микоплазменных инфекций основывается на микробиологических, иммунологических, иммунохимических и генетических методах. Если раньше основной упор делали на микробиологические тесты, то внедрение новых лабораторных технологий, таких как иммуноферментный анализ (ИФА), реакция прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РИФ), полимеразная цепная реакция (ПЦР) создали принципиально новую возможность для диагностики, инфекций, обусловленных микоплазмами (Раковская И.В., Горина Л.Г., 1999, Dorigo-Zetsma L.W., et. al., 1999, Rastawicki W, et. al., 2002). Сейчас перед специалистами стоят задачи по повышению надежности и репрезентативности методов диагностики, что во многом зависит от уровня информативности лабораторных методов исследования и расширения диагностических возможностей. Решение этих проблем позволит применить комплексный подход к лабораторной диагностике, контролю лечения, прогнозированию течения инфекций и внедрению масштабного тестирования отдельных групп населения на ряд инфекций микоплазменной природы.

Большой популярностью в лабораторной практике пользуется иммуноферментный анализ, в основе которого лежит образование комплекса

"антиген-антитело" па твердой фазе полистироловых планшет и дальнейшая регистрация ферментной метки (Нго Т.Т., Ленхофф Г., 1988, Егоров A.M., Осипов А.П. и др., 1991). Основными преимуществами метода являются: высокая чувствительность и специфичность, возможность одновременного исследования большого количества проб, объективная оценка результатов, простота постановки. ИФА является универсальным методом и позволяет выявлять в сыворотке крови и в других биосубстратах специфические антитела различных классов и субклассов (чаще всего определяют антитела классов IgM и IgG). В последние годы появились тест-системы, предназначенные для определения антигенов различных видов микроорганизмов. По чувствительности ИФА уступает лишь ПЦР, широкое использование которой ограничивает необходимость иметь специальное оборудование.

На сегодняшний день в России нет зарегистрированных диагностикумов на основе ИФА для выявления микоплазменных антигенов в клиническом материале. Для дифференциальной диагностики инфекций респираторного тракта фирма "SERION" (Германия) предлагает иммуноферментную тест-систему "ELISA antigen Quadrogen", построенную по принципу сэндвича, для выявления антигенов M.pneumoniae, вирусов гриппа А и В и респираторного синтициального вируса в клиническом материале. В 1991 г. Hirschberg L. et. al. применили в своих исследованиях систему "Semimonoclonal Double-Sandwich Test" (Швеция) для выявления антигенов М. pneumoniae с использованием моноклональных антител. Публикации о диагностике инфекций, обусловленных M.hominis, методом ИФА отсутствуют как в зарубежных, так и в отечественных литературных источниках.

Представленные данные свидетельствуют о необходимости разработки отечественных тест-систем на основе иммуноферментпого анализа для выявления антигенов микоплазм у больных с респираторными и урогенитальными инфекциями с целью верификации этиологического диагноза.

Цель исследования: разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов микоплазм в клиническом материале от больных с респираторными и урогенитальными заболеваниями человека.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Получить высокоактивные иммунные сыворотки к цитоплазматическим мембранам клеток М. pneumoniae и М. hominis.

2) Разработать иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов М. pneumoniae и М. hominis в ИФА и дать оценку их специфичности и чувствительности.

3) Апробировать тест-системы на клиническом материале, полученном от больных с респираторными и урогенитальными микоплазменными инфекциями.

4) Определить условия выявления в ИФА антигенов М. pneumoniae и М. hominis в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в пробах сыворотки крови.

5) Дать электрофоретическую характеристику антигенов М. pneumoniae и М. hominis с помощью «Вестерн-блот» анализа.

6) Провести иммуноблоттинг в пробах сыворотки крови для подтверждения специфичности обнаружения в ИФА антигенов М. pneumoniae и М. hominis в свободном состоянии и в составе ЦИК.

Научная новизна:

Получены высокоактивные гипериммунные сыворотки к М. pneumoniae и М. hominis путем иммунизации кроликов фракциями цитоплазматических мембран клеток микоплазм. Антитела, выделенные из иммунных сывороток, были использованы для создания диагностических тест-систем на основе ИФА для определения антигенов М. pneumoniae и М. hominis в свободном состоянии и в составе ЦИК в сыворотках крови больных с заболеваниями респираторного и урогениталыюго тракта.

Специфичность, чувствительность и диагностическая значимость разработанных вариантов ИФА была показана на примере анализа проб сыворотки крови больных с респираторными и урогенитальными микоплазмснными инфекциями и подтверждена результатами дополнительных исследований этих образцов на присутствие антигенов М. pneumoniae и М. hominis и антител к ним в ИФА, РАГА и иммуноблоте.

Научно-практическая значимость работы.

Разработаны варианты ИФА для обнаружения антигенов М. pneumoniae и М. hominis в клиническом материале, полученном от больных с респираторной и урогениталыюй патологией, и показана их диагностическая значимость. Предложен метод выявления миконлазменных антигенов в составе циркулирующих иммунных комплексов, который дает возможность увеличить специфичность и чувствительность разработанных тест-систем и проследить длительность псрсистенции микоплазм в организме больного. С целью повышения эффективности диагностики микоплазменных инфекций рекомендуется применять ИФА в комплексе с РАГА, РИФ или ПЦР в практике клинических и экспериментальных лабораторий, занимающихся диагностикой микоплазменных инфекций.

Внедрение результатов работы.

Составлены Методические рекомендации «Изготовление и контроль тест-систсмы диагностической для определения антигенов Mycoplasma pneumoniae в иммуноферментном анализе» и « Изготовление и контроль тест-системы диагностической для определения антигенов Mycoplasma hominis в иммуноферментном анализе», предназначенные для микробиологов, иммунологов и других специалистов, занимающихся разработкой и производством диагностических препаратов. Методические рекомендации одобрены на Совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (протокол № 8 от 19 марта 2009 г.).

Положения, выносимые на защиту:

- на основе ИФА разработаны высокочувствительные методы обнаружения антигенов М.рпеитошае и М-Иоггигш в клиническом материале, полученном от больных с респираторной и урогенитальной патологией. Исследование сывороток крови на присутствие микоплазменных антигенов в РАГА, иммуноблоте и антител к ним в ИФА подтвердило специфичность данных тест-систем.

- способ определения антигенов М.рпеитошае и М.Ьогшгш в составе ЦИК увеличивает чувствительность ИФА, а совместная диагностика, как свободных, так и связанных в ЦИК антигенов позволяет установить длительность персистенции антигенов в макроорганизме.

- протестированные в иммуноблоте антигены М.рпеитошае и М.Ьогшгш, обнаруженные в ИФА, имеют широкий протеиновый спектр (от 30 до 170 кД и от 25 до 120 кД соответственно) и содержат как специфические, так и патогенетически значимые антигены.

Апробация работы.

Апробация состоялась на совместной научной конференции отдела медицинской микробиологии и лаборатории микоплазм и Ь-форм бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 18 февраля 2009 года.

Материалы диссертации были обсуждены и доложены на:

- Российской - научно-практической конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами», 2007 год, Москва.

- X Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2006 год, Санкт-Петербург.

- конференции «Современные технологии в диагностике инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами», 2009 год, Краснодар.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных исследований, обсуждения результатов,

выводов и списка литературы (27 отечественных и 107 зарубежных источников). Работа изложена на 119 страницах, иллюстрирована 7 таблицами и 14 рисунками.

Содержание работы.

Материалы и методы.

В работе использовали штаммы: Mycoplasma hominis (Н-34), Mycoplasma pneumoniae (FH) и Ureaplasma urealyticum (8 серотип), полученные от доктора Е. Freundt'a (University of Aarhus, Denmark). Штаммы выращивали на средах, содержащих гидролизат мышцы сердца, мясную воду и дрожжевой гидролизат. Изготовитель - филиал «Медгамал», предприятие по производству бактерийных препаратов ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Антигенами для проведения электрофоретической характеристики белкового профиля и постановки серологических реакций служили растворимые антигены и цитоплазматические мембраны микоплазм, полученные в лаборатории микоплазм и L- форм бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Животные: в работе были использованы кролики породы шиншилла, весом 1,5-2,5 кг, полученные из питомника «Столбовая» РАМН.

Антисыворотки, используемые в ИФА, РАГА и иммуноблоте, получали иммунизацией кроликов препаратами цитоплазматических мембран М. hominis и M.pneumoniae по схеме, разработанной ранее в лаборатории микоплазм и L-форм бактерий ГУНИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи РАМН (Горина Л.Г. и др. 1985г).

Гамма-глобулиновые фракции из иммунных сывороток выделяли 40% насыщением сульфатом аммония и дополнительно очищали на колонке с ДЕАЕ - целлюлозой.

Содержание белка антител в антисыворотках, гамма-глобулиновых фракциях и препаратах антигенов определяли спектрофотометрически при 280 нм.

Коньюгаты гамма глобулиновых фракций с ферментом готовили

методом периодатного окисления карбогидратных групп пероксидазы по Nakane P.K. и Kawaoi А. (1974).

Постановку иммунофсрмснтного анализа (ИФА) для обнаружения аитител к микоплазмам осуществляли на отечественных тест-системах «Микогомоскрин» и «ИФА-Мико-пневмо», производства ЗАО «Ниармедик Плюс» (г.Москва) и ЗАО «Эколаб» (г.Электрогорск) соответственно.

Антигены миконлазм определяли в реакции агрегат-гемагглютинации (РАГА) по методу Гориной Л.Г. и Оловникова A.M. (1975).

Циркулирующие иммунные комплексы выделяли из проб сыворотки крови по Digeon М. et. al. (1977) преципитацией их 3,5% полиэтиленгликолсм (м.м. 6000).

ДСН-элсктрофорез белков микоплазм осуществляли методом электрофореза в градиентном полиакриламидном геле (3% и 13%) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) в модификации Лэмли (Laemmli,1970).

Электроперснос белков микоплазм и иммуноблоттинг проводили в соответствии с форматом Western blotting (Bio-Rad) в модификации Towbin et. al., 1979.

Клинический материал: 123 пробы сыворотки крови больных респираторными инфекциями с диагнозами ОРВИ, бронхит и бронхиальная астма были получены из педиатрического, пульмонологического отделений и отделения патологии детей раннего возраста ММА им. И. М. Сеченова.

123 пробы сыворотки крови пациентов с урогенитальными инфекциями с диагнозами острого и хронического уретрита были получены из медико-санитарной части Федерального Управления медико-биологических и экстремальных проблем при МЗ России.

Все пациенты дополнительно были обследованы с помощью ПЦР на Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Uspp и M.genitalium.

В качестве контроля использовали образцы донорских сывороток (п=100),

предоставленные станцией переливания крови г. Орехово-Зуево. Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку проводили в соответствии с методами вариационной статистики (И.П.Ашмарин, A.A. Воробьев, 1962).

Разработка модельных тест-систем для определения аптигеиов M.pneumoniac и М. hominis в ИФА.

Для обнаружения специфических микоплазменных антигенов использовали полистироловые планшеты фирмы «Costar», сенсибилизированные гамма-глобулиновой фракцией, выделенной из иммунных сывороток и дополнительно очищенной на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой. Постановку тест-системы осуществляли с помощью «сэндвич» -метода ИФА. Отработку оптимальных условий сенсибилизации полистироловых планшет поликлональными антителами к M.pneumoniae и М. hominis проводили, используя концентрации антител в пределах от 1 до 20 мкг/мл (по белку). Самый высокий уровень насыщения поверхности планшет достигался при концентрации белка, равной 10 мкг/мл (рис. 1).

Рисунок 1. Подбор оптимальных сенсибилизирующих доз поликлональных антител к M.pneumoniae и М. hominis.

По оси абсцисс —

1,6 1,4 1,2 1,0 о 0.8 0,6 0,4 0,2

0

концентрация поликлональных антител к М.рпештюшае и МЛюгш'шб (мкг/мл); по оси ординат -показатели оптической плотности при 450 нм. 1 и 2 -поликлональные антитела к антигенам М.рпештюшае и М.1ю1гит8; 3, 4 - контроли (разведения нормальной сыворотки кролика).

10 1S м кг/мл

Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является pH комплексирующего буфера. Полистироловые планшеты сенсибилизировали антителами к М. pneumoniae и М. hominis в буферных растворах с pH от 4,0 до 10,0: ацетатном, фосфатном и карбонат-бикарбонатном.

Рисунок 2. Влияние pH буферных растворов при фиксации поликлональных антител к M.pneumoniae и M.hominis.

По оси абсцисс — значение рН буферных растворов: рН 4,0-5,6 - 0,1 М ацетатный буфер, рН 5,0-8,0 - 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,0-10,0 - 0,1 М карбонат-бикарбонатный буфер; по оси ординат - показатели оптической плотности при 450 нм. 1, 2 - в качестве сенситина использовали гамма-глобулиновые фракции, выделенные из иммунных сывороток к M.hominis и M.pneumoniae.

Установлено, что при рН=9,6 0,1М карбонат-бикарбонатного буфера обеспечивалась стабильная адсорбция поликлональных антител к М. pneumoniae и М. hominis в концентрации 10 мкг/мл на поверхности планшет (см. рис.2). Оптимальное время фиксации - 17 часов при 4°С. Для исключения появления ложноположительных реакций за счет видового гетероперекреста или присутствия РФ-фактора иммуносорбенты с иммобилизованными антителами были предварительно проинкубированы в течение 40 минут с блокирующим раствором, содержащим 1% BSA и 0,5% казеина.

Для получения специфических коиыогатов гамма-глобулиповые фракции, выделенные из иммунных сывороток, метили пероксидазой хрена согласно методике, предложенной Nakanc Р.К. и Kawaoi Л. (1974). Для определения активности полученных коиыогатов подбирали оптимальное рабочее разведение, дающее цветовую реакцию с растворимыми антигенами микоплазм. В сенсибилизированные антителами лупки полистироловых планшет добавляли двукратные разведения коиыогатов от 1/100 до 1/51200. Рабочим разведением коныогата служила концентрация, при которой выявляли наибольшее разведение антигена при минимальном фоне нсспсцифичсской адсорбции. В данном случае рабочие разведения составили - 1:6400 для М. pneumoniae и 1:12800 для M.hominis.

В модельном эксперименте для реакции с адсорбированными на поверхности пластика специфическими антителами использовали растворимые антигены M.pneumoniae и М. hominis в концентрации 7,0 мкг/мл (по белку) и двукратные разведения нормальной сыворотки кролика. Как видно из таблицы 1, в прямом варианте постановки ИФА растворимые антигены M.pneumoniae и M.hominis реагировали с поликлональными антителами к ним, использованными в качестве сенсибилизирующего агента, в разведении 1:32000 (ОП45о= 1,159±0,097) и 1:40000 (ОП45о=1,424±0,057) соответственно, т.е. чувствительность выявления микоплазменных антигенов составила 2 нг/мл.

Таблица 1.

Чувствительность и специфичность иммуноферментных тест-систем

для выявления антигенов M.pneumoniae и M.hominis.

Поликлональные антитела Поликлональные антитела

Растворимые к антигену M.pneumoniae к антигену M.hominis

антигены Титр Показания Титр Показания

7 мкг/мл (по белку) оп450 ОП45о

M.pneumoniae 32000 1,159+0,097 100 0,126+0,018

M.hominis 100 0,199+0,012 40000 1,424+0,057

U.urealyticum 50 0,189+0,009 50 0,098+0,028

ИКС 50 0,096+0,014 50 0,064+0,012

Примечание: ИКС - нормальная сыворотка кролика.

Фон неспецифической реакции нормальной сыворотки кролика, (разведение 1:50), использованной в качестве сенситина, варьировал для микоплазменных антигенов и контрольных сывороток в пределах от 0,052 до 0,100. Показатели экстинкции гетероперекрестных реакций адсорбированных на носителе поликлональных антимикоплазменных антител с растворимыми антигенами различных видов микоплазм находились в границах оптических единиц от 0,070 до 0,199 (таблица 1). Показатели неспецифического связывания КГ-ПХ+ФСБ с поверхностью сенсибилизированных антителами планшет не превышал значений ОП450, равных 0,064 + 0,012.

Для отработки рабочего разведения образцов в ИФА были взяты пробы сыворотки крови доноров и больных с респираторными и урогенитальными инфекциями. Исследование последовательных двукратных разведений положительных проб сыворотки крови показало, что наиболее сильный сигнал при измерении ОП на спектрофотометре был получен для разведения 1:50, которое давало четкую дискриминацию между положительными и отрицательными сыворотками. Показатели экстинкции отрицательных сывороток при 450 им находились в диапазоне от 0,096±0,012 до 0,182±0,014, а положительных - от 0,398±0,018 до 1,246±0,017. В дальнейшей работе для постановки ИФА оптимальное (диагностическое) разведение исследуемых проб сыворотки крови для обеих тест-систем составило 1:50, пороговыми значениями считались показатели в два и более раз превосходящие показатели отрицательных контрольных образцов.

Обнаружение микоплазменных антигенов и антител к ним в клиническом материале.

Высокая чувствительность и специфичность разработанных вариантов ИФА позволила использовать их для обнаружения антигенов микоплазм в клиническом материале. Дополнительно сыворотки крови больных с респираторными и урогенитальными заболеваниями и контрольные сыворотки

были проанализированы в РАГА и ИФА на наличие антигенов M.pneumoniae, М. hominis и антител к ним.

Предварительный анализ 100 проб сыворотки крови доноров показал, что частота определения M.pneumoniae и М. hominis в РАГА (титры от 1:8 до 1:16) и ИФА (ОП45о=0,340-1,159) составила 22 и 18 случаев соответственно. Специфические антитела к M.pneumoniae и М. hominis класса G были обнаружены в ИФА в 37 (ОП450=0,340-1,027) и 45 (ОП45о=0,640-1,027) случаях соответственно, антител класса М обнаружено не было. Такие высокие проценты содержания микоплазменных антигенов и антител к ним в крови доноров связаны с тем обстоятельством, что на станциях переливания крови ие проводится исследований клинического материала на присутствие в нем антигенов микоплазм. Учитывая широкую распространенность микоплазменных инфекций, часто их стертые формы, длительную персистенцию, как антигенов, так и анамнестических антител, можно констатировать, что полученные данные лишь дополнительно подтверждают исследования многих авторов, отметивших факты бессимптомного носительства. В дальнейшем, для проведения контрольных исследований были использованы образцы сыворотки крови доноров, не содержащие ни антигенов M.pneumoniae и М. hominis, ни антител к ним.

В таблицах 2 и 3 представлены результаты анализов в ИФА и РАГА проб сыворотки крови доноров и больных с подозрениями на респираторную и урогенитальную микоплазменные инфекции. Из 98 образцов сыворотки крови пациентов, с подозрением на респираторный микоплазмоз, в 50 случаях в РАГА и в 48 - в ИФА были обнаружены АГ M.pneumoniae и антитела к ним классов G-, M-, G + М в 46,0%, 6,0% и 5,0% случаев соответственно. Общее число проб, содержащих одновременно антигены M.pneumoniae и специфические антитела, составило 38%. Из 67 проб сывороток крови больных с урогенитальной микоплазменной инфекцией в 56 из них в РАГА и в 55 в ИФА

зарегистрировано наличие АГ М. hominis и специфических AT классов G-, М-, G + М в 55%, 9% и 9% случаев (таблица 3).

Сыворотки пациентов, содержащие антигены M.pneumoniae и М. hominis с показаниями ОП450 в ИФА от 0,398±0,018 до 1,246±0,017 были отобраны для дальнейшего исследования с использованием разработанных вариантов ИФА.

Таблица 2.

Выявление антигенов M.pneumoniae у больных с респираторными микоплазменными инфекциями и доноров.

Группы и Частота выявления АГ и AT У

обследованных о в обследованных лиц. + « *

больных й « 8 И я S е 5 Антиген M.pneumoniae Антитела к M.pneumoniae ш ч ш ишь. а й в н я h

О ч И 3 ** «5 О ИФА я с я с S я

ИФА РАГА IgG IgM IgG+IgM

Больные с 48,0 50,0 45,0 6,0 5,0 37,0

респираторными инфекциями 98 48,98% 51,02% 45,92% 6,1% 5,1% 37,76%

±5,04% ±5,04% ±5,03% ±2,41% ±2,22% ±4,87%

22,0 22,0 37,0 22,0

Доноры 100 22% ±4,14% 22% ±4,14% 37% ±4,82% 11/0* н/о 22% ±4,14%

Примечание: н/о - не обнаружено.

Таблица 3.

Выявление антигенов М.ЬотЫэ у больных с урогенитальными инфекциями и доноров.

Группы обследованных £ о 2 и я Частота выявления АГ и AT у обследованных лиц. + ш >• я Я я 4J Ч 0> 2 ?> и s й s н ® н

больных У « а £ О я ч Антигены M.hominis Антитела к M.hominis

ч S О ч ИФА РАГА ИФА я t Я < S я

" >о о IgG IgM IgG+ IgM

Больные с 55,0 56,0 37,0 6,0 6,0 28,0

урогенитальными инфекциями 67 82,1% ±4,68% 83,6% ±4,52% 55,2% ±6,08% 9% ±3,5% 9% ±3,5% 41,8% ±6,03%

Доноры 100 18,0 18,0% ±3,84% 18,0 18,0% ±3,84% 45,0 45,0% ±4,97% н/о* н/о 18,0 18,0% ±3,84%

Примечание: н/о - не обнаружено.

Незначительное расхождение в результатах исследований с использованием ИФА и РАГА заключается в более высокой чувствительности РАГА, которая составляет по белку 1 нг/ мл (Горина Л.Г. и др. 1983).

Как было отмечено, обнаружение антигена в сыворотках больных не всегда совпадало с присутствием специфических антител. Известно, что микоплазменные инфекции часто сопровождаются длительной персистепцией антигенов микоплазм в составе иммунных комплексов (Hiroko М., Hiromishi М., 1984, Горина Л.Г., Вульфович Ю.В., 1996, Горина Л.Г., Гончарова С.А., 2005).

Для обнаружения специфических ЦИК были отработаны условия их диссоциации в пробах сыворотки крови больных с урогеиитальными и респираторными микоплазменными инфекциями, верифицированных ранее в РАГА и ИФА.

Оптимальные результаты диссоциации были достигнуты путем смещения рН в образцах в кислую сторону с помощью 0,2М глицин-HCl (рН 5,0) и последующей нейтрализацией проб 1,5М трис-HCl (рН 7,4) буферными растворами. Пробы с диссоциированными ЦИК переносили на иммуносорбент с иммобилизованными антителами и проводили постановку ИФА в нашей модификации.

Для выявления в ИФА антигенов в ЦИК, выделенных из сывороток больных с респираторными микоплазменными инфекциями, было взято 25 проб сыворотки крови, исследованных ранее в РАГА и ИФА (таблица 4). Из 25 образцов, содержащих антиген в титрах 0-1/8 в РАГА (следовые количества) и в ИФА ОП450 от 0,190 до 0,430 нм, после разделения ЦИК в 64% случаев наблюдалось значительное увеличение оптической плотности в ИФА (ОП45о в пределах от 0,380 до 0,860 нм).

Использование разработанного варианта ИФА для обнаружения антигенов Mycoplasma hominis в составе ЦИК показало, что специфические ИК были обнаружены в 20% случаев (11 образцов из 56). Показатели экстинкции при 450 нм адсорбированных на носителе поликлональных антител с антигеном

Mycoplasma hominis до диссоциации ЦИК находились в границах оптических единиц от 0,206 до 0,346, а после диссоциации - от 0,388 и до 1,654 (см. табл. 4).

Таблица 4.

Показатели ОП450 в ИФА диссоциированных ЦИК в 11 пробах сыворотки крови больных с урогениталышй и респираторной инфекцией.

№ образца Диссоциированные ЦИК в пробах сыворотки крови больных с респираторной инфекцией. Диссоциированные ЦИК в пробах сыворотки крови больных с урогенитальной инфекцией.

Показатели экстинкции при ОП450

До диссоциации ЦИК Интерпретация результатов cut off=0,230 После диссоциации ЦИК Интерпретация результатов До диссоциации ЦИК Интерпретация результатов cut off=0,246 После диссоциации ЦИК Интерпретация результатов

I 0,190 - 0,380 + 0,206 - 0,388 +

2 0,293 + 0,374 + 0,223 - 0,396 +

3 0,219 - 0,403 + 0,201 - 0,423 +

4 0,233 +/- 0,587 + 0,267 + 0,576 +

5 0,235 +/- 0,599 + 0,229 - 0,453 +

6 0,208 - 0,420 + 0,246 +/- 0,798 +

7 0,211 - 0,459 + 0,211 - 0,587 +

8 0,301 + 0,678 + 0,209 - 0,465 +

9 0,296 + 0,478 + 0,327 + 0,956 +

10 0,215 - 0,576 + 0,335 + 0,876 +

11 0,238 +/- 0,530 + 0,346 + 1,654 +

Таким образом, используя предварительную диссоциацию ЦИК для определения антигенов в разрушенных иммунных комплексах с помощью разработанных иммуноферментных тест-систем, мы увеличиваем вероятность определения специфических микоплазменных антигенов в клиническом материале. Этот прием значительно повышает чувствительность метода, тем самым увеличивая диагностическую ценность разработанных вариантов ИФА. Кроме того, определение специфических антигенов в составе ЦИК даст возможность контролировать длительность их циркуляции в крови.

Для доказательства специфичности выявления антигенов микоплазм, сыворотки больных респираторными и урогенитальными микоплазмеиными инфекциями были дополнительно тестированы в иммуноблоттинге.

Предварительно была дана характеристика целых клеток, мембранных белков и растворимых антигенов M.pncumoniae, M.hominis посредством ДСН-элсктрофорсза в градиентном полиакриламидном геле (3% и 13%). Исследуемые образцы мембранных белков и целых клеток микоплазм предварительно были разведены в диссоциирующей смеси (1:2), содержащей: 0,5М Трис-HCl, pH 6,8, 10% глицерин, 10% ДСН, 5% 2-мсркаптоэтанол и в качестве красителя 0,001% бромфеноловый синий. Для более полпого разделения белковых комплексов, разведенные антигены прогревали 3 минуты на кипящей водяной бане и наносили на гель по 15-20 мкл. По окончании электрофореза гели окрашивали 0,25% Кумасси бриллиантовым синим R-250, краску отмывали раствором, содержащим 10% этанола, 10% ледяной уксусной кислоты и 80% дистиллированной воды. Результаты данной работы отображены на рисунках 3 и 4.

В ходе электрофореза как мембранных, так и растворимых антигенов M.pneumoniae (FH) был выявлен широкий протеиновый спектр от 17,5 до 170 кД (17,5, 25, 30, 40,45, 50, 56, 58, 60, 66, 90, 130 и 170 кД). Наиболее ярко выраженными были белки с молекулярными массами 17,5,30,40,45,60,66,90,130 и 170кД.

Электрофорез мембранных белков и целых клеток M.hominis показал, что протеиновый спектр находился в границах от 25 до 120 кД (25, 30, 31, 40, 45, 50, 55, 58, 60, 66, 90, 120 кД). В данном случае и далее в качестве маркера использовали весовой молекулярный стандарт фирмы «BIO RAD» с известными молекулярными массами. Промежуточные показатели молекулярных масс установлены путем построения калибровочных кривых по методике, описанной Weber R., Osborn М. (1969).

Рис. 3.

Результаты электрофоретической разгонки мембранных и растворимых антигенов М.рпеитошае (БН)

Молекулярная масса Маркер белков в кД

, -170 -130 -97

-66

-45

-31

i -21

1 I --17,5

1 234 5 6 7 8 9 10 1-4 - растворимые белки M.pneumoniae. 5-6 - весовой молекулярный стандарт фирмы «BIO RAD». 7-10 - мембранные белки M.pneumoniae.

Рис. 4.

Результаты электрофоретического исследования мембранных белков и целых клеток M.hominis.

Молекулярная масса

Маркер

I 4

белков в кД

-120

-97

-90

-66 -45

-31

J

-21 -17,5

1234 56 789 10

1-4 - целые клетки M.hominis 5-6 - весовой молекулярный стандарт фирмы «BIO RAD» 7-10- мембранные белки M.hominis.

Доказательством того, что в ИФА были выявлены антигены микоплазм, послужили данные, полученные при тестировании в иммуноблоте исследованных в ИФА проб сыворотки крови больных с респираторной и урогенитальной микоплазменными инфекциями. В реакции были использованы меченые ПХ поликлональные антитела к антигенам М.pneumoniae и М. hominis. Специфическая реакция в образцах, полученных от больных с респираторными заболеваниями, наблюдалась с белками, молекулярная масса которых находилась в пределах от 30 до 170 Кд (30, 45, 56, 58, 72, 90, 130 и 170 Кд), с урогенитальной микоплазмепной инфекцией - от 25 до 120 Кд (25, 55, 58, 60, 80, и 120 Кд). Результаты иммуноблота сывороток больных респираторными микоплазменными инфекциями представлены на рисунке 5. Эти данные совпадают с исследованиями Razin S. (2002) и свидетельствуют не только о специфичности определения антигенов М.pneumoniae и М. hominis в ИФА, но и том, что они имеют достаточно широкий диапазон молекулярных масс, в состав которых входят основные специфические антигены. Рис. 5.

Иммуноблот сывороток больных респираторными микоплазменными инфекциями.

Примечание: верхняя часть треков - номера проб сыворотки крови. 1 - отрицательная контрольная сыворотка донора. Треки с 2 по 9 — сыворотки больных с респираторными микоплазменными инфекциями. «М» -весовой молекулярный стандарт фирмы «BIO RAD». Справа на фотографии указаны молекулярные массы обнаруженных протеинов в кД.

По данным отдельных авторов при хронических формах респираторных и урогеиитапьных микоплазменных инфекций большая часть антигенов микоилазм находится в составе ЦИК (Горина Л.Г., Вульфович Ю.В., 1996, Горина Л.Г., Гончарова С.А., 2005).

При исследовании в иммуноблоте ЦИК, выделенных из 20 сывороток больных с респираторным микоплазмозом, в 63% наблюдалась реакция с белками, м. м. которых составила 50, 58, 72, 130 и 170 Кд, и только в 37% случаев антигены в составе ЦИК имели м.м. 37 Кд. На рисунке 6 отображены наиболее демонстративные результаты.

Рис. 6.

Иммуноблот ЦИК, выделенных из проб сыворотки крови больных с респираторной микоплазмеиной инфекцией.

Примечание: верхняя часть треков -номера проб сыворотки крови. №1-6 -ЦИК, выделенные из проб сыворотки крови больных респираторной

микоплазмеиной инфекцией. № 7-8-отрицагельные пробы сыворотки крови доноров. «М» - весовой молекулярный стандарт фирмы «BIO RAD». Слева на фотографии указаны молекулярные массы обнаруженных протеинов в кД.

Следует особо отметить тот факт, что те сыворотки, в которых не было обнаружено антигенов M.pneumoniae в ИФА, в выделенных же из них ЦИК в иммуноблоте были выявлены специфические антигены.

При анализе ЦИК, полученных из сывороток крови больных с урогенитальными микоплазменными инфекциями в 58% случаев наблюдалась

реакция с антигенами М. hominis, м. м. которых составила 58, 60, 80 и 120 Кд, а в 11% случаев антигены в составе ЦИК имели м.м. 55 Кд.

Данные, полученные в иммуноблоте образцов сыворотки крови больных с респираторными и урогенитальными микоплазмснными инфекциями, подтвержденные тестированием этих проб в РАГА и ИФА, свидетельствуют о специфичности разработанных вариантов ИФА и возможности использования модификаций этого метода в диагностике микоплазменных инфекций.

Таким образом, в результате проведенных исследований была показана высокая чувствительность и специфичность разработанных вариантов ИФА, что позволяет рекомендовать этот метод для обнаружения антигенов M.pneumoniae и М. hominis в свободном состоянии и в составе ЦИК в пробах сыворотки крови больных с урогенитальными и респираторными инфекциями.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые на основе поликлональных антител к M.pneumoniae и М. hominis разработаны варианты ИФА для выявления микоплазменных антигенов у больных с респираторными и урогенитальными заболеваниями. Чувствительность модельных тест-систем составила 2 нг/мл (по белку).

2. Показано, что с помощью разработанных вариантов ИФА у больных с респираторной и урогенитальной инфекцией в 48 % и 82% случаев обнаружены антигены M.pneumoniae и M.hominis соответственно. Полученные результаты подтверждены выявлением микоплазменных антигенов в РАГА и иммуноблоттинге, специфических антител в ИФА.

3. Спектр выявляемых в иммуноблотинге антигенов M.pneumoniae и М. hominis в сыворотках крови больных с респираторной и урогенитальной микоплазменными инфекциями находился в пределах от 30 до 170 кД и от 25 до 120 кД соответственно и содержал основные специфические антигены.

4. Разработана методика определения в ИФА антигенов M.pneumoniae и M.hominis в составе ЦИК в пробах сыворотки крови больных с респираторными и урогенитальными инфекциями.

5. Установлено, что использование метода диссоциации ЦИК повышает чувствительность выявления антигенов M.pneumoniae и M.hominis при респираторных и урогенитальных заболеваниях.

6. Иммуноэлектрофоретическая характеристика специфических антигенов в составе ЦИК, выявляемых в ИФА, показала, что антигенный спектр M.pneumoniae и М. hominis находился в диапазоне от 50 до 170 кД и от 55 до 120 кД соответственно.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Горина Л.Г., Шершнева Н.Н.. Лабораторная диагностика респираторного микоплазмоза. // В сборнике материалов конференции «Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней», 2006 год, Москва, с. 155-160.

2. Горина Л.Г., Гончарова С.А., Шершнева Н.Н., Респираторный микоплазмоз - распространение, диагностика. // В материале международного конгресса «Стратегия и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развития медицины», 2006 год, Москва, с. 63-65.

3. Горина Л.Г., Раковская И.В., Гончарова С.А., Шершнева Н.Н., Кузьменко Л.Г. «Частота определения антигенов микоплазм в свободном состоянии и в составе ЦИК у детей с бронхиальной астмой». // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2006, №4, с.85-88.

4. Горина Л.Г., Шершнева Н.Н., Гончарова С.А.. Комплексная диагностика респираторного микоплазмоза. // Медицинская иммунология, 2006, том 8, №3, с.258-259.

5. Шершнева Н.Н., Горина Л.Г., Гончарова С.А. Разработка иммунофсрментных тест-систем для выявления антигенов Mycoplasma hominis и Mycoplasma pneumoniae. // В материалах IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов,

микробиологов и паразитологов. «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации», 2007 год, Москва, 3 том, с. 96-97.

6. Шершнева H.H., Горина Л.Г. Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов Mycoplasma pneumoniae. // В материалах Российской научно-практической конференции «Инфекции, вызываемые усовно-патогенными микроорганизмами», 2007 год, Москва, с.112.

7. Шершнева H.H., Горина Л.Г., Гончарова С.А. Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов Mycoplasma hominis и Mycoplasma pneumoniae. // В материалах XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 2007 год, Москва.

8. Шершнева H.H., Горина Л.Г. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигенов Mycoplasma pneumoniae. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2008, №4, с.83-86.

9. Шершнева H.H., Горина Л.Г. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигенов Mycoplasma hominis и Mycoplasma pneumoniae. // Российский иммунологический журнал. 2008, том 2(11), №4, с.420-426.

10. Горина Л.Г., Шершнева H.H., Балабанов Д., Раковская И.В., Гончарова С.А. Персистенция микоплазм при респираторных и урогенитальных инфекциях. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2008, №6, с.41-44.

Подписано в печать 16.04.2009 г. Печать лазерная цифровая Тираж 80 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: (495) 785-00-38 www.autoref.webstolica.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шершнёва, Наталья Николаевна

Список сокращений

Введение

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О ПРЕДСТАВИТЕЛЯХ

КЛАССА MOLLICUTES.

1.1 .Характеристика семейства Mycoplasmataceae.

1.2.Биологические особенности микоплазм.

1.3 .Патогенные свойства микоплазм.

Глава II. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ МИКОПЛАЗМАМИ.

2.1. Методы лабораторной диагностики микоплазменных инфекций.

2.2.Современное представление об иммуноферментном анализе.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава IV. КОНСТРУИРОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МИКОПЛАЗМЕННЫХ АНТИГЕНОВ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ.

4.1.Разработка модельной тест-системы для определения антигенов M.pneumoniae.

4.2.Разработка модельной тест-системы для определения антигенов M.hominis.

Глава V. АПРОБАЦИЯ РАЗРАБОТАННЫХ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ НА КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

5.1. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы в сравнении с другими методами, используемыми для выявления антигенов M.pneumoniae.

5.2. Характеристика белкового профиля в ЭПАГ мембранных и растворимых антигенов M.pneumoniae (FH).

5.3. Иммуноблоттинг сывороток больных с респираторной микоплазменной инфекцией.

5.4. Иммуноблоттинг ЦИК, выделенных из проб сыворотки крови больных с респираторной инфекцией.

5.5. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы в сравнении с другими методами, используемыми для выявления антигенов M.hominis.

5.6. Характеристика белкового профиля в ЭПАГ мембранных белков и целых клеток M.hominis.

5.7.Иммуноблоттинг проб сыворотки крови больных урогенитальной инфекцией.

5.8. Иммуноблоттинг ЦИК, выделенных из проб сыворотки крови больных урогенитальными инфекциями.

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma hominis"

Актуальность работы:

В последнее время внимание многих исследователей направлено на изучение микоплазм, часто являющихся причиной развития патологических процессов в органах мочеполовой и респираторной системы. Основным возбудителем респираторного микоплазмоза является Mycoplasma pneumoniae. Среди всех респираторных инфекций доля респираторного микоплазмоза, вызванного M.pneumoniae, составляет 10-20%, пневмонии микоплазменной природы регистрируются в 10-16,3% случаев от общего числа пневмоний в различных возрастных группах (11,22,101). Ureaplasma urealyticuM, Mycoplasma hominis и Mycoplasma genitalium заселяют урогенитальный тракт и вызывают воспалительные, чаще всего хронические заболевания мочеполового тракта человека и могут служить причиной повторных спонтанных абортов, мужского и женского бесплодия (123,126). Распространенность M.hominis среди населения по данным разных авторов варьирует от 10 до 50%. Внутриутробные заболевания среди новорожденных, обусловленные M.hominis, составляют 34,4% среди всех внутриутробных инфекций (39; 23).

Микоплазмы являются мембранными паразитами, при этом тесное взаимодействие с мембраной клетки хозяина способствует обмену антигенными комплексами, что позволяет им "ускользать" от иммунологического надзора со стороны иммунной системы хозяина, а повторное инфицирование, или затяжное, хроническое течение болезни может способствовать возникновению аутоиммунного синдрома (101).

Факторы патогенности возбудителя генетически детерминированы. Их принято подразделять на 4 группы: (1) определяющие взаимодействие возбудителя с эпителием соответствующих экологических ниш и колонизацию зоны первичного инфицирования; (2) обеспечивающие устойчивость микробов к факторам защиты макроорганизма и способность к размножению in vivo; (3) индуцирующие синтез цитокинов и медиаторов воспаления, ассоциированных с иммунопатологией; (4) токсины, и токсические продукты, вызывающие патологические изменения в органах и тканях макроорганизма (Бондаренко В.М., 1999). Патогенное действие микоплазм может проявляться как токсическими биомолекулами (токсины, ферменты, метаболиты), так и факторами патогенности, обеспечивающими адгезию, колонизацию и персистенцию возбудителя в организме хозяина. Микоплазменные инфекции не имеют патогномонических особенностей, что чрезвычайно затрудняет клиническую диагностику заболеваний и это обстоятельство выделяет раздел лабораторной диагностики в один из наиболее важных.

В настоящее время диагностика микоплазменных инфекций основывается на микробиологических, иммунологических, иммунохимических и генетических методах. Если раньше основной упор делали на микробиологические тесты, то внедрение новых лабораторных технологий, таких как иммуноферментный анализ (ИФА), реакция прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РИФ), полимеразная цепная реакция (ПЦР) создали принципиально новую возможность для диагностики, инфекций, обусловленных микоплазмами (23, 52, 100). Сейчас перед специалистами стоят задачи по повышению надежности и репрезентативности методов диагностики, что во многом зависит от уровня информативности лабораторных методов исследования и расширения диагностических возможностей. Решение этих проблем позволит применить комплексный подход к лабораторной диагностике, контролю лечения, прогнозированию течения инфекций и внедрению масштабного тестирования отдельных групп населения на ряд инфекций микоплазменной природы.

Большой популярностью в лабораторной практике пользуется иммуноферментный анализ, в основе которого лежит образование комплекса "антиген-антитело" на твердой фазе полистироловых планшет и дальнейшая регистрация ферментной метки (13, 20). Основными преимуществами метода являются: высокая чувствительность и специфичность, возможность одновременного исследования большого количества проб, объективная оценка результатов, простота постановки. ИФА является универсальным методом и позволяет выявлять в сыворотке крови и в других биосубстратах специфические антитела различных классов и субклассов (чаще всего определяют антитела классов IgM и IgG). В последние годы появились тест-системы, предназначенные для определения антигенов различных видов микроорганизмов. По чувствительности ИФА уступает лишь ПЦР, широкое использование которой ограничивает необходимость иметь специальное оборудование.

На сегодняшний день в России нет зарегистрированных диагностикумов на основе ИФА для выявления микоплазменных антигенов в клиническом материале. Для дифференциальной диагностики инфекций респираторного тракта фирма "SERION" (Германия) предлагает иммуноферментную тест-систему "ELISA antigen Quadrogen", построенную по принципу сэндвича, для выявления антигенов M.pneumoniae, вирусов гриппа А и В и респираторного синтициального вируса в клиническом материале. В 1991 г. Hirschberg L. et. al. применили в своих исследованиях систему "Semimonoclonal Double-Sandwich Test" (Швеция) для выявления антигенов М. pneumoniae с использованием моноклональных антител. Публикации о диагностике инфекций, обусловленных M.hominis, методом ИФА отсутствуют как в зарубежных, так и в отечественных литературных источниках.

Представленные данные свидетельствуют о необходимости разработки отечественных тест-систем на основе иммуноферментного анализа для выявления антигенов микоплазм у больных с респираторными и урогенитальными инфекциями с целью верификации этиологического диагноза.

Цель исследования: разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов микоплазм в клиническом материале от больных с респираторными и урогенитальными заболеваниями человека.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Получить высокоактивные иммунные сыворотки к цитоплазматическим мембранам клеток М. pneumoniae и М. hominis.

2) Разработать иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов М. pneumoniae и М. hominis в ИФА и дать оценку их специфичности и чувствительности.

3) Апробировать тест-системы на клиническом материале, полученном от больных с респираторными и урогенитальными микоплазменными инфекциями.

4) Определить условия выявления в ИФА антигенов М. pneumoniae и М. hominis в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в пробах сыворотки крови.

5) Дать электрофоретическую характеристику антигенов М. pneumoniae и М. hominis с помощью «Вестерн-блот» анализа.

6) Провести иммуноблоттинг в пробах сыворотки крови для подтверждения специфичности обнаружения в ИФА антигенов М. pneumoniae и М. hominis в свободном состоянии и в составе ЦИК.

Научная новизна:

Получены высокоактивные гипериммунные сыворотки к М. pneumoniae и М. hominis путем иммунизации кроликов фракциями цитоплазматических мембран клеток микоплазм. Антитела, выделенные из иммунных сывороток, были использованы для создания диагностических тест-систем на основе ИФА для определения антигенов М. pneumoniae и М. hominis в свободном состоянии и в составе ЦИК в сыворотках крови больных с заболеваниями респираторного и урогенитального тракта.

Специфичность, чувствительность и диагностическая значимость разработанных вариантов ИФА была показана на примере анализа проб сыворотки крови больных с респираторными и урогенитальными микоплазменными инфекциями и подтверждена результатами дополнительных исследований этих образцов на присутствие антигенов М. pneumoniae и М. hominis и антител к ним в ИФА, РАГА и иммуноблоттинге.

Научно-практическая значимость работы.

Разработаны варианты ИФА для обнаружения антигенов М. pneumoniae и М. hominis в клиническом материале, полученном от больных с респираторной и урогенитальной патологией, и показана их диагностическая значимость. Предложен метод выявления микоплазменных антигенов в составе циркулирующих иммунных комплексов, который дает возможность увеличить специфичность и чувствительность разработанных тест-систем и проследить длительность персистенции микоплазм в организме больного. С целью повышения эффективности диагностики микоплазменных инфекций рекомендуется применять ИФА в комплексе с РАГА, РИФ или ПЦР в практике клинических и экспериментальных лабораторий, занимающихся диагностикой микоплазменных инфекций.

Внедрение результатов работы.

Составлены Методические рекомендации «Изготовление и контроль тест-системы диагностической для определения антигенов Mycoplasma pneumoniae в иммуноферментном анализе» и «Изготовление и контроль тест-системы диагностической для определения антигенов Mycoplasma hominis в иммуноферментном анализе», предназначенные для микробиологов, иммунологов и других специалистов, занимающихся разработкой и производством диагностических препаратов. Методические рекомендации одобрены на Совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (протокол № 8 от 19 марта 2009 г.).

Положения, выносимые на защиту: - на основе ИФА разработаны высокочувствительные методы обнаружения антигенов M.pneumoniae и M.hominis в клиническом материале, полученном от больных с респираторной и урогенитальной патологией. Исследование сывороток крови на присутствие микоплазменных антигенов в РАГА, иммуноблоте и антител к ним в ИФА подтвердило специфичность данных тест-систем.

- способ определения антигенов M.pneumoniae и M.hominis в составе ЦИК увеличивает чувствительность ИФА, а совместная диагностика, как свободных, так и связанных в ЦИК антигенов позволяет установить длительность персистенции антигенов в макроорганизме.

- протестированные в иммуноблоте антигены M.pneumoniae и M.hominis, обнаруженные в ИФА, имеют широкий протеиновый спектр (от 30 до 170 кДа и от 25 до 120 кДа соответственно) и содержат как специфические, так и патогенетически значимые антигены.

Апробация работы.

Апробация состоялась на совместной научной конференции отдела медицинской микробиологии и лаборатории микоплазм и L-форм бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 18 февраля 2009 года.

Материалы диссертации были обсуждены и доложены на:

- X Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2006 год, Санкт-Петербург.

- Российской - научно-практической конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами», 2007 год, Москва.

- Конференции «Современные технологии в диагностике инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами», 2009 год, Краснодар.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 1. Современное представление о представителях класса Mollicutes.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шершнёва, Наталья Николаевна

выводы.

1. Впервые на основе поликлональных антител к M.pneumoniae и M.hominis разработаны варианты ИФА для выявления микоплазменных антигенов у больных с респираторными и урогенитальными заболеваниями. Чувствительность модельных тест-систем составила 2 нг/мл (по белку).

2. Показано, что с помощью разработанных вариантов ИФА у больных с респираторной и урогенитальной инфекцией в 48 % и 82% случаев обнаружены антигены M.pneumoniae и M.hominis соответственно. Полученные результаты подтверждены выявлением микоплазменных антигенов в РАГА и иммуноблоттинге, специфических антител в ИФА.

3. Спектр выявляемых в иммуноблотинге антигенов M.pneumoniae и М. hominis в сыворотках крови больных с респираторной и урогенитальной микоплазменными инфекциями находился в пределах от 30 до 170 кДа и от 25 до 120 кДа соответственно и содержал основные специфические антигены.

4. Разработана методика определения в ИФА антигенов M.pneumoniae и M.hominis в составе ЦИК в пробах сыворотки крови больных с респираторными и урогенитальными инфекциями.

5. Установлено, что использование метода диссоциации ЦИК повышает чувствительность выявления антигенов M.pneumoniae и M.hominis при респираторных и урогенитальных заболеваниях.

6. Иммуноэлектрофоретическая характеристика специфических антигенов в составе ЦИК, выявляемых в ИФА, показала, что антигенный спектр M.pneumoniae и М. hominis находился в диапазоне от 50 до 170 кДа и от 55 до 120 кДа соответственно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шершнёва, Наталья Николаевна, Москва

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы микробиологических исследований. — Л.:Изд-во Медгиз, 1962.С. 178.

2. Биргер М.О. «Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» Москва, Медицина, 1982, с.464.

3. Бондаренко В.М., «Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса» //Журн. Микробиол. 1999; 5; 34-39.

4. Вонский М.С., Аствацатурянц Г. В., Борхсениус С. Н. Экспрессия белков теплового шока у микоплазм//ДАН. 1993. Т. 331. С. 112-115.

5. Голубева Т.Н. «Факторы патогенности микоплазм урогенитального тракта и чувствительность к антимикробным препаратам». http://www.laborama.ru/articles.

6. Горина Л.Г., Вульфович Ю.В., Зильфян А.В. и др. «Микоплазменные артриты человека и некоторые механизмы их патогенеза» Вестник академии наук 1989 г., №6, с. 84-87.

7. Горина Л.Г., Гончарова С.А., Ланге А., Каган Г.Я. Определение свободного и связанного в имунные комплексы антигена Mycoplasma pneumoniae у больных острыми респираторными заболеваниями.// Лаб. Дело. — 1983-№11-с. 8-10.

8. Горина Л.Г., Вульфович Ю.В. Дифференциация антигенов в составе циркулирующих иммунных комплексов. // Журнал микробиология. — 1996-№1-с. 47-50.

9. Горина Л.Г., Каган Г.Я, Гаврилова и др. Свободный и связанный антиген L-форм стрептококка группы А и уровень циркулирущих иммунных комплексов у больных рожей. // Журнал микробиология. — 1983-№9-с. 106109.

10. Горина Л.Г., Гончарова С.А., Раковская И.В., Машканцева И.В.Частота обнаружения микоплазм при заболеваниях органов дыхания. // Журнал лабор. мед. 2005-№9-с.57-58.

11. Гриппи М. А. Патофизиология легких. Москва. СПб, изд-во БИНОМ -Невский диалект, 2001, с. 19-43.

12. Егоров A.M., Осипов А.П. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. Москва: Высш. шк., 1991. стр. 114.

13. Жевержеева И.В., Коптелова Е.И., Неустроева В.В., Вульфович Ю.В. и др. Индикация микоплазм в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом. // ЖМЭИ. 1983. -№9 - стр.63-66.

14. Зильфян A.B. Патогенез и нммуноморфологическая характеристика экспериментальных артритов, индуцированных микоплазмами arthritidis и fermentans. : Дис. докт. мед. наук. М., 1986.

15. Кац JI.H. Мембранный аппарат L-форм бактерий. // Биомембраны. Рига.: Изд-во Знание. 1977. стр.105.

16. Кац JI.H. Субмикроскопическая структура микроорганизмов с дефектом клеточной стенки. // Успехи микробиол. АН СССР. — 1980. №15. — стр. 180-196.

17. Каган Г .Я. Mycoplasma pneumoniae и респираторные микоплазмозы. Микоплазмы в патологии человека. 1981. М. С. 3-24.

18. Немченко О.И., Уварова Е.В. ФГУ НЦ АГиП "Росмедтехнологий" Журнал: Consilium medicum. Том 09/N1. 2007. http://www.consilium-medicum.com.

19. Нго Т.Г., Ленхофф Г. Иммуноферментный анализ. -1988.- Москва-Мир. -с.256.

20. Покровский В.И. «Медицинская микробиология», ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1998, 183.

21. Прозоровский С.В., Раковская И.В., Вульфович. «Медицинская микоплазмология». Москва. Медицина. 1995, с. 42-43. , стр.262, стр. 187188.

22. Раковская И.В., Горина Л.Г. Лабораторная диагностика микоплазмозов человека. Клин лаб. диагностика 1999; 11:6 7.

23. Раковская И.В. Микоплазмы и патологии человека. — М.: Мзд-во ВНИИМИ, 1981. с.70-82.

24. Руденко А.В. Роль hominis в этиологии и патогенезе нефрологических и урологических заболеваний: Дисс. . докт. мед. наук. Киев, 1986.

25. Синопальников А.И. Атипичная пневмония: диагностика и лчение.// Российские медицинские вести. 2000.-№1.

26. Теплов С.А., Назарова Л.С., Елисеева И.П. Уретриты, циститы, кольпиты, вульвовагиниты. М.: КРОН-Пресс, 2000.

27. Токарев М. «Что такое масс-спектроскопия?» htpp//www.textronica.com.

28. Фримель X. Иммунологические методы. Издательство «Мир», Москва, 1979, стр. 31 и 264-273.

29. Andersen Н., Birkelund S., Christiansen G et.al. Electrophoretic analysis of proteins from M.hominis strains detected by SDS-Page, two-dimensional gel electrophorezis and immunoblotting. // J.Gen.Mycrobiol. 1987.-Vol.133. -p.181-191.

30. Bartholomew L.E: Isolation and characterization of mycoplasmas (PPLO) from patients with rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and Reiter's Syndrome. Arthritis Rheum 1965, 8:376-388.

31. Baseman В., Banai.M., Kahane J. Sialic and residues mediate M.pneumoniae attachment to human and sheep erythrocytes. Infection and Immunity. 1982. Vol.38. P.389-391.

32. Baseman J.B., D.L. Drouillard,D.K. Leith, and Tully J.G. Absence of Mycoplasma pneumoniae cytoadsorbtion protein PI in Mycoplasma genitalium and Mycoplasma gallisepticum. Infect. Immun. 43:1103-1105.

33. Bendjennat M., Blanchard A., et. al. Role of Mycoplasma penetrans Endonuclease P40 as a potential pathogenic determinant. Infect. Immun. 1999. Vol.67, No 9, p. 4456-4462.

34. Bernet C., Garret M., de Barbeyrac В., et al. Detection of Mycoplasma pneumoniae by using the polymerase chain reaction. // Journal of clinical microbiology. 1989-Vol.27-p.2492-2496.

35. Biberfeld G., Norberg. Circulating immune complex in Mycoplasma pneumoniae infection. //J. immunol. 1974. 112. 413-415.

36. Birkelund S., Christiansen G., et.al. Cloning sequencing and variability analysis of a non-ouspensable 75 kD membrane protein from Mycoplasma hominis. 13 IOM. Japan. 2000, p. 133.

37. Blanchard A. Ureaplasma urealyticum urease genes; use of a UGA tryptophan codon. Mol Microbiol 1990; 4 (4): 669-76.

38. Blanchard A. and Bebear,C.M. Mycoplasmas of humans. In Razin S. and Herrmann R., et. al. Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas. Kluwer Academic/Plenum Publishers, London, 2002, pp. 45-71.

39. Boesen Т., Christiansen G. et al. // Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 97-110.

40. Boesen Т., Emmerson L.T., Jensen S.A., et.al. The Mycoplasma hominis vaa gene displays a mosaic gene structure. Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 97-110.

41. Busolo Franco, Tonin Enrico and Conventi Luciano. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. // J. of Clin. Mycrobiol. 1980 - July - p.69-73.

42. Catrein I., Pizkl E., Herrmann R. Genetic variation and adherence in Mycoplasma pneumoniae. 14 IOM. Austria. 2002. p. 138.

43. Christiansen G., Methiesen S., Ladenfogel S. Abstr. X Congr. IOM. 1990, Turkey, p. 111.

44. Cimolai N., Bryan.L.E., To M., and Woods D.E. Immunological Cross-Reactivity of a Mycoplasma pneumoniae Membrane-Associated Protein Antigen with Mycoplasma genitalium and Acholeaplasma laidlawii, Clinical Mycrobiology, Nov. 1987, p. 2136-2139.

45. Clark H.W., Coker-Vann M.R., Bailey J.S., Brown T. Detection of mycoplasmal antigen in immune complexes from reumathoid arthritidis synovial fluids. // Annals, of allergy. 1988. 60. p. 394-398.

46. Clark H., Bauley J., Brown T. Medium-dependent properties of mycoplasmas. Diagn.Mycrobiol.Infect.Dis. 1985. Vol.3. №4. p.283-294.

47. De Silva N.S., QuinnP.A. J.Clin.Microbiol. 1986. Vol.135, p. 683-691.

48. Deguchi Т., Gilroy C.B., Taylor-Robinson D. Failure to detect Mycoplasmafermentans or M.pirum in the uretra of patients with acute nongonococcal urethritis. J.Clin.Microbiol.Inf.Dis. 1996. Vol. 15. p.169-171.

49. Digeon M., Laner M., Risa I. Detection of circulation immune complex in human serum by simplified assays with polyethyleneglicol//l. Immunol. Meth.— 1977.— V. 16.—P. 165-172.

50. Dorigo-Zetsma L.W., Zaat S.A., Wertheim von Dillen P.M.E., et al. Comparison of PCR, culture and serological tests for diagnosis of Micoplasma pneumoniae respiratory tract infection in children. J Clin Microbiol 1999;37:14-7.

51. Duffy M.E., Whithear K.G., et al. Indirect enzyme linked immunosorbent assay for detection of immunoglobuline G reactive with a recombinant protein-expressed for the gene encoding the 116 KD protein of M.pneumoniae . J Clin Microbiol 1999;37:1024-9.

52. Ejsing Т., Birkelund S., Christiansen G. Establishment of colonial Mycoplasma hominis 7488 cell lines. 13 IOM. Japan.2000, p. 132.

53. Ekins R.P. Mycroarrays: their origins and applications. Tibtech. 1999, 17, p.217-218.

54. Feizi Т., Loveless R.W. 1996. Cerbohydratc recognition by Mycoplasma pneumoniae and pathologic consequences II Amer.J.Res.Crit.Care Med. Vol.l54.P.133-136.

55. Fernald G.W. Immunologic interactions between host cells and mycoplasmas: an introduction. Rev. Infect. Dis. 1982. Vol.4. Suppl. P. 201-204.

56. Fernald G.W., Clyde W. Protective effect of vaccines in experimental M.pneumoniae disease. // Infect. Immunity. 1970.-Vol.1.-p.559-565.

57. Fisselia M., Popham P., Birkhead K, Krause D. Exploring HMW1 and HMW2 function in Mycoplasma pneumoniae. 13 IOM. Japan. 2000, p. 167.

58. Freundt E.A. Methods in Mycoplasmology. Academic Press. New York. 1983. Vol. 1, p. 9-13.

59. Fu P.C., Vodian M., Balga M., et al., Perfomance characteristics of a competitive solid fase enzyme immunoassay for serum Digoxin. 1983. Clin. Chem., 29, 1012.

60. Gerlic M, Horowitz J, S Farkash, S Horowitz. The inhibitory effect of Mycoplasma fermentans on tumour necrosis factor (TNF)-alpha-induced apoptosis resides in the membrane lipoproteins. Cellular microbiology. 2007 Jan;9(l): 142-53.

61. Habermann V.E., Ein neus prinzip zur quantativen bestimmung hochmolekularer antigene, 1970. Z. Klin.Chem. u. Klin.Biochem., 8, 51055.

62. Hauge S., Ladefoged S., Birkelund S., et. al. Abst. 7-th Congr. IOM. Baden, Austria, 1988, p. 8.

63. Henrich B.A., Feldman, Hadding U. Cytoadhesins of Mycoplasma hominis. Infect. Immun. 61:2945-2951.

64. Hirschberg L., Holme T. «ELISA for detection of Mycoplasma pneumoniae antigens using monoclonal antibodies». APMIS. 1991. May. 99(5): 475-81.

65. Hollingdale M. The role of Mycoplasma membrane proteins in the adsorbtion of animal cells to M.hominis colonies. J. Gen.Mycrobiol. 1972. Vol.70. P.391-393.

66. Horowitz S., Yevirison В., Horowitz J. «Mycoplasma fermentans in Rheumatoid arthritis and other inflammatory arthritis», 12 IOM, 1998, p.96.

67. Horn Abele M., Busch U., Nitscheo, et al. Molecular approaches to diagnosis of pulmonary diseases due to M.pneumoniae. J Clin Microbiol 1998;36:548-51.

68. Ни P.C., Kenny G.E. Abstr. Ann. Meet. Amer. Soc. Microbiol. 1987. G.28. P.118.

69. Ishikawa et al., Major factors limiting sensitivity of sandwich enzyme immunoassay for ferritin, immunoglobulin E, and thyroid-stimulating hormone, 1982. Ann.Clin.Biochem., 19, 379-384. 1982.

70. Jacobs. E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical state in different populations of patients. // Clin. Infect. Dis. 1993-17-p.579-582.

71. Jansson E., Makisara P., Vianio K. et.al. An 8-year study on Mycoplasma in rheumatoid arthritidis // Scand. J. Rheum. 1971. - Vol. 30. - p. 506-508.

72. Kenny G. Serological cross-reaction between lipids of M.pneumoniae and M.neurolyticum.// Infect.Immunity. 1981. - Vol.4. - p. 149-152.

73. Kuppeveld F.J., Johansson K.E., et.al. 16S r RNA based polymerase chain reaction compared with culture and serological methods for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. // Eur.J.Clin.Microbiol. Infect. Dis. 1994. -Vol.13 -p.401-405.

74. Ladenfogen S. A., Christiansen G. //Microbiolgy. 1998.V. 144. P. 761-770.

75. Ladenfogen S. A. Molecular dissection of Mycoplasma hominis. Apmis. V 108. p.5-45.

76. Laemmli U.K, 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London), 227: 680-685.

77. Lin S.K., Lucier I.S., Huang C.H., Heitzman K., Hu S.C., P.C.Hu. Genetic and biologic characterization of transpose generated cytoadherence-deficient of Mycoplasma pneumoniae. 12 IOM, 1998, p.159.

78. Ling M.C. Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies. 1975. United States Patent No. 3, 867,517.

79. Lo S.-C. et al. // Clin. Infect. Dis. 2003. V. 36. P. 1246-1253.

80. Maeda H. Paradigm shift in microbial pathogenesis: an alternative to the Koch-Pasteur paradigm on the new millennium // 13th Intern. IOM Congress. 2000. Abstracts, p. 35. Fukuoka, Japan.

81. Maiolini R., Masseyeff R. A sandwich method of enzyme immunoassay. I. Aplication to rat and human alpha- fetoprotein. 1975. J. Immunol Methods, 58, 293-300. 25.

82. Michael F.Duffy. Endirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for detection immunoglobulin G Reactive with a recombinant protein expressed from the gene Encoding the 116-kD Protein of Mycoplasma pneumoniae. Journal of clinical Microbyology, 1999.

83. Miettinen A., Hakkaranen K., Jansson E. et.al. Abst. 7-th Congr. IOM.- Baden, Austria, 1988.- p.82.

84. Miettinen Ari., Hannu Turunen, Jorna Paavonen, Elli Janson, and Paul Leinikki. Detection of Mycoplasma hominis antigen in clinical specimens by Enzime Immunoassay (EIA). Journal of Immunological Methods. 69. 1984. 267-275.

85. Minion F., Coguen J. Diffusion of target cell membrane proteins allows recognition of cryptic binding sites by M.pulmonis hemagglutinin. Infection and Immunity. 1985. Vol.48. №2. P.579-580.

86. Mizutani Hiroko, Mizutani Hiromishi. Circulating immune complexes in patients with Mycoplasma pneumoniae. // Am. Rev. Resper. Dis. 1984. 130. p 627629.

87. Morrison-Plummer, J.A.Lazell, and J.B.Baseman. 1987. Shared epitopes between Mycoplasma pneumoniae major adhesion protein PI and a 140-kilodalton protein of Mycoplasma genitalium. Infect. Immun. 55:49-56.

88. Nishimura M., Saida Т., Kuroki S. et al. 1996. Post infections encephalitis with anti-aglactocerebroside antibody subsequent to Mycoplasma pneumoniae infection // J.Neurol.Sci.Vol.l40.P.91-95.

89. Nomura M., Imai M. et al. Three-site radioimmunoassay with monoclonals for a sensitive dtermination of human alpha-phetoprotein. 1983. J. Immunol. Methods, 58, 293-300.

90. Nyvold C, Birkelund S, Christiansen G. The Mycoplasma hominis P120 membrane protein contains a 216 amino acid hypervariable domain that is recognized by the human humoral immune response. Microbiology. 1997; 143: p. 675-688.

91. Olson L.D., Shane S.W., Karpas A.A., et.al. Monoclonal antibodies to surface antigens of pathogenic Mycoplasma hominis strain. Infect. Immun. 1991. 59:1683-1689.

92. Patten В., Whithear K., Rodwell A. Attachment of Mycoplasma synoviae to erythrocytes. IOM. Tokyo. 1982. P. 152.

93. Pletsch K., Ehlers S., Jacobs E. 1994. Cytokine gene expression in the lungs of BALB/C mice during primery end secondary intranasal infection with Mycoplasma pneumoniae II Microbiology Vol. 140. P. 2043-2048.

94. Portstmann В., Portstmann Т., et al., Comparision of direct and indirect tow-site binding enzyme immunoassay. 1982. Clin.Chim.Acta, 122, 1-9.

95. Rastawicki W, Kaluzewski S, Jagielski M, Gierczynski R. Evalution of commercial usefulness for microparticle agglutination Serodia-Myco II test forserodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections. Med Dosw Mikrobiol. 2002. 54 (l):67-73.

96. Razin S., Herrmann R., Barile M.F. Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas, 2002, Kluwer Academic/ Plenum Publisher, New York, p.495.

97. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas // In: Microbiol. Molec. Biol. Rev. 1998, 64:1094-1156

98. Razin S. Membranes and transport. 1982. Vol.1, p. 283-288.

99. Razin S., Barile M.F. The Mycoplasmas. 1983. Academic press. INC. USA p. 404-406, 479, 477, 288.

100. Razin S. The Mycoplasmas. Microbiol.Rev.- 1978.-Vol 42, N2.-p.417-470.

101. Rivera Antonio, Yanez Antonio, Leon-Tello Gloria, Gil Constantino, Giono Silvia, et.al. Experimental arthritis induced by a clinical Mycoplasma fermentans Isolate. BMC Musculoskeletal Disorders 2002, 3:15.

102. Robertson J., Stemke G. Expended serotyping scheme for U.urealyticum strains isolated from humans. J.Clin.Microbiol. 1982. Vol.15, №5, p.873-878.

103. Ross R.F., Dale S.E., Duncan J. R. 1973. Experimentally indused Mycoplasma hyorhinis arthritis of swine immune responce to 26th postinoculation work. Amer. J. Vet. Res. Vol. 34. P. 367-372.

104. TULLY, «Methods in Mycoplasmology», Academic Press, INC, USA, 1983.

105. Schaeverbeke T.,Vernhes J.P.,Lequen L.,Banwarch В., et al: «Mycoplasmas and arthritis», Rev. Rhum, 1997,64:120-12.

106. Schiefer H.-G., Gerhardt U., Brunner H. Immunological stadies on the localization of phosphatidylglycerol in the membranes of M. hominis. Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1975. (MAO). Bd. 356. p. 559-565.

107. Sheena Johnson, David Sidebottom at al «Journal of Clinical Microbiology», Jan., 2000, p. 90-93.

108. Shimizu Takashi, Yutaka Kida, and Koichi Kuwano. A dipalmitoylated lipoprotein from Mycoplasma pneumoniae Activates NF-kB through TLR1, TLR2, and TLR6. Journal of Immunology. 2007. Aug, 121 (4): p.473-83.

109. Skakni Leila, Sardet Anne, Just Jocelyne et.al. Detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples from pediatric patients by polymerase chain reaction. // Journal of clinical microbiology. 1992-Oct.-p.2638-2643.

110. Smith P.F., Isr.J.med.Sci. 1987. Vol.23, p. 448-452.

111. Stanbridge E.J. Mycoplasma Lymphocyte Interaction and their possible role in immunopathologic manifestations of mycoplasmas diseas. Rev. Infect. Dis. 1982. Vol.4. P. 219-226.

112. Stanbridge E., Weiss E. Mycoplasma capping on lymphocytes. Nature. 1978. Vol. 276. №5688. P. 583-587.

113. Standefer J.C., Saunders G.C., Enzyme immunoassay for gentamicin,prolactin. 1978. Clin. Chem., 24, 1903-1907.

114. Swea M.V., Miles R.J., at. al. Potential virulence determinants of Mycoplasma fermentans strain. 14 IOM. Austria. 2002. p. 139.

115. Talkinyton D.F., Thacker W., Keller D.W., et al. Diagnosis of M.pneumoniae infection in autopsy and open-lung biopsy tissues by Nested PCR. J Clin Microbiol 1992;36:1151-3.

116. Taylor-Robinson D., Furr P.M. Geniturin. Med. 1985. Vol. 61. p. 404-408.

117. Taylor-Robinson, D., Tully J. G., and M. F. Barile. 1985. Urethral infection in male chimpanzees produced experimentally by Mycoplasma genitalium. Br. J. Exp. Pathol. 66:95-101.

118. Taylor-Robinson D., Furr P.M. Tully J. G. et.al. J. Med. Sci. 1987. Vol.23, p. 561-564.

119. Taylor-Robinson D., Furr P.M. 1997. Genital mycoplasma infections // Wien Kin. Wochenschr. Bd 109. S. 578-583.

120. Taylor R.B., Duffus W. P. H., Reff M. P., de Petris S. 1971. Redistribution and pinocytosis of lymphocyte surfase immunoglobulin molecules induced by antiimmunoglobulin antibody II Nature New Biol. Vol.223. P. 225-229.

121. Tjhie J.H.,Kuppeveld F.J. et.al. Direct PCR enables detection of Mycoplasma pneumoniae in patients with respiratory tract infections. // J. Clin Microbiol . 1994 - Vol.32-p.l 1-16.

122. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4354.

123. Wang R.Y., Shih J. W., Weiss S. H. et al. 1993. Mycoplasma penetrans infection in male homosexuals with AIDS high seroprevalence and association with Kaposi's sarcoma. Cim. Infect. Dis. Vol.17. P. 724- 729.

124. Weber R., Osborn M., Proteins and sodium dodecyl sulfate: Molecular weight determinations on polyacrylamide gels and related procedures. In: The proteins, 3rd ed., H.Neurath and R.L.Hill, Academic prss, New York, 1975. v. 1, p. 179.

125. Wei-wing, Shi De-li, Chen Yang-kang Ye. Analysis of major proteins of Ureaplasma urealyticum standart serovars and local isolates. Australia, Sidney. 12 IOM. 1998, p.65/

126. Wise K., Cassel G., Acton R. Selective association of murine T lymphoblastoid cell surface alloantigens with M.hyorhinis. Proc. Natl.Acad.Sci. USA. 1978. Vol.75. P.4479-4483.

127. Wise K., Minion F., Cheung H. Translocation of thy-I antigen and a fluorescent lipide probe during lymphoblastoid cell interaction with M.hyorhinis. Rev.Infect.Dis. 1982. Vol.4. P. 210-218.

128. Wise K., Watson H. Antigenic mimicry of mammalian intermediate filaments by mycoplasmas. Infect.Immun. 1985. Vol.48. P.587-591.

129. Ye Yuan-kang, Lu De-yunn, Study of the common antigen between Ureaplasma urealyticum and human sperm. Abst. 12-th. Inter. Congr. IOM. 1998, p.66, Australia, Sidney.

130. Yorde D.E., Sasse E., Wang Т., Hussa R., Garancis J. Conjugatiive enzyme linked immunoassay with the use of soluble enzyme/antibody immune complex for labeling. I. Measurement of human choriogonatropin. 1976. Clin. Chem., 22 1372-1377.

131. You Xiao-xing, Zeng Yan-hia, WU Yi-mou. Interaction between mycoplasma lipid-associated membrane proteins and the host cells. J. of Zhejiang University SCIENCE B. 2006. 7(5): p. 342-350.